RS59634B1 - Genska terapija za retinitis pigmentozu - Google Patents

Genska terapija za retinitis pigmentozu

Info

Publication number
RS59634B1
RS59634B1 RS20191551A RSP20191551A RS59634B1 RS 59634 B1 RS59634 B1 RS 59634B1 RS 20191551 A RS20191551 A RS 20191551A RS P20191551 A RSP20191551 A RS P20191551A RS 59634 B1 RS59634 B1 RS 59634B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
mir
rhodopsin
nucleic acid
aav
raav
Prior art date
Application number
RS20191551A
Other languages
English (en)
Inventor
Catherine O'riordan
Matthew Adamowicz
Original Assignee
Genzyme Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52829343&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS59634(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genzyme Corp filed Critical Genzyme Corp
Publication of RS59634B1 publication Critical patent/RS59634B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/34—Allele or polymorphism specific uses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
POZIVANJE NA POVEZANE PRIJAVE
[0001] Ova prijava zahteva prioritet nad SAD provizorne prijave serijski br.61/969,027, koja je podneta 21. marta 2014.
SPISAK SEKVENCI
[0002] Sadržaj narednog podneska u ASCII tekstualnoj datoteci deo je opisa: računarski čitljiv obrazac (CRF) Spiska sekvenci (naziv datoteke: 159792010040SeqList.txt, datum snimanja: 17. mart 2015., veličina: 63 KB).
OBLAST PRONALASKA
[0003] Predmetni pronalazak se odnosi na AAV vektore za upotrebu u postupcima tretmana retinitis pigmentoze.
KRATAK SAŽETAK PRONALASKA
[0004] Retinitis pigmentoza (RP) je najčešći uzrok nasledne degeneracije mrežnjače, koji se klinički karakteriše noćnim slepilom i gubitkom perifernog vida. Mutacije rodopsina vizuelnog pigmenta štapića prepoznate su kao najčešći uzrok autosomno dominantnog RP (ADRP), i iako su predloženi i testirani brojni tretmani za rodopsin RP na životinjskim modelima i kliničkim studijama, bolest ostaje neizlečiva (Kalloniatis, M., i dr. (2004) Clin. Exp. Optom.87(2):65-80). Dosta podataka podržava mišljenje da je rodopsin RP pogrešno savijanje proteina kod koga pogrešno savijanje ili pogrešno sastavljanje mutantnog proteina menja ćelijsku sudbinu i izaziva ćelijsku smrt (Gregersen, N. i dr. (2006) Annu. Rev.
Genomics Hum. Genet.7:103-24). Poznate RP mutacije gena rodopsina uključuju grešku i kratke mutacije u okviru okvira sa brisanjem, sa jednom baznom supstitucijom u kodonu 23 (P23H) gena rodopsina koji čini -7% svih slučajeva dominantne retinitis pigmentoze u SAD (Dryja, T.P., i dr. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.92(22):10177-81). U kultivisanim ćelijama, P23H mutantni protein, za razliku od divljeg tipa (WT) proteina, se zadržava u ER, što dovodi do indukcije odgovora nesavijenih proteina (UPR), inhibicije proteazoma i agregacije mutantnog proteina u oligomerni, vrste visoke molekularne težine koja formira intraćelijske inkluzije (Saliba, R.S., i dr. (2002) J. Cell Sci.115:2907-18). Slično tome, P23H rodopsin se loše lokalizuje i/ili agregira u ćelijama štapića životinjskih RP modela (Olsson, J.E., i dr. (1992) Neuron 9(5):815-30), što sugeriše da modeli ćelijske kulture mogu biti prediktivni in vivo modeli ove bolesti. Ono što je potrebno jeste način za ublažavanje simptoma RP.
[0005] Ovde opisano obelodanjenje pruža postupke za tretman retinitis pigmentoze kod sisara, koji obuhvataju primenu na oči sisara virusnih čestica rekombinantnih adenopovezanih virusa (rAAV) koje sadrže vektor koji kodira miR-708. U nekim otelotvorenjima, rAAV vektor sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i rodopsin. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke tretmana retinitis pigmentoze koji uključuju primenu na oči sisara prve rAAV virusne čestice koja sadrži prvi rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i druge rAAV virusne čestice koja sadrži drugi rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselina koja kodira rodopsin. U drugim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke za tretman retinitis pigmentoze koji uključuju primenu na oko sisara rAAV virusne čestice koja sadrži rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i rodopsin. U nekim otelotvorenjima, tretman retinitis pigmentoze obuhvata smanjenje ili sprečavanje simptoma povezanih sa retinitis pigmentozom. U nekim otelotvorenjima postupci tretmana retinitis pigmentoze uključuju postupke za smanjenje simptoma povezanih sa RP, postupke za sprečavanje degeneracije mrežnjače, postupke za zaustavljanje progresije RP, postupke za povećanje funkcije fotoreceptora i slično. Simptomi i/ili patologija RP uključuju, ali nisu ograničeni na gubitak vida, gubitak noćnog vida, gubitak perifernih vidnih polja, gubitak ERG funkcije; gubitak oštrine vida i osetljivosti na kontrast; gubitak vizuelno vođenog ponašanja, smanjenje fotoreceptorske funkcije štapića, smrt fotoreceptorskih štapićastih ćelija, smanjenje skotopičnog vida, smanjenje promena u ćeliji mrežnjače (gubitak strukture ili funkcije fotoreceptora; stanjivanje ili zadebljanje spoljnog nuklearnog sloja (ONL); stanjivanje ili zadebljanje spoljašnjeg pleksiformnog sloja (OPL); dezorganizacija praćena gubitkom spoljašnjih segmenata štapića i čepića; skraćenje unutrašnjih segmenata štapića i čepića; povlačenje dendrita bipolarnih ćelija; stanjivanje ili zadebljanje unutrašnjih slojeva mrežnjače, uključujući unutrašnji nuklearni sloj, unutrašnji pleksiformni sloja, ganglijski ćelijski sloj i sloj nervnih vlakana; loša lokalizacija opsina; prekomerno eksprimiranje neurofilamenata i slično. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke za sprečavanje propadanja funkcije štapićastih ćelija i smrti štapićastih ćelija i funkcije kupastih ćelija i smrti kupastih ćelija.
[0006] U nekim aspektima, obelodanjenje pruža postupke tretmana stresa endoplazmatičnog retikuluma (ER) u ćeliji, koji sadrže primenu sisaru rAAV virusne čestice koja sadrži rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708. U nekim otelotvorenjima, sisar ima, ili je pod rizikom da razvije RP. U nekim otelotvorenjima, sisar je čovek koji ima, ili je pod rizikom da razvije RP. U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica se primenjuje na oči sisara. U nekim otelotvorenjima ćelija je ćelija oka. U narednim otelotvorenjima, ćelija je fotoreceptorska ćelija. U narednim otelotvorenjima, ćelija je fotoreceptorska štapićasta ćelija. U nekim otelotvorenjima, postupak uključuje smanjenje jednog ili više ćelijskih markera ER stresa. U narednim otelotvorenjima, jedan ili više ćelijski marker ER stresa su splajsovani XBP-1, CHOP ili Grp78. U nekim otelotvorenjima, rAAV vektor sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i rodopsin. U drugim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke za tretman stresa endoplazmatičnog retikuluma (ER) u ćeliji, koji sadrži primenu sisaru prvog rAAV vektora koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i druge rAAV virusne čestice koja sadrži drugi rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin.
[0007] U nekim otelotvorenjima pronalaska, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je operativno povezana sa promoterom. U nekim otelotvorenjima, promoter je sposoban da eksprimira miR-708 u fotoreceptorskim ćelijama (npr., fotoreceptorska štapićasta ćelija). U narednim otelotvorenjima, promoter sadrži promoter rodopsin kinaze (RK) ili promoter opsina. U drugim otelotvorenjima pronalaska, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin je operativno povezana sa promoterom. U nekim otelotvorenjima, promoter je sposoban da eksprimira rodopsin u fotoreceptorskim ćelijama (npr., fotoreceptorska štapićasta ćelija). U narednim otelotvorenjima, promoter sadrži RK promoter ili promoter opsina.
[0008] U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke za tretman RP i/ili ER stresa koji obuhvataju primenu sisaru rAAV čestice koja sadrži rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i rodopsin. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 i nukleinska kiselina koja kodira rodopsin su operativno povezane sa jednim RK promoterom. U drugim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je operativno povezana sa prvim RK promoterom ili prvim promoterom opsina, dok je nukleinska kiselina koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa drugim RK promoterom ili drugim promoterom opsina. U nekim otelotvorenjima, prvi i/ili drugi promoter opsina uključuje MVM intron (npr., intron od SEQ ID NO: 23). U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je 5' u odnosu na nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin. U drugim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je 3' u odnosu na nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je operativno povezana za kokošijim β-aktin (CBA) promoterom. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin je operativno povezana za kokošijim β-aktin (CBA) promoterom. U nekim otelotvorenjima, sekvenca izvedena iz introna minutnog virusa miša (MVM) nalazi se 3' do promotera. U nekim otelotvorenjima MMV intron sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 23. U nekim otelotvorenjima, promoter dalje sadrži i) CMV pojačivač; ii) sekvencu izvedenu iz faktora transkripcije specifičnog za fotoreceptor; iii) sekvencu izvedenu iz faktora transkripcije specifičnog za fotoreceptor štapića; iv) sekvencu izvedenu iz neuronskog baznog zatvarača mrežnjače; v) sekvenca izvedena iz sekvence transkripcionog faktora koja sadrži homeodomenski čepić-štapić; vi) CMV pojačivač i najmanje jednu ili više sekvenci izvedenih iz faktora transkripcije specifičnog za fotoreceptor, sekvencu izvedenu iz faktora transkripcije specifičnog za fotoreceptor štapića, sekvencu izvedenu iz neuronskog baznog zatvarača mrežnjače; sekvencu izvedenu iz sekvence transkripcionog faktora koja sadrži homeodomenski čepić-štapić; vii) faktor neuronskog baznog leucinskog zatvarača mrežnjače, CMV pojačivač i promoter opsina (-500 do 17); viii) faktor neuronskog baznog leucinskog zatvarača mrežnjače, CMV pojačivač, promoter opsina (-500 do 17) i MVM intron; ik) CMV pojačivač koji sadrži SEQ ID NO: 29; x) faktor neuronskog baznog leucinskog zatvarača mrežnjače koji sadrži SEQ ID NO: 30; xi) sekvenca izvedena iz sekvence transkripcionog faktora koja sadrži homeodomenski čepić-štapić koji sadrži SEQ ID NO: 28; xii) CMV pojačivač koji sadrži SEQ ID NO: 29 i najmanje jednu ili više sekvenci izvedenih iz faktora transkripcije specifičnog za fotoreceptor, sekvencu izvedenu iz faktora transkripcije specifičnog za fotoreceptor štapića, sekvencu izvedenu iz faktor neuronskog baznog zatvarača mrežnjače, koji sadrži SEQ ID NO: 30; sekvencu izvedenu iz sekvence transkripcionog faktora koja sadrži homeodomenski čepić-štapić koji sadrži SEQ ID NO: 28; xiii) faktor neuronskog baznog leucinskog zatvarača mrežnjače koji sadrži SEQ ID NO: 30, CMV pojačivač koji sadrži SEQ ID NO: 29 i promoter opsina (-500 do 17) koji sadrži SEQ ID NO: 22; ili xiv) faktor neuronskog baznog leucinskog zatvarača mrežnjače koji sadrži SEQ ID NO: 28, CMV pojačivač koji sadrži SEQ ID NO: 29, promoter opsina (-500 do 17) koji sadrži SEQ ID NO: 22 i MVM intron koji sadrži SEQ ID NO: 23. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je ugrađena u intron. U nekim otelotvorenjima nukleinska kiselina koja kodira miR-708 sadrži endogenu miR-708 skelu ili miR-155 skelu.
[0009] U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke tretmana RP i/ili ER stresa koji uključuje primenu rAAV čestice koja sadrži rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 sadrži nukleinsku kiselinu SEQ ID NO: 1. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 sadrži nukleinsku kiselinu koja ima najmanje 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 1.
[0010] U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke tretmana RP i/ili ER stresa koji uključuju primenu sisaru rAAV čestice koja sadrži rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin. U nekim otelotvorenjima, rodopsin je rodopsin sisara ili njegov funkcionalni ekvivalent. U nekim otelotvorenjima, rodopsin je ljudski rodopsin ili njegov funkcionalni ekvivalent. U nekim otelotvorenjima, rodopsinu nedostaje ciljana sekvenca 3' neprevedenog regiona (UTR) miR-708. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin sadrži supstituciju, umetanje ili brisanje nukleinske kiseline u miR-708 ciljanoj sekvenci. U nekim otelotvorenjima, supstitucija, umetanje ili brisanje smanjuje ili sprečava prepoznavanje miR-708. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin sadrži supstituciju, umetanje ili brisanje nukleinske kiseline u miR-708 ciljanoj sekvenci gde je miR-708 ciljana sekvenca SEQ ID NO: 19. U nekim otelotvorenjima, eksprimiranje rodopsina je refraktorno prema suzbijanju od strane miR-708. U nekim otelotvorenjima, rodopsin sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2. U nekim otelotvorenjima, rodopsin sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje t 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 2. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin sadrži nukleinsku kiselinu SEQ ID NO: 3. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin sadrži nukleinsku kiselinu koja ima oko 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 3.
[0011] U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke tretmana RP i/ili ER stresa koji uključuju primenu rAAV čestice koja sadrži polinukleotid SEQ ID NO: 5., SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ili SEQ ID NO: 9. U nekim otelotvorenjima AAV virusna čestica sadrži rekombinantni virusni genom koji sadrži polinukleotid koji ima najmanje t 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: : 26, ili SEQ ID NO: 27.
[0012] U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke tretmana RP i/ili ER stresa koji uključuju primenu rAAV čestice sisaru, gde AAV virusna čestica obuhvata AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, kozji AAV, AAV1/AAV2 himerni, goveđi AAV, ili mišji AAV kapsid rAAV2/HBoV1 serotip kapsid. U nekim otelotvorenjima, rAAV virusna čestica obuhvata AAV serotip 5 kapsid. U nekim otelotvorenjima, rAAV virusna čestica obuhvata AAV serotip 5 tirozin mutantni kapsid.
[0013] U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke tretmana RP i/ili ER stresa koji uključuju primenu sisaru prve rAAV virusne čestice koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i druge rAAV virusne čestice koja kodira rodopsin. U nekim otelotvorenjima, prva rAAV čestica i/ili druga rAAV čestica virusa obuhvataju AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, kozji AAV, AAV1/AAV2 himerni, goveđi AAV, ili mišji AAV kapsid rAAV2/HBoV1 serotip kapsid. U nekim otelotvorenjima, prva rAAV virusna čestica i/ili druga rAAV virusna čestica obuhvataju AAV serotip 5 kapsid. U nekim otelotvorenjima, prva rAAV virusna čestica i/ili druga rAAV virusna čestica obuhvataju AAV serotip 5 mutantni kapsid.
[0014] U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke tretmana RP i/ili ER stresa koji uključuju primenu rAAV čestice sisaru gde AAV vektor obuhvata AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, kozji AAV, goveđi AAV, ili mišji AAV serotip ITR. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke tretmana RP i/ili ER stresa koji uključuju primenu sisaru prve rAAV virusne čestice koja sadrži prvi rAAV vektor koji sadrži miR-708 nukleinsku kiselinu i druge rAAV virusne čestice koja sadrži drugi rAAV vektor koji kodira rodopsin. U nekim otelotvorenjima, prvi rAAV vektor i/ili drugi rAAV virusni vektor obuhvata AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, kozji AAV, goveđi AAV, ili mišji AAV serotip ITR.
[0015] U nekim otelotvorenjima pronalaska, rAAV vektori ovog postupka obuhvataju AAV serotip 2 ITR. U nekim otelotvorenjima, ITR i kapsid od rAAV virusne čestice su izvedeni iz istog AAV serotipa. U drugim otelotvorenjima, ITR i kapsid od rAAV virusnih čestica su izvedeni iz različitih AAV serotipova. U nekim otelotvorenjima, rAAV virusna čestica obuhvata AAV-5 kapsid, gde vektor obuhvata AAV2 ITR. U nekim otelotvorenjima, rAAV virusna čestica obuhvata AAV-5 tirozin mutantni kapsid, gde vektor obuhvata AAV2 ITR.
[0016] U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke tretmana RP i/ili ER stresa kod sisara, gde se rAAV čestice primenjuju injekcijom u subretinalni prostor mrežnjače sisara. U nekim otelotvorenjima, rAAV se primenjuje na više mesta jednog subretinalnog prostora mrežnjače sisara. U drugim otelotvorenjima, rAAV čestice se intravitrealno primenjuju injekcijom sisaru. U nekim otelotvorenjima, najmanje 10-30% fotoreceptorskih ćelija (npr., fotoreceptorske štapićaste ćelije) prenosi se sa AAV.
[0017] U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke za tretman RP i/ili ER stresa kod sisara, gde sisar ima mutaciju endogenog gena rodopsina. U nekim otelotvorenjima, mutacija endogenog gena rodopsina je autosomna dominantna mutacija. U nekim otelotvorenjima, retinitis pigmentoza je autosomna dominantna retinitis pigmentoza. U nekim otelotvorenjima sisar je čovek. U nekim otelotvorenjima, čovek ima P23H mutaciju u endogenom genu rodopsina.
[0018] U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke tretmana RP i/ili ER stresa koji uključuju primenu sisaru prve rAAV virusne čestice koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i druge rAAV virusne čestice koja kodira rodopsin, gde se prva rAAV virusna čestica koja kodira miR -708 i druga rAAV virusna čestica koja kodira rodopsin primenjuju sisaru istovremeno. U nekim otelotvorenjima, prve rAAV virusne čestice koje kodiraju miR-708 i rAAV virusne čestice koje kodiraju rodopsin se sisarima primenjuju sekvencijalno. U nekim otelotvorenjima, rAAV virusna čestica koja kodira miR-708 se primenjuje sisaru prva, i rAAV virusna čestica koja kodira rodopsin se primenjuje sisaru druga. U nekim otelotvorenjima, rAAV virusna čestica koja kodira rodopsin se primenjuje sisaru prva, i rAAV virusna čestica koja kodira miR-708 se primenjuje sisaru druga.
[0019] U nekim otelotvorenjima pronalaska, rAAV virusne čestice su u farmaceutskom sastavu. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža sastav koji sadrži rAAV česticu koja sadrži rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 korišćen u ovde opisanim postupcima. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža rAAV česticu koja sadrži rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR708 za upotrebu u tretmanu retinitis pigmentoze ili smanjenju ER stresa prema bilo kom od ovde opisanih postupaka. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža prvu rAAV česticu koja sadrži rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR708, i drugu rAAV česticu koja sadrži rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin za upotrebu u tretmanu retinitis pigmentoze ili smanjenju ER stresa prema bilo kom od ovde opisanih postupaka. U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica sadrži rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR708 i rodopsin za upotrebu u tretmanu retinitis pigmentoze ili smanjenju ER stresa prema bilo kom od ovde opisanih postupaka.
[0020] U nekim aspektima, ovde opisani pronalazak pruža sastave za tretman retinitis pigmentoze kod sisara, i sadrže virusne čestice rekombinantnih adeno-povezanih virusa (rAAV) koje sadrže vektor koji kodira miR-708. U nekim otelotvorenjima, rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 dalje sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža sastave za tretman retinitis pigmentoze koji sadrže prvu rAAV virusnu česticu koja sadrži prvi rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708, i drugu rAAV virusnu česticu koja sadrži drugi rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin. U drugim otelotvorenjima, pronalazak pruža sastave za tretman retinitis pigmentoze koji sadrže rAAV virusnu česticu koja sadrži rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i rodopsin.
[0021] U nekim aspektima, pronalazak pruža sastave za tretman stresa endoplazmatičnog retikuluma (ER) u ćeliji koja sadrži rAAV virusnu česticu koja sadrži rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708. U nekim aspektima, pronalazak pruža sastave za tretman stresa endoplazmatičnog retikuluma (ER) u ćeliji koja sadrži rAAV virusnu česticu koja sadrži rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i rodopsin. U nekim otelotvorenjima, sisar sa ER stresom ima, ili je pod rizikom da razvije RP. U nekim otelotvorenjima, sisar sa ER stresom je čovek koji ima, ili je pod rizikom da razvije RP. U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica se primenjuje na oči sisara. U nekim otelotvorenjima ćelija je ćelija oka. U narednim otelotvorenjima, ćelija je fotoreceptorska ćelija. U kasnijim otelotvorenjima, ćelija je fotoreceptorska štapićasta ćelija. U nekim otelotvorenjima, sastav smanjuje jedan ili više ćelijskih markera ER stresa. U narednim otelotvorenjima, jedan ili više ćelijski marker ER stresa su splajsovani XBP-1, CHOP ili Grp78. U nekim otelotvorenjima, rAAV vektor sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708, i dalje sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin. U drugim otelotvorenjima, pronalazak pruža sastave za tretman stresa endoplazmatičnog retikuluma (ER) u ćeliji koja sadrži prvi rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i drugu rAAV virusnu česticu koja sadrži drugi rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin.
[0022] U nekim otelotvorenjima pronalaska, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je operativno povezana sa promoterom. U nekim otelotvorenjima, promoter je sposoban da eksprimira miR-708 u fotoreceptorskim ćelijama (npr., fotoreceptorske štapićaste ćelije). U narednim otelotvorenjima, promoter sadrži promoter rodopsin kinaze (RK) ili promoter opsina. U drugim otelotvorenjima pronalaska, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin je operativno povezana sa promoterom. U nekim otelotvorenjima, promoter je sposoban da eksprimira rodopsin u fotoreceptorskim ćelijama (npr., fotoreceptorske štapićaste ćelije). U narednim otelotvorenjima, promoter sadrži RK promoter ili promoter opsina.
[0023] U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža sastave za tretman RP i/ili ER stresa koji sadrže rAAV česticu koja sadrži rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i rodopsin. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 i nukleinska kiselina koja kodira rodopsin su operativno povezane sa jednim RK promoterom. U drugim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je operativno povezana sa prvim RK promoterom ili prvim promoterom opsina, i nukleinska kiselina koja kodira rodopsin je operativno povezana za drugi RK promoterom ili drugim promoterom opsina. U nekim otelotvorenjima, prvi i/ili drugi promoter opsina uključuje MVM intron (npr., intron od SEQ ID NO: 23). U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je 5' u odnosu na nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin. U drugim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je 3' u odnosu na nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je operativno povezana za kokošijim β-aktin (CBA) promoterom. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin je operativno povezana za kokošijim β-aktin (CBA) promoterom. U nekim
1
otelotvorenjima, prvi i/ili drugi promoter opsina uključuje MVM intron (npr., intron od SEQ ID NO: 23). U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je 5' u odnosu na nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin. U drugim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je 3' u odnosu na nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je operativno povezana za kokošijim β-aktin (CBA) promoterom. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin je operativno povezana za kokošijim β-aktin (CBA) promoterom. U nekim otelotvorenjima, sekvenca izvedena iz introna minutnog virusa miša (MVM) nalazi se 3' do promotera. U nekim otelotvorenjima MMV intron sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 23. U nekim otelotvorenjima, promoter dalje sadrži i) CMV pojačivač; ii) sekvencu izvedenu iz faktora transkripcije specifičnog za fotoreceptor; iii) sekvencu izvedenu iz faktora transkripcije specifičnog za fotoreceptor štapića; iv) sekvencu izvedenu iz neuronskog baznog zatvarača mrežnjače; v) sekvenca izvedena iz sekvence transkripcionog faktora koja sadrži homeodomenski čepić-štapić; vi) CMV pojačivač i najmanje jednu ili više sekvenci izvedenih iz faktora transkripcije specifičnog za fotoreceptor, sekvencu izvedenu iz faktora transkripcije specifičnog za fotoreceptor štapića, sekvencu izvedenu iz neuronskog baznog zatvarača mrežnjače; sekvencu izvedenu iz sekvence transkripcionog faktora koja sadrži homeodomenski čepić-štapić; vii) faktor neuronskog baznog leucinskog zatvarača mrežnjače, CMV pojačivač i promoter opsina (-500 do 17); viii) faktor neuronskog baznog leucinskog zatvarača mrežnjače, CMV pojačivač, promoter opsina (-500 do 17) i MVM intron; ik) CMV pojačivač koji sadrži SEQ ID NO: 29; x) faktor neuronskog baznog leucinskog zatvarača mrežnjače koji sadrži SEQ ID NO: 30; xi) sekvenca izvedena iz sekvence transkripcionog faktora koja sadrži homeodomenski čepić-štapić koji sadrži SEQ ID NO: 28; xii) CMV pojačivač koji sadrži SEQ ID NO: 29 i najmanje jednu ili više sekvenci izvedenih iz faktora transkripcije specifičnog za fotoreceptor, sekvencu izvedenu iz faktora transkripcije specifičnog za fotoreceptor štapića, sekvencu izvedenu iz faktor neuronskog baznog zatvarača mrežnjače, koji sadrži SEQ ID NO: 30; sekvencu izvedenu iz sekvence transkripcionog faktora koja sadrži homeodomenski čepić-štapić koji sadrži SEQ ID NO: 28; xiii) faktor neuronskog baznog leucinskog zatvarača mrežnjače koji sadrži SEQ ID NO: 30, CMV pojačivač koji sadrži SEQ ID NO: 29 i promoter opsina (-500 do 17) koji sadrži SEQ ID NO: 22; ili xiv) faktor neuronskog baznog leucinskog zatvarača mrežnjače koji sadrži SEQ ID NO: 28, CMV pojačivač koji sadrži SEQ ID NO: 29, promoter opsina (-500 do 17) koji sadrži SEQ ID NO: 22 i MVM intron koji sadrži SEQ ID NO: 23. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je ugrađena u intron. U nekim otelotvorenjima nukleinska kiselina koja kodira miR-708 sadrži endogenu miR-708 skelu ili miR-155 skelu.
[0024] U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža sastave za tretiranje RP i/ili ER stresa koji sadrže rAAV česticu koja sadrži rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 sadrži nukleinsku kiselinu SEQ ID NO: 1. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 sadrži nukleinsku kiselinu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 1.
[0025] U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža sastave za tretman RP i/ili ER stresa koji sadrže rAAV česticu koja sadrži rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin. U nekim otelotvorenjima, rodopsin je rodopsin sisara ili njegov funkcionalni ekvivalent. U nekim otelotvorenjima, rodopsin je ljudski rodopsin ili njegov funkcionalni ekvivalent. U nekim otelotvorenjima, rodopsinu nedostaje ciljana sekvenca 3' neprevedene regije (UTR) miR-708. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin sadrži supstituciju, umetanje ili brisanje nukleinske kiseline u miR-708 ciljanoj sekvenci. U nekim otelotvorenjima, supstitucija, umetanje ili brisanje smanjuje ili sprečava prepoznavanje miR-708. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin sadrži supstituciju, umetanje ili brisanje nukleinske kiseline u miR-708 ciljanoj sekvenci gde je miR-708 ciljana sekvenca SEQ ID NO: 19. U nekim otelotvorenjima, eksprimiranje rodopsina je refraktorno prema suzbijanju od strane miR-708. U nekim otelotvorenjima, rodopsin sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2. U nekim otelotvorenjima, rodopsin sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 2 U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin sadrži nukleinsku kiselinu SEQ ID NO: 3. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin sadrži nukleinsku kiselinu koja ima 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO : 3.
[0026] U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža sastave za tretiranje RP i/ili ER stresa koji sadrže rAAV česticu koja sadrži polinukleotid SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ili SEQ ID NO: 9. U nekim otelotvorenjima, AAV virusna čestica sadrži rekombinantni virusni genom koji sadrži polinukleotid koji ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, ili SEQ ID NO: 27.
[0027] U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža sastave za tretiranje RP i/ili ER stresa koji sadrže rAAV česticu gde AAV virusna čestica obuhvata AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, kozji AAV, AAV1/AAV2 himerni, goveđi AAV, ili mišji AAV kapsid rAAV2/HBoV1 serotip kapsid. U nekim otelotvorenjima, rAAV virusna čestica obuhvata AAV serotip 5 kapsid. U nekim otelotvorenjima, rAAV virusna čestica obuhvata AAV serotip 5 mutantni kapsid.
[0028] U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža sastave za tretman RP i/ili ER stresa koji sadrže prvu rAAV virusnu česticu koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i drugu rAAV virusnu česticu koja kodira rodopsin. U nekim otelotvorenjima, prva rAAV čestica i/ili druga rAAV čestica virusa obuhvata AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, kozji AAV, AAV1/AAV2 himerni, goveđi AAV, ili mišji AAV kapsid rAAV2/HBoV1 serotip kapsid. U nekim otelotvorenjima, prva rAAV virusna čestica i/ili druga rAAV virusna čestica obuhvataju AAV serotip 5 kapsid. U nekim otelotvorenjima, prva rAAV virusna čestica i/ili druga rAAV virusna čestica obuhvataju AAV serotip 5 mutantni kapsid.
[0029] U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža sastave za tretiranje RP i/ili ER stresa koji sadrže rAAV česticu gde AAV vektor obuhvata AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, kozji AAV, goveđi AAV, ili mišji AAV serotip ITR. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža sastave za tretman RP i/ili ER stresa koji sadrže prvu rAAV virusnu česticu koja sadrži prvi rAAV vektor koji sadrži miR-708 nukleinsku kiselinu i drugu rAAV virusnu česticu koja sadrži drugi rAAV vektor koji kodira rodopsin. U nekim otelotvorenjima, prvi rAAV vektor i/ili drugi rAAV virusni vektor obuhvata AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, kozji AAV, goveđi AAV, ili mišji
1
AAV serotip ITR.
[0030] U nekim otelotvorenjima pronalaska, rAAV vektori sastava obuhvataju AAV serotip 2 ITR. U nekim otelotvorenjima, ITR i kapsid rAAV virusne čestice su izvedeni iz istog AAV serotipa. U drugim otelotvorenjima, ITR i kapsid rAAV virusnih čestica potiču od različitih AAV serotipova. U nekim otelotvorenjima, rAAV virusna čestica obuhvata AAV-5 kapsid, gde vektor obuhvata AAV2 ITR. U nekim otelotvorenjima, rAAV virusna čestica obuhvata AAV-5 tirozin mutantni kapsid, gde vektor obuhvata AAV2 ITR.
[0031] U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža sastave za tretman RP i/ili ER stresa kod sisara, gde sisar ima mutaciju endogenog gena rodopsina. U nekim otelotvorenjima, mutacija endogenog gena rodopsina je autosomna dominantna mutacija. U nekim otelotvorenjima, retinitis pigmentoza je autosomno dominantni retinitis pigmentoza. U nekim otelotvorenjima sisar je čovek. U nekim otelotvorenjima, čovek ima P23H mutaciju u endogenom genu rodopsina.
[0032] U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža setove za tretman RP ili za smanjenje ER stresa kod sisara koji sadrže efikasnu količinu rAAV čestica u skladu sa ovde opisanim postupcima. U nekim otelotvorenjima, setovi sadrže efikasnu količinu smeše kao što je ovde opisano. U nekim otelotvorenjima, komplet sadrži efikasnu količinu rAAV čestica koje sadrže rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708. U nekim otelotvorenjima, komplet sadrži efikasnu količinu rAAV čestica koje sadrže rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i rodopsin. U nekim otelotvorenjima, komplet sadrži efikasnu količinu prvih rAAV čestica koje sadrže rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708, i efikasnu količinu drugih rAAV čestica koje sadrže drugi rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin. U narednim otelotvorenjima, komplet sadrži uputstva za upotrebu rAAV čestica u tretmanu retinitis pigmentoze i/ili smanjenju ER stresa. U narednim otelotvorenjima, komplet sadrži uputstva za upotrebu u bilo kom od ovde opisanih postupaka.
[0033] U nekim aspektima, obelodanjenje pruža predmet proizvodnje koji sadrži efikasnu količinu rAAV čestica u skladu sa ovde opisanim postupcima. U nekim otelotvorenjima, predmet proizvodnje sadrži efikasnu količinu bilo kog od ovde opisanih sastava. U nekim otelotvorenjima, predmet proizvodnje sadrži efikasnu količinu rAAV čestica koje sadrže rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708. U nekim otelotvorenjima, predmet proizvodnje sadrži efikasnu količinu rAAV čestica koje sadrže rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i rodopsin. U nekim otelotvorenjima, predmet proizvodnje sadrži efikasnu količinu prvih rAAV čestica koje sadrže rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i efikasnu količinu drugih rAAV čestica koje sadrže drugi rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin.
[0034] U nekim aspektima, obelodanjenje pruža nukleinsku kiselinu koja sadrži intron izveden iz MVM. U nekim otelotvorenjima, MVM intron sadrži SEQ ID NO: 23. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina dalje sadrži promoter. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina dalje sadrži pojačivač. U nekim otelotvorenjima, promoter je smešten 5' do MVM introna. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža konstrukt eksprimiranja koji sadrži nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu ili konstrukt eksprimiranja. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža ćeliju koja sadrži nukleinsku kiselinu, konstrukt eksprimiranja ili vektor.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0035]
SLIKE 1A i 1B prikazuju lokalizaciju divljeg tipa (SLIKA 1A) i P23H mutant (SLIKA 1B) rodopsin u ljudskim pigmentnim epitelnim ćelijama mrežnjače. Ćelije su obojene za rodopsin (zeleno), α-tubulin (crveno) i DNK (plavo). Obrazac bojenja rodopsina divljeg tipa karakterističan je za lokalizaciju membrane (puna strelica), dok je obrazac bojenja P23H mutantnog rodopsina karakterističan za perinuklearnu/retikularnu lokalizaciju (isprekidana strelica).
SLIKE 2A i 2B prikazuju da P23H mutantni rodopsin formira ne-nativne oligomere i zadržava ER-specifične oligosaharide. (SLIKA 2A) Western blot deterdženata rastvorljivih ekstrakata iz ćelija koje eksprimiraju divlji tip („wt“) ili P23H mutantni rodopsin. (SLIKA 2B) Western blot deterdženata rastvorljivih ekstrakata iz ćelija koje eksprimiraju divlji tip („wt“) ili P23H mutantni rodopsin. Ekstrakti su tretirani sa Endoglikozidazom H („Endo-H“) ili su netretirani.
SLIKE 3A i 3B prikazuju da ćelije koje eksprimiraju P23H rodopsin imaju veće eksprimiranje UPR markera i veću sklonost apoptozi. (SLIKA 3A) Relativno eksprimiranje C/EBP homolognog proteina (CHOP; takođe poznat kao Ddit3), vezujući protein imunoglobulina (BiP; takođe poznat kao Hspa5) i geni rodopsina u
1
ćelijama koje eksprimiraju divlji tip („wt“) ili P23H mutantni rodopsin. Relativno eksprimiranje svakog gena je upoređeno sa eksprimiranjem beta-glukoronidaze koristeći ΔΔCtpostupak. (SLIKA 3B) Procenat apoptotskih ćelija u ćelijama koje eksprimiraju kontrolu (pcDNK), rodopsin divljeg tipa, ili R23H mutantni rodopsin, mereno TUNEL bojenjem.
SLIKA 4 prikazuje dijagram konstrukta vektora eksprimiranja za eksprimiranje miR-708 pod kontrolom sveprisutnog promotera (kokošiji β-aktin, CBA) ili promotera specifičnog za fotoreceptor (rodopsin kinaza, RK). DNK koja kodira miR-708 sekvence stabljike i petlje sintetisana je i klonirana između 5' i 3' miR-155 sekvence skele. Ova sekvenca skele sadrži ciljana mesta potrebna da Drosha procesuira primiR-708 u pre-miR-708 u jedru, omogućavajući naknadnu obradu pre-miR-708 u citoplazmi od strane Dicer-a.
SLIKA 5 prikazuje eksprimiranje rodopsin proteina u ćelijama koje eksprimiraju miR-708 ili kontrolnu miRNK, u odnosu na ne-transficirane ćelije. Sve ćelije su HEK-293 ćelije koje eksprimiraju mP23H rodopsin koji ima 3'UTR miR708 ciljanu sekvencu. Eksprimiranje rodopsin proteina normalizuje se hGAPDH eksprimiranjem. Nivo rodopsin proteina se smanjuje u prisustvu miR708 u poređenju sa kontrolnim miR.
SLIKA 6 pokazuje da HEK-293 ćelije koje eksprimiraju mP23H rodopsin imaju smanjene RNK nivoe UPR marker gena CHOP i BiP nakon eksprimiranja miR-708, u poređenju sa ćelijama koje eksprimiraju kontrolnu miRNK („Scramble“).
SLIKE 7A i 7B prikazuju da regulacija na dole rodopsina endogenim miR-708 zavisi od prisustva miR-708 ciljane sekvence u rodopsin 3' UTR. HEK-293 ćelije su transficirane mišjim genom P23H rodopsina, uključujući miR-708 ciljane sekvence (SLIKA 7A), ili sa ljudskim P23H genom rodopsina kom nedostaje miR-708 ciljana sekvenca (SLIKA 7B). Ćelije su takođe transficirane kontrolnom pre-miRNK ili antimiR-708 pre-miRNK kako bi se inhibirao endogeni miR-708. Rodopsin protein je meren u odnosu na hGAPDH protein, i rodopsin mRNK je meren u odnosu na hGAPDH mRNK. Takođe su prikazani nivoi endogenog miR-708 (desna osa i dve krajnje desne kolone na u SLIKAMA 7A i 7B).
SLIKA 8 prikazuje dijagram AAV vektora za eksprimiranje miR-708 u fotoreceptorskim štapićima. Označene su odgovarajuće vektorske karakteristike. SLIKE 9A i 9B prikazuju da eksprimiranje miR-708 koristeći AAV vektor reguliše na dole P23H mutantni rodopsin. (SLIKA 9A) Eksprimiranje miR-708 u WERI ili
1
RPE ćelijama nakon transfekcije vektora koji kodira miR-708 vođen od strane RK promotera ili kontrolne miRNK („Scramble“). Eksprimiranje je prikazano u odnosu na eksprimiranje miR-16. (SLIKA 9B) Eksprimiranje P23H rodopsin mRNK u WERI ćelijama transficiranim pRK-miR-708 plazmidom, u odnosu na ćelije koje su transficirane kontrolnim plazmidom.
SLIKE 10A-10C prikazuju da subretinalna isporuka AAV5 miR-708 vektora rezultuje padom mišjeg rodopsina. (SLIKA 10A) Eksprimiranje mRodopsina u mišjim mrežnjačama u koje su injektirani AAV5 miR-708 ili AAV5 miR-kontrola. (SLIKA 10B) Eksprimiranje RdCVF u mišjim mrežnjačama u koje su injektirani AAV5 miR-708 ili AAV5 miR-kontrola. (SLIKA 10C) eksprimiranje miR-708 u mišjim mrežnjačama u koje su injektirani AAV5 miR-708 ili AAV5 miR-kontrola. SLIKE 11A i 11B prikazuju da tretman očiju sa AAV5 miR-708 smanjuje reakcije posredovane štapićima, ali ne one posredovane čepićima. (SLIKA 11A) Tri reprezentativna elektroretinograma koji predstavljaju skotopične odgovore u očima koja primaju AAV5 miR-708 ili AAV5 miR-kontrolu („Scram“). (SLIKA 11B) Tri reprezentativna elektroretinograma koji predstavljaju fotopične reakcije istih očiju kao na (SLICI 11A) koje primaju AAV5 miR-708 ili AAV5 miR-kontrolu („Scram“).
SLIKA 12 pruža dijagram vektora za suzbijanje/zamenu hRodopsina ugrađenog u miR-708.
SLIKA 13 pokazuje da vektor miR-708 sa ugrađenim intronom smanjuje eksprimiranje mRodopsina, hCHOP i hBiP u WERI ćelijama transficiranim sa P23H mRodopsinom u poređenju sa vektorom miR-kontrole.
SLIKA 14 pokazuje da eksprimiranje miR-708 iz vektora koji je ugrađen u intron ima smanjeno eksprimiranje u poređenju sa ne ugrađenim vektorom u WERI ćelijama, gde je stvar u tome što vektor pRK-hRHO-intron koji je ugrađen u intron takođe ko-eksprimira hRodopsin. Svi vektori koji pokreću eksprimiranje miR-708 koristeći RK promoter imali su za red veličine niže eksprimiranje od vektora koji koristi CBA promoter.
SLIKA 15 pokazuje da je eksprimiranje hRodopsina iz vektora suzbijanja/zamene ugrađenog u intron refraktorno u odnosu na obaranje od strane ko-ekspresiranog miR-708. Nivoi hRodopsin RNK su isti u ćelijama koje su transficirane vektorima koji eksprimiraju miR-708 ili miR-kontrolu.
SLIKA 16 pokazuje da vektor suzbijanja/zamene miR-708 smanjuje XBP-1
1
splajsovanje, marker ER stresa, u WERI ćelijama koje eksprimiraju mutantni rodopsin. Ovo smanjenje se primećuje samo ako je ciljanu sekvencu 3'UTR miR-708 prisutan u transkriptu rodopsina.
SLIKA 17 prikazuje dijagram vektora sa miR-707 ljudskom β-globin intronskom skelom u 3' UTR od cDNK rodopsina.
SLIKA 18 prikazuje da vektor sa miR-707 ljudskom β-globin intronskom skelom u 3' UTR od cDNK rodopsina proizvodi višu eksprimiranja hRodopsina i miR-708 u odnosu na vektor sa skelom u 5' UTR.
SLIKA 19 prikazuje dijagram alternativnog dizajna vektora koristeći odvojene promotere za pokretanje eksprimiranja miR-708 (RK promoter) i hRodopsina (mišji promoter opsina).
SLIKA 20 prikazuje eksprimiranje hRodopsina (levo) i miR-708 (desno) u WERI ćelijama transficiranim određenim vektorom. Eksprimiranje je eksprimirano kao broj kopije izračunat prema DNK standardu.
SLIKE 21A-C prikazuju nivo miR-708 (SLIKA 21A), mišjeg rodopsina (SLIKA 21B) i ljudskog rodopsin (SLIKA 21C) u mišjim mrežnjačama tri nedelje nakon subretinalne injekcije sa AAV5 kapsidnim vektorom koji pokreće eksprimiranje ljudskog rodopsina i miR-708 (miR 708/708), ili ljudskog rodopsina i kontrolnog miRNK (miR-kont), u miR-708 skeli pomoću promotera opsina. Za svaki eksperiment, eksprimiranje je prikazano kao eksprimiranje savijanja u odnosu na kontralateralno oko kom nije data injekcija.
SLIKA 22 prikazuje šemu konstrukta promotera opsina, uključujući sekvencu neuronskog baznog zatvarača mrežnjače (NRL), CMV pojačivač, promoter opsina i MVM intron sekvencu, koja uključuje hibridnu intronsku sekvencu iz CBA egzona 1 i intron iz minutnog virusa miševa (MVM).
SLIKA 23A prikazuje šemu miR-708 sekvence ugrađene u intron beta-globina.
SLIKE 23B i 23C prikazuju šeme miR-708 sekvence u kontekstu miR-708 endogene skele (SLIKA 23B) ili miR-155 skele (SLIKA 23C), ugrađene u intron beta globina. Oznaka miR-155 „petlje“ između 5' i 3' miR sekvenciranja je označena na SLICI 23C.
SLIKA 24 prikazuje procenu vektora kandidata koji sadrže miR-708 sekvencu, u miR-155 ili miR-708 skeli (ugrađenoj u intron beta-globina), i kodirajuću sekvencu ljudskog rodopsina (hRodopsin; takođe nedostaje 3'UTR miR-708 ciljana sekvenca) kog pokreću promoter rodopsin kinaze (GRK1) ili promoter opsina (Ops). Sve četiri
1
kombinacije su testirane na efekte na miR-708 i hRodopsian, kao što je prikazano.
DETALJAN OPIS
[0036] Ovo obelodanjenje pruža postupke za tretman retinitis pigmentoze (RP) kod sisara, koji obuhvataju primenu na oči sisara virusnih čestica rekombinantnih adeno-povezanih virusa (rAAV) koje sadrže vektor koji kodira miR-708. miR-708 cilja region u 3' neprevedenom regionu gena rodopsina i kao takav može suzbiti aktivnost mutiranog rodopsina povezanu sa RP. U nekim aspektima, obelodanjenje pruža postupke tretmana retinitis pigmentoze kod sisara, koji obuhvataju primenu na oči sisara virusnih čestica rekombinantnih adeno-povezanih virusa (rAAV) koje sadrže vektor koji kodira miR-708 i nukleinsku kiselinu divljeg tipa rodopsina. Kao takav, vektor može suzbiti aktivnost mutantnog rodopsina povezanog sa RP, dok istovremeno zamenjuje mutantni rodopsin rodopsinom divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin divljeg tipa ne uključuje 3' UTR cilj od miR-708, tako da će miR-708 ciljati samo eksprimiranje mutantnog rodopsina. Pronalazak pruža sastave koji sadrže rAAV čestice koje kodiraju miR-708 i rAAV čestice koje kodiraju rodopsin. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža sastave koji sadrže rAAV čestice koje kodiraju i miR-708 i rodopsin.
I. Opšte tehnike
[0037] Ovde opisane tehnike ili postupci se uglavnom dobro razumeju i uobičajeno se koriste konvencionalnom metodologijom od strane stručnjaka, kao što su, na primer, široko korišćene metodologije opisane u Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook i dr., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, i dr. eds., 2003); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987);
1
PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis i dr., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan i dr., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel i dr., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway i dr., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); i Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita i dr., eds., J.B. Lippincott Company, 2011).
II. Definicije
[0038] „Vektor“, kako se ovde koristi, odnosi se na rekombinantni plazmid ili virus koji sadrži nukleinsku kiselinu koja treba da se isporuči u ćeliju domaćina, bilo in vitro ili in vivo.
[0039] Izraz „polinukleotid“ ili „nukleinska kiselina“, kako se ovde koristi, odnosi se na polimerni oblik nukleotida bilo koje dužine, bili u pitanju ribonukleotidi ili dezoksiribonukleotidi. Prema tome, ovaj izraz uključuje, ali nije ograničen na, jedno-, dvo- ili višelančane DNK ili RNK, genomsku DNK, cDNK, DNK-RNK hibride ili polimer koji sadrži purinske i pirimidinske baze, ili druge prirodne, hemijske ili biohemijski modifikovane, neprirodne ili derivatizovane nukleotidne baze. Kičma polinukleotida može da sadrži šećere i fosfatne grupe (kao što se obično mogu naći u RNK ili DNK), ili modifikovane ili supstituisane grupe šećera ili fosfata. Alternativno, kičma polinukleotida može da sadrži polimer sintetičkih podjedinica poput fosforamidata, i tako može biti oligodezoksinnukleozid fosforamidat (P-NH2) ili mešoviti fosforamidat-fosfodiester oligomer. Pored toga, dvolančani polinukleotid se može dobiti iz jednolančanog polinukleotidnog proizvoda hemijske sinteze bilo sintetisanjem komplementarnog lanca i kalemljenjem lanaca u odgovarajućim uslovima, ili sintetizacijom komplementarnog lanca de novo koristeći DNK polimerazu sa odgovarajućim prajmerom.
[0040] Pojmovi „polipeptid“ i „protein“ se naizmenično koriste za označavanje polimera aminokiselinskih ostataka, i nisu ograničeni minimalnom dužinu. Takvi polimeri aminokiselinskih ostataka mogu da sadrže prirodne ili ne-prirodne aminokiselinske ostatke i uključuju, ali nisu ograničeni na, peptide, oligopeptide, dimere, trimere i multimere aminokiselinskih ostataka. Definicija obuhvata i proteine pune dužine, kao i njihove
2
fragmente. Izrazi takođe uključuju post-eksprimirajuće modifikacije polipeptida, na primer, glikozilaciju, sijaliliranje, acetilaciju, fosforilaciju i slično. Dalje, za potrebe predmetnog pronalaska, „polipeptid“ se odnosi na protein koji uključuje modifikacije, poput brisanja, dodavanja i supstitucija (uglavnom konzervativne prirode), nativnoj sekvenci, sve dok protein održava željenu aktivnost. Ove modifikacije mogu biti namerne, kao putem mutageneze usmerene na mesto, ili mogu biti slučajne, poput mutacija domaćina koji proizvode proteine ili greške usled PCR amplifikacije.
[0041] „Rekombinantni virusni vektor“ odnosi se na rekombinantni polinukleotidni vektor koji sadrži jednu ili više heterolognih sekvenci (tj., sekvenci nukleinske kiseline koje nisu virusnog porekla). U slučaju rekombinantnih AAV vektora, rekombinantna nukleinska kiselina je povezana sa najmanje jednom, poželjno sa dve, obrnute terminalne sekvence ponavljanja (ITR).
[0042] „Rekombinantni AAV vektor (rAAV vektor)“ odnosi se na polinukleotidni vektor koji sadrži jednu ili više heterolognih sekvenci (tj., sekvenca nukleinske kiseline koja nije AAV porekla), i koja su okružena najmanje jednom, poželjno sa dve, obrnute terminalne sekvence ponavljanja a (ITR). Takvi rAAV vektori se mogu replikovati i pakovati u zarazne virusne čestice kada su prisutne u ćeliji domaćinu koja je zaražena odgovarajućim virusom pomoćnikom (ili onim koji eksprimira odgovarajuće pomoćne funkcije) i koji eksprimira AAV rep i cap genske proizvode (tj. AAV Rep i Cap proteini). Kada se rAAV vektor ugradi u veći polinukleotid (npr., u hromozomu ili drugi vektor, kao što je plazmid korišćen za kloniranje ili transfekciju), tada se rAAV vektor može nazvati „pro-vektorom“ koji se može „spasiti“ replikacijom i inkapsidacijom u prisustvu AAV funkcije pakovanja i pogodne pomoćne funkcije. rAAV vektor može biti u bilo kom od više oblika, uključujući, ali ne ograničavajući se na, plazmide, linearne veštačke hromozome, kompleksirane sa lipidima, inkapsulirane unutar lipozoma, i, kako je najpoželjnije, inkapsidirane u virusnoj čestici, naročito u AAV čestici. rAAV vektor može da se pakuje u kapsid AAV virusa kako bi se generisala „rekombinantna adeno-povezana virusna čestica (rAAV čestica)“.
[0043] „Heterologno“ znači izvedeno iz genotipski različitog entiteta od ostatka entiteta sa kojim se upoređuje, ili u koji je uveden ili uklopljen. Na primer, polinukleotid uveden tehnikama genetskog inženjeringa u drugi tip ćelije je heterologni polinukleotid (i, kada se eksprimira, može da kodira heterologni polipeptid). Slično tome, ćelijska sekvenca (npr., gen ili njegov deo) koji je ugrađena u virusni vektor je heterologna nukleotidna sekvenca u odnosu na vektor.
[0044] Izraz „transgen“ odnosi se na polinukleotid koji se uvodi u ćeliju, i koji je sposoban da bude transkribovan u RNK i opciono, preveden i/ili eksprimiran pod odgovarajućim uslovima. U aspektima, on daje željeno svojstvo ćeliji u koju je uveden, ili na neki drugi način vodi do željenog terapijskog ili dijagnostičkog ishoda. U drugom aspektu, on se može transkribovati u molekul koji posreduje RNK interferenciju, kao što je siRNK.
[0045] Izrazi „genomske čestice (gp),“ „genomski ekvivalenti“ ili „kopije genoma“, kako se koriste u vezi sa virusnim titrom, odnose se na broj viriona koji sadrže rekombinantni AAV DNK genom, bez obzira na infektivnost ili funkcionalnost. Broj čestica genoma u određenom vektorskom preparatu može se meriti postupcima kao što je opisano u ovde navedenim primerima, ili, na primer, kod Clark i dr. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk i dr. (2002) Mol. Ther., 6:272-278.
[0046] Izrazi „infektivna jedinica (tu)“, „infektivna čestica“ ili „jedinica za replikaciju“, kako se koristi u vezi sa titrom virusa, odnose se na broj rekombinantnih AAV čestica vektora sposobnih za replikaciju, mereno testom infektivnog centra, koji takođe poznat kao centar za replikaciju, kao što je opisano, na primer, kod McLaughlin i dr. (1988) J. Virol., 62:1963-1973.
[0047] Izraz „jedinica za transdukciju (tu)“, kako se koristi u vezi sa virusnim titrom, odnosi se na broj infektivnih rekombinantnih AAV vektorskih čestica koje rezultuju proizvodnjom funkcionalnog transgenskog proizvoda, mereno funkcionalnim testovima, kao što je opisano u primerima ovde, ili na primer, kod Xiao i dr. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; ili kod Fisher i dr. (1996) J. Virol., 70:520-532 (LFU test).
[0048] Sekvenca „obrnutog terminalnog ponavljanja“ ili „ITR“ je izraz koji je dobro poznat u struci i odnosi se na relativno kratke sekvence koje su otkrivene na terminusima virusnih genoma koji su suprotne orijentacije.
[0049] Sekvenca „AAV invertnog terminalnog ponavljanja (ITR)“, izraz koji je dobro poznat u struci, je približno 145-nukleotidna sekvenca koja je prisutna na oba terminusa nativnog jednolančanog AAV genoma. Spoljni 125 nukleotidi od ITR mogu biti prisutni u bilo kojoj od dve alternativne orijentacije, što dovodi do heterogenosti između različitih AAV genoma i između dva kraja jednog AAV genoma. Spoljni 125 nukleotidi takođe sadrže nekoliko kraćih regiona samo-komplementarnosti (koji su označeni kao A, A', B, B', C, C' i D regioni), omogućujući da se unutar ovog dela ITR dogodi međulančano bazno uparivanje.
[0050] „Sekvenca terminalne rezolucije“ ili „trs“ je sekvenca u D regionu AAV ITR koja se razdvaja od strane AAV rep proteina tokom virusne replikacije DNK. Mutantna sekvenca terminalne rezolucije refraktorna je za razdvajanje od strane AAV rep proteina.
[0051] „Pomoćni virus“ za AAV odnosi se na virus koji omogućava da se AAV (koji je defektivan parvovirus) replikuje i upakuje od strane ćelije domaćina. Identifikovan je veći broj takvih pomoćnih virusa, uključujući adenoviruse, herpesviruse i poksviruse, kao što su vakcinije. Adenovirusi obuhvataju više različitih podgrupa, mada se najčešće koristi Adenovirus tipa 5 podgrupe C (Ad5). Poznati su brojni adenovirusi ljudskog, sisarskog i ptičjeg porekla, koji su dostupni iz biblioteka kao što je ATCC. Virusi porodice herpesa, koji su takođe dostupni iz biblioteka kao što je ATCC, uključuju, na primer, herpes simpleks viruse (HSV), Epstein-Barr viruse (EBV), citomegaloviruse (CMV) i viruse pseudo-besnila (PRV).
[0052] „Procentualna (%) identičnost sekvence“ u odnosu na referentni polipeptid ili sekvencu nukleinskih kiselina je definisan kao procenat aminokiselinskih ostataka ili nukleotida u sekvenci kandidatu koji su identični sa aminokiselinskim ostacima ili nukleotidima u referentnom polipeptidu ili nukleinskoj kiselini sekvence, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, kako bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, dok se konzervativne supstitucije ne uzimaju u obzir kao deo identičnosti sekvence. Usklađivanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselina ili nukleinskih kiselina može se postići na različite načine koji su poznati u struci, na primer, korišćenjem javno dostupnih računarskih programa, na primer, opisanih u Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel i dr., eds., 1987), Supp.30, section 7.7.18, Table 7.7.1, uključujući BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Poželjni program za prilagođavanje je ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pennsylvania). Oni koji poznaju ovu oblast mogu odrediti odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući bilo koje algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja po celoj dužini sekvence koja se upoređuje. Za potrebe ovde, % identičnosti aminokiselinske
2
sekvence date aminokiselinske sekvence A, sa ili odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B (što se alternativno može reći kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određen % identičnosti aminokiselinske sekvence sa ili odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način: 100 puta razlomak X/Y, gde je X broj aminokiselinskih ostataka koji su određeni da imaju potpunu podudarnost uz pomoć programa za poravnjanje sekvenci prilikom poravnanje A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Podrazumevaće se da kada dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti aminokiselinske sekvence između A i B neće biti jednak % identičnosti aminokiselinske sekvence između B i A. Za potrebe ovde, identičnost nukleinske kiseline date sekvence C sa ili odnosu na datu sekvencu nukleinske kiseline D (što se alternativno može reći kao data sekvenca nukleinske kiseline C koja ima ili sadrži određen % identičnosti aminokiselinske sekvence sa ili odnosu na datu sekvencu nukleinske kiseline D izračunava se na sledeći način: 100 puta razlomak W/Z, gde je W broj nukleotida koji su određeni da imaju potpunu podudarnost uz pomoć programa za poravnjanje sekvenci prilikom poravnanje C i D u tom programu, i gde je Z ukupan broj nukleotida u D. Podrazumevaće se da kada dužina sekvence nukleinske kiseline C nije jednaka dužini sekvence nukleinske kiseline D, % identičnosti sekvence nukleinske kiseline između C i D neće biti jednak % identičnosti sekvence nukleinske kiseline D i C.
[0053] „Izolovani“ molekul (npr., nukleinska kiselina ili protein) ili ćelija znači da je identifikovana i odvojena i/ili izvađena iz komponente svog prirodnog okruženja.
[0054] „Efikasna količina“ je količina dovoljna za postizanje korisnih ili željenih rezultata, uključujući kliničke rezultate (npr. ublažavanje simptoma, postizanje kliničkih krajnjih tačaka i slično). Efikasna količina može se primeniti iz jednom ili više primena. U pogledu stanja bolesti, efikasna količina je količina dovoljna da ublaži, stabilizuje ili odloži razvoj bolesti.
[0055] „Pojedinac“ ili „pacijent“ je sisar. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, domaće životinje (npr., krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr., ljude i primate koji nisu ljudi, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr., miševe i pacove). U nekim otelotvorenjima, pojedinac ili pacijent je čovek.
[0056] Kako se ovde koristi, „tretman“ je pristup za dobijanje korisnih ili željenih kliničkih rezultata. U svrhu predmetnog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, ublažavanje simptoma, smanjenje obima bolesti, stabilizovanje (npr., prestanak pogoršanja) stanja bolesti, sprečavanje širenja (npr. metastaze) bolesti, odlaganje ili usporavanje napredovanja bolesti, poboljšanje ili ublažavanje bolesnog stanja i remisija (bilo delimična ili totalna), bilo primetna ili neprimetna. „Tretman“ takođe može značiti produženje preživljavanja u poređenju sa očekivanim preživljavanjem u izostanku tretmana.
[0057] „Retinitis pigmentoza (RP)“ se odnosi na heterogenu grupu bolesti koju karakteriše progresivni gubitak vida. Simptomi uglavnom potiču od degeneracije ili abnormalnosti mrežnjače, što može uključivati i gubitak funkcije fotoreceptorskih ćelija.
[0058] „Rodopsin“ se odnosi na člana porodice receptora povezanih G-proteinom koji ima funkciju u percepciji svetlosti u fotoreceptorskim štapićastim ćelijama mrežnjače. Vizualni pigment rodopsin sadrži polipeptidni opsin koji se reverzibilno vezuje za svoju ko-faktor mrežnjače. Svetlost izaziva izomerizaciju mrežnjače od 11-cis do all-trans oblika. To zauzvrat izaziva konformacionu promenu polipeptida što dovodi do aktiviranja G-proteina. Pretvaranjem prisustva svetlosti u biohemijski odgovor, rodopsin omogućava vizuelnu percepciju. Njegova funkcija je potrebna za skotopični vid (tj., bezbojni vid pri slabom svetlu), i takođe se smatra da je potrebna za sposobnost preživljavanja fotoreceptorskih ćelija.
[0059] Kako se ovde koristi, „rodopsin“ se može odnositi na ceo vizuelni pigment koji uključuje mrežnjaču ili prosto komponentu aminokiseline ili sekvencu molekula. Rodopsin takođe može biti poznat i kao OPN2, Opsin-2 ili RP4. Primeri rodopsin proteina mogu bez ograničenja uključivati ljudski, mišji, pseći i mačji rodopsin, npr., NCBI referentne sekvence NP_000530, NP_663358, NP_001008277 i NP_001009242. Primeri gena rodopsina mogu bez ograničenja uključivati ljudske, mišje, pseće i mačje gene rodopsina, npr., GenBank Entrez Gene ID 6010 (RHO, takođe poznat kao RP4, OPN2, i CSNBAD1), GenBank Entrez Gene ID 212541 (Rho, takođe poznat kao Ops, RP4, Opn2, i Noerg1), GenBank Entrez Gene ID 493763, i GenBank Entrez Gene ID 493762. Izraz rodopsin kako se ovde koristi takođe uključuje funkcionalne ekvivalente rodopsina (npr., varijante rodopsina), uključujući mutacije, skraćenja, brisanja i/ili umetanja, pod uslovom da funkcionalni ekvivalent održava bar deo aktivnosti rodopsina divljeg tipa kako bi poboljšao simptome retinitis pigmentoze.
[0060] Kako se ovde koristi, „refraktorno“ se odnosi na otpornost na modulaciju. Na primer,
2
gen rodopsina koji je refraktoran na suzbijanje od strane miR-708 je suštinski ili potpuno otporan na suzbijanje od strane miR-708.
[0061] „Promoter opsina“ odnosi se na polinukleotidnu sekvencu dobijenu iz gena opsina (npr., mišji opsin) koji posebno eksprimira fotoreceptorske štapićaste ćelije (npr., fotoreceptorske štapićaste ćelije). Kako se ovde koristi, „promoter opsina“ može da se odnosi na čitavu promotersku sekvencu ili fragment promoterske sekvence koji je dovoljan da pokrene eksprimiranje specifično za štapić, kao što su sekvence opisane kod Quiambao, A.B., i dr. (1997) Vis. Neurosci.14(4):617-25 i Le, Y.Z., i dr. (2006) Mol. Vis.12:389-98. U nekim otelotvorenjima, promoter opsina sadrži 676bp fragment koji kodira 400bp CMV pojačivač uzvodno od dela sekvence promoter opsina (-500bp - 15bp). Pored toga, uključena je 65bp NRL sekvenca; ona kodira neuronskog baznog zatvarača mrežnjače (faktor transkripcije specifičan za fotoreceptor čepića).
[0062] „Rodopsin kinaza (RK promoter“) se odnosi na polinukleotidnu sekvencu izvedenu iz gena rodopsin kinaze (npr., ljudski RK, predstavljen pomoću GenBank Entrez Gene ID 6011) koji pokreće eksprimiranje posebno u fotoreceptorskim ćelijama štapića i čepića, kao i ćelijskim linijama mrežnjače, kao što je WERI Rb-1. Kako se ovde koristi, „promoter rodopsin kinaze“ može da se odnosi na celokupnu promotersku sekvencu ili fragment promoterske sekvence koji je dovoljan za pokretanje eksprimiranja specifičnog za fotoreceptore, kao što su sekvence opisane kod Khani, S.C., i dr. (2007) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.48(9):3954-61 i Young, J.E., i dr. (2003) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.44(9):4076-85. U nekim otelotvorenjima, RK promoter se kreće od - 112 do 180 u odnosu na početno mesto transkripcije.
[0063] „miR-708“ se odnosi na polinukleotidnu sekvencu mikro-RNK (miRNK) koja sadrži matične sekvence i sekvence petlji, kao što je prikazano na SLICI 4. Primeri miR-708 polinukleotida mogu bez ograničenja uključivati ljudski, mišji, pseći i mačji miR-708, npr., kako je predstavljeni pomoću GenBank Entrez Gene ID 100126333, 735284, i 100885899. miRNK su mali, nekodirajući RNK molekuli koji regulišu eksprimiranje gena (npr., redukcijom transkripta gena) koji sadrži ciljano mesto prepoznato od strane miRNK ( Bartel, D.P. (2004) Cell 116(2):281-97). Poznato je da je miR-708 indukovan od strane CHOP, i može biti uključen u regulisanje eksprimiranja rodopsina (Behrman, S., i dr. (2011) J. Cell Biol. 192(6):919-27). Kako se ovde koristi, „miR-708“ može da se odnosi na preradjeni miR-
2
708 polinukleotid ili bilo koji međuproizvod u procesu prerade, npr., pri-miRNK ili premiRNK. Kako se ovde koristi, „miR-708“ može da se odnosi na DNK sekvencu koja je transkribovana kako bi se dobila miR-708 RNK, ili sama RNK sekvenca.
[0064] Pozivanje na „otprilike“ vrednost ili parametar ovde sadrži (i opisuje) otelotvorenja koje su usmerene na tu vrednost ili parametar per se. Na primer, opis koji se odnosi na „oko X“ uključuje opis „X.“
[0065] Kako se ovde koristi, oblici jednine uključuju i oblike množine, osim ako nije drugačije naznačeno.
[0066] Podrazumeva se da ovde opisani aspekti i otelotvorenja predmetnog pronalaska uključuju „sadrži,“ „sastoji se,“ i/ili „ se sastoji pretežno od“ aspekata i otelotvorenja`.
III. Retinitis pigmentoza i njeni eksperimentalni modeli
[0067] Kao što je gore opisano, retinitis pigmentoza (RP) se odnosi na grupu degenerativnih očnih bolesti koje mogu prouzrokovati progresivni gubitak vida, uključujući gubitak noćnog vida, gubitak perifernih vidnih polja i potpuno slepilo. U Americi se smatra da je učestalost RP približno 1 od 4.000 ljudi. RP se često nasleđuje, i opisani su autosomno dominantni, autosomno recesivni i X-povezan poremećaji RP. Mutacije u više od 50 različitih gena povezane su sa RP, uključujući komponente uključene u kaskadu fototransdukcije, retinalni ciklus i faktori splajsovanja, kao i preko 100 različitih mutacija u samom rodopsinu. U mnogim slučajevima mutacije povezane sa RP dovode do gubitka fotoreceptorske funkcije štapića i/ili ćelijske smrti. Ovaj gubitak rezultuje smanjenim skotopičnim vidom i može se manifestovati kao noćno slepilo ili smanjen periferni vid. Smrt štapićastih ćelija takođe je povezana sa naknadnom smrću čepićastih ćelija, uzrokujući gubitak vida visoke oštrine i, u kombinaciji sa smrti ćelija, slepilo.
[0068] Utvrđeni su različiti modeli ćelija i životinja zasnovani na ispitivanju ćelijske osnove RP i ispitivanju eksperimentalnih tretmana. Jedan ćelijski model za RP su kultivisane ćelije pigmentovanog epitela ljudske mrežnjače (RPE) (Adamowicz, M., i dr. (2012) Adv. Exp. Med. Biol.723:573-9). Ovaj model se može koristiti za eksprimiranje mutiranih proteina koji su uključeni kod RP i testiranje efekta ovih mutacija na funkciju proteina, ili efekat mutiranih proteina na funkciju i/ili održivost ćelija. Na primer, ljudski divlji tip i mutantni rodopsin
2
mogu se eksprimirati, koristeći bilo koji odgovarajući promoter (npr., CMV). Bez želje da se vezuje za teoriju, smatra se da pogrešno savijanje opsin polipeptida rezultuje zadržavanjem i stresom ER, indukcijom odgovora nesavijenih proteina (UPR), i povećanjem ćelijske smrti. Ovaj model se može koristiti za ispitivanje efekta bilo koje mutacije koja je povezana sa RP, na primer mutacije rodopsina kao što je P23H.
[0069] RP modeli zasnovani na životinjama mogu uključivati miševe koji sadrže mutacije za koje se sumnja da mogu izazvati RP kod miševa, ili mutacije koje su ortološke onima koje postoje kod ljudi. U nekim otelotvorenjima, mišji modeli mogu uključivati miševe konstruisane da eksprimiraju rodopsin, na primer mutirani ljudski ili mišji oblik, u fotoreceptorskim ćelijama. Primeri mišjih modela uključuju rodopsin P347S miša (Li, T., i dr. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci.93(24):14176-81), Rho-/- miša (Humphries, M.M., i dr. (1997) Nat. Genet.15(2):216-9), i miša koji eksprimira P23H mutantni rodopsin („P23H miš“) (Olsson, J.E., i dr. (1992) Neuron 9(5):815-30). Kod P23H miša, mutirani ljudski rodopsin može biti ubačen u mišju germliniju. Može se koristiti bilo koji promoter poznat u struci kako bi se eksprimirao u fotoreceptorskim ćelijama (npr., mišji opsin ili ljudski RK promoter). U nekim otelotvorenjima, rodopsin se može eksprimirati korišćenjem AAV vektora.
[0070] Takođe se mogu koristiti i drugi životinjski modeli za RP. Pored mišjih modela, mogu se koristiti i modeli pacova, pasa, svinja, žaba (Tam, B.M. and Moritz, O.L. (2006) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.47(8):3234-41), i primata koji nisu ljudi.
IV. Postupci tretmana retinitis pigmentoze
[0071] U nekim aspektima, obelodanjenje pruža postupke i sastave za tretman retinitis pigmentoze kod sisara, koji sadrži primenu sisaru (npr. Na mrežnjaču) efikasne količine virusnih rAAV čestica koje sadrži vektor koji kodira miR-708. Postupci se mogu koristiti za tretman čoveka koji ima RP, za poboljšanje patologija i oštećenja vida povezanih sa RP. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje uključuje primenu efikasne količine rAAV virusnih čestica koje sadrže vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin (npr., normalni ili rodopsin divljeg tipa). U nekim otelotvorenjima, miR-708 služi za suzbijanje aktivnosti mutiranog rodopsina povezanog sa RP. U nekim otelotvorenjima, normalan ili rodopsin divlji tip služi za dopunu oka sa funkcionalnim rodopsinom. U nekim otelotvorenjima, virusna čestica obuhvata AAV serotip 5 kapsid (AAV5 kapsid) i AAV 2 ili
2
AAV 5 obrnuta terminalna ponavljanja. U nekim otelotvorenjima, virusna čestica obuhvata AAV serotip 5 tirozin mutantni kapsid AAV 2 ili AAV 5 obrnuta terminalna ponavljanja.
[0072] U nekim aspektima, obelodanjenje pruža postupke i sastave za ublažavanje simptoma RP, koji sadrže primenu sisaru efikasne količinu rAAV virusnih čestica koje sadrže vektor koji kodira miR-708. U drugim aspektima, obelodanjenje pruža postupke i sastave za ublažavanje simptoma RP, koji sadrže primenu sisaru efikasnu količine rAAV virusnih čestica koje sadrže vektor koji kodira miR-708 i rodopsin. U nekim otelotvorenjima simptomi RP uključuju, ali nisu ograničeni na, slepilo, noćno slepilo, smanjen periferni vid i gubitak vida visoke oštrine. U nekim otelotvorenjima, tretman retinitis pigmentoze obuhvata smanjenje ili sprečavanje simptoma povezanih sa retinitis pigmentozom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, postupke sprečavanja degeneracije mrežnjače, postupke za zaustavljanje progresije RP, postupke za povećanje funkcije fotoreceptora i slično. Simptomi i/ili patologije RP uključuju, ali nisu ograničeni na gubitak vida, gubitak noćnog vida, gubitak perifernih vidnih polja, gubitak funkcije ERG; gubitak oštrine vida i osetljivosti na kontrast; gubitak vizuelno vođenog ponašanja, smanjenje fotoreceptorske funkcije štapića, smrt fotoreceptorskih štapićastih ćelija, smanjenje skotopičnog vida, smanjenje promena u ćelijama mrežnjače (gubitak fotoreceptorske strukture ili funkcije; stanjivanje ili zadebljanje spoljnog nuklearnog sloja (ONL); stanjivanje ili zadebljanje spoljnog pleksiformni sloj (OPL); dezorganizacija praćena gubitkom spoljašnjih segmenata štapića i čepića; skraćenje unutrašnjih segmenata štapića i čepića; povlačenje dendrita bipolarnih ćelija; stanjivanje ili zadebljanje unutrašnjih slojeva mrežnjače, uključujući unutrašnji nuklearni sloj, unutrašnji pleksiformni sloja, sloj ganglijskih ćelija i sloj nervnih vlakana; loša lokalizacija opsina; prekomerno eksprimiranje neurofilamenata i slično. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke za sprečavanje propadanja funkcije štapićastih ćelija i smrti štapićastih ćelija i funkcije kupastih ćelija i smrti kupastih ćelija.
[0073] U nekim aspektima, obelodanjenje pruža postupke za sprečavanje ili odlaganje napredovanja RP. Autosomni dominantni RP je genetska bolest koja se može genotipizovati. Početak i progresija RP mogu se odrediti tomografijom optičke koherencije (OCT) koja omogućava ispitivanje nepravilnosti spoljnog pleksiformnog sloja (OPL).
[0074] Načini za određivanje ublažavanja simptoma RP poznati su u struci. Na primer, merenje vidnih polja (npr. Goldmann-ova vidna polja), određivanje elektroretinograma
2
(ERG), fundus fotografije, tomografija optičke koherencije i fluoresceinska angiografija. Poboljšanja ponašanja na koje utiče vid mogu se takođe koristiti za određivanje ublažavanja simptoma RP; na primer, izjave poput „mogu da pronađem stvari koje padaju“, „mogu da vidim lica tokom večere sa svećama“, „mogu da vidim pruge na majici“, „noću mogu da vidim zvezde“, „mogu čitam uobičajene knjige i sedim napred u učionici“, „sada mogu da igram fudbal i ne treba mi neko pored mene da mi pomogne da pronađem loptu“, „mogu da vozim bicikl po svom kvartu sam“, „ostvario sam svoj san: video sam kako moja ćerka udara houmran, i „kada mogu da mi daju injekciju u drugo oko?“
[0075] U nekim aspektima, postupci i sastavi se koriste za tretman ljudi sa RP. RP se može naslediti na autosomno dominantan, autosomno recesivan ili X-povezan način. X-povezan RP može biti recesivan, koji pogađa prvenstveno samo muškarce, ili dominantan, koji pogađa i muškarce i žene. RP može biti prouzrokovan mutacijama u rho genu koji kodira protein rododopina. U nekim otelotvorenjima obelodanjenja, postupci se koriste za tretman ljudi sa mutacijom u rho genu i/ili rodopsin proteinu. U nekim otelotvorenjima mutacija rodopsin proteina je P23H mutacija (zamena histidina prolinom u aminokiselinskom ostatku 23 rodopsin proteina). U drugim otelotvorenjima, mutacija rodopsin proteina je T58R, P347L ili P347S, ili brisanja ostatka 1255. Mutacije povezane sa retinitis pigmentozom pružene su od strane McWilliam, P, i dr., (1989) Genomics 5:619-622; Dryja, TP i dr., (1990) Nature 343:364-266; Farrar, GJ i dr., (1990) Genomics 8:35-40; Farrar, GJ i dr., (2002) EMBO J. 21:857-864.
[0076] miR-708 je CHOP regulisana mikro RNK koja reguliše eksprimiranje rodopsina (Behrman, S., i dr. (2011) J. Cell Biol.192(6):919-27). miR-708 je intronska mikro RNK koja živi unutar CHOP inducibilnog gena Odz4 (Tenurin-4). CHOP reguliše eksprimiranje miR-708 tokom ER stresa. Postoji pretpostavljena miR-708 sekvenca u 3' UTR od gena rodopsina koji je visoko očuvan (pogledati Sliku 4 kod Behrman i dr., ibid)
[0077] U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke za tretman čoveka koji ima RP. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke za tretman čoveka koji ima autosomnu dominantnu RP. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke za tretman čoveka koji ima RP koja je povezan sa mutacijom gena rodopsina. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupak za tretman čoveka koji ima RP primenom efikasne količine AAV vektora koji kodira miR-708 za suzbijanje aktivnosti mutiranog rodopsina. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke za tretman sisara (npr., psa ili mačke) sa RP. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina miR-708 može bez ograničenja uključivati nukleinsku kiselinu predstavljenu sa GenBank Entrez Gene ID 100126333, 735284, or 100885899.
[0078] U nekim otelotvorenjima, suzbijanje mutantnog rodopsina je dopunjeno primenom efikasne količine AAV vektora koji kodira divlji tip rodopsina ili rodopsina sa aktivnostima u osnovi jednakim divljem tipu rodopsina. U nekim otelotvorenjima, rodopsin je ljudski rodopsin. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupak za tretman čoveka koji ima RP primenom efikasne količine AAV vektora koji kodira miR-708 za suzbijanje aktivnosti mutiranog rodopsina i efikasne količine AAV vektora koji kodira ljudski rodopsin sa aktivnostima divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima, AAV vektor koji kodira miR-708 i AAV vektor koji kodira ljudski rodopsin isti su AAV vektor. U nekim otelotvorenjima, AAV vektor koji kodira miR-708 i AAV vektor koji kodira ljudski rodopsin su različiti AAV vektori. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin može bez ograničenja uključivati nukleinsku kiselinu koju pružaju NCBI referentne sekvence NP_000530, NP_663358, NP_001008277 i NP_001009242.
[0079] U nekim aspektima, obelodanjenje pruža postupke tretmana stresa endoplazmatičnog retikuluma (ER) u ćeliji koja sadrži primenu sisaru rAAV virusne čestice koja sadrži rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708. U nekim otelotvorenjima ćelija je ćelija oka. U narednim otelotvorenjima, ćelija je fotoreceptorska ćelija. U kasnijim otelotvorenjima, ćelija je fotoreceptorska štapićasta ćelija. U nekim otelotvorenjima, postupak uključuje smanjenje jednog ili više ćelijskih markera ER stresa. U narednim otelotvorenjima, jedan ili više ćelijski marker ER stresa su splajsovani XBP-1, CHOP ili Grp78. U nekim otelotvorenjima, rAAV vektor sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708, i dalje sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin. U drugim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupke za tretman stresa endoplazmatičnog retikuluma (ER) u ćeliji koja sadrži primenu sisaru prvog rAAV vektora koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i druge rAAV virusne čestice koja sadrži drugi rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin.
[0080] U nekim aspektima, obelodanjenje pruža postupke za isporuku miR-708 ili miR-708 i rodopsina sisaru koji ima RP, gde postupak uključuje primenu na mrežnjaču sisara efikasne
1
količine rAAV virusnih čestica koje sadrže vektor koji kodira miR-708 i/ili rodopsin.
Primena isporučuje transgeni proizvod fotoreceptorskim ćelijama, gde miR-708 i/ili rodopsin posreduju povoljno dejstvo na fotoreceptorsku ćeliju i okolne fotoreceptorske ćelije. U nekim otelotvorenjima, isporuka AAV virusnih čestica u mrežnjaču vrši se isporukom injekcijom virusnih čestica u sub-retinalni prostor mrežnjače. U nekim otelotvorenjima, isporuka AAV čestica u mrežnjaču se vrši intravitrealnim primenom pod uslovom da AAV čestica može probiti do zadnjeg dela oka i transdukovati fotoreceptorske ćelije. U nekim otelotvorenjima, AAV čestice se primenjuju na jednoj ili više mesta u sub-retinalnom prostoru mrežnjače.
[0081] U nekim otelotvorenjima, primena na mrežnjači efikasne količine rAAV virusnih čestica koje sadrže vektor koji kodira miR-708 i/ili rodopsin transdukuje fotoreceptorske ćelije na ili u blizini mesta primene. U nekim otelotvorenjima, više nego otprilike 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ili 100% fotoreceptorskih ćelija se transdukuje. U nekim otelotvorenjima, oko 5% do oko 100%, oko 10% do oko 50%, oko 10% do oko 30%, oko 25% do oko 75%, oko 25% do oko 50%, ili oko 30% do oko 50% fotoreceptorskih ćelija se transdukuje. Postupci za identifikovanje fotoreceptorskih ćelija koje se prenose pomoću AAV koji eksprimira miR-708 i/ili rodopsin su poznati u struci; na primer, imunohistohemija ili upotreba markera kao što je pojačani zeleni fluorescentni protein, mogu se koristiti za detektovanje eksprimiranja miR-708 i/ili rodopsina.
[0082] U nekim otelotvorenjima obelodanjenja, postupci sadrže primenu mrežnjači (npr., subretinalni prostor) sisara efikasne količina virusnih AAV čestica koje sadrže vektor koji kodira miR708 i/ili rodopsin za tretman sisara, npr., čoveka, koji ima RP. U nekim otelotvorenjima, sastav se isporučuje injekcijom u jedan ili više subretinalnih prostora kako bi se omogućilo eksprimiranje miR-708 i/ili rodopsina u fotoreceptorskim ćelijama. U nekim otelotvorenjima, sastav se isporučuje injekcijom u bilo koju od jedne, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset ili više od deset lokacija u subretinalnom prostoru mrežnjače.
[0083] U nekim otelotvorenjima rAAV virusne čestice se primenjuju na više mesta istovremeno ili sekvencijalno. U nekom otelotvorenju, višestruke injekcije rAAV virusnih čestica nisu razmaknute više od jednog sata, dva sata, tri sata, četiri sata, pet sati, šest sati, devet sati, dvanaest sati ili 24 sata.
2
[0084] U nekim otelotvorenjima, prve rAAV virusne čestice koje kodiraju miR-708 i druge rAAV virusne čestice koje kodiraju rodopsin primenjuju se na jednom ili više mesta istovremeno ili sekvencijalno. U nekom otelotvorenju, višestruke injekcije rAAV virusnih čestica nisu razmaknute više od jednog sata, dva sata, tri sata, četiri sata, pet sati, šest sati, devet sati, dvanaest sati ili 24 sata. U nekim otelotvorenjima, prve rAAV virusne čestice koje kodiraju miR-708 primenjuju se pre nego što se primene druge rAAV virusne čestice koje kodiraju rodopsin. U nekim otelotvorenjima, prve rAAV virusne čestice koje kodiraju miR-708 primenjuju se posle primene drugih rAAV virusnih čestica koje kodiraju rodopsin.
[0085] U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupak za tretman čoveka koji ima RP primenom efikasne količine farmaceutskog sastava koja obuhvata AAV vektor koji kodira miR-708 za suzbijanje aktivnosti mutiranog rodopsina. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža postupak za tretman čoveka koji ima RP primenom efikasne količine farmaceutskog sastava koji obuhvata AAV vektor koji kodira miR-708 za suzbijanje aktivnosti mutiranog rodopsina i efikasne količine farmaceutskog sastava koji obuhvata AAV vektor koji kodira rodopsin kao dodatak fotoreceptorima sa divljim tipom rodopsin aktivnosti. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav koji obuhvata AAV vektor koji kodira miR-708 i farmaceutski sastav koji obuhvata AAV vektor koji kodira ljudski rodopsin su isti farmaceutski sastav. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav koji obuhvata AAV vektor koji kodira miR-708 i farmaceutski sastav koji obuhvata AAV vektor koji kodira ljudski rodopsin su različiti farmaceutski sastavi. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.
[0086] U nekim otelotvorenjima ovog obelodanjenja, zapremina smeše koja se isporučuje injekcijom u subretinalni prostor mrežnjače ili intravitrealno je veća za otprilike 1 µl, 2 µl, 3 µl, 4 µl, 5 µl, 6 µl, 7 µl, 7 µl, 8 µl, 9 µl, 10 µl, 15 µl, 20 µl, 25 µl, 50 µl, 75 µl, 100 µl, 200 µl, 300 µl, 400 µl, 500 µl, 600 µl, 700 µl, 800 µl, 900 µl ili 1 mL, ili bilo koje količine između njih.
[0087] Sastavi predmetnog pronalaska (npr. AAV virusne čestice koje sadrže vektor koji kodira miR-708 i/ili rodopsin) mogu se koristiti bilo sami ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa za tretman RP. Interval između uzastopne primene može biti u najmanje (ili, alternativno, manji od) minuta, sata ili dana.
V. Konstrukti eksprimiranja
[0088] U nekim otelotvorenjima, transgen (npr. miRNA 708 i/ili rodopsin) je operativno povezan sa promoterom. Primeri promotera uključuju, ali nisu ograničeni na, citomegalovirus (CMV) neposredni rani promoter, RSV LTR, MoMLV LTR, promoter fosfoglicerat kinaze-1 (PGK), promoter simijanskog virusa 40 (SV40) i CK6 promoter, transtretretinski promoter (TTR), TK promoter, promoter koji reaguje na tetraciklin (TRE), HBV promoter, hAAT promoter, LSP promoter, himerni promoter specifičan za jetru (LSP), E2F promoter, promoter telomeraze (hTERT) ; pojačivač citomegalovirus/kokošiji beta-aktin/promoter zečjeg β-globina (CAG promoter; Niwa i dr., Gene, 1991, 108(2):193-9) i promotera faktora produženja 1-alfa (EFl-alfa) promotera (Kim i dr., Gene, 1990, 91(2):217-23 and Guo i dr., Gene Ther., 1996, 3(9):802-10). U nekim otelotvorenjima, promoter sadrži ljudski promoter β-glukuronidaze ili pojačivač citomegalovirusa povezan sa promoterom kokošijeg β-aktina (CBA). Promoter može biti konstitutivni, inducibilni ili represivni promoter. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža AAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708, koja je operativno povezan sa CBA promoterom. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža AAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin (npr., ljudski rodopsin) operativno povezan sa CBA promoterom. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža AAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin (npr., ljudski rodopsin) operativno povezan sa CBA promoterom.
[0089] U nekim otelotvorenjima, promoter je sposoban da eksprimira transgene u fotoreceptorskim ćelijama. U otelotvorenjima, promoter je promoter rodopsin kinaze (RK); npr., ljudski RK promoter. U nekim otelotvorenjima, promoter je promoter opsina; npr., ljudski promoter opsina ili mišji promoter opsina.
[0090] U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža AAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708, koja je operativno povezana sa RK promoterom. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža AAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin (npr. ljudski rodopsin) operativno povezan sa RK promoterom. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža AAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i rodopsin (na primer, ljudski rodopsin) operativno povezan sa RK promoterom. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je 5' do nukleinske kiseline koja kodira rodopsin. U drugim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je
4
3' do nukleinske kiseline koja kodira rodopsin. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža AAV vektor koji sadrži miR-708 nukleinsku kiselinu, koja je operativno povezana sa prvim RK promoterom i nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa drugim RK promoterom. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 operativno povezana sa prvim RK promoterom je 5' do nukleinske kiseline koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa drugim RK promoterom. U ostalim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708, koja je operativno povezana sa prvim RK promoterom je 3' od nukleinske kiseline koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa drugim RK promoterom. U nekim otelotvorenjima, miR-708 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 1. U nekim otelotvorenjima, miR-708 sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 1. U nekim otelotvorenjima, rodopsin sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2. U nekim otelotvorenjima, rodopsin sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenca SEQ ID NO: 2. U nekim otelotvorenjima, rodopsin je funkcionalni ekvivalent divljeg tipa rodopsina. U nekim otelotvorenjima, eksprimiranje rodopsina iz AAV vektora je refraktorno prema suzbijanju od strane miR-708. U nekim otelotvorenjima, nukleinskoj kiselini koja kodira rodopsin nedostaje ciljano mesto miR-708 u 3' UTR od gena rodopsina. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin sadrži mutaciju (npr., brisanje, zamena, umetanje, itd.) u ciljanom mestu miR-708 u 3' UTR od gena rodopsina, tako da je refraktorna prema suzbijanju od strane miR-708.
[0091] U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža AAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708, koja je operativno povezana sa promoterom opsina. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža AAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin (npr., ljudski rodopsin) koja je operativno povezana sa promoterom opsina. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža AAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin (npr., ljudski rodopsin), koja je operativno povezana sa promoterom opsina. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je 5' do nukleinske kiseline koja kodira rodopsin. U drugim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je 3' do nukleinske kiseline koja kodira rodopsin. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža AAV vektor koji sadrži miR-708 nukleinsku kiselinu, koja je operativno povezana sa prvim promoterom opsina i nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa drugim promoterom opsina. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708, koja je operativno povezana sa prvim promoterom opsina, je 5' od nukleinske kiseline koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa drugim promoterom opsina. U drugim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708, koja je operativno povezana sa prvim promoterom opsina je 3' od nukleinske kiseline koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa drugim promoterom opsina. U nekim otelotvorenjima, miR-708 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 1. U nekim otelotvorenjima, miR-708 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 1. U nekim otelotvorenjima, miR-708 sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 1. U nekim otelotvorenjima, rodopsin sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2. U nekim otelotvorenjima, rodopsin sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO: 2. U nekim otelotvorenjima, rodopsin je funkcionalni ekvivalent divljeg tipa rodopsina. U nekim otelotvorenjima, eksprimiranje rodopsina iz AAV vektora je refraktorno prema suzbijanju od strane miR-708. U nekim otelotvorenjima, nukleinskoj kiselini koja kodira rodopsin nedostaje ciljano mesto miR-708 u 3' UTR od gena rodopsina. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin sadrži mutaciju (npr., brisanje, zamena, umetanje, itd.) u ciljanom mestu miR-708 u 3' UTR od gena rodopsina, tako da je refraktorna prema suzbijanju od strane miR-708.
[0092] U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža AAV vektor koji sadrži miR-708 nukleinsku kiselinu koja je operativno povezana sa RK promoterom i nukleinskom kiselinom koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa promoterom opsina. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708, koja je operativno povezana sa RK promoterom, je 5' do nukleinske kiseline koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa promoterom opsina. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708, koja je operativno povezana sa RK promoterom, je 3' do nukleinske kiseline koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa promoterom opsina. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža AAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708, koja je operativno povezana sa promoterom opsina i nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa RK promoterom. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708, koja je operativno povezana sa promoterom opsina, je 5' od nukleinske kiseline koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa RK promoterom. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708, koja je operativno povezana sa promoterom opsina, je 3' od nukleinske kiseline koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa RK promoterom. U nekim otelotvorenjima, miR-708 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 1. U nekim otelotvorenjima, miR-708 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 1. U nekim otelotvorenjima, miR-708 sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 1. U nekim otelotvorenjima, rodopsin sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2. U nekim otelotvorenjima, rodopsin sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO: 2. U nekim otelotvorenjima, rodopsin je funkcionalni ekvivalent divljeg tipa rodopsina. U nekim otelotvorenjima, eksprimiranje rodopsina iz AAV vektora je refraktorno prema suzbijanju od strane miR-708. U nekim otelotvorenjima, nukleinskoj kiselini koja kodira rodopsin nedostaje ciljano mesto miR-708 u 3' UTR od gena rodopsina. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin sadrži mutaciju (npr., brisanje, zamena, umetanje, itd.) u ciljanom mestu miR-708 u 3' UTR od gena rodopsina, tako da je refraktorna prema suzbijanju od strane miR-708.
[0093] U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža AAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708, koja je operativno povezana sa CBA promoterom i nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa RK promoterom. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708, koja je operativno povezana sa CBA promoterom je 5' do nukleinske kiseline koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa RK promoterom. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708, koja je operativno povezana sa CBA promoterom je 3' do nukleinske kiseline koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa RK promoterom. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža AAV vektor koji sadrži miR-708 nukleinsku kiselinu koja je operativno povezana sa RK promoterom i nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa CBA promoterom. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708, koja je operativno povezana sa RK promoterom, je 5' do nukleinske kiseline koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa CBA promoterom. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708, koja je operativno povezana sa RK promoterom, je 3' do nukleinske kiseline koja kodira rodopsin, koja je operativno povezana sa CBA promoterom. U nekim otelotvorenjima, miR-708 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 1. U nekim otelotvorenjima, miR-708 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 1. U nekim otelotvorenjima, miR-708 sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 90%, ili 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 1. U nekim otelotvorenjima, rodopsin sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2. U nekim otelotvorenjima, rodopsin sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% identičnosti aminokiselinske sekvence sa SEQ ID NO: 2. U nekim otelotvorenjima, rodopsin je funkcionalni ekvivalent divljeg tipa rodopsina. U nekim otelotvorenjima, eksprimiranje rodopsina iz AAV vektora je refraktorno prema suzbijanju od strane miR-708. U nekim otelotvorenjima, nukleinskoj kiselini koja kodira rodopsin nedostaje ciljano mesto miR-708 u 3' UTR od gena rodopsina. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin sadrži mutaciju (npr., brisanje, zamena, umetanje, itd.) u ciljanom mestu miR-708 u 3' UTR od gena rodopsina, tako da je refraktorna prema suzbijanju od strane miR-708.
[0094] U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 sadrži endogenu miR-708 skelu. U nekim otelotvorenjima, miR-708 skelu pruža SEQ ID NO: 14. U nekim otelotvorenjima nukleinska kiselina koja kodira miR-708 sadrži heterolognu miRNK skelu. U nekim otelotvorenjima, upotreba heterologne miRNK skele se koristi za modulaciju eksprimiranja miRNK; na primer, za povećanje eksprimiranja miRNK ili za smanjenje eksprimiranja miRNK. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 sadrži endogenu miR-155 skelu. U nekim otelotvorenjima, miR-155 skela se pruža SEQ ID NO: 14.
Rekombinantni virusni vektor
[0095] Predmetni pronalazak razmatra upotrebu rekombinantnog virusnog genoma za uvođenje jedne ili više sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju miRNK-miRNK-708 i/ili rodopsin protein koji je ovde opisan za pakovanje u AAV virusnu česticu. Rekombinantni virusni genom može da sadrži bilo koji element za uspostavljanje eksprimiranja miR-708 i/ili miRNK rodopsin proteina, na primer, promoter, miR-708 miRNK i/ili rodopsin transgen, ITR, element za vezivanje ribozoma, terminator, pojačivač, selekcioni marker, intron, polyA signal i/ili poreklo replikacije.
VI. Virusne čestice i postupci proizvodnje virusnih čestica
rAAV virusne čestice
[0096] Obelodanjenje pruža postupke korišćenja rAAV čestica za tretman retinitis pigmentoze i pruža sastave koji sadrže rAAV čestice. U nekim otelotvorenjima, virusna čestica je rekombinantna AAV čestica koja sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu koja kodira miRNK-708 miRNK i/ili rodopsin protein koji je ovde opisan, i koji je okružen sa jednim ili dva ITR. Nukleinska kiselina je inkapsidirana u AAV čestici. AAV čestica takođe sadrži kapsidne proteine. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina sadrži kodirajuću sekvencu od interesa (npr., nukleinska kiselina koja kodira miR-708 miRNK i/ili rodopsin protein) operativno povezane komponente u pravcu transkripcije, kontrolne sekvence koje uključuju sekvencu inicijacije i terminacije transkripcije, stvarajući tako kasetu eksprimiranja. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je ugrađena u intron. Kaseta eksprimiranja je okružena na 5' i 3' kraju sa najmanje jednom funkcionalnom AAV ITR sekvencom. Pod „funkcionalnim AAV ITR
sekvencama“ podrazumeva se da ITR sekvence funkcionišu onako kako su predviđene za spasavanje, replikaciju i pakovanje AAV viriona. Pogledati Davidson i dr., PNAS, 2000, 97(7)3428-32; Passini i dr., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40; i Pechan i dr., Gene Ther., 2009, 16:10-16. Za primenu nekih aspekata predmetnog pronalaska, rekombinantni vektori sadrže najmanje sve sekvence od AAV neophodne za inkapsidijaciju i fizičke strukture za infekciju od strane rAAV. AAV ITR za upotrebu u vektorima ne moraju imati nukleotidnu sekvencu divljeg tipa (npr., kako je opisano kod Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801), i mogu biti izmenjene umetanjem, brisanjem ili zamenom nukleotida, ili AAV ITR mogu biti izvedeni iz bilo kog od nekoliko AAV serotipova. Trenutno je poznato više od 40 AAV serotipova, i novi serotipovi i varijante postojećih serotipova i dalje se identifikuju. Pogledati Gao i dr., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6; Gao i dr., PNAS, 2003, 100(10):6081-6; i Bossis i dr., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810. Smatra se da je potreba bilo kog AAV serotipa unutar opsega predmetnog pronalaska. U nekim otelotvorenjima, rAAV vektor je vektor izveden iz AAV serotipa, uključujući bez ograničenja, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, kozji AAV, goveđi AAV, ili mišji AAV kapsid serotip ITRs ili slično. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži ITR od AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, kozji AAV, goveđi AAV, ili mišji AAV kapsid serotip ITRs ili slično. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV dalje kodira miR-708, rodopsin ili miR-708 i rodopsin kako je ovde opisano. Na primer, nukleinska kiselina u AAV može da sadrži najmanje jedan ITR bilo kog AAV serotipa koji je ovde razmatran, i može dalje da kodira miR-708 koji sadrži nukleinsku kiselinu SEQ ID NO: 1 i/ili nukleinsku kiselinu koja kodira ljudski rodopsin, koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV obuhvata 5' do 3' nukleinske kiseline koja kodira sledeće: AAV ITR, fragment punjenja (npr., SEQ ID NO: 11), himerni intron (npr., SEQ ID NO: 10), miR-708, sekvencu poliadenilacije goveđeg hormona rasta, fragment punjenja i AAV ITR. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži 5' do 3' nukleinske kiseline koja kodira sledeće: AAV ITR, RK promoter, intron β globina, miR-708 ugrađen u intron β globina, ljudski rodopsin, sekvencu poliadenilacije goveđeg hormona rasta i AAV ITR. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži 5' do 3' nukleinske kiseline koja kodira sledeće: AAV ITR, fragment punjenja (npr., SEQ ID NO: 11), RK promoter, himerni intron (npr., SEQ ID NO: 10), ljudski rodopsin, β-globin introna, miR-708 ugrađen u β-globin introna, sekvencu poliadenilacije goveđeg hormona rasta, fragment punjenja i AAV ITR. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži 5' do 3' nukleinske kiseline koja kodira sledeće: AAV ITR, fragment punjenja (npr., SEQ ID NO: 11), RK promoter, himerni intron (npr., SEQ ID NO: 10), miR-708, mišji promoter opsina, ljudski rodopsin, sekvencu poliadenilacije goveđeg hormona rasta i AAV ITR. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži nukleinsku kiselinu SEQ ID NO: 5. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži nukleinsku kiselinu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 5. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV je nukleinska kiselina SEQ ID NO: 6. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži nukleinsku kiselinu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 6. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži nukleinsku kiselinu SEQ ID NO: 7. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži nukleinsku kiselinu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 7. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži nukleinsku kiselinu SEQ ID NO: 8. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži nukleinsku kiselinu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 8. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži nukleinsku kiselinu SEQ ID NO: 9. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži nukleinsku kiselinu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 9. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži nukleinsku kiselinu SEQ ID NO: 24. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži nukleinsku kiselinu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 24. U nekim otelotvorenjima, nukleinska
4
kiselina u AAV sadrži nukleinsku kiselinu SEQ ID NO: 25. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži nukleinsku kiselinu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 25. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži nukleinsku kiselinu SEQ ID NO: 26. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži nukleinsku kiselinu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 26. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži nukleinsku kiselinu SEQ ID NO: 27. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži nukleinsku kiselinu koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 27. U narednim otelotvorenjima, rAAV čestica sadrži kapsidne proteine AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, kozji AAV, AAV1/AAV2 himerni, goveđi AAV, mišji AAV kapsid rAAV2/HBoV1 serotip kapsid, ili mutante ovih kapsidnih proteina. U nekim otelotvorenjima, mutantni kapsidni protein održava sposobnost stvaranja AAV kapsida. U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica obuhvata AAV5 tirozin mutantni kapsid (Zhong L. i dr., (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105(22):7827-7832. U narednim otelotvorenjima, rAAV čestica sadrži kapsidne proteine AAV serotipa iz grana A-F (Gao, i dr., J. Virol.2004, 78(12):6381). U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži sekvencu nukleinskih kiselina izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 5-8, i okružena je sa najmanje jednim AAV2 ITR. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži sekvencu nukleinskih kiselina koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa nukleinskom kiselinom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 5-9, i okružena je sa najmanje jednim AAV2 ITR.
[0097] Različiti AAV serotipovi se koriste za optimizaciju transdukcije određenih ciljanih ćelija ili za ciljanje određenih tipova ćelija unutar određenog ciljanog tkiva (npr., bolesno tkivo). rAAV čestica može da sadrži virusne proteine i virusne nukleinske kiseline istog serotipa ili mešovitog serotipa. Na primer, u nekim otelotvorenjima, rAAV čestica može da sadrži AAV5 kapsidne proteine i najmanje jedan AAV2 ITR ili može da sadrži AAV2 kapsidne proteine i najmanje jedan AAV5 ITR. U drugim otelotvorenjima, rAAV čestica može da sadrži AAV5 tirozin mutantne kapsidne proteine i najmanje jedan AAV2 ITR. U još jednom primeru, rAAV čestica može da sadrži kapsidne proteine i od AAV5 i od AAV2, i dalje može da sadrži najmanje jedan AAV2 ITR. Svaka kombinacija AAV serotipa za proizvodnju rAAV čestice je ovde data kao da je svaka kombinacija ovde izričito navedena. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža rAAV čestice koje obuhvataju AAV5 kapsidne proteine i nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 RNK i/ili rodopsin transgen, okružen sa najmanje jednim AAV2 ITR.
Samo-komplementarni AAV virusni genomi
[0098] U nekim aspektima, pronalazak pruža virusne čestice koje sadrže rekombinantni samo-komplementarni genom. AAV virusne čestice sa samo-komplementarnim genomima i postupci upotrebe samo-komplementarnih AAV genoma opisani su u US Patent Nos.
6,596,535; 7,125,717; 7,765,583; 7,785,888; 7,790,154; 7,846,729; 8,093,054; i 8,361,457; i Wang Z., i dr., (2003) Gene Ther 10:2105-2111. rAAV koji sadrži samo-komplementarni genom brzo će formirati dvolančane molekule DNK zahvaljujući delimično komplementarnim sekvencama (npr., komplementi kodirajućim i ne-kodirajućim lancima transgena). U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža AAV virusnu česticu koja obuhvata AAV genom, gde rAAV genom sadrži prvu heterolognu polinukleotidnu sekvencu (npr., miR-708 i/ili lanac koji kodira rodopsin) i drugu heterolognu polinukleotidnu sekvencu (npr., antisensn lanac od miR-708 i/ili rodopsin ne-kodirajući ili antisens lanac), gde prva heterologna polinukleotidna sekvenca može formirati međulančane bazne parove sa drugom polinukleotidnom sekvencom duž većine ili čitave svoje dužine. U nekim otelotvorenjima, prva heterologna polinukleotidna sekvenca i druga heterologna polinukleotidna sekvenca povezane su sekvencom koja olakšava međulančano bazno uparivanje, npr., DNK struktura ukosnice. Strukture ukosnice su poznate u struci, na primer, u siRNK molekulima. U nekim otelotvorenjima, prva heterologna polinukleotidna sekvenca i druga heterologna polinukleotidna sekvenca povezane su mutiranim ITR (npr., pravi ITR). U nekim otelotvorenjima, ITR sadrži polinukleotidnu sekvencu 5'-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGC CCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG - 3' (SEQ ID NO: 20). Mutirani ITR sadrži brisanje D regiona koji sadrži sekvencu terminalne rezolucije. Kao rezultat, prilikom repliciranja AAV virusnog genoma, rep proteini neće razdvajati virusni genom na mutiranom ITR, i kao takav, rekombinantni virusni genom koji sadrži naredno u 5' do 3' redosledu biće pakovan u virusni kapsid: AAV ITR, prva heterologna polinukleotidna sekvenca koja uključuje regulatorne sekvence, mutirani AAV ITR, drugi heterologni polinukleotid u obrnutoj orijentaciji prema prvom heterolognom polinukleotidu i treći AAV ITR. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža AAV virusne čestice koje sadrže rekombinantni virusni genom koji sadrži funkcionalni AAV2 ITR, prvu polinukleotidnu sekvencu koji kodira miR-708 RNK i/ili rodopsin transgen, mutirani AAV2 ITR koji sadrži brisanje D regiona, i nedostaje mu funkcionalna terminalna sekvenca rezolucije, druga polinukleotidna sekvenca koja sadrži komplementarnu sekvencu sekvenci koja kodira miR-708 RNK i/ili rodopsin, od prve polinukleotidne sekvence i funkcionalni AAV2 ITR.
Proizvodnja AAV čestica
[0099] rAAV čestice se mogu proizvesti korišćenjem postupaka poznatih u struci. Pogledati npr. U.S. Pat. Nos.6,566,118; 6,989,264; i 6,995,006. U primeni pronalaska, ćelije domaćini za proizvodnju rAAV čestica uključuju ćelije sisara, ćelije insekata, biljne ćelije, mikroorganizme i kvasce. Ćelije domaćini takođe mogu biti ćelije za pakovanje u kojima su AAV rep i cap geni stabilno održavani u ćeliji domaćinu ili proizvodnim ćelijama u kojima je genom AAV vektora stabilno održavan. Primerne ćelije za pakovanje i proizvodne ćelije se dobijaju iz 293, A549 ili HeLa ćelija. AAV vektori su prečišćeni i formulisani korišćenjem standardnih tehnika poznatih u struci.
[0100] U nekim aspektima, pružen je postupak za proizvodnju bilo koje rAAV čestice koja je ovde obelodanjena, koji sadrži (a) kultivaciju ćelije domaćina pod uslovom da se proizvode rAAV čestice, gde ćelija domaćin sadrži (i) jedan ili više AAV gena za pakovanje, gde svaki navedeni AAV gen za pakovanje kodira AAV replikaciju i/ili protein inkapsidacije; (ii) rAAV pro-vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 RNK i/ili bilo koji rodopsin transgen kao što je ovde opisano, okružen sa najmanje jednim AAV ITR, i (iii) AAV pomoćnu funkciju; i (b) prikupljanje rAAV čestica koje proizvodi ćelija domaćin. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina kodira miR-708 od RNK SEQ ID NO: 1 i/ili transgen koji kodira rodopsin; npr., rodopsin sa aminokiselinom SEQ ID NO: 2. U nekim otelotvorenjima navedeni bar jedan AAV ITR je izabran iz grupe koju čine AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, kozji AAV, goveđi AAV, ili mišji AAV serotip ITR ili slično. U nekim otelotvorenjima, navedeni protein inkapsidacije je izabran iz grupe koja se sastoji od AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 (npr., AAV6 kapsid divljeg tipa ili varijanta AAV6 kapsida kao što je ShH10, kao što je opisano u U.S. PG Pub.2012/0164106), AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9 (npr., AAV9 kapsida divljeg tipa ili modifikovani AAV9 kapsid kao što je opisano u U.S. PG Pub.
2013/0323226), AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, mutant tirozin kapsida, mutant
4
heparin-vezujućeg kapsida, AAV2R471A kapsid, AAVAAV2/2-7m8 kapsid, AAV DJ kapsid (npr., AAV-DJ/8 kapsid, AAV-DJ/9 kapsid ili bilo koji drugi od kapsida opisanih u U.S. PG Pub. 2012/0066783), AAV2 N587A kapsid, AAV2 E548A kapsid, AAV2 N708A kapsid, AAV V708K kapsid, goat AAV kapsid, AAV1/AAV2 himerni kapsid, goveđi AAV kapsid, mišji AAV kapsid, rAAV2/HBoV1 kapsid, AAV kapsid opisan u U.S. Ne. 8,283,151 ili Međunarodna objava br. WO/2003/042397, ili njihovi mutanti. U nekim otelotvorenjima, protein inkapsidacije je kapsidni protein AAV5 tirozin mutanta. U narednim otelotvorenjima, rAAV čestica sadrži kapsidne proteine AAV serotipa iz grana A-F. U nekim otelotvorenjima, rAAV čestice obuhvataju AAV5 kapsid i rekombinantni genom koji obuhvata AAV2 ITR, mutirani AAV2 ITR i nukleinsku kiselinu koja kodiraju miR-708 i/ili rodopsin. U nekim otelotvorenjima, rAAV čestice obuhvataju mutantni kapsid AAV5 tirozina i rekombinantni genom koji obuhvata AAV2 ITR, mutantni AAV2 ITR i nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i/ili rodopsin. U narednom otelotvorenju, rAAV čestice su prečišćene. Izraz „prečišćen“ kako se ovde koristi uključuje pripremu rAAV čestica lišenih bar nekih drugih komponenti koje mogu takođe biti prisutne tamo gde se rAAV čestice prirodno javljaju ili su od njih prvobitno pripremljene. Tako, na primer, izolovane rAAV čestice mogu da se pripreme korišćenjem tehnike prečišćavanja kako bi se obogatile iz izvorne smeše, poput lizata kulture ili supernatanta proizvodne kulture. Obogaćivanje se može meriti na različite načine, kao što je, na primer, proporcija čestica otpornih na DNazu (DRP) ili kopija genoma (gc) prisutnih u rastvoru, ili infektivnosti, ili se može meriti u odnosu na druge supstance prisutne u izvornoj smeši i koje potencijalno imaju uticaja, kao što su zagađivači, uključujući zagađivače proizvodne kulture ili zagađivače u procesu, uključujući pomoćni virus, komponente medijuma i slično.
[0101] Ovde su takođe pruženi farmaceutski sastavi koji sadrže rAAV česticu koja sadrži transgen koji kodira miR-708 i/ili rodopsin transgen predmetnog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim otelotvorenjima, sastav sadrži rAAV čestice koje sadrže transgen koji kodira miR-708 i rAAV čestice koje sadrže rodopsin transgen. U nekim otelotvorenjima, sastav sadrži rAAV čestice koje sadrže transgene koji kodiraju miR-708 i transgen rodopsin. Farmaceutski sastavi mogu biti pogodni za bilo koji ovde opisani način primene.
Farmaceutski sastav od rAAV koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 RNK i/ili rodopsin transgen, koji je ovde opisan, može se uvesti u oko; na primer, subretinalnom primenom ili intravitrealnom primenom.
[0102] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastavi koji sadrže ovde opisani rAAV i farmaceutski prihvatljiv nosač su pogodni za primenu ljudima. Takvi nosači su dobro poznati u struci (pogledati, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, pp.1035-1038 and 1570-1580). U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastavi koji sadrže ovde opisani rAAV i farmaceutski prihvatljiv nosač su pogodni za očnu injekciju. Takvi farmaceutski prihvatljivi nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulje, uključujući ona od petroleja, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što su kikiriki ulje, sojino ulje, mineralno ulje i slično. Slani rastvori i vodena dekstroza, polietilen glikol (PEG) i rastvori glicerola takođe se mogu koristiti kao tečni nosači, posebno za rastvore za isporuku injekcijom. Farmaceutski sastav može dalje da sadrži dodatne sastojke, na primer konzervanse, pufere, agense za toničnost, antioksidanse i stabilizatore, nejonske ovlaživače ili agense za bistrinu, agense za povećanje viskoznosti i slično. Ovde opisani farmaceutski sastavi mogu se pakovati u pojedinačnim doznim jedinicama ili u oblicima sa više doza. Sastavi su uglavnom formulisane kao sterilni i u suštini izotonični rastvori.
VII. Predmeti proizvodnje i kompleti
[0103] Takođe su pruženi kompleti ili predmeti proizvodnje koji se koriste u ovde opisanim postupcima. U aspektima, kompleti sadrže ovde opisane sastave (npr., rAAV čestice koje sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 RNK i/ili rodopsin transgen) u odgovarajućoj ambalaži. Pogodna pakovanja za sastave (kao što su očni sastave) koji su ovde opisani su poznati i uključuju, na primer, bočice (poput zatvorenih bočica), posude, ampule, boce, tegle, fleksibilno pakovanje (npr., zapečaćene Mylar ili plastične kesice), i slično. Ovi predmeti proizvodnje mogu se dalje sterilisati i/ili zatvoriti.
[0104] Ovo obelodanjenje takođe pruža komplete koji sadrže ovde opisane sastave i mogu dalje da sadrže uputstva o postupcima upotrebe sastava, kao što su ovde opisane upotrebe. Ovde opisani kompleti mogu dalje da uključuju i druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle, špriceve i uloške za pakovanje sa uputstvima za obavljanje bilo kojih ovde opisanih postupaka. Na primer, u nekim otelotvorenjima, komplet sadrži rAAV koji sadrži transgen koji kodira miR-708 RNK i/ili rodopsin transgen za intraokularnu isporuku od najmanje 1 × 10<9>kopija genoma primatu, kao što je ovde opisano, farmaceutski prihvatljiv nosač pogodan za intraokularnu injekciju i jedan ili više od: pufera, razblaživača, filtera, igle, špriceva i pakovanja sa uputstvima za obavljanje očnih injekcija. U nekim otelotvorenjima, komplet sadrži uputstva za tretman
4
retinitis pigmentoze pomoću ovde opisanih rAAV čestica. U nekim otelotvorenjima, komplet sadrži uputstva za smanjenje ER stresa u ćeliji, koristeći rAAV čestice koje su ovde opisane. U nekim otelotvorenjima, komplet sadrži uputstva za upotrebu ovde opisanih rAAV čestica, u skladu sa bilo kojim od ovde opisanih postupaka.
PRIMERI
[0105] Pronalazak će biti u potpunije objašnjen pozivanjem na sledeće primere.
Primer 1:Razvoj ćelijskog modela retinitis pigmentoze
[0106] Terapijska strategija za RHO-povezanu autosomnu dominantnu RP bila obaranje i mutiranog i rodopsina divljeg tipa, i ublažavanje ER stres. To se može postići ko-isporukom mikro-RNK (miR) koja bi inhibirala alele rodopsina i opciono ko-isporukom sekvence rodopsinsa divljeg tipa koja je refraktorna na obaranje pomoću egzogeno isporučenog miR. CHR-regulisani miR, miR-708, reguliše eksprimiranje rodopsina (Behrman, S., i dr. (2011) J. Cell Biol.192(6):919-27). miR-708 je intronski miR nastanjen unutar CHOP-inducibilnog gena Odz4 (Tenurin-4). CHOP reguliše eksprimiranje miR-708 tokom ER stresa, i u 3' UTR od rodopsina postoji pretpostavljena miR-708 sekvenca.
[0107] Ovde su opisani postupci za korišćenje AAV vektora za isporuku egzogenog miR-708 koji cilja i rodopsin divlji tip i mutantni rodopsin kroz 3' UTR miR-708 ciljanu sekvencu prisutnu u oba alela. U otelotvorenjima, takođe se isporučuje alternativna sekvenca za rodopsin divljeg tipa. Ova alternativna sekvenca za rodopsin može se konstruisati tako da ima smanjeno vezivanje za miR-708 (npr. supstitucija nukleotida, brisanje ili dodavanje 3' UTR) i na taj način će biti refraktorna za obaranje pomoću egzogenog miR-708. U otelotvorenjima, alternativnoj sekvenci za rodopsin nedostaje 3' UTR miR-708 ciljana sekvenca. Ukratko, ovi AAV vektori bi oborili eksprimiranje rodopsina koji izaziva ER stres (a samim tim i smrt fotorecepcijskih ćelija) i opciono dopunili eksprimiranje gena rodopsina divljeg tipa ili kodon-optimizovanog, koji je refraktoran na miR-708-indukovano obaranje, čime se obnavljaju normalno eksprimiranje i funkcija rodopsina.
Postupci
Ćelijska kultura
[0108] HEK-293 ćelije su konstruisane da eksprimiraju ljudski ili mišji Ropsopsin P23H koristeći T-Rex Tetracycline Inducible sistem koji pravi Invitrogen. Spojene ćelije u pločama
4
sa 6 komorica su transficirane sa 4 µg miR-708 (pcDNK) vektorom ili kontrolnim miRNK vektorom koristeći Lipofektamin 2000 (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. 48 sati nakon transfekcije medijum je zamenjen medijumom koji sadrži 2 uM tetraciklina. Ćelije su inkubirane tokom dodatna 24 sata, i medijum je uklonjen iz svake komorice.
Western blotting
[0109] Ćelije su lizirane u 400 µl RIPA pufera (Thermo Scientific) koji sadrži ImM PMSF, i propuštene kroz 25g špric nekoliko puta. Lizat je centrifugiran na 14.000 obrtaja u minutu, tokom 10 minuta. Ćelije su držane na 4°C tokom čitavog postupka.30 µl supernatanta je stavljeno na 4-12% Bis/Tris Gel i SDS-PAGE je izveden u MOPS puferu (Invitrogen).
Proteini su tada preneti u nitroceluloznu membranu pomoću I-Blot sistema koji pravi Invitrogen. Membrana je blokirana sat vremena na sobnoj temperaturi u PBS koji je sadržao 0,05% Tween-20 (PBS-T) i 0,1% I-Block (Invitrogen). Membrana je inkubirana preko noći na 4°C u PBS-T koji sadrži 1 µg/mL anti rodopsin mAb 1D4 (Abcam). Posle nekoliko ispiranja u PBS-T, membrana je inkubirana u sekundarnom rastvoru antitela koji je sadržao 1:1000 razblaživanja anti-mišjeg IgG HRP konjugovanog Ab (R&D Systems) tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Membrana je isprana u PBS-T nekoliko puta i razvijena korišćenjem ECL reagensa (Thermo Scientific). Nivoi mRodopsin proteina kvantifikovani su korišćenjem Image-J softvera. Membrana je uklonjena sa proteina u PBS koji sadrži 0,1M glicina pH 2, i potom je nekoliko puta isprana u PBS-T. Zatim je membrana testirana na hGAPDH u PBS-T koja sadrži 1:20.000 razblaženje anti GAPDH pAb (Sigma) tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja nekoliko puta u PBS-T, sekundarno antitelo (anti-zečji IgG-HRP, R&D Systems) je razblaženo 1:1000 u PBS-T i inkubirano tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Membrana je isprana nekoliko puta i razvijena korišćenjem ECL reagensa (Thermo Scientific). Nivo mRodopsin proteina je tada normalizovan na nivo proteina hGAPDH pomoću Image J softvera.
Endogeno obaranje miR-708 u HEK-293 ćelijama
[0110] HEK-293 ćelije koje eksprimiraju mišji ili ljudski rodopsin (opisane iznad) transficirane su sa 100 pmol pre-miR-708, anti-miR-708 ili kontrolnom miRNK (Ambion) koristeći Lipofektamin 2000 protokol za transfekciju sa siRNK molekulima (Invitrogen). 48 sati posle transfekcije, medijum je zamenjen medijumom koji sadrži 2 uM tetraciklina kako bi se izazvalo eksprimiranje Rodopsina.24 sata kasnije svaka komorica je podeljena na 2 uzorka. Jedna je ispitivana za mRodopsin i hGAPDH koristeći Western blotprotokol , i RNK
4
je ekstrahovana iz drugog za TaqMan® (Life Technologies) analizu eksprimiranja rodopsina i miR-708 RNK. Ukupna RNK (uključujući male RNK) je ekstrahovana iz ćelija koristeći miRNeasy komplet koji pravi Qiagen, prema uputstvima proizvođača, uključujući i tretiranje DNK uzoraka. cDNK je sintetisana iz ukupne RNK korišćenjem Quantitect Reverse Transcription sistema koji pravi Qiagen. cDNK je dodata u mRodopsin, hCHOP (Ddit3), hBiP (Hspa5) ili testove eksprimiranja gena hGAPDH TaqMan® (Life Technologies).
Eksprimiranje gena je normalizovano u odnosu na hGAPDH korišćenjem ΔΔCtpostupka. MiR-708 eksprimiranje je kvantifikovano korišćenjem miR-708 TaqMan®testa eksprimiranja (Life Technologies). MiR-708 eksprimiranje je prikazano u odnosu na endogeno miR-16 eksprimiranje koristeći ΔΔCtpostupak.
Eksprimiranje miR-708 vođeno promoterom rodopsin kinaze u WERI Rb-1 ćelijama [0111] miR-708 sekvenca je subklonirana nizvodno od promotera rodopsin kinaze (RK) nakon izbacivanja iz pcDNK 6.2 GW vektora (Block-iT sistem, Invitrogen) u vektor pRK-MVM, koji sadrži nativni hRK promoter i MVM intron sekvence. WERI Rb-1 ćelije (ATCC) su transficirane sa 2 µg pRK-miR-708 ili pRK-miR-kontrolnim vektorom koristeći Fugene-HD (Promega), prema uputstvima proizvođača.48 sati nakon transfekcije, ćelije su sakupljene i ukupna RNK (uključujući male RNK) je ekstrahovana pomoću miRNeasy komplet protokola (Qiagen). miR-708 je kvantifikovan u svakom uzorku koristeći test eksprimiranja miR-708 TaqMan® gena kao što je ranije opisano (Life Technologies). Kako bi se kvantifikovalo obaranje mRodopsin u miR-708 eksprimirajućim WERI Rb-1 ćelijama, ćelije su ko-transficirane sa po 2 µg od pRK-miR-708 (ili kontrolie) i pSport6 mRodopsin P23H koristeći Fugene-HD prema uputstvima proizvođača (Promega). RNK je ekstrahovana kao što je opisano i nivoi mRodopsin RNK su kvantifikovani kao što je gore opisano korišćenjem ΔΔCt postupak u odnosu na nivoe hGAPDH RNK.
Ekstrakcija RNK iz mišjih mrežnjača injekcijom datih sa AAV vektorima
[0112] RNK je ekstrahovana iz mišjih mrežnjača korišćenjem miRNeasy kompleta prema uputstvima proizvođača (Qiagen). Pojedinačne mišje mrežnjače homogenizovane su u Qiazol Lysis puferu koristeći 1 mm cirkonij/silika kuglice (Biospec) u trajanju od 10 min. Nakon homogenizacije, RNK je ekstrahovana prema uputstvima proizvođača. Nivoi miR-708 u svakoj mrežnjači kvantifikovani su korišćenjem qStar mikroRNK sistema za kvantifikovanje (Origene). cDNK je sintetisana pomoću prvog kompleta za sintezu cDNK (Origene), nakon čega je usledila miR-708 specifična amplifikacija i kvantifikacija korišćenjem miR-708
4
specifičnih prajmera i miR-708 prajmera (Origene). Za kvantifikaciju nivoa rodopsina u mišjim očima kojima su primenjene injekcije, mRodopsin je amplifikovan korišćenjem specifičnih prajmera (Life Technologies) i kvantifikovan prema rodopsin cDNK standardu. Nivo RdCVF kvalitativno je analiziran na osnovu GAPDH eksprimiranja korišćenjem ΔΔCt postupka.
Vektor suzbijanja/zamene rodopsina
[0113] hRodopsin cDNK (bez bočnih UTR sekvenci) je kloniran u pRK vektor ekscizijom iz pcDNK vektora i izvođenjem ligacije sa tupim krajem u pRK-MCS. cDNK je sintetisana (Biobasic) tako da sadrži promoter sekvencu hRodopsin kinaze i hβ-globin Intron sa umetanjem hmiR-708 sekvence (sekvenca preuzeta od Genbank/NCBI) smeštenim između mesta akceptora/donora splajsovanja introna. Ova sekvenca je subklonirana iz vektora pUC57, vezana u pcDNK hRodopsin vektor i preimenovana u pRK-miR-708 hRho/wt. Nivoi miRNK-708 i hRodopsin proteina testirani su kao što je gore opisano u transficiranim ćelijama WERI Rb-1.
Kvantifikacija XBP-1 splajsovanja u ćelijama WERI Rb-1 transficiranim sa P23H mRodopsinom
[0114] hWERI Rb-1 ćelije su ko-transficirane pcDNK vektorom koji kodira ne-glikozilirani P23H mutirani mRodopsin i pRK-miR-708 vektor. Ova P23H rodopsin cDNK mutirana je korišćenjem PCR mutageneze usmerene na mesto (Agilent Technologies) kako bi se promenila dva kodona Asparagina (na položajima 2 i 5) u Alanin. Ćelije su transficirane kao što je opisano sa po 2 µg svakog vektora i inkubirane su tokom 72 sata. Ukupna RNK je sakupljena iz ćelija kao što je prethodno opisano. cDNK je sintetisana korišćenjem kompleta za sintezu cDNK visokog kapaciteta (Invitrogen). XBP-1 splajsovanje je procenjeno korišćenjem primerka specifičnih za XBP-1 i High Fidelity PCR MasterMix (Roche).
Pojačane sekvence su analizirane na 2% agaroznom gelu i relativne količine splajsovanog (-280 nt) nasuprot ne-splajsovanog (∼300nt) XBP-1 transkripta su kvantifikovane korišćenjem Image-J softvera.
Dodatni postupci
[0115] Postupci za imunofluorescenciju, Western blotting sa i bez tretmana Endoglikozidazom H, UPR marker eksprimiranje i TUNEL bojenjem ćelija koje eksprimiraju divlji tip ili P23H mutantni rodopsin izvedene su kako je opisano kod Adamowicz, M., i dr.
4
(2012) Adv. Exp. Med. Biol.723:573-9.
Rezultati
[0116] Pigmentirane epitelne (RPE) ćelije ljudske mrežnjače su prolazno transficirane genom koji kodira bilo ljudski divlji tip (WT) ili ljudski P23H mutantni rodopsin (mutacija povezana sa RP). Lokalizacija rodopsina je ispitivana konfokalnom imunofluorescentnom mikroskopijom upotrebom antitela protiv rodopsina. U slučaju proteina divljeg tipa, najveći deo proteina je prerađen u plazma membranu (SLIKA 1A), što ukazuje na normalnu biogenezu. Suprotno tome, mutirani P23H je pokazao perinuklearno/retikularnu distribuciju karakterističnu za zadržavanje endoplazmatičnog retikuluma (ER), bez gotovo ikakvog eksprimiranja na ćelijskoj površini (SLIKA 1B). Ovi rezultati prikazuju da se P23H mutantni rodopsin ne prenosi pravilno na plazma membranu i umesto toga se zadržava u ER.
[0117] Agregacija rodopsina procenjena je sa SDS-PAGE imunoblot analizom rastvorljivih ekstrakata u deterdžentima od RPE ćelija koji prolazno eksprimiraju divlji tip ili P23H mutantni protein (SLIKA 2A). Rodopsin divljeg tipa migrirao je pretežno kao difuzni opseg pri molekularnoj masi od ∼ 40 kDa. Ova vrsta odgovara monomernim, zrelim rodopsinima koji sadrže N-vezane glikone. Mobilnost P23H mutantnog rodopsina izrazito se razlikovala od divljeg rodopsina, gde većina P23H migrira kao dimeri i oligomeri veće težine (SLIKA 2A). P23H je takođe bio osetljiv na Endoglikozidazu H – treba imati na umu da tretman Endoglikozidazom H utiče na migraciju R23H rodopsina, ali ne i divljeg tipa, kao što je prikazano na SLIKA 2B. Endoglikozidaza H je specifična za jezgro glikozilirane oligosaharidne strukture sa visokom manozom, tipičnom za proteine koji nisu sazreli nakon ER.
[0118] Zajedno, ovi podaci sugerišu da se u ćelijama RPE divlji tip rodopsina može saviti i sazreti izvan ER, dok je P23H mutant skloniji stvaranju tuđih oligomera i zadržava se u ER, možda zbog nemogućnosti produktivnog savijanja.
[0119] Dalje, sposobnost P23H rodopsina da indukuje ER stres u transficiranim RPE ćelijama procenjena je merenjem nivoa dva markera od UPR, BiP i CHOP. Povećani nivoi BiP mRNK detektovani su u ćelijama koje prolazno eksprimiraju i WT i P23H rodopsin (SLIKA 3A), što sugeriše da povećanje opterećenje savijanja ER samo po sebi izazva UPR. Međutim, eksprimiranje BiP mRNK bilo je značajno veće u ćelijama koje eksprimiraju P23H rodopsin (43 puta više nego ne-transficirane ćelije) u poređenju sa ćelijama koje eksprimiraju WT rodopsin (14 puta više nego ne-transficirane ćelije) (SLIKA 3A). Nivoi mRNK rodopsina bili su identični u ćelijama koje eksprimiraju WT ili mutantne oblike proteina (SLIKA 3A). Dakle, P23H rodopsin je snažniji induktor BiP u odnosu na WT rodopsin. Bez želje da se veže za teoriju, ovo odstupanje može biti posledica defekta savijanja mutantnog proteina.
[0120] Zatim je ispitano CHOP eksprimiranje. Ćelije koje eksprimiraju WT rodopsin protein prikazuju 15-ostruku indukciju CHOP u poređenju sa ne-transficiranim ćelijama, dok ćelije koje eksprimiraju P23H mutanta prikazuju još veću 23-ostruku indukciju (SLIKA 3A). Kako je CHOP faktor transkripcije koji posreduje apoptozu, izazvan pomoću UPR (Lee, E.S., i dr. (2007) FEBS Lett.581(22):4325-32), mereni su relativni nivoi apoptoze između mutantskih ćelija koje eksprimiraju WT i P23H. U saglasnosti sa mRNK nivoima od CHOP, TUNEL rezultati ispitivanja dalje sugerišu da su RPE ćelije koje prolazno eksprimiraju P23H mutant podložnije apoptozi nego one koje eksprimiraju divlji tip rodopsina (SLIKA 3B).
Primer 2: Modulacija miR-708 nivoa reguliše eksprimiranje rodopsina i UPR u ćelijama HEK-293
[0121] Pronađena je konsenzus sekvenca koja odgovara pretpostavljenom ciljanom mestu miR-708 u 3' UTR od nekoliko sisarskih gena rodopsina (Behrman, S., i dr. (2011) J. Cell Biol. 192(6):919-27). Ovaj primer pokazuje da se miR-708 regulacija rodopsina može koristiti kao alat za modulaciju eksprimiranja rodopsina u kultivisanim ćelijama.
[0122] HEK-293 ćelije koje eksprimiraju P23H mutantni mRodopsin gen koji kodira 3'UTR miR-708 ciljanu sekvencu transficirane su plazmidom koji eksprimira miR-708 ili miR-kontrolu kako je prikazano na SLICI 4. Nakon 72 sata, ćelije su sakupljene, i mP23H eksprimiranje rodopsin proteina je analizirano koristeći Western blot (SLIKA 5).
Eksprimiranje P23H mRodopsin proteina je smanjeno na -30% u ćelijama koje su transficirane sa CBA-miR-708, u poređenju sa ćelijama koje su transficirane sa CBA-miR-kontrola vektorom.
[0123] Eksprimiranje UPR ciljanih gena (CHOP/BIP) je takođe analizirano koristeći TaqMan® analizu eksprimiranja gena. HEK-293 ćelije koje eksprimiraju miR-708 takođe su pokazale smanjeno eksprimiranje CHOP i BiP RNK u poređenju sa kontrolnim ćelijama
1
(SLIKA 6). Ovi rezultati sugerišu da smanjenje nivoa pogrešno savijenog P23H mRodopsina dovodi do pratećeg smanjenja eksprimiranja UPR gena BiP i CHOP.
[0124] U obrnutom eksperimentu, HEK-293 ćelije koje eksprimiraju bilo mišji P23H rodopsin (uključujući 3' UTR miR-708 ciljanu sekvencu) ili ljudski P23H rodopsin (kom nedostaje 3' UTR miR-708 ciljana sekvenca) su transficirane koristeći anti-miR-708 premiRNK ili negativnu kontrolu pre-miRNK (SLIKA 7). U ovom eksperimentu, egzogeni antimiR-708 je korišćen da inhibira endogeni HEK293 miR-708. Ako bi endogeni miR-708 regulisao eksprimiranje rodopsina kroz pretpostavljenu miR-708 ciljanu sekvencu, promene nivoa R23H rodopsina bile bi primećene samo ako bi postojala miR-708 ciljana sekvenca u 3' UTR od gena rodopsina. Ćelije su transficirane sa 100 pmol svake RNK. Stvoreni su ćelijski lizati, i rodopsinski protein je kvantifikovan na Western blotu dok su nivoi mRNK analizirani TaqMan® analizom (SLIKA 7). Inhibicija endogenog miR-708 rezultovala je povećanjem mišjeg rodopsin mRNK i proteina (SLIKA 7A), dok nivoi i ljudskog rodopsin mRNK i proteina ostaju nepromenjeni (SLIKA 7B), uprkos nižim nivoima endogenog miR-708. Ovi rezultati prikazuju da regulacija rodopsina pomoću miR-708 zahteva miR-708 ciljanu sekvencu u rodopsin 3' UTR.
[0125] Zajedno, ovi rezultati prikazuju da je rodopsin funkcionalna meta miR-708 i da se modulacija aktivnosti miR-708 može koristiti kao sredstvo za uticaj na eksprimiranje rodopsina.
Primer 3: Dizajn AAV ITR plazmida koji eksprimira miR-708 pod kontrolom fotoreceptorski specifičnog promotera rodopsin kinaze
[0126] Smatra se da nakupljanje mutantnog rodopsin proteina u ER doprinosi ER stresu koji je među uzročnicima smrti fotorecepcijskih ćelija kod RP. Prethodni primer pokazuje da miR-708 eksprimiranje može da reguliše ukupni nivo rodopsina. Vektor na bazi adenoasocijativnog virusa (AAV) konstruiran je za specifično eksprimiranje miR-708 u fotoreceptorskim ćelijama mrežnjače kako bi se utvrdilo da li snižavanje ukupnog nivoa rodopsina (uključujući divlji tip i mutantne oblike) može ublažiti ER stresa nezavisno od mutacija rodopsina.
[0127] SLIKA 8 prikazuje plazmid sa AAV obrnutim terminalnim ponavljanjem (ITR) dizajniran tako da eksprimira miR-708 specifično u fotoreceptorskim ćelijama mrežnjače.
2
Eksprimiranje miR-708 je podstaknuto promoterom rodopsin kinaze (pRK), koji se posebno eksprimira u fotoreceptorskim štapićastim ćelijama. U ovom vektoru, miR-708 je eksprimiran iz miR-155 skele prikazane na SLICI 4.
[0128] Zatim je ovaj AAV ITR plazmid validiran u kultivisanim ćelijama. WERI ili RPE ćelije su transficirane pre-virusnim plazmidom opisanim na SLICI 8, i nivoi miR-708 kvantifikovani su TaqMan® analizom. SLIKA 9A pokazuje da su WERI ćelije koje su transficirane pRK-vođenim miR-708 plazmidom imale više od 2000 puta povećanje nivoa miR-708 u poređenju sa WERI ćelijama koje su transficirane plazmidom koji eksprimira miR-Scramble (kontrola). Suprotno tome, RPE ćelije, u kojima RK promoter nije značajno eksprimiran, nisu pokazale značajno povećanje nivoa miR-708 (SLIKA 9A).
[0129] Funkcija miR-708 u regulisanju eksprimiranja rodopsina potvrđena je kotransfekcijom pRK-miR-708 plazmida (ili miR-kontrolnog plazmida) i plazmida sa P23H mišjim genom rodopsina koji nosi 3'miR708 ciljanu sekvencu u WERI ćelije. SLIKA 9B pokazuje da je mRNK P23H mRodopsin redukovan u prisustvu miR-708, u poređenju sa miR-kontrolom. Ovi rezultati prikazuju da je eksprimiranje miR-708 pomoću AAV ITR vektora efikasno u smanjenju eksprimiranja rodopsina u fotoreceptorskim ćelijama.
Primer 4: Obaranje rodopsina u mišjim mrežnjačama upotrebom miR-708 AAV5 vektora
[0130] Kako bi se testiralo da li se AAV vektor može koristiti za smanjenje eksprimiranja rodopsina u mrežnjači in vivo, pRK-miR-708 plazmid opisan na SLICI 8 je upakovan u AAV5 kapsid, kako bi se generisao AAV5-RK miR-708. Pored toga, generisan je AAV5 miR-kontrolni vektor. C57bl miševi divljeg tipa primili su subretinalnu injekciju 1x10<8>vgs AAV5-RK miR-708 ili AAV5 miR-kontrole u kontralateralnom oku.1 mesec nakon injekcije, miševi su eutanazirani i neuro retina je ekstrahovana i brzo zamrznuta za kPCR analizu eksprimiranja gena.
[0131] SLIKA 10A pokazuje da su mišje oči kojima je injekcijom dat AAV5 vektor koji eksprimira miR-708 imale smanjeno eksprimiranje rodopsina, u poređenju sa mišjim očima kojima je injekcijom dat AAV5 miR-kontrola vektor. Suprotno tome, eksprimiranje drugog gena koji je specifičan za štapiće, Rod Derived Cone Viability Factor (RdCVF), nije bilo pod uticajem (SLIKA 10B). SLIKA 10C potvrđuje da su očima kojima je injekcijom dat vektor AAV5miR708 pokazale značajno povećanje broja kopija miR-708 u poređenju sa očima koje su dobila AAV5miR kontrolu. Ovi rezultati sugerišu da su vektori zasnovani na AAV koji eksprimiraju miR-708 u fotoreceptorskim štapićima efikasni u smanjenju endogenog eksprimiranja rodopsina in vivo.
[0132] Kako bi se pokazala funkcionalna značajnost obaranja rodopsina, mišje oči tretirane AAV5 miR-708 ili AAV5 miR-kontrolom analizirane su elektroretinogramom (ERG) za procenu funkcije mrežnjače. Oči koje su primile vektor AAV5 miR-708 pokazale su smanjeni skotopični odgovor, kao što je očekivano ako su nivoi rodopsina smanjeni (SLIKA 11A). Skotopični ERG odgovori su procena funkcije štapića, i ovo merenje može biti povezano sa nivoom rodopsina. Međutim, funkcija čepića kod istih životinja, procenjena fotopičnim ERG, bila je nepromenjena nakon isporuke AAV5 miR-708 (SLIKA 11B), potvrđujući da miR-708 ima biološki efekat na fotoreceptorske štapićaste ćelije istovremeno štedeći čepićaste ćelije. Ovi podaci prikazuju da isporuka AAV5 miR-708 dovodi do biološkog efekta koji je ograničen na ciljanu štapićastu ćeliju.
Primer 5: konstrukt vektora za suzbijanje/zamenu hRodopsina sa miR-708 kasetom eksprimiranja u koju je ugrađen intron
[0133] miR-708 se normalno eksprimira in vivo iz prvog introna u ODZ4 genu. Stoga je dizajniran nov konstrukt zasnovana na sekvenci miR-708 i njenoj endogenoj sekvenci/bočnoj sekvenci. miR-708 sekvenca je ugrađena u sintetički intron i klonirana nizvodno od promotera rodopsin kinaze (RK), specifičnog za fotoreceptor, ali uzvodno od cDNK hRodopsina. Endogena miR-708 sekvenca, uključujući njene bočne regulatorne i procesne sekvence, klonirana je u β-globinsku intronsku sekvencu uzvodno od hRodopsin cDNK sekvence, ali nizvodno od RK promotera. Kao takva, miR-708 sekvenca je 5' u odnosu na kodirajuću sekvencu rodopsina.
[0134] SLIKA 12 pruža dijagram ovog 5' vektora za suzbijanje/zamenu. hRodopsin (kom nedostaje 3' UTR mir708 ciljana sekvenca) je kontrolisan od strane RK promotera. Endogena miR-708 sekvenca, uključujući endogenu skelu (npr., uključujući bilo koje Drosha/Dicer motive prepoznavanja) ugrađena je u β-globin introna. hRodopsin cDNK (bez 3' miR-708 UTR ciljane sekvence) uključena je nizvodno od mesta spajanja splajsovanja. miR-708 je ugrađen unutar β-globina, koji je smešten nizvodno od RK promotera, i zbog toga je miR-708 prerađen nakon splajsovanja intronske sekvence P-globina. Pored toga, generisan je vektor sa
4
sličnom strukturom koji sadrži kontrolni miR.
[0135] Vektor opisan na SLICI 12, ili vektor sa kontrolnom miRNK, korišćen je za transfekciju WERI ćelija. WERI ćelije su korišćene zato što eksprimiraju malo, ako išta, endogenog miR-708, i dopuštaju RK promoter. WERI ćelije su transficirane sa cDNK koja kodira P23H mRodopsin (sa 3'UTR miR-708 sekvencom). Ispitivani su nivoi obaranja rodopsina (nivoi RNK) i nivoi UPR gena CHOP i BIP u transficiranim ćelijama.
[0136] SLIKA 13 pokazuje da ćelije ko-transficirane sa mRodopsinom (P23H) i miR-708 vektorom imaju smanjene nivoe mRodopsina u poređenju sa ćelijama koje su ko-transficirane sa mRodopsinom i kontrolnim miRNK vektorom. Pored toga, UPR geni CHOP i BiP su takođe bili regulisani u miR-708 transficiranim ćelijama u poređenju sa kontrolom. Ovi podaci sugerišu da upotreba endogene skele miR708 sa intronskom eksprimiranjem miR708 daje alternativnu skelu koja podržava obradu i eksprimiranje miR708.
Primer 6: Poređenje različitih skela miR-708
[0137] Niži nivoi eksprimiranja miR-708 mogu biti korisni u smanjenju bilo kakvih potencijalnih efekata miRNK izvan cilja, u kliničkim uslovima. Zbog toga su različite miR skela testirane na snagu eksprimiranja u WERI ćelijskoj liniji ljudskog retinoblastoma.
[0138] SLIKA 14 prikazuje kvantifikovane nivoe miR-708 u WERI ćelijama transficiranim sa CBA-vođenim miR-708, RK-vođenim miR708 korišćenjem miR-155 skele prikazane na SLICI 4, ili miR-708 hRodopsin vektor sa ugrađenim RK, koji je prikazan na SLICI 12. miR-708 eksprimiranje u RK intronskom sistemu nije bilo tako robusno kao sistem vođen sa CBA. Međutim, eksprimiranje miR-708 je i dalje znatno iznad pozadine i oko 5 puta niže od pRKmiR708 koji koristi miR-155 skelu. Treba imati na umu da je hRodopsin ko-eksprimiran iz vektora sa ugrađenim intronom, ali ne i iz vektora CBA ili RK miR-155 skele.
[0139] Dalje, nivoi mRNK hRodopsina su upoređeni u WERI ćelijama koje eksprimiraju miR-708 vektor suzbijanja/zamene sa ugrađenim intronom, ili miR-kontrolni vektor. SLIKA 15 pokazuje da su WERI ćelije transficirane sa miR-708 vektorom suzbijanja/zamene sa ugrađenim intronom imale sličan nivo hRodopsina u poređenju sa ćelijama koje su bile transficirane kontrolnim vektorom. Ovi rezultati prikazuju da je eksprimiranje hRodopsina iz vektora suzbijanja/zamene, kom nedostaje 3' UTR miR-708 ciljana sekvenca, refraktorno na inhibiciju eksprimiranjem miR-708. Obe ćelije su pokazale veće eksprimiranje hRodopsina u odnosu na ne-transficirane WERI ćelije.
Primer 7: Obaranje mutantnog rodopsina pomoću miR-708 vektora suzbijanja/zamene smanjuje marker ER stresa
[0140] Ispitana je sposobnost vektora suzbijanja/zamene miR-708 da smanjuje ER stres u ćelijama koje eksprimiraju mutantni rodopsin. WERI ćelije koje eksprimiraju ne-glikoziliran, P23H mutantni rodopsin (N2K/N15K/P23H), sa ili bez 3'UTR miR708 ciljane sekvence, su transficirane sa vektorom suzbijanja zamene opisanim na SLICI 12. Ćelije su sakupljene i RNK je ekstrahovana za merenje splajsovanja X-box vezujućeg proteina 1 (XBP-1). XBP-1 je faktor transkripcije važan za regulisanje gena ER stresa. Njegovo splajsovanje je poznati marker ćelijskog ER stresa/UPR; ćelije podvrgnute UPR pokazuju povećane nivoe spajanja XBP-1.
[0141] Kao što je prikazano na SLICI 16, ćelije koje eksprimiraju mutantni rodopsin sa 3' UTR ciljanom sekvencom su smanjile splajsovanje XBP-1 kada su transficirane miR-708 vektorom suzbijanja/zamene. Suprotno tome, ćelije koje eksprimiraju mutirani P23H rodopsin bez ciljane sekvence 3'UTR miR-708 imale su ekvivalentne nivoe spajanja XBP-1 u poređenju sa ćelijama koje su transficirane miR-kontrolnom sekvencom. Ovi rezultati prikazuju da je obaranje mutantnog rodopsina upotrebom vektora suzbijanja/zamene miR-708 efikasno u smanjenju ER stresa.
Primer 8: Eksprimiranje miR-708 u β-globin intronskoj skeli smeštenoj u rodopsina UTR 3' povećava eksprimiranje rodopsina i miR-708
[0142] Kako bi se ispitivalo da li položaj miR-708 skele utiče na njegovo eksprimiranje, konstruisan je vektor gde je miR-708 sekvenca (uključujući njene bočne regulacione/procesne sekvence) klonirana u β-globin intronsku sekvencu nizvodno od cDNK rodopsina., tj. unutar 3' UTR. SLIKA 17 prikazuje dijagram ovog 3' vektora za suzbijanje/zamenu, koji je sličan prikazanom na SLICI 12, osim što je miR-708 ljudska βglobin intronska skela u 3' UTR od cDNK rodopsina, a ne u 5' UTR.
[0143] Kako bi se utvrdilo da li je položaj miR-708 skeleta ljudskog β-globin introna u vektoru koji utiče na eksprimiranje miR-708 ili hRodopsina iz vektora, WERI ćelije su transficirane sa 5' UTR vektorom sa SLIKE 12 ili 3' UTR vektorom sa SLIKE 17. SLIKA 18 prikazuje eksprimiranje hRodopsina i miR-708 u ovim ćelijama. Otkriveno je da vektor sa miR-708 skelom u 3' UTR proizvodi više nivoe hRodopsin, i miR-708 RNK nego vektor koji koristi 5' UTR konfiguraciju.
Primer 9: Procena vektora suzbijanja/zamene u P23H mišem modelu degeneracije mrežnjače
[0144] Konstrukti suzbijanja/zamene procenjuju se u P23H mišjem modelu degeneracije mrežnjače. U ovom modelu, mutirani P23H protein eksprimiran u ćelijama fotoreceptora štapića indukuje ER stres/UPR, izazivajući apoptozu i krajnju smrt štapića (Lee, E.S., i dr. (2007) FEBS Lett.581(22):4325-32). Nakon smrti štapićastih ćelija dolazi do ne-ćelijskiautonomne smrti čepićastih ćelija.
[0145] P23H miš se tretira sa AAV vektorom suzbijanja/zamene koji eksprimira miR-708 i genom ljudskog rodopsina, koji je refraktoran na obaranje od strane miR708 (jer mu nedostaje miR-708 ciljana sekvencu). Vektor za suzbijanje/zamenu rezultuje padom WT i P23H mišjih rodopsina, ali zamenski gen rodopsina nadoknađuje smanjenje WT nivoa rodopsina. Zbog toga, vektor pruža neophodni rodopsin štapića kako bi se održala funkcija i celovitost štapićastih ćelija.
[0146] Takođe je testiran alternativni konstrukt suzbijanja/zamene. Kao što je prikazano na SLICI 19, ovaj alternativni vektor pokreće eksprimiranje miR-708 od RK promotera i koeksprimira hRodopsin (refraktoran sa miR-708 obaranjem) koristeći mišji promoter opsina.
[0147] Ovi vektori suzbijanja/zamene takođe su testirani kao što je gore opisano u P23H mišjem modelu, u kom endogeni gen mRodopsina sadrži jednu kopiju alela gubitka funkcije (npr., miš je heterozigotan u odnosu na alel mRodopsin obaranja). Ovaj heterorozni mišji model može se konstruisati korišćenjem standardnih mišjih genetskih tehnika od mRho<-/->miša i gore opisani P23H model. Bez želje da se veže teorijom, smatra se da je ovaj mRho<-/->P23H mišji model, koji sadrži jednu kopiju mutiranog hRodopsin P23H alela i jednu kopiju gena divljeg tipa, može ličiti na ljudski ADRP genotip, kod kog pacijenti imaju jednake kopije mutantnih i rodopsinskih alela divljeg tipa.
Primer 10: Procena dodatnih vektora za suzbijanje/zamenu
[0148] Klonirano je nekoliko vektora koji eksprimiraju i miR-708 (ili kontrolnu sekvencu miRNK) i hRodopsin iz jednog vektora. Vektori se međusobno razlikuju po tome što bočne miRNK sekvence sekvence potiču iz miR-155 (preuzeto iz Invitrogen „Block-It“ sistema) ili iz endogenih miR-7085' i 3' bočnih sekvenci. miRNK sekvence su ugrađene u hβ-globin intron nizvodno od promotera rodopsin kinaze i uzvodno od hRodopsin ORF. Cilj je bio testirati da li su eksprimiranje i obrada miRNK slični od svakog konstrukta. Dodatni par vektora je sadržao miRNK sekvence (kontrola ili miR-708) nizvodno od hRodopsin ORF, takođe ugrađene u β-globin intron. U ovom eksperimentu su testirani samo vektori koji sadrže miR-708 sekvencu endogenih bočnih 5' i 3' smeštenih nizvodno od hRodopsin ORF, i endogenih miR-708 i miR-155 bočnih sekvenci testiranih u vektorima gde se β-globin intron nalazi se uzvodno od hRodopsin ORF. WERI ćelije su transficirane sa svakim konstruktom i određeno je eksprimiranje miR-708 i hRodopsina.
[0149] Rezultati u SLIKA 20 ukazuju na to da miR-155 bočne sekvence stvaraju bolje eksprimiranje (ili obradu miRNK) miR-708 u poređenju sa endogenim miR-708 bočnim sekvencama. Eksprimiranje miR-708 bilo je oko 10 puta veća u onim ćelijama koje su transficirane vektorima koji sadrže miR-155 bočne sekvence u poređenju sa miR-708 bočnim sekvencama. Vektori koji sadrže miR-708 bočne sekvence imali su niže eksprimiranje miR-708 bez obzira da li su sekvence uzvodno ili nizvodno u odnosu na hRodopsin ORF. Na eksprimiranje hRodopsina nije uticalo prekomerno eksprimiranje miR-708, jer su nivoi njegovog eksprimiranja približno jednaki bez obzira na miRNK sekvencu ko-eksprimiranu u vektoru. MiR-708 eksprimiranje nije detektovano u vektorima koji sadrže kontrolne miRNK sekvence, kao što je očekivano.
Primer 11: Procena dodatnih vektora suzbijanja/zamene sa mutiranom ciljanom sekvencom miR-708
[0150] Kao što je gore opisano, pronađena je konsenzus sekvenca koja odgovara pretpostavljenom miR-708 ciljanom mestu u 3' UTR nekoliko sisarskih gena rodopsina (Behrman, S., i dr. (2011) J. Cell Biol.192(6):919-27). Ovaj primer pokazuje da se rodopsin sa mutiranom ciljanom sekvencom miR-708 može koristiti u vektoru suzbijanja/zamene.
[0151] Konstruisan je rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i genom ljudskog rodopsina. Ljudski gen rodopsina je mutiran u miR-708 ciljanoj sekvenci (SEQ ID NO: 19) supstitucijom nukleotida, brisanjem ili umetanjem kako bi se smanjilo ili sprečilo prepoznavanje miR-708. U nekim primerima briše se cela ciljana miR-708 sekvenca.
U nekim primerima, smanjenje ili prevencija od strane miR-708 se meri u odnosu na miR-708 prepoznavanje divljeg tipa rodopsina 3'UTR koji sadrži miR-708 ciljanu sekvencu.
[0152] Kako bi se testiralo suzbijanje autosomno dominantnog rodopsina miR-708 sa pratećim eksprimiranjem divljeg tipa rodopsina, HEK-293 ćelije koje eksprimiraju P23H mutantni mRodopsin gen koji kodira 3'UTR miR-708 ciljanu sekvencu transfeciraju se plazmidom koji eksprimira miR-708 i ljudski rodopsin sa (CBA-miR-708-hRho-3'UTR-) ili bez (CBA-miR-708-hRho-3'UTR<+>) mutirane miR-708 ciljane sekvence. Takođe se koristi i miR kontrola kao što je opisano u Primeru 2. Nakon 72 sata, ćelije se sakupljaju, i eksprimiranje mP23H Ropsopsina i ljudskog rodopsin proteina se analiziraju koristeći Western blot. Smanjenje eksprimiranja P23H mRodopsin proteina u ćelijama transficiranim sa CBA-miR-708-hRho-3'UTR<->i CBA-miR-708-hRho-3'UTR<+>u poređenju sa ćelijama koje su transficirane CBA-miR-kontrolnim vektorom ukazuju na miR-708 aktivnost.
Eksprimiranje ljudskog rodopsina u ćelijama transficiranim sa CBA-miR-708-hRho-3'UTR-ali ne i CBA-miR-708-hRho-3'UTR<+>ukazuje da je rodopsin kodiran sa CBA-miR-708-hRho-3'UTR<->refraktoran prema suzbijanju od strane miR-708.
Primer 12: AAV-posredovano suzbijanje endogenog rodopsina i eksprimiranje ljudskog rodopsina u mišjoj mrežnjači
[0153] Na osnovu gore opisanih eksperimenata, izvedeni su dalji eksperimenti kako bi se testirala strategija suzbijanja/zamene rodopsina u netaknutom oku. Ovaj primer demonstrira efikasnost AAV vektora za suzbijanje/zamenu izgrađenog pomoću miR-708 skele u mišjoj mrežnjači.
[0154] AAV5 kapsid sa vektorom koji nosi štapićasto-specifični promoter opsina, miR-708 skelu (npr., miR-708 endogene skela/bočne sekvence) i ljudski zamenski gen rodopsina. U jednoj verziji ovog vektora, miR-708 sekvenca (npr., miR-708 sekvenca koja vezuje miR-708 ciljanu sekvencu) je ubačena da pokrene eksprimiranje miR-708 u kontekstu miR708 skele i gena za zamenu ljudskog rodopsina (AAV5OPSmiR708708hRHO). U drugoj verziji ovog vektora, generisan je kontrolni vektor koji je sadržao miR kontrolnu sekvencu (AAV5OPSmiRcontrol708hRHO). U oba vektora, zamena ljudskog gena rodopsina bila je refraktorna do obaranja miR-708, jer joj nedostaje miR-708 ciljana sekvenca. Oba vektora su injekcijom data subretinalno u mrežnjače miševa divljeg tipa. Za svakog miša, kontralateralnom naivnom oku nije data injekcija, i eksprimiranje u svakoj mrežnjači kojoj je data injekcija je normalizovano kao eksprimiranje savijanja u odnosu na kontralateralnu, mrežnjaču kojoj nije data injekcija. Tri nedelje nakon injekcije, mrežnjače su sakupljene i analizirane za miR-708 nivoe (SLIKA 21A) mRNK nivoe mišjeg rodopsina (SLIKA 21B) i ljudski rodopsin (SLIKA 21C).
[0155] SLIKA 21A pokazuje porast nivoa miR-708 u mišjoj mrežnjači nakon injekcije sa AAV5OPSmiR708708hRHO vektorom, u poređenju sa kontralateralnim naivnim okom.
Značajno smanjenje mišjeg rodopsina izmereno je u oku koje je primilo AAV5OPSmiR708708hRHO, i nije izmereno smanjenje mišjeg rodopsina u očima koja su dobila kontrolni vektor, AAV5OPSmiRcontrol708hRHO (SLIKA 21B). Pored toga, nivo rodopsina kod ljudi povećan je do 100 puta za oba vektora, u poređenju sa kontralateralnim, naivnim očima kojima nisu date injekcije (SLIKA 21C). Ovi podaci prikazuju da je AAV5OPSmiR708708hRHO vektor bio efikasan in vivo.
[0156] Ukratko, optimizovani vektor suzbijanja/zamene AAV5OPSmiR708708hRHO postigao je obaranje mišjeg rodopsina pomoću miR-708 (endogeni mišji rodopsin ima 3'UTR ciljanu sekvencu) sa pratećim eksprimiranjem zamenskog ljudskog rodopsina, koji je bio refraktoran za miR708 obaranje (ljudskom zamenskom genu rodopsina nedostaje 3'UTR miR708 ciljana sekvenca). Ovi rezultati prikazuju efikasnost strategije za suzbijanje/zamenu u netaknutom oku sisara.
Primer 13: Validacija vektora kandidata u ljudskim ćelijama
[0157] Vektori kandidati zasnovani na AAV5 su zatim testirani za sposobnost promovisanja miR-708 eksprimiranje i ljudskog rodopsina u ljudskim ćelijama (HeLa).
[0158] Ispitana su dva različita promotera: rodopsin kinaza (GRK1) i promoter opsina.
Promoter rodopsin kinaze je opisan iznad. Promoter opsina (prikazan u SEQ ID NO: 22) sadrži 676bp fragment koji kodira 400bp CMV pojačivač uzvodno od sekvence promotera opsina (-500bp - 15bp). Pored toga, uključena je NRL sekvenca od 65bp; ona kodira neuronskog baznog zatvarača mrežnjače (faktor transkripcije specifičan za fotoreceptor čepića). Nizvodno od konstrukta promotera je hibridna intronska sekvenca iz CBA egzona1 i minutnog virusa miša (MVM) - nazvana MVM intronska sekvenca (prikazana u SEQ ID NO: 23). Dijagram ovog konstrukta promotera je prikazan na SLIKA 22.
[0159] Korišćene su dve različite skele: miR-155 skela ili miR-708 skela. Obe su ugrađene u intron beta globina. Ukupno su testirana 4 kandidata vektora: AAV5GRK1miR708_155hRho (vektor AAV5 sa promoterom rodopsin kinaze koji pokreće eksprimiranje miR-708 u miR-155 skeli i ljudski rodopsin minus miR-708 ciljana sekvenca; SEQ ID NO: 24), AAV5GRK1miR708_708h vektor sa promoterom rodopsin kinaze, koji pokreće eksprimiranje miR-708 u miR-708 skeli i ljudski rodopsin minus miR-708 ciljana sekvenca; SEQ ID NO: 25), AAV5OPSmiR708_155hRho (AAV5 vektor sa promoterom opsina koji pokreće eksprimiranje miR-708 u skela miR-155 i ljudski rodopsin minus miR-708 ciljana sekvenca; SEQ ID NO: 26) i AAV5OPSmiR708_708hRho (AAV5 vektor sa promoterom opsina koji pokreće eksprimiranje miR-708 u miR-708 skeli i ljudski rodopsin minus miR-708 ciljana sekvenca; SEQ ID NO: 27). SLIKA 23A prikazuje miR-708 sekvencu ugrađenu u intron beta globina. miR-708 i miR-155 skele su prikazane na SLIKAMA 23B i 23C, respektivno.
[0160] Svaki od 4 AAV5 vektora kandidata korišćen je za inficiranje HeLa ćelija (korišćenjem AdTs149 pomoćnog virusa), i mereni su miR-708 i hRodopsin. Kao što je prikazano na SLICI 24, sva četiri vektora rezultovala su eksprimiranjem miR-708 i hRodopsina u ljudskim ćelijama in vivo, u poređenju sa vektorima koji pokreću eksprimiranje kontrolnog miR bilo od opsina ili od promotera rodopsin kinaze (Ops miR-kont i RK miR-kont, respektivno). Ovi rezultati prikazuju uspešnu validaciju nekoliko vektora koji se mogu koristiti za strategije suzbijanja/zamene (poput onih opisanih iznad) u ljudskim ćelijama.
1
SEKVENCE
[0161]
miR-708 nukleotidna sekvenca
Ljudska rodopsin aminokiselinska sekvenca
Ljudska rodopsin cDNK-UTR izbrisana
Ljudska rodopsin cDNK-uključuje 3'UTR
2
RK-miR-708-op-rodopsin
4
RK-intron-miR-708-op-hRho wt
Himerni intron
pCBA-hrodopsin-miR708 (miR-155 skela)
Endogena MIR708 skela
pRK-hrodopsin-miR-708 (mir708 u miR708 endogenoj skeli, nalazi se u 3' UTR od hrodopsina)
β-globin intronska sekvenca
MIR708 sekvenca u nativnoj skeli
1
Ljudski rodopsin miR-708 cilj od 3'UTR
ITR sekvenca divljeg tipa
MVM intron
AAV5GRK1miR708 155hRho (AAV5 vektor sa promoterom rodopsin kinaze koji vodi eksprimiranje miR-708 u miR-155 skeli i ljudski rodopsin minus miR-708 ciljana sekvenca)
2
AAV5GRK1miR708_708hRho (AAV5 vektor sa promoterom rodopsin kinaze koji vodi eksprimiranje miR-708 u miR-708 skeli i ljudski rodopsin minus miR-708 ciljana sekvenca)
AAV5OPSmiR708 155hRho (AAV5 vektor sa promoterom opsina koji vodi eksprimiranje miR-708 u miR-155 skela i ljudski rodopsin minus miR-708 ciljana sekvenca)
AAV5OPSmiR708 708hRho (AAV5 vektor sa promoterom opsina koji vodi eksprimiranje miR-708 u miR-708 skela i ljudski rodopsin minus miR-708 ciljana sekvenca)
4
Homeodomenske čepićase ćelije koje sadrži faktor transkripcije
Faktor neuronskog baznog leucinskog zatvarača mrežnjače TTTCTGCAGCGGGGATTAATATGATTATGAACACCCCCAATCTCCCAGATG CTGATTCAGCCAGGA (SEQ ID NO:30)
SPISAK SEKVENCI
1
2
4
1
2
4

Claims (21)

Patentni zahtevi
1. rAAV čestica koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 ili koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira miR-708 i nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin.
2. rAAV čestica prema patentnom zahtevu 1, gde je nukleinska kiselina koja kodira miR-708 i/ili nukleinska kiselina koja kodira rodopsin operativno povezana sa promoterom.
3. rAAV čestica prema patentnom zahtevu 2, gde promoter eksprimira miR-708 i/ili rodopsin u fotoreceptorskim ćelijama.
4. rAAV čestica prema patentnom zahtevu 2 ili 3, gde promoter sadrži RK promoter, promoter opsina ili CBA promoter.
5. rAAV čestica prema patentnom zahtevu 4, gde i) nukleinska kiselina koja kodira miR-708 i nukleinska kiselina koja kodira rodopsin su operativno povezane za jedan RK promoter ili promoter opsina; ili ii) nukleinska kiselina koja kodira miR-708 je operativno povezana za prvi RK promoter ili prvi promoter opsina i nukleinska kiselina koja kodira rodopsin je operativno povezana za drugi RK promoter ili drugi promoter opsina.
6. rAAV čestica prema patentnom zahtevu 5, gde nukleinska kiselina koja kodira miR-708 jeste 5' za nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin, ili gde nukleinska kiselina koja kodira miR-708 jeste 3' za nukleinsku kiselinu koja kodira rodopsin.
7. rAAV čestica prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, gde je nukleinska kiselina koja kodira miR-708 ugrađena u intron.
8. rAAV čestica prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, gde nukleinska kiselina koja kodira miR-708 sadrži endogenu miR-708 skelu ili miR-155 skelu.
9. rAAV čestica prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, gde nukleinska kiselina koja kodira rodopsin sadrži supstituciju, umetanje ili brisanje nukleinske kiseline u miR-708 ciljanoj sekvenci ili joj nedostaje 3' UTR miR-708 ciljana sekvenca gde supstitucija, umetanje ili brisanje smanjuje ili sprečava prepoznavanje od strane miR-708.
10. rAAV čestica prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde nukleinska kiselina koja kodira miR-708 sadrži nukleinsku kiselinu SEQ ID NO: 1, ili gde nukleinska kiselina koja kodira miR-708 sadrži nukleinsku kiselinu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 1; i gde rodopsin sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 3 ili gde nukleinska kiselina koja kodira rodopsin sadrži nukleinsku kiselinu koja ima 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 3.
11. rAAV čestica prema patentnom zahtevu 1, gde AAV virusna čestica sadrži rekombinantni virusni genom koji sadrži polinukleotid od SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, ili SEQ ID NO: 27; ili gde AAV virusna čestica sadrži rekombinantni virusni genom sadrži polinukleotid koji ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, ili SEQ ID NO: 27.
12. rAAV čestica prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde AAV virusna čestica sadrži AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV5 tirozin mutant, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, kozji AAV, AAV1/AAV2 himerni, goveđi AAV, ili mišji AAV kapsid rAAV2/HBoVl serotip kapsid; i gde rAAV vektor sadrži AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, kozji AAV, goveđi AAV, ili obrnuta terminalna ponavljanja (ITR) mišjeg AAV serotipa.
13. rAAV čestica prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde rAAV virusna čestica obuhvata AAV-5 kapsid ili AAV-5 tirozin mutantni kapsid, gde vektor obuhvata AAV2 ITR.
14. Sastav koja sadrži rAAV česticu prema bilo kom patentnom zahtevu 1-13.
15. rAAV čestica prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13, za upotrebu u postupku tretmana retinitis pigmentoze kod sisara, gde je retinitis pigmentoza povezana sa mutacijom endogenog gena rodopsina kod sisara.
16. rAAV čestica prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13, za upotrebu u postupku tretmana stresa endoplazmatičnog retikuluma (ER) u ćeliji sisara, gde je ER stres povezan sa mutacijom gena endogenog rodopsina kod sisara.
17. rAAV čestica za upotrebu prema patentnom zahtevu 15 ili 16, gde je ćelija očna ćelija ili fotoreceptorska ćelija, opciono fotoreceptorska štapićasta ćelija.
18. rAAV čestica za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 15-17, gde se rAAV čestica isporučuje injekcijom u subretinalni prostor mrežnjače sisara na jednom ili više mesta.
19. rAAV čestica za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 15-18, gde se rAAV čestica intravitrealnom injekcijom isporučuje sisaru.
20. rAAV čestica za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 15 ili 17-19, gde je retinitis pigmentoza autosomno dominantna retinitis pigmentoza ili autosomno recesivna retinitis pigmentoza.
21. rAAV čestica za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 15-20, gde se rAAV virusna čestica koja kodira miR-708 i druga rAAV virusna čestica koja kodira rodopsin primenjuju istovremeno sisaru, ili se rAAV virusna čestica koja kodira miR-708 i rAAV virusna čestica koja kodira rodopsin primenjuju sekvencijalno sisaru.
RS20191551A 2014-03-21 2015-03-20 Genska terapija za retinitis pigmentozu RS59634B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461969027P 2014-03-21 2014-03-21
PCT/US2015/021896 WO2015143418A2 (en) 2014-03-21 2015-03-20 Gene therapy for retinitis pigmentosa
EP15716232.2A EP3119437B1 (en) 2014-03-21 2015-03-20 Gene therapy for retinitis pigmentosa

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59634B1 true RS59634B1 (sr) 2020-01-31

Family

ID=52829343

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191551A RS59634B1 (sr) 2014-03-21 2015-03-20 Genska terapija za retinitis pigmentozu
RS20230833A RS64611B1 (sr) 2014-03-21 2015-03-20 Genska terapija za retinitis pigmentozu

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230833A RS64611B1 (sr) 2014-03-21 2015-03-20 Genska terapija za retinitis pigmentozu

Country Status (36)

Country Link
US (3) US10383953B2 (sr)
EP (3) EP3628334B1 (sr)
JP (3) JP6669664B2 (sr)
KR (3) KR20230006039A (sr)
CN (2) CN115252823A (sr)
AR (1) AR099837A1 (sr)
AU (3) AU2015230942B2 (sr)
CA (2) CA2943185C (sr)
CL (1) CL2016002333A1 (sr)
CR (1) CR20160480A (sr)
DK (2) DK3628334T5 (sr)
DO (1) DOP2016000237A (sr)
EA (1) EA201691891A1 (sr)
EC (1) ECSP16083000A (sr)
ES (2) ES2760263T3 (sr)
FI (1) FI3628334T3 (sr)
HR (2) HRP20192141T1 (sr)
HU (2) HUE063460T2 (sr)
IL (3) IL247543B (sr)
LT (2) LT3628334T (sr)
MA (1) MA39390B2 (sr)
MX (2) MX376190B (sr)
MY (2) MY203654A (sr)
NZ (1) NZ724622A (sr)
PE (1) PE20161252A1 (sr)
PH (1) PH12016501684B1 (sr)
PL (2) PL3628334T3 (sr)
PT (2) PT3628334T (sr)
RS (2) RS59634B1 (sr)
SG (3) SG11201607005UA (sr)
SI (2) SI3628334T1 (sr)
TW (2) TWI706789B (sr)
UA (1) UA120050C2 (sr)
UY (1) UY36044A (sr)
WO (1) WO2015143418A2 (sr)
ZA (1) ZA201605924B (sr)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3628334B1 (en) 2014-03-21 2023-06-28 Genzyme Corporation Gene therapy for retinitis pigmentosa
SG11201706444TA (en) 2015-02-10 2017-09-28 Genzyme Corp VARIANT RNAi
CN108472390B (zh) 2015-12-03 2022-04-15 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 SynP162,用于基因在视杆光感受器中特异性表达的启动子
WO2017093934A1 (en) * 2015-12-03 2017-06-08 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Synp160, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors
WO2017093566A1 (en) * 2015-12-04 2017-06-08 Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) Promoters and uses thereof
WO2017151823A1 (en) 2016-03-01 2017-09-08 University Of Florida Research Foundation, Inc. Aav vectors for treatment of dominant retinitis pigmentosa
AU2017293773A1 (en) * 2016-07-05 2019-02-21 The Johns Hopkins University CRISPR/Cas9-based compositions and methods for treating retinal degenerations
EP3600446A1 (en) * 2017-03-21 2020-02-05 Michalakis, Stylianos Gene therapy for the treatment of cngb1-linked retinitis pigmentosa
MY205041A (en) * 2017-09-22 2024-09-29 Genzyme Corp Variant rnai
AU2018338608B2 (en) * 2017-09-27 2025-09-11 Sigilon Therapeutics, Inc. Methods, compositions, and implantable elements comprising active cells
CN107961380B (zh) * 2017-11-23 2020-05-05 清华大学 试剂在制备药物中的用途、筛选药物的方法以及药物组合物
US12162994B2 (en) 2018-03-02 2024-12-10 Sigilon Therapeutics, Inc. Biocompatible hydrogel capsules and process for preparing same
JP2021519067A (ja) * 2018-03-23 2021-08-10 ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク 常染色体優性疾患のための遺伝子編集
MX2020010369A (es) 2018-04-04 2020-10-22 Sigilon Therapeutics Inc Particulas implantables y metodos relacionados.
CN112204145B (zh) * 2018-06-01 2024-03-26 佛罗里达大学研究基金会有限公司 用于治疗显性视网膜色素变性的组合物和方法
GB201817469D0 (en) * 2018-10-26 2018-12-12 Univ Oxford Innovation Ltd Gene therapy for retinal disease
CN111518813B (zh) * 2019-02-03 2023-04-28 武汉纽福斯生物科技有限公司 视紫红质的编码序列、其表达载体构建及其应用
JP7637060B2 (ja) * 2019-03-04 2025-02-27 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ａｋｔ経路を標的とする神経保護遺伝子療法
CA3133455A1 (en) * 2019-03-21 2020-09-24 Ptc Therapeutics, Inc. Vector and method for treating angelman syndrome
CN114555084A (zh) * 2019-08-15 2022-05-27 费城儿童医院 用于治疗SCA1的转基因和内含子衍生miRNA联合疗法
JP2023510799A (ja) * 2020-01-10 2023-03-15 ソリッド・バイオサイエンシーズ・インコーポレーテッド 併用療法のためのウイルスベクター
BR112022014852A2 (pt) * 2020-01-29 2022-10-11 Genzyme Corp Proteínas modificadas do capsídeo viral adenoassociado para terapia gênica ocular e métodos de uso das mesmas
EP4071247A4 (en) * 2020-07-24 2023-08-23 Rznomics Inc. TRANSSPLICING OF RIBOZYME SPECIFIC TO RHODOPSIN TRANSCRIPTOME AND ITS USE
JP2023535956A (ja) * 2020-07-29 2023-08-22 ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファンデーション インコーポレーティッド 改善されたｘ連鎖性網膜分離症のａａｖ媒介療法
WO2022221405A1 (en) * 2021-04-16 2022-10-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of x-linked juvenile retinoschisis
TWI832531B (zh) * 2022-11-02 2024-02-11 慈濟學校財團法人慈濟大學 Rip1抑制劑或mlkl抑制劑用於治療或預防遺傳性視網膜失養症的用途
CN117625619B (zh) * 2023-12-05 2024-11-12 云舟生物科技(广州)股份有限公司 核酸分子及其作为特异启动子的应用
CN120230798A (zh) * 2023-12-29 2025-07-01 上海朗昇生物科技有限公司 用于视网膜基因递送的重组腺相关病毒载体及其应用

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5262529A (en) * 1990-01-24 1993-11-16 President And Fellows Of Harvard College Diagnosis of hereditary retinal degenerative diseases
US5985583A (en) * 1992-06-23 1999-11-16 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Cloning and expression of gonadotropin-releasing hormone receptor
US6989264B2 (en) 1997-09-05 2006-01-24 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
ATE403715T1 (de) 1999-08-09 2008-08-15 Targeted Genetics Corp Erhöhung der expression einer einzelsträngigen, heterologen nukleotidsequenz von einem rekombinanten viralen vektor durch ausgestaltung der sequenz in einer art und weise, dass basenpaarungen innerhalb der sequenz entstehen
NZ522840A (en) 2000-06-01 2004-12-24 Univ North Carolina A parvovirus vector that carries a duplexed genome resulting in co-packaging of strands of plus and minus polarity tethered together
CN103555677B (zh) 2001-11-13 2018-01-30 宾夕法尼亚大学托管会 检测和/或鉴定腺伴随病毒(aav)序列以及分离所鉴定的新型序列的方法
EP1486567A1 (en) 2003-06-11 2004-12-15 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Improved adeno-associated virus (AAV) vector for gene therapy
CA2553976C (en) * 2004-01-22 2013-09-24 Dnavec Research Inc. Method for producing minus-strand rna viral vectors using hybrid promoter comprising cytomegalovirus enhancer and chicken .beta.-actin promoter
US7765583B2 (en) 2005-02-28 2010-07-27 France Telecom System and method for managing virtual user domains
WO2006119432A2 (en) 2005-04-29 2006-11-09 The Government Of The U.S.A., As Rep. By The Sec., Dept. Of Health & Human Services Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (aav) serotypes
US7588772B2 (en) 2006-03-30 2009-09-15 Board Of Trustees Of The Leland Stamford Junior University AAV capsid library and AAV capsid proteins
ES2907452T3 (es) 2007-04-12 2022-04-25 The Provost Fellows Found Scholars & The Other Members Of Board Of The College Of The Holy & Undiv T Supresión y reemplazo genético
US20090214478A1 (en) 2008-02-21 2009-08-27 Alberto Auricchio Method of treating ocular diseases by gene therapy
US9217155B2 (en) * 2008-05-28 2015-12-22 University Of Massachusetts Isolation of novel AAV'S and uses thereof
WO2010138263A2 (en) * 2009-05-28 2010-12-02 University Of Massachusetts Novel aav 's and uses thereof
US9078914B2 (en) 2009-09-10 2015-07-14 Velin-Pharma A/S Method for the preparation of micro-RNA and its therapeutic application
WO2011094198A1 (en) 2010-01-28 2011-08-04 The Children's Hospital Of Philadelphia Research Institute, Abramson Research Center A scalable manufacturing platform for viral vector purification and viral vectors so purified for use in gene therapy
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
EP2634253B1 (en) * 2010-10-27 2016-05-11 Jichi Medical University Adeno-associated virus virions for transferring genes into neural cells
ES2724800T3 (es) 2011-02-17 2019-09-16 Univ Pennsylvania Composiciones y métodos para alterar la especificidad de tejido y mejorar la transferencia génica mediada por AAV9
JP5884152B2 (ja) 2011-07-29 2016-03-15 シャープ株式会社 基地局、端末、通信システムおよび通信方法
ITRM20110685A1 (it) * 2011-12-23 2013-06-24 Internat Ct For Genetic En Gineering And Microrna per la rigenerazione cardiaca attraverso l induzione della proliferazione dei miociti cardiaci
WO2013123503A1 (en) * 2012-02-17 2013-08-22 The Children's Hospital Of Philadelphia Aav vector compositions and methods for gene transfer to cells, organs and tissues
EP2834259A4 (en) * 2012-04-02 2016-08-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES
US9127274B2 (en) * 2012-04-26 2015-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpinc1 iRNA compositions and methods of use thereof
PL4289948T3 (pl) 2012-05-25 2025-06-02 The Regents Of The University Of California Sposoby i kompozycje do modyfikacji kierowanego na rna docelowego dna i do nakierowanej na rna modulacji transkrypcji
JP6199965B2 (ja) * 2012-07-11 2017-09-20 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ｒｐｇｒｘ連鎖性網膜変性のａａｖ媒介型遺伝子治療
WO2014066498A1 (en) * 2012-10-23 2014-05-01 Vivek Mittal Treatment of metastatic breast cancer
US9884125B2 (en) 2013-10-04 2018-02-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Glucose-responsive insulin conjugates
EP3628334B1 (en) * 2014-03-21 2023-06-28 Genzyme Corporation Gene therapy for retinitis pigmentosa

Also Published As

Publication number Publication date
EP4345165A2 (en) 2024-04-03
WO2015143418A3 (en) 2015-11-19
DOP2016000237A (es) 2016-10-16
BR112016021017A2 (pt) 2017-10-03
EA201691891A1 (ru) 2017-01-30
JP7534348B2 (ja) 2024-08-14
US20200046851A1 (en) 2020-02-13
AU2015230942B2 (en) 2020-11-19
CA2943185A1 (en) 2015-09-24
IL275918A (en) 2020-08-31
IL247543B (en) 2020-07-30
MX2016012201A (es) 2017-01-19
FI3628334T3 (fi) 2023-09-15
PH12016501684A1 (en) 2016-10-03
MX376190B (es) 2025-03-07
PT3119437T (pt) 2019-12-12
LT3119437T (lt) 2019-12-27
AR099837A1 (es) 2016-08-24
MA39390A1 (fr) 2017-12-29
AU2021200988B2 (en) 2024-08-01
HUE046454T2 (hu) 2020-03-30
WO2015143418A2 (en) 2015-09-24
KR20230006039A (ko) 2023-01-10
US12201698B2 (en) 2025-01-21
EP3119437A2 (en) 2017-01-25
CN106456660B (zh) 2022-05-31
AU2015230942A1 (en) 2016-10-13
DK3628334T3 (da) 2023-10-02
DK3628334T5 (da) 2024-09-02
SG10201912968WA (en) 2020-02-27
TW202021627A (zh) 2020-06-16
MX2020010694A (es) 2020-11-06
UY36044A (es) 2015-10-30
LT3628334T (lt) 2023-09-25
SG10201808218YA (en) 2018-10-30
EP3628334A1 (en) 2020-04-01
IL284741A (en) 2021-08-31
PT3628334T (pt) 2023-09-26
RS64611B1 (sr) 2023-10-31
JP7048563B2 (ja) 2022-04-05
AU2024227776A1 (en) 2024-11-28
CN106456660A (zh) 2017-02-22
EP4345165A3 (en) 2024-09-25
CN115252823A (zh) 2022-11-01
ZA201605924B (en) 2017-09-27
MY190726A (en) 2022-05-12
DK3119437T3 (da) 2019-12-09
CR20160480A (es) 2016-12-14
IL247543A0 (en) 2016-11-30
CL2016002333A1 (es) 2017-05-26
PE20161252A1 (es) 2016-11-30
KR20160127832A (ko) 2016-11-04
AU2021200988A1 (en) 2021-03-11
US10383953B2 (en) 2019-08-20
SI3119437T1 (sl) 2020-01-31
TWI706789B (zh) 2020-10-11
IL284741B2 (en) 2023-02-01
US11103598B2 (en) 2021-08-31
NZ724622A (en) 2022-05-27
HRP20231077T1 (hr) 2023-12-22
JP2022084810A (ja) 2022-06-07
JP2020059737A (ja) 2020-04-16
MA39390B2 (fr) 2022-04-29
JP2017509632A (ja) 2017-04-06
MY203654A (en) 2024-07-11
JP6669664B2 (ja) 2020-03-18
ES2957840T3 (es) 2024-01-26
SG11201607005UA (en) 2016-09-29
HUE063460T2 (hu) 2024-01-28
CA3254798A1 (en) 2025-12-01
NZ762841A (en) 2023-11-24
TW201622752A (zh) 2016-07-01
IL275918B (en) 2021-07-29
PL3628334T3 (pl) 2023-12-18
HRP20192141T1 (hr) 2020-02-21
ECSP16083000A (es) 2017-02-24
EP3119437B1 (en) 2019-09-04
PH12016501684B1 (en) 2023-03-17
ES2760263T3 (es) 2020-05-13
SI3628334T1 (sl) 2023-11-30
KR20250172735A (ko) 2025-12-09
EP3628334B1 (en) 2023-06-28
PL3119437T3 (pl) 2020-04-30
US20170173183A1 (en) 2017-06-22
CA2943185C (en) 2025-09-16
UA120050C2 (uk) 2019-09-25
TWI780401B (zh) 2022-10-11
IL284741B (en) 2022-10-01
US20220054657A1 (en) 2022-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7534348B2 (ja) 網膜色素変性症のための遺伝子治療
JP7814430B2 (ja) 深部イントロン突然変異の遺伝子編集
KR102931619B1 (ko) 알파-시뉴클레인에 대한 변이형 RNAi
JP2020535803A (ja) バリアントＲＮＡｉ
HK40109446A (en) Gene therapy for retinitis pigmentosa
HK40080889A (en) Gene therapy for retinitis pigmentosa
HK40026944A (en) Gene therapy for retinitis pigmentosa
HK40026944B (en) Gene therapy for retinitis pigmentosa
HK1233535B (en) Gene therapy for retinitis pigmentosa
HK1233535A1 (en) Gene therapy for retinitis pigmentosa
BR112016021017B1 (pt) Partículas de raav, composições e uso das mesmas no tratamento para retinite pigmentosa ou no tratamento do estresse do retículo endoplasmático
HK40116478A (zh) 深内含子突变的基因编辑