TWI706789B - 用於色素性視網膜炎的基因療法 - Google Patents

Abstract

在此提供使用編碼miR-708的AAV顆粒治療色素性視網膜炎的方法。在一個方面，將病毒顆粒投予至人受試者的眼部；例如，藉由視網膜下注射。包含AAV5衣殼或其突變體的病毒顆粒在考慮之列。

Description

用於色素性視網膜炎的基因療法 對相關申請的交叉引用

本申請案請求2014年3月21日申請的美國臨時申請序列號61/969,027的優先權利益，其係以參考方式整體併入本文。

序列表

通過提述將如下以ASCII文本文件提交的內容整體併入本文：電腦可讀形式(CRF)的序列表(文件名：159792010040SeqList.txt，記錄日期：2015年3月17日，大小：63KB)。

本發明涉及AAV載體和使用AAV載體治療色素性視網膜炎的方法。

色素性視網膜炎(RP)是遺傳性視網膜變性(inherited retinal degeneration)的最常見病因，其臨床上的特徵是夜盲症(night blindness)和周邊視覺(peripheral vision)的喪失。視桿色素視紫紅質(rod visual pigment rhodopsin)公認為體染色體顯性RP(ADRP)的最常見原因，儘管已經提出了許多針對視紫紅質RP的治療方法並在 動物模型和臨床研究中進行了測試，該疾病仍然無法治癒(Kalloniatis,M.,et al.(2004)Clin.Exp.Optom.87(2)：65-80)。許多數據支持這樣的觀點，即視紫紅質RP是一種蛋白質錯誤折疊疾病，其中突變體蛋白的錯誤折疊或錯誤裝配改變其細胞命運並誘發細胞死亡(Gregersen,N.et al.(2006)Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.7：103-24)。視紫紅質基因中已知的RP突變包括無義和短小、讀框內缺失突變，其中視紫紅質基因在密碼子23(P23H)處的單一鹼基取代占美國全部顯性色素性視網膜炎病例的~7%(Dryja,T.P.,et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(22)：10177-81)。在培養的細胞中，與野生型(WT)蛋白不同，P23H突變體蛋白保留在ER中，這導致對未折疊蛋白質反應(unfolded protein response；UPR)的誘導、對蛋白酶體的抑制和突變體蛋白聚集成寡聚、高分子量形式(oligomeric,high molecular weight species)，這種寡聚、高分子量形式形成胞內包含體(intracellular inclusion)(Saliba,R.S.,et al.(2002)J.Cell Sci.115：2907-18)。類似地，P23H視紫紅質錯誤定位和/或聚集在動物RP模型的視桿細胞中(Olsson,J.E.,et al.(1992)Neuron 9(5)：815-30)，提示細胞培養物模型可以預測這種疾病的體內模型。需要的是一種緩解RP症狀的手段。

本文描述的發明提供用於治療哺乳動物中色素性視網膜炎的方法，包括將包含編碼miR-708的載體的重組腺伴隨病毒(recombinant adeno-associated virus；rAAV)病毒顆粒投予所述哺乳動物的眼部。在一些具體實例中，所述rAAV載體包含編碼miR-708和視紫紅質 的核酸。在一些具體實例中，本發明提供用於治療色素性視網膜炎的方法，包括將包含第一rAAV載體的第一rAAV病毒顆粒和包含第二rAAV載體的第二rAAV病毒顆粒投予所述哺乳動物的眼部，所述第一rAAV載體包含編碼miR-708的核酸，所述第二rAAV載體包含編碼視紫紅質的核酸。在其他具體實例中，本發明提供用於治療色素性視網膜炎的方法，包括將包含rAAV載體的rAAV病毒顆粒投予所述哺乳動物的眼部，所述rAAV載體編碼miR-708和視紫紅質的核酸。在一些具體實例中，治療色素性視網膜炎包含減少或預防與色素性視網膜炎相關的症狀。在一些具體實例或本發明中，治療色素性視網膜炎的方法包括減少與RP有關的症狀的方法，預防視網膜變性的方法，用於阻滯RP進展的方法，提高感光細胞功能的方法，等等。RP的症狀和/或病理包括但不限於失明、夜間視覺喪失、周邊視野損失、ERG功能喪失；視覺敏銳度和對比敏感度損失；視覺引導行為的喪失，視桿細胞功能下降，視桿細胞死亡，降低的暗視覺(scotopic vision)，視網膜細胞變化減少，感光細胞結構或功能的喪失；外核層(ONL)變薄或變厚；外網層(OPL)變薄或變厚；桿狀和錐狀外段的瓦解和之後的喪失(disorganization followed by loss of rod and cone outer segments)；桿狀和錐狀內段變短；雙極細胞樹突的回縮；視網膜內層包括內核層、內網層、神經節細胞(ganglion cell)層和神經纖維層的變薄或變厚；視蛋白錯誤定位；神經絲的過度表現；等等。在一些具體實例中，本發明提供預防視桿細胞功能退化和視桿細胞死亡和視錐細胞功能退化和視錐細胞死亡的方法。

在一些方面，本發明提供治療細胞中內質網(ER)壓力的方法， 包括將包含rAAV載體的rAAV病毒顆粒投予所述哺乳動物，所述rAAV載體包含編碼miR-708的核酸。在一些具體實例中，所述哺乳動物患有或有風險罹患RP。在一些具體實例中，所述哺乳動物是患有或有風險罹患RP的人。在一些具體實例中，將所述rAAV顆粒投予至哺乳動物的眼部。在一些具體實例中，所述細胞是眼細胞。在進一步的具體實例中，所述細胞是感光細胞。在更進一步的具體實例中，所述細胞是視桿細胞。在一些具體實例中，所述方法包括減少ER壓力的一種或多種細胞標誌。在進一步的具體實例中，所述ER壓力的一種或多種細胞標誌是剪接的XBP-1、CHOP或Grp78。在一些具體實例中，所述rAAV載體包含編碼miR-708和視紫紅質的核酸。在其他具體實例中，本發明提供用於治療細胞中內質網(ER)壓力的方法，包括將包含編碼miR-708的核酸的第一rAAV載體和包含含有編碼視紫紅質的核酸的第二rAAV載體的第二rAAV病毒顆粒投予至哺乳動物。

在本發明的一些具體實例中，所述編碼miR-708的核酸可操作地連接至啟動子。在一些具體實例中，所述啟動子能夠在感光細胞(例如，視桿細胞)中表現miR-708。在進一步的具體實例中，所述啟動子包括視紫紅質激酶(RK)啟動子或視蛋白啟動子。在本發明的其他具體實例中，所述編碼視紫紅質的核酸可操作地連接至啟動子。在一些具體實例中，所述啟動子能夠在感光細胞(例如，視桿細胞)中表現視紫紅質。在進一步的具體實例中，所述啟動子包括RK啟動子或視蛋白啟動子。

在一些具體實例中，本發明提供治療RP和/或ER壓力的方法，包括向哺乳動物投予包含rAAV載體的rAAV顆粒，所述rAAV載 體包含編碼miR-708和視紫紅質的核酸。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的核酸和編碼視紫紅質的核酸可操作地連接至一個RK啟動子。在其他具體實例中，所述編碼miR-708的核酸可操作地連接至第一RK啟動子或第一視蛋白啟動子，而所述編碼視紫紅質的核酸可操作地連接至第二RK啟動子或第二視蛋白啟動子。在一些具體實例中，所述第一和/或第二視蛋白啟動子包括MVM內含子(例如，SEQ ID NO：23的內含子)。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的核酸係在所述編碼視紫紅質的核酸的5’。在其他具體實例中，所述編碼miR-708的核酸係在所述編碼視紫紅質的核酸的3’。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的核酸可操作地連接至雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子。在一些具體實例中，所述編碼視紫紅質的核酸可操作地連接至雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子。在一些具體實例中，源自小鼠細小病毒(MVM)內含子的序列位於所述啟動子的3’。在一些具體實例中，所述MMV內含子包含SEQ ID NO：23的核苷酸序列。在一些具體實例中，所述啟動子還包含i)CMV增強子；ii)

源自感光細胞特異性轉錄因子的序列；iii)源自視桿細胞特異性轉錄因子的序列；iv)源自神經視網膜鹼性拉鍊因子(basic zipper factor)的序列；v)源自含視錐視桿同源框(cone rod homebox)的轉錄因子序列的序列；vi)CMV增強子，和源自感光細胞特異性轉錄因子的序列、源自視桿細胞特異性轉錄因子的序列、源自神經視網膜鹼性拉鍊因子的序列、源自含視錐視桿同源框的轉錄因子序列的序列中的至少一種或多種；vii)神經視網膜鹼性亮胺酸拉鍊因子、CMV增強子和視蛋白啟動子(-500至+17)；viii)神經視網膜鹼性亮胺酸拉鍊因子、CMV增強子、視蛋白啟動子(-500至+17)和MVM內含 子；ix)包含SEQ ID NO：29的CMV增強子；x)包含SEQ ID NO：30的神經視網膜鹼性亮胺酸拉鍊因子序列；xi)包含SEQ ID NO：28的源自含視錐視桿同源框的轉錄因子序列的序列；xii)包含SEQ ID NO：29的CMV增強子，和源自感光細胞特異性轉錄因子的序列、源自視桿細胞特異性轉錄因子的序列、包含SEQ ID NO：30的源自神經視網膜鹼性拉鍊因子的序列、包含SEQ ID NO：28的源自含視錐視桿同源框的轉錄因子序列的序列中的至少一種或多種；xiii)包含SEQ ID NO：30的神經視網膜鹼性亮胺酸拉鍊因子、包含SEQ ID NO：29的CMV增強子和包含SEQ ID NO：22的視蛋白啟動子(-500至+17)；或xiv)包含SEQ ID NO：30的神經視網膜鹼性亮胺酸拉鍊因子、包含SEQ ID NO：29的CMV增強子、包含SEQ ID NO：22的視蛋白啟動子(-500至+17)和包含SEQ ID NO：23的MVM內含子。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的核酸嵌入在內含子中。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的核酸包含內源性miR-708支架或miR-155支架。

在一些具體實例中，本發明提供治療RP和/或ER壓力的方法，包括向哺乳動物投予包含rAAV載體的rAAV顆粒，所述rAAV載體包含編碼miR-708的核酸。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的核酸包含SEQ ID NO：1的核酸。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的核酸包含與SEQ ID NO：1具有約至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核酸。

在一些具體實例中，本發明提供治療RP和/或ER壓力的方法，包括向哺乳動物投予包含rAAV載體的rAAV顆粒，所述rAAV載體包含編碼視紫紅質的核酸。在一些具體實例中，所述視紫紅質是 哺乳動物視紫紅質或其功能等效物。在一些具體實例中，所述視紫紅質是人視紫紅質或其功能等效物。在一些具體實例中，所述視紫紅質缺少3’非翻譯區(UTR)miR-708靶序列。在一些具體實例中，所述編碼視紫紅質的核酸在miR-708靶序列中包含核酸的取代、插入或缺失。在一些具體實例中，所述取代、插入或缺失降低或阻止miR-708進行的識別。在一些具體實例中，所述編碼視紫紅質的核酸在miR-708靶序列中包含核酸的取代、插入或缺失，其中所述miR-708靶序列是SEQ ID NO：19。在一些具體實例中，所述視紫紅質的表現難以受到miR-708的抑制。在一些具體實例中，所述視紫紅質包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述視紫紅質包含與SEQ ID NO：2具有約至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。在一些具體實例中，編碼視紫紅質的核酸包含SEQ ID NO：3的核酸。在一些具體實例中，所述編碼視紫紅質的核酸包含與SEQ ID NO：3具有約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核酸。

在一些具體實例中，本發明提供治療RP和/或ER壓力的方法，包括向哺乳動物投予包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的多核苷酸的rAAV顆粒。在一些具體實例中，所述AAV病毒顆粒包含重組病毒基因組，所述重組病毒基因組包含與SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27具有約至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核苷酸。

在一些具體實例中，本發明提供治療RP和/或ER壓力的方法，包括向哺乳動物投予rAAV顆粒，其中所述AAV病毒顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合型、牛AAV或小鼠AAV衣殼rAAV2/HBoV1血清型衣殼。在一些具體實例中，所述rAAV病毒顆粒包含AAV血清型5衣殼。在一些具體實例中，所述rAAV病毒顆粒包含AAV血清型5酪胺酸突變體衣殼。

在一些具體實例中，本發明提供治療RP和/或ER壓力的方法，包括向哺乳動物投予包含編碼miR-708的核酸的第一rAAV病毒顆粒和編碼視紫紅質的第二rAAV病毒顆粒視紫紅質。在一些具體實例中，所述第一rAAV顆粒和/或所述第二rAAV病毒顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合型、牛AAV或小鼠AAV衣殼rAAV2/HBoV1血清型衣殼。在一些具體實例中，所述第一rAAV病毒顆粒和/或所述第二rAAV病毒顆粒包含AAV血清型5衣殼。在一些具體實例中，所述第一rAAV病毒顆粒和/或所述第二rAAV病毒顆粒包含AAV血清型5酪胺酸突變體衣殼。

在一些具體實例中，本發明提供治療RP和/或ER壓力的方法，包括向哺乳動物投予rAAV顆粒，其中所述AAV載體包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、 AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些具體實例中，本發明提供治療RP和/或ER壓力的方法，包括向哺乳動物投予包含第一rAAV載體的第一rAAV病毒顆粒和包含第二rAAV載體的第二rAAV病毒顆粒，所述第一rAAV載體包含編碼miR-708的核酸，所述第二rAAV載體編碼視紫紅質。在一些具體實例中，所述第一rAAV載體和/或所述第二rAAV病毒載體包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。

在本發明的一些具體實例中，所述方法的rAAV載體包含AAV血清型2 ITR。在一些具體實例中，所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼來自相同的AAV血清型。在其他具體實例中，所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼源自不同的AAV血清型。在一些具體實例中，所述rAAV病毒顆粒包含AAV-5衣殼，並且其中所述載體包含AAV2 ITR。在一些具體實例中，所述rAAV病毒顆粒包含AAV-5酪胺酸突變體衣殼，並且其中所述載體包含AAV2 ITR。

在一些具體實例中，本發明提供治療哺乳動物中RP和/或ER壓力的方法，其中將rAAV顆粒注射至所述哺乳動物視網膜的視網膜下間隙中。在一些具體實例中，將所述rAAV投予至所述哺乳動物視網膜的視網膜下間隙中的超過一個位置。在其他具體實例中，將所述rAAV顆粒玻璃體內(intravitreally)注射至所述哺乳動物。在一些具體實例中，至少10-30%的感光細胞(例如，視桿細胞)由所述AAV轉導。

在一些具體實例中，本發明提供治療哺乳動物中RP和/或ER壓力的方法，其中所述哺乳動物在內源視紫紅質基因中具有突變。在一些具體實例中，所述內源視紫紅質基因中的突變是體染色體顯性突變。在一些具體實例中，所述色素性視網膜炎是體染色體顯性色素性視網膜炎。在一些具體實例中，所述哺乳動物是人。在一些具體實例中，所述人具有內源性視紫紅質基因中的P23H突變。

在一些具體實例中，本發明提供治療RP和/或ER壓力的方法，包括向哺乳動物投予包含編碼miR-708的核酸的第一rAAV病毒顆粒和編碼視紫紅質的第二rAAV病毒顆粒，其中將所述編碼miR-708的第一rAAV病毒顆粒和所述編碼視紫紅質的第二rAAV病毒顆粒同時投予哺乳動物。在一些具體實例中，將所述編碼miR-708的第一rAAV病毒顆粒和所述編碼視紫紅質的rAAV病毒顆粒連續地投予哺乳動物。在一些具體實例中，首先將編碼miR-708的rAAV病毒顆粒投予哺乳動物，其次再將編碼視紫紅質的rAAV病毒顆粒投予哺乳動物。在一些具體實例中，首先將編碼視紫紅質的rAAV病毒顆粒投予哺乳動物，其次再將編碼miR-708的rAAV病毒顆粒投予哺乳動物。

在本發明的一些具體實例中，所述rAAV病毒顆粒在醫藥組成物中。在一些具體實例中，所述醫藥組成物進一步包含醫藥上可接受載劑。在一些具體實例中，本發明提供包含rAAV顆粒的組成物，所述rAAV顆粒包含rAAV載體，所述rAAV載體包含編碼miR-708的核酸，其用於本文所述的方法中。在一些具體實例中，本發明提供包含rAAV載體的rAAV顆粒，所述rAAV載體包含編碼miR708的核酸，用於根據本文所述的任何方法用於治療色素性視網膜炎或 降低ER壓力。在一些具體實例中，本發明提供第一rAAV顆粒和第二rAAV顆粒，所述第一rAAV顆粒包含含有編碼miR708的核酸的rAAV載體，所述第二rAAV顆粒包含含有編碼視紫紅質的核酸的rAAV載體，用於根據本文所述的任何方法治療色素性視網膜炎或降低ER壓力。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含含有編碼miR708和視紫紅質的核酸的rAAV載體，用於根據本文所述的任何方法治療色素性視網膜炎或降低ER壓力。

在一些方面，本文描述的發明提供用於治療哺乳動物中色素性視網膜炎的組成物，其包含重組腺伴隨病毒(rAAV)病毒顆粒，所述病毒顆粒包含編碼miR-708的載體。在一些具體實例中，所述包含編碼miR-708的核酸的rAAV載體還包含編碼視紫紅質的核酸。在一些具體實例中，本發明提供用於治療色素性視網膜炎的組成物，其包含第一rAAV病毒顆粒和第二rAAV病毒顆粒，所述第一rAAV病毒顆粒包含含有編碼miR-708的核酸的第一rAAV載體，所述第二rAAV病毒顆粒包含含有編碼視紫紅質的核酸的第二rAAV載體。在其他具體實例中，本發明提供用於治療色素性視網膜炎的組成物，其包含含有rAAV載體的rAAV病毒顆粒，所述rAAV載體包含編碼miR-708和視紫紅質的核酸。

在一些方面，本發明提供用於治療細胞中內質網(ER)壓力的組成物，其包含含有rAAV載體的rAAV病毒顆粒，所述rAAV載體包含編碼miR-708的核酸。在一些方面，本發明提供用於治療細胞中內質網(ER)壓力的組成物，其包含含有rAAV載體的rAAV病毒顆粒，所述rAAV載體包含編碼miR-708和視紫紅質的核酸。在一些具體實例中，具有ER壓力的哺乳動物患有或有風險罹患RP。在 一些具體實例中，具有ER壓力的哺乳動物是患有或有風險罹患RP的人。在一些具體實例中，將所述rAAV顆粒投予至所述哺乳動物的眼部。在一些具體實例中，所述細胞是眼細胞。在進一步的具體實例中，所述細胞是感光細胞。在更進一步的具體實例中，所述細胞是視桿細胞。在一些具體實例中，所述組成物減少ER壓力的一種或多種細胞標誌。在進一步的具體實例中，所述ER壓力的一種或多種細胞標誌是剪接的XBP-1、CHOP或Grp78。在一些具體實例中，所述rAAV載體包含編碼miR-708的核酸，進一步包含編碼視紫紅質的核酸。在其他具體實例中，本發明提供用於治療細胞中內質網(ER)壓力的組成物，其包含第一rAAV載體和包含第二rAAV載體的第二rAAV病毒顆粒，所述第一rAAV載體包含編碼miR-708的核酸，所述第二rAAV載體包含編碼視紫紅質的核酸。

在本發明的一些具體實例中，所述編碼miR-708的核酸可操作地連接至啟動子。在一些具體實例中，所述啟動子能夠在感光細胞(例如，視桿細胞)中表現miR-708。在進一步的具體實例中，所述啟動子包括視紫紅質激酶(RK)啟動子或視蛋白啟動子。在本發明的其他具體實例中，所述編碼視紫紅質的核酸可操作地連接至啟動子。在一些具體實例中，所述啟動子能夠在感光細胞(例如，視桿細胞)中表現視紫紅質。在進一步的具體實例中，所述啟動子包括RK啟動子或視蛋白啟動子.

在一些具體實例中，本發明提供組成物以治療RP和/或ER壓力，其包含rAAV顆粒，所述rAAV顆粒包含含有編碼miR-708和視紫紅質的核酸的rAAV載體。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的核酸和編碼視紫紅質的核酸可操作地連接至一個RK啟 動子。在其他具體實例中，所述編碼miR-708的核酸可操作地連接至第一RK啟動子或第一視蛋白啟動子，而所述編碼視紫紅質的核酸可操作地連接至第二RK啟動子或第二視蛋白啟動子。在一些具體實例中，所述第一和/或第二視蛋白啟動子包括MVM內含子(例如，SEQ ID NO：23的內含子)。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的核酸在所述編碼視紫紅質的核酸的5’。在其他具體實例中，所述編碼miR-708的核酸在所述編碼視紫紅質的核酸的3’。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的核酸可操作地連接至雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子。在一些具體實例中，所述編碼視紫紅質的核酸可操作地連接至雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子。在一些具體實例中，所述第一和/或第二視蛋白啟動子包括MVM內含子(例如，SEQ ID NO：23的內含子)。在一些具體實例中，編碼miR-708的核酸在編碼視紫紅質的核酸的5’。在其他具體實例中，編碼miR-708的核酸在編碼視紫紅質的核酸的3’。在一些具體實例中，編碼miR-708的核酸可操作地連接至雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子。在一些具體實例中，編碼視紫紅質的核酸可操作地連接至雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子。在一些具體實例中，源自小鼠細小病毒(MVM)內含子的序列位於所述啟動子的3’。在一些具體實例中，所述MMV內含子包含SEQ ID NO：23的核苷酸序列。在一些具體實例中，所述啟動子還包含i)CMV增強子；ii)源自感光細胞特異性轉錄因子的序列；iii)源自視桿細胞特異性轉錄因子的序列；iv)源自神經視網膜鹼性拉鍊因子的序列；v)源自含視錐視桿同源框的轉錄因子序列的序列；vi)CMV增強子，和源自感光細胞特異性轉錄因子的序列、源自視桿細胞特異性轉錄因子的序列、源自神經視網膜鹼性拉鍊因子的序列、源自含視錐視 桿同源框的轉錄因子序列的序列中的至少一種或多種；vii)神經視網膜鹼性亮胺酸拉鍊因子、CMV增強子和視蛋白啟動子(-500至+17)；viii)神經視網膜鹼性亮胺酸拉鍊因子、CMV增強子、視蛋白啟動子(-500至+17)和MVM內含子；ix)包含SEQ ID NO：29的CMV增強子；x)包含SEQ ID NO：30的神經視網膜鹼性亮胺酸拉鍊因子序列；xi)包含SEQ ID NO：28的源自含視錐視桿同源框的轉錄因子序列的序列；xii)包含SEQ ID NO：29的CMV增強子，和源自感光細胞特異性轉錄因子的序列、源自視桿細胞特異性轉錄因子的序列、包含SEQ ID NO：30的源自神經視網膜鹼性拉鍊因子的序列、包含SEQ ID NO：28的源自含視錐視桿同源框的轉錄因子序列的序列中的至少一種或多種；xiii)包含SEQ ID NO：30的神經視網膜鹼性亮胺酸拉鍊因子、包含SEQ ID NO：29的CMV增強子和包含SEQ ID NO：22的視蛋白啟動子(-500至+17)；或xiv)包含SEQ ID NO：30的神經視網膜鹼性亮胺酸拉鍊因子、包含SEQ ID NO：29的CMV增強子、包含SEQ ID NO：22的視蛋白啟動子(-500至+17)和包含SEQ ID NO：23的MVM內含子。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的核酸嵌入在內含子中。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的核酸包含內源性miR-708支架或miR-155支架。

在一些具體實例中，本發明提供組成物以治療RP和/或ER壓力，其包含rAAV顆粒，所述rAAV顆粒包含含有編碼miR-708的核酸的rAAV載體。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的核酸包含SEQ ID NO：1的核酸。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的核酸包含與SEQ ID NO：1具有約至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核酸。

在一些具體實例中，本發明提供組成物以治療RP和/或ER壓力，其包含rAAV顆粒，所述rAAV顆粒包含含有編碼視紫紅質的核酸的rAAV載體。在一些具體實例中，所述視紫紅質是哺乳動物視紫紅質或其功能等效物。在一些具體實例中，所述視紫紅質是人視紫紅質或其功能等效物。在一些具體實例中，所述視紫紅質缺少3’非翻譯區(UTR)miR-708靶序列。在一些具體實例中，所述編碼視紫紅質的核酸在miR-708靶序列中包含核酸的取代、插入或缺失。在一些具體實例中，所述取代、插入或缺失降低或阻止miR-708進行的識別。在一些具體實例中，所述編碼視紫紅質的核酸在miR-708靶序列中包含核酸的取代、插入或缺失，其中所述miR-708靶序列是SEQ ID NO：19。在一些具體實例中，所述視紫紅質的表現難以受到miR-708的抑制。在一些具體實例中，所述視紫紅質包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述視紫紅質包含與SEQ ID NO：2具有約至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。在一些具體實例中，編碼視紫紅質的核酸包含SEQ ID NO：3的核酸。在一些具體實例中，所述編碼視紫紅質的核酸包含與SEQ ID NO：3具有約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核酸。

在一些具體實例中，本發明提供組成物以治療RP和/或ER壓力，其包含rAAV顆粒，所述rAAV顆粒包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的多核苷酸。在一些具體實例中，所述AAV病毒顆粒包含重組病毒基因組，所述重組病毒基因組包含與SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、 SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27，具有約至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核苷酸。

在一些具體實例中，本發明提供組成物以治療RP和/或ER壓力，其包含rAAV顆粒，其中所述AAV病毒顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合型、牛AAV或小鼠AAV衣殼rAAV2/HBoV1血清型衣殼。在一些具體實例中，所述rAAV病毒顆粒包含AAV血清型5衣殼。在一些具體實例中，所述rAAV病毒顆粒包含AAV血清型5酪胺酸突變體衣殼。

在一些具體實例中，本發明提供用於治療RP和/或ER壓力的組成物，其包含含有編碼miR-708的核酸的第一rAAV病毒顆粒和編碼視紫紅質的第二rAAV病毒顆粒。在一些具體實例中，所述第一rAAV顆粒和/或所述第二rAAV病毒顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合型、牛AAV或小鼠AAV衣殼rAAV2/HBoV1血清型衣殼。在一些具體實例中，所述第一rAAV病毒顆粒和/或所述第二rAAV病毒顆粒包含AAV血清型5衣殼。在一些具體實例中，所述第一rAAV病毒顆粒和/或所述第二rAAV病毒顆粒包含AAV血清型5酪胺酸突變體衣殼。

在一些具體實例中，本發明提供組成物以治療RP和/或ER壓力包含rAAV顆粒，其中所述AAV載體包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些具體實例中，本發明提供用於治療RP和/或ER壓力的組成物，其包含第一rAAV病毒顆粒和第二rAAV病毒顆粒，所述第一rAAV病毒顆粒包含含有編碼miR-708的核酸的第一rAAV載體，所述rAAV病毒顆粒包含編碼視紫紅質的第二載體。在一些具體實例中，所述第一rAAV載體和/或所述第二rAAV病毒載體包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11或AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。。

在本發明的一些具體實例中，所述組成物的rAAV載體包含AAV血清型2 ITR。在一些具體實例中，所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼源自相同的AAV血清型。在其他具體實例中，所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼源自不同的AAV血清型。在一些具體實例中，所述rAAV病毒顆粒包含AAV-5衣殼，並且其中所述載體包含AAV2 ITR。在一些具體實例中，所述rAAV病毒顆粒包含AAV-5酪胺酸突變體衣殼，並且其中所述載體包含AAV2 ITR。

在一些具體實例中，本發明提供組成物以在哺乳動物中治療RP和/或ER壓力，其中所述哺乳動物具有內源性視紫紅質基因中的突變。在一些具體實例中，所述內源性視紫紅質基因中的突變是體染色體顯性突變。在一些具體實例中，所述色素性視網膜炎是體染色 體顯性色素性視網膜炎。在一些具體實例中，所述哺乳動物是人。在一些具體實例中，所述人具有內源性視紫紅質基因中的P23H突變。

在一些具體實例中，本發明提供套組以在哺乳動物中治療RP或降低ER壓力，其包含有效量的根據本文描述的方法的rAAV顆粒。在一些具體實例中，所述套組包含有效量的如本文所述的組成物。在一些具體實例中，所述套組包含有效量的rAAV顆粒，所述rAAV顆粒包含含有編碼miR-708的核酸的rAAV載體。在一些具體實例中，所述套組包含有效量的rAAV顆粒，所述rAAV顆粒包含含有編碼miR-708和視紫紅質的核酸的rAAV載體。在一些具體實例中，所述套組包含有效量的第一rAAV顆粒和有效量的第二rAAV顆粒，所述第一rAAV顆粒包含含有編碼miR-708的核酸的rAAV載體，所述第二rAAV顆粒包含含有編碼視紫紅質的核酸的第二rAAV載體。在進一步的具體實例中，所述套組包含將所述rAAV顆粒用於治療色素性視網膜炎和/或降低ER壓力的說明書。在進一步的具體實例中，所述套組包含關於在本文所述的任一方法中使用的說明書。

在一些方面，本發明提供包含根據本文所述方法之有效量的rAAV顆粒之製品。在一些具體實例中，所述製品包含有效量的本文所述的任一組成物。在一些具體實例中，所述製品包含有效量的rAAV顆粒，所述rAAV顆粒包含含有編碼miR-708的核酸的rAAV載體。在一些具體實例中，所述製品包含有效量的rAAV顆粒，所述rAAV顆粒包含含有編碼miR-708和視紫紅質的核酸的rAAV載體。在一些具體實例中，所述製品包含有效量的第一rAAV顆粒和 有效量的第二rAAV顆粒，所述第一rAAV顆粒包含含有編碼miR-708的核酸的rAAV載體，所述第二rAAV顆粒包含含有編碼視紫紅質的核酸的第二rAAV載體。

在一些方面，本發明提供包含源自MVM的內含子的核酸。在一些具體實例中，所述MVM內含子包含SEQ ID NO：23。在一些具體實例中，所述核酸還包含啟動子。在一些具體實例中，所述核酸還包含增強子。在一些具體實例中，所述啟動子位於所述MVM內含子的5’。在一些具體實例中，本發明提供包含所述核酸的表現構築體。在一些具體實例中，本發明提供包含所述核酸或所述表現構築體的載體。在一些具體實例中，本發明提供包含核酸、表現構築體或載體的細胞。

發明詳述

本發明提供了用於治療哺乳動物中的色素性視網膜炎(RP)的方法，包括將包含編碼miR-708的載體的重組腺伴隨病毒(rAAV)病毒顆粒投予所述哺乳動物的眼部。所述miR-708靶向視紫紅質基因的3’非翻譯區中的區域，並且因此可抑制突變視紫紅質與RP相關的活性。在一些方面，本發明提供用於治療哺乳動物中色素性視網膜炎的方法，包括將包含編碼miR-708和野生型視紫紅質核酸的載體的重組腺伴隨病毒(rAAV)病毒顆粒投予所述哺乳動物的眼部。如此，所述載體可抑制突變視紫紅質與RP相關的活性，同時用野生型視紫紅質替代突變視紫紅質。在一些具體實例中，編碼野生型視紫紅質的核酸不包括miR-708的3’ UTR靶，因此miR-708將僅靶向突 變視紫紅質的表現。本發明還提供包含編碼miR-708的rAAV顆粒並包含編碼視紫紅質的rAAV顆粒的組成物。在一些具體實例中，本發明提供包含編碼miR-708和視紫紅質二者的rAAV顆粒的組成物。

I.通用技術

本文描述或引用的技術和流程通常是本領域技術人員充分理解的並使用常規方法學通常採用的，例如，舉例來說，廣泛使用的方法學描述在Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Sambrook et al.,4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2012)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,et al.eds.,2003)；Methods in Enzymology系列(Academic Press,Inc.)；PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor eds.,1995)；Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow and Lane,eds.,1988)；Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney,6th ed.,J.Wiley and Sons,2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,Academic Press,1998)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,Plenum Press,1998)；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,J.Wiley and Sons,1993-8)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1996)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.,J.Wiley and Sons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway et al.,2004)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：A Practical Approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies：A Practical Approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；Using Antibodies：A Laboratory Manual(E.Harlow and D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)；和Cancer：Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita et al.,eds.,J.B.Lippincott Company,2011)中。

II.定義

“載體”，如用於本文，指重組質體或病毒，其包含在體外或在體內遞送至宿主細胞的核酸。

術語“多核苷酸”或“核酸”如用於本文指任何長度的核苷酸(或者是核糖核苷酸或者是脫氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，該術語包括，但不限於，單鏈、雙鏈或多鏈DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜合體，或包含嘌呤和嘧啶鹼基的聚合物，或其他天然的、經化學或生物修飾的、非天然的或衍生化的核苷酸鹼基。所述多核苷酸的主鏈可以包含糖和磷酸基團(如通常可見於RNA或DNA中)，或經修飾或取代的糖或磷酸基團。或者，所述多核苷酸的主鏈可包含合成亞基如氨基磷酸酯的聚合物，並因此可以是寡聚脫氧核 糖核苷胺基磷酸酯(oligodeoxynucleoside phosphoramidate)(P-NH2)或混合型氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。此外，雙鏈多核苷酸可以獲得自化學合成的單鏈多核苷酸產物，或者通過合成互補鏈並在合適條件下將鏈退火，或者通過使用DNA聚合酶以合適的引子從頭(de novo)合成互補鏈。

術語“多肽”和“蛋白質”可互換使用，用於指胺基酸殘基的聚合物，並且不限制最小長度。這樣的胺基酸殘基的聚合物可以含有天然的或非天然的胺基酸殘基，並且包括但不限於肽、寡肽、胺基酸殘基的二聚體、三聚體和多聚體。全長蛋白質及其片段二者均涵蓋在該定義內。該術語還包括多肽的表現後修飾，例如，糖基化、唾液酸化、乙醯化、磷酸化等。另外，就本發明而言，“多肽”涉及包括對天然序列進行修飾如缺失、添加和取代(通常在性質上是保守的)的蛋白質，只要所述蛋白質保留了期望的活性。這些修飾可以有意的，如通過定點誘變，或者可以是意外的，如通過產生蛋白質的宿主的突變或因PCR擴增而產生的錯誤。

“重組病毒載體”指包含一個或多個異源序列(即，非病毒來源的核酸序列)的重組多核苷酸載體。在重組AAV載體的情況下，所述重組核酸的側翼有至少一個、較佳兩個反向末端重複序列(ITRs)。

“重組AAV載體(rAAV載體)”指包含一個或多個異源序列(即非AAV來源的核酸序列)的多核苷酸載體，所述異源序列的側翼有至少一個，優選兩個，AAV反向末端重複序列(ITRs)。當存在於已經用合適的輔助病毒感染(或表現合適的輔助功能)並表現AAV rep和cap基因產物(即AAV Rep和Cap蛋白)的宿主細胞中時，這種AAV載體可以被複製並包裝在感染性病毒顆粒中。當將rAAV載體納入 更大的多核苷酸中(例如，染色體中或另一載體如用於選殖或轉染的質體)時，那麼所述rAAV載體可以稱作“原-載體(pro-vector)”，其可以在AAV包裝功能和合適的輔助功能存在下通過複製和被衣殼包裝而被“拯救”。rAAV載體可以是多種形式中的任何一種，所述形式包括但不限於質體、線性人工染色體、與脂質複合的、封裝在脂質體內的，和最優選被衣殼包裝(encapsidate)在病毒顆粒特別是AAV顆粒中的。rAAV載體可以包裝在AAV病毒衣殼中以生成“重組腺伴隨病毒顆粒(rAAV顆粒)”。

“異源”意指衍生自與跟其進行比較的其餘實體或者其所插入或併入其中的其餘實體在基因型上不同的實體。例如，通過基因工程技術引入不同細胞類型中的多核苷酸是異源多核苷酸(並且，在表現時，能夠編碼異源多肽)。類似地，併入病毒載體中的細胞序列(例如，基因或其部分)相對於載體是異源核苷酸序列。

術語“轉殖基因”指引入細胞中並且能夠轉錄成RNA並且任選地在適當條件下轉譯和/或表現的多核苷酸。在多個方面中，其賦予其被引入的細胞期望的性質，或者以其他方式產生期望的治療或診斷結果。在另一方面，其可以轉錄成介導RNA幹擾的分子，如siRNA。

術語“基因組顆粒(gp)”、“基因組等效物”或“基因組拷貝”如在涉及病毒滴度時使用，指含有重組AAV DNA基因組的病毒體(virion)的數目，無關乎感染力或功能性。特定載體製備物中的基因組顆粒數能夠通過例如本文實施例中或例如Clark et al.(1999)Hum.Gene Ther.,10：1031-1039；Veldwijk et al.(2002)Mol.Ther.,6：272-278中描述的流程來測量。

術語“感染單元(iu)”、“感染顆粒”或“複製單元”，如在涉及病毒 滴度時使用，指感染性且有複製能力的重組AAV載體顆粒的數目，如通過感染中心測定(infectious center assay)，也稱作複製中心測定(replication center assay)，所測量的，如例如McLaughlin et al.(1988)J.Virol.,62：1963-1973中所述。

術語“轉導單元(tu)”如在涉及病毒滴度時使用，指導致功能性轉殖基因產物產生的傳染性重組AAV載體顆粒的數目，如在功能性測定(例如描述于本文實施例或例如Xiao et al.(1997)Exp.Neurobiol.,144：113-124；或Fisher et al.(1996)J.Virol.,70：520-532(LFU測定)中)所測量的。

“反向末端重複”或“ITR”序列是本領域中被充分理解的術語，並且指病毒基因組末端存在的方向相反的相對較短的序列。

“AAV反向末端重複(ITR)”序列是本技術中被充分理解的術語，是一種大約145個核苷酸的序列，其存在於天然單鏈AAV基因組的兩個末端。ITR最外側的125個核苷酸可以以兩種可選的方向中的任何一種存在，導致不同AAV基因組之間以及單個AAV基因組的兩端之間的異質性。所述最外側的125個核苷酸還含有自我互補的幾個較短區域(指名為A、A'、B、B'、C、C'和D區)，使得在ITR的這個區域內鏈內部的鹼基配對得以發生。

“末端解析序列(terminal resolution sequence)”或“trs”是AAV ITR的D區中在病毒DNA複製過程中被AAV rep蛋白切割的序列。突變的末端解析序列難以受到AAV rep蛋白的切割。

用於AAV的“輔助病毒”指使得AAV(其為缺陷型細小病毒(defective parvovirus))得以通過宿主細胞複製並且包裝的病毒。已經鑑定了多種這樣的輔助病毒，包括腺病毒、皰疹病毒和痘病毒，如 牛痘。腺病毒涵蓋多個不同的亞組，儘管亞組C的腺病毒5型(Ad5)最常使用。多種人、非人哺乳動物和鳥類來源的腺病毒是已知的，並且可從保存機構如ATCC獲得。皰疹病毒科(herpes family)的病毒也可從保存機構如ATCC獲得，包括例如單純皰疹病毒(herpes simplex viruses(HSV))、EB病毒(Epstein-Barr viruse(EBV))、巨細胞病毒(cytomegaloviruses(CMV))和偽狂犬病病毒(pseudorabies viruses(PRV))。

相對於參照多肽或核酸序列的“百分比(%)序列同一性”被定義為在對齊所述序列並在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性之後，候選序列中與所述參照多肽或核酸序列中的胺基酸殘基或核苷酸相同的胺基酸殘基或核苷酸的百分比，並且不考慮任何保守取代作為序列同一性的一部分。為了測定百分比胺基酸或核酸序列同一性的比對可以多種方式實現，這些方式屬本領域的技術，例如，使用公開可用的電腦軟體程式，例如，描述於Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.,1987),Supp.30,section 7.7.18,Table 7.7.1中者，並且包括BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。優選的比對程序是ALIGN Plus(Scientific and Educational Software,Pennsylvania)。本領域技術人員能夠確定適當的參數用於測量比對，包括在所比較序列的整個長度上實現最大比對所需的任何算法。處於本文的目的，給定胺基酸序列A與或相對於給定胺基酸序列B的%胺基酸序列同一性(或者可以任選地換種說法叫做與或相對於給定胺基酸序列B具有或包含特定%胺基酸序列同一性的給定胺基酸序列A)如下計算：100乘以分數X/Y，其中X是由序列比對程式在該程式對A和B的比對中計為相 同匹配的胺基酸殘基數，並且其中Y是B中的胺基酸殘基總數。將會理解的是，在胺基酸序列A的長度與胺基酸序列B的長度不等的情況下，A與B的%胺基酸序列同一性會不等於B與A的%胺基酸序列同一性。就本文而言，給定核酸序列C與、同或相對於給定核酸序列D的%核酸序列同一性(或者可以任選地換種說法叫做與、同或相對於給定核酸序列D具有或包含特定%核酸序列同一性的給定核酸序列C)如下計算：100乘以分數W/Z，其中W是由序列比對程式在該程式對C和D的比對中計為相同匹配的核苷酸數，並且其中Z是D中的核苷酸總數。將會理解的是，在核酸序列C的長度與核酸序列D的長度不等的情況下，C與D的%核酸序列同一性會不等於D與C的%核酸序列同一性。

“分離的”分子(例如，核酸或蛋白質)或細胞意指其已經鑑定並且與其天然環境中的成分分離和/或從中回收。

“有效量”是足以實現有益的或期望的結果的量，所述結果包括臨床結果(例如，症狀的緩解，實現臨床終點，等等)。有效量可以作為一次或多次給藥來投予。就疾病狀態而言，有效量是足以使疾病緩解、穩定或延遲其進展的量。

“個體”或“受試者”是哺乳動物。哺乳動物包括，但不限於，馴養的動物(例如，奶牛、綿羊、貓、狗和馬)，靈長類(例如，人和非人靈長類如猴)，兔，以及齧齒動物(例如，小鼠和大鼠)。在某些具體實例中，所述個體或受試者是人。

如用於本文，“治療/處理”是用於獲得有益的或期望的臨床結果的手段。就本發明而言，有益的或期望的臨床結果包括，但不限於，症狀的緩解，疾病程度的削弱，穩定(例如，不惡化)的疾病狀態， 預防疾病的擴散(例如，轉移)，延遲或減緩疾病進程，緩解或減輕疾病狀態，和緩和(無論是部分或是全部)，無論這些是可檢測的或是不可檢測的。“治療/處理”還可意指與不接受治療/處理的話所預期的生存期相比得到延長的生存期。

“色素性視網膜炎(RP)”指以進行性失明為特徵的一類各種疾病。症狀通常起源於視網膜的變性或異常，其可能包括感光細胞功能的喪失。

“視紫紅質”指在視網膜的使肝細胞中發揮感光功能的G蛋白偶聯受體家族成員。視色素視紫紅質含有與其輔因子視黃醛(cofactor retinal)可逆地結合的多肽視蛋白。光引起視黃醛從11-順式異構化為全-反式形式。這繼而引起多肽中的構象變化，導致G蛋白活化。通過將光的存在轉化為生化反應，視紫紅質使得視覺感知成為可能。其功能是暗視覺(即，弱光中的無色視覺)所需，並且其也被認為是感光細胞生存力所需。

如用於本文，“視紫紅質”可指完整的視覺色素，包括視黃醇，或僅僅是分子的胺基酸成分或序列。視紫紅質還可稱作OPN2、Opsin-2或RP4。視紫紅質蛋白的實例可包括但不限於人、小鼠、狗和貓視紫紅質，例如，NCBI參考序列NP_000530、NP_663358、NP_001008277和NP_001009242。視紫紅質基因的實例可包括但不限於人、小鼠、狗和貓視紫紅質基因，例如，GenBank Entrez Gene ID6010(RHO，即RP4、OPN2和CSNBAD1)、GenBank Entrez Gene ID 212541(Rho，即Ops、RP4、Opn2和Noerg1)、GenBank Entrez Gene ID 493763和GenBank Entrez Gene ID 493762。術語視紫紅質如用於本文還包括視紫紅質包括突變、截短、缺失和/或插入的功能等效物 (例如，視紫紅質變體)，只要該功能等效物保持了至少一部分野生型視紫紅質緩解色素性視網膜炎症狀的活性。

如用於本文“難以(refractory)”指對調節的抗性。例如，難以受到miR-708的抑制的視紫紅質基因基本上或完全抵抗miR-708的抑制。

“視蛋白啟動子”指源自視蛋白基因(例如，小鼠視蛋白)的多核苷酸序列，其特異性驅動在視桿細胞(例如，視桿細胞)中的表現。如用於本文，“視蛋白啟動子”可指完整啟動子序列或足以驅動視桿細胞特異性表現(rod-specific expression)的啟動子序列片段，例如Quiambao,A.B.,et al.(1997)Vis.Neurosci.14(4)：617-25和Le,Y.Z.,et al.(2006)Mol.Vis.12：389-98中描述的序列。在一些具體實例中，視蛋白啟動子含有編碼400bp CMV增強子的676bp片段，其在視蛋白啟動子序列部分的上游(-500bp-+15bp)。此外，包括65bp NRL序列；這一序列編碼神經視網膜鹼性拉鍊因子(視桿細胞特異性轉錄因子)。

“視紫紅質激酶(RK)啟動子”指源自視紫紅質激酶基因(例如，人RK，由GenBank Entrez Gene ID 6011代表)的多核苷酸序列，其特異性驅動在視桿細胞和視錐細胞中以及視網膜細胞系如WERI Rb-1中的表現。如用於本文，“視紫紅質激酶啟動子”指完整啟動子序列或足以驅動感光細胞特異性表現(photoreceptor-specific expression)的啟動子序列片段，例如Khani,S.C.,et al.(2007)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.48(9)：3954-61和Young,J.E.,et al.(2003)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.44(9)：4076-85中描述的序列。在一些具體實例中，所述RK啟動子跨越相對於轉錄起始位點而言從-112至+180的位置。

“miR-708”指包含如圖4所示的莖和環序列的微RNA(miRNA)多核苷酸序列。miR-708多核苷酸的實例可包括但不限於人、小鼠、狗和貓miR-708，例如，如GenBank Entrez Gene IDs 100126333、735284和100885899所代表。miRNAs是小的非編碼RNA分子，其調節含有由該miRNA識別的靶位點的基因的表現(例如，通過下調基因轉錄物)(Bartel,D.P.(2004)Cell 116(2)：281-97)。miR-708已知受到CHOP誘導並且可能參與調節視紫紅質表現(Behrman,S.,et al.(2011)J.Cell Biol.192(6)：919-27)。如用於本文，“miR-708”可指經加工的miR-708多核苷酸或加工途徑中的任何中間體，例如，pri-miRNA或pre-miRNA。如用於本文，“miR-708”可指轉錄生成miR-708 RNA的DNA序列，或RNA序列本身。

本文提及“約/大約”某個值或參數包括(和記載)涉及該值或參數本身的具體實例。例如，提及“約X”的記載包括記載“X”。

如用於本文，冠詞“一個”、“一種”和“所述/該”的單數形式包括對複數的提及，除非另行說明。

應理解的是本文描述的發明的各個方面和具體實例包括“包含”、“其組成為”和/或“其組成基本上為”各個方面和具體實例。

III.色素性視網膜炎及其實驗模型

如上所述，色素性視網膜炎(RP)指一類退行性眼病，其能夠引起進行性失明，包括夜間視覺喪失、周邊視野損失和完全失明。在美國，RP的發病率被認為在大約每4000人中有一人。RP通常是遺傳的，並且體染色體顯性RP、體染色體隱性RP和X連鎖RP病症已有記載。已將超過50種不同基因中的突變與RP關聯，包括光傳 導級聯、視黃醛循環(retinal cycle)和剪接因子中牽涉的組分，以及在視紫紅質自身中超過100種不同的突變。在許多情況中，與RP相關的突變導致視錐細胞(感光細胞)功能的喪失和/或細胞死亡。這種喪失導致暗視覺的下降並可能表現為夜盲或周邊視覺的下降。視桿細胞死亡也與後續的視錐細胞死亡相關，引起高敏銳度視覺的喪失，與視桿細胞死亡一起引起失明。

已經建立了多種基於細胞和動物的模型用於檢視RP的細胞學基礎以及用於測試實驗性治療。一種用於RP的基於細胞的模型是培養的人視網膜色素上皮(RPE)細胞(Adamowicz,M.,et al.(2012)Adv.Exp.Med.Biol.723：573-9)。這種模型可以用於表現RP中牽涉的突變體蛋白並測試這些突變對蛋白質功能的作用或突變體蛋白對細胞功能和/或生存力的作用。例如，可以使用任何合適的啟動子(例如，CMV)表現人野生型和突變型視紫紅質。不希望受限於理論，認為視蛋白多肽的錯誤折疊導致ER駐留和壓力、對未折疊蛋白質反應(UPR)的誘導和增加的細胞死亡。這種模型可以用於檢視任何RP相關突變，例如視紫紅質突變如P23H的作用。

基於動物的RP模型可包括小鼠，該小鼠攜帶已知或疑似引起小鼠中RP的突變，或與在人中發現的那些突變直系同源的突變。在一些具體實例中，小鼠模型可以包括經工程化而在感光細胞中表現視紫紅質(例如突變的人或小鼠形式)的小鼠。小鼠模型的實例包括視紫紅質P347S小鼠(Li,T.,et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93(24)：14176-81)、Rho-/-小鼠(Humphries,M.M.,et al.(1997)Nat.Genet.15(2)：216-9)和表現P23H突變視紫紅質的小鼠(“P23H小鼠”)(Olsson,J.E.,et al.(1992)Neuron 9(5)：815-30)。在P23H小鼠中，可 以將突變型人視紫紅質插入小鼠種系。可以使用本領域中已知的任何在感光細胞中表現的啟動子(例如，小鼠視蛋白或人RK啟動子)。在一些具體實例中，視紫紅質可以使用AAV載體表現。

也可以使用其他用於RP的動物模型。除了小鼠模型之外，還可以使用大鼠、狗、豬、蛙(Tam,B.M.and Moritz,O.L.(2006)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.47(8)：3234-41)和非人靈長類模型。

IV.治療色素性視網膜炎的方法

在一些方面，本發明提供用於治療哺乳動物中的色素性視網膜炎的方法和組成物，包括將有效量的rAAV病毒顆粒投予所述哺乳動物(例如，至視網膜)，所述rAAV病毒顆粒包含編碼miR-708的載體。所述方法可用於治療患有RP的人，以改善與RP有關的病理狀態(pathologies)和視覺損傷。在一些具體實例中，本發明包括投予有效量的rAAV病毒顆粒，所述rAAV病毒顆粒包含含有編碼視紫紅質的核酸(例如，正常的或野生型視紫紅質)的載體。在一些具體實例中，所述miR-708作用於抑制與RP相關的突變的視紫紅質的活性RP。在一些具體實例中，所述正常的或野生型視紫紅質作用於為眼補充有功能的視紫紅質。在一些具體實例中，所述病毒顆粒包含AAV血清型5衣殼(AAV5衣殼)，和AAV 2或AAV 5反向末端重複中任一者。在一些具體實例中，所述病毒顆粒包含AAV血清型5酪胺酸突變衣殼，和AAV 2或AAV 5反向末端重複中任一者。

在一些方面，本發明提供用於緩解RP症狀的方法和組成物，包括將有效量的rAAV病毒顆粒投予所述哺乳動物的眼部，所述rAAV病毒顆粒包含編碼miR-708的載體。在其他方面，本發明提 供用於緩解RP症狀的方法和組成物，包括將有效量的rAAV病毒顆粒投予所述哺乳動物的眼部，所述rAAV病毒顆粒包含編碼miR-708和視紫紅質的載體。在一些具體實例中，所述RP的症狀包括，但不限於，失明、夜盲、周邊視覺下降和高敏銳度視覺喪失。在一些具體實例中，治療色素性視網膜炎包括減少或預防與色素性視網膜炎相關的症狀，包括但不限於預防視網膜變性的方法，用於阻滯RP進展的方法，提高感光細胞功能的方法，用於增加感光細胞等。RP的症狀和/或病理狀態包括但不限於視野損失(loss of sight)、夜間視覺喪失、周邊視野損失、ERG功能喪失；視覺敏銳度和對比敏感度(contrast sensitivity)損失；視覺引導的行為喪失，視桿細胞功能喪失，視桿細胞死亡，暗視覺下降，視網膜細胞變化減少(感光細胞結構或功能的喪失；外核層(ONL)變薄或變厚；外網層(OPL)變薄或變厚；桿狀和錐狀外段的瓦解和之後的喪失；桿狀和錐狀內段變短；雙極細胞樹突的回縮；視網膜內層包括內核層、內網層、神經節細胞層和神經纖維層的變薄或變厚；視蛋白錯誤定位；神經絲的過度表現；等等。在一些具體實例中，本發明提供預防視桿細胞功能退化和視桿細胞死亡和視錐細胞功能退化和視錐細胞死亡的方法。

在一些方面，本發明提供預防或延遲RP進展的方法。體染色體顯性的RP是一種能夠被基因分型的遺傳病。RP的發作和進展可以通過光學相干斷層成像術(Optical Coherence Tomography(OCT))來確定，其允許對外網層(OPL)異常進行檢視。

用於測定RP症狀緩解的手段是本領域已知的。例如，測量視野(例如，Goldmann視野)，測定視網膜電圖(ERG)，眼底照相，光學相干斷層成像術和螢光素血管造影(fluorescein angiography)。視覺 喚起行為上的改善也可用於確定RP症狀的緩解；例如，做出“我能發現下落的物品”，“我能在燭光晚餐中看到面孔”，“我能看到我襯衫上的條紋”，“我能看到夜晚的星星”，“我能閱讀普通的書，並且可以坐在教室前排”，“現在我能踢足球，而且不需要有人在旁邊幫我找到球”，“我能自己在我家周圍騎自行車”，“我實現了我的夢想：我看到我女兒打出了全壘打”，以及“什麼時候能給我的另一隻眼睛進行注射？”的陳述。

在本發明的一些方面，將所述方法和組成物用於治療患有RP的人。RP可以按照體染色體顯性、體染色體隱性或X連鎖的方式遺傳。X連鎖的RP可以是隱性的，主要影響男性，或者可以是顯性的，既影響男性也影響女性。RP可由編碼視紫紅質蛋白的rho基因中的突變引起。在本發明的一些具體實例中，將所述方法用於治療在rho基因和/或在視紫紅質蛋白中具有突變的人。在本發明的一些具體實例中，視紫紅質蛋白中的突變是P23H突變(視紫紅質蛋白胺基酸殘基23處的脯胺酸被組胺酸取代)。在其他具體實例中，所述視紫紅質蛋白中的突變是T58R、P347L、或P347S，或殘基I255的缺失。與色素性視網膜炎相關的突變由McWilliam,P,et al.,(1989)Genomics 5：619-622；Dryja,TP et al.,(1990)Nature 343：364-266；Farrar,GJ et al.,(1990)Genomics 8：35-40；Farrar,GJ et al.,(2002)EMBO J.21：857-864提供；將其以參考方式全部併入本文。

miR-708是一種CHOP調節的微RNA，其調節視紫紅質表現(Behrman,S.,et al.(2011)J.Cell Biol.192(6)：919-27)。miR-708是位於CHOP誘導型基因Odz4(Tenurin-4)內部的內含子型微RNA。CHOP在ER壓力期間調節miR-708表現。在視紫紅質基因的3’ UTR 中存在推定的miR-708序列，其是高度保守的(參見Behrman et al.的圖4，同前)。

在一些具體實例中，本發明提供用於治療患有RP的人的方法。在一些具體實例中，本發明提供用於治療患有體染色體顯性的RP的人的方法。在一些具體實例中，本發明提供用於治療患有與視紫紅質基因中的突變相關的RP的人的方法。在一些具體實例中，本發明提供用於治療患有RP的人的方法，其通過投予有效量的編碼miR-708的AAV載體以抑制突變型視紫紅質的活性。在一些具體實例中，本發明提供用於治療患有RP的哺乳動物(例如，狗或貓)的方法。在一些具體實例中，所述miR-708核酸可包括但不限於由GenBank Entrez Gene IDs 100126333、735284或100885899代表的核酸。

在本發明的一些具體實例中，對突變型視紫紅質的抑制係藉由遞送有效量的編碼野生型視紫紅質或或與野生型視紫紅質具有實質上相同活性的視紫紅質的AAV載體來補充。在一些具體實例中，所述視紫紅質是人視紫紅質。在一些具體實例中，本發明提供用於治療患有RP的人的方法，其藉由投予有效量的編碼miR-708的載體以抑制突變型視紫紅質的活性和有效量的編碼具有野生型活性的人視紫紅質的載體。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的AAV載體和編碼人視紫紅質的AAV載體是相同的AAV載體。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的AAV載體和編碼人視紫紅質的AAV載體是不同的AAV載體。在一些具體實例中，編碼視紫紅質的核酸可以包括但不限於由NCBI參考序列NP_000530、NP_663358、NP_001008277、and NP_001009242鑑定並提供的核酸。

在一些方面，本發明提供用於治療細胞中內質網(ER)壓力的方法，其包括向哺乳動物投予包含rAAV載體的rAAV病毒顆粒，所述rAAV載體包含編碼miR-708的核酸。在一些具體實例中，所述細胞是眼細胞。在進一步的具體實例中，所述細胞是感光細胞。在更進一步的具體實例中，所述細胞是視桿細胞。在一些具體實例中，所述方法包括減少ER壓力的一種或多種細胞標誌。在進一步的具體實例中，所述一種或多種ER壓力的細胞標誌是剪接的XBP-1、CHOP或Grp78。在一些具體實例中，所述包含編碼miR-708的核酸的rAAV載體進一步包含編碼視紫紅質的核酸。在其他具體實例中，本發明提供用於治療細胞中內質網(ER)壓力的方法，其包括向哺乳動物投予包含編碼miR-708的核酸的第一rAAV載體和包含含有編碼視紫紅質的核酸之第二rAAV載體的第二rAAV病毒顆粒。

在一些方面，本發明提供向患有RP的哺乳動物遞送miR-708或miR-708和視紫紅質的方法，所述方法包括向所述哺乳動物的視網膜投予有效量的rAAV病毒顆粒，所述rAAV病毒顆粒包含編碼miR-708和/或視紫紅質的載體。所述投予將轉殖基因產物遞送至感光細胞，其中miR-708和/或視紫紅質介導對所述感光細胞和周圍的感光細胞的有益作用。在一些具體實例中，AAV病毒顆粒向視網膜的遞送是經由將病毒顆粒注射至視網膜的視網膜下間隙來進行。在一些具體實例中，AAV顆粒向視網膜的遞送是通過玻璃體內遞送來進行，條件是所述AAV顆粒能夠滲透至眼後並轉導(transduce)感光細胞。在一些具體實例中，所述AAV顆粒是在視網膜的視網膜下間隙中的一個或多個位置投予。

在一些具體實例中，向視網膜投予有效量的包含編碼miR-708 和/或視紫紅質的載體的rAAV病毒顆粒轉導位於投予位置處或附近的感光細胞。在一些具體實例中，超過約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或100%中任一者的感光細胞被轉導。在一些具體實例中，約5%至約100%、約10%至約50%、約10%至約30%、約25%至約75%、約25%至約50%或約30%至約50%的感光細胞被轉導。鑑定受到表現miR-708和/或視紫紅質的AAV轉導的感光細胞的方法是本領域已知的；例如，免疫組織化學或使用標誌物，如增強型綠色螢光蛋白，可用於檢測miR-708和/或視紫紅質的表現。

在本發明的一些具體實例中，所述方法包括向哺乳動物的視網膜(例如，視網膜下間隙)投予有效量的包含編碼miR708和/或視紫紅質的載體的AAV病毒顆粒用於治療患有RP的哺乳動物，例如，人。在一些具體實例中，將組成物注射至一處或多處視網膜下間隙以允許miR-708和/或視紫紅質在感光細胞中表現。在一些具體實例中，將組成物注射至視網膜的視網膜下間隙中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或超過十個中任一項的位置。

在一些具體實例中，將rAAV病毒顆粒同時或連續投予至超過一個位置。在一些具體實例中，rAAV病毒顆粒的多次注射之間不超過1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、9小時、12小時或24小時。

在一些具體實例中，將編碼miR-708的第一rAAV病毒顆粒和編碼視紫紅質的第二rAAV病毒顆粒同時或連續投予至一個或多個位置。在一些具體實例中，rAAV病毒顆粒的多次注射之間不超過1 小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、9小時、12小時或24小時。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的第一rAAV病毒顆粒的投予在所述編碼視紫紅質的第二rAAV病毒顆粒的投予之前。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的第一rAAV病毒顆粒的投予在所述編碼視紫紅質的第二rAAV病毒顆粒的投予之後。

在一些具體實例中，本發明提供用於治療患有RP的人的方法，其藉由投予有效量的包含編碼miR-708的AAV載體的醫藥組成物，以抑制突變型視紫紅質的活性。在一些具體實例中，本發明提供用於治療患有RP的人的方法，其通過投予有效量的包含編碼miR-708的AAV載體的醫藥組成物以抑制突變型視紫紅質的活性和有效量的包含編碼視紫紅質的AAV載體的醫藥組成物以為感光細胞補充野生型視紫紅質活性。在一些具體實例中，所述包含編碼miR-708的AAV載體的醫藥組成物和所述包含編碼人視紫紅質的AAV載體的醫藥組成物是相同的醫藥組成物。在一些具體實例中，所述包含編碼miR-708的AAV載體的醫藥組成物和所述包含編碼人視紫紅質的AAV載體的醫藥組成物是不同的醫藥組成物。在一些具體實例中，所述醫藥組成物包含一種或多種藥學上可接受的賦形劑。

在本發明的一些具體實例中，注射至視網膜的視網膜下間隙或玻璃體內注射的組成物的體積超過約1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、15μl、20μl、25μl、50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl或1mL或其間的任何量中的任一者。

本發明的組成物(例如，包含編碼miR-708和/或視紫紅質的載體的AAV病毒顆粒)可單獨使用或與一種或多種其他治療劑組合使 用用於治療RP。順序投予之間的間隔可以以至少(或任選地少於)數分鐘、數小時或數天為單位。

V.表現構築體

在一些具體實例中，轉殖基因(例如，miRNA 708和/或視紫紅質)與啟動子可操作地連接。例示性啟動子包括但不限於巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子、猿猴病毒40(SV40)啟動子和CK6啟動子、運甲狀腺素蛋白(transthyretin)啟動子(TTR)、TK啟動子、四環素反應性啟動子(TRE)、HBV啟動子、hAAT啟動子、LSP啟動子、嵌合肝特異性啟動子(LSPs)、E2F啟動子、端粒酶(hTERT)啟動子；巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/兔β-球蛋白啟動子(CAG啟動子；Niwa et al.,Gene,1991,108(2)：193-9)和延伸因子1-α啟動子(EF1-α)啟動子(Kim et al.,Gene,1990,91(2)：217-23和Guo et al.,Gene Ther.,1996,3(9)：802-10)。在一些具體實例中，所述啟動子包含人β-葡糖醛酸糖苷酶啟動子或巨細胞病毒增強子連接雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子。所述啟動子可以是組成型、誘導型或抑制型啟動子。在一些具體實例中，本發明提供包含與CBA啟動子可操作連接的編碼miR-708的核酸的AAV載體。在一些具體實例中，本發明提供包含與CBA啟動子可操作連接的編碼視紫紅質的核酸(例如，人視紫紅質)的AAV載體。在一些具體實例中，本發明提供包含與CBA啟動子可操作連接的編碼miR-708的核酸且編碼視紫紅質(例如，人視紫紅質)的核酸的AAV載體。

在一些具體實例中，所述啟動子能夠在感光細胞中表現轉殖基 因。在多個具體實例中，所述啟動子是視紫紅質激酶(RK)啟動子；例如，人RK啟動子。在一些具體實例中，所述啟動子是視蛋白啟動子；例如，人視蛋白啟動子或小鼠視蛋白啟動子。

在一些具體實例中，本發明提供包含與RK啟動子可操作連接的編碼miR-708的核酸的AAV載體。在一些具體實例中，本發明提供包含可操作連接至RK啟動子的編碼視紫紅質(例如，人視紫紅質)的核酸的AAV載體。在一些具體實例中，本發明提供包含可操作連接至RK啟動子的編碼miR-708和視紫紅質(例如，人視紫紅質)的核酸的AAV載體。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的核酸在編碼視紫紅質的核酸的5’。在其他具體實例中，所述編碼miR-708的核酸在編碼視紫紅質的核酸的3’。在一些具體實例中，本發明提供包含與第一RK啟動子可操作連接的編碼miR-708的核酸和與第二RK啟動子可操作連接的編碼視紫紅質的核酸的AAV載體。在一些具體實例中，所述可操作連接至第一RK啟動子的編碼miR-708的核酸係在可操作連接至第二RK啟動子的編碼視紫紅質的核酸的5’。在其他具體實例中，所述可操作連接至第一RK啟動子的編碼miR-708的核酸係在可操作連接至第二RK啟動子的編碼視紫紅質的核酸的3’。在一些具體實例中，所述miR-708包含SEQ ID NO：1的序列。在一些具體實例中，所述miR-708包含與SEQ ID NO：1的序列至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核苷酸序列。在一些具體實例中，所述視紫紅質包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述視紫紅質包含與SEQ ID NO：2的胺基酸序列至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同 的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述視紫紅質是野生型視紫紅質的功能等效物。在一些具體實例中，視紫紅質從AAV載體的表現難以受到miR-708的抑制。在一些具體實例中，編碼視紫紅質的核酸缺乏視紫紅質基因的3’ UTR中的miR-708靶位點。在一些具體實例中，編碼視紫紅質的核酸在視紫紅質基因的3’ UTR中的miR-708靶位點中包含突變(例如，缺失、取代、插入等)，從而使其難以受到miR-708的抑制。

在一些具體實例中，本發明提供包含可操作連接至視蛋白啟動子的編碼miR-708的核酸的AAV載體。在一些具體實例中，本發明提供包含可操作連接至視蛋白啟動子的編碼視紫紅質(例如，人視紫紅質)的核酸的AAV載體。在一些具體實例中，本發明提供包含可操作連接至視蛋白啟動子的編碼miR-708的核酸和編碼視紫紅質(例如，人視紫紅質)的核酸的AAV載體。在一些具體實例中，所述編碼miR-708的核酸在編碼視紫紅質的核酸的5’。在其他具體實例中，所述編碼miR-708的核酸在編碼視紫紅質的核酸的3’。在一些具體實例中，本發明提供包含可操作連接至第一視蛋白啟動子的編碼miR-708的核酸和可操作連接至第二視蛋白啟動子的編碼視紫紅質的核酸的AAV載體。在一些具體實例中，所述可操作連接至第一視蛋白啟動子的編碼miR-708的核酸在可操作連接至第二視蛋白啟動子的編碼視紫紅質的核酸的5’。在其他具體實例中，所述可操作連接至第一視蛋白啟動子的編碼miR-708的核酸在可操作連接至第二視蛋白啟動子的編碼視紫紅質的核酸的3’。在一些具體實例中，所述miR-708包含SEQ ID NO：1的序列。在一些具體實例中，所述miR-708包含SEQ ID NO：1的序列。在一些具體實例中，所述 miR-708包含與SEQ ID NO：1的序列至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核苷酸序列。在一些具體實例中，所述視紫紅質包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述視紫紅質包含與SEQ ID NO：2的胺基酸序列至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述視紫紅質是野生型視紫紅質的功能等效物。在一些具體實例中，視紫紅質從AAV載體的表現難以受到miR-708的抑制。在一些具體實例中，編碼視紫紅質的核酸缺乏視紫紅質基因的3’ UTR中的miR-708靶位點。在一些具體實例中，編碼視紫紅質的核酸在視紫紅質基因的3’ UTR中的miR-708靶位點中包含突變(例如，缺失、取代、插入等)，從而使其難以受到miR-708的抑制。

在一些具體實例中，本發明提供包含可操作連接至RK啟動子的編碼miR-708的核酸和可操作連接至視蛋白啟動子的編碼視紫紅質的核酸的AAV載體。在一些具體實例中，所述可操作連接至RK啟動子的編碼miR-708的核酸在可操作連接至視蛋白啟動子的編碼視紫紅質的核酸的5’。在一些具體實例中，所述可操作連接至RK啟動子的編碼miR-708的核酸在可操作連接至視蛋白啟動子的編碼視紫紅質的核酸的3’。在一些具體實例中，本發明提供包含可操作連接至視蛋白啟動子的編碼miR-708的核酸和可操作連接至RK啟動子的編碼視紫紅質的核酸的AAV載體。在一些具體實例中，所述可操作連接至視蛋白啟動子的編碼miR-708的核酸在可操作連接至RK啟動子的編碼視紫紅質的核酸的5’。在一些具體實例中，所述可操作連接至視蛋白啟動子的編碼miR-708的核酸在可操作連接 至RK啟動子的編碼視紫紅質的核酸的3’。在一些具體實例中，所述miR-708包含SEQ ID NO：1的序列。在一些具體實例中，所述miR-708包含SEQ ID NO：1的序列。在一些具體實例中，所述miR-708包含與SEQ ID NO：1的序列至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核苷酸序列。在一些具體實例中，所述視紫紅質包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述視紫紅質包含與SEQ ID NO：2的胺基酸序列至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述視紫紅質是野生型視紫紅質的功能等效物。在一些具體實例中，視紫紅質從AAV載體的表現難以受到miR-708的抑制。在一些具體實例中，編碼視紫紅質的核酸缺乏視紫紅質基因的3’ UTR中的miR-708靶位點。在一些具體實例中，編碼視紫紅質的核酸在視紫紅質基因的3’ UTR中的miR-708靶位點中包含突變(例如，缺失、取代、插入等)，從而使其難以受到miR-708的抑制。

在一些具體實例中，本發明提供包含可操作連接至CBA啟動子的編碼miR-708的核酸和可操作連接至RK啟動子的編碼視紫紅質的核酸的AAV載體。在一些具體實例中，所述可操作連接至CBA啟動子的編碼miR-708的核酸在可操作連接至RK啟動子的編碼視紫紅質的核酸的5’。在一些具體實例中，所述可操作連接至CBA啟動子的編碼miR-708的核酸在可操作連接至RK啟動子的編碼視紫紅質的核酸的3’。在一些具體實例中，本發明提供包含可操作連接至RK啟動子的編碼miR-708的核酸和可操作連接至CBA啟動子的編碼視紫紅質的核酸的AAV載體。在一些具體實例中，所述可 操作連接至RK啟動子的編碼miR-708的核酸在可操作連接至CBA啟動子的編碼視紫紅質的核酸的5’。在一些具體實例中，所述可操作連接至RK啟動子的編碼miR-708的核酸在可操作連接至CBA啟動子的編碼視紫紅質的核酸的3’。在一些具體實例中，所述miR-708包含SEQ ID NO：1的序列。在一些具體實例中，所述miR-708包含SEQ ID NO：1的序列。在一些具體實例中，所述miR-708包含與SEQ ID NO：1的序列至少約80%、85%、90%或95%相同的核苷酸序列。在一些具體實例中，所述視紫紅質包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述視紫紅質包含與SEQ ID NO：2的胺基酸序列至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%相同的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述視紫紅質是野生型視紫紅質的功能等效物。在一些具體實例中，視紫紅質從AAV載體的表現難以受到miR-708的抑制。在一些具體實例中，編碼視紫紅質的核酸缺乏視紫紅質基因的3’ UTR中的miR-708靶位點。在一些具體實例中，編碼視紫紅質的核酸在視紫紅質基因的3’ UTR中的miR-708靶位點中包含突變(例如，缺失、取代、插入等)，從而使其難以受到miR-708的抑制。

在一些具體實例中，編碼miR-708的核酸包含內源miR-708支架。在一些具體實例中，所述miR-708支架由SEQ ID NO：14提供。在一些具體實例中，編碼miR-708的核酸包含異源miRNA支架。在一些具體實例中，異源miRNA支架的使用是用於調節miRNA表現；例如，以增加miRNA表現或減少miRNA表現。在一些具體實例中，編碼miR-708的核酸包含內源miR-155支架。在一些具體實例中，所述miR-155支架由SEQ ID NO：14提供。

重組病毒載體

本發明涉及重組病毒基因組的使用，用於將本文描述的編碼miR-708 miRNA和/或視紫紅質蛋白的一種或多種核酸序列引入用於包裝至AAV病毒顆粒中。所述重組病毒基因組可包括確立miR-708 miRNA和/或視紫紅質蛋白表現的任何元素，例如，啟動子，miR-708 miRNA和/或視紫紅質轉殖基因，ITR，核糖體結合元件，終止子，增強子，選擇標誌物，內含子，多聚A信號和/或複製起點。

VI.病毒顆粒和用於產生病毒顆粒的方法

rAAV病毒顆粒

本發明提供使用rAAV顆粒治療色素性視網膜炎的方法並提供包含rAAV顆粒的組成物。在一些具體實例中，所述病毒顆粒是重組AAV顆粒，其包含的核酸包含本文描述的編碼miR-708 miRNA和/或視紫紅質蛋白的序列，側翼為一個或兩個ITR。所述核酸被衣殼包裝在AAV顆粒中。所述AAV顆粒還包含衣殼蛋白。在一些具體實例中，所述核酸包含感興趣的編碼序列(例如，編碼miR-708 miRNA和/或視紫紅質蛋白的核酸)，其是按照轉錄的方向可操作連接的組分，調控序列(包括轉錄起始和終止序列)，由此形成表現盒。在一些具體實例中，編碼miR-708的核酸嵌入在內含子中。所述表現盒的5'和3'端側翼有至少一個功能性AAV ITR序列。“功能性AAV ITR序列”的意思是所述ITR序列按照預期發揮拯救、複製和包裝AAV病毒體的功能。參見Davidson et al.,PNAS,2000,97(7)3428-32；Passini et al.,J.Virol.,2003,77(12)：7034-40；和Pechan et al.,Gene Ther.,2009,16：10-16，將其整體以參考方式併入本文。為了實施本發明的一些方面，所述重組載體至少包含對於衣殼包裝和用於由rAAV進行感染的物理結構來說至關重要的全部AAV序列。用於本發明載體中的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列(例如，如Kotin,Hum.Gene Ther.,1994,5：793-801中所述)，並且可以通過核苷酸的插入、缺失或取代來改變，或者所述AAV ITR可以源自數種AAV血清型中的任何一種。目前已知超過40種AAV血清型，並且將不斷鑑定新的血清型和現有血清型的變體。參見Gao et al.,PNAS,2002,99(18)：11854-6；Gao et al.,PNAS,2003,100(10)：6081-6；and Bossis et al.,J.Virol.,2003,77(12)：6799-810。任何AAV血清型的使用均被認為在本發明的範圍之內。在一些具體實例中，rAAV載體是源自AAV血清型的載體，所述AAV血清型包括但不限於AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣殼血清型ITR或類似物。在一些具體實例中，AAV中的核酸包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣殼血清型ITR或類似物。在一些具體實例中，AAV中的核酸還編碼如本文所述的miR-708、視紫紅質，或miR-708和視紫紅質。例如，AAV中的核酸可包含本文考慮的任意AAV血清型的至少一個ITR，並且還可編碼包含SEQ ID NO：1的核酸的miR-708和/或編碼包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列的人視紫紅質的核酸。在一些具體實例中，AAV中的核酸從5’至3’ 包含編碼以下各項的核酸：AAV ITR，填充片段(stuffer fragment)(例如，SEQ ID NO：11)，嵌合內含子(例如，SEQ ID NO：10)，miR-708，牛生長激素多聚腺苷酸化序列(bovine growth hormone polyadenylation sequence)，填充片段，和AAV ITR。在一些具體實例中，AAV中的核酸從5’至3’包含編碼以下各項的核酸：AAV ITR，RK啟動子，β球蛋白內含子，嵌入β球蛋白內含子中的miR-708，人視紫紅質，牛生長激素多聚腺苷酸化序列，和AAV ITR。在一些具體實例中，AAV中的核酸從5’至3’包含編碼以下各項的核酸：AAV ITR，填充片段(例如，SEQ ID NO：11)，RK啟動子，嵌合內含子(例如，SEQ ID NO：10)，人視紫紅質，β-球蛋白內含子，嵌入β-球蛋白內含子的miR-708，牛生長激素多聚腺苷酸化序列，填充片段，和AAV ITR。在一些具體實例中，AAV中的核酸從5’至3’包含編碼以下各項的核酸：AAV ITR，填充片段(例如，SEQ ID NO：11)，RK啟動子，嵌合內含子(例如，SEQ ID NO：10)，miR-708，小鼠視蛋白啟動子，人視紫紅質，牛生長激素多聚腺苷酸化序列，和AAVITR。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO：5的核酸。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含與SEQ ID NO：5的核酸至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO：6的核酸。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含與SEQ ID NO：6至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO：7的核酸。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含與SEQ ID NO：7至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO：8的核酸。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含與SEQ ID NO：8至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO：9的核酸。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含與SEQ ID NO：9至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO：24的核酸。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含與SEQ ID NO：24至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO：25的核酸。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含與SEQ ID NO：2580%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO：26的核酸。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含與SEQ ID NO：26至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO：27的核酸。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含與SEQ ID NO：27至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸。在進一步的具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊 AAV、AAV1/AAV2嵌合型、牛AAV、小鼠AAV衣殼rAAV2/HBoV1血清型衣殼的衣殼蛋白，或這些衣殼蛋白的突變型。在一些具體實例中，突變型衣殼蛋白保有形成AAV衣殼的能力。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV5酪胺酸突變型衣殼(Zhong L.et al.,(2008)Proc Natl Acad Sci U S A 105(22)：7827-7832。在進一步的具體實例中，所述rAAV顆粒包含進化枝A-F(Clades A-F)的AAV血清型的衣殼蛋白(Gao,et al.,J.Virol.2004,78(12)：6381)。在一些具體實例中，AAV中的核酸包括選自由SEQ ID NOs：5-8組成的組的核酸序列，並且側翼有至少一個AAV2 ITR。在一些具體實例中，AAV中的核酸包括與選自由SEQ ID NOs：5-9組成的組的核酸至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列，並且側翼有至少一個AAV2 ITR。

將不同AAV血清型用於優化特定靶細胞的轉導或用於靶向特定組織內的具體細胞類型(例如，患病組織)。rAAV顆粒可包含相同血清型或混合血清型的病毒蛋白和病毒核酸。例如，在一些具體實例中，rAAV顆粒可包含AAV5衣殼蛋白和至少一種AAV2 ITR或其可包含AAV2衣殼蛋白和至少一種AAV5 ITR。在其他具體實例中，rAAV顆粒可包含AAV5酪胺酸突變型衣殼蛋白和至少一種AAV2 ITR。在又另一個實例中，rAAV顆粒可包含來自AAV5和AAV2二者的衣殼蛋白，並且進一步包含至少一種AAV2 ITR。本文提供用於產生rAAV顆粒的AAV血清型的任何組合，正如每種組合已經在本文明確說明一樣。在一些具體實例中，本發明提供rAAV顆粒，其包含AAV5衣殼蛋白和編碼miR-708 RNA和/或視紫紅質轉殖基因的核酸，其側翼有至少一個AAV2 ITR。

自我互補的AAV病毒基因組

在一些方面，本發明提供包含重組自我互補基因組(recombinant self-complementing genome)的病毒顆粒。具有自我互補基因組的AAV病毒顆粒和使用自我互補AAV基因組的方法記載於美國專利Nos.6,596,535；7,125,717；7,765,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054；和8,361,457；以及Wang Z.,et al.,(2003)Gene Ther 10：2105-2111，將其每一篇整體以參考方式併入本文。包含自我互補基因組的rAAV會借助於其部分互補序列(例如，補充轉殖基因的編碼和非編碼鏈)將快速形成雙鏈DNA分子。在一些具體實例中，本發明提供包含AAV基因組的AAV病毒顆粒，其中所述rAAV基因組包含第一異源多核苷酸序列(例如，miR-708和/或視紫紅質編碼鏈)和第二異源多核苷酸序列(例如，miR-708的反義鏈和/或視紫紅質非編碼或反義鏈)，其中所述第一異源多核苷酸序列可以與所述第二多核苷酸序列在其長度的大部分或全部上形成鏈內鹼基配對。在一些具體實例中，所述第一異源多核苷酸序列和第二異源多核苷酸序列通過輔助鏈內鹼基配對的序列連接；例如，髮夾DNA結構。髮夾結構是本領域已知的，例如在siRNA分子中。在一些具體實例中，所述第一異源多核苷酸序列和第二異源多核苷酸序列係經由突變型ITR(例如，右側ITR)連接。在一些具體實例中，所述ITR包括多核苷酸序列5’-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG-3’(SEQ ID NO：20)。所述突變型ITR包含D區的缺失，所述D區包含末端 解析序列。這樣的結果是，在複製AAV病毒基因組時，rep蛋白不會在突變型ITR處切割病毒基因組，並且如此以5'至3'順序包含以下各項的重組病毒基因組會被包裝至病毒衣殼中：AAV ITR，包括調節序列的第一異源多核苷酸序列，突變型AAV ITR，與所述第一異源多核苷酸方向相反的第二異源多核苷酸和第三AAV ITR。在一些具體實例中，本發明提供包含重組病毒基因組的AAV病毒顆粒，所述重組病毒基因組包含功能性AAV2 ITR，編碼miR-708 RNA和/或視紫紅質轉殖基因的第一多核苷酸序列，包含D區缺失並且缺乏功能性末端解析序列的突變型AAV2 ITR，包含與所述第一多核苷酸序列的編碼miR-708 RNA和/或視紫紅質的序列互補的序列的第二多核苷酸序列和功能性AAV2 ITR。

AAV顆粒的產生

rAAV顆粒可以使用本領域已知的方法產生。參見，例如，美國專利Nos.6,566,118；6,989,264；和6,995,006。在本發明的實踐中，用於產生rAAV顆粒的宿主細胞包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、微生物和酵母。宿主細胞還可以是包裝細胞，其中AAV rep和cap基因穩定保持在所述宿主細胞中，或是生產者細胞，其中穩定保有AAV載體基因組。示例性包裝和生產證細胞源自293、A549或HeLa細胞。使用本領域已知的標準技術純化和配製AAV載體。

在一些方面，提供用於產生如本文公開的任何rAAV顆粒的方法，包括(a)在產生rAAV顆粒的條件下培養宿主細胞，其中所述宿主細胞包含(i)一種或多種AAV包裝基因，其中每種所述AAV包裝 基因編碼AAV複製和/或衣殼包裝蛋白(encapsidation protein)；(ii)包含編碼如本文所述的miR-708 RNA和/或任何視紫紅質轉殖基因的核酸的rAAV原載體(pro-vector)，其側翼有至少一個AAV ITR，和(iii)AAV輔助功能；和(b)回收由宿主細胞產生的rAAV顆粒。在一些具體實例中，核酸編碼SEQ ID NO：1的miR-708 RNA和/或編碼視紫紅質的轉殖基因；例如，具有SEQ ID NO：2的胺基酸的視紫紅質。在一些具體實例中，所述至少一個AAV ITR選自下列組成的群組：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR或類似物。在一些具體實例中，所述衣殼包裝蛋白選自下列組成的群組：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6(例如，野生型AAV6衣殼，或變體AAV6衣殼，如ShH10，如美國核准前公開案2012/0164106中所述)、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9(例如，野生型AAV9衣殼，或修飾型AAV9衣殼，如美國核准前公開案2013/0323226)、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、酪胺酸衣殼突變型、肝素結合衣殼突變型(heparin binding capsid mutant)、AAV2R471A衣殼、AAVAAV2/2-7m8衣殼、AAV DJ衣殼(例如，AAV-DJ/8衣殼、AAV-DJ/9衣殼或美國核准前公開案2012/0066783中描述的任何其他衣殼)、AAV2 N587A衣殼、AAV2 E548A衣殼、AAV2 N708A衣殼、AAV V708K衣殼、山羊AAV衣殼、AAV1/AAV2嵌合衣殼、牛AAV衣殼、小鼠AAV衣殼、rAAV2/HBoV1衣殼、美國專利號8,283,151或國際公開案號WO/2003/042397中描述的AAV衣殼，或其突變型。在一些具體實 例中，衣殼包裝蛋白是AAV5酪胺酸突變型衣殼蛋白。在進一步的具體實例中，所述rAAV顆粒包含來自進化枝A-F的AAV血清型的衣殼蛋白。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV5衣殼和包含AAV2 ITRs、突變型AAV2 ITR和編碼miR-708和/或視紫紅質的核酸的重組基因組。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV5酪胺酸突變型衣殼和包含AAV2 ITRs、突變型AAV2 ITR和編碼miR-708和/或視紫紅質的核酸的重組基因組。在進一步的具體實例中，所述rAAV顆粒是經純化的。術語“純化的”如用於本文包括不含至少一些其他成分的rAAV顆粒的製備物，所述其他成分可能也存在於所述rAAV顆粒天然存在之處或所述rAAV顆粒最初從中製備之處。因此，例如，分離的rAAV顆粒可使用純化技術製備以使其從來源混合物(如培養裂解液或生產培養物上清液)富集。富集可以以多種方式測量，例如藉由溶液中存在的DNA酶抗性顆粒(DRP)或基因組拷貝(gc)的比例，或者通過感染力，或者其可以相對於來源混合物中的次要的、潛在幹擾性物質來測量，如污染物，包括生產培養物污染物或加工污染物(in-process contaminant)，包括輔助病毒，培養基成分，等等。

本文還提供包含本發明的rAAV顆粒和醫藥上可接受載劑的醫藥組成物，所述rAAV顆粒包含編碼miR-708的轉殖基因和/或視紫紅質轉殖基因。在一些具體實例中，所述組成物包含含有編碼miR-708的轉殖基因的rAAV顆粒和包含視紫紅質轉殖基因的rAAV顆粒。在一些具體實例中，所述組成物包含含有編碼miR-708的轉殖基因和視紫紅質轉殖基因的rAAV顆粒。所述醫藥組成物可適用於本文描述的任何投予模式。本文所述的包含編碼miR-708 RNA的 核酸和/或視紫紅質轉殖基因的rAAV的醫藥組成物可導入至眼部；例如，通過視網膜下投予或玻璃體內投予。

在一些具體實例中，包含本文所述的rAAV和醫藥上可接受載劑的醫藥組成物適合於向人投予。這些載體是本領域中熟知的(參見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,15th Edition,pp.1035-1038和1570-1580)。在一些具體實例中，包含本文所述的rAAV和醫藥上可接受載劑的醫藥組成物適用於眼部注射。這些醫藥上可接受載劑可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，如花生油、大豆油、礦物油等。鹽水溶液和含水葡萄糖(aqueous dextrose)、聚乙二醇(PEG)和甘油溶液也可用作液體載體，特別是用於注射溶液。所述醫藥組成物可進一步包含額外的成分，例如防腐劑、緩衝液、張度劑(tonicity agents)、抗氧化劑和穩定劑、非離子型潤濕劑或澄清劑、增粘劑等。本文所述的醫藥組成物可以包裝成單一單位劑量或包裝成多劑量形式。所述組成物通常配製為無菌且基本上等滲的溶液。

VII.製品和套組

還提供在本文所述的方法中使用的套組或製品。在多個方面中，所述套組包含在合適的包裝中的本文所述的組成物(例如，包含編碼miR-708 RNA的核酸和/或視紫紅質轉殖基因的rAAV顆粒)。用於本文所述的組成物(如眼部組成物)的合適包裝是本領域已知的，並且包括，例如，小瓶(如密封小瓶)、容器、安瓿(ampule)、瓶、罐、柔性包裝(例如，密封的Mylar或塑料袋)，等等。這些製品可以進一步滅菌和/或密封。

本發明還提供包含本文所述的組成物的套組，並且可進一步包含關於使用所述組成物的方法(如本文所述的使用)的說明。本文描述的套組可進一步包括從商業和用戶立場來看理想的其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器和帶有關於實施本文所述任何方法的說明的包裝插頁。例如，在一些具體實例中，所述套組包含含有編碼miR-708 RNA的轉殖基因和/或視紫紅質轉殖基因的rAAV用於眼內遞送至少1×109基因組拷貝至如本文所述的靈長類，適合於眼內注射的醫藥上可接受載劑，和如下的一種或多種：緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器和帶有關於實施眼部注射的說明的包裝插頁。在一些具體實例中，所述套組包含關於使用本文所述的rAAV顆粒治療色素性視網膜炎的說明。在一些具體實例中，所述套組包含關於使用本文所述的rAAV顆粒降低細胞中ER壓力的說明。在一些具體實例中，所述套組包含關於根據本文所述的任一方法使用本文所述的rAAV顆粒的說明。

附圖簡述

圖1A和1B顯示野生型(圖1A)和P23H突變型(圖1B)視紫紅質在人視網膜色素上皮細胞中的定位。將細胞針對視紫紅質(綠色)、α-微管蛋白(紅色)和DNA(藍色)進行染色。野生型視紫紅質的染色樣式的特徵在於膜定位(實心箭頭)，而P23H突變視紫紅質的染色樣式的特徵在於繞核(perinuclear)/網狀(reticular)定位(虛線箭頭)。

圖2A和2B顯示P23H突變視紫紅質形成非天然寡聚體並保留ER特異性寡糖。(圖2A)來自表現野生型(“wt”)或P23H突變視紫紅 質的細胞的洗滌劑可溶性萃取物的蛋白質印跡。(圖2B)來自表現野生型(“wt”)或P23H突變視紫紅質的細胞的洗滌劑可溶性萃取物的蛋白質印跡。萃取物用內切糖苷酶H(Endoglycosidase H)(“Endo-H”)處理或不經處理。

圖3A和3B顯示表現P23H視紫紅質的細胞具有較高的UPR標誌物表現和較高的凋亡傾向。(圖3A)C/EBP同源蛋白(CHOP；即Ddit3)、結合免疫球蛋白(BiP；即Hspa5)和視紫紅質基因在表現野生型(“wt”)或P23H突變視紫紅質的細胞中的相對表現。使用ΔΔCt方法將各個基因的相對表現與β-葡糖醛酸糖苷酶(beta-glucoronidase)表現比較。(圖3B)表現對照(pcDNA)、野生型視紫紅質或P23H突變視紫紅質的細胞中凋亡細胞的百分比，通過TUNEL染色測量。

圖4顯示用於在遍在啟動子(雞β-肌動蛋白，CBA)或感光特異性(photoreceptor-specific)啟動子(視紫紅質激酶，RK)調控下表現miR-708的表現載體的構建的示意圖。合成了編碼miR-708的莖和環序列的DNA並選殖至5’和3’ miR-155支架序列之間。這種支架序列含有Drosha在核中將pri-miR-708加工成pre-miR-708所需的靶位點，允許後續通過Dicer在細胞質中對pre-miR-708進行加工。

圖5顯示相對於未轉染的細胞，視紫紅質蛋白在表現miR-708或對照miRNA的細胞中的表現。所有細胞均為表現具有3’UTR miR708靶序列的mP23H視紫紅質的HEK-293細胞。將視紫紅質蛋白表現相對於hGAPDH表現標準化。視紫紅質蛋白水平在miR708存在時與對照miR相比有所減少。

圖6顯示與表現對照miRNA(“亂序(Scramble)”)的細胞相比， 表現mP23H視紫紅質的HEK-293細胞在表現miR-708時具有降低的UPR標誌基因CHOP和BiP的RNA水平。

圖7A和7B顯示通過內源miR-708下調視紫紅質依賴於視紫紅質3’ UTR中miR-708靶序列的存在。將HEK-293細胞用包括miR-708靶序列的小鼠P23H視紫紅質基因(圖7A)，或用缺少miR-708靶序列的人P23H視紫紅質基因(圖7B)轉染。還將細胞用對照pre-miRNA或anti-miR-708 pre-miRNA轉染以抑制內源miR-708。相對於hGAPDH蛋白測量視紫紅質蛋白，並且相對於hGAPDH mRNA測量視紫紅質mRNA。還顯示內源miR-708的水平(圖7A和7B中的右側軸和最右兩欄)。

圖8描繪用於在視桿感光細胞中表現miR-708的AAV載體的示意圖。對相關的載體特徵進行標示。

圖9A和9B顯示使用AAV載體表現miR-708下調P23H突變視紫紅質。(圖9A)在轉染編碼由RK啟動子驅動的miR-708或對照miRNA(“亂序(scramble)”)的載體時，WERI或RPE細胞中miR-708的表現。表現相對於miR-16描繪。(圖9B)相對於用對照質體轉染的細胞，在用pRK-miR-708質體轉染的WERI細胞中P23H視紫紅質mRNA的表現。

圖10A-10C顯示AAV5 miR-708載體的視網膜下遞送導致小鼠視紫紅質的敲低(knockdown)。(圖10A)m視紫紅質在注射AAV5 miR-708或AAV5 miR-對照的小鼠視網膜中的表現。(圖10B)RdCVF在注射AAV5 miR-708或AAV5 miR-對照的小鼠視網膜中的表現。(圖10C)miR-708在注射AAV5 miR-708或AAV5 miR-對照的小鼠視網膜中的表現。

圖11A和11B顯示用AAV5 miR-708處理眼降低視桿細胞介導、但視錐細胞不介導的反應。(圖11A)三個代表性視網膜電圖，代表在接受AAV5 miR-708或AAV5 miR-對照(“Scram”)的眼中的暗視反應(scoptopic response)。(圖11B)三個代表性視網膜電圖，代表在與(圖11A)相同的接受AAV5 miR-708或AAV5 miR-對照(“Scram”)的眼中的明視反應(photopic response)。

圖12提供miR-708內含子嵌入h視紫紅質抑制/替代載體的示意圖。

圖13顯示如與miR-對照載體比較，內含子嵌入的miR-708載體降低m視紫紅質、hCHOP和hBiP在用P23H m視紫紅質轉染的WERI細胞中的表現。

圖14顯示在WERI中miR-708由內含子嵌入載體的表現比非嵌入載體具有降低的表現，事先聲明的是內含子嵌入載體pRK-hRHO-內含子miR-708也共表現h視紫紅質。全部使用RK啟動子驅動miR-708表現的載體比使用CBA啟動子的載體具有低幾個數量級的表現。

圖15顯示h視紫紅質由內含子嵌入抑制/替代載體的表現難以通過共表現的miR-708敲低。h視紫紅質RNA的水平在用表現miR-708或miR-對照的載體轉染的細胞中是相同的。

圖16顯示在表現突變視紫紅質的WERI細胞中，miR-708抑制/替代載體降低XBP-1剪接(一種ER壓力的標誌)。這種降低僅在視紫紅質轉錄物中存在3’UTR miR-708靶序列的條件下被觀察到。

圖17顯示在視紫紅質cDNA的3’ UTR中具有miR-708人β-球蛋白內含子支架的載體的示意圖。

圖18顯示在視紫紅質cDNA的3’ UTR中具有miR-708人β-球蛋白內含子支架的載體比在5’ UTR具有支架的載體產生更高的h視紫紅質和miR-708表現。

圖19顯示另一種載體設計的示意圖，其使用單獨的啟動子來驅動miR-708(RK啟動子)和h視紫紅質(小鼠視蛋白啟動子)的表現。

圖20顯示用指定載體轉染的WERI細胞中h視紫紅質(左)和miR-708(右)表現。將表現表示為針對DNA標準品計算的拷貝數。

圖21A-C顯示在視網膜下注射以使用視蛋白啟動子在miR-708支架中驅動人視紫紅質和miR-708(miR 708/708)或人視紫紅質和對照miRNA(miR-對照)表現的AAV5衣殼載體之後三周，小鼠視網膜中miR-708(圖21A)、小鼠視紫紅質(圖21B)和人視紫紅質(圖21C)的水平。對於每個實驗，將表現作為與對側、未經注射的眼的表現倍數顯示。

圖22顯示視蛋白啟動子構築體的示意圖，包括神經視網膜鹼性拉鍊因子序列(NRL)、CMV增強子、視蛋白啟動子和MVM內含子序列，其包括來自CBA外顯子1和來自小鼠細小病毒的內含子的雜合內含子序列(MVM)。

圖23A顯示嵌入β-球蛋白內含子中的miR-708序列的示意圖。

圖23B和23C顯示在miR-708內源性支架(圖23B)或在miR-155支架(圖23C)背景(context)下的miR-708序列的示意圖，其嵌入在β-球蛋白內含子中。在圖23C中標記出5’和3’ miR側翼序列之間的miR-155“環序列”。

圖24顯示對候選載體的評估，所述候選載體含有由視紫紅質激酶(GRK1)啟動子或視蛋白(Ops)啟動子驅動的在miR-155或miR-708 支架(嵌入β-球蛋白內含子中)中的miR-708序列和人視紫紅質編碼序列(人視紫紅質；也缺乏3’UTR miR-708靶序列)。如圖所示，測試了所有四種組合對miR-708和人視紫紅質表現的作用。

實施例

參考以下實施例會更充分地理解本發明。然而，不應將它們理解為對本發明範圍的限制。應理解的是此處記載的實施例和具體實例僅出於示例性目的，並且本領域技術人員會得到提示在其啟發下進行多種修改或變化，並且這些修改或變化包括在本申請的宗旨和範圍以及所附權利要求範圍之內。

實施例1：色素性視網膜炎細胞模型的開發

用於RHO相關體染色體遺傳RP的治療策略會同時敲低突變和野生型視紫紅質並緩解ER壓力。這可以通過共同遞送會抑制視紫紅質等位基因的微RNA(miR)並任選地共同遞送難以通過外源遞送的miR敲低的野生型視紫紅質序列來實現。受CHOP調節的miR，miR-708，調節視紫紅質表現(Behrman,S.,et al.(2011)J.Cell Biol.192(6)：919-27)。miR-708是位於CHOP-誘導型基因Odz4(Tenurin-4)之內的內含子miR。在ER壓力期間CHOP調節miR-708表現，並且在視紫紅質的3’ UTR中存在推定的miR-708序列。

本文描述了使用AAV載體遞送外源miR-708的方法，所述外源miR-708通過兩種等位基因中存在的3’ UTR miR-708靶序列靶向野生型和突變視紫紅質二者。在多個具體實例中，野生型視紫紅質取 代序列也被共同遞送。這種取代視紫紅質序列可經工程化以具有減少的與miR-708的結合(例如，核苷酸取代、缺失或添加至3’ UTR)，並因此會難以通過外源miR-708敲低。在多個具體實例中，取代視紫紅質序列缺乏3’ UTR miR-708靶序列。簡言之，所述AAV載體會敲低引起ER壓力的視紫紅質的表現(並因此有感光細胞死亡)，並任選地補充難以受到miR-708誘導的敲低的野生型或密碼子優化的視紫紅質基因的表現，因此重建正常表現和視紫紅質功能。

方法

細胞培養

使用來自Invitrogen的T-Rex四環素誘導系統將HEK-293細胞經工程化以表現人或小鼠視紫紅質P23H。將6孔板中融合的細胞用4μg miR-708(pcDNA)載體或對照miRNA載體使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)按照生產商的說明轉染。轉染後48小時，將培養基用含有2μM四環素的培養基替代。將細胞培育額外的24小時，並將培養基從每個孔去除。

蛋白質印跡法(Western Blotting)

將細胞在含有1mM PMSF的400μL RIPA緩衝液(Thermo Scientific)中裂解，並多次通過25g注射器。將裂解液在14,000rpm離心10分鐘。在整個過程中將細胞保持在4℃。將30μL上清液裝載至4-12% Bis/Tris凝膠上並在MOPS緩衝液(Invitrogen)中進行SDS-PAGE。然後將蛋白質使用來自Invitrogen的I-Blot系統轉移至硝酸纖維素膜。將膜在室溫在含有0.05% Tween-20(PBS-T)和0.1% I-Block(Invitrogen)的PBS中封阻1小時。將膜在含有1μg/mL抗視紫紅質mAb 1D4(Abcam)的PBS-T中在4℃培育過夜。在PBS-T中清洗幾次之後，將膜在含有1：1000稀釋的抗小鼠IgG HRP偶聯Ab(R&D Systems)的第二抗體溶液中在室溫培育1小時。將膜在PBS-T中清洗幾次，並使用ECL試劑(Thermo Scientific)顯影。m視紫紅質蛋白水平使用Image-J軟體定量。在含有0.1M甘胺酸pH 2的PBS中將膜的蛋白質剝離，然後在PBS-T中漂洗幾次。然後在室溫在含有1：20,000稀釋的抗GAPDH pAb(Sigma)的PBS-T中探查膜的hGAPDH 2小時。在PBS-T中清洗幾次之後，將第二抗體(抗兔IgG-HRP,R&D Systems)在PBS-T以1：1000中稀釋，並在室溫培育1小時。將膜清洗幾次，並使用ECL試劑(Thermo Scientific)顯影。然後使用Image J軟體將m視紫紅質蛋白質水平標準化至hGAPDH蛋白質水平。

HEK-293細胞中內源miR-708的敲低

將(上述)表現小鼠或人視紫紅質的HEK-293細胞用100pmol pre-miR-708,anti-miR-708或對照miRNA(Ambion)使用用於以siRNA分子轉染的Lipofectamine 2000方案(Invitrogen)進行轉染。在轉染後48小時，將培養基用含2uM四環素的培養基替代以誘導視紫紅質表現。24小時之後，將每個孔分成2個樣品。一個使用上述蛋白質印跡方案探查m視紫紅質和hGAPDH，並從另一個萃取RNA用於對視紫紅質和miR-708 RNA表現的TaqMan®(Life Technologies)分析。使用Qiagen的miRNeasy套組，根據生產商的說明，從細胞萃取總RNA(包括小RNA)，包括對樣品的DNA酶處 理。使用Qiagen的Quantitect Reverse Transcription(Quantitect反轉錄)系統從總RNA合成cDNA。將cDNA添加至m視紫紅質、hCHOP(Ddit3)、hBiP(Hspa5)或hGAPDH TaqMan®基因表現測定(Life Technologies)。將基因表現相對於hGAPDH使用ΔΔCt方法標準化。將miR-708表現使用miR-708 TaqMan®表現測定(Life Technologies)定量。將miR-708表現相對於內源miR-16表現使用ΔΔCt方法呈現。

WERI Rb-1細胞中視紫紅質激酶啟動子驅動的miR-708表現

將miR-708序列在從pcDNA 6.2 GW載體(Block-iT系統，Invitrogen)切下之後次選殖至載體pRK-MVM中視紫紅質激酶(RK)啟動子的下游，所述載體pRK-MVM含有天然hRK啟動子和MVM內含子序列。將WERI Rb-1細胞(ATCC)用2μg pRK-miR-708或pRK-miR-對照載體使用Fugene-HD(Promega)根據生產商的說明轉染。在轉染後48小時，收集細胞，並使用miRNeasy套組方案(Qiagen)萃取總RNA(包括小RNAs)。使用miR-708TaqMan®基因表現測定如之前所述(Life Technologies)定量每個樣品中的miR-708。為了定量表現miR-708的WERI Rb-1細胞中的m視紫紅質敲低，將細胞用各2μg pRK-miR-708(或對照)和pSport6 m視紫紅質P23H使用Fugene-HD根據生產商的說明(Promega)共轉染。如所述的萃取RNA，並如上所述使用ΔΔCt方法相對于hGAPDH RNA水平定量m視紫紅質RNA水平。

從注射AAV載體的小鼠視網膜萃取RNA

使用miRNeasy套組根據生產商的說明(Qiagen)從小鼠視網膜萃 取RNA。將各個小鼠視網膜在Qiazol Lysis Buffer(Qiazol裂解緩衝液)中使用1mm氧化鋯/二氧化矽珠(Biospec)均質化10分鐘。在均質化之後，根據生產商的說明萃取RNA。使用qStar microRNA定量系統(Origene)定量每個視網膜中的miR-708水平。使用第一鏈cDNA合成套組(Origene)合成cDNA，接著使用miR-708特異性引子和miR-708拷貝標準品(Origene)進行miR-708特異性擴增和定量。為了定量經注射的小鼠眼內的視紫紅質水平，使用特異性引子(Life Technologies)擴增m視紫紅質，並相對於視紫紅質cDNA標準品定量。使用ΔΔCt方法相對於GAPDH表現定量分析RdCVF水平。

視紫紅質抑制/替代載體

通過從pcDNA載體切下並進行平端連接至pRK-MCS中將h視紫紅質cDNA(沒有側翼UTR序列)選殖至pRK載體中。合成(Biobasic)的cDNA含有h視紫紅質激酶啟動子序列和h^β-球蛋白內含子，帶有位於內含子的剪接受體/供體位點之間的hmiR-708序列插入(取自Genbank/NCBI的序列)。將該序列從pUC57載體次選殖，連接至pcDNA h視紫紅質載體中，並重命名為pRK-miR-708 hRho/wt。如上所述測定經轉染的WERI Rb-1細胞中的miRNA-708和h視紫紅質蛋白質水平。

定量P23H m視紫紅質-轉染的WERI Rb-1細胞中的XBP-1剪接

將hWERI Rb-1細胞用編碼非糖基化的P23H突變的m視紫紅質的pcDNA載體和pRK-miR-708載體共轉染。使用定點PCR誘變 (Agilent Technologies)突變這種P23H視紫紅質cDNA以將兩個天冬醯胺密碼子(在位置2和5)變成丙胺酸。按照描述用每種載體2μg轉染細胞並培育72小時。如先前所述從細胞收集總RNA。使用High Capacity cDNA合成套組(Invitrogen)合成cDNA。使用對於XBP-1特異性的引子和High Fidelity PCR MasterMix(高保真PCR主混合物)(Roche)評價XBP-1剪接。在2%瓊脂糖凝膠上分析擴增的序列，並使用Image-J軟體定量剪接的(~280nt)相對於未剪接的(~300nt)XBP-1轉錄物的相對量。

其他方法

用於免疫螢光的方法、帶有和不帶有內切糖苷酶H處理的蛋白質印跡、UPR標誌物表現和TUNEL染色表現野生型或P23H突變視紫紅質的細胞如Adamowicz,M.,et al.(2012)Adv.Exp.Med.Biol.723：573-9中所述進行。

結果

用編碼人野生型(WT)或人P23H突變視紫紅質(與RP連鎖的突變)的基因瞬時轉染人視網膜色素上皮(RPE)細胞。通過共聚焦免疫螢光顯微鏡使用抗視紫紅質抗體研究視紫紅質的定位。在野生型蛋白質的情況下，大部分蛋白質經加工至細胞膜(圖1A)，說明正常的生物發生。相對而言，突變的P23H顯示了內質網(ER)駐留的繞核(perinuclear)/網狀(reticular)分佈特徵，其中幾乎沒有在細胞表面的表現(圖1B)。這些結果證明，P23H突變視紫紅質不能正確地運輸至細胞膜，反而駐留在ER中。

通過對來自瞬時表現野生型或P23H突變體蛋白的RPE細胞的洗滌劑可溶性萃取物的SDS-PAGE免疫印跡分析評估了視紫紅質的聚集(圖2A)。野生型視紫紅質主要作為彌散條帶遷移至在~40kDa的分子量處。這種類型對應於單體、成熟的含n-聯聚糖的視紫紅質。P23H突變視紫紅質的遷移力顯著區別於野生型視紫紅質，其中大部分P23H作為更高分子量的二聚體和寡聚體遷移(圖2A)。P23H還對內切糖苷酶H敏感-注意到用內切糖苷酶H的處理影響P23H視紫紅質的遷移，但不影響野生型，如圖2B中所示。內切糖苷酶H特異性針對尚未成熟至ER之外的蛋白質中典型的核心糖基化、高甘露糖N聯寡糖結構。

綜合起來，這些數據提示在RPE細胞野生型中，視紫紅質能夠折疊並成熟至ER之外，而P23H突變型更傾向於形成非天然寡聚體並保留在ER之內，這或許是因為不具有有效折疊的能力。

接下來，通過測量UPR的兩種標誌物(BiP和CHOP)的水平來評估P23H視紫紅質在經轉染的RPE細胞中誘導ER壓力的能力。在瞬時表現WT和P23H視紫紅質的細胞中檢測到了BiP mRNA水平的增加(圖3A)，提示增加ER本身的折疊載荷(folding load)誘導UPR。然而，BiP mRNA表現在表現P23H視紫紅質的細胞(是未經轉染的細胞的43-倍)中比在表現WT視紫紅質的細胞(是未經轉染的細胞的14-倍)中顯著更高(圖3A)。視紫紅質mRNA水平在表現WT或所述蛋白的突變形式的細胞中相同(圖3A)。因此，P23H視紫紅質是比WT視紫紅質更有效的BiP誘導劑。不希望受限於理論，這種差異可能是由於突變體蛋白的缺陷。

接下來檢視CHOP表現。表現WT視紫紅質蛋白的細胞與未經 轉染的細胞相比顯示出了15-倍的CHOP誘導，而表現P23H突變型的細胞顯示了更勝一籌的23-倍的誘導(圖3A)。由於CHOP是一種介導凋亡的UPR-誘導型轉錄因子(Lee,E.S.,et al.(2007)FEBS Lett.581(22)：4325-32)，測量了表現WT和P23H突變型的細胞之間凋亡的相對水平。與CHOP的mRNA水平一致，TUNEL測定結果進一步提示瞬時表現P23H突變型的RPE細胞比表現野生型視紫紅質的那些更傾向於凋亡(圖3B)。

實施例2：對miR-708水平的調整調節HEK-293細胞中視紫紅質表現和UPR

已在數種哺乳動物視紫紅質基因的3’ UTR中發現了對應於推定的miR-708靶位點的共有序列(Behrman,S.,et al.(2011)J.Cell Biol.192(6)：919-27)。本實施例證明對視紫紅質的miR-708調節可用作調整所培養的細胞中視紫紅質表現的手段。

用如圖4中所描繪的表現miR-708或miR-對照的質體轉染了表現編碼3’UTR miR-708靶序列的P23H突變型m視紫紅質基因的HEK-293細胞。72小時之後，手機細胞，並使用蛋白質印跡分析了mP23H視紫紅質蛋白的表現(圖5)。與用CBA-miR-對照載體轉染的細胞相比，在用CBA-miR-708轉染的細胞中P23H m視紫紅質蛋白的表現降低至~30%。

還藉由TaqMan®基因表現分析來分析UPR靶基因(CHOP/BIP)的表現。表現miR-708的HEK-293細胞還顯示與對照細胞相比降低的CHOP和BiP RNA的表現(圖6)。這些結果提示降低錯誤折疊的P23H m視紫紅質的水平導致UPR基因BiP和CHOP表現的同時降 低。

在相反的實驗中，用anti-miR-708 pre-miRNA或陰性對照pre-miRNA轉染了表現小鼠P23H視紫紅質(包括3’ UTR miR-708靶序列)或人P23H視紫紅質(缺乏3’ UTR miR-708靶序列)的HEK-293細胞(圖7)。在這項實驗中，使用了外源anti-miR-708抑制內源HEK293 miR-708。如果內源miR-708透過推定的miR-708靶序列調節視紫紅質表現，則只會在視紫紅質基因的3’ UTR中存在miR-708靶序列的情況下觀察到P23H視紫紅質水平的變化。將細胞用每種RNA各100pmol轉染。生成細胞裂解液，並且在蛋白質上定量視紫紅質蛋白，同時藉由TaqMan®分析來分析mRNA水平(圖7)。對內源miR-708抑制導致小鼠視紫紅質mRNA和蛋白質均有所增加(圖7A)，而人視紫紅質mRNA和蛋白質二者的水平均保持不便(圖7B)，儘管內源miR-708水平較低。這些結果證明經由miR-708調節視紫紅質需要視紫紅質3’ UTR中的miR-708靶序列。

綜合起來，這些結果證明視紫紅質是miR-708的功能性靶物，並且對miR-708活性的調整可用作影響視紫紅質表現的手段。

實施例3：設計在感光細胞特異性視紫紅質激酶啟動子控制下表現miR-708的AAV ITR質體

認為ER中突變型視紫紅質蛋白的累積促成RP中引起感光細胞死亡的ER壓力。前述實施例證明瞭miR-708表現能夠調節視紫紅質的整體水平。構建了基於腺伴隨病毒(AAV)的載體，用於miR-708在視網膜的感光細胞中的特異性表現，以測定降低總視紫紅質水平(包括野生型和突變形式)是否可不依賴於視紫紅質突變來緩解ER 壓力。

圖8描繪設計用於在視網膜感光細胞中特異性表現miR-708的AAV反向末端重複(ITR)質體。miR-708表現由視紫紅質激酶啟動子(pRK)驅動，其在視桿細胞中特異性地表現。在這種載體中，miR-708從圖4中所示的miR-155支架表現。

接下來，在培養的細胞中驗證這種AAV ITR質體。將WERI或RPE細胞用圖8中描述的前病毒質體(pre-viral plasmid)轉染，並且藉由TaqMan®分析定量miR-708水平。圖9A顯示用pRK驅動的miR-708質體轉染的WERI細胞與用表現miR-亂序(對照)的質體轉染的WERI細胞相比在miR-708水平上具有超過2000倍的增加。相對來說，RPE細胞，其中RK啟動子不顯著表現，沒有顯示miR-708水平的顯著增加(圖9A)。

miR-708在調節視紫紅質表現中的功能通過將pRK-miR-708質體(或miR-對照質體)和具有含3’miR708靶序列的P23H小鼠視紫紅質基因的質體共轉染至WERI細胞中而得到了確認。圖9B顯示與miR-對照相比，在miR-708存在下P23H m視紫紅質mRNA減少。這些結果證明使用AAV ITR載體表現miR-708有效降低了感光細胞中視紫紅質的表現。

實施例4：使用miR-708 AAV5載體敲低小鼠視網膜中的視紫紅質

為了檢驗AAV載體是否能夠在體內用於降低視網膜中視紫紅質的表現，將圖8中描述的pRK-miR-708質體包裝至AAV5衣殼中以生成AAV5-RK miR-708。另外，生成AAV5 miR-對照載體。野生 型C57bl小鼠在對側眼中接受了視網膜下注射的1x108 vgs的AAV5-RK miR-708或AAV5 miR-對照。在注射後1個月，對小鼠進行麻醉，萃取了神經視網膜並快速冷凍用於對基因表現進行qPCR分析。

圖10A顯示用表現miR-708的AAV5載體注射過的小鼠眼與注射AAV5 miR-對照載體的小鼠眼相比具有降低的視紫紅質表現。相對而言，另一視桿細胞特異性基因(視桿細胞來源的視錐細胞活力因子(Rod Derived Cone Viability Factor(RdCVF)))的表現未受影響(圖10B)。圖10C確認注射了AAV5miR708載體的眼與接受AAV5miR對照的眼相比顯示出miR-708拷貝數的顯著增加。這些結果提示，在視桿細胞(rod photoreceptor)中表現miR-708的基於AAV的載體有效降低體內內源視紫紅質的表現。

為了證明視紫紅質敲低的功能相關性，藉由視網膜電圖(ERG)分析了用AAV5 miR-708或AAV5 miR-對照處理的小鼠眼以評估視網膜功能。接受AAV5 miR-708載體的眼顯示降低的暗視反應，正如若視紫紅質水平減少時的情況所預期(圖11A)。暗視ERG反應是對視桿細胞功能的評估，並且這種測量能夠與視紫紅質水平相關聯。然而，相同動物中視錐細胞功能，如通過明視ERG來評估，在AAV5 miR-708遞送之後沒有變化(圖11B)，確認miR-708對視桿細胞具有生物學效應而不影響視錐細胞(while sparing the cone cells)。這些數據證明AAV5 miR-708遞送導致僅限於視桿靶細胞的生物學作用。

實施例5：構建具有嵌入內含子的miR-708表現盒的h視紫紅質抑制/替代載體

miR-708在正常情況下由ODZ4基因中的第一內含子在體內表現。因此，基於miR-708的序列及其內源支架/側翼序列設計新的構築體。將miR-708序列嵌入合成內含子並選殖至感光細胞特異性啟動子視紫紅質激酶(RK)的下游，但在h視紫紅質cDNA的上游。將內源miR-708序列包括其側翼調節和加工序列選殖至h視紫紅質cDNA序列上游但在RK啟動子下游的β-球蛋白內含子中。如此，miR-708序列相對於視紫紅質編碼序列係位於5’。

圖12提供了這種5’抑制/替代載體的示意圖。藉由RK啟動子控制h視紫紅質(缺乏3’ UTR mir708靶序列)。將包括內源支架(例如，包括任何Drosha/Dicer識別基序)的內源miR-708序列嵌入β-球蛋白內含子之內。將h視紫紅質cDNA(無3’ miR-708 UTR靶序列)納入在剪接連接位點(splice junction site)的下游。將miR-708嵌入在β-球蛋白之內，其位於RK啟動子的下游，因此miR-708在β-球蛋白內含子序列的剪接之後得到加工。另外，生成含有對照miR的具有相似結構的載體。

使用圖12描述的載體或具有對照miRNA的載體轉染WERI細胞。使用WERI細胞是因為它們(如果有的話)表現很少的內源miR-708，並且它們對於RK啟動子是可容許的。將WERI細胞用編碼P23H m視紫紅質(具有3’UTR miR-708序列)的cDNA共轉染。在經轉染的細胞中同時檢視了視紫紅質敲低(RNA水平)以及UPR基因CHOP和BIP的水平。

圖13顯示用m視紫紅質(P23H)和miR-708載體共轉染的細胞與用視紫紅質和對照miRNA載體共轉染的細胞相比具有降低的m視紫紅質水平。另外，與對照相比UPR基因CHOP和BiP也在 miR-708轉染的細胞中被下調。此數據提示使用其中內含子表現miR708的內源miR708支架提供一種可供選擇的支持miR708加工和表現的支架。

實施例6：比較不同的miR-708支架

較低的miR-708表現水平可能有益於降低臨床使用情況中任何潛在的miRNA脫靶效應(off-target effects)。因此，測試不同miR支架在WERI人成視網膜細胞瘤細胞系中的表現強度。

圖14描繪用CBA驅動的miR-708、圖4中顯示的使用miR-155支架的RK驅動的miR708或圖12中顯示的RK內含子嵌入的miR-708 h視紫紅質載體轉染的WERI細胞中的定量miR-708水平。RK內含子系統中的miR-708表現不如CBA驅動系統中那樣堅固(robust)。然而，miR-708表現仍足以在背景之上，並且比使用miR-155支架的pRKmiR708低大約5倍。注意到h視紫紅質由內含子嵌入載體共表現，在CBA或RKRK miR-155支架載體中則否。

接下來，比較表現miR-708內含子嵌入的、抑制/替代載體或miR-對照載體的WERI細胞中的h視紫紅質mRNA水平。圖15顯示用miR-708內含子嵌入的、抑制/替代載體轉染的WERI細胞與用對照載體轉染的細胞相比具有相似的h視紫紅質水平。這些結果表明缺乏3’ UTR miR-708靶序列的h視紫紅質由所述抑制/替代載體的表現難以受到miR-708表現的抑制。兩種細胞均顯示比未經轉染的WERI細胞高的h視紫紅質之表現。

實施例7：通過miR-708抑制/替代載體敲低突變型視紫紅質降 低了ER壓力的標誌物

檢視了miR-708抑制/替代載體降低表現突變型視紫紅質的細胞中ER壓力的能力。用圖12中描述的抑制替代載體轉染了表現非糖基化的、P23H突變視紫紅質(N2K/N15K/P23H)(帶有或不帶有3’UTR miR708靶序列)的WERI細胞。收穫細胞並萃取RNA以測量X-框(box)結合蛋白1(XBP-1)剪接。XBP-1是在對ER壓力基因的調節中重要的轉錄因子，其剪接是細胞ER壓力/UPR的已知標誌物；正在經歷UPR的細胞顯示出升高的經剪接XBP-1水平。

如圖16中所示，當用miR-708抑制/替代載體轉染時，表現帶有3’ UTR靶序列的突變型視紫紅質的細胞具有降低的XBP-1剪接。相對來說，表現缺乏3’UTR miR-708靶序列的突變型P23H視紫紅質的細胞與用miR-對照序列轉染的細胞相比具有水平相當的XBP-1剪接。這些結果證明使用miR-708抑制/替代載體敲低突變型視紫紅質有效降低ER壓力。

實施例8：置於視紫紅質3’ UTR中的β-球蛋白內含子支架中的miR-708的表現增加視紫紅質和miR-708的表現

為了檢驗miR-708支架的位置是否影響其表現，構建了載體，其中將miR-708序列(包括其側翼調節/加工序列)選殖至視紫紅質cDNA下游的β-球蛋白內含子序列中，即在3’ UTR之內。圖17顯示了這種3’抑制/替代載體的示意圖，其與圖12中所示的載體類似，除了miR-708人β-球蛋白內含子支架位於視紫紅質cDNA的3’ UTR中，而不是5’ UTR。

為了確定miR-708人β-球蛋白內含子支架在載體中的位置是否 影響了miR-708或h視紫紅質由所述載體的表現，用圖12的5’ UTR載體和圖17的3’ UTR載體轉染WERI細胞。圖18顯示這些細胞中h視紫紅質和miR-708的表現。發現miR-708支架在3’ UTR中的載體比使用5’ UTR構型的載體產生更高水平的h視紫紅質和miR-708 RNA二者。

實施例9：在視網膜變性的P23H小鼠模型中評估所述抑制/替代載體

在視網膜變性的P23H小鼠模型中評估抑制/替代構築體。在這種模型中，在視桿細胞中表現的突變型P23H蛋白誘導了ER壓力/UPR，引起凋亡和最終的視桿細胞死亡(Lee,E.S.,et al.(2007)FEBS Lett.581(22)：4325-32)。在視桿細胞死亡之後，出現視錐細胞的非細胞自主性死亡。

用表現miR-708和難以被miR708敲低的人視紫紅質基因(因為其缺乏miR-708靶序列)的抑制/替代AAV載體治療P23H小鼠。抑制/替代載體導致WT和P23H小鼠視紫紅質二者的敲低，但是替代視紫紅質基因補償了視紫紅質WT水平上的降低。因此，所述載體提供必要的視桿細胞視紫紅質以維持視桿細胞功能和完整性。

還測試另一種備選抑制/替代構築體設計。如圖19中所示，這種備選載體驅動miR-708從RK啟動子的表現並且使用小鼠視蛋白啟動子共表現h視紫紅質(難以被miR-708敲低)。

這些抑制/替代載體還如上所述在P23H小鼠模型中進行了測試，在所述P23H小鼠模型中內源人視紫紅質包含單一拷貝功能喪失的等位基因(例如，該小鼠就人視紫紅質敲除等位基因而言是雜合的)。 這種雜合小鼠模型可以使用標準小鼠遺傳技術由mRho-/-小鼠和上述P23H模型構建。不希望受限於理論，認為這種mRho+/- P23H小鼠模型(含有一個拷貝突變型人視紫紅質P23H等位基因和一個拷貝野生型小鼠基因)可模擬人ADRP基因型，在人ADRP基因型中患者具有相等拷貝的突變型和野生型視紫紅質等位基因。

實施例10：評估其他抑制/替代載體

選殖了數種載體，其從單一載體表現miR-708(或對照miRNA序列)和h視紫紅質二者。這些載體彼此的區別在於miRNA序列的側翼序列或者源自miR-155(得自Invitrogen“Block-It”系統)或者源自內源miR-708 5’和3’側翼序列。將miRNA序列嵌入在視紫紅質激酶啟動子下游且在h視紫紅質ORF上游的hβ-球蛋白內含子中。目的是檢測來自每種構築體的表現和miRNA加工是否相似。另一對載體在h視紫紅質ORF下游含有該miRNA序列(對照或miR-708)，也嵌入在β-球蛋白內含子中。在本實驗中僅測試含有位於h視紫紅質ORF下游的miR-708內源側翼5’和3’序列的載體，在其中β-球蛋白內含子位於h視紫紅質ORF上游的載體中測試了內源miR-708和miR-155兩種側翼序列。用每種構築體轉染WERI細胞，並且測定miR-708表現和h視紫紅質表現二者。

圖20中的結果表明miR-155側翼序列與內源miR-708側翼序列相比產生了更好的miR-708表現(或miRNA加工)。在用含有miR-155側翼序列的載體轉染的那些細胞中miR-708表現與miR-708側翼序列相比高約10倍。無論所述序列相對於h視紫紅質ORF位於上游或下游，含有miR-708側翼序列的載體具有較低的miR-708表現。 h視紫紅質表現不受miR-708過度表現的影響，因為無論載體中共表現的miRNA為何，其表現水平大致相等。未在含有對照miRNA序列的載體中檢測到miR-708表現，與預期一致。

實施例11：評估其他具有突變的miR-708靶序列的抑制/替代載體

如上所述，已經在數種哺乳動物視紫紅質基因的3’ UTR中發現對應於推定的miR-708靶位點的共有序列(Behrman,S.,et al.(2011)J.Cell Biol.192(6)：919-27)。本實施例證明具有突變miR-708靶序列的視紫紅質能夠用於抑制/替代載體中。

構建的rAAV載體包含編碼miR-708的核酸和人視紫紅質的基因。藉由核酸取代、缺失或插入來使人視紫紅質基因於miR-708靶序列突變(SEQ ID NO：19)，以減少或防止miR-708進行識別。在一些實施例中，整個miR-708靶序列缺失。在一些實施例中，miR-708的減少和防止(reduction or prevention by miR-708)參考miR-708對包含miR-708靶序列的野生型視紫紅質3’UTR的識別來測量。

為了測試通過miR-708抑制體染色體顯性視紫紅質並同時表現野生型視紫紅質，用表現miR-708和人視紫紅質的質體(帶有(CBA-miR-708-hRho-3’UTR^-)或不帶有(CBA-miR-708-hRho-3’UTR⁺)突變的miR-708靶序列)轉染表現編碼3’UTR miR-708靶序列的P23H突變型m視紫紅質基因的HEK-293細胞。還使用實施例2中描述的miR-對照。72小時之後，收集細胞，並使用蛋白質印跡分析mP23H視紫紅質和人視紫紅質蛋白表現。在用CBA-miR-708-hRho-3’UTR^-或CBA-miR-708-hRho-3’UTR⁺轉染的細 胞中P23H m視紫紅質的蛋白表現與用CBA-miR-對照載體轉染的細胞相比降低說明miR-708活性。人視紫紅質在用CBA-miR-708-hRho-3’UTR-、而非CBA-miR-708-hRho-3’UTR+轉染的細胞中的表現表明由CBA-miR-708-hRho-3’UTR-編碼的視紫紅質難以受到miR-708的抑制。

實施例12：AAV介導的對內源視紫紅質和人視紫紅質在小鼠視網膜中的表現的抑制

基於上述實驗，實施了進一步的實驗在完整眼中檢驗視紫紅質抑制/替代策略。本實施例證明瞭使用miR-708支架構建的抑制/替代AAV載體在小鼠視網膜中的效力。

構建了具有如下載體的AAV5衣殼，所述載體包含視桿細胞特異性視蛋白啟動子、miR-708支架(例如，miR-708內源支架/側翼序列)和人視紫紅質替代基因。在這種載體的一個版本中，插入miR-708序列(例如，與miR-708靶序列結合的miR-708序列)以驅動表現miR708支架背景下的miR-708和人視紫紅質替代基因(AAV5OPSmiR708708hRHO)。在這種載體的另一個版本中，生成的對照載體包含miR對照序列(AAV5OPSmiR對照708hRHO)。在兩種載體中，替代性人視紫紅質基因均難以受到miR-708敲低，因為其缺乏miR-708靶序列。兩種載體均視網膜下注射至野生型小鼠的視網膜中。對於每隻小鼠，未用藥的對側眼是未經注射的，並且將在每個經注射的視網膜中的表現標準化為相較於未經注射的對側視網膜的表現倍數。注射後三周，收穫視網膜並測定miR-708水平(圖21A)、小鼠視紫紅質mRNA水平(圖21B)和人視紫紅質(圖21C)。

圖21A顯示與未用藥的對側眼相比，在注射AAV5OPSmiR708₇₀₈hRHO載體後小鼠視網膜中miR-708水平的增加。在接受AAV5OPSmiR708₇₀₈hRHO的眼中測量到了小鼠視紫紅質的顯著降低，而在接受對照載體AAV5OPSmiRcontrol₇₀₈hRHO的眼中沒有測量到小鼠視紫紅質的降低(圖21B)。此外，與對側未經注射的未用藥眼相比，兩種載體均將人視紫紅質水平升高高達100倍(圖21C)。這些數據證明AAV5OPSmiR708₇₀₈hRHO載體在體內是有效的。

總的來說，優化的抑制/替代載體AAV5OPSmiR708₇₀₈hRHO通過miR-708實現小鼠視紫紅質的敲低(內源小鼠視紫紅質具有3’UTR靶序列)，同時實現替代人視紫紅質的表現，其難以受到miR708敲低(人視紫紅質替代基因缺乏3’UTR miR708靶序列)。這些結果證明瞭抑制/替代策略在完整哺乳動物眼中的效力。

實施例13：在人細胞中驗證候選載體

接下來測定基於AAV5的候選載體在人細胞(HeLa)中促進miR-708和人視紫紅質表現的能力。

測試了兩種不同的啟動子：視紫紅質激酶(GRK1)和視蛋白啟動子。上文描述了視紫紅質激酶啟動子。視蛋白啟動子(示於SEQ ID NO：22)含有編碼400bp CMV增強子的676bp片段，其在視蛋白啟動子的上游(-500bp-+15bp)。此外，包括65bp NRL序列；這一序列編碼神經視網膜鹼性拉鍊因子(視桿細胞特異性轉錄因子)。啟動子構築體下游是雜合內含子序列，其來自CBA外顯子1和小鼠細小病毒(MVM)-稱作MVM內含子序列(示於SEQ ID NO：23)。這種啟動 子構築體的示意圖示於圖22。

使用了兩種不同的支架：miR-155支架或miR-708支架。二者均嵌入β-球蛋白內含子中。總共測試4種候選載體：AAV5GRK1miR708_155hRho(AAV5載體，具有視紫紅質激酶啟動子驅動表現miR-155支架中的miR-708和去掉miR-708靶序列的人視紫紅質；SEQ ID NO：24)，AAV5GRK1miR708_708hRho(AAV5載體，具有視紫紅質激酶啟動子驅動表現miR-708支架中的miR-708和去掉miR-708靶序列的人視紫紅質；SEQ ID NO：25)，AAV5OPSmiR708_155hRho(AAV5載體，具有視蛋白啟動子驅動表現miR-155支架中的miR-708和去掉miR-708靶序列的人視紫紅質；SEQ ID NO：26)，和AAV5OPSmiR708_708hRho(AAV5載體，具有視蛋白啟動子驅動表現miR-708支架中的miR-708和去掉miR-708靶序列的人視紫紅質；SEQ ID NO：27)。圖23A顯示嵌入在β-球蛋白內含子中的miR-708序列。miR-708和miR-155支架分別示於圖23B和23C。

將4種候選AAV5載體中的每一種用於感染HeLa細胞(使用AdTs149輔助病毒)，並測量miR-708和人視紫紅質的水平。如圖24中所示，如與驅動從視蛋白或視紫紅質激酶啟動子表現對照miR的載體相比(分別為Ops miR-對照和RK miR-對照)，所有四種載體導致了miR-708和人視紫紅質在人細胞中的體內表現。這些結果證明，成功地驗證幾種載體可用於在人細胞中的抑制/替代策略(例如上述那些)。

序列 miR-708核苷酸序列

(SEQ ID NO：1)

人視紫紅質胺基酸序列

(SEQ ID NO：2)

人視紫紅質cDNA-UTR缺失

(SEQ ID NO：3)

人視紫紅質cDNA-包括3’UTR

(SEQ ID NO：4)

僅RK-miR708

(SEQ ID NO：5)

RK-miR-708-op-視紫紅質

(SEQ ID NO：6)

RK-內含子-視紫紅質-miR-708.

(SEQ ID NO：7)

RK-miR-708-內含子hRho wt

(SEQ ID NO：8)

RK-內含子-miR-708-op-hRho wt

(SEQ ID NO：9)

嵌合內含子

(SEQ ID NO：10)

填充序列(Stuffer sequence)

(SEQ ID NO：11)

pCBA-h視紫紅質-miR708(miR-155支架)

(SEQ ID NO：12)

MIR155支架

(SEQ ID NO：13)

內源MIR708支架

(SEQ ID NO：14)

pRK-h視紫紅質-miR-708(mir708內源支架中的mir708，其位於人視紫紅質的3’UTR中)

(SEQ ID NO：15)

β-球蛋白內含子序列

(SEQ ID NO：16)

mir155支架中的Mir708序列

(SEQ ID NO：17)

天然支架中的Mir708序列

(SEQ ID NO：18)

來自3’UTR的人視紫紅質miR-708靶

(SEQ ID NO：19)

突變的AAV ITR

(SEQ ID NO：20)

野生型ITR序列

(SEQ ID NO：21)

視蛋白啟動子

(SEQ ID NO：22)

MVM內含子

(SEQ ID NO：23)

AAV5GRK1miR708_155hRho(AAV5載體，其具有視紫紅質啟動子驅動表現miR155支架中的miR-708和去掉miR-708靶序列的人視紫紅質)

(SEQ ID NO：24)

AAV5GRK1miR708_708hRho(AAV5載體，其具有視紫紅質啟動子驅動表現miR-708支架中的miR-708和去掉miR-708靶序列的人視紫紅質)

(SEQ ID NO：25)

AAV5OPSmiR708_155hRho(AAV5載體，其具有視蛋白啟動子驅動表現miR-155支架中的miR-708和去掉miR-708靶序列的人視紫紅質)

(SEQ ID NO：26)

AAV5OPSmiR708_708hRho(AAV5載體，其具有視蛋白啟動子驅動表現miR-708支架中的miR-708和去掉miR-708靶序列的人視紫紅質)

(SEQ ID NO：27)

含視錐視桿同源框的轉錄因子

(SEQ ID NO：28)

CMV增強子

(SEQ ID NO：29)

神經視網膜鹼性亮胺酸拉鍊因子

(SEQ ID NO：30)

<110> Catherine O’Riordan Matthew Adamowicz

<120> 用於色素性視網膜炎的基因療法

<140> 104109152

<141> 2015/03/23

<150> US 61/969,027

<151> 2014-03-21

<160> 30

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 88

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

<210> 2

<211> 348

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

<210> 3

<211> 1044

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

<210> 4

<211> 2768

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

<210> 5

<211> 1512

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 5

<210> 6

<211> 3444

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 6

<210> 7

<211> 3014

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 7

<210> 8

<211> 1826

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 8

<210> 9

<211> 3444

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 9

<210> 10

<211> 1017

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 10

<210> 11

<211> 2239

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 11

<210> 12

<211> 6408

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 12

<210> 13

<211> 155

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 13

<210> 14

<211> 189

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

<210> 15

<211> 6172

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 15

<210> 16

<211> 441

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

<210> 17

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 17

<210> 18

<211> 190

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 18

<210> 19

<211> 79

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 19

<210> 20

<211> 113

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 20

<210> 21

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 21

<210> 22

<211> 795

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 22

<210> 23

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 23

<210> 24

<211> 2064

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 24

<210> 25

<211> 2093

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 25

<210> 26

<211> 2716

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 26

<210> 27

<211> 2755

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 27

<210> 28

<211> 145

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 28

<210> 29

<211> 364

<212> DNA

<213> 巨細胞病毒

<400> 29

<210> 30

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 30

Claims (21)

1. 一種rAAV顆粒，其包含編碼miR-708的核酸及編碼視紫紅質的核酸，其中該編碼視紫紅質的核酸包含在miR-708靶序列中核酸的取代、插入或缺失，或缺少3’UTR miR-708靶序列，且其中該取代、插入或缺失降低或防止miR-708進行的識別。
2. 如請求項1的rAAV顆粒，其中該編碼miR-708的核酸及/或該編碼視紫紅質的核酸可操作地連接至啟動子。
3. 如請求項2的rAAV顆粒，其中該啟動子在感光細胞中表現miR-708及/或視紫紅質。
4. 如請求項2的rAAV顆粒，其中該啟動子包含RK啟動子、視蛋白啟動子或CBA啟動子。
5. 如請求項4的rAAV顆粒，其中i)該編碼miR-708的核酸和編碼視紫紅質的核酸可操作地連接至一個RK啟動子或視蛋白啟動子；或ii)該編碼miR-708的核酸可操作地連接至第一RK啟動子或第一視蛋白啟動子，且該編碼視紫紅質的核酸可操作地連接至第二RK啟動子或第二視蛋白啟動子。
6. 如請求項5的rAAV顆粒，其中該編碼miR-708的核酸係在該編碼視紫紅質的核酸的5’，或其中該編碼miR-708的核酸係在該編碼視紫紅質的核酸的3’。
7. 如請求項1的rAAV顆粒，其中所述編碼miR-708的核酸嵌入在內含子中。
8. 如請求項1的rAAV顆粒，其中該編碼miR-708的核酸包含內源性miR-708支架或miR-155支架。
9. 如請求項1的rAAV顆粒，其中該編碼miR-708的核酸包含 SEQ ID NO：1的核酸；且其中該視紫紅質包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列，或其中該編碼視紫紅質的核酸包含SEQ ID NO：3的核酸序列。
10. 如請求項8的rAAV顆粒，其中該rAAV顆粒包含重組病毒基因組，該重組病毒基因組包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27的多核苷酸。
11. 如請求項1的rAAV顆粒，其中該rAAV顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV5酪胺酸突變體、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合型、牛AAV或小鼠AAV衣殼rAAV2/HBoV1血清型衣殼；且其中該rAAV載體包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV1、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型反向末端重複序列(ITR)。
12. 如請求項11的rAAV顆粒，其中該rAAV顆粒包含AAV-5衣殼或AAV-5酪胺酸突變體衣殼，並且其中該載體包含AAV2 ITR。
13. 一種包含rAAV顆粒的組成物，該rAAV顆粒包含編碼miR-708的核酸及編碼視紫紅質的核酸，其中該編碼視紫紅質的核酸包含在miR-708靶序列中核酸的取代、插入或缺失，或缺少3’UTR miR-708靶序列，且其中該取代、插入或缺失降低或防止miR-708 進行的識別。
14. 一種組成物，其包括包含編碼miR-708的核酸之第一rAAV顆粒以及包含編碼視紫紅質的核酸之第二rAAV顆粒，其中該編碼視紫紅質的核酸包含在miR-708靶序列中核酸的取代、插入或缺失，或缺少3’UTR miR-708靶序列，且其中該取代、插入或缺失降低或防止miR-708進行的識別。
15. 一種如請求項13或14的組成物用於製備治療哺乳動物中的色素性視網膜炎(retinitis pigmentosa)的藥物之用途。
16. 一種如請求項13或14的組成物用於製備治療哺乳動物細胞中的內質網(ER)壓力的藥物之用途。
17. 如請求項16的用途，其中該細胞是眼細胞(ocular cell)或感光細胞(photoreceptor cell)。
18. 如請求項15的用途，其中該rAAV顆粒係配製以注射入該哺乳動物視網膜的視網膜下間隙(subretinal space)一或多個位置。
19. 如請求項15的用途，其中該rAAV顆粒係配製以玻璃體內注射至該哺乳動物。
20. 如請求項15的用途，其中該色素性視網膜炎是體染色體顯性色素性視網膜炎或體染色體隱性色素性視網膜炎。
21. 如請求項15的用途，其中該組成物包含第二rAAV顆粒，其包含編碼視紫紅質的核酸，且其中編碼miR-708的rAAV顆粒和編碼視紫紅質的第二rAAV顆粒係被同時投予該哺乳動物，或編碼miR-708的rAAV顆粒和編碼視紫紅質的第二rAAV顆粒係連續投予該哺乳動物。

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