RS59445B1 - Derivat 6,7,8,9-tetrahidro-3h-pirazolo[4,3-f]izohinolina koristan u tretmanu raka - Google Patents

Description

Opis

[0001] Specifikacija se odnosi na određena jedinjenja indazola i njihove farmaceutski prihvatljive soli koji selektivno regulišu na dole receptor estrogena i poseduju aktivnost protiv raka. Specifikacija se takođe odnosi na upotrebu navedenih jedinjenja indazola i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli u postupcima tretmana ljudskog ili životinjskog tela, na primer u prevenciji ili tretmanu raka. Specifikacija se takođe odnosi na procese i jedinjenja međuproizvode koji su uključeni u dobijanje navedenih jedinjenja indazola i na farmaceutske sastave koji ih sadrže.

[0002] Estrogen receptor alfa (ERα, ESR1, NR3A) i estrogen receptor beta (ERβ, ESR2, NR3b) su steroidni hormonski receptori koji su članovi velike porodice nuklearnih receptora. Strukturiran nalik svim nuklearnim receptorima, ERα se sastoji od šest funkcionalnih domena (nazvanih A-F) (Dahlman-Wright, i dr., Pharmacol. Rev., 2006, 58:773-781) i klasifikovan je kao faktor transkripcije koji zavisi od liganda jer se nakon povezanosti sa specifičnim ligandom (ženski polni steroidni hormon 17b estradiol (E2)), kompleks vezuje za genomske sekvence, nazvane elementi estrogen receptora (Estrogen Receptor Elements - ERE) i interaguje sa ko-regulatorima za modulaciju transkripcije ciljanih gena. ERα gen je smešten na 6q25.1 i kodira 595AA protein i višestruki izoformi se mogu proizvesti usled alternativnog spajanja i translacionih početnih mesta. Pored domena koji vezuje DNK (domen C) i domena koji vezuje ligand (domen E) receptor sadrži N-terminalni (A/B) domen, zglobni (D) domen koji povezuje C i E domene i C-terminalnu ekstenziju (F domen). Dok su C i E domeni ERα i ERβ prilično očuvani (96% i 55% identičnosti aminokiselina respektivno), očuvanje domena A/B, D i F je slabo (ispod 30% identičnosti aminokiselina). Oba receptora su uključena u regulaciju i razvoj ženskog reproduktivnog trakta, i osim toga igraju ulogu u centralnom nervnom sistemu, kardiovaskularnom sistemu i u koštanom metabolizmu. Genomsko dejstvo ER javlja se u jezgru ćelije kada receptor vezuje ERE direktno (direktna aktivacija ili klasičan put) ili indirektno (indirektna aktivacija ili neklasičan put). U nedostatku liganda, ER se povezuju sa proteinima toplotnog udara, Hsp90 i Hsp70, i pripadajuća mašinerija šaperona stabilizuje domen koji vezuje ligand (LBD) čineći ga dostupnim ligandu. Ligandirani ER se odvaja od proteina toplotnog udara što dovodi do konformacione promene receptora što omogućava dimerizaciju, vezivanje DNK, interakciju sa ko-aktivatorima ili ko-represorima i modulaciju eksprimiranja ciljanog gena. Na neklasičnom putu, AP-1 i Sp-1 su alternativne regulatorne DNK sekvence koje koriste oba izoforma receptora za modulaciju eksprimiranja gena. U ovom primeru, ER ne komunicira direktno sa DNK, nego preko povezanosti sa drugim faktorima transkripcije vezanim za DNK, npr. c-Jun ili c-Fos (Kushner i dr., Pure Applied Chemistry 2003, 75:1757-1769). Precizan mehanizam kojim ER utiče na transkripciju gena nije u potpunosti poznat, ali čini se da posreduju brojni nuklearni faktori koji regrutuju receptor vezan za DNK. Regrutovanje regulatora primarno posreduju dve proteinske površine, AF2 i AF1 koje se nalaze u E-domenu i A/B domenu. AF1 je regulisan faktorima rasta i njegova aktivnost zavisi od ćelijskog i promoterskog okruženja dok AF2 u potpunosti za aktivnost zavisi od vezivanja liganda. Iako dva domena mogu delovati nezavisno, maksimalna aktivnost ER transkripcije postiže se sinergijskim interakcijama preko dva domena (Tzukerman, i dr., Mol. Endocrinology, 1994, 8:21-30). Iako se ER smatraju faktorima transkripcije, oni takođe mogu delovati preko ne-genskih mehanizama, što dokazuju brzi efekti ER u tkivima nakon primene E2 u vremenskom intervalu koji se smatra prebrzim za gensko delovanje. Još uvek nije jasno da li su receptori odgovorni za brzo delovanje estrogena isti nuklearni ER ili različiti steroidni receptori povezani u G-proteinu (Warner, i dr., Steroids 200671:91-95) ali je identifikovan sve veći broj puteva indukovanih od strane E2, npr. MAPK/ERK put i aktivacija sintaze endotelnog azot oksida i PI3K/Akt put. Pored puteva zavisnih od liganda, pokazalo se da ERα ima nezavisnu aktivnost liganda kroz AF-1 koji je povezana sa stimulacijom MAPK signalizacijom faktora rasta, npr. insulinsličnog faktora rasta 1 (IGF-1) i epidermalnog faktora rasta (EGF). Aktivnost AF-1 zavisi od fosforilacije Ser118, i primer unakrsne komunikacije između ER i signalizacije faktora rasta je fosforilacija Ser 118 od strane MAPK kao odgovor na faktore rasta kao što su IGF-1 i EGF (Kato, i dr., Science, 1995, 270:1491-1494).

[0003] Pokazalo se da se veliki broj strukturno različitih jedinjenja vezuje za ER. Neka jedinjenja kao što je endogeni ligand E2, deluju kao agonisti receptora, dok druga konkurentno inhibiraju vezivanje E2 i deluju kao antagonisti receptora. Ova jedinjenja se mogu podeliti u 2 klase u zavisnosti od svojih funkcionalnih efekata. Selektivni modulatori receptora estrogena (SERM), kao što je tamoksifen, imaju mogućnost da deluju i kao agonisti receptora i kao antagonisti, u zavisnosti od ćelijskog i promoterskog konteksta, kao i od ciljanog ER izoforma. Na primer, tamoksifen deluje kao antagonist u dojci, ali deluje kao delimični agonist u kostima, kardiovaskularnom sistemu i materici. Čini se da svi SERM deluju kao antagonisti AF2 i dobijaju svoje delimične karakteristike agonista kroz AF1. Druga grupa, čiji je primer fulvestrant, klasifikovana je kao potpuni antagonisti i sposobna je da blokira aktivnost estrogena potpunom inhibicijom AF1 i AF2 domena kroz indukciju jedinstvene promene konformacije u domenu vezivanja liganda (LBD) na vezivanje jedinjenja što rezultuje u potpunom prekidu interakcije između heliksa 12 i ostatka LBD, blokirajući regrutaciju ko-faktora (Wakeling, i dr., Cancer Res., 1991, 51:3867-3873; Pike, i dr., Structure, 2001, 9:145-153).

[0004] Intracelularni nivoi ERα su regulisani na dole u prisustvu E2 kroz ubikvitin/proteozom (Ub/26S) put. Polibikvitinilacija ligandiranog ERα katalizuje se od strane najmanje tri enzima; ubikvitin aktiviran ubikvitin-aktivirajućim enzimom E1 se konjuguje sa E2 sa ostacima lizina preko izopeptidne veze pomoću E3 ubikvitin ligaze i poliubikvitinirana ERα se zatim usmerava u proteozom za razgradnju. Iako su ER-zavisna regulacija transkripcije i proteozomska degradacija ER povezani (Lonard, i dr., Mol. Cell, 2000 5:939-948), transkripcija sama po sebi nije potrebna za razgradnju ERα i sastavljanje kompleksa za inicijaciju transkripcije je dovoljno za ciljanje ERα za nuklearnu proteozomalnu degradaciju. Veruje se da je ovaj proces razgradnje izazvan sa E2 neophodan zbog svoje sposobnosti brzog aktiviranja transkripcije kao odgovora na zahteve za ćelijsku proliferaciju, diferencijaciju i metabolizam (Stenoien, i dr., Mol. Cell Biol., 2001, 21:4404-4412). Fulvestrant je takođe klasifikovan kao selektivni regulator na dole estrogenskih receptora (SERD), podskup antagonista koji takođe mogu indukovati brzu regulaciju na dole Erα pomoću 26S proteozomalnog puta. Suprotno tome, SERM kao što je tamoksifen može povećati nivo ERα iako je efekat na transkripciju sličan onome koji se pogledati kod SERD.

[0005] Otprilike 70% rakova dojke eksprimira ER i/ili progesteronske receptore što implicira hormonsku zavisnost ovih tumorskih ćelija za rast. Smatra se da i drugi rakovi, poput raka jajnika i endometrijuma, zavise od signalizacije ERα za rast. Terapije za takve pacijente mogu inhibirati ER signalizaciju bilo antagoniziranjem vezivanja liganda na ER, npr. tamoksifen koji se koristi za tretman ranog i uznapredovalog ER pozitivnog raka dojke i pre i posle menopauze; antagonizacijom i regulacijom na dole ERα, npr. fulvestrant koji se koristi za tretman raka dojke kod žena kod kojih je napredovao uprkos terapiji inhibitorima tamoksifena ili aromataze; ili blokiranjem sinteze estrogena, npr. inhibitori aromataze koji se koriste za tretman ranog i uznapredovalog ER pozitivnog raka dojke. Iako su ove terapije imale izuzetno pozitivan uticaj na tretmane raka dojke, značajan broj pacijenata čiji tumori ispoljavaju ER pokazuje de novo rezistenciju na postojeće ER terapije ili tokom vremena razvijaju otpornost na te terapije. Nekoliko različitih mehanizama je opisano da objasne rezistenciju na prvu terapiju tamoksifenom, koja uglavnom uključuje prelazak sa tamoksifena koji deluje kao antagonist na agonista, bilo kroz niži afinitet određenih ko-faktora koji se vezuju za tamoksifen-Erα kompleks, jer je pomaknut prekomernim eksprimiranjem ovih kofaktora ili formiranjem sekundarnih mesta koja olakšavaju interakciju tamoksifen-ERα kompleksa sa ko-faktorima koji se obično ne vezuju za kompleks. Otpor bi, prema tome, mogao nastati kao rezultat porasta ćelija koje eksprimiraju specifične ko-faktore koji pokreću tamoksifen-Erα aktivnost. Takođe postoji mogućnost da drugi signalni putevi faktora rasta direktno aktiviraju ER receptor ili ko-aktivatore kako bi pokrenuli ćelijsku proliferaciju nezavisno od signalizacije liganda.

[0006] U novije vreme, mutacije u ESR1 identifikovane su kao mogući mehanizam rezistencije u uzorcima tumora dobijenih od metastatskim ER-pozitivnih pacijenata i modelima ksenografta (PDX) dobijenih od pacijenta, na frekvencijama koje variraju od 17-25%. Ove mutacije su pretežno, ali ne isključivo, u domenu koji vezuje ligande i vode do mutiranih funkcionalnih proteina; primeri promena aminokiselina uključuju Ser463Pro, Val543Glu, Leu536Arg, Tyr537Ser, Tyr537Asn i Asp538Gly, i promene u aminokiselinama 537 i 538 čine većinu trenutno opisanih promena. Ove mutacije nisu prethodno detektovane u genomima iz primarnih uzoraka dojke koji su okarakterisani u Cancer Genome Atlas bazi podataka. Od 390 primarnih uzoraka raka dojke pozitivnih na eksprimiranje ER, nije detektovana nijedna mutacija u ESR1 (Cancer Genome Atlas Network, 2012 Nature 490: 61-70). Smatra se da su mutacije domena koji vezuju ligand razvijene kao otpornost na endokrine terapije inhibitora aromataze, pošto ovi mutirani receptori pokazuju baznu transkripcijsku aktivnost u odsustvu estradiola. Kristalna struktura ER, mutirana na aminokiselinama 537 i 538, pokazala je da oba mutanata pogoduju agonističkoj konformaciji ER pomeranjem položaja heliksa 12 kako bi se omogućilo regrutovanje ko-aktivatora i na taj način oponašao aktivirani agonist divljeg tipa ER. Objavljeni podaci su pokazali da se endokrine terapije, kao što su tamoksifen i fulvestrant, još uvek mogu vezati za mutantni ER i do određene mere inhibiraju transkripcijsku aktivaciju, i da je fulvestrant u stanju da razgradi Try537Ser, ali da će biti potrebne veće doze za potpunu inhibiciju receptora (Toy i dr., Nat. Genetics 2013, 45: 1439-1445; Robinson i dr., Nat. Genetics 2013, 45: 144601451; Li, S. i dr. Cell Rep.4, 1116-1130 (2013). Stoga je izvodljivo da će neka jedinjenja Formule (I) ili njihove farmaceutski prihvatljive soli (kao što je opisano u daljem tekstu) biti sposobna da regulišu i antagonizuju mutantni ER, mada u ovoj fazi nije poznato da li su mutacije ESR1 povezane sa izmenjenim kliničkim ishodom.

[0007] WO 2016/097072 obelodanjuje tetrahidro-pirido[3,4-b]indol-1-il jedinjenja korisna kao agensi za ciljanje ERα.

[0008] Bez obzira na mehanizam rezistencije ili na kombinaciju mehanizama, mnogi se još uvek oslanjaju na ER-zavisne aktivnosti, i uklanjanje receptora preko SERD mehanizma nudi najbolji način uklanjanja ERα receptora iz ćelije. Fulvestrant je trenutno jedini SERD odobren za kliničku upotrebu, ali uprkos svojim mehaničkim svojstvima, farmakološka svojstva leka su ograničila njegovu efikasnost zbog trenutnog ograničenja mesečne doze od 500 mg što rezultuje sa manje od 50% obrta receptora u uzorcima pacijenta u poređenju sa potpunom redukcijom receptora u in vitro eksperimentima ćelijske linije dojke (Wardell, i dr., Biochem. Pharm., 2011, 82:122-130). Otuda postoji potreba za novim agensima za usmeravanje ER koji imaju tražena farmaceutska svojstva i SERD mehanizam kako bi se omogućila veća korist u ranim, metastatskim i stečenim postavkama rezistencije.

[0009] Otkriveno je da jedinjenja iz ove specifikacije poseduju potentnu anti-tumorsku aktivnost, i stoga su korisna u inhibiranju nekontrolisane ćelijske proliferacije koja proizilazi iz maligne bolesti. Jedinjenja iz ove specifikacije primenjuju anti-tumorski efekat, delujući minimalno, kao SERD. Na primer, jedinjenja iz ove specifikacije mogu da pokazuju antitumorsku aktivnost kroz sposobnost da regulišu receptor estrogena u velikom broju različitih ćelijskih linija raka dojke, na primer protiv MCF-7, CAMA-1, BT474 i/ili MDA-MB-134 ćelijske linije raka dojke. Može se očekivati da su takva jedinjenja pogodnija kao terapeutski agensi, posebno za tretman raka.

[0010] Jedinjenja ove specifikacije mogu takođe da pokazuju povoljna fizička svojstva (na primer, nižu lipofilnost, veću rastvorljivost u vodi, veću propusnost, niže vezivanje proteina u plazmi i/ili veću hemijsku stabilnost) i/ili povoljne profile toksičnosti (na primer, smanjena aktivnost na hERG) i/ili povoljnim metaboličkim ili farmakokinetičkim profilima, u poređenju sa drugim poznatim SERD. Ovakva jedinjenja mogu biti posebno pogodna kao terapeutski agensi, posebno za tretman raka.

[0011] Ovde su opisana jedinjenja Formule (I):

gde:

A je CR<2>ili N;

G je CR<3>ili N;

D je CR<4>ili N;

E je CR<5>ili N;

Q je O, NH ili NMe;

R<1>je CH2F, CHF2ili CF3;

R<2>je H, F, Cl, Me, CN, OMe ili OEt;

R<3>je H ili F;

R<4>je H, F, CN ili OMe;

R<5>je H ili F;

R<6>je H, Me, CH2F, CHF2ili CF3;

R<7>je H ili Me;

R<8>je C1-3alkil, CH2F, CHF2, CF3ili C3-4cikloalkil;

R<9>je Me, F ili CH2F;

R<10>je Me, F, CH2F, CHF2, CF3, CH2OMe ili CH2OH;

R<11>je H ili F; ili

R<10>i R<11>uzeti zajedno za atomom ugljenika za koji su vezani formiraju ciklopropil prsten ili oksetan prsten;

R<12>je nezavisno izabran od F ili Me;

R<13>je H ili F; i

a je 0, 1 ili 2;

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0012] Prema jednom aspektu specifikacije pruženo je jedinjenje Formule (I) koje je N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0013] Kako bi se izbegle nedoumice, u svim otelotvorenjima i aspektima specifikacije koji se odnose na jedinjenje Formule (I) ovde, jedinjenje Formule (I) je N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0014] Ova specifikacija takođe opisuje farmaceutske sastave koje sadrže jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0015] Ova specifikacija takođe opisuje jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu kao lek.

[0016] Ova specifikacija takođe opisuje jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u tretmanu raka.

[0017] Ova specifikacija takođe opisuje kombinacije jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, sa drugim agensom protiv tumora, za upotrebu u tretmanu raka.

[0018] U jednom otelotvorenju je pruženo jedinjenje Formule (I) koje je N-(1-(3fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0019] Jedinjenje Formule (I) ima dva hiralna centra i biće prepoznato da jedinjenje Formule (I) može biti pripremljeno, izolovano i/ili snabdeveno sa ili bez prisustva, pored toga, jednog ili više mogućih drugih enantiomernih i/ili dijastereomernih izomera jedinjenja Formule (I) u bilo kojim relativnim proporcijama. Priprema enantio-obogaćenih/enantio-čistih i/ili dijastereo-obogaćenih/dijastereo-čistih jedinjenja može se izvesti standardnim tehnikama organske hemije koje su dobro poznate u struci, na primer sintezom iz enantio-obogaćenih ili enantio-čistih polaznih materijala, upotrebom odgovarajućeg enantio-obogaćenog ili enantiočistog katalizatora tokom sinteze i/ili razdvajanjem racemske ili delimično obogaćene smeše stereoizomera, na primer hiralnom hromatografijom.

[0020] Za upotrebu u farmaceutskom kontekstu može biti poželjno pružiti jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, bez prisustva velikih količina drugih stereoizomernih oblika.

[0021] Prema tome, u jednom otelotvorenju pružen je sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, opciono zajedno sa jednim ili više drugih stereoizomernih oblika jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, gde su jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prisutni u smeši sa dijastereomernim viškom (%de) od ≥ 90%.

[0022] U narednom otelotvorenju, %de u gore navedenom sastavu je ≥ 95%.

[0023] U narednom otelotvorenju, %de u gore navedenom sastavu je ≥ 98%.

[0024] U narednom otelotvorenju, %de u gore navedenom sastavu je ≥ 99%.

[0025] U narednom otelotvorenju pružen je sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, opciono zajedno sa jednim ili više drugih stereoizomernih oblika jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, gde su jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prisutni u sastavu sa enantiomernim viškom (%ee) ≥ 90%.

[0026] U narednom otelotvorenju, %ee u gore navedenom sastavu je ≥ 95%.

[0027] U narednom otelotvorenju, %ee u gore navedenom sastavu je ≥ 98%.

[0028] U narednom otelotvorenju, %ee u gore navedenom sastavu je ≥ 99%.

[0029] U narednom otelotvorenju pružen je sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, opciono zajedno sa jednim ili više drugih stereoizomernih oblika jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, gde su jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prisutni u sastavu sa enantiomernim viškom (%ee) od ≥ 90% i dijastereomernim viškom (%de) od ≥ 90%.

[0030] U narednim otelotvorenjima gore navedenog sastava, %ee i %de mogu uzeti bilo koju kombinaciju vrednosti kako je navedeno u nastavku:

• %ee je ≤5%, i %de je ≥ 80%.

• %ee je ≤5%, i %de je ≥ 90%.

• %ee je ≤5%, i %de je ≥ 95%.

• %ee je ≤5%, i %de je ≥ 98%.

• %ee je ≥ 95%, i %de je ≥ 95%.

• %ee je ≥ 98%, i %de je ≥ 98%.

• %ee je ≥ 99%, i %de je ≥ 99%.

[0031] U narednom otelotvorenju pružen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0032] U jednom otelotvorenju pružen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, koji opciono dalje sadrži jedan ili više drugih stereoizomernih oblika jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, gde su jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prisutni u smeši sa enantiomernim viškom (%ee) od ≥

[0033] U narednom otelotvorenju, %ee u gore navedenom sastavu je ≥ 95%.

[0034] U narednom otelotvorenju, %ee u gore navedenom sastavu je ≥ 98%.

[0035] U narednom otelotvorenju, %ee u gore navedenom sastavu je ≥ 99%.

[0036] U jednom otelotvorenju pružen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, koji opciono dalje sadrži jedan ili više drugih stereoizomernih oblika jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, gde su jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prisutni u smeši sa dijastereomernim viškom (%de) od ≥ 90%.

[0037] U narednom otelotvorenju, %de u gore navedenom sastavu je ≥ 95%.

[0038] U narednom otelotvorenju, %de u gore navedenom sastavu je ≥ 98%.

[0039] U narednom otelotvorenju, %de u gore navedenom sastavu je ≥ 99%.

[0040] U jednom otelotvorenju pružen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, koji opciono dalje sadrži jedan ili više drugih stereoizomernih oblika jedinjenja Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde je jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prisutno u smeši sa enantiomernim viškom (%ee) od ≥ 90% i dijastereomernim viškom (%de) od ≥ 90 %.

[0041] U narednim otelotvorenjima gore navedenog farmaceutskog sastava, %ee i %de mogu uzeti bilo koju kombinaciju vrednosti kao što je navedeno u nastavku:

• %ee je ≥ 95%, i %de je ≥ 95%.

• %ee je ≥ 98%, i %de je ≥ 98%.

• %ee je ≥ 99%, i %de je ≥ 99%.

[0042] Jedinjenje Formule (I) i njegove farmaceutski prihvatljive soli mogu se pripremiti, koristiti ili isporučiti u amorfnom obliku, kristalnom obliku ili polukristalnom obliku, i jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so mogu biti formirani u više od jednog kristalnog/polimorfnog oblika, uključujući hidrirane (npr. hemihidrat, monohidrat, dihidrat, trihidrat ili drugu stehiometriju hidrata) i/ili solvatirane oblike. Treba razumeti da ova specifikacija obuhvata bilo koje i sve takve čvrste oblike jedinjenja Formule (I) i njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0043] U narednim otelotvorenjima pruženo je jedinjenje Formule (I), koje se može dobiti postupcima opisanim u odeljku „Primeri“ u daljem tekstu.

[0044] Predmetna specifikacija je namenjena da obuhvati sve izotope atoma koji se javljaju u ovim jedinjenjima. Pod izotopima se podrazumeva da uključuju one atome koji imaju isti atomski broj, ali različit masni broj. Na primer, izotopi vodonika uključuju tritijum i deuterijum. Izotopi ugljenika uključuju<13>C i<14>C. Izotopi azota uključuju<15>N. Ovde je opisano jedinjenje Formule (I) gde je R<6>deuterijum.

[0045] Pogodna farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja Formule (I) je, na primer, kisela adiciona so. Pogodna farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja Formule (I) može biti, na primer, kisela adiciona so jedinjenja Formule (I), na primer kisela adiciona so sa neorganskom ili organskom kiselinom, kao što je sirćetna kiselina, adipinska kiselina, benzen sulfonska kiselina, benzojeva kiselina, cimetna kiselina, limunska kiselina, D, L-mlečna kiselina, etan disulfonska kiselina, etan sulfonska kiselina, fumarna kiselina, hlorovodonična kiselina, L-vinska kiselina, maleinska kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, metan sulfonska kiselina, napadisilna kiselina, fosforna kiselina, saharin, jantarna kiselina, sumporna kiselina, p-toluensulfonska kiselina, toluen sulfonska kiselina ili trifluorosirćetna kiselina.

[0046] Naredna pogodna farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja Formule (I) je, na primer, so koja se formira u ljudskom ili životinjskom telu nakon primene jedinjenja Formule (I) navedenom ljudskom ili životinjskom telu.

[0047] Jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so mogu biti pripremljeni kao čvrsti oblik ko-kristala. Treba razumeti da farmaceutski prihvatljiv ko-kristal jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, formira aspekt ove specifikacije.

[0048] Specifični čvrsti oblici opisani ovde primenjuju obrasce rendgenske difrakcije praha koji su uglavnom isti kao obrasci rendgenske difrakcije praha prikazani na slikama i imaju različite vrednosti 2-teta kao što su prikazane u ovde uključenim tabelama. Razumeće se da 2-teta vrednosti rendgenske difrakcije praha mogu malo da se razlikuju od jedne mašine do druge ili od jednog uzorka do drugog, tako da navedene vrednosti ne treba tumačiti kao apsolutne.

[0049] Poznato je da se može dobiti obrazac rendgenske difrakcije praha koja ima jednu ili više grešaka merenja u zavisnosti od uslova merenja (poput opreme ili mašine koja se koristi). Konkretno, poznato je da intenziteti u obrascu rendgenske difrakcije praha mogu da variraju u zavisnosti od uslova merenja. Stoga treba shvatiti da čvrsti oblici ove specifikacije nisu ograničeni na kristale koji pružaju obrasce rendgenske difrakcije praha koji su identični obrascu rendgenske difrakcije praha prikazanom na slikama, i bilo koji kristali koji primenjuju obrasce rendgenske difrakcije praha koji su značajno isti kao oni prikazani na Slikama su obuhvaćeni ovom specifikacijom. Osoba koja je vešta u oblasti rendgenske difrakcije praha je u stanju da proceni suštinski identičnost obrazaca rendgenske difrakcije praha.

[0050] Stručnjaci u oblasti rendgenske difrakcije praha shvatiće da na relativni intenzitet vrhova može uticati, na primer, zrno veličine veće od 30µm i ne unitarni odnosi, koji mogu uticati na analizu uzoraka. Iskusna osoba će takođe shvatiti da na položaj refleksije može uticati tačna visina na kojoj uzorak sedi u difraktometru i nulta kalibracija difraktometra. Površinska ravnina uzorka takođe može imati mali efekat. Stoga predstavljene podatke difrakcionog obrasca ne treba uzimati kao apsolutne vrednosti. (Jenkins, R & Snyder, R.L.' Introduction to X-Ray Powder Diffractometry' John Wiley & Sons 1996; Bunn, C.W. (1948), Chemical Crystallography, Clarendon Press, London; Klug, H. P. & Alexander, L. E. (1974), X-Ray Diffraction Procedures).

[0051] Generalno, greška merenja difrakcionog ugla u rendgenskom difraktogramu praha je otprilike plus ili minus 0,2° 2-teta, i takav stepen greške merenja treba uzeti u obzir pri razmatranju obrasca rendgenske difrakcije praha na Slikama i pri čitanju podataka sadržanih u ovde uključenim Tabelama. Dalje, treba shvatiti da intenziteti mogu fluktuirati u zavisnosti od eksperimentalnih uslova i pripreme uzorka (poželjna orijentacija).

[0052] U ovoj specifikaciji za oblik jedinjenja N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina (u daljem tekstu: Jedinjenje X, pogledati takođe Primer 17 u nastavku) inicijalno je utvrđeno da je amorfna čvrsta supstanca. Korisni kristalni polimorfni oblici jedinjenja su zatim proizvedeni korišćenjem uslova opisanih u eksperimentalnom odeljku.

[0053] Ovde je opisan polimorfni Oblik A Jedinjenja X. Ovaj polimorfni oblik je karakterističan po tome što pruža najmanje jednu od sledećih 2θ vrednosti merenih CuKa zračenjem: 15,5, 18,6 i 24,6°.

[0054] Polimorfni Oblik A Jedinjenja X je karakterističan po tome što pruža obrazac rendgenske difrakcije praha, u osnovi kao što je prikazano na Slici 1.

[0055] Deset vrhova rendgenske difrakcije praha za ovaj polimorfni oblik [ugao 2-teta (2θ), intenzitet (%)] su: 21,1 (100%), 20,8 (54,3%), 14,6 (41,9%), 18,6 (41,6%), 12,3 (38,9%), 15,5 (34,1%), 24,6 (31,3%), 15,8 (30,6%), 13,4 (23,2%) i 19,0° (21,7%).

[0056] Ovde je opisan polimorfni Oblik A Jedinjenja X, koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha sa bar jednim specifičnim vrhom od oko 2-teta = 15,5°.

[0057] Ovde je opisan polimorfni Oblik A Jedinjenja X, koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha sa bar jednim specifičnim vrhom od oko 2-teta = 18,6°.

[0058] Ovde je opisan polimorfni Oblik A Jedinjenja X, koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha sa bar jednim specifičnim vrhom od oko 2-teta = 24,6°.

[0059] Ovde je opisan polimorfni Oblik A Jedinjenja X, koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha sa bar dva specifična vrha od oko 2-teta = 15,5° i 18,6°.

[0060] Ovde je opisan polimorfni Oblik A Jedinjenja X, koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha sa specifičnim vrhovima od oko 2-teta = 21,1, 20,8, 14,6, 18,6, 12,3, 15,5, 24,6, 15,8, 13,4 i 19,0°.

[0061] Ovde je opisan polimorfni Oblik A Jedinjenja X koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha u osnovi isto kao obrazac rendgenske difrakcije praha prikazan na Slici 1.

[0062] Ovde je opisan pruženi polimorfni Oblik A Jedinjenja X, koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha sa bar jednim specifičnim vrhom na 2-teta = 15,5° plus ili minus 0,2° 2-teta.

[0063] Ovde je opisan polimorfni Oblik A Jedinjenja X, koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha sa bar jednim specifičnim vrhom na 2-teta = 18,6° plus ili minus 0,2° 2-teta.

[0064] Ovde je opisan polimorfni Oblik A Jedinjenja X, koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha sa bar dva specifična vrha at 2-teta = 15,5° i 18,6° gde navedene vrednosti mogu biti plus ili minus 0,2° 2-teta.

[0065] Ovde je opisan polimorfni Oblik A Jedinjenja X, koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha sa specifičnim vrhovima at 2-teta = 21,1, 20,8, 14,6, 18,6, 12,3, 15,5, 24,6, 15,8, 13,4 i 19,0° gde navedene vrednosti mogu biti plus ili minus 0,2° 2-teta.

[0066] Ovde je opisan polimorfni Oblik E Jedinjenja X. Ovaj polimorfni oblik je karakterističan po tome što pruža najmanje jednu od sledećih 2θ vrednosti merenih CuKa zračenjem: 14,8, 16,2 i 17,9°.

[0067] Polimorfni Oblik E Jedinjenja X je karakterističan po tome što pruža obrazac rendgenske difrakcije praha, u osnovi kao što je prikazano na Slici 8.

[0068] Deset vrhova rendgenske difrakcije praha za ovaj polimorfni oblik [ugao 2-teta (2θ), intenzitet (%)] su: 17,9 (100%), 14,8 (67,1%), 20,9 (60,1%), 23,1 (55,4%), 16,2 (49,3%), 20,0 (35,6%), 18,2 (32,9%), 12,3 (30,4%), 22,2 (19,0%) i 13,9° (18,9%).

[0069] Ovde je opisan polimorfni Oblik E Jedinjenja X, koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha sa bar jednim specifičnim vrhom od oko 2-teta = 17,9°.

[0070] Ovde je opisan polimorfni Oblik E Jedinjenja X, koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha sa bar jednim specifičnim vrhom od oko 2-teta = 14,8°.

[0071] Ovde je opisan polimorfni Oblik E Jedinjenja X, koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha sa bar jednim specifičnim vrhom od oko 2-teta = 17,9°.

[0072] Ovde je opisan polimorfni Oblik E Jedinjenja X, koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha sa bar dva specifična vrha od oko 2-teta = 17,9° i 14,8°.

[0073] Ovde je opisan polimorfni Oblik E Jedinjenja X, koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha sa specifičnim vrhovima od oko 2-teta = 17,9, 14,8, 20,9, 23,1, 16,2, 20,0, 18,2, 12,3, 22,2 i 13,9°.

[0074] Ovde je opisan polimorfni Oblik E Jedinjenja X koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha u osnovi isto kao obrazac rendgenske difrakcije praha prikazan na Slici 8.

[0075] Ovde je opisan polimorfni Oblik E Jedinjenja X, koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha sa bar jednim specifičnim vrhom na 2-teta = 17,9° plus ili minus 0,2° 2-teta.

[0076] Ovde je opisan polimorfni Oblik E Jedinjenja X, koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha sa bar jednim specifičnim vrhom na 2-teta = 14,8° plus ili minus 0,2° 2-teta.

[0077] Ovde je opisan polimorfni Oblik E Jedinjenja X, koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha sa bar dva specifična vrha at 2-teta = 17,9° i 14,8° gde navedene vrednosti mogu biti plus ili minus 0,2° 2-teta.

[0078] Ovde je opisan polimorfni Oblik E Jedinjenja X, koji ima obrazac rendgenske difrakcije praha sa specifičnim vrhovima at 2-teta = 17,9, 14,8, 20,9, 23,1, 16,2, 20,0, 18,2, 12,3, 22,2 i 13,9° gde navedene vrednosti mogu biti plus ili minus 0,2° 2-teta.

[0079] In vivo efekti jedinjenja Formule (I) mogu se delom ispoljiti od strane jednog ili više metabolita koji se formiraju u ljudskom ili životinjskom telu nakon primene jedinjenja Formule (I). Kao što je prethodno navedeno, in vivo efekti jedinjenja Formule (I) mogu se takođe pokazati putem metabolizma jedinjenja prekursora (pro-leka).

[0080] Ovde je opisan postupak za dobijanje jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. Pogodan postupak ilustruju sledeće reprezentativne varijante procesa u kojima, ako nije drugačije navedeno, A, D, E, G, Q i R<1>to R<12>imaju bilo koje od ranije definisanih značenja. Potrebni početni materijali mogu se dobiti standardnim postupcima organske hemije. Priprema takvih polaznih materijala je opisana zajedno sa narednim reprezentativnim varijantama procesa i u pratećim primerima. Alternativno, potrebni polazni materijali mogu se dobiti postupcima analognim onima koji su ilustrovani i koji su unutar uobičajene veštine organskog hemičara.

[0081] Jedinjenja Formule (I) gde R<13>je H mogu se napraviti prateći korake, na primer: a) eterifikacija pogodnog aril ili heteroaril jedinjenja Formule (II), gde je L na primer halogena (kao što je jod), ili trifluorometansulfonil (triflat) grupa, ili boronska kiselina ili estar, sa alkoholom Formule (III) korišćenjem pogodnog metalnog katalizatora (na primer RockPhos pred-katalizator treće generacije) u pogodnom rastvaraču (kao što su toluen ili DME) u prisustvu pogodne baze (kao što je cezijum karbonat) i pogodne temperature (kao što je 90-120°C); uklanjanje zaštitne grupe (PG) u Formuli (II), kao što je THP, korišćenjem kiselih uslova (kao što je nevodeni HCl u 1,4-dioksanu) na pogodnoj temperaturi (kao što je 10-30°C).

b) aminacija pogodnog arilnog ili heteroarilnog jedinjenja Formule (II), gde je L na primer halogena (kao što je jod), ili trifluorometilsulfoniloksi (triflatna) grupa, sa aminom Formule (IV) korišćenjem pogodnog metalnog katalizatora (na primer BrettPhos ili RuPhos, i Pd2(dba)3) u pogodnom rastvaraču (na primer 1,4-dioksanu) u prisustvu pogodne baze (na primer cezijum karbonata, natrijum-terc-butoksida ili LiHMDS) na pogodnoj temperaturi (kao što je 90-130°C); uklanjanje zaštitne grupe (PG), kao što je THP, korišćenjem kiselih uslova (kao što je nevodeni HCl u 1,4-dioksanu) na pogodnoj temperaturi (kao što je 10-30°C).

c) alkilacija pogodnog fenola ili hidroksil heteroaril jedinjenja Formule (V) alkoholom Formule (III) putem Mitsunobu reakcije upotrebom odgovarajućih reagensa (kao što su trifenilfosfin i diizopropil (E)-dijazen-1,2-dikarboksilat) u pogodnom rastvaraču (kao što je THF); uklanjanje zaštitne grupe (PG), kao što je THP, u formuli (VII), korišćenjem kiselih uslova (kao što je nevodeni HCl u 1,4-dioksanu) na pogodnoj temperaturi (kao što je 10-30°C).

d) alkilacija pogodnog anilin ili heteroaril amina ili fenola ili hidroksil heteroaril jedinjenja Formule (VI) sa jedinjenjem Formule (VII) gde je LG odlazeća grupa (kao što je halogenid ili mezilat), koristeći blage baze (na primer DIPEA) u pogodnom rastvaraču (kao što je DMF ili MeCN); uklanjanje zaštitne grupe (PG), kao što je THP, korišćenjem kiselih uslova (kao što je nevodeni HCl u 1,4-dioksanu) na pogodnoj temperaturi (kao što je 10-30°C).

e) Alkilacija amina Formule (VIII) sa pogodnom alkilirajućom grupom Formule (IX) (gde LG može biti halogenid, kao bromid, jodid ili hlorid, ili može biti neka druga pogodna odlazeća grupa, poput mesilata) u pogodnom rastvaraču (kao što je DMF) u prisustvu pogodne baze (poput DIPEA) na pogodnoj temperaturi (kao što je 10-30°C).

[0082] Jedinjenja Formule (II) gde R<6>nije jednak vodoniku mogu se dobiti, na primer, iz jedinjenja Formule (X) oksidacijom pogodnim reagensom (na primer bis (trifluoracetoksi)-jodobenzen) i tretiranjem organometalnim reagensom (na primer metil magnezijum bromidom kada je R<6>metil) u pogodnom rastvaraču (na primer THF) na niskoj temperaturi (tipično -80 do -60°C).

[0083] Jedinjenja Formule (X) mogu da se pripreme, na primer, reakcijom anilina Formule (XI) sa pogodnim reagensima da utiču na izgradnju indazola kao što je anorganski nitrit (kao što je natrijum nitrit) u organskoj kiselini (kao što je propionska kiselina) na niskoj temperaturi (tipično -20 do 0°C) ili alternativno kiseli anhidrid (poput sirćetnog anhidrida) u prisustvu pogodne baze (poput kalijum acetata), zajedno sa organskim nitritom (kao što je izopentil nitrit), opciono u prisustvo krunskog etra (kao što je 18-kruna-6) u pogodnom rastvaraču (kao što je hloroform) na pogodnoj temperaturi (kao što je 70°C).

[0084] Jedinjenja Formule (XI) mogu da se dobiju reakcijom jedinjenja Formule (XII) sa jedinjenjem Formule (XIII) pod uslovima poznatim u struci kao pogodnim za Pictet-Spengler-ove reakcije, kao što je u prisustvu kiseline (kao što je sirćetna kiselina) i u pogodnom rastvaraču (na primer toluenu ili vodi) i pogodnoj temperaturi (kao što je 60-100°C).

[0085] Jedinjenja Formule (XII) mogu se pripremiti interkonsverzijama funkcionalnih grupa poznatih u struci, na primer, aminacijama halogenida Formule (XIV) iz aril halogenida (kao što je bromid) uz upotrebu zaštićenog amina (poput difenilmetanimina) u prisustvu pogodnog katalizatora i liganda (kao što je bis(dibenzilidenaceton)paladijum(0) i rac-2,2'-bis (difenilfosfino)-1,1'-binaftil) u prisustvu pogodne baze (kao što je natrijum terc-butoksid) u pogodnom rastvaraču (kao što je toluen), na pogodnoj temperaturi (kao što je 80-100°C).

[0086] Jedinjenja Formule (XIV) mogu da se pripreme:

a) reakcijom jedinjenja Formule (XV) sa aldehidom Formule (XVI), u pogodnom rastvaraču (na primer THF) u prisustvu pogodnog redukcionog agensa (kao što je natrijum triacetoksiborohidrid) i na pogodnoj temperaturi (kao što je kao 20-30°C); b) (i) reakcijom jedinjenja Formule (XV) sa kiselinom Formule (XVII) u standardnim uslovima formiranja amidne veze (na primer, u prisustvu reagensa za spajanje amida (kao što je HATU) i pogodne baze (kao što je kao trietilamin) u pogodnom rastvaraču (kao što je DMF)), nakon čega sledi (ii) redukcija rezultujuće amidne veze korišćenjem odgovarajućeg redukcionog agensa (poput borana) u pogodnom rastvaraču (kao što je THF), na pogodnoj temperaturi (kao što je kao 60-70°C); c) reakcijom jedinjenja Formule (XV) sa jedinjenjem Formule (XVIII), gde je LG pogodna odlazeća grupa (na primer atom halogena (kao što su brom ili hloro) ili triflat), u prisustvu pogodne baze (kao što je diizopropiletilamin) u pogodnom rastvaraču (na primer DCM ili dioksanu) i na pogodnoj temperaturi (kao što je 20-85°C).

[0087] Jedinjenja Formule (XV) mogu se pripremiti većim brojem poznatih postupaka za sintezu hiralnih amina;

a) Otvor prstena sulfamidata Formule (XIX) prema šemi prikazanoj niže:

Korak 1:Alkilacija, npr. n-butillitijum/THF/-78°C do 0°C

Korak 2: Uklanjanje zaštitnih grupa, npr. nevodeni HCl u MeOH/DCM, sobna temperatura.

b) Alkilacija faznim prenosom u prisustvu hiralnog katalizatora (poput (1)S,2S,4S,5R)-2-((R)-(aliloksi)(kinolin-4-il) metil)-1-(antracen-9-ilmetil)-5-vinilkinuklidin-1-ijum bromida) praćena manipulacijom funkcionalnim grupama.

Korak 1:Alkilacija, npr. hiralni katalizator, toluen/KOH, 0°C

Korak 2: Interkonverzija funkcionalnih grupa.

[0088] Jedinjenja Formule (XII) mogu se direktno pripremiti:

a) reakcijom jedinjenja Formule (XX) sa aldehidom Formule (XVI), u pogodnom rastvaraču (na primer THF) u prisustvu pogodnog redukcionog agensi (kao što je natrijum triacetoksiborohidrid) i na pogodnoj temperaturi (kao što je kao 20-30°C); b) (i) reakcijom jedinjenja Formule (XX) sa kiselinom Formule (XVII) pod standardnim uslovima formiranja amidne veze (na primer u prisustvu reagensa za spajanje amida (kao što je HATU) i odgovarajuće baze (kao što je kao trietilamin) u pogodnom rastvaraču (kao što je DMF)), posle čega sledi (ii) redukcija rezultujuće amidne veze korišćenjem odgovarajućeg redukcionog agensi (poput borana) u pogodnom rastvaraču (kao što je THF), na pogodnoj temperaturi (kao što je kao 60-70°C);

c) reakcijom jedinjenja Formule (XX) sa jedinjenjem Formule (XIII), gde je LG pogodna odlazeća grupa (na primer atom halogena (kao što su brom ili hloro) ili triflat), u prisustvu pogodne baze (kao što je diizopropiletilamin) u pogodnom rastvaraču (na primer DCM ili dioksanu) i na pogodnoj temperaturi (kao što je 20-85°C).

[0089] Jedinjenja Formule (XX) mogu se dobiti reakcionom sekvencom počevši od zaštićenog 3-bromo-2-metil-anilina kao što je prikazano u nastavku.

Korak 1:Alkilacija, npr. n-butillitijum/THF/-78°C do sobne temperature.

Korak 2: Uklanjanje amin zaštitnih grupa, npr. nevodeni HCl u MeOH/DCM, sobna temperatura.

Korak 3: Uklanjanje anilinskih zaštitnih grupa, npr. refluksiranje u hidroksilaminu.

[0090] Jedinjenja Formule (V) mogu da se pripreme kroz sekvencu koja uključuje Pictet-Spengler-ovu ciklizaciju jedinjenja Formule (XIII) koje sadrži boronat estara kao što je opisano iznad kako bi se dobilo jedinjenje Formule (XXI). Jedinjenje Formule (XXI) može da se oksiduje u jedinjenje Formule (V) korišćenjem pogodnog oksidansa (poput vodonikperoksida) u prisustvu pogodne baze (poput natrijum-hidroksida) u pogodnom rastvaraču (kao što je THF).

[0091] Jedinjenja Formule (VI, Q je NH) mogu da se pripreme kroz sekvencu koja uključuje Pictet-Spengler-ovu ciklizaciju jedinjenja Formule (XIII) koja sadrži nitro, kako je gore opisano, dajući jedinjenje Formule (XXII). Jedinjenje Formule (XXII) može se redukovati do jedinjenja Formule (VI) korišćenjem pogodnih nitro redukcionih uslova (kao što je hidrogenacija) u prisustvu pogodnog katalizatora (poput platina dioksida) u pogodnom rastvaraču (poput metanola).

[0092] Jedinjenja Formule (VIII), gde Q je O, mogu se dobiti od aril halida Formule (II) i terc-butil 3-hidroksiazetidin-1-karboksilata koristeći odgovarajući metalni katalizator (kao što je RockPhos pred-katalizator treće generacije) u pogodnom rastvaraču (kao što su toluen ili DME) u prisustvu pogodne baze (kao što je cezijum karbonat) na pogodnoj temperaturi (kao što je 90-120°C); Boc zaštitna grupa može biti naknadno uklonjena korišćenjem kiseline (kao što je trifluorosirćetna kiselina) u pogodnom rastvaraču (kao što je DCM). Jedinjenja Formule (VIII) (K je O) mogu se takođe dobiti iz jedinjenja Formule (V) pod uslovima poznatim u struci kao pogodnim za Mitsunobu reakcije koristeći odgovarajuće reagense (kao što su trifenilfosfin i diizopropil (E)-dijazen-1,2-dikarboksilat) sa terc-butil 3-hidroksiazetidin-1-karboksilatom u pogodnom rastvaraču (kao što je THF).

[0093] Jedinjenja Formule (VIII), gde Q je NH, mogu se dobiti od aril halida Formule (II) i terc-butil 3-aminoazetidin-1-karboksilata koristeći odgovarajući metalni katalizator (na primer, RuPhos ili BrettPhos i Pd2(dba)3) u pogodnom rastvaraču (na primer 1,4-dioksanu) u prisustvu pogodne baze (na primer cezijum karbonata, natrijum-terc-butoksida ili LiHMDS) na pogodnoj temperaturi (kao što je 90-130°C); Boc zaštitna grupa može biti naknadno uklonjena korišćenjem kiseline (kao što je trifluorosirćetna kiselina) u pogodnom rastvaraču (kao što je DCM).

[0094] Jedinjenja Formule (III) mogu da se pripreme:

a) Reakcijom alkilacije između 3-hidroksiazetidina i jedinjenja Formule (IX) gde je LG na primer halogen ili druga odlazeća grupa (poput mesil grupe) u prisustvu pogodne baze, kao što je cezijum karbonat, u pogodnom rastvaraču, kao što je kao acetonitril, na pogodnoj temperaturi, kao što je 120°C, i u pogodnoj posudi, kao što je zatvorena cev.

b) Reakcionom reduktivnom aminacijom između 3-hidroksiazetidina i aldehida ili ketona jedinjenja Formule (XXIII) u prisustvu pogodnog reduktivnog reagensa, kao što je natrijum triacetoksiborohidrid, u pogodnom rastvaraču, kao što je DCM, u pogodnoj temperaturi, kao što je 10 -30°C.

[0095] Jedinjenja Formule (IV) mogu da se pripreme:

a) (i) Reakcijom alkilacije između jedinjenja Formule (XXIV), gde je PG zaštitna grupa, na primer Boc, i jedinjenja Formule (IX) gde je LG na primer halogen ili druga odlazeća grupa, poput mesilata, u prisustvu pogodne baze, poput DIPEA, u pogodnom rastvaraču, kao što je 1,4-dioksan, na pogodnoj temperaturi, kao što je 10-30°C. (ii) Uklanjanjem zaštitne grupe pod pogodnim uslovima, kao što su kiseli uslovi za uklanjanje Boc.

b) (i) Reakcijom reduktivne aminacije između jedinjenja Formule (XXIV) i jedinjenja aldehida ili ketona Formule (XXIII) u prisustvu pogodnog reduktivnog reagensa, kao što je natrijum triacetoksiborohidrid, u pogodnom rastvaraču, kao što je DCM, i na pogodnoj temperaturi, kao što je 10-30°C. (ii) Uklanjanjem zaštitne grupe pod pogodnim uslovima, kao što su kiseli uslovi za uklanjanje Boc.

[0096] Treba shvatiti da su moguće i druge permutacije koraka procesa u gore opisanim varijantama procesa.

[0097] Takođe će se primetiti da će u nekim reakcijama koje su navedene ranije biti neophodno ili poželjno zaštititi bilo koje osetljive funkcionalnosti u jedinjenjima. Primeri u kojima je zaštita potrebna ili poželjna i pogodni postupci zaštite su poznati stručnjacima. Konvencionalne zaštitne grupe mogu se koristiti u skladu sa standardnom praksom (za ilustraciju pogledati T. W. Green, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, 1991). Stoga, ako reaktanti uključuju grupe kao što su amino, karboksi ili hidroksi, možda bi bilo poželjno zaštititi grupu u nekim od ovde navedenih reakcija.

[0098] Pogodna zaštitna grupa za amino ili alkilamino grupu je, na primer, acil grupa, na primer alkanoil grupa kao što je acetil, alkoksikarbonil grupa, na primer metoksikarbonil, etoksikarbonil ili t-butoksikarbonilna grupa, arilmetoksikarbonilna grupa, na primer benziloksikarbonilna grupa, ili aroilna grupa, na primer benzoil. Uslovi uklanjanja zaštite za gore navedene zaštitne grupe nužno variraju u zavisnosti od izbora zaštitne grupe. Tako, na primer, acil grupa kao što je alkanoil ili alkoksikarbonil grupa ili aroil grupa može biti uklonjena, na primer, hidrolizom sa pogodnom bazom, kao što je hidroksid alkalnog metala, na primer litijum ili natrijum hidroksid. Alternativno alkoksikarbonilna grupa kao što je tbutoksikarbonilna grupa može biti uklonjena, na primer, tretiranjem pogodnom kiselinom kao što je hlorovodonična, sumporna, mravlja, fosforna ili trifluorosirćetna kiselina, i arilmetoksikarbonilna grupa kao što je benziloksikarbonilna grupa može se ukloniti, na primer, hidrogenacijom preko katalizatora kao što je paladijum na ugljeniku, ili tretmanom Lewis-ovom kiselinom, kao što je borov tris(trifluoroacetat). Pogodna alternativna zaštitna grupa za primarnu amino grupu je, na primer, ftaloil grupa, koja se može ukloniti tretmanom alkilaminom, na primer dimetilaminopropilaminom ili hidrazinom.

[0099] Pogodna zaštitna grupa za hidroksi grupu je, na primer, acil grupa, na primer alkanoil grupa kao što je acetil, aroil grupa, na primer benzoil, arilmetil grupa, na primer benzil, ili trialkil ili diarilalkil silan, tkao što su TBDMS ili TBDPS. Uslovi uklanjanja zaštite za gore navedene zaštitne grupe će nužno varirati u zavisnosti od izbora zaštitne grupe. Tako, na primer, acil grupa kao što je alkanoil ili aroil grupa može biti uklonjena, na primer, hidrolizom sa pogodnom bazom, kao što je hidroksid alkalnog metala, na primer litijum ili natrijum hidroksid. Alternativno, arilmetil grupa kao što je benzil grupa može biti uklonjena, na primer, hidrogenacijom preko katalizatora kao što je paladijum na ugljeniku.

[0100] Pogodna zaštitna grupa za karboksi grupu je, na primer, estarifikaciona grupa, na primer metil ili etil grupa koja se može ukloniti, na primer, hidrolizom sa bazom kao što je natrijum hidroksid, ili na primer t-butil grupa koja se može ukloniti, na primer, tretiranjem sa kiselinom, kao što je trifluorosirćetna kiselina, ili na primer benzil grupa koja se može ukloniti, na primer, hidrogenacijom preko katalizatora, kao što je paladijum na ugljeniku.

[0101] Zaštitne grupe mogu se ukloniti u bilo kom pogodnom stadijumu u sintezi koristeći konvencionalne tehnike dobro poznate u hemijskoj struci.

[0102] Neki međuproizvodi koji su ovde definisani su novi i oni su dati kao dodatne karakteristike specifikacije.

[0103] Ovde je opisano jedinjenje Formule (XXV), ili njegova so:

gde L je bromo, hloro, jodo ili trifluorometansulfonil, na primer L je bromo.

Biološka ispitivanja

[0104] Naredni testovi su korišćeni za merenje efekata jedinjenja ove specifikacije. Za izbegavanje sumnje, jedinjenje Formule (I), N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin, ovde je Primer 17, i dalji primeri su referentni primeri navedeni kako bi pomogli stručnjaku.

ERα test vezivanja

[0105] Sposobnost jedinjenja da se vezuju za izolovani domen vezivanja liganda receptora estrogena alfa (ER alfa - LBD (GST)) procenjena je u testovima nadmetanja korišćenjem LanthaScreen™ Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer (TR-FRET) krajnje tačke detektovanja. Za LanthaScreen TR-FRET krajnju tačku, pogodan fluorofor (Fluormone ES2, ThermoFisher, šifra proizvoda P2645) i rekombinantni ljudski domen vezivanja liganda receptora estrogena alfa, ostaci 307-554 (eksprimirani i prečišćeni interno) korišćeni su za merenje vezivanja jedinjenja. Princip ispitivanja je da se ER alfa-LBD (GST) dodaje fluorescentnom ligandu kako bi se formirao receptor/fluorofor kompleks. Terbijumom obeleženo anti-GST antitelo (šifra proizvoda PV3551) koristi se za indirektno obeležavanje receptora vezivanjem na njegovu GST oznaku, i kompetitivno vezivanje detektuje se sposobnošću test jedinjenja da pomera fluorescentni ligand, što rezultuje gubitkom TR-FRET signala između Tb-anti-GST antitela i tragača. Ispitivanje je izvedeno na sledeći način sa svim dodavanjima reagensa izvršenim korišćenjem mikrofluidne radne stanice Beckman Coulter BioRAPTR FRD:

1. Akustično doziranje 120 nL ispitivanog jedinjenja u crne ploče za ispitivanje niske zapremine sa 384 komorice.

2. Priprema 1x ER alfa -LBD/Tb-antiGST Ab u ES2 skrining puferu i inkubiranje tokom 15 minuta.

3. Raspodela 6 µL 1x AR-LBD/Tb-anti-GST Ab reagensa u svaku komoricu test ploče, nakon čega sledi 6 µL fluorofor reagensa u svaku komoricu ploče za ispitivanje.

4. Pokrivanje ploče za ispitivanje kako bi se zaštitili reagensi od svetlosti i isparavanja i inkubiranje na sobnoj temperaturi tokom 4 sata.

5. Pobuđivanje se na 337 nm i merenje fluorescentnog emisionog signala svake komorice na 490 nm i 520 nm koristeći BMG PheraSTAR.

[0106] Jedinjenja su dozirana direktno iz mikroploče sa izvorom jedinjenja koja sadrži serijski razblaženo jedinjenje (4 komorice koje sadrže 10 mM, 0,1 mM, 1 mM i 10 nM krajnjeg jedinjenja, respektivno) na mikroploči za ispitivanje pomoću Labcyte Echo 550. Echo 550 je tečni agens koji koristi akustičku tehnologiju za izvođenje direktnih prenosa rastvora DMSO jedinjenja sa mikroploče na mikroploču, i sistem se može programirati tako da prenosi više manjih nL zapremina jedinjenja iz različitih komorica izvorne ploče kako bi se dobilo željeno serijsko razblaživanje jedinjenja u testu koji se tada puni u nazad kako bi se normalizovala koncentracija DMSO u opsegu razblaženja.

[0107] Ukupno 120 nL jedinjenja plus DMSO je dodato u svaku komoricu i jedinjenja su testirana u formatu odgovora na koncentracije sa 12 tačaka u konačnom rasponu koncentracije od 10, 2,917, 1,042, 0,2083, 0,1, 0,0292, 0,0104, 0,002083, 0,001, 0,0002917, 0,0001042 i 0,00001 µM, respektivno. TR-FRET podaci odgovora na dozu dobijeni sa svakim jedinjenjem su eksportovani u odgovarajući softverski paket (kao što su Origin ili Genedata) kako bi se izvršila analiza prilagođavanja krive. Kompetetivno vezivanje ER alfa je izraženo kao IC50vrednost. Ovo je utvrđeno izračunavanjem koncentracije jedinjenja koja je bila potrebna kako bi se dobilo 50% smanjenje vezivanja tragača za ER alfa-LBD.

Test MCF-7 ER regulacije na dole

[0108] Sposobnost jedinjenja da regulišu na dole brojke estrogen receptora (ER) procenjena je u imuno-fluorescentnom testu zasnovanom na ćeliji koristeći MCF-7 ljudsku ćelijsku liniju duktalnog raka dojke. MCF-7 ćelije su izvedene direktno iz krio-epruvete (približno 5 × 10<6>ćelija) u medijumu za analizu (fenol crveni slobodan Dulbecc-ov modifikovan Eagle-ov medijum (DMEM); Sigma D5921) koji sadrži 2 mM L-glutamina i 5% (v/v) fetalnog telećeg seruma sa ugljenikom/dekstranom. Ćelije su jednom ubrizgane pomoću sterilne 18G x 1,5 inčne (1,2 × 40 mm) široke igle i gustina ćelija je izmerena korišćenjem Coulter Counter (Beckman). Ćelije su dalje razblažene u medijumu za ispitivanje do gustine 3,75 × 10<4>ćelija po mL i 40 µL po komorici je dodato u providne, crne, ploče sa 384 komorica tretirane kulturom tkiva (Costar, No.3712) koristeći Thermo Scientific Matrix WellMate ili Thermo Multidrop. Posle sejanja ćelija, ploče su inkubirane preko noći na 37°C, 5% CO2(Liconic carousel inkubataor). Podaci testova generisani su korišćenjem Labcyte Echo™ modela 555 složenih reformatora koji je deo automatizovane radne stanice (integrisana Echo 2 radna stanica). Osnovni rastvori jedinjenja (10 mM) ispitivanih jedinjenja korišćeni su za generisanje ploče za doziranje jedinjenja sa 384 komorice (Labcyte P-05525-CV1).40 µL svakog od 10 mM osnovnih rastvora jedinjenja raspodeljeno je u komoricu prvog kvadranta i zatim su 1:100 koraci serijskih razblaženja u DMSO izvršeni korišćenjem Hydra II (MATRIX UK) tečne jedinice kako bise dobilo 40 µL razblaženog jedinjenja u kvadratnim komoricama 2 (0,1 mM), 3 (1 µM) i 4 (0,01 µM), respektivno.40 µL DMSO dodato je u komorice u redu P na izvornoj ploči i dozvoljena je normalizaciju DMSO u čitavom rasponu doza. Za doziranje kontrolnih komorica dodato je 40 µL DMSO u red O1, i 40 µL od 100 µM fulvestranta u DMSO je dodato u red O3 na ploči izvornog jedinjenja.

[0109] Echo koristi akustičku tehnologiju za izvođenje direktnih mikroploča-do-mikroploče prenosa DMSO jedinjenja na test ploče. Sistem se može programirati tako da zapremine prenosa budu niske kao što je 2,5 nL iz više ponavljanja između mikroploča, i na taj način se generiše serijsko razblaživanje jedinjenja na ploči za ispitivanje koja se zatim ponovo puni kako bi se normalizovala koncentracija DMSO kroz opseg razblaživanja. Jedinjenja su raspoređena na ćelijske ploče sa izvornom pločom sa jedinjenjem koja je pripremljena kao iznad, stvarajući duplikat od 12 tačaka od 3 µM do 3 pM sa 3-strukim razblaživanjem i jednim krajnjim 10-strukim razblaživanjem pomoću integrisane radne stanice Echo 2.

Maksimalni kontrolni otvori za signal su dozirani sa DMSO kako bi se dobila konačna koncentracija od 0,3%, i minimalni kontrolni otvori za doziranje su dozirani sa fulvestrantom kako bi se dobila konačna koncentracija od 100 nM u skladu sa tim. Ploče su dalje inkubirane 18-22 sati na 37°C, 5% CO2i zatim su fiksiran dodatkom 20 µL 11,1% (v/v) rastvora formaldehida (u fiziološkom rastvoru sa fosfatom (PBS)) dajući krajnju koncentraciju formaldehida od 3,7% (v/v). Ćelije su fiksirane na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta pre nego što su se dva puta isprane sa 250 µL PBS/Proclin (PBS sa Biocide konzervansom) koristeći BioTek mašinu za pranje ploča, zatim je dodato 40 µL PBS/Proclin u sve komorice i ploče su čuvane na 4°C. Gore opisan postupak fiksiranja izvedena je na integrisanoj Echo 2 radnoj stanici. Imunobojenje je izvršeno pomoću automatizovane radne stanice AutoElisa. PBS/Proclin je aspiriran iz svih komorica i ćelije su prožimane sa 40 µL PBS koji je sadržao 0,5% Tween™ 20 (v/v) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane tri puta u 250 µL PBS/0,05% (v/v) Tween 20 sa Proclin-om (PBST sa Biocide konzervansom), i zatim je dodato 20 µL ERac (SP1) zečjeg monoklonskog antitela (Thermofisher) 1:1000 u PBS/Tween™/3% (w/v) goveđem serumskom albuminu. Ploče su inkubirane preko noći na 4°C (Liconic carousel inkubator), i zatim tri puta isprane sa 250 µL PBS/0,05% (v/v) Tween™ 20 sa Proclin -om(PBST). Ploče su zatim inkubirane sa 20 µL/komorica kozjeg anti-zečjeg IgG AlexaFluor 594 ili kozjeg anti-zečjeg AlexaFluor 488 antitela (Molecular Probes) sa Hoechst-om pri 1:5000 u PBS/Tween™/3% (w/v) goveđeg serumskog albumina u trajanju od 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane tri puta sa 250 µL PBS/0,05% (v/v) Tween™ 20 sa Proclin-om (PBST sa Biocide konzervansom). U svaku komoricu je dodato 20 µL PBS, i ploče su prekrivene crnim zatvaračem i čuvane na 4°C pre nego što su očitane. Ploče su očitane koristeći Cellomics Arrayscan očitavanje 594 nm (vremenska tačka od 24 sata) ili 488 nm (vremenska tačka od 5 sati) fluorescencije za merenje nivoa ERα receptora u svakoj komorici. Srednji ukupni intenzitet je normalizovan za broj ćelije dajući ukupan intenzitet po ćeliji. Podaci su ubačeni u odgovarajući softverski paket (kao što je Origin) za analizu uklapanja krive. Regulacija na dole ERα receptora izražena je kao IC50vrednost i određena je izračunavanjem koncentracije jedinjenja koja je bila potrebna kako bi se smanjilo 50% prosečnog signala maksimalnog ukupnog intenziteta.

[0110] Podaci prikazani u Tabeli A su generisani (podaci u nastavku mogu biti rezultat jednog eksperimenta ili prosek dva ili više eksperimenata):

Tabela A

Primer ER vezivanje IC50 vrednost ER regulisanje na dole IC50 vrednost

Western blotting test

[0111] Sposobnost jedinjenja da regulišu receptor estrogena (ER) procenjena je western blotting-om primenom ćelijskih linija ljudskog raka dojke (MCF-7 i CAMA-1). Ćelije su podeljene u 12-komorične pločice tretirane sa kulturom pri 0,5x10<6>/komorica u RPMI bez fenol crvenog koji sadrži 2 mM L-glutamina i 5% (v/v) fetalnog telećeg seruma tretiranog ugljem (F6765, Sigma). Ćelije su inkubirane sa jedinjenjima (100 nM) ili sa kontrolom nosača (0,1% DMSO) tokom 48 sati na 37°C, 5% CO2pre pranja jednom sa PBS i liziranja sa 80 µl pufera za lizu (25 mM Tris/HCl, 3 mM EDTA, 3 mM EGTA, 50 mM NaF, 2 mM natrijum ortovanadata, 0,27 M saharoze, 10 mM β-glicerofosfata, 5 mM natrijum pirofosfata, 0,5% TritonX-100, pH 6,8) na ledu.

[0112] Ćelije su strugane, sonicirane i centrifugirane pre obavljanja ispitivanja proteina (DC Bio-Rad Protein kit, 500-0116) i pravljenja uzoraka do koncentracije proteina od 1-2 mg/ml u puferu za liziranje koji sadrži 1xLDS uzorak pufera (NP0007, Invitrogen) i 1x NuPAGE agens za redukovanje uzorka (NP0009, Invitrogen). Uzorci su prokuvani 10 min na 95°C, i zatim zamrznuti na -20°C dok nisu spremni za upotrebu.

[0113] 10-20 µg proteina je naneto na 26-komorične Criterion gelove (BioRad 345-0034). Gelovi su pušteni na 125 V tokom 1 sata i 25 minuta u puferu (24 mM Tris Base Sigma, 192 mM glicin, 3,5 mM SDS, obrađen u destilovanoj vodi). Zatim su gelovi preneseni na 30V tokom 2 sata u puferu za prenos (25 mM Tris, 192 mM glicin, 20% (v/v) metanol, pH 8,3, sastavljeno u destilovanoj vodi) na nitroceluloznoj membrani. Mrlja je obojena sa Ponceau S (P7170, Sigma) i isečena u skladu sa odgovarajućim markerima molekulske težine.

[0114] Membrane su blokirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi u 5% Marvel (w/v) u fiziološkom rastvoru sa fosfatom koji sadrži 0,05% Tween™ 20 (PBS/Tween). Blotovi su zatim inkubirani sa anti-ERα (SP1) zečjim monoklonskim antitelom (Thermofisher) razblaženim 1:1000 na 4°C tokom noći (uz lagano mućkanje) nakon čega je usledilo nekoliko ispiranja sa PBS/Tween. Sekundarno anti-zečje HRP antitelo (7074, CST), razblaženo sa 1:2000 razblaživanjem, inkubira se tokom 2 sata na sobnoj temperaturi (uz lagano mućkanje) nakon čega sledi nekoliko ispiranja sa PBS/Tween. Sva antitela su sastavljena u 5% Marvel (w/v) u PBS/Tween.

[0115] Imunobloti su razvijeni korišćenjem Pierce WestDura hemiluminescentnih reagensa (Thermo Scientific 34076) i razvijeni/kvantifikovani na G-kutiju uz korišćenje Syngene softvera. Regulacija na dole ERα receptora je normalizovana na kontrolu nosača (0% regulisanje na dole) i 100 nM fulvestrant kontrolu (100% regulisanje na dole) se odvija unutar istog gela.

[0116] Tabela B prikazuje podatke dobijene za odabrane Primere (podaci u nastavku mogu biti rezultat jednog eksperimenta ili proseka dva ili više eksperimenata):

Tabela B

Test ljudskog hepatocita

[0117] Metabolička stabilnost jedinjenja u ljudskim hepatocitima je procenjena korišćenjem sledećeg protokola:

1. Pripremiti 10 mM osnovnih rastvora jedinjenja i kontrolnih jedinjenja u odgovarajućem rastvaraču (DMSO). Inkubacioni medijum (L-15Medium) staviti u vodenu kadu na 37°C i ostaviti da se zagreva najmanje 15 minuta pre upotrebe. 2. Dodati 80 µL acetonitrila u svaki otvor 96-komorične ploče sa dubokim komoricama (ploča za gašenje).

3. U novoj ploči sa 96 komorica razblažiti 10 mM test jedinjenja i kontrolnog jedinjenja do 100 µM kombinujući 198 µL acetonitrila i 2 µL 10 mM osnovnog rastvora.

4. Izvaditi bočicu krio-konzerviranih (niže od -150°C) ljudskih hepatocita (LiverPool™ 10 donorskih ljudskih hepatocita dobijenih iz Celsis IVT. Chicago, IL (Product No. S01205)) iz skladišta, osiguravajući da bočice ostanu na kriogenim temperaturama dok ne usledi proces odmrzavanja. Što je brže moguće, ćelije odmrznuti tako što će bočica biti postavljena u vodenu kadu na 37°C i lagano protresti bočice. Bočice treba da ostanu u vodenoj kadi sve dok se svi kristali leda ne otope i više ne budu vidljivi. Po završetku odmrzavanja, bočicu prskati sa 70% etanolom, preneti bočicu u ormar za biološku sigurnost.

5. Otvorite bočicu i staviti sadržaj u kupastu epruvetu od 50 mL u kojoj se nalazi agens za odmrzavanje. Staviti 50 mL kupastu epruvetu u centrifugu i centrifugirati na 100 g tokom 10 minuta. Po završetku centrifugiranja, aspirirati medijum za odmrzavanje i resuspendovati hepatocite u dovoljno inkubacionog medijuma kako bi se dobilo ∼1,5 × 10<6>ćelija/mL.

6. Pomoću Cellometer® Vision, izbrojati ćelije i odrediti gustinu vitalnih ćelija. Ćelije slabe vitalnosti (<80% vitalnosti) nisu prihvatljive za upotrebu. Razblažiti ćelije sa inkubacionim medijumom do gustine radne stanice od 1,0 × 10<6>vitalnih ćelija/mL.

7. Preneti 247,5 µL hepatocita u svaku komoricu 96-komorične ploče sa ćelijskom kulturom. Postaviti ploču na Eppendorf Thermomixer Comfort šejker ploča kako bi se se hepatociti zagrejali tokom 10 minuta.

8. Dodati 2,5 µL ispitivanog jedinjenja od 100 µM ili kontrolnih jedinjenja u inkubunbacionu komoricu koja sadrži ćelije, mešati kako bi se postigla homogena suspenzija na 0,5 min, koja će, kada se postigne, definisati vremensku tačku od 0,5 min. U vremenu od 0,5 min, preneti 20 µL inkubirane smeše u komorice u „ploči za gašenje“ nakon čega sledi mešanje.

9. Inkubirati ploču na 37°C pri 900 obrtaja u minuti na Eppendorf Thermomixer Comfort šejkeru ploča. Na 5, 15, 30, 45, 60, 80, 100 i 120 minuta, pomešati sistem inkubacije i preneti uzorke 20 µL inkubirane smeše u svakoj vremenskoj tački u komorice posebne „ploče za gašenje“, nakon čega sledi mešanje.

10. Ploče za gašenje centrifugirati 20 minuta pri 4.000 o/min.4 različita jedinjenja su spojena u jednu kasetu i koriste se za LC/MS/MS analizu.

[0118] Sva izračunavanja su izvršena koristeći Microsoft Excel. Površine vrhova su određene iz ekstrakovanih jonskih hromatograma. In vitro unutrašnji klirens (in vitro Clint, u L/min/10<6>ćelija) matičnog jedinjenja određen je regresionom analizom nestajanja Ln procenta roditelja u odnosu na vremensku krivu. In vitro unutrašnji klirens (in vitro Clint, u L/min/10<6>ćelija) određen je iz vrednosti nagiba korišćenjem naredne jednačine, i prikazan je u Tabeli C za izabrane primere: in vitro

V = zapremina inkubacije (0,25 mL);

N = broj hepatocita po komorici (0,25 × 10<6>ćelija).

Tabela C

Fizička svojstva

logD

[0119] Lipofilnost leka je važno fizičko svojstvo koje može uticati na mnoga biološka i metabolička svojstva jedinjenja, na primer, na profile apsorpcije, distribucije, metabolizma, izlučivanja i toksičnosti jedinjenja. Koeficijent raspodele između 1-oktanola i vodenog pufera, LogDO/W, pri pH 7,4, je najčešće korišćeno merenje lipofilnosti jedinjenja. Trenutni postupak za merenje LogDO/W zasniva se na tradicionalnoj tehnici mućkanja, ali sa modifikacijom merenja jedinjenja u deset mešavina istovremeno, koristeći UPLC kvantitativnu masenu spektrometriju (MS) kao postupak za merenje relativnog oktanola i vodene koncentracije. Maksimalni kapacitet je 379 projektnih jedinjenja (48 komorica sa 10 jedinjenja uključujući tri QC jedinjenja) po eksperimentu. 2 uzorka za kontrolu kvaliteta (QC), ciklobenzaprin sa umerenim LogD i nikardipin sa visokim LogD koriste se u svim komoricama kako bi se osigurao dobar kvalitet. Dodatni QC uzorak kofeina, sa niskim LogD, koristi se i nasumično postavlja u sve staze. Postupak je temeljno potvrđen u odnosu na prethodne metodologije mućkanja boca.

Rastvorljivost

[0120] Kako bi oralno jedinjenje stiglo do mesta dejstva i kako bi došlo do oralne apsorpcije iz creva, to jedinjenje mora da bude u rastvoru, pa stoga jedinjenja koja poseduju visoku unutrašnju rastvorljivost mogu biti pogodnija za farmaceutsku upotrebu. Termodinamička rastvorljivost jedinjenja za istraživanje se meri u standardnim uslovima. To je pristup mućkanja boce koji koristi 10 mM DMSO rastvore koji se isporučuju iz skladišta tečnosti Compound Managements i predstavljaju postupak visoke propusnosti. Osušena jedinjenja se uravnotežuju u vodenom fosfatnom puferu (pH 7,4) tokom 24 sata na 25°C, deo sa rastvorenim jedinjenjem se odvaja od ostataka. Rastvori su analizirani i kvantifikovani korišćenjem UPLC/MS/MS, QC uzorci su ugrađeni u svako ispitivanje kako bi se osigurao kvalitet ispitivanja.

Vezivanje proteina ljudske plazme

[0121] Vezivanje proteina u ljudskoj plazmi je ključni faktor u kontroli količine slobodnog (nevezanog) leka koji je na raspolaganju za vezivanje na ciljani faktor i zato igra važnu ulogu u posmatranoj efikasnosti lekova in vivo. Zbog toga, jedinjenja koja poseduju visok slobodni fragment (nizak nivo vezivanja na proteine u plazmi) mogu da pokazuju povećanu efikasnost u odnosu na jedinjenje sa sličnom potencijom i nivoom izloženosti. Automatizovani test za ravnotežnu dijalizu u ljudskoj plazmi koristi RED (brza ravnotežna dijaliza) uređaj i rukovanje uzorcima. Analiza obično traje preko dva do tri dana, uključujući dobijanje rezultata. Nakon dijalize tokom 18 sati, uzorci plazme i pufera se pripremaju za analizu tečnom hromatografijom i masenom spektrometrijom. Uzorci se generalno testiraju u jednom primerku i kvantifikuju sa LC/MSMS korišćenjem kalibracione krive u plazmi sa 7 tačaka. Jedinjenja su skupljena u komoricama plazme do 10 jedinjenja. U svakom toku se koriste tri referentna jedinjenja, Propranolol, Metoprolol i Varfarin. Varfarin se koristi kao kontrola u svakoj komorici, i Propranolol i Metoprolol se postavljaju nasumično u svakom ponavljanju. Interni Excel makro koristi se za pripremu datoteka za robota i maseni spektrometar, i koristi se i za izračunavanje nevezanog fragmenta (fu%) u plazmi.

[0122] Tabela D prikazuje podatke za logD, rastvorljivost i vezivanje proteina plazme za odabrane primere (podaci u nastavku mogu biti rezultat jednog eksperimenta ili prosek dva ili više eksperimenata):

Tabela D

hERG test vezivanja

[0123] hERG (ljudski gen povezan sa go go-etrom) ključni su za normalnu električnu aktivnost u srcu. Aritmija se može izazvati blokadom hERG kanala različitom grupom lekova. Ova nuspojava je čest razlog za neuspeh lekova u pretkliničkim ispitivanjima sigurnosti [Sanguinetti i dr., Nature., 2006, 440, 463-469.] i stoga minimizovanje aktivnosti blokiranja hERG kanala može biti poželjno svojstvo kandidata za lek.

[0124] Svrha testa vezivanja hERG je da se proceni uticaj test jedinjenja na kalijum kanal zavisan od napona koji je kodiran ljudskim genom povezanim sa go go-etrom (hERG) koristeći konstitutivno eksprimirajuću CHO ćelijsku liniju na automatizovanom sistemu Nanion Syncropatch 384PE.

[0125] Ispitivanje je sprovedeno na sledeći način sa svim reagensima koji su korišćeni na sobnoj temperaturi, osim ako nije drugačije navedeno.

Pripremanje reagensa uključuje:

[0126]

1. Unutrašnji „IC700“ rastvor korišćen za perfuziju donje strane čipa (u mM), KF 130, KCl 20, MgCl2, EGTA 10 i HEPES 10, (svi Sigma-Aldrich; pH 7,2-7,3 koristeći 10 M KOH, 320 mOsm) i dopunjeno sa 25 □M escina.

2. Spoljni i ćelijski pufer (u mM), NaCl 137, KCl 4, HEPES 10, D-glukoza 10, CaCl2 2, MgCl2 1 (pH 7,4, NaOH)

3. NMDG „referentni“ pufer korišćen za uspostavljanje stabilne osnovice pre dodavanja test jedinjenja, NaCl 80, KCl4, CaCl22, MgCl2, NMDG Cl 60, D-glukoza monohidrat 5, HEPES 10 (pH 7,4 NaOH 298 mOsm)

4. Pojačivač plombi se koristi za poboljšanje kvaliteta ćelija, NaCl 80, KCl3, CaCl2 10, HEPES 10, MgCl21 (pH 7,4 NaOH)

Pripremanje ćelija:

[0127]

1. Ako se koristi ćelijska kultura; ćelije se inkubiraju na 30°C tokom približno 4-6 dana pre upotrebe. Na dan ispitivanja ćelije se podižu koristeći aktazu i ponovo suspenduju u 20 ml ćelijskog pufera do gustine od 0,8 do 1e6 ćelija/ml.

2. Ako se koriste krio-epruvete spremne za ispitivanje; brzo odmrznuti dve krioepruvete na 37°C i polako ih pipetirati u spoljni rastvor od 23 ml

3. Svi preparati ćelije inkubiraju se tokom 15 minuta na kućištu za ćelije koje se mućka postavljenom na 10°C pre početka ispitivanja

Pripremanje jedinjenja:

[0128] Sva jedinjenja su akustično raspršena u četiri ponavljanja koristeći Labcyte Echo. 10 mM osnovni rastvor koristi se za generisanje 6 izvornih ploča sa jedinjenjem u različitim koncentracijama kako bi se omogućilo kumulativno doziranje na ćelije (0,03167 mM, i zatim 0,1 mM, zatim 0,3167 mM, 1 mM, 3,167 mM, 10 mM,). 90 µL referentnog pufera je dodato u svaku komoricu izvornih ploča koje sadrže 600 nl jedinjenja za krajnju koncentraciju jedinjenja od 0,1 µM, 0,39 µM, 1,2 µM, 3,9 µM, 12,5 µM i 39,6 µM respektivno. hERG test (svi koraci doziranja se izvode pomoću rukovanja sa tečnošću koja je podešena na Nanion syncropatch)

1. Napuniti čipove sa 4 rupe sa 384 komorica sa medijumom otpornosti sa 40 µl spoljnog pufera i perfudirati unutrašnji pufer na donjoj strani ploče.

2. Raspodeliti 20 µl ćelija u svaku komoricu čipa, i zatim 20 µl pojačivača plombi. 3. Ukloniti 40 µl reagensa iz svakog ležišta do stanice za pranje ostavljajući preostali volumen od 40 µl

4. Raspodeliti 40 µl referentnog pufera sa korakom uklanjanja od 40 µl nakon 3 min, ponoviti ovaj korak.

5. Raspodeliti 40 µl ploča jedinjenja 1 (0,03167 mM), snimke u „realnom vremenu“ tokom 3 minuta izlaganja pre uklanjanja 40 µl. Ovaj korak se ponavlja za 5 sledećih ploča jedinjenja u povećanim koncentracijama kako bi se stvorila kumulativna kriva koncentracija-efekat u svakoj komorici Syncropatch čipa.

[0129] hERG-posredovane struje izazvane su korišćenjem protoka koraka napona koji se sastojao od neprekidnog napona držanja od -80 mV, sa korakom od 500 ms do 60 mV, i zatim korakom od 500 ms do -40 mV svakih 15 sekundi. hERG jačina struje merena je automatski iz tragova od kijih su oduzeta curenja pomoću Nanion softvera tako što je vršna vrednost hERG „repne“ struje bila na -40 mV svakih 15 sekundi i uzeta su poslednja tri od tih odgovora za svaku koncentraciju kako bi se stvorila koncentracija-efekat kriva

[0130] Proračun rezultata se vrši pomoću APC paketa u okviru Genedata. Za rutinsku normalizaciju podataka iz komorice sa referentnim komoricama sa neutralnim i inhibitorskim kontrolnim grupama, GeneData Assay Analyzer koristi narednu jednačinu za normalizaciju vrednosti signala u željeni opseg signala:

x je izmerena vrednost sirovog signala komorice

<cr> je srednja vrednost izmerenih vrednosti signala za centralne referentne (neutralne) komorice na ploči

<sr> je srednja vrednost izmerenih vrednosti signala za komorice referentne razmere (inhibitori) na ploči

CR je željena srednja normalizovana vrednost za centralne reference (neutralnu) SR je željena srednja normalizovana vrednost za referentne razmere (inhibitori)

[0131] Tabela E prikazuje podatke vezane za hERG za odabrane primere (podaci u nastavku mogu biti rezultat jednog eksperimenta ili prosek dva ili više eksperimenata):

Tabela E

Propusnost

[0132] Kako bi se maksimizovala oralna apsorpcija, lek mora da ima dovoljan transmembranski protok, kao i da izbegava isticanje P-glikoproteina. Najrašireniji sistem za predviđanje oralne apsorpcije je određivanje brzine prožimanja jedinjenja pomoću monoslojeva ćelijske linije ljudskog adenokarcinoma creva Caco-2.

Dvosmerna propusnost ljudskog Caco-2 od A do B i B do A

[0133] Automatizovani test je korišćen za određivanje dvosmerne propusnosti (isticanje i unošenje) jedinjenja u Caco-2 ćelije sprovedeno tokom 2 sata pri pH 7,4. Uzorci su analizirani pomoću LC/MS/MS kako bi se procenio primećeni koeficijent propusnosti (Papp) jedinjenja putem Calo-2 ćelijskih mono-slojeva, i rezultati su navedeni u jedinicama x10<-6>cm/s.

[0134] Odnos isticanja (ER) može se odrediti pomoću naredne jednačine:

Gde Papp (B-A)označava primećeni koeficijent propusnosti u bazolateralnom do apikalnog pravca i Papp (A-B)označava primećeni koeficijent propusnosti u apikalnom do bazolateralnog pravca.

Pasivna propusnost ljudskog Caco-2 od A do B Papp

[0135] Automatizovani test je korišćen za određivanje pasivne propusnosti jedinjenja u mono-slojevima ćelija Caco-2, i sproveden je tokom 2 sata sa apikalnim pH od 6,5 i bazolateralnim pH od 7,4. Test Caco-2 AB inhibicije se izvodi hemijskom inhibicijom tri glavna transportera isticanja ABCB1 (P-gp), ABCG2 (BCRP) i ABCC2 (MRP2) u Caco-2 ćelijama. Inkubacija apikalne i bazolateralne grupe je izvedena sa koktelom inhibitora (50 µM kinidina, 20 µM sulfasalazina i 100 µM benzbromarona). Uzorci su analizirani pomoću LC/MS/MS kako bi se procenio primećeni koeficijent propusnosti (Papp) jedinjenja preko Calo-2 ćelijskih mono-slojeva, i rezultati su navedeni u jedinicama x10<-6>cm/s

[0136] Tabela F prikazuje podatke propusnosti koji su generisani za odabrane primere (podaci u nastavku mogu biti rezultat jednog eksperimenta ili prosek dva ili više eksperimenata):

Tabela F

Anti-tumorska efikasnost ljudskog roditeljskog MCF7 ksenografta kod miša [0137] Kako bi se utvrdio efekat Primera 17 na rast ksenografta MCF7, izvedeno je naredno ispitivanje. MCF7 ćelije (ATCC) uzgajane su in vitro u eksponencijalnoj fazi pre implantacije. Ukratko, muški SCID miševi težine 18 g ili više (Envigo UK) implantirani su potkožno na leđa kuglicom estrogena (0,5 mg, 21-dnevno oslobađanje od Innovative Research of America) pod anestetikom. Dan kasnije, miševi su inokulirani subkutano na levom boku sa 5 miliona MCF7 ćelija, pripremljenih kao 0,1 ml ćelijske suspenzije u 1:1 RPMI (Gibco, Life Technologies) i matrigel (Corning). Kada su tumori dostigli ∼ 250 mm<3>miševi su nasumično podeljeni u grupe od 9 miševa (12 miševa za kontrolu nosača) i počet je tretman lekovima. Jedinjenja su pripremljena u nosaču (40% tetraetilen glikol (w/v), 7,5% kaptisol (w/v) u vodi za injekcije) i primenjena su oralno u količini od 10 ml/kg jednom dnevno tokom 21 dana, u 0,5 mg/kg do 50 mg/kg. Tumori su mereni dva puta nedeljno, i zapremina tumora izračunata je pomoću eliptične formule (pi/6 x širina x širina x dužina). Podaci predstavljaju geo srednju vrednost zapremina tumora u odnosu na zapreminu tumora na dan randomizacije. Stubići grešaka imaju interval pouzdanosti od 95% (Graphpad Prism). Ovo istraživanje pokazalo je da doze od 10 mg/kg i više primenjuju regresiju tumora (Slika 12).

Anti-tumorska efikasnost ljudskog Y537S ESR1 mutant MCF7 ksenografta kod miša [0138] Kako bi se utvrdio efekat iz Primera 17 na rast ksenografta dobijenih iz MCF7 ćelija genetički dizajniranih za eksprimiranje Y537S ESR1, izvedeno je naredno ispitivanje. Y537S ESR1 MCF7 ćelije su stvorene uređivanjem genoma i eksprimiraju samo Y537S ESR1 (Ladd, i dr., Oncotarget, 2016, 7:54120-54136). Ukratko, mužjaci SCID miševa težine 18 g ili više (Envigo UK) inkulirani su subkutano na levom boku sa 5 miliona Y537S ESR1 MCF7 ćelija, pripremljenih kao 0,1 ml suspenzije ćelija u 1:1 RPMI (Gibco, Life Technologies) i matrigel (Corning). Kada su tumori dostigli ∼250 mm<3>miševi su nasumično podeljeni u grupe od 9 miševa (12 miševa za kontrolu nosača) i počet je tretman lekovima. Jedinjenja su pripremljena u nosaču (40% tetraetilen glikol (w/v), 7,5% kaptisol (w/v) u vodi za injekcije) i primenjena oralno u količini od 10 ml/kg jednom dnevno tokom 22 dana po 0,5 mg/kg do 50 mg/kg. Tumori su mereni dva puta nedeljno, i zapremina tumora izračunata je pomoću eliptične formule (pi/6 x širina x širina x dužina). Podaci predstavljaju geo srednju vrednost zapremina tumora u odnosu na zapreminu tumora na dan randomizacije. Stubići grešaka imaju interval pouzdanosti od 95% (Graphpad Prism). Ovo istraživanje pokazalo je da doze od 10 mg/kg i više primenjuju regresiju tumora (Slika 13).

Anti-tumorska efikasnost ljudskog ksenografta CTC174 dobijenog od ljudskog pacijenta raka dojke sa ESR1 mutacijom kod miševa

[0139] Kako bi se odredio efekat Primera 17 na rast ksenografta CTC174 dobijenog od pacijenta sa ESR1 mutacijom, ženkama NSG implantirani su fragmenti CTC174 u jastučić za mlečne masti. CTC174 su izvedeni iz cirkulišućih ćelija tumora izolovanih od pacijenta sa metastatskim ER rakom dojke i pokazano je da nose mutaciju D538G u ESR1 na frekvenciji 0,33 alela (Ladd, i dr., Oncotarget, 2016, 7:54120-54136). Ukratko, ženke NOD/SCID (Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (NSG) miševa sa uklonjenim jajnicima (uzrasta od 6-7 nedelja - The Jackson Laboratory) implantirane su pod anestetikom sa ∼50 mm<3>fragmenta CTC174 ksenografta u trećem jastučiću za mlečne masti. Kada su tumori dostigli ∼200 mm<3>miševi su nasumično podeljeni u grupe od 10 miševa i počet je tretman lekovima. Jedinjenja su pripremljena u nosaču (40% tetraetilen glikol (w/v), 7,5% kaptisol (w/v) u vodi za injekcije) i primenjena oralno u količini od 10 ml/kg jednom dnevno tokom 32 dana, sa 0,8 mg/kg kg do 40 mg/kg. Tumori su mereni dva puta nedeljno, i zapremina tumora izračunata je pomoću eliptične formule (pi/6 x širina x širina x dužina). Podaci predstavljaju geo srednju vrednost zapremina tumora u odnosu na zapreminu tumora na dan randomizacije. Stubići grešaka imaju interval pouzdanosti od 95% (Graphpad Prism). Ovo istraživanje pokazalo je da doze od 10 mg/kg i više primenjuju gotovo potpunu inhibiciju rasta tumora (Slika 14).

[0140] Prema narednom aspektu specifikacije pružen je farmaceutski sastav, koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kao što je prethodno definisano u vezi sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0141] Pogodni farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi za formulaciju tableta uključuju, na primer, inertne razblaživače, agense za granulaciju i dezintegraciju, vezujuće agense, agense za podmazivanje, agense za zaštitu i antioksidanse. Dalji pogodan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens može biti helatni agens. Formulacije tableta mogu biti premazane ili obložene bilo da modifikuju svoje razlaganje i posledičnu apsorpciju aktivnog sastojka u gastrointestinalnom traktu, ili da poboljšaju svoju stabilnost i/ili izgled, u oba slučaja, koristeći konvencionalne agense za oblaganje i postupke dobro poznate u struci.

[0142] Sastavi za oralnu upotrebu mogu alternativno da budu u obliku tvrdih želatinskih kapsula u kojima je aktivni sastojak pomešan sa inertnim čvrstim razblaživačem, ili kao meke želatinske kapsule u kojima je aktivni sastojak pomešan sa vodom ili uljem.

[0143] Vodene suspenzije uglavnom sadrže aktivni sastojak u obliku finog praha zajedno sa jednim ili više agenasa za suspendovanje, agenasa za raspršivanje ili vlaženje. Vodene suspenzije takođe mogu da sadrže jedan ili više konzervansa, anti-oksidansa, agenasa bojenje, aromatizaciju i/ili zaslađivanje.

[0144] Uljane suspenzije se mogu formulisati suspenzijom aktivnog sastojka u biljnom ili mineralnom ulju. Uljane suspenzije takođe mogu da sadrže agens za zgušnjavanje. Agensi za zaslađivanje, kao oni navedeni iznad, i agensi za aromatizaciju mogu se dodati kako bi se dobio oralni preparat koji se može imati prijatni ukus. Ovi sastavi mogu se sačuvati dodavanjem anti-oksidansa.

[0145] Prašci i granule koje se mogu raspršiti i koji su pogodni za pripremu vodene suspenzije dodatkom vode obično sadrže aktivni sastojak zajedno sa agensom za raspršivanje ili vlaženje, agensom za suspendovanje i jednim ili više konzervansa. Takođe mogu biti prisutni dodatni ekscipijensi poput zaslađivača, aroma i boja.

[0146] Farmaceutski sastavi iz ove specifikacije mogu takođe biti u obliku ulje u vodi emulzija. Uljana faza može biti biljno ulje ili mineralno ulje ili mešavina bilo čega od navedenog. Emulzije mogu takođe da sadrže agense za zaslađivanje, aromatizaciju i konzervans.

[0147] Sirupi i eliksiri mogu se formulisati sa agensima za zaslađivanje, i mogu takođe da sadrže i agens za uklanjanje vlage, konzervans, arome i/ili boje.

[0148] Farmaceutski sastavi takođe mogu biti u obliku sterilne vodene ili uljane suspenzije za injekcije, koja se može formulisati prema poznatim postupcima koristeći jedan ili više odgovarajućih agenasa za raspršivanje ili vlaženje i agenasa suspendovanje, koji su gore navedeni. Sterilni preparat za injekcije takođe može biti sterilni rastvor za injekcije ili suspenzija u netoksičnom parenteralno prihvatljivom razblaživaču ili sistemu rastvarača.

[0149] Sastavi za primenu inhalacijom mogu biti u obliku konvencionalnog aerosola pod pritiskom, koji je podešen da raspršuje aktivni sastojak bilo kao aerosol koji sadrži sitno podeljene čvrste ili tečne kapljice. Uobičajeni aerosolni propelanti kao što su nestabilni fluorisani ugljovodonici ili ugljovodonici mogu se koristiti, i aerosolni uređaj je pogodno postavljen da dozira odmerenu količinu aktivnog sastojka. Takođe mogu biti pogodni inhalatori suvog praha.

[0150] Za dalje informacije o formulacijama, čitalac se upućuje na Chapter 25.2 u Volume 5 od Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990.

[0151] Količina aktivnog sastojka koja je kombinovana sa jednim ili više ekscipijenata za dobijanje jednog doznog oblika će nužno varirati u zavisnosti od tretiranog domaćina i određenog puta primene. Na primer, oralna primena ljudima obično zahteva, na primer, od 1 mg do 2 g aktivnog agensa (pogodnije od 100 mg do 2 g, na primer, od 250 mg do 1,8 g, kao što je od 500 mg do 1,8 g, posebno od 500 mg do 1.5 g, pogodno od 500 mg do 1 g) koji se primenjuje u kombinaciji sa odgovarajućom i pogodnom količinom ekscipijenasa koja može varirati od oko 3 do oko 98 procenata težine ukupnog sastava. Razumeće se da, ako se zahteva velika doza, može biti potrebno više doznih oblika, na primer dve ili više tableta ili kapsula, gde se doza aktivnog sastojka pogodno podeli između njih. Tipično, jedinični dozni oblici sadrže oko 10 mg do 0,5 g jedinjenja ove specifikacije, mada jedinični dozni oblik može sadržati i do 1 g. Pogodno, jedan čvrsti dozni oblik može da sadrži između 1 i 300 mg aktivnog sastojka.

[0152] Veličina doze u terapeutske ili profilaktičke svrhe jedinjenja ove specifikacije će se, naravno, razlikovati u skladu sa prirodom i težinom bolesnog stanja, uzrasta i pola životinje ili pacijenta i načina primene, u skladu sa dobro poznatim principima medicine.

[0153] Kada se koriste jedinjenja ove specifikacije u terapeutske ili profilaktičke svrhe, ona će se generalno primenjivati tako da se primi dnevna doza u opsegu, na primer, 1 mg/kg do 100 mg/kg telesne težine, koja se primenjuje ako je potrebno u podeljenim dozama.

Generalno, niže doze će se primenjivati kada se koristi parenteralni put. Tako, na primer, za intravensku primenu, obično se koristi doza u opsegu, na primer, 1 mg/kg do 25 mg/kg telesne težine. Slično, za primenu inhalacijom, koristiće se doza u opsegu, na primer, 1 mg/kg do 25 mg/kg telesne težine. Ipak je poželjna oralna primena, posebno u obliku tableta.

[0154] U jednom aspektu specifikacije, jedinjenja ove specifikacije ili njihove farmaceutski prihvatljive soli primenjuju se u obliku tableta koje sadrže 10 mg do 100 mg jedinjenja iz ove specifikacije (ili njegove farmaceutski prihvatljive soli), gde se jedna ili više tableta primenjuje po potrebi kako bi se postigla željena doza.

[0155] Kao što je gore navedeno, poznato je da signalizacija kroz ERα izaziva tumorogenezu jednim ili više efekata posredovanja proliferacije raka i drugih ćelija, posredstvom angiogenih događaja i posredovanjem pokretljivosti, migracije i invazivnosti ćelija raka. Otkrili smo da jedinjenja ove specifikacije poseduju potentnu anti-tumorsku aktivnost za koju se veruje da je dobijena antagonizmom i redukcijom ERα koja je uključena u korake transdukcije signala koji dovode do proliferacije i opstanka tumorskih ćelija i invazivne i migracione sposobnosti metastaziranja tumorskih ćelija.

[0156] Prema tome, jedinjenja ove specifikacije mogu biti vredna kao anti-tumorska agensi, posebno kao selektivni inhibitori proliferacije, preživljavanja, pokretljivosti, diseminacije i invazivnosti sisarskih ćelija raka, što dovodi do inhibicije rasta i preživljavanja tumora i do inhibicije metastazirajućeg rasta tumora. Posebno, jedinjenja ove specifikacije mogu biti vredna kao antiproliferativni i anti-invazioni agensi u zadržavanju i/ili tretmanu oboljenja čvrstog tumorskog. Posebno, jedinjenja ove specifikacije mogu biti korisna u prevenciji ili tretmanu onih tumora koji su osetljivi na inhibiciju ERα i koji su uključeni u korake transdukcije signala koji dovode do proliferacije i opstanka tumorskih ćelija i migratorne sposobnosti i invazivnosti metastazirajućih ćelija tumora. Dalje, jedinjenja ove specifikacije mogu biti korisna u prevenciji ili tretmanu onih tumora koji su posredovani potpuno ili delimično antagonizmom i regulacijom na dole ERα, tj. jedinjenja se mogu koristiti za stvaranje inhibicionog efekta ERα kod toplokrvne životinje kojoj je potreban takav tretman.

[0157] Prema narednom aspektu specifikacije pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je prethodno definisano, za upotrebu kao lek kod toplokrvne životinje kao što je čovek.

[0158] Prema narednom aspektu specifikacije, pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je prethodno definisano za upotrebu u proizvodnji antiproliferativnog efekta kod toplokrvne životinje kao što je čovek.

[0159] Prema narednom aspektu specifikacije pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je prethodno definisano za upotrebu kod toplokrvne životinje, kao što je čovek, kao anti-invazioni agens u suzbijanju i/ili tretmanu oboljenja čvrstog tumora.

[0160] Prema narednom aspektu specifikacije, pružena je upotreba jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, kao što je prethodno definisano, za proizvodnju antiproliferativnog efekta kod toplokrvne životinje kao što je čovek.

[0161] Prema narednom aspektu specifikacije, pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je prethodno definisano, za upotrebu u prevenciji ili tretmanu raka kod toplokrvne životinje, kao što je čovek.

[0162] Prema narednom aspektu specifikacije, pruženo je jedinjenje Formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je prethodno definisano, za upotrebu u prevenciji ili tretmanu oboljenja čvrstog tumora kod toplokrvne životinje kao što je čovek.

[0163] Prema narednom aspektu specifikacije pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kao što je prethodno definisano, za upotrebu u prevenciji ili tretmanu onih tumora koji su osetljivi na inhibiciju ERα koji su uključen u korake transdukcije signala koji dovode do proliferacije, preživljavanja, invazivnosti i migratorne sposobnosti tumorskih ćelija.

[0164] Prema narednom aspektu specifikacije pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je prethodno definisano, za upotrebu u pružanju inhibitornog efekta na ERα.

[0165] Prema narednom aspektu specifikacije pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je prethodno definisano, za upotrebu u pružanju selektivnog inhibitornog efekta na ERα.

[0166] Ovde su opisana jedinjenja koja se mogu vezati za vezujući domen ERα liganda i selektivni su degraderi receptora estrogena. U biohemijskim i ćelijskim ispitivanjima, pokazano je da jedinjenja ove specifikacije predstavljaju snažne vezujuće agense za receptore estrogena i smanjuju ćelijski nivo ERα i mogu biti korisni u tretmanu bolesti ili stanja osetljivih na estrogen (uključujući bolesti koje su razvile otpornost na endokrinu terapiju), tj. za upotrebu u tretmanu raka dojke i ginekoloških rakova (uključujući rak endometrijuma, jajnika i grlića materice) i rakova koji eksprimiraju ERα mutirane proteine koji mogu biti de novo mutacije ili su nastali kao rezultat tretmana prethodnom endokrinom terapijom, kao inhibitor aromataze.

[0167] Prema narednom aspektu specifikacije pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je prethodno definisano, za upotrebu u tretmanu raka dojke ili ginekoloških rakova.

[0168] Prema narednom aspektu specifikacije pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je prethodno definisano, za upotrebu u tretmanu raka dojke, endometrijuma, jajnika ili grlića materice.

[0169] Prema narednom aspektu specifikacije pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je prethodno definisano, za upotrebu u tretmanu raka dojke.

[0170] Prema narednom aspektu specifikacije pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je prethodno definisano, za upotrebu u tretmanu raka dojke, gde je rak razvio otpornost na jednu ili više drugih endokrinih terapija.

[0171] U jednoj od karakteristika specifikacije, rak koji se tretira je rak dojke. U narednom aspektu ove karakteristike, rak dojke je receptor estrogena ve (ER+ve). U jednom otelotvorenju ovog aspekta, jedinjenje Formule (I) se dozira u kombinaciji sa drugim agensom protiv raka, kao što je anti-hormonski agens kao što je ovde definisano.

[0172] Prema narednom aspektu specifikacije pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kako je prethodno definisano, za upotrebu u tretmanu ER+ve raka dojke.

[0173] Kao što je prethodno navedeno, in vivo efekti jedinjenja Formule (I), mogu se delom ispoljiti od strane jednog ili više metabolita koji se formiraju u ljudskom ili životinjskom telu nakon primene jedinjenja Formule (I).

[0174] Predmetna specifikacija takođe razmatra postupak za inhibiciju ER-α kod pacijenta, koji sadrži primenu pacijentu količine jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, efikasne u inhibiciji ER-α kod pacijenta.

[0175] Ovde definisan tretman protiv raka može se primeniti kao jedina terapija ili može uključivati, pored jedinjenja iz specifikacije, konvencionalnu hirurgiju ili radioterapiju ili hemoterapiju. Takva hemoterapija može da obuhvata jednu ili više sledećih kategorija agenasa protiv tumora:-(i) drugi antiproliferativni/antineoplastični lekovi i njihove kombinacije, kao što se koriste u medicinskoj onkologiji, kao što su alkilirajući agensi (na primer cis-platin, oksaliplatin, karboplatin, ciklofosfamid, azotni ipirit, melfalan, hlorambucil, busulfan, temozolamid i nitrozouree); antimetaboliti (na primer gemcitabin i antifolati, poput fluoropirimidina poput 5-fluorouracila i tegafura, raltitrekseda, metotreksata, citozin arabinozida i hidroksiuree); anti-tumorski antibiotici (na primer antraciklini poput adriamicina, bleomicina, doksorubicina, daunomicina, epirubicina, idarubicina, mitomicina-C, daktinomicina i mitramicina); antimitotički agensi (na primer vinka alkaloidi poput vinkristina, vinblastina, vindesina i vinorelbina i taksidoidi poput taksola i taksotera i inhibitora polokinaze); i inhibitori topoizomeraze (na primer epipodofilotoksini poput etopozida i teniposida, amsakrina, topotekana i kamptotecina);

(ii) anti-hormonalni agensi kao što su anti-estrogeni (na primer tamoksifen, fulvestrant, toremifen, raloksifen, droloksifen i jodoksfen), progestogeni (na primer megestrol acetat), inhibitori aromataze (na primer kao anastrozol, letrozol, vorazole i eksemestan);

(iii) inhibitori funkcije faktora rasta i njihovi nizvodni signalni putevi: uključeni su Ab modulatori bilo kog faktora rasta ili ciljevi receptora faktora rasta, pregled od strane Stern i dr. Critical Reviews in Oncology/Haematology, 2005, 54, pp11-29); takođe su uključeni inhibitori malih molekula takvih ciljeva, na primer inhibitori kinaze - primeri uključuju antierbB2 antitelo trastuzumab [Herceptin™], anti-EGFR antitelo panitumumab, anti-EGFR antitelo cetuksimab [Erbitux, C225] i inhibitore tirozin kinaze uključujući inhibitore porodice receptora erbB, kao što je porodica receptora epidermalnog faktora rasta faktora rasta (EGFR/erbB1), inhibitori tirozin kinaza, kao što su gefitinib ili erlotinib, inhibitori erbB2 tirozin kinaze, kao što je lapatinib, i mešani inhibitori erb1/2, kao što su afatanib; slične strategije su dostupne za ostale klase faktora rasta i njihove receptore, na primer inhibitore porodice faktora rasta hepatocita ili njihove receptore, uključujući c-met i ron; inhibitore insulina i porodice faktora rasta insulina ili njihove receptore (IGFR, IR) inhibitore porodice faktora rasta trombocita ili njihove receptore (PDGFR), i inhibitore signalizacije posredovane drugim receptorima tirozin kinaza, kao što su c-kit, AnLK i CSF-1R; takođe su uključeni modulatori koji ciljaju signalne proteine u signalnom putu PI3-kinaze, na primer, inhibitori izoforma PI3-kinaze kao što su PI3K-α/β/γ ser/thr kinaze kao što su AKT, mTOR (kao što je AZD2014), PDK, SGK, PI4K ili PIP5K; takođe su obuhvaćeni inhibitori serin/treonin kinaza koji nisu gore navedeni, na primer inhibitori rafa kao što su vemurafenib, MEK inhibitori kao što je selumetinib (AZD6244), Abl inhibitori kao što su imatinib ili nilotinib, Btk inhibitori kao što je ibrutinib, Syk inhibitori kao što je fostamatinib, inhibitori aurora kinaze (na primer AZD1152), inhibitori drugih ser/thr kinaza kao što su JAK, STAT i IRAK4 i inhibitori kinaze zavisne od ciklina, na primer inhibitori CDK1, CDK7, CDK9 i CDK4/6, kao što je palbociklib;

iv) modulatori signala oštećenja DNK, na primer PARP inhibitori (npr. Olaparib), ATR inhibitori ili ATM inhibitori;

v) modulatori apoptotskih puteva i puteva ćelijske smrti kao što su modulatori porodice Bcl (npr. ABT-263/Navitoclax, ABT-199);

(vi) antiangiogeni agensi kao što su ona koja inhibiraju efekte vaskularnog endotelnog faktora rasta, [na primer, antitelo protiv faktora rasta vaskularne endotelne ćelije, antitelo bevacizumab (Avastin™) i na primer, inhibitor VEGF receptora tirozin kinaze, kao što su sorafenib, akitinib, pazopanib, sunitinib i vandetanib (i jedinjenja koja deluju drugim mehanizmima (na primer linomid, inhibitori funkcije integrin αvβ3 i angiostatin)];

(vii) agensi za vaskularno oštećenje, kao što je kombretastatin A4;

(viii) agensi protiv invazije, na primer inhibitori porodice c-Src kinaza kao što su (dasatinib, J. Med. Chem., 2004, 47, 6658-6661) i bosutinib (SKI-606) i inhibitori metaloproteinaze poput marimastata, inhibitori funkcije receptora urokinaza plazminogena ili antitela za heparanazu];

(ix) imunoterapijski pristupi, uključujući na primer ex-vivo i in vivo pristupe za povećanje imunogenosti pacijentovih ćelija tumora, poput transfekcije citokinima kao što su interleukin 2, interleukin 4 ili faktor koji stimuliše koloniju granulocita i makrofaga, pristupi smanjenju T-ćelijske anergije, pristupi koji koriste transfekovane imune ćelijama kao što su dendritične ćelije koje su transfekovane citokinom, pristupi koji koriste ćelija linija tumora transfekovanih citokinima i pristupi koji koriste anti-idiotipska antitela. Specifični primeri uključuju monoklonska antitela koja ciljaju PD-1 (npr. BMS-936558) ili CTLA4 (npr. ipilimumab i tremelimumab);

(x) terapije zasnovane na antisensu ili RNKi, na primer one koje su usmerene na navedene ciljeve.

(xi) pristupi genske terapije, uključujući na primer pristupe zamene aberantnih gena kao što su aberantni p53 ili aberantni BRCA1 ili BRCA2, GDEPT (gensko-usmerena enzimska prolek terapija), kao što su oni koji koriste citozin deaminazu, timidin kinazu ili bakterijski enzim nitroreduktaze i pristupe za povećanje tolerancije pacijenata na hemoterapiju ili radioterapiju, kao što je genska terapija rezistencijom na više lekova.

[0176] Shodno tome, u jednom otelotvorenju je pruženo jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, i dodatna anti-tumorska supstanca za zajednički tretman raka.

[0177] U skladu sa ovim aspektom specifikacije, pružena je kombinacija pogodna za upotrebu u tretmanu raka koja sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i drugi agens protiv tumora, naročito bilo koji od agenasa protiv tumora koji navedeni pod (i)-(xi) iznad. Naročito, agens protiv tumora naveden pod (i)-(xi) iznad predstavlja standard nege za specifični rak koji se tretira; osoba koja je vešta u ovoj oblasti razumeće značenje „standarda nege“.

[0178] Zbog toga je u narednom aspektu specifikacije pruženo jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, u kombinaciji sa drugim agensom protiv tumora, posebno agens protiv tumora izabran od onih koji su navedeni pod (i)-(xi) iznad.

[0179] U narednom aspektu specifikacije pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, u kombinaciji sa drugim agensom protiv tumora, posebno agens protiv tumora izabran od onih koji su navedeni pod (i) iznad.

[0180] U narednom aspektu specifikacije pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, i bilo koji od agenasa protiv tumora navedenih pod (i) iznad.

[0181] U narednom aspektu ove specifikacije pružena je kombinacija pogodna za upotrebu u tretmanu raka koja sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i taksoid, poput na primer taksola ili taksotera, pogodno taksoter.

[0182] U narednom aspektu specifikacije pruženo je jedinjenje Formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, u kombinaciji sa drugim agensom protiv tumora, posebno agensom protiv tumora izabranim od onih koji su navedeni pod (ii) iznad.

[0183] U narednom aspektu ove specifikacije pružena je kombinacija pogodna za upotrebu u tretmanu raka koja sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i bilo koji od anti-hormonalnih agenasa navedenih pod (ii) iznad, na primer bilo koji od antiestrogena navedenih pod (ii) iznad, ili na primer inhibitor aromataze naveden pod (ii) iznad.

[0184] U narednom aspektu specifikacije pružena je kombinacija pogodna za upotrebu u tretmanu raka koja sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i mTOR inhibitor, kao što je AZD2014.

[0185] U narednom aspektu specifikacije pružena je kombinacija pogodna za upotrebu u tretmanu raka koja sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i inhibitor PI3Kα, kao što je jedinjenje 1-(4-(5-(5-amino-6-(5-terc-butil-1,3,4-oksadiazol-2-il)pirazin-2-il)-1-etil-1H-1,2,4-triazol-3-il)piperidin-1-il)-3-hidroksipropan-1-on, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0186] U narednom aspektu ove specifikacije pružena je kombinacija pogodna za upotrebu u tretmanu raka koja sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i CDK4/6 inhibitor, kao što je palbociklib.

[0187] U jednom aspektu, gore navedena kombinacija jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, sa agensom protiv tumora navedenim pod (ii) iznad, ili mTOR inhibitorom (poput AZD2014), ili PI3K-α inhibitorom (kao što je jedinjenje 1-(4-(5-(5-amino-6-(5-terc-butil-1,3,4-oksadiazol-2-il)pirazin-2-il)-1-etil-1H-1,2,4-triazol-3-il)piperidin-1-il)-3-hidroksipropan-1-on) ili CDK4/6 inhibitorom (kao što je palbociklib), pogodna je za upotrebu u tretmanu raka dojke ili ginekoloških bolesti, poput raka dojke, endometrijuma, jajnika ili grlića materice, posebno raka dojke, kao što je ER+ve rak dojke.

[0188] Ovde, gde se koristi izraz „kombinacija“, treba razumeti da se to odnosi na istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu. U jednom aspektu specifikacije „kombinacija“ se odnosi na istovremenu primenu. U drugom aspektu specifikacije, „kombinacija“ se odnosi na odvojenu primenu. U narednom aspektu specifikacije, „kombinacija“ se odnosi na sekvencijalnu primenu. Ako je primena sekvencijalna ili odvojena, kašnjenje u primeni druge komponente ne bi trebalo da bude takvo da se izgubi korisni efekat kombinacije. Kada se kombinacija dve ili više komponenti primenjuje odvojeno ili sekvencijalno, razumeće se da režim doziranja za svaku komponentu može biti različit i nezavisan od ostalih komponenti. Povoljno je da se jedinjenja iz ove specifikacije doziraju jednom dnevno.

[0189] Prema narednom aspektu specifikacije, predviđen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so u kombinaciji sa agensom protiv tumora odabranim od onih koji su navedeni pod (i)-(xi) iznad, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0190] Prema narednom aspektu specifikacije, predviđen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so u kombinaciji sa bilo kojim od anti-hormonalnih agenasa navedenih pod (ii) iznad, na primer bilo kojim od anti-estrogena navedenih pod (ii) iznad, ili na primer inhibitor aromataze naveden pod (ii) iznad, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0191] U narednom aspektu specifikacije pružen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i mTOR inhibitor, kao što je AZD2014, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0192] U narednom aspektu specifikacije pružen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i PI3Kα-inhibitor, kao što je jedinjenje 1-(4-(5-(5-amino-6-(5-terc-butil-1,3,4-oksadiazol-2-il)pirazin-2-il)-1-etil-1H-1,2,4-triazol-3 -il)piperidin-1-il)-3 - hidroksipropan-1-on, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0193] U narednom aspektu specifikacije pružen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i CDK4/6 inhibitor (kao što je palbociklib) u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0194] Prema narednom aspektu specifikacije, predviđen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa agensom protiv tumora odabranim od onih koji su navedeni pod (i)-(xi) iznad, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom za upotrebu u tretmanu raka.

[0195] Prema narednom aspektu specifikacije, predviđen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa bilo kojim od anti-hormonalnih agenasa navedenih pod (ii) iznad, na primer bilo kojim od anti-estrogena navedenih pod (ii) iznad, ili na primer inhibitor aromataze naveden pod (ii) iznad, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom za upotrebu u tretmanu raka.

[0196] U narednom aspektu specifikacije pružen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i mTOR inhibitor, kao što je AZD2014, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom za upotrebu u tretmanu raka.

[0197] U narednom aspektu specifikacije pružen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i PI3Kα-inhibitor, kao što je jedinjenje 1-(4-(5-(5-amino-6-(5-terc-butil-1,3,4-oksadiazol-2-il)pirazin-2-il)-1-etil-1H-1,2,4-triazol-3-il)piperidin-1-il)-3-hidroksipropan-1-on, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom za primenu u tretmanu raka.

[0198] U narednom aspektu specifikacije pružen je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i inhibitor CDK4/6 (poput palbocikliba) u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom za upotrebu u tretmanu raka.

[0199] U jednom aspektu, gore navedeni farmaceutski sastavi jedinjenja Formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, sa agensom protiv tumora navedenim pod (ii) iznad, ili mTOR inhibitorom (poput AZD2014), ili PI3K-α inhibitorom (kao što je jedinjenje 1-(4-(5-(5-amino-6-(5-terc-butil-1,3,4-oksadiazol-2-il)pirazin-2-il)-1-etil-1H-1,2,4-triazol-3-il)piperidin-1-il)-3-hidroksipropan-1-on) ili CDK4/6 inhibitorom (kao što je palbociklib), pogodni su za upotrebu u tretmanu raka dojke ili ginekoloških bolesti, poput raka dojke, endometrijuma, jajnika ili grlića materice, posebno raka dojke, kao što je ER+ve rak dojke.

[0200] U jednom aspektu, gore navedene kombinacije i farmaceutski sastavi se koriste za tretman raka dojke ili ginekoloških rakova, poput raka dojke, endometrijuma, jajnika ili grlića materice, posebno raka dojke, kao što je ER+ve rak dojke.

[0201] Takođe je opisan komplet koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so u kombinaciji sa agensom protiv tumora odabranim od gore navedenog pod (i)-(xi).

[0202] Takođe je opisan komplet koji sadrži jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so u kombinaciji sa agensom protiv tumora odabranim od gore navedenog pod (i) ili (ii).

[0203] Takođe je opisan komplet koji sadrži:

a) jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so u prvom jediničnom doznom obliku;

b) agens protiv tumora izabran od jednog navedenog pod (i)-(xi) iznad u drugom jediničnom doznom obliku; i

c) kontejner koji sadrži navedene prve i druge dozne oblike.

[0204] Takođe je opisan komplet koji sadrži:

a) jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so u prvom jediničnom doznom obliku;

b) agens protiv tumora izabran od jednog od navedenih iznad pod (i)-(ii) u drugom jediničnom doznom obliku; i

c) kontejner koji sadrži navedene prve i druge dozne oblike.

[0205] Takođe je opisan komplet koji sadrži:

a) jedinjenje Formule (I), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so u prvom jediničnom doznom obliku;

b) agens protiv tumora izabran od anti-tumorskog agensa navedenog pod (ii) iznad, mTOR inhibitora (poput AZD2014), PI3Kα-inhibitora, kao što je jedinjenje 1-(4-(5-(5-amino-6-(5-terc-butil-1,3,4-oksadiazol-2-il)pirazin-2-il)-1-etil-1H-1,2,4-triazol-3-il)piperidin-1-il)-3-hidroksipropan-1-on i CDK4/6 inhibitora, kao što je palbociklib, u drugom jediničnom doznom obliku; i

c) kontejner koji sadrži navedene prve i druge dozne oblike.

[0206] Kombinovana terapija kao što je gore opisano može se dodati iznad standardne terapije nege koja se obično sprovodi u skladu sa svojim uobičajenim rasporedom prepisivanja.

[0207] Iako su jedinjenja Formule (I) prvenstveno vredna kao terapeutska agensi za upotrebu kod toplokrvnih životinja (uključujući čoveka), ona su takođe korisna kad god je potrebno inhibirati ER-α. Stoga su korisna kao farmakološki standardi za upotrebu u razvoju novih bioloških testova i u potrazi za novim farmakološkim lekovima.

Personalizovana zdravstvena nega

[0208] Drugi aspekt ove specifikacije zasnovan je na identifikovanju veze između statusa gena koji kodira ERa i potencijalne osetljivosti na tretmane jedinjenjem Formule (I).

Naročito, status ERa gena može ukazivati na to da pacijent ima manju verovatnoću da reaguje na postojeću hormonsku terapiju (kao što su inhibitori aromataze), barem delom zato što se neke ERa mutacije ipak javljaju kao mehanizmi rezistencije na postojeće tretmane. SERD, posebno SERD koji se može primenjivati oralno u potencijalno većim dozama bez prekomerne nelagodnosti, može se tada korisno koristiti za tretman pacijenata sa ERa mutacijama koji mogu biti otporni na druge terapije. Ovo pruža mogućnosti, postupke i alate za izbor pacijenata za tretman jedinjenjem Formule (I), posebno pacijenata obolelih od raka. Ova specifikacija se odnosi na alate i postupke odabira pacijenata (uključujući personalizovani lek). Odabir se zasniva na tome da li ćelije tumora koje se tretiraju poseduju divlji tip ili mutirani ERa gen. Status ERa gena može se, dakle, koristiti kao biomarker kako bi se pokazalo da li odabir tretmana sa SERD može biti koristan. kako bi se izbegla sumnja, smatra se da su jedinjenja Formule (I), kao što je ovde opisano, slično aktivna u odnosu na divlji tip i mutirane ERa gene, barem one mutacije u ERa genu identifikovane na dan podnošenja ove prijave.

[0209] Postoji jasna potreba za biomarkerima koji će obogatiti ili odabrati pacijente čiji će tumori odgovoriti na tretmane sa SERD, kao što je jedinjenje Formule (I). Biomarkeri za odabir pacijenata koji identifikuju pacijente koji najbrže reaguju na jedan agens u odnosu na drugi, idealni su za tretman raka, jer smanjuju nepotrebno tretmane pacijenata sa tumorima koji ne reaguju na potencijalne nuspojave takvih agenasa.

[0210] Biomarker se može opisati kao „karakteristika koja se objektivno meri i procenjuje kao pokazatelj normalnih bioloških procesa, patogenih procesa ili farmakoloških odgovora na terapijsku intervenciju“. Biomarker je bilo koji prepoznatljiv i merljiv indikator povezan sa određenim stanjem ili bolešću gde postoji povezanost između prisustva ili nivoa biomarkera i nekog aspekta stanja ili bolesti (uključujući prisustvo, nivo ili nivo promene, tip, stadijum, osetljivost na stanje ili bolest, ili osetljivost na lek koji se koristi za tretman stanja ili bolesti). Korelacija može biti kvalitativna, kvantitativna ili i kvalitativna i kvantitativna. Obično je biomarker jedinjenje, fragment jedinjenja ili grupa jedinjenja. Takva jedinjenja mogu biti bilo koja jedinjenja koja se nalaze u organizmu ili ih organizam proizvodi, uključujući proteine (i peptide), nukleinske kiseline i druga jedinjenja.

[0211] Biomarkeri mogu imati prediktivnu moć i kao takvi se mogu koristiti za predviđanje ili otkrivanje prisustva, nivoa, tipa ili stadijuma određenih stanja ili bolesti (uključujući prisustvo ili nivo određenih mikroorganizama ili toksina), osetljivosti (uključujući genetsku osetljivost) na određena stanja ili bolesti ili odgovor na određene tretmane (uključujući tretmane lekovima). Smatra se da će biomarkeri igrati sve važniju ulogu u budućnosti otkrivanja i razvoja lekova, poboljšavajući efikasnost programa istraživanja i razvoja.

Biomarkeri se mogu koristiti kao dijagnostička agensi, za praćenje napredovanja bolesti, praćenje tretmana i kao prediktori kliničkog ishoda. Na primer, razni istraživački projekti za biomarkere pokušavaju da identifikuju markere specifičnih rakova i specifičnih kardiovaskularnih i imunoloških bolesti. Veruje se da će razvoj novih potvrđenih biomarkera dovesti do značajnih smanjenja troškova zdravstvene nege i razvoja lekova, kao i do značajnih poboljšanja u tretmanu za širok spektar bolesti i stanja.

[0212] Kako bi se optimalno dizajnirala klinička ispitivanja i od njih dobio maksimum informacija, možda će biti potreban biomarker. Marker se može meriti u surogatima i tumorskim tkivima. U idealnom slučaju ovi markeri će takođe biti u korelaciji sa efikasnošću i na taj način bi se na kraju mogli koristiti za odabir pacijenata.

[0213] Prema tome, tehnički problem koji stoji u ovom aspektu ove specifikacije je identifikacija načina za stratifikaciju pacijenata za tretman jedinjenjem Formule (I). Tehnički problem je rešen pružanjem otelotvorenja okarakterisanih u patentnim zahtevima i/ili opisu.

[0214] Smatra se da su tumori koji sadrže divlji tip ERa podložni tretmanu jedinjenjem Formule (I), na primer kao tretman prve linije. Tumori mogu takođe da reaguju na tretmane jedinjenjem Formule (I) kao druga linija, treća linija ili naknadna terapija i to može biti korisno, naročito tamo gde tumori sadrže mutiran ERa i stoga mogu biti otporni na postojeće terapije kao što su kao AI. Veća doza jedinjenja Formule (I) može biti potrebna u rezistentnom okruženju nego kod tumora divljeg tipa.

[0215] Specifikacija pruža postupak za određivanje osetljivosti ćelija na jedinjenje Formule (I). Postupak uključuje utvrđivanje statusa ERa gena u navedenim ćelijama. Ćelija je definisana kao osetljiva na jedinjenje Formule (I) ako inhibira povećanje broja ćelija u testu rasta ćelije (bilo putem inhibicije ćelijske proliferacije i/ili povećanjem ćelijske smrti).

Postupci specifikacije su korisni za predviđanje koje ćelije imaju veću verovatnoću da odgovore na jedinjenje Formule (I) inhibiranjem rasta.

[0216] Uzorak „reprezentativan za tumor“ može biti izolovan stvarni uzorak tumora, ili može biti uzorak koji je dalje obrađen, npr. uzorak PCR-pojačane nukleinske kiseline iz uzorka tumora.

Definicije:

U ovom odeljku o personalizovanoj zdravstvenoj zaštiti:

[0217]

„Alel“ se odnosi na određeni oblik genetskog lokusa, koji se od ostalih oblika razlikuje po njegovom posebnom nizu nukleotida ili aminokiselina.

„Reakcije pojačavanja“ su reakcije nukleinske kiseline koje rezultuju specifičnim pojačavanjem ciljanih nukleinskih kiselina u odnosu na nukleinske kiseline koje nisu ciljane. Polimerna lančana reakcija (PCR) je dobro poznata reakcija pojačavanja.

„Rak“ se ovde koristi za označavanje neoplastičnog rasta koji potiče od ćelijske transformacije u neoplastični fenotip. Takva ćelijska transformacija često uključuje genetsku mutaciju.

„Gen“ je segment DNK koji sadrži sve informacije za regulisanu biosintezu RNK proizvoda, uključujući promoter, eksone, introne i druge elemente sekvence koji se mogu nalaziti u 5' ili 3' bočnim regionima (a ne unutar transkribovanih delovi gena) koji kontrolišu eksprimiranje. „Status gena“ odnosi se na to da li je gen divljih vrsta ili ne (tj. mutant).

„Oznaka“ se odnosi na sastav koji može da proizvede detektabilni signal koji ukazuje na prisustvo ciljanog polinukleotida u test uzorku. Pogodne oznake uključuju radioizotope, nukleotidne hromofore, enzime, supstrate, fluorescentne molekule, hemiluminescentne delove, magnetne čestice, bioluminescentne delove i slično. Kao takva, oznaka je bilo koji sastav koji se može otkriti spektroskopskim, fotohemijskim, biohemijskim, imunohemijskim, električnim, optičkim ili hemijskim agensima.

„Nesinonimna varijacija“ odnosi se na varijaciju (varijansu) kodiranja ili preklapanja kodirajuće sekvence gena koja rezultuje proizvodnjom različite (izmenjene) polipeptidne sekvence. Ove varijacije mogu ali ne moraju uticati na funkciju proteina i uključuju varijante promene smisla (rezultujući supstitucijom jedne aminokiseline drugom), besmislene varijante (što rezultuje skraćenim polipeptidom usled stvaranja preuranjenog zaustavnog kodona) i varijante ubacivanja/brisanja.

„Sinonimna varijacija“ odnosi se na varijaciju (varijansu) kodirajuće sekvence gena koja ne utiče na sekvencu kodiranog polipeptida. Ove varijacije mogu indirektno uticati na funkciju proteina (na primer, promenom eksprimiranja gena), ali, u nedostatku dokaza za suprotno, obično se pretpostavlja da su neškodljive.

„Nukleinska kiselina“ se odnosi na jednolančane ili dvolančane molekule DNK i RNK, uključujući prirodne nukleinske kiseline koje se nalaze u prirodi i/ili na modifikovane, veštačke nukleinske kiseline koje imaju modifikovane kičme ili baze, kao što je poznato u struci.

„Prajmer“ se odnosi na jednolančanu DNK oligonukleotidnu sekvencu koja može delovati kao tačka inicijacije za sintezu proizvoda produžavanja prajmera koji je komplementaran u lancu nukleinske kiseline koji treba kopirati. Dužina i redosled prajmera moraju biti takvi da su u stanju da primene sintezu proizvoda produžavanja. Tipični prajmer sadrži najmanje oko 7 nukleotida u dužini sekvence koja je značajno komplementarna ciljanoj sekvenci, ali poželjni su nešto duži prajmeri. Obično prajmeri sadrže oko 15-26 nukleotida, ali mogu se koristiti i duži ili kraći prajmeri.

„Polimorfno mesto“ je položaj unutar lokusa u kom su u populaciji pronađene najmanje dve alternativne sekvence.

„Polimorfizam“ se odnosi na promenu sekvenci opaženu kod pojedinca na polimorfnom mestu. Polimorfizmi uključuju nukleotidne supstitucije, ubacivanja, brisanja i mikrosatelite i mogu, ali ne moraju, da rezultuju uočljivim razlikama u eksprimiranju gena ili funkciji proteina. U nedostatku dokaza o uticaju na eksprimiranje ili funkciju proteina, uobičajeni polimorfizmi, uključujući nesinonimne varijante, generalno se smatraju uključenim u definiciju gena sekvence divljeg tipa. NCBI vodi katalog ljudskih polimorfizama i pridružene napomene, uključujući validaciju, posmatrane frekvencije i povezanost sa bolestima (dbSNP: http://www.ncbi.nlm.nlh.gov/projects/SNP/). Treba napomenuti da se izraz „polimorfizam“, kada se koristi u kontekstu sekvence gena, ne treba mešati sa izrazom „polimorfizam“ kada se koristi u kontekstu čvrstog stanja jedinjenja koje je kristalne ili amorfne prirode. Stručnjak će razumeti predviđeno značenje u kontekstu.

„Sonda“ se odnosi na jednolančane specifične oligonukleotide koji imaju sekvencu koja je tačno komplementarna ciljanoj sekvenci alela koji treba da bude detektovan.

„Odgovor“ se definiše merenjima urađenim prema kriterijumima za procenu odgovora u čvrstim tumorima (RECIST) koji uključuju klasifikaciju pacijenata u dve glavne grupe: oni koji pokazuju parcijalni odgovor ili stabilnu bolest i oni koji pokazuju znakove progresivne bolesti.

„Strogi uslovi hibridizacije“ odnosi se na inkubaciju preko noći na 42°C u rastvoru koji sadrži 50% formamid, 5x SSC (750 mM NaCI, 75 mM trizodrijum-citrata), 50 mM natrijumfosfata (pH 7,6), 5x Denhardt-ov rastvor, 10% dekstran sulfata i 20 pg/ml denaturisane, cepane DNK sperme lososa, praćeno filtriranjem u 0,1x SSC na oko 65°C.

„Preživljavanje“ obuhvata opšti opstanak i preživljavanje bez progresije.

„Opšti opstanak“ (OS) definiše se kao vreme od započinjanja primene lekova do smrti od bilo kog uzroka. Preživljavanje bez progresije (PFS) definiše se kao vreme od početka primene lekova do prve pojave progresivne bolesti ili smrti od bilo kog uzroka.

[0218] Ovde je opisan postupak odabira pacijenata za tretman jedinjenjem Formule (I), gde postupak sadrži pružanje uzorka koji sadrži ćeliju tumora od pacijenta; određivanje da li je ERa gen u uzorku koji sadrži ćeliju tumora od pacijenta divljeg tipa ili mutant; i odabir pacijenata za tretman jedinjenjem Formule (I) na osnovu toga.

[0219] Postupak može uključivati ili isključiti stvarni korak izolacije uzorka pacijenta. Prema tome, prema jednom aspektu specifikacije pružen je postupak odabira pacijenata za tretman jedinjenjem Formule (I), gde postupak uključuje utvrđivanje da li je ERa gen u uzorku koji sadrži ćeliju tumora od pacijenta divljeg tipa ili mutant; i odabir pacijenata za tretman jedinjenjem Formule (I) na osnovu toga.

[0220] Pacijent može biti odabran za tretman jedinjenjem Formule (I) ako DNK tumorskih ćelija ima mutirani ERa gen. Pacijent čija DNK tumorskih ćelija poseduje divlji tip ERa gena može biti izabran za tretman jedinjenjem Formule (I).

[0221] U svrhu ove specifikacije, status gena divljeg tipa podrazumeva normalno ili odgovarajuće eksprimiranje gena i normalnu funkciju kodiranog proteina. Suprotno tome, status mutanata podrazumeva eksprimiranje proteina sa izmenjenom funkcijom, u skladu sa poznatim ulogama mutiranih ERa gena u raku (kao što je ovde opisano). Bilo koji broj genetskih ili epigenetskih promena, uključujući mutaciju, pojačavanje, brisanje, genomsko preuređivanje ili promene profila metilacije, može rezultovati mutantnim statusom. Međutim, ako takve promene ipak rezultuju odgovarajućim eksprimiranjem normalnog proteina ili funkcionalno ekvivalentnom varijantom, tada se status gena smatra divljim tipom. Primeri varijanti koje obično ne bi rezultovale funkcionalnim mutiranim statusom gena uključuju varijante sinonimnog kodiranja i uobičajene polimorfizme (sinonimne ili nesinonimne). Kao što je razmatrano u nastavku, status gena može se proceniti funkcionalnim testom, ili se može zaključiti iz prirode detektovanih odstupanja od referentne sekvence.

[0222] Status divljeg tipa ili mutiranog ERα gena određuje se prisustvom ili odsustvom nesinonimnih varijacija nukleinskih kiselina u genima. Posmatrane nesinonimne varijacije koje odgovaraju poznatim uobičajenim polimorfizmima bez naznačenih funkcionalnih efekata ne doprinose statusu mutiranog gena.

[0223] Ostale varijacije Era gena koje označavaju status mutanta uključuju varijacije na mestu spajanja koje smanjuju prepoznavanje intron/egzon veze tokom obrade pre-mRNK do mRNK. To može rezultovati preskakanjem egzona ili uključivanjem normalno intronske sekvence u splajsovanu mRNK (zadržavanje introna ili korišćenje kriptičnih spojnica splajsovanja). Ovo zauzvrat može rezultovati proizvodnjom aberantnog proteina sa ubacivanjem i/ili brisanjem u odnosu na normalan protein. Tako, u primerima, gen ima status mutanta ako postoji varijanta koja menja sekvencu prepoznavanja mesta splajsovanja na intron/egon spoju.

[0224] Za ESR1, referentne sekvence su dostupne za gen (GenBank pristupni broj:

NG_008493), mRNK (GenBank pristupni broj: NM_000125) i protein (GenBank pristupni broj: NP_000116 ili Swiss-Prot pristupni: P03372). Stručnjak će moći da odredi status gena ESR1, tj. da li je određeni ESR1gen divljeg tipa ili mutant, na osnovu poređenja DNK ili proteinske sekvence sa divljim tipom.

[0225] Biće očigledno da su sekvence gena i mRNK otkrivene za gen Era reprezentativne sekvence. Kod normalnih pojedinaca postoje dve kopije svakog gena, majčinska i očinska kopija, koje će verovatno imati neke razlike u sekvenci, štaviše, u populaciji će postojati brojne alelne varijante genske sekvence. Ostale sekvence koje se smatraju divljim tipom uključuju one koji poseduju jednu ili više sinonimnih promena u sekvenci nukleinske kiseline (promene koje ne menjaju kodiranu sekvencu proteina), nesinonimne uobičajene polimorfizme (npr. germlinijski polimorfizmi) koji menjaju sekvencu proteina, ali ne utiču na funkciju proteina, i promene intronskih sekvenci koje nisu mesto splajsovanja.

[0226] Brojne tehnike su na raspolaganju stručnjaku da utvrdi genski status ERα. Genski status može se odrediti određivanjem sekvence nukleinske kiseline. To se može desiti direktnim sekvenciranjem gena pune dužine ili analizom određenih mesta unutar gena, npr. često mutirane lokacije.

Uzorci

[0227] Uzorak pacijenta koji se testira na status gena može biti bilo koje tumorsko tkivo ili uzorak koji sadrži ćelije tumor koji je dobijen ili se može dobiti od pojedinca. Test uzorak pogodno je uzorak krvi, brisa iz usta, biopsije ili druge telesne tečnosti ili tkiva dobijenih od pojedinca. Konkretni primeri uključuju: cirkulišuće ćelije tumora koje, cirkulišuću DNK u plazmi ili serumu, ćelije izolovane iz tečnosti ascitesa pacijenata sa rakom jajnika, plućni ispljuvak za pacijente sa tumorima u plućima, aspirat sitnom igla pacijenta sa rakom dojke, mokraću, perifernu krv, strugane ćelija, folikule dlake, probiranje kože ili bukalni uzorak.

[0228] Razumeće se da test uzorak može jednako biti sekvenca nukleinske kiseline koja odgovara sekvenci u test uzorku, to jest da se ceo ili deo regiona u uzorku nukleinske kiseline mogu pre analize najpre amplifikovati upotrebom bilo koje pogodne tehnike, npr. lančanom reakcijom polimeraze (PCR). Nukleinska kiselina može biti genomska DNK ili fragmentisana ili cela ćelijska RNK. U posebnim slučajevima RNK je cela ćelijska RNK i koristi se direktno kao obrazac za obeležavanje cDNK prvog lanca pomoću slučajnih prajmera ili poli A prajmera. Nukleinska kiselina ili protein iz test uzorka mogu se izvući iz uzorka prema standardnim metodologijama (pogledati Green & Sambrook, Eds.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2012, četvrto izdanje, Vol. 1-3, ISBN 9781936113422), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)

[0229] Opisani dijagnostički postupci mogu se preduzeti korišćenjem uzorka prethodno uzetog od pojedinca ili pacijenta. Takvi uzorci se mogu sačuvati zamrzavanjem ili fiksirati i ugraditi u formalin-parafin ili druge podloge. Alternativno, može se dobiti i koristiti sveža tumorska ćelija koja sadrži uzorak.

[0230] Opisani postupci se mogu primeniti pomoću ćelija bilo kog tumora. Pogodni tumori za tretman jedinjenjem Formule (I) su prethodno opisani.

Postupci detektovanja nukleinskih kiselina

[0231] Detektovanje nukleinskih kiselina mutiranog ERα može se koristiti, u kontekstu ove specifikacije, za izbor tretmana lekovima. Pošto se mutacije u tim genima dešavaju na nivou DNK, postupci specifikacije mogu se zasnivati na detektovanju mutacija ili varijacija genomske DNK, kao i na transkriptima i samim proteinima. Može biti poželjno da se mutacije genomske DNK potvrde analizom transkripata i/ili polipeptida, kako bi se osiguralo da je otkrivena mutacija zaista eksprimirana kod pacijenta.

[0232] Stručnjaku će biti očigledno da postoji veliki broj analitičkih postupaka koji se mogu koristiti za detektovanje prisustva ili odsustva varijanti nukleotida na jednom ili više položaja u genu. Uopšte, detektovanje varijacija alela zahteva tehniku diskriminacije mutacija, opciono reakciju pojačanja (poput one zasnovane na lančanoj reakciji polimeraze) i opciono sistem za generisanje signala. U oblasti tehnike je dostupno mnoštvo tehnika detektovanja mutacija i one se mogu koristiti u kombinaciji sa sistemom generisanja signala, od kojih su brojni dostupni u struci. Mnogi postupci za detektovanje varijacija alela su pregledani kod Nollau i dr., Clin. Chem., 1997, 43, 1114-1120; Anderson SM. Expert Rev Mol Diagn., 2011, 11, 635-642; Meyerson M. i dr., Nat Rev Genet., 2010, 11, 685-696; i u standardnim udžbenicima, kao na primer „Laboratory Protocols for Mutation detektovanje“, Ed. od U. Landegren, Oxford University Press, 1996 i „PCR“, 2. izdanje od Newton & Graham, BIOS Scientific Publishers Limited, 1997.

[0233] Kao što je gore napomenuto, određivanje prisustva ili odsustva određene varijacije ili mnoštva varijacija ERα gena kod pacijenta sa rakom može se izvesti na različite načine. Takvi testovi se obično izvode korišćenjem DNK ili RNK prikupljenih iz bioloških uzoraka, npr. biopsije tkiva, urina, stolice, ispljuvka, krvi, ćelija, delova tkiva, aspirata dojke ili drugih ćelijskih materijala, i mogu se izvesti raznim postupcima, uključujući, ali ne ograničavajući se na PCR, hibridizaciju sondama specifičnim za alele, enzimatsko detektovanje mutacija, hemijsko cepanje neusklađenosti, masenu spektrometriju ili sekvenciranje DNK, uključujući minisekvenciranje.

[0234] Pogodne tehnike detektovanja mutacija uključuju sistem pojačavanje refraktorne mutacije (ARMS™), linearni nastavak sistema za pojačavanje refraktorne mutacije (ALEX™), kompetitivni sistem za prajmovanje oligonukleotida (COPS), Taqman, Molecular Beacons, polimorfizam dužine restrikcionog fragmenta (RFLP) i tehnike PCR zasnovanog na mestu restrikcij i energetski transfer fluorescentne rezonancije (FRET).

[0235] Kao što je ovde opisano, postupak koji se koristi za određivanje nukleotida u biomarker genu odabran je između: alelno specifične pojačavanja (alelni PCR) - kao što je sistem pojačavanje refraktorne mutacije (ARMS), sekvenciranje, test alelne diskriminacije, hibridizacija, polimorfizam dužine restrikcionog fragmenta (RFLP) ili test oligonukleotidne ligacije (OLA).

[0236] Kao što je ovde opisano, hibridizacija sa alelno specifičnim sondama može se izvesti pomoću: (1) alelno specifičnih oligonukleotida vezanih na čvrstu fazu (npr. staklene, silikonske, najlonske membrane) sa obeleženim uzorkom u rastvoru, na primer kao u mnogim primenama DNK čipova; ili (2) vezani uzorak (često klonirana DNK ili PCR pojačana DNK) i obeleženi oligonukleotidi u rastvoru (bilo alelno specifični ili kratki kako bi omogućili sekvenciranje hibridizacijom). Dijagnostički testovi mogu uključivati panel varijacija, često na čvrstom nosaču, što omogućava istovremeno određivanje više od jedne varijanse. Takve hibridizacione sonde su dobro poznate u struci (pogledati, npr., Green & Sambrook, Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2012, četvrto izdanje, Vol.1-3, ISBN 9781936113422), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) i mogu da obuhvataju dva ili više mesta varijanse.

[0237] Kao što je ovde opisano, detektovanje prisustva ili odsustva bar jedne mutacije omogućava dovođenje u dodir nukleinske kiseline ERα koja sadrži pretpostavljeno mesto mutacije sa najmanje jednom sondom nukleinske kiseline. Sonda poželjno hibridizuje sa sekvencom nukleinske kiseline koja uključuje mesto varijanse i sadrži komplementarne nukleotidne baze na mestu varijanse pod uslovima selektivne hibridizacije. Hibridizacija se može otkriti detektabilnom oznakom upotrebom oznaka poznatih stručnjacima. Takve oznake uključuju, ali nisu ograničene na radioaktivne, fluorescentne oznake, boje i enzimske oznake.

[0238] Kao što je ovde opisano, detektovanje prisustva ili odsustva najmanje jedne mutacije omogućava dovođenje u dodir ERα nukleinske kiseline koja sadrži pretpostavljeno mesto mutacije sa najmanje jednim prajmerom nukleinske kiseline. Prajmer se poželjno hibridizuje sa sekvencom nukleinske kiseline koja uključuje mesto varijanse i sadrži komplementarne nukleotidne baze na mestu varijanse pod uslovima selektivne hibridizacije.

[0239] Oligonukleotidi koji se koriste kao prajmeri za specifično pojačavanje mogu nositi komplementarnu nukleotidnu bazu do mutacije od interesa u centru molekule (tako da pojačavanje zavisi od diferencijalne hibridizacije; pogledati npr. Gibbs, i dr., 1989. Nucl. Acids Res., 17, 2437-248) ili na krajnjem 3'-terminusu jednog prajmera gde, pod odgovarajućim uslovima, neusklađivanje može sprečiti ili smanjiti ekstenziju polimeraze (pogledati npr. Prossner, 1993, Tibtech, 11238).

[0240] Kao što je ovde opisano, detektovanje prisustva ili odsustva najmanje jedne mutacije obuhvata sekvencioniranje najmanje jedne sekvence nukleinske kiseline i upoređivanje dobijene sekvence sa poznatom sekvencom nukleinske kiseline divljeg tipa.

[0241] Alternativno, prisustvo ili odsustvo najmanje jedne mutacije obuhvata maseno spektrometrijsko određivanje najmanje jedne sekvence nukleinske kiseline.

[0242] Kao što je ovde opisano, detektovanje prisustva ili odsustva bar jedne varijanse nukleinske kiseline obuhvata izvođenje lančane reakcije polimeraze (PCR). Pojačana je ciljana sekvenca nukleinske kiseline koja sadrži hipotetičku varijansu i utvrđena je nukleotidna sekvenca pojačane nukleinske kiseline. Određivanje nukleotidne sekvence pojačane nukleinske kiseline sadrži sekvencioniranje najmanje jednog segmenta nukleinske kiseline. Alternativno, proizvodi za pojačavanje mogu biti analizirani bilo kojim postupkom koji je sposoban da razdvoji proizvode prema pojačavanja njihovoj veličini, uključujući automatizovanu i ručnu elektroforezu gela i slično.

[0243] Mutacije genomske nukleinske kiseline pogodno su detektovane tehnikama zasnovanim na pomaku mobilnosti u pojačanim fragmentima nukleinske kiseline. Na primer, Chen i dr., Anal Biochem 1996, 239, 61-9, opisuju detektovanje jedno-baznih mutacija kompetitivnim testom pomaka mobilnosti. Štaviše, analize zasnovane na tehnici pd Marcelino i dr., BioTechniques 1999, 26, 1134-1148 dostupni su komercijalno.

[0244] U posebnom primeru, kapilarna heterodupleks analiza može se koristiti za detektovanje prisustva mutacija na osnovu pomaka mobilnosti dupleksnih nukleinskih kiselina u kapilarnim sistemima kao rezultat prisustva neusklađenosti.

[0245] Generisanje nukleinskih kiselina za analizu iz uzoraka generalno zahteva pojačavanje nukleinske kiseline. Mnogi postupci pojačavanja oslanjaju se na enzimsku lančanu reakciju (kao što je lančana reakcija polimeraza, lančana reakcija ligaze ili samoodrživa replikacija sekvence) ili na replikaciju celog ili dela vektora u koji je klonirana. Na primer, pojačavanje prema specifikaciji je eksponencijalno pojačavanje, kao što je pokazano na primer lančanom reakcijom polimeraze.

[0246] Mnogi postupci pojačavanja cilja i signala su opisani u literaturi, na primer, opšti pregledi tih postupaka kod Landegren, U. , i dr., Science, 1988242, 229-237 i Lewis, R., Genetic Engineering News 1990, 10, 54-55. Ovi postupci pojačavanja mogu se koristiti u postupcima naše specifikacije, i uključuju lančanu reakciju polimeraze (PCR), PCR in situ, reakciju pojačavanja ligaze (LAR), hibridizaciju ligaze, Qβ bakteriofagnu replikazu, sistem za pojačavanje na bazi transkripcije (TAS), genomsko pojačavanje sekvenciranjem transkripata (GAWTS), pojačavanje zasnovano na sekvenci nukleinskih kiselina (NASBA) i in situ hibridizacija. Prajmeri pogodni za upotrebu u različitim tehnikama pojačavanja mogu se pripremiti prema postupcima poznatim u struci.

[0247] Lančana reakcija polimeraze (PCR) PCR je postupak pojačavanja nukleinske kiseline opisan, između ostalog, kod U.S. Pat. Nos.4,683,195 i 4,683,202. PCR se sastoji od ponavljanih ciklusa reakcija produženja prajmera nastalih DNK polimerazom. Ciljana DNK je toplotno denaturisana, i hibridizovana su dva oligonukleotida koja vezuju ciljanu sekvencu na suprotnim lancima DNK koja treba da se pojača. Ovi oligonukleotidi postaju prajmeri za upotrebu sa DNK polimerazom. DNK se kopira ekstenzijom prajmera kako bi se napravila druga kopija obe linije. Ponavljanjem ciklusa toplotne denaturacije, hibridizacije i ekstenzije prajmera, ciljana DNK se može pojačati milion puta ili više za oko dva do četiri sata. PCR je molekularno biološki alat koji se mora koristiti zajedno sa tehnikom detektovanja kako bi se odredili rezultati pojačavanja. Prednost PCR je što povećava osetljivost povećavajući količinu ciljane DNK za milion do milijardu puta u približno 4 sata. PCR se može koristiti za pojačavanje bilo koje poznate nukleinske kiseline u dijagnostičkom kontekstu (Mok i dr., Gynaecologic Oncology, 1994, 52: 247-252,).

[0248] Tehnika pojačavanja specifična za alele kao što je Amplification Refractory Mutation System (ARMS™) (Newton i dr., Nucleic Acids Res., 1989, 17, 2503-2516) takođe se može koristiti za detektovanje pojedinačnih mutacija baze. Pod odgovarajućim PCR amplifikacionim uslovima, jedna bazna neusklađenost smeštena na 3'-treminusu prajmera je dovoljna za poželjno pojačavanje savršeno podudarnog alela (Newton i dr., 1989, supra), omogućavajući diskriminaciju srodnih vrsta. Osnova sistema pojačavanja pomoću prethodno opisanih prajmera je da oligonukleotidi sa neusklađenim 3'-ostatkom neće funkcionisati kao prajmeri u PCR pod odgovarajućim uslovima. Ovaj sistem pojačavanja omogućava genotipizaciju isključivo pregledom reakcionih smeša nakon elektroforeze agaroznog gela.

[0249] Analiza proizvoda pojačavanja može se izvršiti bilo kojim postupkom koji je sposoban da razdvoji proizvode pojačavanja prema svojoj veličini, uključujući automatizovanu i ručnu elektroforezu gela, masenu spektrometriju i slično.

[0250] Postupke izolacije, pojačavanja i analize nukleinskih kiselina su rutinski za one koji poznaju ovo područje i primeri protokola se mogu naći, na primer, kod Green & Sambrook, Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2012, četvrto izdanje, Vol.1-3, ISBN 9781936113422), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) Posebno koristan izvor protokola za postupke koje se koriste u PCR pojačavanju je PCR (Basics: From Background to Bench) od strane M. J. McPherson, S. G. Mailer, R. Beynon, C. Howe, Springer Verlag; prvo izdanje (15. oktobar 2000), ISBN: 0387916008.

[0251] Predmetna specifikacija takođe opisuje prediktivne i dijagnostičke komplete koji sadrže degenerisane prajmere za pojačavanje ciljane nukleinske kiseline u genu ERα i uputstva koja sadrže; protokol pojačanja i analizu rezultata. Komplet može alternativno takođe da sadrži pufere, enzime i posude za obavljanje pojačavanja i analizu proizvoda pojačavanja. Komplet takođe može biti komponenta skrininga ili dijagnostičkog kompleta koji sadrži druge alate kao što su DNK mikronizovi ili drugi nosači. Kao što je ovde opisano, komplet takođe pruža jedan ili više kontrolnih šablona, kao što su nukleinske kiseline izolovane iz normalnog uzorka tkiva, i/ili niz uzoraka koji predstavljaju različite varijanse u referentnim genima.

[0252] Kao što je ovde opisano, komplet pruža dva ili više početnih parova, od kojih svaki par može da pojača različito područje referentnog (ERα) gena (svaki region mesto potencijalne varijanse) i na taj način pruži komplet za analizu eksprimiranja više varijansi gena u biološki uzorak u jednoj ili više paralelnih reakcija.

[0253] Prajmeri u kompletima mogu biti označeni, na primer fluorescentno, kako bi se olakšalo detektovanje proizvoda pojačavanja i potom analiza varijansi nukleinskih kiselina. Komplet takođe može omogućiti detektovanje više varijansi u jednoj analizi. Kombinovani komplet će se, dakle, sastojati od prajmera koji mogu amplifikovati različite segmente referentnog gena. Prajmeri mogu biti različito obeleženi, na primer korišćenjem različitih fluorescentnih oznaka, tako da se varijanse razlikuju.

[0254] Kako se ovde koristi, izrazi „efikasnost“ i „delotvornost“ uključuju i farmakološku efikasnost i fiziološku sigurnost. Farmakološka efikasnost odnosi se na sposobnost tretmana da rezultuje željenim biološkim efektom kod pacijenta. Fiziološka sigurnost odnosi se na nivo toksičnosti ili druge štetne fiziološke efekte na nivou ćelije, organa i/ili organizma (koji se često nazivaju sporedni efekti) koji su posledica primene tretmana. „Manje efikasno“ znači da tretman dovodi do terapeutski značajno nižeg nivoa farmakološke efikasnosti i/ili terapeutski višeg nivoa štetnih fizioloških efekata.

[0255] Ovde je takođe opisana upotreba jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za tretman pacijenta obolelog od raka čije su tumorske ćelije identifikovane kao da poseduju mutirani ERα gen.

[0256] Ovde je takođe opisan farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I), za upotrebu u prevenciji i tretmanu raka sa tumorskim ćelijama koje su identifikovane da sadrže mutantni ERα gen.

[0257] Mutirani oblici ERα su određeni/identifikovani na svim položajima u genu.

[0258] Koristeći tumore kao što je rak dojke kao primer, određeni/identifikovani određeni mutirani oblici ERα su oni na pozicijama Ser463Pro, Val543Glu, Leu536Arg, Tyr537Ser, Tyr537Asn i Asp538Gly.

Opis slika

[0259]

Slika 1 prikazuje obrazac rendgenske difrakcije praha za Oblik A od N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina.

Slika 2 prikazuje DSC/TGA termogram za Oblik A od N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina.

Slika 3 prikazuje obrazac rendgenske difrakcije praha za Oblik B od N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina.

Slika 4 prikazuje obrazac rendgenske difrakcije praha za Oblik C od N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina.

Slika 5 prikazuje DSC/TGA termogram za Oblik C od N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina.

Slika 6 prikazuje obrazac rendgenske difrakcije praha za Oblik D od N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina.

Slika 7 prikazuje DSC/TGA termogram za Oblik D od N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina.

Slika 8 prikazuje obrazac rendgenske difrakcije praha za Oblik E od N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina.

Slika 9 prikazuje DSC/TGA termogram za Oblik E od N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina.

Slika 10 prikazuje obrazac rendgenske difrakcije praha za Oblik F od N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina.

Slika 11 prikazuje obrazac rendgenske difrakcije praha za Oblik G od N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina.

Slika 12 prikazuje rezultate studije anti-tumorske efikasnosti ljudskog parentalnog MCF7 ksenografta kod miševa sa N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-aminom.

Slika 13 prikazuje rezultate studije anti-tumorske efikasnosti ljudskog Y537S ESR1 mutant MCF7 ksenografta kod miševa N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-aminom. Slika 14 prikazuje rezultate studije anti-tumorske efikasnosti ljudskog ksenografta CTC174 dobijenog od ljudskog pacijenta raka dojke sa ESR1 mutacijom kod miševa N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-aminom.

Primeri

[0260] Jedinjenja opisana u ovoj specifikaciji dalje su ilustrovana u sledećim primerima. Ovi primeri su dati samo kao ilustracija i nisu ograničavajući. Kao što je navedeno iznad, jedinjenje Formule (I) je jedinjenje iz Primera 17, dalji primeri su referentni primeri dati kao pomoć kvalifikovanom čitaocu. Uopšteno:

(i) radnje su izvedene na sobnoj temperaturi, tj. u opsegu od 17 do 25°C i u atmosferi inertnog gasa, kao što je azot, osim ako nije drugačije navedeno;

(ii) isparavanje je izvršeno rotacionim isparavanjem ili korišćenjem Genevac opreme ili Biotage v10 isparivača u vakuumu i postupci obrade su izvršeni nakon uklanjanja zaostalih čvrstih materija filtracijom;

(iii) pročišćavanje fleš hromatografije izvršeno je na automatizovanom Teledyne Isco CombiFlash® Rf ili Teledyne Isco CombiFlash® Companion® upotrebom unapred pripremljenih RediSep Rf Gold™ silika kolona (20-40 µm, sferne čestice), GraceResolv™ patrona (Davisil® silica) ili Silicycle patrona (40 - 63 µm).

(iv) preparativna hromatografija izvedena je na Gilson prep HPLC instrumentu sa UV prikupljanjem ili preko superkritične tečnosti hromatografijom izvedenom na Waters Prep 100 SFC-MS instrumentu MS- i UV- izazvanim prikupljanjem ili Thar MultiGram III SFC instrumentom sa UV prikupljanjem;

(v) hiralna preparativna hromatografija izvedena je na Gilson instrumentu sa UV prikupljanjem (233 injektor/sakupljač fragmenata, 333 i 334 pumpe, 155 UV detektor) ili Varian Prep Star instrumentu (2 x pumpe SD1, 325 UV detektor, 701 sakupljač fagmenata) pumpa koja radi sa Gilson 305 injekcijom;

(vi) prinosi, ako su prisutni, nisu nužno maksimalno ostvarivi;

(vii) uopšteno, strukture krajnjih proizvoda Formule I su potvrđene spektroskopijom nuklearne magnetne rezonance (NMR); Vrednosti NMR hemijskog pomaka su merene na delta skali [spektri protonske magnetne rezonance su određeni korišćenjem Bruker Avance 500 (500 MHz) ili Bruker Avance 400 (400 MHz) instrumenta]; merenja su vršena na sobnoj temperaturi, osim ako nije drugačije određeno; korišćene su sledeće skraćenice: s, singlet; d, dublet; t, triplet; k, kvartet; m, multiplet; dd, dublet dubleta; ddd, dublet dubleta dubleta; dt, dublet tripleta; bs, široki signal

(viii) krajnji proizvodi Formule I su takođe karakterisani masenom spektroskopijom posle tečne hromatografije (LCMS ili UPLC); UPLC je izveden koristeći Waters UPLC opremljen sa Waters SQ masenim spektrometrom (temp. kolone 40, UV = 220-300 nm, maseni spektar = ESI sa pozitivnim/negativnim prebacivanjem) pri brzini protoka od 1 ml/min koristeći sistem rastvarača od 97% A 3% B do 3% A do 97% B tokom 1,50 minuta (ukupno vreme izvođenja sa ravnotežom do početnih uslova itd.1,70min), gde je A = 0,1% mravlje kiseline u vodi (za rad sa kiselinama) ili 0,1% amonijaka u vodi (za baznu obradu) B = acetonitril. Za analizu kiseline korišćena je kolona Waters Acquity HSS T31,8 um 2,1 x 50 mm, i za baznu analizu korišćena je kolona Waters Acquity BEH 1,7 μm 2,1 x 50 mm; LCMS je izveden upotrebom Waters Alliance HT (2795) opremljenog sa Waters ZQ ESCi masenim spektrometrom i Phenomenex Gemini -NX (50x2,1mm 5 µm) kolonom pri protoku od 1,1 ml/min 95% A do 95% B tokom 4 min sa zadržavanjem 0,5 min. Modifikator se drži na konstantnih 5% C (50:50 acetonitril: voda 0,1% mravlje kiseline) ili D (50:50 acetonitril:voda 0,1% amonijum hidroksid (0,88 SG), u zavisnosti od toga da li je kiseli ili bazni postupak.

(ix) prečišćavanje jonske razmene obično se vrši upotrebom SCX-2 (Biotage, propillsulfonskom kiselinom funkcionalizovana silika. Proizvedeno je pomoću trifunkcionalnog silana, bez zatvarača) patrone.

(x) srednja čistoća je procenjena tankoslojnom hromatografijom, masenim spektrom, HPLC (tečna hromatografija visokih performansi) i/ili NMR analizom;

(xi) korišćene su sledeće skraćenice:

AcOH

sirćetna kiselina

aq

Vodeno

Boc

terc-butoksikarbonil

n-BuLi

n-butil litijum

tBuOH

terc-butanol

Brettphos

2-(dicikloheksilfosfino)3,6-dimetoksi-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenil CDCl3

deutero-hloroform

CHCl3

hloroform

Konc.

koncentrisan

DCM

dihlorometan

DIPEA

diizopropiletilamin

DMAP

dimetilaminopiridin

DMSO

dimetil sulfoksid

EtOH

etanol

EtOAc

etil acetat

HATU

1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat

HCl

hlorovodonična kiselina

HPLC

hromatografija visokih performansi

K2CO3

kalijum karbonat

MeOH

metanol

MgSO4

magnezijum sulfat

NaH

natrijum hidrid

NaHCO3

natrijum bikarbonat

Na2SO4

natrijum sulfat

Pd2(dba)3

tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0)

Rac-BINAP

(±)-2,2'-Bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftalen

rt/RT

sobna temperatura

RockPhos treća generacija prekatalizatora

[(2-Di-terc-butilfosfino-3-metoksi-6-metil-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenil)-2-(2-aminobifenil)]paladijum(II) methanesulfonat

Ruphos

2-Dicikloheksilfosfino-2',6'-diizopropoksi-1,1'-bifenil

zas.

zasićen

SFC

hromatografija superkritične tečnosti

ras.

rastvor

TBAF

tetra-n-butilamonijum fluorid

TEA

trietilamin

THF

tetrahidrofuran

THP

tetrahidropiran

TFA

trifluorosirćetna kiselina

Xantphos

4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetil ksanten

Primer 1

N-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin [0261]

[0262] [(2-Di-cikloheksilfosfino-3,6-dimetoksi-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenil)-2-(2'-amino-1,1'-bifenil)]paladijum(II) metansulfonat (BrettPhos Pd G3) (6,80 mg, 7,50 µmol) je dodat suspenziji (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (85 mg, 0,15 mmol), 1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina (29,7 mg, 0,23 mmol) i natrijum terc-butoksida (28,8 mg, 0,30 mmol) u degaziranom 1,4-dioksanu (1,5 mL) i reakcija je zagrejana do 90°C tokom 3 sata. Nakon hlađenja, reakcija je razblažena sa DCM i oprana sa vodom. Vodeni deo je ekstrahovan sa DCM, zatim je kombinovana organska materija osušena i isparena. Sirov ostatak je rastvoren u DCM (2 mL) i TFA (0,7 mL) je dodat. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, zatim je razblažena sa DCM i bazifikovana dodavanjem zasićenog NaHCO3rastvora. Slojevi su razdvojeni i vodeni deo je ekstrahovan sa DCM. Kombinovana organska materija je osušena i isparena, zatim je sirov proizvod prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 20% MeOH u EtOAc. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio N-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin (39,0 mg, 49%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,09 (3H, d), 1,83 (2H, ddd), 2,65 - 2,86 (4H, m), 2,96 - 3,08 (1H, m), 3,11 (1H, dd), 3,22 (2H, d), 3,38 (3H, s), 3,51 - 3,63 (2H, m), 3,73 - 3,82 (1H, m), 3,82 (3H, s), 3,86 (2H, q), 4,15 - 4,28 (1H, m), 4,43 (1H, t), 4,53 (1H, t), 5,37 (1H, s), 5,88 (1H, dd), 6,14 (1H, d), 6,46 (1H, d), 6,80 (1H, d), 7,13 (1H, d), 8,04 (1H, d). m/z: ES+ [M+H]+ 532.

[0263] (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin je pripremljen kako sledi:

Priprema 2,2-difluoro-3-(tritiloksi)propan-1-ola

[0264]

[0265] 2,2-difluoropropan-1,3-diol (2,50 g, 22,3 mmol) je rastvoren u DCM (61,7 mL) i THF (15,4 mL). DIPEA (3,93 mL, 22,3 mmol) je dodat, praćeno (hlorometanetriil)tribenzenom (6,22 g, 22,3 mmol) i konačno DMAP (0,288 g, 2,23 mmol). Reakcija je zagrejana do 40°C tokom 2 sata. Nakon hlađenja, reakcija je oprana sa 1N HCl rastvorom, zatim osušena i isparena. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 25% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio 2,2-difluoro-3-(tritiloksi)propan-1-ol (4,43 g, 56%) kao bezbojna čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) 3,42 (2H, t), 3,92 (2H, t), 7,23 - 7,3 (4H, m), 7,3 - 7,39 (6H, m), 7,39 - 7,49 (6H, m).

Priprema ((2,2-difluoro-3-metoksipropoksi)metantriil)tribenzena

[0266]

[0267] Natrijum hidrid (0,562 g, 14,0 mmol) je dodat rastvoru 2,2-difluoro-3-(tritiloksi)propan-1-ola (4,15 g, 11,7 mmol) u THF (46 mL) i reakcija je mešana tokom 1 sata, zatim je jodometan (0,802 mL, 12,9 mmol) dodat u THF (5 mL). Reakcija je mešana tokom dodatnog 1 sata. Reakcija je ugašena sa vodom i rasolom, zatim ekstrahovana sa EtOAc. Organski sloj je osušen i isparena kako bi se dobio ((2,2-difluoro-3metoksipropoksi)metantriil)tribenzen (4,18 g, 97%) kao bledo žuto ulje.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) 3,36 (2H, t), 3,40 (3H, s), 3,77 (2H, t), 7,15 - 7,28 (3H, m), 7,28 - 7,38 (6H, m), 7,39 - 7,47 (6H, m).

Priprema 2,2-difluoro-3-metoksipropil trifluorometansulfonata

[0268]

[0269] Trifluorometansulfonskai anhidrid (1,918 mL, 11,40 mmol) je dodat rastvoru ((2,2-difluoro-3-metoksipropoksi)metantriil)tribenzena (4,00 g, 10,9 mmol) u DCM (39,6 mL). Reakcija je mešana tokom 30 minuta, zatim je trietilsilan (1,934 mL, 11,94 mmol) dodat i reakcija je mešana tokom dodatnih 30 minuta. Reakcija je isparena, i triflat, je korišćen direktno u sledećoj fazi.

Priprema (R)-1-(3-bromo-2-metilfenil)propan-2-amina

[0270]

[0271] n-BuLi (26,1 mL, 41,8 mmol) je dodat kapanjem rastvoru 1,3-dibromo-2-metilbenzena (9,95 g, 39,8 mmol) u THF (100 mL) na -78°C. Nakon mešanja tokom 30 minuta, (R)-terc-butil 4-metil-1,2,3-oksatiazolidin-3-karboksilat 2,2-dioksid (10,39 g, 43,8 mmol) je dodat iz delova i reakcija je mešana tokom dodatnih 30 minuta pre nego što joj je omogućeno da se zagreje do 0°C tokom 30 minuta. 1N limunske kiseline je dodato i smeša je mešana tokom 5 minuta pre neko što je ekstrahovana sa EtOAc (x2). Kombinovane organske faze su isparene. Ostatak je mešan u 4M HCl u dioksanu (69,7 mL, 278,7 mmol) na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, zatim su isparljive materije isparene. Ostatak je suspendovan u dietil etru, i ekstrahovan sa vodom (x2). Kombinovane vodene faze su bazifikovane dodavanjem 2N Na2CO3, zatim ekstrahovane sa DCM (x3). Kombinovane organske faze su osušene preko MgSO4i koncentrovane kako bi se dobio (R)-1-(3-bromo-2-metilfenil)propan-2-amin (7,55 g, 83%) kao žuto ulje.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3, 27°C) 1,13 (3H, d), 1,43 (2H, s), 2,40 (3H, s), 2,61 (1H, dd), 2,77 (1H, dd), 3,14 (1H, dq), 6,97 (1H, t), 7,08 (1H, d), 7,43 (1H, d). m/z (ES+), [M+H]+ = 228.

Priprema (R)-N-(1-(3-bromo-2-metilfenil)propan-2-il)-2,2-difluoro-3-metoksipropan-1amina

[0272]

[0273] 2,2-Difluoro-3-metoksipropil trifluorometansulfonat (3,03 g, 11,73 mmol) (sirov iz prethodnog koraka) je dodat rastvoru (R)-1-(3-bromo-2-metilfenil)propan-2-amina (2,327 g, 10,2 mmol) i DIPEA (2,82 mL, 16,32 mmol) u 1,4-dioksanu (34,3 mL) i reakcija je zagrejana do 80°C preko noći. Nakon hlađenja, isparljive materije su isparene, zatim je ostatak rastvoren u DCM i opran sa rasolom. Organska faza je osušena i isparena, zatim je sirov proizvod prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 100% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio (R)-N-(1-(3-bromo-2-metilfenil)propan-2-il)-2,2-difluoro-3-metoksipropan-1-amin (2,330 g, 68%) kao bledo žuto ulje.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) 1,06 (3H, d), 2,40 (3H, s), 2,63 (1H, dd), 2,82 (1H, dd), 2,86 - 2,94 (1H, m), 2,95 - 3,11 (2H, m), 3,38 (3H, s), 3,51 - 3,63 (2H, m), 6,94 - 7 (1H, m), 7,07 (1H, dd), 7,4 - 7,51 (1H, m). m/z: ES+ [M+H]+ 336.

Priprema (R)-3-(2-((2,2-difluoro-3-metoksipropil)amino)propil)-2-metilanilina [0274]

[0275] Pd2(dba)3(0,184 g, 0,20 mmol) i Rac-BINAP (0,250 g, 0,40 mmol) su dodati suspenziji (R)-N-(1-(3-bromo-2-metilfenil)propan-2-il)-2,2-difluoro-3-metoksipropan-1-amina (2,25 g, 6,69 mmol), benzofenon imina (1,334 g, 7,36 mmol) i natrijum terc-butoksida (0,965 g, 10,0 mmol) u degaziranom toluenu (28,5 mL) i reakcija je zagrejana do 90°C tokom 3 sata. Nakon hlađenja, toluen je većim delom isparen, zatim je ostatak rastvoren u DCM i opran sa vodom. Vodena faza je ekstrahovana sa DCM, zatim je organska materija isparena do -50 mL zapremine. 2N HCl rastvor (50 mL) je dodat i dvofazna smeša je mešana energično tokom 30 minuta. Slojevi su razdvojeni, zatim je vodeni deo ekstrahovan sa DCM. Organska faza je ponovo ekstrahovana sa 1N HCl. Kombinovane vodene faze su bazifikovane dodavanjem čvrstog K2CO3zatim ekstrahovane sa DCM (x3), i kombinovani DCM ekstrakti su osušeni i ispareni kako bi se dobio (R)-3-(2-((2,2-difluoro-3-metoksipropil)amino)propil)-2-metilanilin (1,780 g, 98%) kao svetlo braon ulje.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) 1,06 (3H, d), 2,11 (3H, s), 2,59 (1H, dd), 2,75 (1H, dd), 2,86 - 2,94 (1H, m), 2,94 - 3,12 (2H, m), 3,38 (3H, s), 3,53 - 3,63 (4H, m), 6,5 - 6,68 (2H, m), 6,86 - 7,01 (1H, m). m/z: ES+ [M+H]+ 273.

Priprema (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-2-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina

[0276]

[0277] (R)-3-(2-((2,2-Difluoro-3-metoksipropil)amino)propil)-2-metilanilin (490 mg, 1,80 mmol) i 4-bromo-2-metoksibenzaldehid (813 mg, 3,78 mmol) su zagrejani u sirćetnoj kiselini (8,8 mL) i vodi (0,162 mL, 9,00 mmol) do 75°C preko noći. Nakon hlađenja, sirćetna kiselina je isparena pod vakuumom, zatim je ostatak rastvoren u EtOAc (20 mL) i 2N HCl rastvor (20 mL) je dodat. Dvofazna smeša je mešana tokom 30 minuta, zatim su slojevi razdvojeni.

Organska faza je ekstrahovana sa vodom, zatim je vodena faza bazifikovana dodavanjem 2N NaOH rastvora i ekstrahovana sa DCM (x2). Kombinovani DCM slojevi su osušeni i ispareni, zatim je sirov proizvod prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-2-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (384 mg, 46%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,03 (3H, d), 2,07 (3H, s), 2,42 (1H, dd), 2,60 - 2,76 (2H, m), 2,99 (1H, ddd), 3,34 (1H, d), 3,36 (3H, s), 3,52 (2H, s), 3,54 - 3,66 (1H, m), 3,76 (1H, ddd), 3,87 (3H, s), 5,28 (1H, s), 6,47 (2H, s), 6,59 (1H, d), 6,88 (1H, dd), 7,01 (1H, d). m/z: ES+ [M+H]+ 469.

Priprema (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0278]

[0279] Natrijum nitrit (59,8 mg, 0,87 mmol) je dodat u vodi (0,2 mL) ohlađenom rastvoru (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-2-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina (370 mg, 0,79 mmol) u propinonskoj kiselini (2628 µL)/vodi (526 µL) na -10°C. Reakcija je mešana tokom 1 sata, zatim je ledom ohlađen EtOAc (20 mL) dodat. Reakcija je ugašena dodavanjem hladnog zasićenog rastvora NaHCO3i mešana je tokom 15 minuta, pre nego što joj je omogućeno da se zagreje do sobne temperature. Slojevi su razdvojeni i vodeni deo je ekstrahovan sa EtOAc. Kombinovana organska materija je osušena i isparena, zatim je sirov proizvod prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (252 mg, 67%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,10 (3H, d), 2,72 (1H, td), 2,85 (1H, dd), 3,08 (1H, ddd), 3,16 (1H, dd), 3,36 (3H, s), 3,48 - 3,66 (2H, m), 3,65 - 3,81 (1H, m), 3,90 (3H, s), 5,44 (1H, s), 6,59 (1H, d), 6,77 (1H, d), 6,89 (1H, dd), 7,05 (1H, d), 7,19 (1H, dd), 8,07 (1H, d). m/z: ES+ [M+H]+ 480.

Priprema (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0280]

[0281] 3,4-Dihidro-2H-piran (0,064 mL, 0,70 mmol) je dodat rastvoru (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (240 mg, 0,50 mmol) i hidrata p-toluensulfonske kiseline (9,51 mg, 0,05 mmol) u DCM (2,5 mL) i reakcija je zagrejana do 40°C tokom 1 sata. Nakon hlađenja, reakcija je razblažena sa DCM i oprana sa zasićenim rastvorom NaHCO3. Organska faza je osušena i isparena. Sirov ostatak je provučen kroz čep od silika gela (EtOAc/heptan, 1:1 kao eluent) i filtrat je isparen kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (262 mg, 93%) kao bledo žuta čvrsta supstanca kao 5:1 odnos THP regioizomera (svaki THP regioizomer je dijastereoizomerna smeša). m/z: ES+ [M+H]+ 564. Priprema terc-butil (1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)karbamata

[0282]

[0283] Kalijum karbonat (1,605 g, 11,61 mmol), terc-butil azetidin-3-ilkarbamat (1,0 g, 5,81 mmol) i 1-fluoro-3-jodopropan (1,146 g, 6,10 mmol) su suspendovani u acetonitrilu (11,61 mL) i zapečaćeni u mikrotalasnu cev. Reakcija je zagrejana do 95°C tokom 15 minuta u mikrotalasnom reaktoru. Reakcija je ohlađena do sobne temperature, razređena sa EtOAc (100 mL) i ekstrahovana iz zasićenog NaHCO3(50 mL). Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i isparena kako bi se dobio terc-butil (1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)karbamat (1,248 g, 93%) kao žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 22°C) 1,44 (9H, s), 1,68 - 1,80 (2H, m), 2,56 (2H, t), 2,88 (2H, s), 3,66 (2H, t), 4,31 (1H, d), 4,43 (1H, t), 4,53 (1H, t), 4,90 (1H, s).

Priprema 1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina

[0284]

[0285] TFA (2,69 ml) je dodat rastvoru terc-butil (1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)karbamata (1,248 g, 5,37 mmol) u DCM (8,06 mL) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Isparljive materije su isparene i prečišćene hromatografijom razmere jona, koristeći SCX kolonu. Željeni proizvod je eluiran iz kolone koristeći 1M NH3/MeOH i čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio 1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin (0,697 g, 98%) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,66 - 1,83 (2H, m), 1,96 (3H, s), 2,54 (2H, t), 2,67 (2H, td), 3,58 - 3,70 (2H, m), 4,43 (1H, t), 4,52 (1H, t).

Primer 2

6-((6S,8R)-7-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)piridin-3-amina

[0287] [(2-Di-cikloheksilfosfino-3,6-dimetoksi-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenil)-2-(2'-amino-1,1'-bifenil)]paladijum(II) metansulfonat (BrettPhos Pd G3) (6,83 mg, 8,00 µmol) i natrijum terc-butoksid (48,0 mg, 0,50 mmol) su dodati degaziranom rastvoru (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (107 mg, 0,20 mmol) i 1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina (52,9 mg, 0,40 mmol) u 1,4-dioksanu (1,6 mL) i reakcija je zagrejana do 90°C tokom 5 sati. Nakon hlađenja, reakcija je razblažena sa DCM i oprana sa vodom. Organska faza je isparena, zatim rastvorena u DCM (2 mL), pre nego što je TFA (1 mL) dodat. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, zatim je razblažena sa DCM i oprana sa zasićenim NaHCO3rastvorom. Slojevi su razdvojeni i vodeni deo je ekstrahovan sa DCM. Kombinovana organska materija je osušena i isparena, zatim je sirov proizvod prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 20% MeOH u EtOAc. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio 6-((6S,8R)-7-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)piridin-3-amin (83 mg, 83%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) 1,12 (3H, d), 1,79 (2H, ddd), 2,71 (2H, t), 2,75 - 2,90 (2H, m), 3,06 - 3,23 (3H, m), 3,39 (3H, s), 3,51 - 3,66 (2H, m), 3,66 - 3,76 (1H, m), 3,76 - 3,84 (2H, m), 4,14 (1H, s), 4,44 (2H, t), 4,53 (1H, t), 5,06 (1H, s), 6,80 (1H, dd), 6,88 (1H, d), 7,13 (2H, dd), 7,84 (1H, d), 7,99 (1H, d). m/z: ES+ [M+H]+ 503.

[0288] (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin je pripremljen kako sledi:

Priprema (1S,3R)-1-(5-bromopiridin-2-il)-2-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina

[0289]

[0290] 5-Bromopikolinaldehid (1172 mg, 6,30 mmol) je dodat rastvoru (R)-3-(2-((2,2-difluoro-3-metoksipropil)amino)propil)-2-metilanilina (817 mg, 3,00 mmol) u sirćetnoj kiselini (14,7 mL) i voda (270 µL, 15,0 mmol) i reakcija je zagrejana do 80°C tokom 2 sata. Nakon hlađenja, isparljive materije su isparene pod vakuumom. Ostatak je rastvoren u DCM i opran sa zasićenim rastvorom NaHCO3. Organska materija je isparena do zapremine -20 mL i 2N HCl rastvor (20 mL) je dodat. Dvofazna smeša je mešana tokom 15 minuta, zatim razdvojena. Organska materija je ekstrahovana sa vodom, zatim je vodena faza ponovo ekstrahovana sa DCM. Vodena faza je zatim bazifikovana dodavanjem čvrstog K2CO3, zatim ekstrahovana sa DCM. Organski ekstrakti su osušeni i ispareni. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio (1S,3R)-1-(5-bromopiridin-2-il)-2-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (810 mg, 61%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) 1,07 (3H, d), 2,05 (3H, s), 2,49 (1H, d), 2,75 (2H, dd), 3,04 - 3,17 (1H, m), 3,30 - 3,36 (1H, m), 3,37 (3H, s), 3,58 - 3,74 (2H, m), 4,96 (1H, s), 6,51 (1H, d), 6,60 (1H, d), 7,22 (1H, d), 7,68 (1H, dd), 8,55 (1H, dd). m/z: ES+ [M+H]+ 440. Priprema (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0291]

[0292] Natrijum nitrit (133 mg, 1,93 mmol) je dodat u vodi (0,5 mL) ohlađenom rastvoru (1S,3R)-1-(5-bromopiridin-2-il)-2-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina (771 mg, 1,75 mmol) u propinonskoj kiselini (5833 µL)/vodi (1167 µL) na -15°C. Reakcija je mešana tokom 30 minuta, zatim je dodat EtOAc (50 mL), koji je ohlađen u suvom ledu. Reakcija je ugašena dodavanjem 2N Na2CO3dok penušanje nije prestalo, zatim su slojevi razdvojeni. Vodeni deo je ekstrahovan sa EtOAc, zatim je organska materija osušena i isparena. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (460 mg, 58%) kao bledo žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) 1,14 (3H, d), 2,81 (1H, dd), 2,88 (1H, dd), 3,10 - 3,26 (2H, m), 3,38 (3H, s), 3,46 - 3,55 (1H, m), 3,58 - 3,76 (2H, m), 5,13 (1H, s), 6,94 (1H, d), 7,23 (1H, dd), 7,29 (1H, d), 7,72 (1H, dd), 8,05 (1H, d), 8,57 (1H, dd). m/z: ES+ [M+H]+ 451.

Priprema (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0293]

[0294] 3,4-Dihidro-2H-piran (0,114 mL, 1,25 mmol) je dodat rastvoru (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (450 mg, 1,00 mmol) i hidrata PTSA (37,9 mg, 0,20 mmol) u DCM (5 mL) i reakcija je zagrejana do 45°C tokom 3 sata. Nakon hlađenja, reakcija je razblažena sa DCM i oprana sa zasićenim rastvorom NaHCO3. Organska faza je osušena i isparena, zatim je sirova supstanca provučena kroz čep od silike (1:1 EtOAc/heptan). Filtrat je isparen kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(2,2-difluoro-3-metoksipropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (510 mg, 9 %) kao narandžasta čvrsta supstanca (∼6,5:1 odnos THP regioizomera). m/z: ES+ [M+H]+ 535.

Primer 3

6-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)piridin-3-amina

[0295]

[0296] [(2-Di-cikloheksilfosfino-3,6-dimetoksi-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenil)-2-(2'-amino-1,1'-bifenil)]paladijum(II) metansulfonat (BrettPhos Pd G3) (12,11 mg, 0,01 mmol) i natrijum terc-butoksid (85 mg, 0,89 mmol) su dodati degaziranom rastvoru (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (177 mg, 0,35 mmol) i 1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina (94 mg, 0,71 mmol) u 1,4-dioksanu (2835 µL) i reakcija je zagrejana do 90°C tokom 5 sati. Nakon hlađenja, reakcija je razblažena sa DCM i oprana sa vodom. Organska faza je isparena, zatim rastvorena u DCM (2 mL), pre nego što je TFA (1 mL) dodat. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, zatim je razblažena sa DCM i oprana sa zasićenim rastvorom NaHCO3. Slojevi su razdvojeni i vodena faza je ekstrahovana sa DCM. Kombinovana organska materija je osušena i isparena kako bi se dobio sirov proizvod. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom LCMS (Waters SunFire kolona, 5µ silika, 19 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željena jedinjenja su ispareni do suvoće kako bi se dobio 6-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)piridin-3-amin (17,0 mg, 10%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 0,36 - 0,46 (1H, m), 0,49 - 0,59 (1H, m), 0,88 - 1,07 (2H, m), 1,09 (3H, d), 1,69 - 1,75 (1H, m), 1,75 - 1,81 (1H, m), 2,59 (2H, t), 2,70 (1H, dd), 2,86 - 2,96 (3H, m), 3,01 - 3,11 (1H, m), 3,37 - 3,44 (1H, m), 3,72 (2H, q), 3,78 -3,88 (1H, m), 3,95 (1H, d), 4,04 - 4,13 (1H, m), 4,44 (1H, t), 4,53 (1H, t), 4,95 (1H, s), 6,75 (1H, dd), 6,91 (1H, d), 7,12 - 7,17 (2H, m), 7,86 (1H, d), 8,05 (1H, d), 10,04 (1H, s). m/z: ES+ [M+H]+ 467.

[0297] (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin je pripremljen kako sledi: Priprema 1-(3-bromo-2-metilfenil)-2,5-dimetil-1H-pirola

[0298]

[0299] Smeša 3-bromo-2-metilanilina (40 g, 215 mmol), heksan-2,5-diona (25,3 mL, 215 mmol) i p-toluensulfonska kiselina monohidrata (0,409 g, 2,15 mmol) u toluenu (300 mL) je zagrejana na uslove refluksa tokom 2 sata u boci opremljenoj sa kondenzatorom i Dean-Stark uređajem. Smeša je zatim ohlađena do sobne temperature i oprana sekvencijalno sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom, vodenim HCl (1N), i zasićenim vodenim natrijum hloridom. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov 1-(3-bromo-2-metilfenil)-2,5-dimetil-1H-pirol (57,9 g, 102%) kao bledo žuto ulje.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,8 (6H, s), 1,9 (3H, s), 5,8 (2H, s), 7,2 - 7,4 (2H, m), 7,7 (1H, dd). m/z: ES+ [M+H]+ 264.

Priprema terc-butil (R)-(1-(3-(2,5-dimetil-1H-pirol-1-il)-2-metilfenil)propan-2-il)karbamata

[0300]

[0301] n-Butillitijum u heksanu (2,5M; 89 mL, 221 mmol) je dodat tokom 15 minuta rastvoru sirovog 1-(3-bromo-2-metilfenil)-2,5-dimetil-1H-pirola (55,7 g, 211 mmol) u THF (400 mL) na -78°C. Nakon 30 minuta, terc-butil (R)-4-metil-1,2,3-oksatiazolidin-3-karboksilat 2,2-dioksid (50 g, 211 mmol) je dodat. Rezultujuća smeša je mešana na -78°C tokom 15 minuta i omogućeno joj je da se zagreje do sobne temperature tokom 2 sata. Vodena limunska kiselina (1N; 250 mL) je dodata, i mešanje je nastavljeno tokom 30 minuta. Smeša je ekstrahovana sa heksanima, i kombinovani organski slojevi su oprani sa zasićenim vodenim natrijum karbonatom, osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujuća braon čvrsta supstanca, sirov terc-butil (R)-(1-(3-(2,5-dimetil-1H-pirol-1-il)-2-metilfenil)propan-2-il)karbamat je korišćena u narednom koraku bez daljeg prečišćavanja. m/z: ES+ [M+H]+ 343.

Priprema (R)-1-(3-(2,5-dimetil-1H-pirol-1-il)-2-metilfenil)propan-2-amina

[0302]

[0303] Hlorovodonična kiselina u dioksanu (4 M; 100 mL, 400 mmol) je dodata suspenziji sirovog terc-butil (R)-(1-(3-(2,5-dimetil-1H-pirol-1-il)-2-metilfenil)propan-2-il)karbamata u MeOH (200 mL) i DCM (50 mL). Rezultujući crveni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 4 sata i zatim koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujuća braon čvrsta supstanca je korišćena u narednom koraku bez daljeg prečišćavanja. m/z: ES+ [M+H]+ 243.

Priprema (R)-3-(2-aminopropil)-2-metilanilina

[0304]

[0305] Smeša sirovog (R)-1-(3-(2,5-dimetil-1H-pirol-1-il)-2-metilfenil)propan-2-amina dihlorovodonika, vodenog hidroksilamina (50% težine; 107 mL, 1,74 mol), i hidroksilamin hlorovodonika (97 g, 1,39 mol) u etanolu (400 mL) je zagrejana do uslova refluksa. Nakon 18 sati, reakcija je ohlađena do 0°C, bazifikovana sa vodenim natrijum hidroksidom (50% težine; 153 g, 1,92 mol) i ekstrahovana sa DCM. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen sa SFC (Princeton Chromatography DEAP kolona, 100 mm dužina, 30 mm prečnik, 5 µm, 40°C kolona temperature, 100 bar kolona pritiska, 100 mg/mL stopa protoka), eluiranjem sa 25% metanolom sadrži 0,2% NH4OH u CO2, kako bi se dobio (R)-3-(2-aminopropil)-2-metilanilin (24 g, 84%) kao svetlo ćilibarna čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, DMSO, 27°C) 1,05 (3H, d), 1,99 (3H, s), 2,55 (1H, dd), 2,93 (1H, dd), 3,11 - 3,25 (1H, m), 4,77 (2H, s), 6,35 (1H, dd), 6,52 (1H, dd), 6,81 (1H, t). Alkil NH2protoni nisu primećeni. m/z: ES+ [M+H]+ 165.

Priprema (R)-N-(1-(3-amino-2-metilfenil)propan-2-il)-1-fluorociklopropan-1-karboksamida

[0306]

[0307] (R)-3-(2-aminopropil)-2-metilanilin (1,70 g, 10,4 mmol) je rastvoren u DMF (29,9 mL) i tretiran sa 1-fluorociklopropan-1-karboksilnaom kiselinom (1,00 g, 9,61 mmol), HATU (4,02 g, 10,6 mmol), i TEA (2,68 mL, 19,22 mmol). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata i zatim ugašena sa vodom i ekstrahovana sa EtOAc. Organski sloj je opran sa zasićenim vodenim natrijum hloridom, osušen preko natrijum sulfata, i filtriran. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je osušen pod vakuumom preko noći kako bi se uklonio rezidualni DMF. Ostatak je zatim adsorbovan na silika i prečišćen fleš kolonom silika hromatografije, gradijent eluiranja 0 do 80% etil acetata u heksanima kako bi se dobio (R)-N-(1-(3-amino-2-metilfenil)propan-2-il)-1-fluorociklopropan-1-karboksamid (1,47 g, 61,1%) kao svetlo žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,01 - 1,28 (7H, m), 2,02 (3H, s), 2,54 - 2,62 (1H, m), 2,83 (1H, dd), 3,89 - 4,16 (1H, m), 4,68 (2H, s), 6,38 (1H, d), 6,49 (1H, d), 6,78 (1H, t), 8,14 (1H, d) m/z: ES+ [M+H]+ 251.

Priprema (R)-3-(2-(((1-fluorociklopropil)metil)amino)propil)-2-metilanilina

[0308]

[0309] Boran tetrahidrofuran kompleks u THF (1 M; 35,2 ml, 35,2 mmol) je dodat rastvoru (R)-N-(1-(3-amino-2-metilfenil)propan-2-il)-1-fluorociklopropan-1-karboksamida (1,47 g, 5,87 mmol) u THF (13,7 mL) na sobnoj temperaturi pod azotom. Reakcija je zatim zagrejana na 65°C tokom 6 sati. Reakcija je ohlađena do 0°C i ugašena pažljivo sa MeOH (evolucija gasa). Rastvor je zatim koncentrovan pod redukovanim pritiskom i čuvan u frižideru tokom 18 sati. Ostatak je rastvoren u MeOH (6 mL) i zagrejan na 65°C tokom 3 sata. Rastvor je ohlađen do sobne temperature i zatim koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Dobijeni ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 16% metanol u DCM, kako bi se dobio (R)-3-(2-(((1-fluorociklopropil)metil)amino)propil)-2-metilanilin (1,14 g, 82%) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 0,54 - 0,70 (2H, m), 0,79 - 1,02 (5H, m), 1,64 (1H, br. S.), 1,99 (3H, s), 2,36 (1H, dd), 2,69 - 2,97 (4H, m), 4,68 (2H, s), 6,36 (1H, d), 6,49 (1H, d), 6,79 (1H, t). m/z: ES+ [M+H]+ 237.

Priprema (1S,3R)-1-(5-bromopiridin-2-il)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina

[0311] 5-Bromopikolinaldehid (507 mg, 2,72 mmol) je dodat mešanom rastvoru (R)-3-(2-(((1-fluorociklopropil)metil)amino)propil)-2-metilanilina (322 mg, 1,36 mmol) u sirćetnoj kiselini (7028 µL) i vodi (143 µL). Rezultujuća smeša je zagrejana do 90°C i mešana na ovoj temperaturi tokom 5 sati. Smeša je koncentrovana i rastvorena u EtOAC (50 mL) i zasićenom NaHCO3(25 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (2 x 50 mL). Kombinovana organska materija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je rastvoren u DCM (20 mL) i 1M HCl (20 mL). Smeša je mešana energično tokom 30 minuta. Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je opran sa DCM (20 mL). Vodeni sloj je bazifikovan do > pH 10 sa čvrstim NaOH. Rastvor je ekstrahovan sa DCM (3 x 25 mL). Kombinovana organska materija je osušena (patrona faznog separatora) i koncentrovana kako bi se dobio sirov proizvod. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 60% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio (1S,3R)-1-(5-bromopiridin-2-il)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (217 mg, 39%) kao žuta guma.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 0,33 - 0,47 (1H, m), 0,49 - 0,6 (1H, m), 0,89 - 1,01 (2H, m), 1,04 (3H, d), 2,06 (3H, s), 2,55 - 2,64 (2H, m), 2,92 - 3,04 (2H, m), 3,51 (2H, s), 3,65 - 3,72 (1H, m), 4,88 (1H, s), 6,45 (1H, d), 6,58 (1H, d), 7,31 (1H, dd), 7,66 (1H, dd), 8,54 (1H, dd). m/z: ES+ [M+H]+ 404.

Priprema (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0312]

[0313] (1S,3R)-1-(5-Bromopiridin-2-il)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4tetrahidroizohinolin-6-amin (295 mg, 0,73 mmol) u propinonskoj kiselini (8291 µL) je ohlađen do -20°C. Natrijum nitrit (50,3 mg, 0,73 mmol) u vodi (829 µL) je dodat kapanjem tokom 2-3 minuta. Reakciona smeša je mešana na -20°C tokom 45 minuta. Reakciona smeša je razblažena sa ledeno hladnim EtOAc (30 mL). Reakciona smeša je sipana u zasićen NaHCO3(40 mL). Smeša je mešana energično tokom 5 minuta. Slojevi su razdvojeni i organski sloj je opran sa zasićenim NaHCO3(2 x 30 mL). Kombinovani vodeni slojevi su ponovo ekstrahovani sa EtOAc (2 x 30 mL). Kombinovane organske faze su osušene (Na2SO4) i koncentrovane kako bi se dobio sirov proizvod kao braon ulje. Sirov materijal` je prečišćen fleš silika kolonom hromatografije, eluiranjem sa 0-45% EtOAc u heptanu kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (107 mg, 35%) kao narandžasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 0,35 - 0,44 (1H, m), 0,51 - 0,63 (1H, m), 0,92 - 1,07 (2H, m), 1,09 (2H, d), 2,69 (1H, dd), 2,96 (1H, dd), 3,01 - 3,10 (1H, m), 3,33 - 3,49 (2H, m), 3,78 -3,89 (1H, m), 5,03 (1H, s), 6,95 (1H, d), 7,19 (1H, d), 7,34 - 7,39 (1H, m), 7,68 (1H, dd), 8,07 (1H, d), 8,58 (1H, dd). m/z: ES+ [M+H]+ 415 i 417.

Priprema (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0314]

[0315] 3,4-Dihidro-2H-piran (0,029 mL, 0,32 mmol) je dodat rastvoru (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (107 mg, 0,26 mmol) i hidrat 4-metilbenzensulfonske kiseline (9,80 mg, 0,05 mmol) u DCM (2 mL) i reakcija je zagrejana do 45°C tokom 3 sata. Dodatni 3,4-dihidro-2H-piran (0,235 mL, 2,58 mmol) i hidrat 4-metilbenzensulfonske kiseline (49,0 mg, 0,26 mmol) su dodati i smeša je zagrejana na 45°C tokom 16 sata. Reakcija je razblažena sa DCM i oprana sa zasićenim NaHCO3rastvorom. Organska faza je osušena i isparena, zatim je sirova supstanca provučena kroz čep od silike (1:1 EtOAc/heptan). Filtrat je isparen kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin kao braon ulje koje je korišćeno bez daljeg prečišćavanja. m/z: ES+ [M+H]+ 499.

Primer 4

N-(4-((6S,8R)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin (dijastereoizomerna smeša)

[0316]

[0317] 1-(3-Fluoropropil)azetidin-3-amin (50 mg, 0,37 mmol), smeša (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin i (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (140 mg, 0,25 mmol), cezijum karbonat (163 mg, 0,50 mmol) i [(2-di-cikloheksilfosfino-3,6-dimetoksi-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenil)-2-(2'-amino-1,1'-bifenil)]paladijum(II) metansulfonat (BrettPhos Pd G3) (23 mg, 0,02 mmol) su suspendovani u 1,4-dioksanu (2 mL) i zapečaćeni u mikrotalasnoj cevi. Reakcija je zagrejana do 100°C tokom 4 sata pod mikrotalasnim zračenjem. Reakciona smeša je razblažena sa DCM (25 mL) i oprana sa vodom (25 mL). Organski sloj je isparena. Ostatak je rastvoren u DCM (3 mL) i TFA (1 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata i zatim podeljena između DCM i 2M NaOH (20 mL svaki). Organska faza je isparena i sirov proizvod prečišćen preparativnom HPLC (Waters CSH C18 OBD kolona, 5µ silika, 30 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente kako bi se dobio N-(4-((6S,8R)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin (26,0 mg, 20%) kao guma kao smeša dijastereoizomera.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27°C) 0,94 - 0,99 (3H, m), 1,16 - 1,24 (3H, m), 1,64 (2H, dq), 2,39 - 2,47 (3H, m), 2,70 (2H, t), 2,74 - 2,84 (2H, m), 3,03 - 3,21 (2H, m), 3,24 (3H, d), 3,48 (2H, dd), 3,58 - 3,64 (2H, m), 3,79 (3H, d), 3,88 - 3,94 (1H, m), 4,44 (2H, dt), 5,17 (1H, d), 5,88 (1H, td), 5,97 (1H, dd), 6,16 (1H, d), 6,32 - 6,38 (1H, m), 6,63 (1H, t), 7,16 (1H, dd), 8,02 (1H, s), 12,91 (1H, s).<19>F NMR (471 MHz, DMSO-d6, 27°C) -218,19, -149,21, -148,22. m/z: ES+ [M+H]+ 528.

[0318] Smeša (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin i (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirazolo[4,3-f]izohinolina je pripremljena kako sledi;

Priprema dijastereoizomerne smeše N-((R)-1-(3-bromo-2-metilfenil)propan-2-il)-2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropan-1-amina

[0319]

[0320] Trifluorometansulfonski anhidrid (2,148 ml, 12,79 mmol) je dodat ((2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropoksi)metantriil)tribenzenu (4,44 g, 12,18 mmol) rastvorenom u dihlorometanu (50 mL) i reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Trietilsilan (2,140 ml, 13,40 mmol) je zatim dodat i smeša je mešana tokom dodatnih 30 minuta. Reakcija je koncentrovana kako bi se dobio sirov racemski 2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil trifluorometansulfonat koji je u narednom koraku korišćen direktno bez daljeg prečišćavanja.

[0321] DIPEA (5,36 mL, 30,68 mmol) je dodat do (R)-1-(3-bromo-2-metilfenil)propan-2-amina (2,80 g, 12,3 mmol) i 2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil trifluorometansulfonata (3,12 g, 12,3 mmol) u 1,4-dioksanu (60 mL) na sobnoj temperaturi pod azotom [egzoterm].

Rezultujuća smeša je mešana na 85°C tokom 24 sata. Reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi i reakciona smeša je isparena. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 60% EtOAc u heptanu kako bi se dobio N-((R)-1-(3-bromo-2-metilfenil)propan-2-il)-2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropan-1-amin (2,480 g, 73%) kao ulje kao smeša dijastereoizomera.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,02 - 1,07 (3H, m), 1,31 (1,5H, d), 1,32 (1,5H, d), 2,41 (3H, s), 2,57 - 2,66 (1H, m), 2,68 - 2,90 (4H, m), 3,34 (1,5H, d), 3,35 (1,5H, d), 3,38 - 3,46 (2H, m), 6,96 (1H, t), 7,07 (1H, d), 7,42 (1H, d). NH nije primećen.<19>F NMR (471 MHz, CDCl3, 27°C) -157,94, -157,53. m/z: ES+ [M+H]+ 332/334.

Priprema dijastereoizomerne smeše 3-((R)-2-((2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)amino)propil)-2-metilanilina

[0322]

[0323] Tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0) (0,205 g, 0,22 mmol) i (±)-2,2'-bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftalen (0,279 g, 0,45 mmol) su dodati suspenziji dijastereoizomerne smeše N-((R)-1-(3-bromo-2-metilfenil)propan-2-il)-2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropan-1-amina (2,48 g, 7,46 mmol), benzofenon imina (1,487 g, 8,21 mmol) i natrijum terc-butoksida (1,076 g, 11,20 mmol) u degaziranom toluenu (30 mL) i reakcija je zagrejana do 90°C tokom 3 sata. Nakon hlađenja, toluen je isparen. Ostatak je rastvoren u DCM (250 mL) i opran sa vodom (250 mL). Vodeni deo je ekstrahovan sa DCM (100 mL) i kombinovana organska materija je koncentrovana do otprilike 50 mL.2 M HCl rastvor (50 mL) je dodat i dvofazna smeša je mešana energično tokom 30 minuta. Slojevi su razdvojeni i vodena faza je ekstrahovana sa DCM. Vodena faza je bazifikovana sa 2 M vodenim NaOH. Ovo je ekstrahovano sa DCM (2 x 250 mL) i kombinovani DCM ekstrakti su ispareni kako bi se dobio 3-((R)-2-((2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)amino)propil)-2-metilanilin (2,00 g, 100%) kao ulje kao smeša dijastereoizomera.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,04 (3H, d), 1,31 (1,5H, d), 1,32 (1,5H, d), 2,11 (3H, s), 2,53 - 2,60 (1H, m), 2,70 - 2,89 (4H, m), 3,35 (2H, d), 3,36 (1,5H, d), 3,43 (1,5H, dd), 3,58 (2H, s), 6,57 (1H, d), 6,61 (1H, d), 6,94 (1H, t), 7,58 (1H, s).<19>F NMR (471 MHz, CDC13, 27°C) -157,61, -157,30. m/z: ES+ [M+H]+ 269.

Priprema dijastereoizomerne smeše (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-2-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina

[0324]

[0325] Dijastereoizomerna smeša 3-((2R)-2-((2-Fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)amino)propil)-2-metilanilina (2,00 g, 7,45 mmol) i 4-bromo-2metoksibenzaldehida (3,37 g, 15,6 mmol) je zagrejana u sirćetnoj kiselini (30 mL) i vodi (0,671 mL, 37,3 mmol) do 70°C preko noći. Nakon hlađenja, sirćetna kiselina je isparena. Ostatak je rastvoren u EtOAc (40 mL) i 2N HCl rastvor (40 mL) je dodat. Dvofazna smeša je mešana tokom 30 minuta, zatim su slojevi razdvojeni. Organska faza je ekstrahovana sa vodom, zatim su kombinovane vodene faze bazifikovane dodavanjem 2N NaOH rastvora i ekstrahovane sa DCM (2 x 200 mL). Kombinovani DCM slojevi su ispareni i sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu kako bi se dobio prvi (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-2-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (0,354 g, 10%) kao pojedinačni dijastereoizomer.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27°C) 0,91 (3H, d), 1,22 (3H, d), 1,94 (3H, s), 2,26 - 2,40 (2H, m), 2,65 - 2,78 (2H, m), 3,16 - 3,25 (4H, m), 3,42 (1H, dd), 3,85 (3H, s), 4,61 (2H, s), 5,10 (1H, s), 6,24 (1H, d), 6,37 (1H, d), 6,61 (1H, d), 6,95 (1H, dd), 7,15 (1H, d). Jedan deo delimično zaklonjen vodom.<19>F NMR (471 MHz, DMSO-d6, 27°C) -149,65. m/z: ES+ [M+H]+ 465/467. Praćeno fragmentima koji sadrže smešu dijastereoizomera od (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-2-(-2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina (1,700 g, 49%)<19>F NMR (471 MHz, DMSO-d6, 27°C) -149,65, -148,78. m/z: ES+ [M+H]+ 465/467. Praćeno fragmentima koji sadrže drugi dijastereoizomer od (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-2-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina (0,274 g, 8%) kao pojedinačni dijastereoizomer.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27°C) 0,91 (3H, d), 1,16 (3H, d), 1,93 (3H, s), 2,26 - 2,4 (2H, m), 2,63 - 2,74 (2H, m), 3,23 (3H, s), 3,35 (1H, dd), 3,47 (1H, dd), 3,85 (3H, s), 4,60 (2H, s), 5,09 (1H, s), 6,24 (1H, d), 6,37 (1H, d), 6,61 (1H, d), 6,93 (1H, dd), 7,15 (1H, d). Jedan proton je zaklonjen vodom.<19>F NMR (471 MHz, DMSO-d6, 27°C) -148,78. m/z: ES+ [M+H]+ 465/467. Svi kao guma.

Priprema dijastereoizomerne smeše (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(-2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina [0326]

[0327] Rastvor natrijum nitrita (0,277 g, 4,02 mmol) u vodi (1,0 mL) je dodat rastvoru dijastereoizomerne smeše (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-2-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina (1,70 g, 3,65 mmol) u propinonskoj kiselini (15 mL) na -10°C. Reakcija je mešana tokom 1 sata, zatim je ledom ohlađen EtOAc (20 mL) dodat. Reakcija je ugašena dodavanjem vodenog NaHCO3rastvora (30 mL) i mešana je tokom 15 minuta, pre nego što joj je omogućeno da se zagreje do sobne temperature. Organska faza je oprana sa vodenim NaHCO3rastvorom (30 mL) i rasolom (20 mL), osušena (Na2SO4), filtrirana i isparena. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (0,950 g, 55%) kao braon čvrsta supstanca smeša dijastereoizomera.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27°C) 0,95 - 0,97 (3H, m), 1,14 - 1,23 (3H, m), 2,31 - 2,40 (1H, m), 2,78 - 2,88 (2H, m), 3,11 - 3,21 (2,5H, s), 3,23 (1,5H, s), 3,32 -3,38 (1H, m), 3,40 - 3,52 (2H, m), 3,88 (1,5H, s), 3,89 (1,5H, s), 5,28 (1H, s), 6,59 - 6,69 (2H, m), 6,92 - 6,96 (1H, m), 7,16 - 7,22 (2H, m), 8,05 (1H, s), 12,96 (1H, s).<19>F NMR (471 MHz, DMSO-d6, 27°C) -149,65, -148,68. m/z: ES+ [M+H]+ 476/478.

Priprema smeša (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin i (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirazolo[4,3-f]izohinolina [0328]

[0329] Hidrat 4-metilbenzensulfonske kiseline (0,038 g, 0,20 mmol) je dodat rastvoru dijastereoizomerne smeše (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (0,950 g, 1,99 mmol) i 3,4-dihidro-2H-pirana (0,546 mL, 5,98 mmol) u DCM (30 mL) i smeša je zagrejana na 40°C preko noći. Još 3,4-dihidro-2H-pirana (0,546 mL, 5,98 mmol) i hidrata 4-metilbenzensulfonske kiseline (0,038 g, 0,20 mmol) je dodato. Zagrevanje nastavljeno tokom 7 sati. Dodatni delovi 3,4-dihidro-2H-pirana (0,546 mL, 5,98 mmol) i hidrata 4metilbenzensulfonske kiseline (0,038 g, 0,20 mmol) su dodati i reakcija je zagrejana preko noći. Reakciona smeša je razblažena sa DCM (50 mL) i oprana sa zasićenim vodenim NaHCO3(50 mL). Organska faza je isparena do tamno braon ulja i sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 35% EtOAc u heptanu kako bi se dobila smeša (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin i (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (0,960 g, 86%) kao pena, kao smeša dijastereoizomera.<19>F NMR (471 MHz, DMSO-d6, 27°C) -149,79, -149,74, -149,69, -149,65, -148,77, -148,73, -148,69, -148,66. m/z: ES+ [M+H]+ 560/562.

Primer 5

3-((6S,8R)-6-(2,6-difluoro-4-((1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)amino)fenil)-8-metil-3,6,8,9-tetrahidro-7H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-7-il)-2,2-difluoropropan-1-ol

[0330]

[0331] TBAF u THF (1 M; 160 µL, 0,16 mmol) je dodat rastvoru N-(4-((6S,8R)-7-(3-((tercbutildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina (80 mg, 0,10 mmol) u THF (0,5 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon 4 sata, reakcija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 30 do 90% (10% MeOH u DCM sadrži 1% NH4OH) u DCM. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je ponovo prečišćen koristeći iste uslove. Fragmenti proizvoda su ponovo koncentrovani pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Waters XBridge Prep C18 OBD kolona, 5µ silika, 19 mm prečnik, 100 mm dužina) koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 0,2 % amonijum hidroksid) i MeCN kao eluente (40 do 70% tokom 7 minuta) kako bi se dobio 3-((6S,8R)-6-(2,6-difluoro-4-((1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)amino)fenil)-8-metil-3,6,8,9-tetrahidro-7H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-7-il)-2,2-difluoropropan-1-ol (17 mg, 31%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,02 (3H, d), 1,59 - 1,69 (2H, m), 2,44 (2H, t), 2,56 - 2,67 (1H, m), 2,72 (2H, t), 2,88 (1H, dd), 3,02 - 3,13 (1H, m), 3,17 (1H, dd), 3,49 - 3,56 (1H, m), 3,57 -3,69 (3H, m), 3,91 (1H, tdt), 4,44 (2H, dt), 5,08 (1H, s), 5,25 (1H, br. S), 6,07 (2H, d), 6,64 (1H, d), 6,69 (1H, d), 7,20 (1H, d), 8,04 (1H, s), 12,95 (1H, br. S). One H nije primećen. M/z: ES+ [M+H]+ 524.

[0332] N-(4-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin je pripremljen kako sledi:

Priprema 3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropan-1-ola

[0333]

[0334] NaH u mineralnom ulju (60% težine; 343 mg, 8,58 mmol) je dodat iz jednog dela mešanom rastvoru 2,2-difluoropropan-1,3-diola (874 mg, 7,80 mmol) u THF (32 mL) na 0°C. Reakciji je omogućeno da se zagreje do sobne temperature, i je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Reakciona smeša je ponovo ohlađena do 0°C, i terc-butildifenilhlorosilan (2,0 mL, 7,8 mmol) je dodat kapanjem pomoću šprica. Reakcionoj smeši je omogućeno da se da se zagreje do sobne temperature tokom 1 sata i je zatim ugašena sa vodom i ekstrahovana sa EtOAc. Organski sloj je osušen sa Na2SO4, filtriran, i filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, eluiranjem sa izokratskim 5% etil acetatom u heksanima, kako bi se dobio 3-((tercbutildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropan-1-ol (1,94, 71%) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) δ ppm 1,03 - 1,14 (9H, s), 3,87 - 3,93 (4H, m), 7,37 - 7,44 (6H, m), 7,64 - 7,66 (4H, m).

Priprema 3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil trifluorometan sulfonata

[0336] Rastvor 3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropan-1-ola (1,94 g, 5,55 mmol) i 2,6-dimetilpiridina (1,94 ml, 16,6 mmol) u DCM (18 ml) je ohlađen do -10°C (so/ledena kada). Trifluorometansulfonski anhidrid (1,88 ml, 11,1 mmol) je dodat polako kapanjem tokom 10 minuta. Reakcija je održavana pod tim uslovima tokom 2 sata. Reakcija je zatim oprana sa vodom, vodenim HCl (1N; 100 mL), i zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom. Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil trifluorometansulfonat (2,68 g, 100 %) kao crveno ulje.<1>H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) 1,03 - 1,14 (9H, s), 3,90 (2H, t), 4,76 (2H, t), 7,39 - 7,56 (6H, m), 7,59 - 7,75 (4H, m).

Priprema 3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil trifluorometan sulfonata [0337]

[0338] 3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil trifluorometansulfonat (1,92 g, 3,98 mmol) je dodat rastvoru (R)-3-(2-aminopropil)-2-metilanilina (0,784 g, 4,77 mmol) i DIPEA (1,031 ml, 5,97 mmol) u 1,4-dioksanu (15 ml). Reakcija je zagrejana na 85°C tokom 18 sati. Nakon hlađenja, reakcija je razblažena sa DCM i oprana sa vodom. Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM, i kombinovani organski slojevi su osušeni preko magnezijum sulfat, filtrirana, i koncentrovane pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 4% metanolskog amonijaka u DCM. Čisti fragmenti su koncentrovani do suvoće kako bi se dobio (R)-3-(2-((3-((tercbutildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)amino)propil)-2-metilanilin (1,97 g, 100%) kao žuto ulje.<1>H NMR (300 MHz, MetanOL-d4, 27°C) δ ppm 0,97 - 1,12 (12H, m), 2,10 (3H, s), 2,53 - 2,63 (1H, m), 2,74 - 2,84 (1H, m), 2,86 - 2,99 (1H, m), 3,00 - 3,19 (2H, m), 3,80 (2H, td), 6,53 (1H, d), 6,63 (1H, d), 6,86 (1H, t), 7,38 - 7,50 (6H, m), 7,64 - 7,72 (4H, m). M/z: ES+ [M+H]+ 497.

Priprema (1S,3R)-1-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-2-(3-((terc-butildifenilsilil) oksi)-2,2-difluoropropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina

[0339]

[0340] 4-Bromo-2,6-difluorobenzaldehid (1,55 g, 7,02 mmol) je dodat rastvoru (R)-3-(2-((3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)amino)propil)-2-metilanilina (1,74 g, 3,51 mmol) u sirćetnoj kiselini (17 mL) i vodi (0,32 mL, 18 mmol), i reakcija je zagrejana na 80°C preko noći. Reakcija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i ostatak je podeljen između EtOAc i zasićenog vodenog NaHCO3. Organski sloj je koncentrovan pod redukovanim pritiskom i prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 20 do 80% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (1S,3R)-1-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-2-(3-((tercbutildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (1,33 g, 54,5%) kao čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) δ ppm 1,04 - 1,11 (12H, m), 2,25 - 2,38 (3H, m), 2,53 - 2,65 (1H, m), 2,73 (1H, q), 2,86 - 3,03 (1H, m), 3,15 - 3,38 (1H, m), 3,52 - 3,71 (2H, m), 3,85 - 4,01 (1H, m), 5,31 (1H, d), 6,58 - 6,64 (1H, m), 6,67 - 6,73 (1H, m), 6,88 - 6,95 (2H, m), 7,18 - 7,24 (2H, m), 7,37 - 7,50 (6H, m), 7,60 - 7,70 (4H, m). M/z: ES+ [M+H]+ 699.

Priprema (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-(3-((terc-butildifenilsilil) oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0341]

[0342] Natrijum nitrit (0,130 g, 1,89 mmol) u vodi (0,900 mL) je dodat kapanjem rastvoru (1S,3R)-1-(4-bromo-2,6-difluorofeny1)-2-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina (1,32 g, 1,89 mmol) u propinonskoj kiselini (9 mL) na -8°C (so/ledena kada) i mešano je pod tim uslovima tokom 20 minuta. Reakcija je razblažena sa etil acetatom (20 mL, prethodno ohlađen do -10°C) i ugašena sporim dodavanjem zasićenog vodeni NaHCO3(30 mL, prethodno ohlađen do -10°C) tokom 15 minuta na 0°C. Smeši je omogućeno da se da se zagreje do sobne temperature i održavana je pod tim uslovima tokom 18 sati. Organski sloj je razdvojen, i vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc. Kombinovani organski slojevi su oprani sa zasićenim vodenim NaHCO3i vodom, osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom.

Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 15 do 50% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-(3-((tercbutildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (0,520 g, 38,8%) kao svetlo braon čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) δ ppm 1,07 (9H, s), 1,12 (3H, d), 2,72 - 2,92 (2H, m), 3,21 - 3,39 (2H, m), 3,51 - 3,66 (1H, m), 3,67 - 3,79 (1H, m), 3,86 - 4,00 (1H, m), 5,37 (1H, s), 6,81 (1H, d), 6,87 - 6,98 (2H, m), 7,25 - 7,29 (1H, m), 7,35 - 7,50 (6H, m), 7,59 - 7,70 (4H, m), 8,14 (1H, s). Indol NH nije primećen. M/z: ES+ [M+H]+ 710.

Priprema (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-(3-((terc-butildifenilsilil) oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0343]

[0344] 3,4-Dihidro-2H-piran (95 µL, 1,04 mmol) je dodat rastvoru (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (492 mg, 0,69 mmol) i monohidrata para-toluensulfonske kiseline (13 mg, 0,07 mmol) u DCM (3,5 mL), i reakcija je zagrejana pod uslovima refluksa tokom 6 sati. Nakon hlađenja, reakcija je oprana sa zasićenim vodenim NaHCO3, osušena preko Na2SO4, filtrirana, i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 10 do 30% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (474 mg, 86%) kao svetlo braon gumasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) 1,06 (9H, s), 1,19 - 1,25 (3H, m), 1,74 - 1,84 (3H, m), 2,09 - 2,20 (2H, m), 2,49 - 2,67 (1H, m), 2,84 - 2,96 (2H, m), 3,27 - 3,45 (2H, m), 3,61 - 3,87 (3H, m), 4,04 (2H, d), 5,52 (1H, s), 5,66 - 5,72 (1H, m), 6,78 (1H, d), 6,94 (2H, d), 7,32 (1 H, d), 7,36 - 7,50 (6H, m), 7,60 - 7,68 (4H, m), 8,04 (1 H, s).

Priprema terc-butil 3-((4-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)amino)azetidin-1-karboksilata

[0345]

[0346] Degazirana smeša (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-(3-((tercbutildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (0,474 g, 0,600 mmol), terc-butil 3-aminoazetidin-1-karboksilata (0,15 g, 0,89 mmol), ksantfosa (0,069 g, 0,12 mmol), Pd2(dba)3(0,06 g, 0,06 mmol), i cezijum karbonata (0,389 g, 1,19 mmol) u dioksanu (3 mL) je zagrejana na 115°C tokom 4 sata. Reakcija je zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je adsorbovan na silika gelu i prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 5 do 50% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio terc-butil 3-((4-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)ammo)azetidm-1-karboksilat (0,377 g, 71,3%) kao čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) 1,06 (9H, s), 1,12 (3H, d), 1,46 (9H, s), 1,65 - 1,84 (3H, m), 2,07 - 2,23 (2H, m), 2,58 (1H, d), 2,75 - 2,91 (2H, m), 3,16 - 3,34 (2H, m), 3,52 - 3,78 (5H, m), 3,91 - 4,07 (3H, m), 4,19 - 4,29 (2H, m), 5,23 - 5,34 (1H, m), 5,67 (1H, dd), 5,81 (2H, d), 6,81 (1H, d), 7,25 - 7,29 (1H, m), 7,35 -7,48 (6H, m), 7,65 (4H, ddd), 8,02 (1 H, s). Anilin NH nije primećen. M/z: ES+ [M+H]+ 886.

Priprema N-(4-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)azetidin-3-amina [0347]

[0348] TFA (328 µL, 4,25 mmol) je dodat polako rastvoru terc-butil 3-((4-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)amino)azetidin-1-karboksilata (377 mg, 0,43 mmol) u DCM (2 mL) na 0°C. Reakciji je omogućeno da se zagreje do sobne temperature i je mešana pod tim uslovima tokom 1 sata. Reakcija je zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je podeljen između etil acetat i zasićenog vodenog NaHCO3. Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 30 do 70% (10% metanol u DCM sadrži 1% amonijum hidroksid) u DCM kako bi se dobio N-(4-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)azetidin-3-amin (166 mg, 55,6%) kao bledo čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) 0,96 - 1,20 (12H, m), 2,62 - 3,03 (2H, m), 3,10 - 3,42 (2H, m), 3,42 - 3,63 (3H, m), 3,63 - 3,80 (2H, m), 3,81 - 4,08 (3H, m), 4,15 - 4,28 (1H, m), 4,38 (1H, d), 5,23 (1H, s), 5,83 (2H, m), 6,80 (1H, m), 7,15 (1H, d), 7,32 - 7,53 (6H, m), 7,61 - 7,81 (4H, m), 8,06 (1H, s). Indazol NH nije primećen. M/z: ES+ [M+H]+ 702.

Priprema N-(4-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina

[0349]

[0350] 1-Fluoro-3-jodopropan (40 mg, 0,21 mmol) je dodat rastvoru N-(4-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)azetidin-3-amina (144 mg, 0,21 mmol) i DIPEA (107 µL, 0,62 mmol) u DMF (1 mL) na temperaturi okruženja. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata i zatim razređena sa EtOAc (40 mL) i oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (3 x 20 mL). Organski slojevi su osušeni preko MgSO4, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 15 do 30% (10% metanol u DCM sadrži 1% amonijum hidroksid) u DCM, kako bi se dobio N-(4-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin (87 mg, 56%) kao žuta čvrsta supstanca. M/z: ES+ [M+H]+ 762.

Primer 6

N-(4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina

[0351]

[0352] 1-Fluoro-3-jodopropan (40,9 µL, 0,39 mmol) je dodat rastvoru N-(4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)azetidin-3-amina (169 mg, 0,39 mmol) i DIPEA (203 µL, 1,16 mmol) u NMP (1,7 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon 18 sati, reakcija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš hromatografijom reverzne faze (C18), eluiranjem sa opadajuće polarnom smešom vode (sadrži 0,2 % amonijum hidroksid) i MeCN kao eluentima. Fragmenti proizvoda su kombinovani i liofilizovani kako bi se dobio N-(4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin (75 mg, 39%) kao bistar ostatak.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27°C) 0,39 - 0,46 (1H, m), 0,47 - 0,54 (1H, m), 0,77 - 0,85 (2H, m), 0,91 (3H, d), 1,51 - 1,64 (2H, m), 2,38 (2H, t), 2,54 (1H, dd), 2,63 (2H, q), 2,75 - 2,90 (2H, m), 3,14 (1H, dd), 3,52 - 3,64 (3H, m), 3,73 (3H, s), 3,79 - 3,88 (1H, m), 4,38 (2H, dt), 5,10 (1H, s), 5,82 - 5,87 (1H, m), 5,91 (1H, d), 6,09 (1H, d), 6,49 (1H, d), 6,57 (1H, d), 7,07 (1H, d), 7,94 (1H, s), 12,83 (1H, s). Mlz: ES+ [M+H]+ 496.

[0353] N-(4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)azetidin-3-amin je pripremljen kako sledi. Priprema (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksinhenil)-2-((1-fluorociklopropil) metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina

[0354]

[0355] (R)-3-(2-(((1-Fluorociklopropil)metil)amino)propil)-2-metilanilin (451 mg, 1,91 mmol) i 4-bromo-2-metoksibenzaldehid (410 mg, 1,91 mmol) u smeši vode (172 mg, 9,54 mmol) i sirćetne kiseline (7,5 mL) su zagrejani na 80°C tokom 6 sati. Reakcija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je tretiran sa vodenim HC1 (1N; 18 mL). Smeša je mešana na 80°C tokom 18 sati. Reakcija je zatim ohlađena i zasićen vodeni NaHCO3je dodat. Smeša je ekstrahovana sa DCM, i organski sloj je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 5 do 35% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (591 mg, 71,5%) kao gumasti film.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 0,42 - 0,61 (2H, m), 0,81 - 0,91 (2H, m), 0,93 (3H, d), 1,93 (3H, s), 2,43 - 2,48 (2H, m), 2,72 - 2,89 (2H, m), 3,48 - 3,57 (1H, m), 3,87 (3H, s), 4,57 (2H, s), 5,12 (1H, s), 6,24 (1H, d), 6,35 (1H, d), 6,82 (1H, d), 6,96 (1H, d), 7,16 (1 H, d). M/z: ES+ [M+H]+ 433.

Priprema (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-((1-fluorociklopropil) metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0356]

[0357] Sirćetna kiselina (0,392 ml, 6,84 mmol) je dodat (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-aminu (0,593 g, 1,37 mmol) u CHCl3(5 mL), i rezultujući rastvor je ohlađena do 0°C. Izopentil nitrit (0,321 g, 2,74 mmol) u CHCl3(1 mL) je dodat reakciji kapanjem, i reakcija je mešana na 0°C tokom dodatna 2 sata. Zatim je zasićeni vodeni NaHCO3(1 g u 20 mL vode) dodat polako. Reakcija je mešana na 0°C tokom 10 minuta, i zatim su slojevi razdvojeni. Organski sloj je prečišćen fleš kolonom hromatografije, gradijent eluiranja 5 do 35% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (0,299 g, 49,2%) kao svetlo braon čvrsta supstanca.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) δ ppm 0,39 - 0,65 (2H, m), 0,77 - 0,96 (2H, m), 1,00 (3H, d), 2,52 - 2,63 (1H, m), 2,87 - 3,03 (2H, m), 3,21 - 3,28 (1H, m), 3,71 (1 H, d), 3,92 (3H, s), 5,31 (1H, s), 6,65 (1H, d), 6,86 - 6,92 (1H, m), 6,97 (1H, m), 7,18 (1H, d), 7,23 (1H, d), 8,05 (1H, s), 12,94 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 444.

Priprema (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(O-fluorociklopropil) metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0358]

[0359] 3,4-Dihidro-2H-piran (176 µL, 1,93 mmol) je dodat rastvoru (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (286 mg, 0,64 mmol) i monohidrata para-toluensulfonske kiseline (12 mg, 0,060 mmol) u DCM (2,5 ml). Reakcija je podvrgnuta mikrotalasnim uslovima (100°C, 300W) tokom 6 sati. Nakon hlađenja, reakcija je oprana sa zasićenim vodenim NaHCO3, osušena preko Na2SO4, filtrirana, i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 10 do 30% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (299 mg, 88%) kao svetlo braon gumasta čvrsta supstanca. M/z: ES+ [M+H]+ 528.

Priprema terc-butil 3-((4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)amino)azetidin-1-karboksilata

[0360]

[0361] (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (278 mg, 0,53 mmol), terc-butil 3-ammoazetidm-1-karboksilat (136 mg, 0,79 mmol), cezijum karbonat (343 mg, 1,05 mmol), i BrettPhos pred-katalizator treće generacije (24 mg, 0,030 mmol) u dioksanu (2,5 mL) su podvrgnuti mikrotalasnim uslovima (100°C, 300W) tokom 6 sati.

Reakcija je zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je adsorbovan na silika gelu pre pročišćavanja pomoću fleš silika hromatografije, gradijent eluiranja 20 do 60% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio terc-butil 3-((4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksipbenil)amino)azetidin-1-karboksilat (296 mg, 91%). M/z: ES+ [M+H]+ 620.

Priprema N-(4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)azetidin-3-amina

[0362]

[0363] HC1 u dioksanu (4 M; 1,2 mL, 4,78 mmol) je dodat kapanjem rastvoru terc-butil 3-((4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)amino)azetidin-1-karboksilata (296 mg, 0,48 mmol) u MeOH (3,5 ml). Nakon mešanja na sobnoj temperaturi preko noći, reakcija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je rastvoren u MeOH (2 mL). Ovaj rastvor je zatim postavljen na SCX-2 jono-izmenjivačku patronu koja je prethodno tretirana sa metanolom. Patrona je oprana sa metanolom i zatim 7N amonijakom u metanolu. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio N-(4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]soquinolin-6-il)-3-metoksifenil)azetidin-3-amin (181 mg, 87%) kao bledo čvrsta supstanca. M/z: ES+ [M+H]+ 436.

Primer 7

(6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-6-(4-((1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)oksi)-2-metoksifenil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin

[0364]

[0365] 1-Fluoro-3-jodopropan (5,79 µL, 0,05 mmol) je dodat rastvoru soli (6S,8R)-6-(4-(azetidin-3-iloksi)-2-metoksifenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin trifluorosirćetne kiseline (0,030 g, 0,050 mmol) i DIPEA (0,029 mL, 0,16 mmol) u NMP (0,52 ml) na sobnoj temperaturi. Nakon 3 sata, reakcija je razblažena sa EtOAc (40 mL) i oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (3 x 20 mL). Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 15 do 30% (MeOH u DCM sadrži 1% amonijum hidroksid) u DCM kako bi se dobio (6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-6-(4-((1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)oksi)-2-metoksifenil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (5 mg, 18%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, Metanol-d4, 26°C) 0,45 - 0,56 (2H, m), 0,85 - 1,03 (2H, m), 1,12 (3H, d), 1,67 - 1,81 (2H, m), 2,50 - 2,62 (1H, m), 2,61 - 2,68 (2H, m), 2,92 (1H, dd), 3,08 - 3,21 (3H, m), 3,25 - 3,28 (1H, m), 3,70 - 3,84 (3H, m), 3,86 - 3,91 (3H, m), 4,45 (2H, dt), 4,73 - 4,82 (1H, m), 5,49 (1H, br. S), 6,19 (1H, d), 6,50 (1H, br. S.), 6,72 (1H, d), 6,79 (1H, d), 7,18 (1H, d), 8,05 (1H, s). Indazol NH nije primećen. M/z: ES+ [M+H]+ 497.

[0366] So N-(4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)azetidin-3-amin trifluorosirćetne kiseline je pripremljena kako sledi:

Priprema (6S,8R)-7-(1-fluorociklopropil)metil)-6-(2-metoksi-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)fenil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0367]

[0368] Smeša (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (369 mg, 0,70 mmol; pripremljen u skladu sa Primerom 6), bis(pinakolato)diboron (266 mg, 1,05 mmol), [1,1'-bis(difenilfosfino)ferocen]dihloropaladijum(II) (51 mg, 0,070 mmol) i kalijum acetata (233 mg, 2,37 mmol) u dioksanu (3,50 mL) je degazirana i isprana sa azotom. Reakciona smeša je zatim zagrejana do 80°C. Nakon mešanja pod tim uslovima tokom 18 sati, reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature, filtrirana kroz Celite® ploču, i oprana sa EtOAc(100 mL). Filtrat je oprana sa vodom (100 mL), vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (2 x 70 mL), i kombinovani organski slojevi su oprani sa vodom (3 x 70 mL) i zasićen vodeni natrijum hlorid (50 mL) pre nego što su osušeni preko MgSO4, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 25% etil acetata u heksanu kako bi se dobio (6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-6-(2-metoksi-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)fenil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (186 mg, 46,3%) kao žuta čvrsta supstanca. M/z: ES+ [M+H]+ 576.

Priprema 4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenola

[0369]

[0370] Vodeni vodonik peroksid (33%; 75 µL, 0,74 mmol) je dodat kapanjem mešanom rastvoru (6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-6-(2-metoksi-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)fenil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (186 mg, 0,32 mmol) i vodenog natrijum hidroksida (1 M; 350 µL, 0,32 mmol) u THF (2,5 mL) na 5°C pod vazduhom. Rezultujuća smeša je mešana na 5°C tokom 5 minuta. Reakcija je zatim razređena sa vodom (50 mL) i DCM (100 mL). Slojevi su razdvojeni, i vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (2 x 50 mL). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 20 do 50% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio 4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenol (94 mg, 62,5 %) kao žuta čvrsta supstanca, m/z: ES+ [M+H]+ 466.

Priprema terc-butil 3-(4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenoksi)azetidin-1-karboksilata

[0371]

[0372] Dietil (E)-diazen-1,2-dikarboksilat (88 mg, 0,20 mmol) je dodat rastvoru 4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenola (94 mg, 0,20 mmol), terc-butil 3-hidroksiazetidin-1-karboksilata (35 mg, 0,20 mmol), trifenilfosfina (53 mg, 0,20 mmol) i toluena (2,03 mL). Reakcija je zatim zagrejana do 110°C. Nakon 15 sati, reakcija je ohlađena, koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i prečišćena fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 30% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio terc-butil 3-(4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenoksi)azetidin-1-karboksilat (95 mg, 75%). M/z: ES+ [M+H]+ 621.

Priprema soli terc-butil 3-(4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenoksi)azetidin-1-karboksilat trifluorosirćetne kiseline

[0373]

[0374] HC1 u dioksanu (4N; 383 µL, 1,53 mmol) je dodat kapanjem rastvoru terc-butil 3-(4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenoksi)azetidin-1-karboksilata (95 mg, 0,15 mmol) u MeOH (1 mL), i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati. Reakcija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je prečišćen fleš hromatografijom reverzne faze, koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 0,01% TFA) i MeCN kao eluente (20 do 80%) kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-(azetidin-3-iloksi)-2-metoksifenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (30 mg, 36%) kao TFA so.<1>H NMR (300 MHz, MetanOL-d4, 27°C) 0,86 - 1,09 (2H, m), 1,26 - 1,52 (3H, m), 1,59 (3H, d), 3,22 - 3,31 (1H, m), 3,36 - 3,47 (1H, m), 3,66 (1 H, dd), 4,03 (3H, s), 4,07 - 4,27 (4H, m), 4,52 - 4,62 (2H, m), 5,14 - 5,27 (1H, m), 6,33 (1H, dd), 6,57 - 6,63 (1H, m), 6,68 (1H, d), 6,75 (1 H, s), 6,93 (1H, d), 7,50 (1H, d), 8,23 (1H, s). Indazol NH i dodavanje H nisu primećeni. M/z: ES+ [M+H]+ 437.

Primer 8

N-(3,5-difluoro-4-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin

[0375]

[0376] 1-Fluoro-3-jodopropan (5,4 µl, 0,050 mmol) i diizopropiletilamin (0,013 mL, 0,070 mmol) su dodati mešanom rastvoru N-(3,5-difluoro-4-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroethy1)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)azetidin-3-amina (22 mg, 0,050 mmol) u NMP (0,4 mL) na temperaturi okruženja. Nakon 16 sati sirova reakcija je prečišćen direktno preparativnom HPLC reverzne faze (Waters XBridge C18 kolona, 19 mm prečnik, 100 mm dužina, 5 µm silika), gradijent eluiranja 40 do 70% MeCN u vodi koji sadrži 0,2% amonijum hidroksid kao modifikator. Fragmenti proizvoda su koncentrovani do suvoće kako bi se dobio N-(3,5-difluoro-4-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin (9 mg, 36%) kao bledo žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CD2Cl2, 27°C) 1,11 (3H, d), 1,69 - 1,78 (3H, m), 2,51 - 2,59 (2H, m), 2,81 - 2,94 (3H, m), 2,95 - 3,03 (1H, m), 3,16 - 3,30 (1H, m), 3,59 - 3,70 (3H, m), 3,94 - 4,05 (1H, m), 4,41 (1H, t), 4,45 (1H, d), 4,51 (1H, t), 5,27 (1H, s), 6,02 (2H, d), 6,83 (1H, d), 7,21 (1H, d), 8,03 (1H, s), 10,47 (1H,br. S). M/z: ES+ [M+H]+ 512.

[0377] N-(3,5-difluoro-4-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)azetidin-3-amin je pripremljen kako sledi;

Priprema 2,2,2-trifluoroetil trifluorometansulfonata

[0378]

[0379] Trifluorometansulfonski anhidrid (3,14 mL, 18,6 mmol) je dodat kapanjem pomoću šprica tokom 5 minuta mešanom rastvoru 2,2,2-trifluoroetan-1-ol (1,23 mL, 16,9 mmol) i 2,6-dimetilpiridina (2,36 mL, 20,3 mmol) u DCM (50 mL) na -10°C. Nakon 2 sata reakcija je oprana sukcesivno sa vodenim HC1 (1N; 2 x 30 mL) i zasićenim vodenim NaHCO3(20 mL). Organski sloj je zatim osušena preko MgSO4, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 2,2,2-trifluoroetil trifluorometansulfonat (0,92 g, 23%) kao crveno ulje.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3, 27°C) 4,69 (2H, q).

Priprema (R)-2-metil-3-(2-((2,2,2-trifluoroetil)amino)propil)anilina

[0380]

[0381] 2,2,2-Trifluoroetil trifluorometansulfonat (1,3 g, 2,8 mmol) je dodat mešanom rastvoru (R)-3-(2-aminopropil)-2-metilanilina (0,460 g, 2,80 mmol; pripremljen u skladu sa Primerom 3) i diizopropiletilamina (0,636 mL, 3,64 mmol) u 1,4-dioksanu (10 mL). Reakcija je zagrejana na 65°C tokom 15 sati i zatim ohlađena i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je rastvoren u EtOAc (50 mL) i opran sa smešom zasićenog vodenog NaHCO3i zasićenog vodenog natrijum hlorida. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (20 mL), i kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je rastvoren u MeOH, adsorbovan na dijatomejskoj zemlji pod redukovanim pritiskom, i prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 1 do 6% MeOH u DCM. Fragmenti proizvoda su koncentrovani do suvoće kako bi se dobio (R)-2-metil-3-(2-((2,2,2-trifluoroetil)amino)propil)anilin (0,30 g, 44%) kao bledo narandžasta guma.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3, 27°C) 1,07 (3H, d), 2,09 (3H, s), 2,63 (1H, dd), 2,76 (1H, dd), 2,92 - 3,05 (1H, m), 3,15 (2H, q), 6,58 (2H, d), 6,85 - 7,00 (1H, m). Signali za tri NH's nisu primećeni. M/z: ES+ [M+H]+ 247.

Priprema (1S,3R)-1-(4-bromo-2,6-difluoroi)henil)-3,5-dimetil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina

[0382]

[0383] (R)-2-metil-3-(2-((2,2,2-trifluoroetil)amino)propil)anilin (303 mg, 1,23 mmol) i 4-bromo-2,6-difluorobenzaldehid (544 mg, 2,46 mmol) su zagrejani u smeši sirćetne kiseline (5 mL) i vode (0,111 mL) na 90°C tokom 2 sata. Reakciji je omogućeno da se polako ohladi do temperature okruženja i mešana je preko noći. Reakcija je zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je rastvoren u EtOAc (30 mL) i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3(2 x 20 mL). Kombinovani vodeni slojevi su ekstrahovani sa EtOAc (2 x 20 mL), i kombinovani organski slojevi su oprani sa zasićenim vodenim natrijum hloridom i koncentrovani do minimalne zapremine (∼20 mL). Vodeni HC1 (1N; 20 mL) je dodat, i dvofazna smeša je mešana energično tokom 2 sata. Slojevi su razdvojeni, i vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (20 mL). Vodeni sloj je bazifikovan dodavanjem čvrstog natrijum karbonata (dok pH nije dostigao ∼8 kako je izmereno koristeći pH traku) i zatim ekstrahovan sa DCM (3 x 20 mL). Kombinovani DCM ekstrakti su osušeni preko MgSO4, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobilo 40 mg sirovog proizvoda. Za to vreme, kombinovani EtOAc ekstrakti su oprani sa zasićenim vodenim natrijum hloridom i koncentrovani do suvoće. Rezultujući ostatak je rastvoren u THF (10 mL) i mešana sa polistiren-vezanim tosilhidrazidom (1,03 g, 2,76 mmol) tokom 14 sati. Smeša je filtrirana, i smola je oprana sukcesivno sa THF (10 mL) i MeOH (3 x 10 mL). Filtrat je kombinovani sa prethodno dobijenih otprilike 40 mg sirovog proizvoda i koncentrovan je pod redukovanim pritiskom. Ovaj konačni ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 30% EtOAc u heksanima. Fragmenti proizvoda su koncentrovani do suvoće kako bi se dobio (1S,3R)-1-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-3,5-dimetil-2-(2,2,2-tnfluoroetil)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (230 mg, 41%) kao bledo žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3, 27°C) 1,04 (3H, d), 2,42 (3H, s), 2,58 (1H, dd), 2,74 - 2,87 (1H, m), 3,02 - 3,28 (2H, m), 3,46 - 3,59 (1H, m), 5,27 (1H, s), 6,66 (1H, d), 7,02 (2H, d), 7,32 (1H, d), 9,95 - 10,73 (2H, br. S). M/z: ES+ [M+H]+ 449.

Priprema (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0384]

[0385] Rastvor natrijum nitrita (35 mg, 0,51 mmol) u vodi (0,20 mL) je dodat kapanjem tokom 1 minuta mešanom rastvoru (1S,3R)-1-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-3,5-dimetil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina (230 mg, 0,51 mmol) u propinonskoj kiselini (2 mL) na otprilike -20°C (led-NaCl kada). Nakon 15 minuta reakcija je razblažena sa ledeno hladnim EtOAc (15 mL). Dvofazna smeša je mešana energično pod tim uslovima i neutralizovana je laganim dodavanjem čvrstog Na2CO3(dok nije postala bazna kako je izmereno koristeći pH traku). Kada za hlađenje je uklonjena. Faze su razdvojene, i organski sloj je opran sa zasićenim vodenim NaHCO3(2 x 15 mL), zasićenim vodenim natrijum hloridom (15 mL), osušen preko MgSO4, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 5 do 35% EtOAc u heksanima. Fragmenti proizvoda su koncentrovani do suvoće kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (104 mg, 45%) kao bledo narandžasti film.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3, 27°C) 1,15 (3H, d), 2,89 - 3,04 (2H, m), 3,20 - 3,36 (1H, m), 3,50 (1H, dd), 3,61 -3,75 (1H, m), 5,41 (1H, s), 6,80 (1H, d), 7,01 - 7,11 (2H, m), 7,23 (1H, d), 8,10 (1H, s), 10,24 (1H, br. S). M/z: ES+ [M+H]+ 460.

Priprema (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0386]

[0387] 3,4-Dihidro-2H-piran (0,103 mL, 1,13 mmol) i p-toluensulfonska kiselina monohidrat (2 mg, 0,01 mmol) su dodati mešanom rastvoru (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (104 mg, 0,23 mmol) u DCM (1,5 mL). Reakcija je održavana pod uslovima refluksa tokom 1 sata. Nakon hlađenja, reakcija je razblažena sa DCM, oprana sa zasićenim vodenim NaHCO3, osušena preko MgSO4, filtrirana, i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 30% EtOAc u heksanima. Fragmenti proizvoda su koncentrovani do suvoće kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (117 mg, 95%) kao bledo žuta čvrsta supstanca. M/z: ES+ [M+H]+ 544.

Priprema terc-butil 3-((3,5-difluoro-4-((6S,8R)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)amino)azetidin-1-karboksilata

[0388]

[0389] Bočica opremljena šipkom za mešanje je napunjena sa (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolinom (55 mg, 0,10 mmol), terc-butil 3-aminoazetidin-1-karboksilatom (26 mg, 0,15 mmol), Pd2dba3(9 mg, 0,01 mmol), ksantfosom (12 mg, 0,02 mmol), i cezijum karbonatom (99 mg, 0,30 mmol). Bočica je zapečaćena i evakuisana/ponovo napunjena sa azotom (3x) pre dodavanja degaziranog 1,4-dioksana (1 mL) pomoću šprica. Smeša je mešana na temperaturi okruženja tokom 2 minuta, zatim je smeštena u blok za zagrevanje koji je unapred zagrejan do 90°C. Nakon 22 sata, smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i zatim je razređena sa EtOAc. Smeša je filtrirana kroz dijatomejsku zemlju, i filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 45% EtOAc u heksanima. Fragmenti proizvoda su koncentrovani do suvoće kako bi se dobio tercbutil 3-((3,5-difluoro-4-((6S,8R)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-7-(2,2,2-trifluoroetil)6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)amino)azetidin-1-karboksilat (46 mg, 72%) kao bledo žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3, 27°C) 1,08 (3H, d), 1,42 (9H, s), 1,55 - 1,81 (4H, m), 1,97 - 2,23 (2H, m), 2,45 - 2,63 (1H, m), 2,80 - 3,02 (2H, m), 3,09 - 3,27 (1H, m), 3,34 - 3,47 (1H, m), 3,53 - 3,65 (1H, m), 3,66 - 3,75 (3H, m), 3,92 -4,02 (1H, m), 4,19 - 4,32 (3H, m), 5,25 (1H, s), 5,58 - 5,67 (1H, m), 5,93 (2H, dd), 6,81 (1H, d), 7,22 - 7,27 (1H, m), 7,98 (1H, s). Delimično preklapanje multipleta na 7,22 do 7,27 ppm sa hloroformom, m/z: ES+ [M+H]+ 636.

Priprema N-(3,5-difluoro-4-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izopuinolin-6-il)fenil)azetidin-3-amina

[0390]

[0391] Terc-butil 3-((3,5-difluoro-4-((6S,8R)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)amino)azetidin-1-karboksilat (46 mg, 0,08 mmol) je rastvoren u mravljoj kiselini (0,50 mL, 13 mmol), i mešani rastvor je zagrejana do 30°C. Nakon 27 sata reakcija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je rastvoren u 5% IPA/DCM i neutralizovan sa zasićenim vodenim NaHCO3. Faze su razdvojene, i vodeni sloj je ekstrahovan sa 5% IPA/DCM (2 x 4 mL). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov N-(3,5-difluoro-4-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)azetidin-3-amin (38 mg, 111%) zagađen sa malom količinom početnog materijala kom je delimično uklonjena zaštita kao bledo žut film. M/z: ES+ [M+H]+ 452.

Primer 9

5-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo [4,3-f]izopuinolin-6-il)-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-4-metoksipiridin-2-amin

[0392]

[0393] DMF (1 mL) i DIPEA (0,022 ml, 0,13 mmol) su dodati sekvencijalno boci napunjenoj sa N-(azetidin-3-il)-5-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-4-metoksipiridin-2-aminom (22 mg, 0,050 mmol).1-Fluoro-3-jodopropan (9 mg, 0,05 mmol) u DMF (0,1 mL) je zatim dodat. Nakon 2 sata, reakcija je razblažena sa zasićenim vodenim natrijum hloridom, i smeša je ekstrahovana u EtOAC (3x). Kombinovani organski slojevi su oprani sa vodom i osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući sirov film je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 2 do 10% MeOH u DCM, kako bi se dobio 5-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-4-metoksipiridin-2-amin (9,0 mg, 36%) kao suv film.<1>H NMR (500 MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) δ ppm 0,46 - 0,66 (2H, m), 0,85 - 1,05 (2H, m), 1,09 (3H, d), 1,64 - 1,78 (2H, m), 2,50 - 2,61 (3H, m), 2,83 (1H, dd), 2,87 - 2,96 (2H, m), 3,04 - 3,21 (2H, m), 3,56 - 3,69 (2H, m), 3,70 - 3,76 (1H, m), 3,85 (3H, s), 4,30 - 4,37 (1H, m), 4,45(2H, dt), 4,93 (1H, br d), 5,32 (1H, s), 5,82 (1H, s), 6,76 (1H, d), 7,00 (1H, d), 7,32 (1H, s), 7,99 (1H, s), 11,00 (1H, br s). M/z: ES+ [M+H]+ 497

[0394] N-(azetidin-3-il)-5-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-4-metoksipiridin-2-amin je pripremljen kako je opisano u nastavku.

Priprema (1S,3R)-1-(6-bromo-4-metoksipiridin-3-il)-2-((1-fluorociklopropil) metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina

[0395]

[0396] 6-Bromo-4-metoksinicotinaldehid (1,46 g, 6,77 mmol) je dodat rastvoru (R)-3-(2-(((1fluorociklopropil)metil)amino)propil)-2-metilanilin (0,800 g, 3,39 mmol) u AcOH (27 ml) i vodi (0,305 g, 16,9 mmol), i reakcija je zagrejana na 85°C tokom 18 sati. Nakon hlađenja, reakcija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je razblažen sa etil acetatom i bazifikovana sa zasićenim vodenim natrijum hidrogenkarbonatom. Organski sloj je kombinovan sa vodenim HCl (1N), i dvofazna smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Organski sloj je opran sa vodenim HC1 (1N), zatim su kombinovani vodeni slojevi ekstrahovani sa etil acetatom. Vodeni sloj je zatim bazifikovan dodavanjem čvrstog K2CO3i ekstrahovan sa etil acetatom (2x). Kombinovani etil acetat ekstrakti iz bazifikovanog vodenog sloja su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen silika fleš hromatografijom, gradijent eluiranja 10 do 100% etil acetata u heksanima kako bi se dobio (1S,3R)-1-(6-bromo-4-metoksipiridin-3-il)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (0,450 g, 30,6%) kao guma.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 27°C) δ ppm 0,47 - 0,64 (2 H, m), 0,87 - 0,98 (5 H, m), 1,95 (3 H, s), 2,42 - 2,48 (1H, m), 2,79 (1H, dd), 2,87 - 2,99 (1H, m), 3,41 - 3,50 (H, m), 3,92 - 3,97 (3H, m), 4,66 (2H, s), 5,11 (1H, s), 6,30 (1H, d), 6,39 (1H, d), 7,26 (1H, s), 7,64 (1H, s). Jedan vodonik zaklonjen sa DMSO. M/z : ES+ [M+H]+ 434.

Priprema (6S,8R)-6-(6-bromo-4-metoksipiridin-3-il)-7-((1-fluorociklopropil) metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0397]

[0398] Rastvor natrijum nitrita (0,045 g, 0,65 mmol) u vodi (0,75 mL) je dodat kapanjem rastvoru (1S,3R)-1-(6-bromo-4-metoksipiridin-3-il)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina (0,270 g, 0,62 mmol) u propinonskoj kiselini (3,0 mL) na -15°C (so/ledena kada), i reakcija je mešana pod tim uslovima 1 sata. Ledeno hladni EtOAc (10 mL) je dodat praćen zasićenim vodenim NaHCO3(15 mL) iz delova.

Slojevi su razdvojeni, i organski sloj je opran sa zasićenim vodenim NaHCO3(2X).

Kombinovani vodeni slojevi (pH=8) su ekstrahovani sa EtOAc, i zatim su svi kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen silika fleš hromatografijom, gradijent eluiranja 20 do 60% etil acetata u heksanima kako bi se dobio (6S,8R)-6-(6-bromo-4-metoksipiridin-3-il)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (0,11 g, 41%) kao guma.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 27°C) 0,47 - 0,64 (2H, m), 0,87 - 0,97 (2H, m), 0,97 - 1,01 (3H, m), 2,51 - 2,63 (1H, m), 2,89 (1H, dd), 2,94 - 3,06 (1H, m), 3,23 (1H, br dd), 3,54 - 3,67 (1H, m), 3,97 (3H, s), 5,28 (1H, s), 6,68 (1H, d), 7,21 (1H, d), 7,30 (1H, s), 7,68 (1H, s), 8,06 (1H, s), 12,98 (1 H, br s). M/z : ES+ [M+H]+ 445.

Priprema (6S,8R)-6-(6-bromo-4-metoksi-3-piridil)-7-[(1-fluorociklopropil) metil]-8-metil-3-[(2R)-tetrahidropiran-2-il]-8,9-dihidro-6H-pirazolo[4,3-f]izohinolina i (6S,8R)-6-(6-bromo-4-metoksipiridin-3-il)-7-(1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0399]

[0400] DCM (4 mL) je dodat boci napunjenoj sa (6S,8R)-6-(6-bromo-4-metoksipiridin-3-il)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolinom (150 mg, 0,34 mmol) i hidratom 4-metilbenzensulfonske kiseline (71 mg, 0,37 mmol). 3,4-Dihidro-2H-piran (43 mg, 0,51 mmol) je dodat mešanoj reakciji, i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Reakcija je oprana sa zasićenim vodenim natrijum hidrogenkarbonatom, i organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobila sirova braon guma. Ovo je prečišćeno fleš hromatografijom, gradijent eluiranja 5 do 40% EtOAc u heksanima kako bi se dobila smeša (6S,8R)-6-(6-bromo-4-metoksi-3-piridil)-7-[(1-fluorociklopropil)metil]-8-metil-3-[(2R)-tetrahidropiran-2-il]-8,9-dihidro-6H-pirazolo[4,3-f]izohinolina i (6S,8R)-6-(6-bromo-4-metoksipiridin-3-il)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (151 mg, 85%) kao guma.<1>H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) 0,45 - 0,61 (2H, m), 0,96 - 1,06 (2H, m), 1,09 (3H, d), 1,46 - 1,91 (3H, m), 2,03 - 2,20 (2H, m), 2,47 - 2,63 (2H, m), 2,88 (1H, ddd), 3,14 (1H, dd), 3,20 -3,31 (1 H, m), 3,64 - 3,79 (2H, m), 3,96 (3H, d), 3,98 - 4,06 (1H, m), 5,40 (1H, d), 5,64 - 5,71 (1H, m), 6,78 (1H, d), 6,99 (1H, d), 7,25 - 7,33 (1H, m), 7,76 (1H, d), 8,02 (1H, d).

Priprema terc-butil 3-((5-((6S,8R)-7-(1-fluorociklopropil)methy)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-4-metoksipiridin-2-il)amino)azetidin-1-karboksilata i terc-butil 3-(5-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-4-metoksipiridin-2-ilamino)azetidin-1-karboksilata

[0401]

[0402] Dioksan (2,7 mL) je dodat boci napunjenoj smešom (6S,8R)-6-(6-bromo-4-metoksipiridin-3-il)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina i (6S,8R)-6-(6-bromo-4-metoksipiridin-3-il)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (140 mg, 0,26 mmol), cezijum karbonata (172 mg, 0,53 mmol) i terc-butil 3-aminoazetidin-1-karboksilata (68 mg, 0,40 mmol), i reakciona boca je evakuisana i ponovo napunjena sa azotom (3x). BrettPhos pred-katalizator treće generacije (24 mg, 0,030 mmol) je dodat, i boca je ponovo evakuisana i ponovo napunjena sa azotom (3x). Reakcija je zagrejana na 110°C tokom 4 sata. Reakcija je ohlađena do sobne temperature, filtrirana, i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujuća guma je prečišćena fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 30 do 100% etil acetata u heksanima kako bi se dobila smeša terc-butil 3-((5-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-4-metoksipiridin-2-il)amino)azetidin-1-karboksilata i terc-butil 3-(5-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-4-metoksipiridin-2-ilamino)azetidin-1-karboksilata (53 mg, 32%) kao suv film.<1>H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) 0,50 - 0,68 (2H, m), 0,96 - 1,09 (2H, m), 1,12 (3H, d), 1,42 - 1,47 (9H, m), 1,60 - 1,88 (3H, m), 2,07 - 2,21 (2H, m), 2,50 - 2,67 (2H, m), 2,85 (1H, ddd), 3,10 - 3,23 (2H, m), 3,63 - 3,79 (4H, m), 3,87 - 3,91 (3H, m), 3,99 - 4,07 (1H, m), 4,24 - 4,33 (2H, m), 4,42 - 4,52 (1H, m), 5,36 (1H, d), 5,64 - 5,73 (1H, m), 5,83 (1H, d), 6,85 (1H, d), 7,26 - 7,32 (2H, m), 7,40 (1H, d), 8,00 - 8,03 (1H, m). Mlz: ES+ [M+H]+ 621.

Priprema N-(azetidin-3-il)-5-((6S,8R)-7-((1fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]soquinolin-6-il)-4-metoksipiridin-2-amina

[0403]

[0404] Metanol (0,5 mL) je dodat boci napunjenoj sa terc-butil 3-((5-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-4-metoksipiridin-2-il)amino)azetidin-1-karboksilatom (0,047 g, 0,080 mmol). HCl u dioksanu (4 M; 0,5 mL, 2 mmol) je dodat, i mešanje je nastavljeno tokom 2 sata. Reakcija je zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je prečišćen koristeći SCX-2 patronu, eluiranjem sa 3N amonijakom u metanol, kako bi se dobio sirov N-(azetidin-3-il)-5-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-4-metoksipiridin-2-amin (25 mg, 76%) kao guma. Proizvod je korišćen u narednom koraku bez daljeg prečišćavanja. Mlz: ES+ [M+H]+ 437.

Primer 10

N-(4-((6S,8R)-7-((3-(fluorometil)oksetan-3-il)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin

[0406] 1-(3-Fluoropropil)azetidin-3-amin (47,3 mg, 0,36 mmol) je dodat u 1,4-dioksanu (1,4 mL) zapečaćenoj mikrotalasnoj bočici koja sadrži (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-((3-(fluorometil)oksetan-3-il)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (100 mg, 0,18 mmol), natrijum terc-butoksid (34,4 mg, 0,36 mmol) i [(2-di-cikloheksilfosfino-3,6-dimetoksi-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenil)-2-(2'-amino-1,1'-bifenil)]paladijum(II) metansulfonat (BrettPhos Pd G3) (8,10 mg, 8,95 µmol). Bočica je degazirana sa penušavim azotom tokom 10 minuta, zatim je zagrejana do 90°C tokom 1 sata. Nakon hlađenja, reakcija je razblažena sa EtOAc i oprana sa vodom. Vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc, zatim je kombinovana organska materija isparena. Sirov ostatak je rastvoren u DCM (2 mL) i TFA (1 mL) je dodat. Smeša je mešana tokom 1 sata, zatim isparena. Ostatak je rastvoren u DCM i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3rastvorom. Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM, zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4i isparena. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (Waters XBridge Prep C18 OBD kolona, 5µ silika, 19 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 0,1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željena jedinjenja su ispareni do suvoće kako bi se dobio N-(4-((6S,8R)-7-((3-(fluorometil)oksetan-3-il)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin (59,0 mg, 63%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,07 (3H, d), 1,68 - 1,87 (2H, m), 2,62 (2H, t), 2,75 (1H, d), 2,83 (1H, dd), 2,87 - 2,96 (3H, m), 3,10 (1H, dd), 3,27 (1H, dt), 3,74 (2H, q), 3,84 (3H, s), 4,04 - 4,14 (2H, m), 4,43 (4H, td), 4,53 (1H, t), 4,58 (1H, d), 4,78 (2H, td), 5,11 (1H, s), 5,90 (1H, dd), 6,12 (1H, d), 6,48 (1H, d), 6,80 (1H, d), 7,15 (1H, d), 8,05 (1H, d); m/z: ES+ [M+H]+ 526.

[0407] N-(4-((6S,8R)-7-((3-(fluorometil)oksetan-3-il)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin je pripremljen kako sledi:

Priprema (3-(fluorometil)oksetan-3-il)metanola

[0408]

[0409] cezijum fluorid (5,03 g, 33,14 mmol) je dodat boci koja sadrži (3-(bromometil)oksetan-3-il)metanol (2,00 g, 11,05 mmol) u etilen glikolu (6 mL) i reakcija je zagrejana do 150°C tokom 2 sata. Nakon hlađenja, reakcija je razblažena sa EtOAc (30 mL) i vodom (30 mL). Vodeni deo je ekstrahovan sa dietil etrom (3 x 30 mL) i etil acetatom (3 x 30 mL). Kombinovana organska materija je osušena preko MgSO4, filtrirana i isparena, zatim je sirov proizvod prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 100% EtOAc u heptanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio (3-(fluorometil)oksetan-3-il)metanol (0,734 g, 55%) kao bezbojna tečnost.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 3,92 (2H, s), 4,52 (4H, t), 4,59 - 4,89 (2H, m).

Priprema (3-(fluorometil)oksetan-3-il)metil trifluorometansulfonata

[0410]

[0411] Trifluorometansulfonski anhidrid (1,47 ml, 8,74 mmol), praćen sa 2,6-dimetilpiridinom (1,12 ml, 9,57 mmol) je dodat rastvoru (3-(fluorometil)oksetan-3-il)metanol (1,00 g, 8,32 mmol) u DCM (30,7 mL) i reakcija je mešana na 0°C tokom 1 sata. Reakcija je oprana sa vodom i rastvorom 1N limunske kiseline, zatim osušena preko Na2SO4, filtrirana i isparena kako bi se dobio (3-(fluorometil)oksetan-3-il)metil trifluorometansulfonat (1,98 g, 94%) kao crveno ulje, koje je korišćeno direktno bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 4,40 - 4,75 (8H, m).

Priprema (R)-3-(2-(((3-(fluorometil)oksetan-3-il)metil)amino)propil)-2-metilanilina [0412]

[0413] (3-(Fluorometil)oksetan-3-il)metil trifluorometansulfonat (1,92 g, 7,61 mmol) je dodat rastvoru (R)-3-(2-aminopropil)-2-metilanilin (1,00 g, 6,09 mmol) i DIPEA (1,58 ml, 9,13 mmol) u 1,4-dioksanu (18,7 mL) i reakcija je zagrejana do 70°C tokom 5 sati. Nakon hlađenja, reakcija je razblažena sa EtOAc i oprana sa vodom. Vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc, zatim je kombinovana organska materija osušena preko Na2SO4, filtrirana i isparena. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 10% MeOH u EtOAc. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio (R)-3-(2-(((3-(fluorometil)oksetan-3-il)metil)amino)propil)-2-metilanilin (0,673 g, 42%) kao bledo žuta guma.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,11 (3H, d), 2,04 (3H, s), 2,59 - 2,71 (1H, m), 2,76 - 3,10 (4H, m), 4,34 - 4,52 (4H, m), 4,53 - 4,68 (2H, m), 6,58 (1H, d), 6,60 (1H, d), 6,95 (1H, t). Mlz: ES+ [M+H]+ 267.

Priprema (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-2-((3-(fluorometil)oksetan-3-il)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina

[0414]

[0415] 4-Bromo-2-metoksibenzaldehid (645 mg, 3,00 mmol) je dodat rastvoru (R)-3-(2-(((3-(fluorometil)oksetan-3-il)metil)amino)propil)-2-metilanilin (400 mg, 1,5 mmol) u sirćetnoj kiselini (7,4 mL) i vodi (135 µl, 7,50 mmol). Reakcija je zagrejana do 80°C tokom 4 sata. Nakon hlađenja, sirćetna kiselina je isparena, zatim je ostatak rastvoren u DCM i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3. Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i isparen.

Ostatak je rastvoren u metanolu (5 mL), zatim su hidroksilamin hlorovodonik (313 mg, 4,50 mmol) i kalijum acetat (588 mg, 6,00 mmol) dodati i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Isparljive materije su isparene, zatim je ostatak rastvoren u DCM i vodi. Slojevi su razdvojeni, zatim je vodeni deo ekstrahovan sa DCM. Kombinovana organska materija je osušena preko Na2SO4, filtrirana i isparena, zatim je sirov proizvod prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu.

Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-2-((3-(fluorometil)oksetan-3-il)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (302 mg, 43%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,01 (3H, d), 2,07 (3H, s), 2,45 (1H, dd), 2,61 - 2,73 (1H, m), 2,86 (1H, d), 3,01 - 3,14 (1H, m), 3,54 (2H, s), 3,87 (3H, s), 4,41 - 4,48 (2H, m), 4,51 (1H, d), 4,53 - 4,60 (2H, m), 4,67 (1H, d), 4,73 - 4,81 (1H, m), 5,00 (1H, s), 6,47 (1H, s), 6,47 (1H, s), 6,61 (1H, d), 6,88 (1H, dd), 7,01 (1H, d). Mlz: ES+ [M+H]+ 463.

Priprema (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-((3-(fluorometil)oksetan-3-il)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0416]

[0417] Natrijum nitrit (39,1 mg, 0,57 mmol) je dodat u vodi (0,5 mL) ohlađenom rastvoru (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-2-((3-(fluorometil)oksetan-3-il)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina (250 mg, 0,54 mmol) u propinonskoj kiselini (2,2 mL) na -15°C (kada suvog leda/acetona). Nakon mešanja tokom 30 minuta, ledeno hladni toluen (15 mL) je dodat i reakcija je mešana na 0°C tokom 15 minuta i zatim zagrejana do sobne temperature tokom 1 sata. Voda (15 mL) je dodata i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (2 x 15 mL), zatim kombinovana organska materija je oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom, osušena preko Na2SO4, filtrirana i isparena. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-((3-(fluorometil)oksetan-3-il)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (188 mg, 74%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,07 (3H, d), 2,70 (1H, d), 2,87 (1H, dd), 2,97 (1H, d), 3,11 - 3,18 (1H, m), 3,18 - 3,27 (1H, m), 3,90 (3H, s), 4,42 - 4,52 (3H, m), 4,59 (1H, d), 4,63 - 4,87 (2H, m), 5,19 (1H, s), 6,63 (1H, d), 6,76 (1H, d), 6,88 (1H, dd), 7,05 (1H, d), 7,19 (1H, d), 8,09 (1H, d). Mlz: ES+ [M+H]+ 474.

Priprema (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-((3-(fluorometil)oksetan-3-il)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0418]

[0419] 3,4-dihidro-2H-piran (67,3 µl, 0,74 mmol) je dodat rastvoru (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-((3-(fluorometil)oksetan-3-il)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (175 mg, 0,37 mmol) i hidrata 4-metilbenzensulfonske kiseline (14,0 mg, 0,07 mmol) u DCM (3,6 mL) i reakcija je mešana na 40°C tokom 2 sata. Nakon hlađenja, reakcija je razblažena sa DCM i oprana sa zasićenim vodenim NaHCO3, osušena preko Na2SO4, filtrirana i isparena. Ostatak je provučen kroz silika čep, eluiran sa EtOAc/heptanom (1:1). Filtrat je isparen kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-((3-(fluorometil)oksetan-3-il)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (196 mg, 95%) kao bež čvrsta supstanca, koji je korišćen direktno u sledećoj fazi. Mlz: ES+ [M+H]+ 558.

Primer 11

N-(3,5-difluoro-4-((6S,8R)-7-(1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin

[0420]

[0421] 4N HCl u dioksanu (0,25 mL, 0,99 mmol) je dodato rastvoru N-(3,5-difluoro-4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina (58 mg, 0,10 mmol) u metanolu (0,30 mL) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Ispraljive materije su isparene i ostatak je suspendovan u zasićenom vodenom NaHCO3(30 mL) i ekstrahovan sa DCM (x2). Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i isparena. Sirov ostatak je prečišćen silika gel hromatografijom i eluiran koristeći gradijent od 0 do 10% 1M NH3/MeOH u DCM. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio N-(3,5-difluoro-4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin (45,4 mg, 91%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDC13, 27°C) 0,47 (2H, dtd), 0,95 (2H, dt), 1,08 (3H, d), 1,68 - 1,85 (2H, m), 2,59 (2H, s), 2,69 (1H, dd), 2,91 (3H, dq), 3,14 (1H, dd), 3,43 (1H, dd), 3,69 (2H, q), 3,81 (1H, dd), 4,01 (1H, q), 4,28 (1H, d), 4,43 (1H, t), 4,53 (1H, t), 5,19 (1H, s), 5,96 (2H, d), 6,82 (1H, d), 7,15 (1H, d), 8,06 (1H, d), 10,36 (1H, s). M/z (ES+), [M+H]<+>= 502.

[0422] N-(3,5-difluoro-4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin je pripremljen kako sledi:

Priprema (1S,3R)-1-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina

[0423]

[0424] (R)-3-(2-(((1-Fluorociklopropil)metil)amino)propil)-2-metilanilin (0,35g, 1,48 mmol) i 4-bromo-2,6-difluorobenzaldehid (0,33 g, 1,48 mmol) u smeši H2O (0,13 mL, 7,40 mmol) i sirćetna kiselina (5,79 mL) su zagrejani na 80°C tokom 7 sati. Rastvarač je isparen i ostatak je tretiran sa HCl (1N, 10 mL) i mešan je na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Reakciji je dodat čvrst Na2CO3dok pH reakcije nije dostigao >8. Smeša je razblažena sa H2O (40 mL) i ekstrahovana dvaput sa EtOAc (2x50 mL). Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana, koncentrovana i prečišćena je silika hromatografijom (10 do 70% EtOAc u heptanu) kako bi se dobio (1S,3R)-1-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (0,285 g, 44%) kao bledo žuta guma.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 0,44 (2H, dq), 0,91 - 0,95 (1H, m), 0,95 - 0,99 (1H, m), 1,02 (3H, d), 2,06 (3H, s), 2,50 - 2,65 (2H, m), 3,00 - 3,15 (2H, m), 3,50 (2H, s), 3,69 (1H, d), 5,17 (1H, s), 6,42 (2H, s), 6,97 (1H, d), 6,99 (1H, d). M/z (ES+), [M+H]+ = 439.

Priprema (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0425]

[0426] (1S,3R)-1-(4-Bromo-2,6-difluorofenil)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (0,280 g, 0,64 mmol) u propinonskoj kiselini (2,66 mL) je ohlađen do -17°C (kada suvog leda/acetona). Natrijum nitrit (0,044 g, 0,64 mmol) u vodi (0,53 mL) je dodat kapanjem i reakciona smeša je mešana na -17°C tokom 30 minuta.

Reakciona smeša je razblažena sa ledeno hladnim toluenom (15 mL) i mešana je na 4°C tokom 15 minuta. Smeša je zatim mešana i zagrejana do sobne temperature tokom 45 minuta. Reakciona smeša je oprana sa vodom (2 x 15 mL), kombinovane vodene faze su oprane sa EtOAc (2 x 10 mL), kombinovana organska materija oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (1 x 20 mL), osušen (MgSO4), filtrirana i filtrat isparen do narandžasto-braon ulja. Sirov materijal je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0-40% EtOAc u heptanu kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (0,216 g, 75%) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 0,46 (2H, dddd), 0,91 - 1,04 (2H, m), 1,07 (3H, d), 2,66 (1H, dd), 2,95 (1H, dd), 3,15 (1H, dd), 3,46 (1H, dd), 3,83 (1H, dd), 5,32 (1H, s), 6,76 (1H, d), 7,00 (2H, d), 7,18 (1H, d), 8,09 (1H, d), 10,52 (1H, s). M/z (ES+), [M+H]+ = 450.

Priprema (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin i (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenvl)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0427]

[0428] Mikrotalasna bočica je napunjena sa (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolinom (216 mg, 0,48 mmol), hidratom 4-metilbenzensulfonske kiseline (9,1 mg, 0,05 mmol), 3,4-dihidro-2H-piranom (0,07 mL, 0,72 mmol) i DCM (2 mL). Smeša je zagrejana u mikrotalasnoj na 80°C tokom 20 minuta. Dodatnih (0,035 mL, 0,36 mmol) 3,4-dihidro-2H-pirana je dodato i reakcija je zagrejana do 85°C tokom dodatnih 15 minuta. Reakcija je razblažena sa DCM i oprana sa zasićenim vodenim NaHCO3, zatim je organski sloj osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobila dva regioizomerna THP-zaštićena proizvoda (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin i (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (237 mg, 92%) kao bledo žuta guma (dati su podaci za glavni izomer).<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 0,35 - 0,55 (2H, m), 0,96 (2H, ddd), 1,05 (3H, dd), 1,58 - 1,84 (3H, m), 1,97 - 2,32 (3H, m), 2,64 (1H, dd), 2,77 (1H, dd), 3,14 (1H, ddd), 3,29 - 3,54 (1H, m), 3,62 - 3,91 (2H, m), 3,96 - 4,25 (1H, m), 5,26 (1H, d), 5,65 (1H, ddd), 6,64 (1H, d), 7,00 (2H, d), 7,26 - 7,45 (1H, m), 8,13 (1H, dd). M/z (ES+), [M+H]+ = 534. Priprema N-(3,5-difluoro-4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina

[0429]

[0430] [(2-Di-cikloheksilfosfino-3,6-dimetoksi-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenil)-2-(2'-amino-1,1'-bifenil)]paladijum(II) metansulfonat (BrettPhos Pd G3) (5,0 mg, 5,54 µmol) je dodat suspenziji (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin i (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (37 mg, 0,07 mmol), 1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina (22,9 mg, 0,17 mmol) i natrijum terc-butoksida (13,3 mg, 0,14 mmol) u degaziranom 1,4-dioksanu (0,58 mL) i reakcija je zagrejana do 95°C tokom 1,5 sata u mikrotalasnoj. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc, filtrirana kroz celit i isparena do suvoće. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 10% 1M NH3/MeOH u DCM. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio N-(3,5-difluoro-4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin (18,0 mg, 44%) kao bezbojni suv film.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 0,38 - 0,54 (2H, m), 0,94 (2H, ddd), 1,06 (3H, dd), 1,67 - 1,82 (4H, m), 2,04 - 2,25 (4H, m), 2,59 (2H, t), 2,63 - 2,77 (2H, m), 2,89 (2H, dd), 3,14 (1H, s), 3,29 - 3,37 (1H, m), 3,70 (2H, q), 3,75 - 3,81 (2H, m), 4,00 (1H, q), 4,12 - 4,17 (1H, m), 4,22 (1H, d), 4,43 (1H, t), 4,52 (1H, t), 5,10 (1H, s), 5,55 - 5,74 (1H, m), 5,96 (2H, d), 6,71 (1H, d), 7,28 - 7,44 (1H, m), 8,10 (1H, dd). M/z (ES+), [M+H]+ = 586.

Primeri 12 & 13

Priprema pojedinačnih dijastereoizomera (6S,8R)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-6-(4-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-iloksi)-2-metoksifenil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0431]

[0432] DMF (0,66 mL) praćen sa DIPEA (23,9 µl, 0,14 mmol) je dodat boci napunjenoj sa (6S,8R)-6-(4-(azetidin-3-iloksi)-2-metoksifenil)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolinom (32 mg, 0,07 mmol). U mešanu reakciju je kapanjem iz šprica dodat 1-fluoro-3-jodopropan (13,5 mg, 0,07 mmol) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Reakcija je isparena do suvoće i ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 10% 1M NH3/MeOH u DCM. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio proizvod kao dijastereoizomerna smeša. Dijastereoizomeri su razdvojeni hiralnom preparativnom SFC (Phenomonex Lux C4 kolona, 5µ silika, 30 mm prečnik, 250 mm dužina), koristeći opadajuće izokratski 40% MeOH 0,1% NH3u CO2kao eluent kako bi se dobio prvi izomer eluiranja (8,0 mg, 22%) i drugi izomer eluiranja (8,0 mg, 22%) kao bledo žuti suvi filmovi. Izomer 1:<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,06 (3H, d), 1,28 (3H, d), 1,72 - 1,83 (2H, m), 2,47 (1H, dd), 2,63 (2H, t), 2,8 - 2,95 (2H, m), 3,03 - 3,11 (2H, m), 3,19 (2H, s), 3,33 (3H, s), 3,56 (1H, dd), 3,67 (1H, d), 3,79 (2H, q), 3,86 (3H, s), 4,44 (1H, t), 4,53 (1H, t), 4,74 (1H, t), 5,32 (1H, s), 6,10 (1H, dd), 6,41 (1H, d), 6,69 (1H, d), 6,76 (1H, d), 7,13 (1H, d), 8,05 (1H, d), 10,20 (1H, s). M/z (ES+), [M+H]+ = 529;

Izomer 2:<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,06 (3H, d), 1,25 (3H, d), 1,70 - 1,82 (2H, m), 2,45 - 2,56 (1H, m), 2,63 (2H, t), 2,78 - 2,91 (2H, m), 3,02 - 3,11 (2H, m), 3,18 (1H, d), 3,36 (3H, s), 3,42 (1H, dd), 3,47 - 3,55 (1H, m), 3,62 (1H, d), 3,74 - 3,82 (2H, m), 3,86 (3H, s), 4,43 (1H, t), 4,53 (1H, t), 4,73 (1H, t), 5,36 (1H, s), 6,08 (1H, dd), 6,41 (1H, d), 6,67 (1H, d), 6,79 (1H, d), 7,15 (1H, d), 8,06 (1H, d), 10,20 (1H, s). M/z (ES+), [M+H]+ = 529.

[0433] (6S,8R)-6-(4-(azetidin-3-iloksi)-2-metoksifenil)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin je pripremljen kako sledi:

Priprema dijastereoizomerne smeše (6S,8R)-6-(4-(azetidin-3-iloksi)-2-metoksifenil)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0434]

[0435] Terc-butil 3-hidroksiazedin-1-karboksilat (102 mg, 0,59 mmol), (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (110 mg, 0,20 mmol), terc-butil 3-hidroksiazetidin-1-karboksilat (102 mg, 0,59 mmol), Pd RockPhos treće generacije (16,6 mg, 0,02 mmol) i cezijum karbonat (128 mg, 0,39 mmol) su suspendovani u toluenu (1,26 mL) i zapečaćeni u mikrotalasnoj cevi. Reakcija je zagrejana do 95°C tokom 20 sata. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc (25 mL) i filtrirana kroz celit. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 100% EtOAc u heptanu. Fragmenti koji sadrži nečist proizvod su ispareni do suvoće i rastvoreni u DCM (1,3 mL) kom je TFA (378 µl, 4,91 mmol je dodat kapanjem. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata, zatim su isparljive materije uklonjene u vakuumu. Ostatak je opran sa zasićenim vodenim NaHCO3(30 mL) i ekstrahovan sa DCM (2x 30 mL). Kombinovana organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i isparena. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 40% 1M NH3/MeOH u DCM. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-(azetidin-3-iloksi)-2-metoksifenil)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (35,0 mg, 38%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,06 (3H, dd), 1,24 - 1,35 (3H, m), 2,49 (1H, dt), 2,76 - 2,96 (2H, m), 3,08 - 3,27 (2H, m), 3,34 (3H, d), 3,41 (1H, s), 3,53 - 3,69 (2H, m), 3,69 - 3,93 (7H, m), 4,81 - 5,08 (1H, m), 5,34 (1H, d), 6,02 - 6,12 (1H, m), 6,40 (1H, t), 6,68 (1H, s), 6,77 (1H, dd), 7,13 (1H, d), 8,05 (1H, t). M/z (ES+), [M+H]+ = 469.

Primeri 14 & 15

Priprema pojedinačnih dijastereoizomera N-(4-((6S,8R)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina

[0436]

[0437] 1-(3-Fluoropropil)azetidin-3-amin (175 mg, 1,32 mmol), (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2-fluoro-3-metoksi-2-metilpropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (370 mg, 0,66 mmol) i natrijum terc-butoksid (127 mg, 1,32 mmol) su suspendovani u 1,4-dioksanu (8 mL). Smeša je degazirana i [(2-dicikloheksilfosfino-3,6-dimetoksi-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenil)-2-(2'-amino-1,1'-bifenil)]paladijum(II) metansulfonat metansulfonat (Brett Phos G3) (60 mg, 0,07 mmol) je dodat. Reakcija je zagrejana do 100°C tokom 3 sata. Reakciona smeša je razblažena sa DCM (100 mL) i oprana sa vodom (100 mL). Organski sloj je isparen. Ovaj proces je ponovljen koristeći 114 mg (0,3 mmol) aril bromida. Kombinovan sirov proizvod ovi reakcija je suspendovan u hlorovodoničnoj kiselini (2M, 5 mL) i mešan na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Reakciona smeša je razblažena sa vodom (10 mL) i oprana sa EtOAc (10 mL). Vodena faza je bazifikovana sa 2M vodeni natrijum hidroksid i ekstrahovan sa DCM (2 x 15 mL). Kombinovana organska materija je isparena i sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 20% MeOH u DCM. Fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio sirov proizvod kao smeša dijastereoizomera koji su razdvojeni hiralnom preparativnom SFC (Phenomonex Lux C4 kolona, 5µ silika, 30 mm prečnik, 250 mm dužina), koristeći opadajuće izokratski 40% MeOH 0,1% NH3u CO2kao eluent kako bi se dobio prvi izomer eluiranja (42 mg, 19%) i drugi izomer eluiranja (29 mg, 13%) Izomer 1:<1>H NMR (500 MHz, DMSO, 27°C) 0,96 (3H, d), 1,20 (3H, d), 2,36 - 2,44 (1H, m), 2,65 - 2,85 (3H, m), 2,92 (4H, q), 3,05 - 3,22 (3H, m), 3,23 (3H, s), 3,24 - 3,27 (2H, m), 3,46 - 3,59 (2H, m), 3,78 (3H, s), 4,49 (2H, dd), 5,16 (1H, s), 5,35 (1H, t), 5,95 (1H, dd), 6,23 (1H, d), 6,36 (1H, d), 6,63 (1H, d), 7,16 (1H, d), 8,02 (1H, s), 12,90 (1H, s);<19>F NMR (471 MHz, DMSO, 27°C) -219,77, -149,11, m/z: ES+ [M+H]+ 528.

Izomer 2:<1>H NMR (500 MHz, DMSO, 27°C) 0,97 (3H, d), 1,19 (3H, d), 2,68 - 2,81 (3H, m), 2,88 - 2,95 (3H, m), 3,05 - 3,11 (1H, m), 3,21 - 3,28 (5H, m), 3,32 - 3,39 (1H, m), 3,43 - 3,56 (2H, m), 3,79 (3H, s), 4,49 (2H, dd), 5,17 (1H, s), 5,34 (1H, t), 5,93 (1H, dd), 6,23 (1H, d), 6,35 (1H, d), 6,64 (1H, d), 7,16 (1H, d), 8,02 (1H, s), 12,90 (1H, s);<19>F NMR (471 MHz, DMSO, 27°C) -219,76, -148,20; m/z: ES+ [M+H]+ 528.

Primer 16

Priprema 2,2-difluoro-3-((6S,8R)-6-(5-((1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)amino)piridin-2-il)-8-metil-3,6,8,9-tetrahidro-7H-pirazotolo[4,3-f]izohinolin-7-il)propan-1-ola [0438]

[0439] Hlorovodonična kiselina (2,0 M, 0,5 mL) je dodat do 2,2-difluoro-3-((6S,8R)-6-(5-((1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)amino)piridin-2-il)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-3,6,8,9-tetrahidro-7H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-7-il)propan-1-ol (0,132 g, 0,23 mmol) i rastvor je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Reakciona smeša je prečišćen hromatografijom razmere jona, koristeći SCX kolona. Željeni proizvod je eluiran iz kolone koristeći 1M NH3/MeOH kako bi se dobio 2,2-difluoro-3-((6S,8R)-6-(5-((1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)amino)piridin-2-il)-8-metil-3,6,8,9-tetrahidro-7H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-7-il)propan-1-ol (0,084 g, 75%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, DMSO, 27°C) 1,04 (3H, d), 1,20 - 1,28 (2H, m) 1,59 - 1,71 (2H, m), 2,60 - 2,70 (1H, m), 2,73 - 2,84 (3H, m), 2,99 (1H, dd), 3,08 - 3,18 (1H, m), 3,41 (1H, d), 3,61 - 3,72 (4H, m), 3,93 (1H, d), 4,44 (2H, dt), 4,94 (1H, s), 5,42 (1H, t), 6,21 (1H, d), 6,78 - 6,82 (2H, m), 6,90 (1H, d), 7,21 (1H, d), 7,74 (1H, d), 8,03 (1H, s), 12,94 (1H, s);<19>F NMR (471 MHz, DMSO, 27°C) -218,24, -108,31; m/z: ES+ [M+H]+ 489.

[0440] 2,2-difluoro-3-((6S,8R)-6-(5-((1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)amino)piridin-2-il)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-3,6,8,9-tetrahidro-7H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-7-il)propan-1-ol je pripremljen kako sledi:

Priprema (1S,3R)-1-(5-bromopiridin-2-il)-2-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina

[0441]

[0442] (R)-3-(2-((3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)amino)propil)-2-metilanilin (1,20 g, 2,42 mmol) i 5-bromopikolinaldehid (0,944 g, 5,07 mmol) su zagrejani u sirćetnoj kiselini (12 mL) i voda (0,22 mL, 12,08 mmol) do 70°C tokom 30 minuta.

Reakciona smeša je isparena i ostatak je ponovo rastvoren u etanolu (10 mL). Kalijum acetat (0,594 g, 6,05 mmol) i hidroksilamin hlorovodonik (0,252 g, 3,63 mmol) su dodati.

Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta, zatim je isparena i ostatak je podeljen između DCM (30 mL) i zasićenog vodenog natrijum bikarbonata (30 mL). Organska faza je isparena i sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu kako bi se dobio (1S,3R)-1-(5-hromopiridin-2-il)-2-(3-((terc-hutildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (1,090 g, 68%) kao bezbojna guma.<1>H NMR (500 MHz, DMSO, 27°C) 0,96 (9H, s), 0,98 (3H, d), 1,94 (3H, s), 2,40 (1H, dd), 2,57 (1H, dd), 2,66 - 2,78 (1H, m), 3,11 - 3,22 (2H, m), 3,84 - 3,93 (1H, m), 3,95 - 4,05 (1H, m), 4,69 (2H, s), 4,91 (1H, s), 6,39 (1H, d), 6,42 (1H, d), 6,99 (1H, d), 7,39 - 7,48 (6H, m), 7,59 (4H, ddd), 7,80 (1H, dd), 8,51 (1H, dd);<19>F NMR (471 MHz, DMSO, 27°C) -109,84 (d), -108,39 (d); m/z: ES+ [M+H]+ 664/666.

Priprema (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0443]

[0444] Natrijum nitrit (119 mg, 1,72 mmol) u vodi (1,0 mL) je dodat ledom ohlađenom rastvoru (1S,3R)-1-(5-bromopiridin-2-il)-2-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina (1,09 g, 1,64 mmol) i hidrat paratoluensulfonske kiseline (0,94 g, 4,92 mmol) u acetonitrilu (6 mL). Reakcija je mešana tokom 15 minuta i zatim je zagrejana do sobne temperature tokom 45 minuta. Nakon hlađenja nazad do 4°C, tetrabutilamonijum acetat (2,54 g, 8,20 mmol) u ledeno hladnom MeCN (40 mL) je dodat i reakcija je mešana tokom 15 minuta pre zagrevanja do sobne temperature tokom dodatnih 30 minuta, EtOAc (120 mL) je dodat praćen sa 2 M NaOH (100 mL). Organska faza je oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom, osušena (Na2SO4) i isparena. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (0,330 g, 30%) kao svetlo braon pena.<1>H NMR (500 MHz, DMSO, 27°C) 0,97 (9H, s), 1,06 (3H, d), 2,75 -2,91 (2H, m), 2,99 - 3,06 (1H, m), 3,34 - 3,41 (2H, m), 3,88 - 4,01 (2H, m), 5,12 (1H, s), 6,83 (1H, d), 7,12 (1H, d), 7,26 (1H, d), 7,39 - 7,45 (4H, m), 7,46 - 7,50 (2H, m), 7,56 - 7,62 (4H, m), 7,85 (1H, dd), 8,07 - 8,09 (1H, m), 8,54 (1H, dd), 13,02 (1H, s);<19>F NMR (471 MHz, DMSO, 27°C) -110,01 (d), -108,72 (d); m/z: ES+ [M+H]+ 675/677.

Priprema dijastereoizomerne smeše (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(3-((tercbutildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0445]

[0446] Rastvoru (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (0,330 g, 0,49 mmol) i 3,4-dihidro-2H-piran (0,13 mL, 1,47 mmol) u DCM (5 mL) je dodat hidrat para toluensulfonske kiseline (93 mg, 0,49 mmol) i reakcija je zagrejana na 40°C tokom 1 sata. Reakciona smeša je razblažena sa DCM (20 mL) i oprana sa zasićenim vodenim natrijum bikarbarbonatom (20 mL). Organska faza je isparena do tamno braon ulja i sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50 % EtOAc u heptanu kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-3-((S)-tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (0,330 g, 89%) kao guma.<19>F NMR (471 MHz, DMSO, 27°C) -110,03 (d), -108,83 (d), -108,79 (d); m/z: ES+ [M+H]+ 759/761.

Priprema dijastereoizomerne smeše 6-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)piridin-3-amina

[0447]

[0448] 1-(3-Fluoropropil)azetidin-3-amin (0,115 g, 0,87 mmol), (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (0,330 g, 0,43 mmol), dicikloheksil(2',4',6'-triizopropil-3,6-dimetoksi-[1,1'-bifenil]-2-il)fosfan (0,023 g, 0,04 mmol) i natrijum terc-butoksid (0,125 g, 1,30 mmol) su suspendovani u 1,4-dioksanu (4 mL). Smeša je degazirana i [(2-di-cikloheksilfosfino-3,6-dimetoksi-2',4',6'- triizopropil-1,1'-bifenil)-2-(2'-amino-1,1'-bifenil)]paladijum(II) metansulfonat metansulfonat (BrettPhos G3) (0,039 g, 0,04 mmol) je dodat. Reakcija je zagrejana do 100°C tokom 3 sata. Reakciona smeša je razblažena sa DCM (50 mL) i oprana sa vodom (50 mL). Organski sloj je isparena i sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 20% MeOH u DCM kako bi se dobio 6-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)piridin-3-amin (0,264 g, 75%) kao žuta guma kao smeša dijastereoizomera.<19>F NMR (471 MHz, DMSO, 27°C) -218,19, -110,13, - 109,44, -108,6 -107,8; m/z: ES+ [M+H]+ 811.

Priprema dijastereoizomerne smeše 2,2-difluoro-3-((6S,8R)-6-(5-((1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)amino)piridin-2-il)-8-metil-3,6,8,9-tetrahidro-7H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-7-il)propan-1-ola

[0449]

[0450] Tetrabutilamonijum fluorid (1,0 M u THF, 0,5 mL, 0,50 mmol) je dodat rastvoru 6-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izoqumolm-6-il)-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)piridin-3-amina (0,264 g, 0,33 mmol) u THF (2 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 4 sata i reakciona smeša je isparena i ostatak je podeljen između DCM (20 mL) i voda (20 mL). Organska faza je isparena i sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 20% MeOH u DCM kako bi se dobio 2,2-difluoro-3-((6S,8R)-6-(5-((1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)amino)piridin-2-il)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-3,6,8,9-tetrahidro-7H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-7-il)propan-1-ol (0,132 g, 71%) kao bezbojan suv film kao smeša dijastereoizomera.<19>F NMR (471 MHz, DMSO, 27°C) -218,19, -108,42, -108,39; m/z: ES+ [M+H]+ 573.

Primer 17

Priprema N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina

[0451]

[0452] 1-(3-Fluoropropil)azetidin-3-amin (50 mg, 0,38 mmol), (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (0,100 g, 0,20 mmol), cezijum karbonat (128 mg, 0,39 mmol) i [(2-di-cikloheksilfosfino-3,6-dimetoksi-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenil)-2-(2'-amino-1,1'-bifenil)]paladijum(II) metansulfonat metansulfonat (Brett Phos G3) (23 mg, 0,02 mmol) su suspendovani u 1,4-dioksanu (2 mL) i zapečaćeni u mikrotalasnoj cevi. Reakcija je zagrejana do 100°C tokom 4 sata pod mikrotalasnim zračenjem. Reakciona smeša je razblažena sa DCM (20 mL) i oprana sa vodom (20 mL). Organski sloj je isparena i sirov proizvod je rastvoren u DCM (3 mL) i TFA (0,3 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, zatim je reakciona smeša podeljena između DCM (20 mL) i 2M NaOH (20 mL).

Organska faza je isparena i sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 20% MeOH u DCM. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin (9,0 mg, 10%) kao bezbojan suv film.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,14 (3H, d), 1,70 - 1,82 (2H, m), 2,62 (2H, t), 2,85 (1H, dd), 2,93 - 3,06 (3H, m), 3,20 - 3,31 (2H, m), 3,59 (1H, td), 3,73 (2H, dt), 4,10 (2H, dd), 4,48 (2H, dt), 5,03 (1H, s), 6,80 (1H, dd), 6,89 (1H, d), 7,15 (1H, d), 7,21 (1H, d), 7,84 (1H, dd), 8,01 (1H, d);<19>F NMR (471 MHz, DMSO, 27°C) -224,69, -75,55; m/z: ES+ [M+H]+ 477.

[0453] (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin je pripremljen kako sledi.

Priprema (1S,3R)-1-(5-bromopiridin-2-il)-3,5-dimetil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina

[0454]

[0455] (R)-2-Metil-3-(2-((2,2,2-trifluoroetil)amino)propil)anilin (0,290 g, 1,18 mmol) i 5-bromopikolinaldehid (0,460 g, 2,47 mmol) su zagrejani u sirćetnoj kiselini (6 mL) i vodi (0,1 mL) do 70°C tokom 30 minuta. Reakciona smeša je isparena i ostatak je rastvorena u etanolu (10 mL). Kalijum acetat (0,290 g, 2,95 mmol) i hidroksilamin hlorovodonik (0,123 g, 1,77 mmol) su dodati i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta.

Reakciona smeša je isparena i ostatak je podeljen između DCM (30 mL) i zasićenog vodenog natrijum bikarbonata (30 mL). Organska faza je isparena i sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu kako bi se dobio (1S,3R)-1-(5-bromopiridin-2-il)-3,5-dimetil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (0,264 g, 54%) kao bezbojan suv film.<1>H NMR (500 MHz, DMSO, 27°C) 1,03 (3H, d), 1,94 (3H, s), 2,45 (1H, dd), 2,67 (1H, dd), 2,90 (1H, dd), 3,22 -3,29 (1H, m), 3,49 (1H, dd), 4,69 (2H, s), 4,85 (1H, s), 6,40 - 6,46 (2H, m), 7,21 (1H, d), 7,95 (1H, dd), 8,56 (1H, dd);<19>F NMR (471 MHz, DMSO, 27°C) -69,83; m/z: ES+ [M+H]+ 414/416.

Priprema (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0456]

[0457] Natrijum nitrit (0,048 g, 0,70 mmol) je dodat u vodi (0,2 mL) ohlađenom rastvoru (1S,3R)-1-(5-bromopiridin-2-il)-3,5-dimetil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina (0,264 g, 0,64 mmol) u propinonskoj kiselini (2,5 mL) na -10°C. Reakcija je mešana tokom 1 sata, zatim je ledom ohlađen EtOAc (10 mL) dodat.

Reakcija je ugašena dodavanjem vodenog zasićenog natrijum bikarbonata (15 mL) i mešana je tokom 15 minuta pre nego što joj je omogućeno da se zagreje do sobne temperature.

Organska faza je osušena (Na2SO4) i isparena kako bi se dobio sirov (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (0,272 g, 0,64 mmol) kao braon guma. Materijal je rastvoren u DCM (10 mL) i hidrat para toluensulfonske kiseline (0,012 g, 0,06 mmol) je dodat i smeša je zagrejana na 40°C tokom 2 sata. Reakciona smeša je razblažena sa DCM (20 mL) i oprana sa vodenim NaOH (2M, 30 mL). Organska faza je isparena do tamno braon ulja i sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 40 % EtOAc u heptanu kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (0,142 g, 44%). M/z: ES+ [M+H]+ 509/511.

Alternativni put #1 za Primer 17:

Priprema N-[1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il]-6-[(6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)3,6,8,9-tetrahidropirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il]piridin-3-amina

[0458]

[0459] Trifluoro sirćetna kiselina (1,30 L, 17,04 mol) je dodata mešanom rastvoru terc-butil (1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)karbamata (0,50 Kg, 2,04 mol) u DCM (1,50 L) na 0°C tokom 0,5 sata. Smeši je omogućeno da se da se zagreje do 20°C i mešana je na 20°C tokom 2,5 sata. Smeša je zagrejana do 30°C i mešanje je nastavljeno tokom 1 sata. Smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom i ostatak je koncentrovane pod redukovanim pritiskom iz toluena (3 x 3,00 L). Rezultujući ostatak je rastvoren u 1,4-dioksanu (3,00 L) i tretiran sa 30% natrijum 2-metilbutan-2-olat rastvorom u Me-THF (5,50 L, 13,63 mol) tokom 45 minuta, vodeći računa da temperatura ne pređe 29°C. Rastvor 90% w/w (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (0,81 Kg, 1,70 mol) u 1,4-dioksanu (1,50 L) i BrettPhos Pd G3 (0,077 Kg, 0,085 mol) su dodati i atmosfera je zamenjena sa azotom koristeći cikluse vakuuma i azota (3 x). Smeša je zagrejana do 55°C i mešana na 55°C 2,5 sata. Smeša je ohlađena do 21°C i 8% NaHCO3 rastvor u vodi (7,16 L, 6,82 mol) je dodat, praćen izopropil acetatom (4,50 L). Smeša je mešana tokom 2-3 minuta i slojevi su razdvojeni. Organski sloj je opran sa 8% NaHCO3 rastvorom u vodi (7,16 L, 6,82 mol), uz mešanje smeše tokom 5 minuta i zatim su slojevi razdvojeni. Kombinovani vodeni slojevi su ekstrahovani sa izopropil acetatom (4,50 L). Kombinovani organski slojevi su tretiran sa Silicycle (SiliaMetS-Thiol, 400 g, 1,26om mmol/g, 6 ekvivalenta u odnosu na Pd) i smeša je mešana tokom 16 sati. Čvrste supstance su uklonjene filtriranjem kroz celit, pranjem filter-kolača sa izopropil acetatom. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom (temperatura kade 40°C). Ostatak je rastvoren u izopropil acetatu (5,00 L) i tretiran sa daljim Silicycle (SiliaMetS-Thiol, 250 g, 1,26 mmol/g, 3,7 ekvivalenta u odnosu na Pd). Rezultujuća smeša je mešana na 21°C tokom 16 sati. Čvrste supstance su uklonjene filtriranjem kroz celit, pranjem filter-kolača sa izopropil acetatom (2,50 L). Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom (temperatura kade 40°C) kako bi se dobila braon pena. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom SFC (Lux C4 kolona, 50 mm prečnik, 250 mm dužina), koristeći gradijent eluiranja od EtOH/DEA 100/0,5 u CO2, 140 bara mobilnu fazu pri stopi protoka od 400 mL/minut na 40°C) kako bi se dobila svetlo braon čvrsta pena. EtOAc (2,00 L) je dodat i rastvor je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. EtOAc (1,90 L) i heptan (1,90 L) su dodati i smeša je posejana na 25°C. Smeša je držana na 25°C tokom 1 sata. Heptan (6,50 L) je dodat tokom 2 sata smeši uz mešanje. Rezultujuća smeša je mešana na 22°C tokom 18 sati. Rezultujuća čvrsta supstanca je prikupljena filtriranjem, pranjem filter-kolača sa 1:5 EtOAc/heptanom (2,50 L). Čvrsta supstanca je osušena pod azotnim prekrivačem tokom 30 minuta, zatim osušena pod vakuumom na 40°C tokom 9 dana kako bi se dobio N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin (626 g, 77%) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,07 (3H d) 1,63 (2H, dquin), 2,45 (2H, t), 2,72 (2H, br t), 2,83 (1H, br dd), 2,91 - 3,00 (1H, m), 3,06 (1H, br dd) 3,42 - 3,55 (2H, m), 3,58-3,65 (2H, m), 3,92 (1H, dquin) 4,43 (2H, dt) 4,92 (1H, s), 6,22 (1H, d), 6,79 (1H, d) 6,82 (1H, dd), 6,96 (1H, d), 7,21 (1H, d), 7,73 (1H, d), 8,04 (1H, s), 12,96 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]<+>477.

[0460] Procedure korišćene za pripremu početnih materijala terc-butil (1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)karbamata i (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina su opisane u nastavku.

Priprema terc-butil (1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)karbamata

[0461]

[0462] Reakcija je izvršena u duplikatu i kombinovana za obradu: 1-Fluoro-3-jodo-propan (189 g, 1,00 mol) je dodat smeši pod mešanjem terc-butil N-(azetidin-3-il)karbamata; hlorovodonika (200 g, 0,96 mol) i K2CO3(331 g, 2,40 mol) u THF (1,40 L) i vodi (0,50 mol) na 20°C. Reakciona smeša je zagrejana do 70°C i mešana na 70°C tokom 1,5 sata. Dve reakcione smeše su kombinovane i dodate vodi (2,5 L) i EtOAc (2,0 L). Smeša je mešana na 21°C tokom 3 minuta. Slojevi su razdvojeni i organski sloj je opran sa vodom (2 x 2,0 L) i zasićenim rastvorom amonijum hlorida (2,0 L). Organski sloj je koncentrovan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov proizvod. Toluen (400 mL) je dodat i smeša je zagrejana do 60°C. Heptan (1,6 L) je dodat i smeši je omogućeno da se ohladi do 21°C i mešana je tokom 15 minuta. Čvrsta supstanca je prikupljena filtriranjem i osušena kako bi se dobio terc-butil (1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)karbamat (230 g, 52%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,44 (9H, s), 1,68 - 1,80 (2H, m), 2,56 (2H, t), 2,87 (2H, s), 3,66 (2H, t), 4,29 (1H, s), 4,43 (1H, t), 4,52 (1H, t), 4,86 (1H, s).

Priprema 4-bromo-1-tetrahidropiran-2-il-indazola

[0463]

[0464] Suspenziji 4-bromo-1H-indazola (1,50 Kg, 7,60 mol) i 3,4-dihidro-2H-pirana (0,96 Kg, 11,40 mol) u DCM (2,40 L) je dodat hidrat 4-metilbenzensulfonske kiseline (11,60 g, 0,06 mol) na 20°C pod azotom. Rezultujuća suspenzija je mešana na između 20°C i 29°C (mali egzoterm) tokom 110 minuta. Rezultujući rastvor je opran sa zasićenim vodenim NaHCO3, (2,00 L), i organski sloj je isparen pod redukovanim pritiskom. Vrući (70°C) heptan (2,50 L) je dodat i smeša je isparena pod redukovanim pritiskom kako bi se dobila kristalna čvrsta supstanca. Prečišćavanje re-kristalizacijom od vrućeg (70°C) heptana (7,00 L) je sprovedeno omogućujući rastvoru da se ohladi polako do 34°C. Rezultujuća čvrsta supstanca je prikupljena filtriranjem i oprana sa hladnim heptanom kako bi se dobio 4-bromo-1 -tetrahidropiran-2-il-indazol (1,87 Kg, 87%) kao kristalna čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,54 - 1,66 (2H, m), 1,67 - 1,85 (1H, m), 1,94 - 2,09 (2H, m), 2,31 - 2,45 (1H, m), 3,70 - 3,81 (1H, m), 3,83 - 3,97 (1H, m), 5,88 (1H, dd), 7,32 - 7,39 (1H, m), 7,40 - 7,44 (1H, m), 7,79 (1H, dt), 8,09 (1H, d) m/z: ES- [M-H]<->282.

Priprema terc-butil N-[(1R)-1-metil-2-(1-tetrahidropiran-2-ilindazol-4-il)etil]karbamata [0465]

[0466] Rastvor 4-bromo-1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-1H-indazola (0,70 Kg, 2,49 mol) u THF (3,50 L) je postepeno ohlađen u 10°C koracima do -70°C.2,5 M Butillitijum u heksanima (1,10 L, 2,74 mol) je dodat tokom 70 minuta, održavajući unutrašnju temperaturu ispod -60°C. Rezultujuća smeša je mešana na -72°C tokom 1 sata.2,3 M heksillitijum u heksanima (0,054 L, 0,12 mol) je dodat, praćen rastvorom terc-butil (R)-4-metil-1,2,3-oksatiazolidin-3-karboksilat 2,2-dioksida (652 g, 2,74 mol) u THF (2,80 L) tokom 2 sata, vodeći računa da unutrašnja temperatura ne pređe -58°C. Rezultujuća smeša je mešana na -60°C tokom 16 sati. Smeša je polako zagrejana do -10°C tokom 1,5 sata. Voda (2,10 L) je pažljivo dodata. Slojevi su razdvojeni i organski sloj je opran sa zasićenim rasolom (1,40 L) i organski sloj je koncentrovan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobilo ulje. IPA (1,50 L) je dodat i smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio terc-butil ((2R)-1-(1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-1H-indazol-4-il)propan-2-il)karbamat (1,27 Kg, >100%) kao braon ulje. Ovo je uzeto bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,08 (3H, dd), 1,43 (9H, s), 1,63 - 1,69 (1H, m), 1,73 - 1,82 (2H, m), 2,07 (1H, dd), 2,17 (1H, dd), 2,53 - 2,64 (1H, m), 2,95 (1H, s), 3,21 (1H, dt), 3,70 - 3,80 (1H, m), 3,97 - 4,12 (2H, m), 4,33 -4,49 (1H, m), 5,71 (1H, ddd), 6,96 (1H, dd), 7,31 (1H, ddd), 7,46 (1H, d), 8,13 (1H, s). M/z: ES+ [M·+] 359

Priprema (2R)-1-(1H-indazol-4-il)pronan-2-amin.dihlorovodonika

[0467]

[0468] 12 M HC1 (1,00 L, 12,0 mol) je dodat tokom 20 minuta mešanom rastvoru tercbutil((2R)-1-(1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-1H-indazol-4-il)propan-2-il)karbamata (1,27 Kg, 1,76 mol) u IPA (1,50 L), održavajući unutrašnju temperaturu ispod 30°C. Rezultujuća smeša je zagrejana do 40°C i mešana na 40°C tokom 16 sati. Temperatura je povećana do 55°C i dalji deo od 12 M HC1 (0,20 L, 2,40 mol) je dodat i mešanje je nastavljeno tokom 7 sati. MTBE (2,50 L) je dodat i smeši je omogućeno da se meša na 25°C tokom 16 sati.

Rezultujuća čvrsta supstanca je prikupljena filtriranjem i filter-kolač je opran sa 10% IPA u MTBE (2,00 L). Rezultujuća čvrsta supstanca je osušena pod redukovanim pritiskom na 40°C tokom 72 sata kako bi se dobio (2R)-1-(1H-indazol-4-il)propan-2-amin;dihlorovodonik (0,39 Kg, 89%) kao beličasta čvrsta supstanca.

<1>H NMR (500 MHz, DMSO, 27°C) 1,12 (3H, d), 2,96 (1H, dd), 3,39 (1H, dd), 3,45 - 3,55 (1H, m), 6,94 (1H, d), 7,28 (1H, dd), 7,43 (1H, d), 8,23 (3H, s), 8,28 (1H, d). M/z: ES+ [M·+] 175.

Priprema (2R)-1-(1H-indazol-4-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amina

[0469]

[0470] Rastvor 2,2,2-trifluoroetil trifluorometansulfonata (0,73 Kg, 2,94 mol) u MeCN (2,00 L) je dodat smeši pod mešanjem (R)-1-(1H-indazol-4-il)propan-2-amin dihlorovodonika (0,77 Kg, 2,94 mol) i K2CO3(1,26 Kg, 9,13 mol) u MeCN (8,00 L) na 25°C pod azotom. Rezultujuća smeša je zagrejana do 60°C i mešana na 60°C tokom 18 sati. MeCN (5,00 L) je dodat i čvrste supstance su uklonjene filtriranjem. Filtrat je koncentrovane pod redukovanim pritiskom i rezultujuća čvrsta supstanca je rastvorena u EtOAc (10,00 L), oprana sa vodom (4,0 L) i razblaženim zasićenim vodenim natrijum hloridom (4,8 L). Organski sloj je koncentrovan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio (2R)-1-(1H-indazol-4-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amin (0,73 Kg, 96%).<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,12 (3H, d), 2,96 (1H, dd), 3,08 (1H, dd), 3,14 - 3,33 (3H, m), 6,98 (1H, d), 7,32 (1H, dd), 7,37 -7,41 (1H, m), 8,13 (1H, d), 10,86 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]<+>257.

Priprema (6S,8R)-6-(5-bromo-2-piridil)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-3,6,8,9-tetrahidropirazolo[4,3-f]izohinolina

[0471]

[0472] Trifluorosirćetna kiselina (0,66 L, 8,66 mol) je polako dodata smeši pod mešanjem 5-bromopikolinaldehida (0,55 Kg, 2,89 mol) i (R)-1-(1H-indazol-4-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amina (0,83 Kg, 2,89 mol) u toluenu (7,30 L) na 21°C. Rezultujući rastvor je zagrejana do 80°C i mešana na 80°C tokom 18 sati. Temperatura je povećana do 90°C i zagrevanje je nastavljeno tokom 4 sata. Smeši je omogućeno da se ohladi do 80°C i dalji deo od 5-bromopikolinaldehida (0,015 Kg, 0,081 mol) je dodat i rastvor je mešan na 80°C tokom 16 sati. Smeši je omogućeno da se ohladi do 21°C i zasićen vodeni NaHCO3 (6,60 L) je dodat tokom 20 minuta. EtOAc (5,00 L) je dodat i slojevi su razdvojeni. Organski sloj je opran sa zasićenim vodenim NaHCO3 (3,30 L) i koncentrovan je pod redukovanim pritiskom. Etanol je dodat i smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov proizvod kao hrskava čvrsta supstanca. Cis izomer je uklonjen preparativnom SFC (SuperSep 1™ kolona (napunjena sa CelluCoat™ 10 µm), 50 mm prečnik, 250 mm dužina), eluiranje 28% EtOH u CO2, 140 bara mobilna faza pri stopi protoka od 450 mL/minut na 30°C) kako bi se dobio kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-bromo-2-piridil)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-3,6,8,9-tetrahidropirazolo[4,3-f]izohinolin (0,94 Kg, 77%) kao bledo žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,16 (3H, d), 2,89 (1H, dd), 2,99 (1H, dq), 3,25 - 3,34 (2H, m), 3,55 (1H, td), 5,10 (1H, s), 6,93 (1H, d), 7,22 (1H, d), 7,40 (1H, d), 7,75 (1H, dd), 8,05 (1H, d), 8,56 (1H, dd), 10,24 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]<+>427. Alternativni put #2 za Primer 17:

Priprema N-[1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il]-6-[(6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-3,6,8,9-tetrahidropirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il]piridin-3-amina

[0473]

[0474] 1-(3-Fluoropropil)azetidin-3-amin (6,31 g, 37,98 mmol) je dodat rastvoru (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (15,47 g, 34,92 mmol) u 1,4-dioksanu (175 mL). Rezultujući rastvor je degaziran pod vakuumom tokom 5 minuta, zatim ponovo napunjen sa azotom (x2). Natrijum terc-butoksid (13,43 g, 139,69 mmol) je dodat, praćeno BrettPhos pred-katalizatorom treće generacije (0,95 g, 1,05 mmol). Rezultujuća smeša je zagrejana na 55°C tokom 18 sati.

Smeša je sipana u EtOAc i vodu. Zasićen rasol je dodat, i slojevi su razdvojeni. Organski sloj je opran sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (x3), i kombinovani vodeni slojevi su ekstrahovani sa EtOAc. Kombinovani organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% metanola u etil acetatu. Fragmenti koji sadrže željeni proizvod su kombinovani, koncentrovani pod redukovanim pritiskom, i zatim ponovo prečišćeni fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 40% EtOAc u heksanima, kako bi se dobila crveno-narandžasta čvrsta supstanca. Ova čvrsta supstanca je rastvoren u 10% MeOH u DCM, filtrirana, uz pranje filter-kolača sa DCM. Kombinovani filtrati su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin (15,28 g, 92%) kao svetlo narandžasta penasta čvrsta supstanca. Trans i cis izomeri su razdvojeni preparativnom SFC ((S,S) Whelk-O1 kolona, 30 mm prečnik, 250 mm dužina), eluiranjem sa 30% (0,2% NH4OH u MeOH) u CO2, 100 bara mobilna faza pri stopi protoka od 20 mL/minut na 40°C). Fragmenti koji sadrži trans izomer su koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je dalje prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 30% MeOH u EtOAc. Fragmenti koji sadrže željeni proizvod su koncentrovani pod redukovanim pritiskom, zatim koncentrovani od MeCN (x 2) kako bi se dobio N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin (10,76 g, 74%) kao bledo žuta pena/čvrsta supstanca.<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,07 (3H d) 1,63 (2H, dquin), 2,45 (2H, t), 2,72 (2H, br t), 2,83 (1H, br dd), 2,91 - 3,00 (1H, m), 3,06 (1H, br dd) 3,42 - 3,55 (2H, m), 3,58-3,65 (2H, m), 3,92 (1H, dquin) 4,43 (2H, dt) 4,92 (1H, s), 6,22 (1H, d), 6,79 (1H, d) 6,82 (1H, dd), 6,96 (1H, d), 7,21 (1H, d), 7,73 (1H, d), 8,04 (1H, s), 12,96 (1H, s). M/z: ES+ (M+H)+ 477.

[0475] Fragmenti SFC koji sadrže cis izomer su koncentrovani pod redukovanim pritiskom i rezultujući ostatak je dalje prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 30% MeOH u EtOAc. Fragmenti koji sadrže željeni proizvod su koncentrovani pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je filtriran kako bi se dobio N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6R,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin (1,13 g, 8%) kao svetlo žuto penasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,28 (3H, d), 1,55 - 1,75 (2H, m), 2,42 - 2,49 (2H, m), 2,76 (2H, br t), 2,80 - 2,92 (1H, m), 3,07 - 3,18 (1H, m), 3,18 - 3,28 (1H, m), 3,38 - 3,54 (2H, m), 3,59 -3,70 (2H, m), 3,95 (1H, sxt), 4,45 (2H, dt), 5,11 (1H, s), 6,21 (1H, d), 6,72 (1H, d), 6,82 (1H, dd), 7,02 (1H, d), 7,19 (1H, d), 7,78 (1H, d), 8,06 (1H, s), 12,94 (1H, s). M/z: ES+ (M+H)+ 477.

[0476] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina su opisane u nastavku.

Priprema 2,2,2-trifluoro-N-[(1R)-2-(1H-indazol-4-il)-1-metil-etil]acetamida

[0478] TEA (26,0 mL, 186,5 mmol) je dodat pomoću šprica mešanoj suspenziji (R)-1-(1H-indazol-4-il)propan-2-amin dihlorovodonika (15,29 g, 61,61 mmol) i etil 2,2,2-trifluoroacetata (8,09 mL, 67,8 mmol) u MeOH (150 mL) na sobnoj temperaturi. Rezultujući rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 18 sati, zatim je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujuća čvrsta supstanca je zatim rastvorena u DCM (40 mL) i rezidualni trietilamin hlorovodonik je taložen dodavanjem Et2O (300 mL). Suspenzija je mešana tokom 5 minuta, zatim je filtrirana i filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobila čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca je rastvorena u EtOAc i zasićenom vodenom natrijum hloridu. Slojevi su razdvojeni i organski sloj je opran sa zasićenim vodenim natrijum hloridom, osušen preko MgSO4, filtriran i koncentrovan kako bi se dobio (R)-N-(1-(1H-indazol-4-il)propan-2-il)-2,2,2-trifluoroacetamid (16,51 g, 99%) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,19 (3H, d), 3,03 (1H, dd), 3,13 (1H, dd), 4,13 - 4,30 (1H, m), 6,89 (1H, d), 7,25 (1H, dd), 7,38 (1H, d), 8,18 (1H, t), 9,35 (1H, br d), 13,01 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 272.

Priprema (2R)-1-(1H-indazol-4-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amina

[0479]

[0480] 1M Boran THF kompleks u THF (365 mL, 365,0 mmol) je dodat brzo kapanjem pomoću kanule mešanom rastvoru (R)-N-(1-(1H-indazol-4-il)propan-2-il)-2,2,2-trifluoroacetamida (16,5 g, 60,8 mmol) u THF (100 mL) na sobnoj temperaturi (evolucija gasa; mali egzoterm je primećen tokom dodavanja). Reakcija je zatim zagrejana na 60°C tokom 15,5 sati, zatim joj je omogućeno da se ohladi do sobne temperature. Reakcija je smeštena u vodenu kadu na temperaturi okruženja i MeOH (80 mL) je polako dodat kapanjem. Reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je rastvoren u MeOH (80 mL) i koncentrovan pod redukovanim pritiskom.

Rezultujući ostatak je rastvoren u MeOH (250 mL) i smešten u vodenu kadu na temperaturi okruženja. Suspenzija 10% paladijuma na ugljeniku (6,47 g, 6,08 mmol) u MeOH (90 mL) je dodata, ispirajući bocu sa MeOH (10 mL) (nešto evolucije gasa je zabeleženo). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi otprilike 3 minuta, zatim je zagrejana na 65°C tokom 2 sata. Nakon hlađenja do sobne temperature, smeša je filtrirana kroz celit i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Bledo žuti ostatak je rastvoren u DCM i filtrirana, i filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 10 do 60% EtOAc u heksanima. Fragmenti koji sadrže željeni proizvod su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio (R)-1-(1H-indazol-4-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amin (14,21 g, 86%) kao bledo žuto ulje.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 0,91 (3H, d), 2,17 - 2,30 (1H, m), 2,71 (1H, dd), 2,98 -3,17 (2H, m), 3,22 - 3,38 (2H, m), 6,89 (1H, d), 7,24 (1H, dd), 7,35 (1H, d), 8,12 (1H, t), 12,97 (1H, br s). M/z: ES+ [M+H]+ 258.

Priprema (6S,8R)-6-(5-bromo-2-piridil)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-3,6,8,9-tetrahidrolopirazolo[4,3-f]izohinolina

[0481]

[0482] 5-Bromopikolinaldehid (9,80 g, 52,7 mmol) je dodat mešanom rastvoru (R)-1-(1H-indazol-4-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amina (14,05 g, 51,66 mmol) u toluenu (246 mL) pod azotom. Trifluorosirćetna kiselina (12,30 mL) je zatim dodata i reakcija je zagrejana na 90°C tokom 4,5 sati. Smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i EtOAc (200 mL) je dodat. Smeša je ohlađena do 5°C i smeša je bazifikovana sporim dodavanjem zasićenog vodenog NaHCO3, rezultujući slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (2 x 80 mL). Kombinovani organski ekstrakti su oprani sa zasićenim vodenim NaHCO3, zasićenim vodenim natrijum hloridom, osušeni preko MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 5 do 60% EtOAc u heksanima. Fragmenti koji sadrže željeni proizvod su koncentrovani pod redukovanim pritiskom, zatim osušeni u vakuumu na 50°C tokom 3 sata kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (19,29 g, 88%) kao bledo narandžasta čvrsta supstanca.1H NMR analiza je otkrila 10:1 trans/cis izomere.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,10 (3H, d), 2,83 - 2,94 (1H, m), 2,95 - 3,14 (2H, m), 3,34 -3,47 (1H, m), 3,49 - 3,72 (1H, m), 5,10 (1H, s), 6,88 (1H, d), 7,25 (1H, d), 7,33 (1H, d), 7,99 (1H, dd), 8,06 (1H, d), 8,56 (1H, d), 13,00 (1H, s) m/z: ES+ [M+H]+ 425.

Alternativni putevi za međuproizvode korišćene u sintezi Primera 17:

Priprema N-[(1R)-2-(3-amino-2-metil-fenil)-1-metil-etil]-2,2,2-trifluoroacetamida [0483]

[0484] Rastvor (R)-3-(2-aminopropil)-2-metilanilina (0,51 g, 3,13 mmol), DIPEA (0,55 mL, 3,13 mmol), i etil 2,2,2-trifluoroacetata (0,47 mL, 3,91 mmol) u MeOH (9,5 mL) je mešan na sobnoj temperaturi pod azotom tokom 16 sati. Reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. DCM i voda su dodati i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (3 x 50 mL), i kombinovani organski slojevi su osušeni (Na2SO4) i filtrirani. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 100% EtOAc u heksanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio N-[(1R)-2-(3-amino-2-metil-fenil)-1-metil-etil]-2,2,2-trifluoro-acetamid (680 mg, 83%).<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,06 - 1,14 (m, 3 H), 2,01 (s, 3 H), 2,54 - 2,71 (m, 1 H), 2,72 - 2,84 (m, 1 H), 4,04 - 4,12 (m, 1 H), 4,60 - 4,77 (m, 2 H), 6,24 - 6,37 (m, 1 H), 6,43 - 6,52 (m, 1 H), 6,72 - 6,84 (m, 1 H), 9,19 - 9,32 (m, 1 H). M/z: ES+ [M+H]+ 261.

Priprema 2-metil-3-[(2R)-2-(2,2,2-trifluoroetilamino)propil]anilina

[0485]

[0486] 1,0M borana u THF, u THF (19,4 mL, 19,37 mmol) je dodato mešanom rastvoru (R)-N-(1-(3-amino-2-metilfenil)propan-2-il)-2,2,2-trifluoroacetamida (840 mg, 3,23 mmol) u THF (10 mL). Reakciona smeša je zagrejana na 65°C pod azotom tokom 6 sati. Smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i MeOH je pažljivo dodat. Rezultujuća smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta i zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je rastvoren u MeOH i zagrejan do 65°C tokom 6 sati. Smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i zatim je koncentrovana pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov proizvod koji je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 100% EtOAc u heksanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio 2-metil-3-[(2R)-2-(2,2,2-trifluoroetilamino)propil]anilin (665 mg, 84%).<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 0,89 (s, 3 H), 1,98 (s, 3 H), 2,08 - 2,22 (m, 1 H), 2,25 - 2,42 (m, 1 H), 2,69 - 2,87 (m, 2 H), 3,15 - 3,29 (m, 2 H), 4,61 - 4,75 (m, 2 H), 6,30 - 6,40 (m, 1 H), 6,43 - 6,54 (m, 1 H), 6,71 - 6,83 (m, 1 H). M/z: ES+ [M+H]+ 247.

Priprema (2R)-1-(3-bromo-2-metil-fenil)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amina [0487]

[0488] DIPEA (2,99 mL, 17,10 mmol) je dodat (R)-1-(3-bromo-2-metilfenil)propan-2-aminu (1,30 g, 5,70 mmol), i 2,2,2-trifluoroetil trifluorometansulfonatu (0,23 M u DCM, 29,7 mL, 6,84 mmol) u 1,4-dioksanu (25 mL) na sobnoj temperaturi pod azotom. Rezultujuća smeša je mešana na 85°C tokom 16 sati. Reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom i sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio (R)-1-(3-bromo-2-metilfenil)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amin (0,56 g, 32%) kao ulje.<1>H NMR (500 MHz, DMSO, 27°C) 0,91 (3H, d), 2,26 (1H, q), 2,34 (3H, s), 2,78 - 2,86 (1H, m), 2,89 (1H, dd), 3,19 - 3,28 (2H, m), 7,01 - 7,06 (1H, m), 7,15 (1H, dd), 7,43 (1H, dd). M/z: ES+ [M+H]+ 310/312.

Priprema 2-metil-3-[(2R)-2-(2,2,2-trifluoroetilamino)propil]anilina

[0489]

[0490] Tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0) (0,050 g, 0,05 mmol) i (±)-2,2'-Bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftalen (0,067 g, 0,11 mmol) su dodati suspenziji (R)-1-(3-bromo-2-metilfenil)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amina (0,56 g, 1,81 mmol), benzofenon imina (0,33 mL, 1,99 mmol) i natrijum terc-butoksida (0,26 g, 2,71 mmol) u degaziranom toluenu (7 mL) i reakcija je zagrejana do 90°C tokom 16 sati. Nakon hlađenja do sobne temperature, smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je rastvoren u DCM (50 mL) i opran sa vodom (50 mL). Vodeni deo je ekstrahovan sa DCM (25 mL) i kombinovana organska materija je koncentrovana do ∼25 mL.2 M HC1 rastvor (50 mL) je dodat i dvofazna smeša je mešana energično tokom 30 minuta. Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je opran sa DCM. Vodena faza je bazifikovana dodavanjem 2 M vodenog NaOH. Rezultujuća smeša je ekstrahovana sa DCM (2 x 100 mL) i kombinovani organski ekstrakti su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio (R)-2-metil-3-(2-((2,2,2-trifluoroetil)amino)propil)anilin (0,31 g, 70%) kao ulje.<1>H NMR (500 MHz, DMSO, 27°C) 0,90 (3H, d), 1,98 (3H, s), 2,12 - 2,18 (1H, m), 2,30 - 2,36 (1H, m), 2,74 - 2,82 (2H, m), 3,17 - 3,29 (2H, m), 4,69 (2H, s), 6,35 (1H, dd), 6,48 (1H, dd), 6,78 (1H, t). ES+ [M+H]+ 247.

Priprema (1S,3R)-1-(5-bromo-2-piridil)-3,5-dimetil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-3,4-dihidro-1H-izohinolin-6-amina

[0491]

[0492] So trifluorometansulfonska kiselina iterbijuma(III) (0,17 g, 0,27 mmol) je dodata mešanom rastvoru (R)-2-metil-3-(2-((2,2,2-trifluoroetil)amino)propil)anilina (1,35 g, 5,49 mmol), 5-bromopikolinaldehida (1,02 g, 5,49 mmol) i vode (0,49 mL, 27,43 mmol) u MeCN (21,5 mL). Rezultujući rastvor je mešana na 80°C tokom 1 sata. Smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom i ostatak je suv postavljen na silika gel i prečišćen je fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 10 do 30% EtOAc u heksanu. Fragmenti koji sadrže željeni proizvod su koncentrovani do suvoće kako bi se dobio (1S,3R)-1-(5-bromopiridin-2-il)-3,5-dimetil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (2,22 g, 98%) kao žućkasta guma.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 0,88 (3H, d), 1,91 (3H, s), 2,37 - 2,46 (1H, m), 2,60 - 2,76 (1H, m), 2,76 - 3,00 (1H, m), 3,15 - 3,28 (1H, m), 3,34 - 3,63 (1H, m), 4,65 (2H, s), 4,85 (1H, s), 6,19 - 6,52 (2H, m), 7,10 -7,31 (1H, m), 7,97 (1H, dd), 8,62 (1H, d). M/z: ES+ [M+H]<+>414.

Priprema (6S,8R)-6-(5-bromo-2-piridil)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-3,6,8,9-tetrahidropirazolo[4,3-f]izohinolina

[0493]

[0494] (1S,3R)-1-(5-bromopiridin-2-il)-3,5-dimetil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (2,21 g, 5,33 mmol) u propinonskoj kiselini (14,0 mL) je ohlađen do -20°C. Rastvor natrijum nitrita (0,40 g, 5,86 mmol) u vodi (2,8 mL) je dodat kapanjem tokom 5 minuta, održavajući temperaturu kade između -20°C i -15°C. Rezultujuća smeša je mešana na -20°C tokom 45 minuta. Toluen (80 mL), ohlađen do -15°C, je sipan u reakciju, i reakcija je mešana tokom 15 minuta. Rastvor natrijum karbonata (12,0 g, 113 mmol) u vodi (125 mL) je polako dodat i smeši je omogućeno da se da se zagreje do sobne temperature. EtOAc (100 mL) je dodat i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa CHCl3/IPA (3:1) (100 mL). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov proizvod koji je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 15 do 50% EtOAc u heksanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (1,63 g, 72%) kao braon čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,10 (3H, d), 2,83 - 2,96 (1H, m), 2,96 - 3,14 (2H, m), 3,35 - 3,48 (1H, m), 3,49 - 3,73 (1H, m), 5,11 (1H, s), 6,87 (1H, d), 7,27 (1H, d), 7,35 (1H, d), 7,99 (1H, dd), 8,09 (1H, s), 8,53 - 8,63 (1H, m), 12,96 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]<+>425.

Priprema terc-butil (1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)karbamata

[0495]

[0496] Suspenzija terc-butil azetidin-3-ilkarbamata (10,00 g, 58,06 mmol), 1-fluoro-3-jodopropana (11,13 g, 59,22 mmol) i kalijum karbonata (16,05 g, 116,13 mmol) u MeCN (200 mL) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 dana. Čvrste supstance su uklonjene filtriranjem i filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je tretiran sa vodom i ekstrahovan sa DCM. Kombinovani organski ekstrakti su osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio terc-butil (1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)karbamat (13,40 g, 99%) kao bledo žuta čvrsta supstanca.<1>HNMR (300 MHz, CDCl3, 27°C) 1,45 (9H, s), 1,61 - 1,92 (2H, m), 2,51 - 2,67 (2H, m), 2,85 (2H, br s), 3,57 - 3,72 (2H, m), 4,30 (1H, br d), 4,36 - 4,63 (2H, m), 4,89 (1H, br d).

Alternativna priprema terc-butil (1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)karbamat

[0497]

[0498] Trifluorometansulfonski anhidrid (2,31 mL, 13,75 mmol), praćen 2,6-dimetilpiridinom (1,74 mL, 15,00 mmol), dodat je rastvoru 3-fluoropropan-1-ola (0,94 mL, 12,5 mmol) u DCM (47 mL) na 0°C i reakcija je mešana na 0°C tokom 1 sata. Reakciona smeša je oprana sa IN HCl, zatim je organski sloj osušen i pažljivo isparen. Ostatak je zatim dodat u različitu bocu koja sadrži suspenziju terc-butil azetidin-3-ilkarbamata (1,94 g, 11,25 mmol) i DIPEA (3,24 ml, 18,75 mmol) u dioksanu/DCM (1:1, 40 mL) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi (egzotermno dodavanje triflata). Reakciona smeša je razblažena sa DCM i oprana sa rastvorom NH4Cl. Organski sloj je osušen i isparen pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov proizvod. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 10% 1M NH3/MeOH u DCM. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio terc-butil (1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)karbamat (2,82 g, 97%) kao ulje boje sleza<1>HNMR kao iznad.

Priprema 1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina

[0499]

[0500] Triflurosirćetna kiselina (39,8 mL, 517 mmol) je dodata kapanjem tokom 30 minuta rastvoru terc-butil (1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)karbamata (20,0 g, 86 mmol) u DCM (67,8 mL) koji je potopljen u vodenu kadu. Nakon 18 sati, reakcija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom do narandžastog ulja. Ovo ulje je rastvoreno u 10% metanolu u DCM (125 mL) i kalijum karbonat (71,4 g, 517 mmol) je dodat sa energičnim mešanjem. Nakon 15 minuta, dodatnih 30 g kalijum karbonata je dodato. Mešanje je postalo sporo, i Celit je dodat (~ 15 g). Mešanje je nastavljeno tokom dodatnih 15 minuta, i smeša je filtrirana sa 10% metanola u DCM ispiranju. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom na rotacionom isparavaču (pritisak: 100 mbar, temperatura vodene kade: 30°C), i rezultujuće narandžasto ulje je prečišćeno fleš silika hromatografijom (λ detektovanje = 210 nm), gradijent eluiranja 0 do 15% (2 M amonijak u metanol) u DCM kako bi se dobio 1-(3fluoropropil)azetidin-3-amin (12,8 g) zagađen sa 28% težine metanola na osnovu NMR integracije kao žuto ulje. Ovaj materijal može da se koristi direktno, čuvan u frižideru za kasniju upotrebu, ili je dalje prečišćen vakuumskom destilacijom kao prema narednom primeru: 1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin (14,8 g) kao svetlo žuto ulje je destilovan koristeći uslove aparata za destilaciju kratkog puta sa vodenim hlađenjem pod vakuumom (vakuumska pumpa). Boca koja sadrži amin je potopljena u uljanu kadu, i temperatura kade je postepeno povećana do 140°C tokom perioda od 30 minuta. Destilacija se dogodila sa temperaturom kade od 110-135°C i temperaturom glave od otprilike od 70°C kako bi se dobio 1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin (12,4 g, 84%) kao bistro bezbojno ulje. Ovo ulje je čuvano u frižideru pre primene.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,52 - 1,70 (2H, m), 1,75 (2H, br s), 2,38 (2H, t), 2,43 - 2,48 (2H, m), 3,27 - 3,39 (1H, m), 3,42 - 3,48 (2H, m), 4,43 (2H, dt). M/z: ES+ [M+H]+ 133.

Primer 17A: Priprema N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina Oblik A (nevodeni oblik)

Postupak 1

[0501] 4,0 mg amorfnog N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina je rastvoreno u 100 ul EtOAc do formiranja bistrog rastvora. Oko 200 ul heptana je dodato polako rastvoru, mutna suspenzija je formirana. Suspenzija je mešana na uslovima okruženja tokom 3 dana. Kristalni materijal Oblika A je dobijen.

Postupak 2

[0502] 1,60 g amorfnog N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina je suspendovano u 15 ml smeše acetona/H2O (10:1). Suspenzija je formirana, i zatim je formirana gel.10 mg N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina Oblika A je dodato nakon 2 sata, i suspenzija je mešana na temperaturi okruženja tokom 1 dana kada je gel postao čvrst kolač. Čvrsti kolači na zidu i dnu su ručno uklonjeni u rastvori, i homogena suspenzija je dobijena nakon mešanje tokom 1 sata. Čvrsta supstanca je prikupljena filtriranjem i oprana sa 5,0 ml acetona/H2O (1:10) dvaput, praćeno sa H2O nekoliko puta.

1,45 g belog praška je dobijeno (90% prinos) kao Oblik A nakon sušenja u vakuumu tokom 4 sata.

Postupak 3

[0503] 501 mg amorfnog materijala N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahiro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina je rastvoreno u 1,0 ml EtOAc do formiranja braon rastvora. Rastvoru, 1,0 ml heptana je dodato polako. Na kraju dodavanja, čvrsta supstanca je počela da se formira ali je zatim rastvorena.

2-5 mg N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina-Oblika A je dodat bistrom braon rastvoru, kada je čvrsta supstanca počela da se taloži. Suspenzija je mešana na temperaturi okruženja tokom 1 dana. Čvrsta supstanca je prikupljena filtriranjem i osušena u vazduhu.

345 mg beličastog praška je dobijeno (prinos: ~69%) kao Oblik A.

[0504] Oblik A iz postupka 2 je analiziran sa XRPD i rezultati su dati u tabeli u nastavku (Tabela 1) i prikazani na Slici 1.

Tabela 1. XRPD vrhovi za Oblik A

[0505] Oblik A je analiziran sa termalnim tehnikama. DSC analiza je ukazala da Oblik A ima tačku topljenja sa početkom na 132°C i vrhom na 137°C. TGA je ukazala da Oblik A ispoljava gubitak mase od oko 0,2 % nakon zagrevanja od oko 25°C do oko 100°C.

Reprezentativni DSC/TGA termogram Oblika A je prikazan na Slici 2.

Primer 17B: Priprema N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina Oblika B (TBME solvat)

[0506] 100 mg N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina (amorfni materijal) je delimično rastvoreno u 1,0 ml TBME. Suspenzija je mešana pod uslovima okruženja, kada se još čvrste supstance taložilo u suspenziji. Suspenzija je mešana tokom 2 sata. N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin-Oblik B je identifikovan kada je suspenzija direktno postavljena na držač uzoraka radi XRPD karakterizacije. Oblik B se konvertovao u Oblik C nakon što je čvrsta supstanca filtrirana i osušena u uslovima okruženja.

[0507] Oblik B je analiziran sa XRPD i rezultati su dati u tabeli u nastavku (Tabela 2) i prikazani na Slici 3.

Tabela 2. XRPD vrhovi za Oblik B

Primer 17C: Priprema N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina Oblika C (TBME solvat)

[0508] 200 mg N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin amorfni materijal je maltene rastvoren u 1 ml TBME. Suspenzija je mešana pod uslovima okruženja, kada se još čvrste supstance taložilo nakon 10 minuta. Suspenzija je mešana tokom 2 sata i zatim isparena pod uslovima okruženja. Oblik C je dobijen nakon što je čvrsta supstanca filtrirana i osušena u uslovima okruženja.

[0509] Oblik C je analiziran sa XRPD i rezultati su dati u tabeli u nastavku (Tabela 3) i prikazani na Slici 4.

Tabela 3. XRPD vrhovi za Oblik C

[0510] Oblik C je analiziran sa termalnim tehnikama. DSC analiza je ukazala da Oblik C ima endotermni događaj desolvacije sa početkom na 75°C i vrhom na 84°C. TGA je ukazala da Oblik C ispoljava gubitak mase od oko 7,1 % nakon zagrevanja od oko 25°C do oko 150°C. Reprezentativni DSC/TGA termogram Oblika C je prikazan na Slici 5.

Primer 17D: Priprema N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izociuinolin-6-il)piridin-3-amina Oblika D (CPME solvat)

[0511] 150 mg N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin amorfnog materijala je mešano u 2,0 ml CPME (ciklopentil metil etar). Nakon mešanja tokom 1 dana, čvrsta supstanca je izolovana filtriranjem i osušen na vazduhu. Dobijeno je ~ 50 mg belog praška Oblika D.

[0512] Oblik D je analiziran sa XRPD i rezultati su dati u tabeli u nastavku (Tabela 4) i prikazani na Slici 6.

Tabela 4. XRPD vrhovi za Oblik D

[0513] Oblik D je analiziran sa termalnim tehnikama. DSC analiza je ukazala da Oblik D ima endotermni događaj desolvacije sa početkom na 76°C i vrhom na 81°C, praćeno dodatnim endotermnim događajem sa početkom na 128°C i vrhom na 133°C. TGA je ukazala da Oblik D ispoljava gubitak mase od oko 6,8 % nakon zagrevanja od oko 25°C do oko 150°C.

Reprezentativni DSC/TGA termogram Oblika D je prikazan na Slici 7.

Primer 17E: Priprema N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina Oblika E (nevodeni oblik)

Postupak 1

[0514] 100 mg amorfnog N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina je dodato u 2,0 ml heptana do formiranja suspenzije. 0,40 ml EtOAc je dodato. Nakon mešanja tokom 2 sata, dodatnih 0,10 ml EtOAc je dodato suspenziji i suspenzija je mešana pod uslovima okruženja tokom 18 sati, kada je nov kristalni oblik, Oblik E, identifikovan sa XRPD.75 mg belog čvrstog Oblika E je dobijeno nakon što je čvrsta supstanca izolovana i osušena na uslovima okruženja (prinos: 75%).

Postupak 2

[0515] 1,002 g amorfnog N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina je rastvoreno u 5,0 ml EtOAc kako bi se dobio bistar svetlo braon rastvor.5,0 ml heptana je dodato i rastvor ostao bistar.10 mg N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina-Oblika E je dodato, i suspenzija je mešana na temperaturi okruženja. Čvrste supstance su počele da se talože pod uslovima okruženja, i vlažan kolač je formirana nakon 1 sata.5,0 ml EtOAc je dodato polako suspenziji i rezultujuća suspenzija je mešana na temperaturi okruženja tokom 1 sata. Dodatnih 10 ml heptana je dodato, i još čvrste supstance je počelo da se taloži. Nakon mešanja pod uslovima okruženja tokom 2 sata, suspenzija je zagrejana do 60°C i mešana na 60°C tokom 2 sata. Suspenzija je ohlađena do temperature okruženja i mešana tokom 18 sati. Beličasti čvrsti Oblik E je izolovan filtriranjem i opran sa 1:4 EtOAc/heptan mešanim rastvaračem 3 puta.0,875 g bledo belog praška je prikupljeno nakon sušenja vazduhom (prinos: 87%).

[0516] Oblik E iz postupka 1 je analiziran sa XRPD i rezultati su dati u tabeli u nastavku (Tabela 5) i prikazani na Slici 8.

Tabela 5. XRPD vrhovi za Oblik E

[0517] Oblik E je analiziran sa termalnim tehnikama. DSC analiza je ukazala da Oblik E ima tačku topljenja sa početkom na 126°C i vrhom na 133°C. TGA je ukazala da Oblik E ispoljava gubitak mase od oko 0,8 % nakon zagrevanja od oko 25°C do oko 100°C.

Reprezentativni DSC/TGA termogram Oblika E je prikazan na Slici 9.

Primer 17F: Priprema N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-flizohinolin-6-il)piridin-3-amina Oblika F (heptan solvat)

[0518] 20 mg amorfnog N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina je rastvoreno u 200 ul acetona.1,0 ml heptana je dodat polako rastvoru. Rastvor je počeo da se zamućuje i zatim je formirana suspenzija. Suspenzija je mešana na temperaturi okruženja nakon što je 1,0 ml heptana dodato. Čestice u obliku igle su primećene u suspenziji.

Suspenzija je zagrejana do 60°C i mešana tokom 2 sata i zatim ohlađena do temperature okruženja. Čestice igle su formirane.

[0519] Suspenzija koja rezultuje iz Oblika F je analizirana sa XRPD i rezultati su prikazani na Slici 10. Kristalnost Oblika F je smanjena tokom XRPD karakterizacije, i drugo ponavljanje XRPD ukazuje da je amorfni materijal dobijen nakon sušenja u držaču uzoraka.

Primer 17F: Priprema N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina Oblika G (metilpentanon solvat)

[0520] 100 mg amorfnog N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina je suspendovano u 200 ul metilpentanona, i 2-5 mg N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina-Oblika A je dodato, čime je kolač formiran nakon mešanje pod uslovima okruženja tokom 10 minuta.200 ul metilpentanona je dodato i suspenzija je formirana.

Suspenzija je mešana na uslovima okruženja tokom 18 sati. XRPD je pokazao da se formirao kristalni oblik, N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin-Oblik G. Oblik G se konvertovao u delimično amorfni materijal nakon izolovanja i sušenja pod uslovima okruženja.

[0521] Oblik G je analiziran sa XRPD i rezultati su dati u tabeli u nastavku (Tabela 6) i prikazani na Slici 10.

Tabela 6. XRPD vrhovi za Oblik G

Primer 18

5-fluoro-6-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)piridin-3-amin [0522]

[0523] [(2-Di-cikloheksilfosfmo-3,6-dimetoksi-2',4',6'-tmsopropil-1,l'-bifenil)-2-(2'-amino-1,1'-bifenil)]paladijum(II) metansulfonat metansulfonat (Brett Phos G3) (48,6 mg, 0,05 mmol) je dodat degaziranom rastvoru 1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina (95 mg, 0,72 mmol), (6S,8R)-6-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (155 mg, 0,36 mmol) i natrijum tercbutoksida (206 mg, 2,15 mmol) u 1,4-dioksanu (3 mL) pod azotom. Rezultujući rastvor je mešana na 90°C tokom 2 sata. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc (50 mL), i oprana sekvencijalno sa vodom (50 mL) i zasićenim vodenim natrijum hloridom (50 mL). Organski sloj je osušen sa MgSO4, filtriran i isparen kako bi se dobio sirov proizvod koji je prečišćen preparativnom HPLC (Waters XBridge Prep C18 OBD kolona, 5µ silika, 50 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 0,1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobio 5-fluoro-6-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3fizohinolin-6-il)-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)piridin-3-amin (39,0 mg, 22%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 0,48 - 0,61 (2H, m), 0,92 - 1,09 (2H, m), 1,13 (3H, d), 1,68 - 1,83 (2H, m), 2,56 - 2,62 (2H, m), 2,67 (1H, dd), 2,86 (1H, dd), 2,90 -2,95 (2H, m), 3,17 (1H, dd), 3,27 (1H, dd), 3,70 (2H, q), 3,87 (1H, td), 4,04 (1H, q), 4,21 (1H, d), 4,43 (1H, t), 4,53 (1H, t), 5,39 (1H, s), 6,50 (1H, dd), 6,79 (1H, d), 7,12 (1H, d), 7,68 (1H, d), 8,03 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 485.

[0524] 5-fluoro-6-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)piridin-3-amin je pripremljen kako sledi:

Priprema 1-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-N-((1S,3R)-1-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-il)metanimina [0525]

[0526] 5-Bromo-3-fluoropikolinaldehid (1,09 g, 5,33 mmol) je dodat (R)-3-(2-(((1-fluorociklopropil)metil)amino)propil)-2-metilanilinu (630 mg, 2,67 mmol) i vodi (0,240 mL, 13,33 mmol) u sirćetnoj kiselini (12 mL). Rezultujući rastvor je mešana na 70°C tokom 2 sata. Reakciona smeša je koncentrovana i razređena sa EtOAc (50 mL) i oprana sekvencijalno sa zasićenim vodenim NaHCO3(50 mL). Organski sloj je osušen sa MgSO4, filtriran i isparen kako bi se dobio 1-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-N-((1S,3R)-1-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-il)metanimin kao sirov proizvod (1,53 g, 2,51 mmol). M/z: ES+ [M+H]+ 607.

Priprema (1S,3R)-1-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina

[0527]

[0528] Hidroksilamin hlorovodonik (0,174 g, 2,51 mmol) je dodat 1-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-N-((1S,3R)-1-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-il)metaniminu (1,53 g, 2,51 mmol) i kalijum acetatu (0,62 g, 6,27 mmol) u MeOH (12 mL). Rezultujući rastvor je mešan na 20°C tokom 5 sati. Reakciona smeša je koncentrovana i razređena sa DCM (75 mL) i oprana sekvencijalno sa NaOH (2M, 75 mL) i zasićenim vodenim natrijum hloridom (50 mL). Organski sloj je osušen sa MgSO4, filtriran i isparen kako bi se dobio sirov proizvod koji je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 20% EtOAc u heptanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio (1S,3R)-1-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (0,672 g, 63%) kao bezbojna guma.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 0,45 - 0,61 (2H, m), 0,92 - 1,06 (2H, m), 1,07 (3H, d), 2,07 (3H, s), 2,51 (1H, dd), 2,59 (1H, dd), 2,85 (1H, dd), 3,13 (1H, dd), 3,52 (2H, s), 3,64 - 3,75 (1H, m), 5,35 (1H, s), 6,48 (2H, s), 7,52 (1H, dd), 8,36 (1H, dd); m/z: ES+ [M+H]+ 422/424.

Priprema (6S,8R)-6-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0529]

[0530] (1S,3R)-1-(5-Bromo-3-fluoropiridin-2-il)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (0,672 g, 1,59 mmol) u propinonskoj kiselini (6,63 mL) je ohlađen do -17°C (suv led/aceton). Natrijum nitrit (0,110 g, 1,59 mmol) u vodi (1,33 mL) je dodat kapanjem i reakciona smeša mešana na -17°C tokom 30 minuta. Reakciona smeša je razblažena sa ledeno hladnim toluenom (30 mL), mešana na 0°C tokom 15 minuta zatim na sobnoj temperaturi tokom 45 minuta. Reakciona smeša je oprana sa vodom (2 x 25 mL), kombinovane vodene faze oprana sa EtOAc (25 mL), kombinovana organska materija je oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (50 mL), osušena (MgSO4), filtrirana i filtrat isparena do narandžasto-braon ulje. Sirov materijal je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0-50% EtOAc u heptanu kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (0,310 g, 45%) kao narandžasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 0,50 - 0,59 (2H, m), 1,03 (2H, dd), 1,13 (3H, d), 2,72 (1H, dd), 2,91 (1H, dd), 3,16 (1H, dd), 3,27 (1H, dd), 3,77 - 3,90 (1H, m), 5,50 (1H, s), 6,80 (1H, d), 7,20 (1H, dd), 7,56 (1H, dd), 8,07 (1H, d), 8,36 (1H, dd); m/z: ES+ [M+H]+ 433.

Primer 19

Priprema N-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina [0531]

[0532] DMF (2 mL) i DIPEA (0,074 mL, 0,42 mmol) su dodati sekvencijalno boci napunjenoj sa N-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)azetidin-3-amina (75 mg, 0,17 mmol). 1-Fluoro-3-jodopropan (31,9 mg, 0,17 mmol) u DMF (0,1 mL) je zatim dodat, i mešanje je nastavljeno tokom 2 sata. Reakcija je zaustavljena, razređena sa zasićenim vodenim natrijum hloridom i jedinjenje je ekstrahovano u EtOAC (x3). Kombinovani ekstrakti su oprani sa vodom i osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio film. Ovaj materijal je prečišćen fleš silika hromatografijom, eluiranjem sa 2 do 10% (metanol sadrži 1% amonijum hidroksid) u DCM kako bi se dobio N-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin (43 mg, 51%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,00 (3H, d), 1,45 - 1,70 (5H, m), 2,44 (2H, t), 2,55 - 2,66 (1H, m), 2,66 - 2,72 (2H, m), 2,79 (1H, dd), 2,87 - 3,01 (1H, m), 3,10 (1H, br dd), 3,38 - 3,53 (1H, m), 3,56 - 3,67 (2H, m), 3,77 (3H, s), 3,85 - 3,97 (1H, m), 4,43 (2H, dt), 5,21 (1H, s), 5,88 (1H, dd), 6,00 (1H, d), 6,16 (1H, d), 6,35 (1H, d), 6,64 (1H, d), 7,17 (1H, d), 8,02 (1H, s), 12,92 (1H, d). M/z :

(ES+), [M+H]+ = 502.

[0533] Početni materijal N-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-flizohinolin-6-il)-3-metoksifenil)azetidin-3-amin je pripremljen u skladu sa procedurama u nastavku.

Priprema 2,2-difluoropropil trifluorometansulfonata

[0534]

[0535] Trifluorometansulfonski anhidrid (3,29 ml, 19,5 mmol) je dodat kapanjem rastvoru 2,2-difluoropropan-1-ola (1,7 g, 18 mmol) u DCM (40 mL) na -10°C (so/ledena kada).2,6-Dimetilpiridin (2,5 mL, 21 mmol) je zatim dodat, i reakcija je mešana tokom 1 sata pod tim uslovima. Reakcija je zatim oprana sa vodom (x2), i organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom (vakuum ~200 mbara) kako bi se dobio 2,2-difluoropropil trifluorometansulfonat (2,1 g, 52%) kao crveno ulje.<1>H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) 4,48 (2 H, t), 1,73 (3 H, t).

Priprema (R)-3-(2-((2,2-difluoropropil)amino)propil)-2-metilanilina

[0536]

[0537] 2,2-Difluoropropil trifluorometansulfonat (1,68 g, 7,37 mmol) je dodat mešanom rastvoru (R)-3-(2-aminopropil)-2-metilanilina (1,1 g, 6,7 mmol) i DIPEA (1,52 ml, 8,71 mmol) u 1,4-dioksanu (20 mL). Reakcija je zagrejana na 65°C tokom 3 sata pre nego što je ohlađena do sobne temperature i zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom.

Rezultujući ostatak je rastvoren u EtOAc (30 mL) i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (20 mL) i kombinovani organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujuće crveno ulje je prečišćeno fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 30 do 90% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (R)-3-(2-((2,2-difluoropropil)amino)propil)-2-metilanilin (1,02 g, 63%) kao guma.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27°C) 0,90 (3H, d), 1,55 (3H, t), 1,75 (1H, br s), 1,97 (3H, s), 2,29 - 2,38 (1H, m), 2,69 - 2,76 (2H, m), 2,86 (2H, br t), 4,69 (2H, s), 6,34 (1H, d), 6,47 (1H, d), 6,77 (1H, t). M/z : (ES+), [M+H]+ = 439.

Priprema (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-2-(2,2-difluoropropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina

[0538]

[0539] 4-Bromo-2-metoksibenzaldehid (1,07 g, 4,95 mmol) je dodat rastvoru (R)-3-(2-((2,2-difluoropropil)amino)propil)-2-metilanilina (0,600 g, 2,48 mmol) u AcOH (12 mL) i vodi (0,223 g, 12,4 mmol), i reakcija je zagrejana na 80°C tokom 18 sati. Nakon hlađenja, isparljive materije su koncentrovane pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je rastvoren u EtOAc. Rastvor je neutralizovan pranjem sa zasićenim vodenim NaHCO3organski sloj je kombinovan sa vodenim HCl (1N), i dvofazna smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Slojevi su zatim razdvojeni, i organski sloj je opran sa vodenim HCl (1N). Kombinovani vodeni slojevi su ekstrahovani sa EtOAc i zatim bazifikovani dodavanjem čvrstog K2CO3. Organski sloj je zatim ekstrahovan sa EtOAc (x2), i kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 10 do 60% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-2-(2,2-difluoropropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (0,576 g, 53%) kao guma.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 27°C) 0,95 (3H, d), 1,54 (3H, t), 1,93 (3H, s), 2,27 - 2,43 (2H, m), 2,57 - 2,74 (1H, m), 2,76 - 2,98 (1H, m), 3,19 - 3,26 (1H, m), 3,84 (3H, s), 4,63 (2H, s), 5,12 (1H, s), 6,26 (1H, d), 6,38 (1H, d), 6,58 (1H, d), 6,94 (1H, dd), 7,16 (1H, d). M/z : (ES+), [M+H]+ = 439.

[0540] Takođe je izolovan N-((1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-2-(2,2-difluoropropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-il)acetamid (0,081 g, 7%) kao guma.

Priprema (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0541]

[0542] Natrijum nitrit (0,049 g, 0,72 mmol) kao rastvor u vodi (0,750 mL) je dodat kapanjem ohlađenom rastvoru (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-2-(2,2-difluoropropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina (0,30 g, 0,68 mmol) u propinonskoj kiselini (2,5 mL) na -15°C, i reakcija je mešana tokom 1 sata pod tim uslovima. Ledeno hladni EtOAc (10 mL) je dodat praćen zasićenim vodenim NaHCO3(10 mL) iz delova. Slojevi su razdvojeni, i organski sloj je opran sa zasićenim vodenim NaHCO3, kombinovani vodeni slojevi su ekstrahovani sa EtOAc, i svi organski slojevi su kombinovani, osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 20 do 70% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (0,23 g, 75%) kao guma.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,01 (3H, d), 1,53 (3H, t), 2,84 (1H, dd), 2,96 - 3,09 (1H, m), 3,14 (1H, br dd), 3,36 - 3,48 (1H, m), 3,89 (3H, s), 5,32 (1H, s), 6,64 (2H, app t), 6,94 (1H, dd), 7,16 - 7,27 (2H, m), 8,06 (1H, s), 12,99 (1H, br s).1H je zaklonjen sa DMSO. M/z : (ES+), [M+H]+ = 450.

Priprema (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoropropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina i (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoropropil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0543]

[0544] DCM (7 mL) je dodat boci napunjenoj sa (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolinom (0,3 g, 0,67 mmol) i hidratom 4-metilbenzensulfonske kiseline (0,025 g, 0,13 mmol). 3,4-Dihidro-2H-piran (0,084 g, 1,0 mmol) je dodat, i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati.

Reakcija je oprana sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom, i organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš hromatografijom, eluiranjem sa 5 do 40% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoropropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (175 mg, 49%) kao guma.<1>H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) 0,99 - 1,13 (3H, br s), 1,48 - 1,88 (6H, m), 2,01 - 2,08 (1H, m), 2,08 - 2,18 (1H, m), 2,48 - 2,70 (2H, m), 2,82 (1H, dt), 2,88 - 3,04 (1H, m), 3,20 (1H, br d), 3,55 - 3,67 (1H, m), 3,63 - 3,73 (1H, m), 3,88 (3H, s), 3,94 - 3,98 (1H, m), 5,42 (1H, br s), 5,63 (1H, dt), 6,64 (1H, dd), 6,73 (1H, dd), 6,86 (1H, dd), 7,03 (1H, t), 7,25 -7,29 (1H, m), 7,98 (1H, d). M/z : (ES+), [M+H]+ = 534.

[0545] Takođe izolovan je (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoropropil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (68 mg, 19%) kao guma.<1>H NMR (400MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) 1,02 - 1,07 (3H, m), 1,42 -1,53 (3H, m), 1,59 - 1,81 (3H, m), 2,03 - 2,09 (1H, m), 2,18 - 2,25 (2H, m), 2,59 (1H, qd), 2,69 (1H, dd), 2,86 - 2,98 (1H, m), 3,02 - 3,14 (1H, m), 3,46 - 3,57 (1H, m), 3,72 - 3,82 (1H, m), 3,87 - 3,90 (3H, m), 4,11 - 4,16 (1H, m), 5,31 (1H, s), 5,61 - 5,68 (1H, m), 6,60 (1H, dd), 6,72 (1H, dd), 6,88 (1H, dt), 7,01 - 7,05 (1H, m), 7,36 (1H, d), 8,09 (1H, s). M/z : (ES+), [M+H]+ = 534.

Priprema terc-butil 3-((4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoropropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)amino)azetidin-1-karboksilata

[0546]

[0547] Dioksan (3,5 mL) je dodat boci napunjenoj sa CS2CO3(213 mg, 0,65 mmol), tercbutil 3-aminoazetidin-1-karboksilatom (85 mg, 0,49 mmol), i (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoropropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolinom (175 mg, 0,33 mmol). Reakciona boca je evakuisana i ponovo napunjena sa azotom (x3). BrettPhos pred-katalizator treće generacije (30 mg, 0,03 mmol) je dodat, i boca je ponovo evakuisana i ponovo napunjena sa azotom (x3). Reakcija je zagrejana na 100°C tokom 4 sata. Reakcija je ohlađena do sobne temperature, filtrirana, i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujuća sirova guma je prečišćen fleš silika hromatografijom, eluiranjem sa 15 do 70% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio tercbutil 3-((4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoropropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)amino)azetidin-1-karboksilat (152 mg, 74%) kao film.<1>H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) 1,05 (3H, d), 1,42 (9 H, s), 1,44 - 1,57 (3H, m), 1,57 - 1,63 (1H, m), 1,66 - 1,77 (2H, m), 2,04 - 2,08 (1H, m), 2,09 - 2,18 (1H, m), 2,47 - 2,69 (2H, m), 2,79 (1H, dt), 2,84 - 2,99 (1H, m), 3,16 (1H, br dd), 3,48 - 3,61 (1H, m), 3,69 (3H, dt), 3,83 (3H, s), 3,94 - 4,04 (2H, m), 4,15 (1H, br s), 4,20 -4,29 (2H, m), 5,32 (1H, s), 5,63 (1H, dt), 5,86 (1H, dd), 6,07 (1H, t), 6,55 (1H, dd), 6,78 (1H, dd), 7,20 - 7,23 (1H, m), 7,98 (1H, d). M/z : (ES+), [M+H]+ = 626.

Priprema N-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)azetidin-3-amina

[0548]

[0549] Metanol (1 mL) i zatim HCl u dioksanu (4 M; 1 mL, 4 mmol) su dodati sekvencijalno boci napunjenoj sa terc-butil 3-((4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoropropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)amino)azetidin-1-karboksilatom (140 mg, 0,22 mmol). Nakon 2 sata, reakcija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom i rezultujući ostatak je prečišćen koristeći SCX-2 patronu koja je u napred tretirana sa metanolom. Jedinjenje je eluirano najpre sa metanolom, pa zatim sa amonijakom u metanolu (3N). Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio N-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)azetidin-3-amin (91 mg, 92%) kao guma. Proizvod je korišćen u narednom koraku bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,00 (3H, d), 1,52 (3H, t), 2,55 - 2,59 (1H, m), 2,78 (1H, dd), 2,85 - 2,99 (1H, m), 3,09 (1H, dd), 3,39 - 3,50 (1H, m), 3,55 - 3,66 (2H, m), 3,77 (3H, s), 4,03 - 4,14 (1H, m), 5,21 (1H, s), 5,85 (1H, dd), 6,05 (1H, br d), 6,14 (1H, d), 6,34 (1H, d), 6,63 (1H, d), 7,17 (1H, d), 8,02 (1H, s), 12,93 (1H, br s).3H nije primećen. M/z : (ES+), [M+H]+ = 442.

Primer 20

Priprema N-(3-etoksi-4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina [0550]

[0551] DMF (2 mL) i DIPEA (0,050 mL, 0,28 mmol) su dodati sekvencijalno boci napunjenoj sa N-(3-etoksi-4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)azetidin-3-aminom (0,051 g, 0,11 mmol).1-Fluoro-3-jodopropan (0,021 g, 0,11 mmol) je dodat kao rastvor u DMF (0,2 mL), i nakon 2 sata, reakcija je razblažena sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom. Smeša je ekstrahovana sa etil acetatom (x3), i kombinovani organski slojevi su oprani sa vodom, osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom.

Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 2 do 10% (metanol sadrži 1% amonijum hidroksid) u DCM. Fragmenti proizvoda su kombinovani, koncentrovani pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom koristeći gore navedene uslove kako bi se dobio N-(3-etoksi-4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin (0,023 g, 40%).<1>H NMR (CHLOROFORM-d, 27°C) 0,50 (2H, br d), 0,88 - 1,05 (2H, m), 1,12 (3H, br d), 1,45 (3H, t), 1,75 - 1,87 (2H, m), 2,59 - 2,73 (3H, m), 2,87 - 3,04 (3H, m), 3,04 - 3,15 (1H, m), 3,41 (1H, br dd), 3,73 - 3,90 (3H, m), 3,93 - 4,18 (4H, m), 4,52 (2H, dt), 5,37 (1H, br s), 5,99 (1H, dd), 6,13 (1H, br d), 6,80 - 6,89 (2H, m), 7,14 (1H, d), 8,06 - 8,08 (1H, m), 10,02 (1H, br s). M/z : (ES+), [M+H]+ = 510.

[0552] Procedure korišćene za pripremu N-(3-etoksi-4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)azetidin-3-amina su opisane u nastavku.

Priprema (1S,3R)-1-(4-bromo-2-etoksifenil)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina

[0553]

[0554] 4-Bromo-2-etoksibenzaldehid (0,775 g, 3,39 mmol) je dodat rastvoru (R)-3-(2-(((1-fluorociklopropil)metil)amino)propil)-2-metilanilina (0,400 g, 1,69 mmol) u AcOH (9 mL) i voda (0,152 g, 8,46 mmol). Reakcija je zagrejana na 80°C tokom 18 sati. Nakon hlađenja, reakcija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i zatim je ostatak rastvoren u EtOAc i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3. Slojevi su razdvojeni, i organska faza je kombinovana sa vodenom hlorovodoničnom kiselinom (1N). Nakon mešanja dvofazne smeše tokom 30 minuta, slojevi su razdvojeni. Organski sloj je opran sa vodenim HCl (1N), i kombinovani vodeni slojevi su ekstrahovani sa EtOAc (x2). Kombinovani vodeni slojevi su zatim bazifikovani dodavanjem čvrstog K2CO3i ekstrahovani sa EtOAc (x2). Organski ekstrakti su kombinovani, osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 10 do 60% etil acetata u heksanima kako bi se dobio (1S,3R)-1-(4-bromo-2-etoksifenil)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (0,48 g, 63%) kao čvrsta supstanca. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6, 27°C) 0,40 - 0,59 (2H, m), 0,83 - 0,93 (2H, m), 0,94 (3H, d), 1,35 (3H, t), 1,93 - 1,96 (3H, m), 2,45 - 2,53 (2H, m), 2,80 - 2,93 (2H, m), 3,57 (1H, br d), 4,14 (2H, q), 4,58 (2H, s), 5,15 (1H, s), 6,26 (1H, d), 6,35 (1H, d), 6,86 (1H, d), 6,95 (1H, dd), 7,15 (1H, d). M/z : (ES+), [M+H]+ = 447.

Priprema (6S,SR)-6-(4-bromo-2-etoksifenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0555]

[0556] Natrijum nitrit (0,039 g, 0,56 mmol) kao rastvor u vodi (0,750 mL) je dodat kapanjem ohlađenom rastvoru (1S,3R)-1-(4-bromo-2-etoksifenil)-2-((1-fluorociklopropil)metil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina (0,240 g, 0,54 mmol) u propinonskoj kiselini (3,0 mL) na -15°C, i reakcija je održavana pod tim uslovima tokom 1 sata. Zatim je ledom ohlađen EtOAc (10 mL) dodat, praćen zasićenim vodenim NaHCO3(15 mL) iz delova.

Nakon što je dodavanje završeno i kad je evolucija gasa prestala, slojevi su razdvojeni.

Organski sloj je opran sa zasićenim vodenim NaHCO3 (x2), i kombinovani vodeni slojevi su ekstrahovani sa EtOAc (x2). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš hromatografijom, gradijent eluiranja 20 do 60% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2-etoksifeny1)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (0,145 g, 59%) kao guma.<1>H NMR (500MHz, DMSO-d6, 27°C) 0,45 (1H, br s), 0,57 (1H, br s), 0,83 - 0,98 (2H, m), 1,00 (3H, d), 1,37 (3H, t), 2,54 - 2,63 (1H, m), 2,87 - 3,00 (2H, m), 3,27 - 3,32 (1H, m), 3,74 (1H, br d), 4,13 - 4,23 (2H, m), 5,32 (1H, s), 6,67 (1H, d), 6,94 (1H, s), 6,96 - 6,99 (1H, m), 7,19 (1H, d), 7,22 (1H, d), 8,06 (1H, s), 12,96 (1H, s). M/z : (ES+), [M+H]+ = 458.

Priprema (6S,8R)-6-(4-bromo-2-etoksifenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0557]

[0558] DCM (3 mL) i 3,4-dihidro-2H-piran (35,8 mg, 0,43 mmol) su dodati boci napunjenoj sa (6S,8R)-6-(4-bromo-2-etoksifenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolinom (130 mg, 0,28 mmol) i hidratom 4-metilbenzensulfonske kiseline (10,79 mg, 0,06 mmol). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati. Reakcija je oprana sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom, i organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujuća braon guma je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 5 do 40% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2-etoksifenil)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (147 mg, 96%) kao suv film.<1>H NMR (500MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) 0,42 - 0,51 (2H, m), 0,94 - 1,03 (2H, m), 1,07 - 1,12 (3H, m), 1,49 (3H, t), 1,61 - 1,68 (1H, m), 1,73 - 1,79 (2H, m), 2,02 - 2,10 (1H, m), 2,12 - 2,20 (1H, m), 2,53 - 2,63 (2H, m), 2,93 (1H, dt), 3,10 (1H, ddd), 3,38 - 3,46 (1H, m), 3,65 - 3,77 (1H, m), 3,83 - 3,92 (1H, m), 4,00 - 4,07 (1H, m), 4,12 - 4,19 (2H, m), 5,43 (1H, s), 5,66 (1H, ddd), 6,81 (1H, d), 6,89 - 6,93 (1H, m), 6,95 - 7,00 (1H, m), 7,03 - 7,06 (1H, m), 7,25 (1H, dd), 8,03 (1H, s). M/z : (ES+), [M+H]+ = 542.

Priprema terc-butil 3-((3-etoksi-4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)amino)azetidin-1-karboksilata

[0559]

[0560] Dioksan (2,7 mL) je dodat boci napunjenoj sa (6S,8R)-6-(4-bromo-2-etoksifenil)-7-((1-fluorociklopropil)metbil)-8-metbil-3-(tetrabydro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolinom (140 mg, 0,26 mmol), CS2CO3(168 mg, 0,52 mmol) i terc-butil 3-aminoazetidin-1-karboksilatom (67 mg, 0,39 mmol). Reakciona boca je evakuisana i napunjena sa N2(x3). BrettPhos pred-katalizator treće generacije (23 mg, 0,030 mmol) je dodat, i boca je evakuisana i napunjena sa azotom (x3). Reakcija je zagrejana na 90°C tokom 1 sata i zatim na 90°C tokom 44 sata. Reakcija je ohlađena do sobne temperature, filtrirana, i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujuća guma je prečišćena fleš hromatografijom, gradijent eluiranja 30 do 100% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio terc-butil 3-((3-etoksi-4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)amino)azetidin-1-karboksilat (86 mg, 53%) kao guma.<1>H NMR (500MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) 0,39 -0,49 (2H, m), 0,87 - 0,95 (2H, m), 1,06 (3H, d), 1,38 - 1,45 (12H, m), 1,57 - 1,62 (1H, m), 1,68 - 1,74 (2H, m), 1,98 - 2,06 (1H, m), 2,07 - 2,15 (1H, m), 2,49 - 2,63 (2H, m), 2,85 (1H, dt), 3,05 (1H, br t), 3,29 - 3,35 (1H, m), 3,63 - 3,73 (3H, m), 3,75 - 3,83 (1H, m), 3,92 (1H, br d), 3,99 (1H, br d), 4,05 (2H, q), 4,14 (1H, br dd), 4,18 - 4,26 (2H, m), 5,33 (1H, s), 5,58 -5,63 (1H, m), 5,90 (1H, br d), 6,02 - 6,06 (1H, m), 6,76 (1H, dd), 6,80 (1H, d), 7,19 (1H, d), 7,97 (1H, s). M/z : (ES+), [M+H]+ = 634.

Priprema N-(3-etoksi-4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)azetidin-3-amina

[0561]

[0562] Metanol (0,5 mL) je dodat boci napunjenoj sa terc-butil 3-((3-etoksi-4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)amino)azetidin-1-karboksilata (0,080 g, 0,13 mmol). Hlorovodonična kiselina u dioksanu (4 M; 0,5 mL, 2 mmol) je dodata, i mešanje je nastavljeno tokom 2 sata. Reakcija je zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je prečišćen koristeći SCX-2 patronu koje je u napred tretirana sa metanolom, eluiran najpre sa metanolom, pa zatim sa amonijakom u metanolu (3N), kako bi se dobio N-(3-etoksi-4-((6S,8R)-7-((1-fluorociklopropil)metil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)azetidin-3-amin (0,057 g, 99%) kao čvrsta supstanca.<1>H NMR (500MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) 0,44 - 0,55 (2H, m), 0,90 - 1,00 (2H, m), 1,12 (3H, d), 1,45 (3H, t), 2,61 - 2,71 (1H, m), 2,92 (1H, br dd), 3,10 (1H, br dd), 3,40 (1H, br dd), 3,51 - 3,58 (2H, m), 3,83 - 3,90 (1H, m), 3,91 - 4,02 (2H, m), 4,03 - 4,16 (3H, m), 4,36 (1H, sxt), 5,38 (1H, s), 5,98 (1H, dd), 6,12 (1H, br d), 6,77 - 6,89 (2H, m), 7,13 (1H, d), 8,07 (1H, s), 10,09 (1H, br s). One H nije primećen i verovatno je zaklonjen vrhom vode. M/z: (ES+), [M+H]+ = 450.

Primer 21

Priprema N-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina

[0563]

[0564] Hlorovodonična kiselina u dioksanu (4 M; 1,23 mL, 5,2 mmol) je dodata kapanjem mešanom rastvoru terc-butil 3-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenilamino)azetidin-1-karboksilata (316 mg, 0,52 mmol) u MeOH (5 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati. Reakcija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je rastvoren u MeOH. Višak tetraalkilamonijum karbonat makroporozne smole (Aldrich; 18-50 mreža; 2,5-3,5 mmol/g N opterećenje) je dodat, i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta. Smeša je filtrirana, i filtrat je osušen preko natrijum sulfata, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov N-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)azetidin-3-amin kao guma (220 mg). Ovo materijal je direktno korišćen u narednom koraku bez daljeg prečišćavanja. M/z : (ES+), [M+H]+ = 428.

[0565] Smeša N-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)azetidin-3-amina (220 mg, 0,51 mmol), 1-fluoro-3-jodopropana (106 mg, 0,57 mmol), i DIPEA (0,270 mL, 1,54 mmol) u DMF (5 mL) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati. Reakcija je razblažena sa DCM i oprana sa zasićenim vodenim amonijum hloridom. Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM, i kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (Xbridge C18 kolona, 19 mm x 150 mm; 5 µm; stopa protoka: 20 mL/minut), eluiranjem sa 40 do 80% acetonitrilom u vodi koji sadrži 0,2% amonijum hidroksid. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je prečišćen preparativnom SFC (2-etilpiridin kolona, 19 mm x 150 mm, 5 µm; stopa protoka: 75 mL/minut; temperatura kolone: 40°C; izlazni pritisak: 100 bar), eluiranjem sa 15% metanolom koji sadrži 0,2% amonijum hidroksid u ugljen dioksidu, kako bi se dobio N-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin (82 mg, 33% dva koraka) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (300MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,03 (3H, d), 1,55 - 1,74 (2H, m), 2,41 - 2,47 (2H, m), 2,53 -2,83 (4H, m), 2,86 - 3,04 (1H, m), 3,10 (1H, br dd), 3,32 - 3,43 (1H, m), 3,58 - 3,66 (2H, m), 3,82 (3H, s), 3,86 - 3,98 (1H, m), 4,45 (2H, dt), 5,21 (1H, s), 5,89 (1H, t), 5,90 (1H, dd), 6,01 (1H, d), 6,19 (1H, d), 6,35 (1H, d), 6,67 (1H, d), 7,19 (1H, d), 8,03 (1H, s), 12,92 - 12,96 (1H, m). M/z: ES+ [M+H]+ 488.

[0566] Početni materijal terc-butil 3-((4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenil)amino)azetidin-1-karboksilat je pripremljen prema narednim procedurama. Priprema (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina i (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0567]

[0568] Mikrotalasna bočica je napunjena sa (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (986 mg, 2,26 mmol), hidrat 4-metilbenzensulfonske kiseline (43 mg, 0,23 mmol), 3,4-dihidro-2H-piran (0,31 mL, 3,4 mmol) i DCM. Reakcija je zagrejana na 80°C pod mikrotalasnim uslovima (300 W) tokom 20 minuta. Reakcija je zatim ohlađena i razređena sa DCM pre nego što je oprana sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom. Slojevi su razdvojeni, i organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 70% EtOAc u heksanima, kako bi se dobio brzo eluirajući (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (457 mg, 39%) kao narandžasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) 1,04 - 1,22 (3H, m), 1,59 - 1,86 (3H, m), 2,04 - 2,23 (2H, m), 2,53 - 3,31 (5H, m), 3,40 - 3,57 (1H, m), 3,68 - 3,79 (1H, m), 3,97 (3H, s), 4,00 - 4,09 (1H, m), 5,41 (1H, br s), 5,69 (1H, br s), 5,66 - 5,73 (1H, m), 6,67 (1H, dd), 6,80 (1H, dd), 6,92 (1H, dd), 7,06 - 7,12 (1H, m), 7,29 - 7,37 (1H, m), 8,03 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 612. Takođe je izolovana sporo eluirajući (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (627 mg, 57%) kao bež prašak.<1>H NMR (300MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) 1,12 (3H, br d), 1,64 - 1,87 (3H, m), 2,03 - 2,17 (1H, m), 2,18 - 2,29 (2H, m), 2,61 - 2,83 (2H, m), 2,89 - 3,15 (2H, m), 3,43 (1H, br s), 3,75 - 3,86 (1H, m), 3,95 (3H, s), 4,13 - 4,20 (1H, m), 5,32 (1H, s), 5,79 (1H, br t), 5,66 - 5,73 (1H, m), 6,63 - 6,77 (2H, m), 6,93 (1H, d), 7,09 (1H, d), 7,43 (1H, d), 8,14 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 612.

Priprema terc-butil 3-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenilamino)azetidin-1-karboksilata

[0569]

[0570] Mikrotalasna bočica je napunjena sa (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirazolo[4,3-f]izohinolinom (310 mg, 0,60 mmol), terc-butil 3-aminoazetidin-1-karboksilatom (154 mg, 0,89 mmol), Cs2CO3(388 mg, 1,19 mmol), i BrettPhos pred-katalizatorom treće generacije (54,0 mg, 0,06 mmol). Bočica je degazirana i napunjena sa azotom (x2). Bočica je degazirana ponovo i ponovo napunjena sa 1,4-dioksanom (6 mL) i azotom. Bočica je degazirana ponovo i ponovo napunjena sa azotom. Smeša je zagrejana pod mikrotalasnim uslovima (300W, 110°C) tokom 3,5 sati. Reakcija je razblažena sa DCM i oprana sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 20 do 60% EtOAc u heksanima, kako bi se dobio tercbutil 3-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-2-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenilamino)azetidin-1-karboksilat (322 mg, 88%) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300MHz, CHLOROFORM-d, 27°C) 1,08 (3H, br d), 1,39 - 1,43 (9H, m), 1,58 - 1,81 (3H, m), 2,06 (1H, br dd), 2,13 - 2,25 (2H, m), 2,58 - 2,71 (1H, m), 2,82 - 3,11 (2H, m), 3,34 - 3,50 (1H, m), 3,66 - 3,81 (3H, m), 3,86 (3H, s), 3,90 -4,01 (1H, m), 4,08 - 4,20 (3H, m), 4,19 - 4,29 (2H, m), 5,22 (1H, s), 5,76 (1H, t), 5,64 (1H, t), 5,88 (1H, br d), 6,09 (1H, d), 6,59 (1H, br t), 6,67 (1H, d), 7,37 (1H, br d), 8,08 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 612.

Primer 22

Priprema (6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-6-(4-((1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)oksi)-2-metoksifenil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0571]

[0572] HCl u dioksanu (4 M; 1,02 mL, 4,08 mmol) je dodat kapanjem mešanom rastvoru terc-butil 3-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenoksi)azetidin-1-karboksilata (250 mg, 0,41 mmol) u MeOH (4 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati. Reakcija je zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je rastvoren sa MeOH. Višak tetraalkilamonijum karbonat makroporozne smole (Aldrich; 18-50 mreža; 2,5-3,5 mmol/g N opterećenje) je dodat, i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta pre nego što je osušena preko natrijum sulfata, filtrirana, i koncentrovana pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio sirov (6S,8R)-6-(4-(azetidin-3-iloksi)-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (179 mg), koji je direktno korišćen u narednom koraku bez daljeg prečišćavanja. M/z: ES+ [M+H]+ 429.

[0573] Smeša (6S,8R)-6-(4-(azetidin-3-iloksi)-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (178 mg, 0,42 mmol), 1-fluoro-3-jodopropana (94 mg, 0,50 mmol), i DIPEA (0,218 mL, 1,25 mmol) u DMF (4 mL) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati. Reakcija je zatim razređena sa DCM i oprana sa zasićenim vodenim amonijum hloridom. Slojevi su razdvojeni, i vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM. Kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen preparativnom SFC (2-etilpiridin kolona; 19 mm x 150 mm; 5µm; stopa protoka: 75 mL/minut; temperatura kolone: 40°C; izlazni pritisak: 100 bar), eluiranjem sa 15% (metanol sadrži 0,2% amonijum hidroksid) u ugljen dioksid kako bi se dobio (6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-6-(4-((1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)oksi)-2-metoksifenil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (70 mg, 35% preko dva steps) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (300MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,02 (3H, d), 1,61 - 1,84 (2H, m), 2,55 - 2,84 (3H, m), 2,90 - 3,13 (2H, m), 3,18 - 3,43 (4H, m), 3,87 (3H, s), 3,89 - 4,00 (2H, m), 4,45 (2H, dt), 4,81 (1H, quin), 5,28 (1H, s), 5,74 - 6,16 (1H, m), 6,19 (1H, dd), 6,49 - 6,54 (2H, m), 6,66 (1H, d), 7,21 (1H, d), 8,04 (1H, s), 12,98 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 489.

[0574] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala terc-butil 3-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenoksi)azetidin-1-karboksilat su opisane u nastavku.

Priprema terc-butil 3-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenoksi)azetidin-1-karboksilata

[0575]

[0576] Mikrotalasna bočica je napunjena sa (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolinom (259 mg, 0,50 mmol), terc-butil 3-hidroksiazetidin-1-karboksilatom (259 mg, 1,49 mmol), cezijum karbonatom (324 mg, 1,00 mmol), i RockPhos pred-katalizatorom treće generacije (42 mg, 0,050 mmol). Bočica je evakuisana i ponovo napunjena sa azotom (x2). Zatim je bočica evakuisana i ponovo napunjena sa toluenom (3 mL). Bočica je evakuisana i ponovo napunjena sa azotom. Smeša je zagrejana na 110°C tokom 4 sata. Reakcija je razblažena sa DCM i oprana sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom.

Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 60% EtOAc u heksanima kako bi se dobio terc-butil 3-(4-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3-metoksifenoksi)azetidin-1-karboksilat (220 mg, 72%) kao bela penasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (400MHz, DMSO-d6, 100°C) 1,03 - 1,09 (3H, m), 1,40 (9H, s), 1,56 - 1,64 (2H, m), 1,67 - 1,84 (1H, m), 1,93 - 2,01 (1H, m), 2,02 - 2,12 (1H, m), 2,34 - 2,46 (1H, m), 2,59 - 2,74 (1H, m), 2,84 (1H, dt), 2,93 - 3,06 (1H, m), 3,13 - 3,23 (1H, m), 3,40 - 3,50 (1H, m), 3,65 -3,74 (1H, m), 3,76 - 3,84 (2H, m), 3,84 - 3,91 (4H, m), 4,21 - 4,28 (2H, m), 4,97 (1H, tt), 5,33 (1H, s), 5,67 - 6,00 (1H, m), 5,74 (1H, dd), 6,23 (1H, ddd), 6,54 (1H, d), 6,66 (1H, t), 6,73 (1H, d), 7,35 (1H, d), 8,04 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 613.

Primeri 23 i 24

Priprema pojedinačnih dijastereoizomera 3-((6S,8R)-6-(2,6-difluoro-4-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-ilamino)fenil)-8-metil-8,9-dihidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-7(6H)-il)-2-fluoro-2-metilpropan-1-ola

[0577]

[0578] Tetrabutilamonijum fluorid u THF (1 M; 0,114 mL, 0,11 mmol) je dodat kapanjem pomoću šprica mešanom rastvoru N-(4-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina (82 mg, 0,08 mmol) u THF (0,75 mL). Nakon 2,5 sata dodatni tetrabutilamonijum fluorid u THF (1 M; 0,08 mL, 0,08 mmol) je dodat i reakcija je mešana tokom dodatnih 18 sati. Reakcija je razblažena sa DCM i oprana sukcesivno sa zasićenim vodenim NaHCO3i zasićenim vodenim natrijum hloridom, osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0,5 do 10% MeOH u DCM. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom i rezultujući ostatak je dalje prečišćen preparativnom HPLC (Waters XBridge Prep C18 OBD kolona, 5µm silika, 19 mm prečnik, 150 mm dužina), koristeći gradijent eluiranja od 45 do 85% acetonitrila u (voda koja sadrži 0,2% NH4OH). Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio prvi izomer eluiranja 1 (2,7 mg, 7%) i drugi izomer eluiranja (2,1 mg, 5%) od 3-((6S,8R)-6-(2,6-difluoro-4-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-ilamino)fenil)-8-metil-8,9-dihidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-7(6H)-il)-2-fluoro-2-metilpropan-1-ol kao bledo žuti filmovi. Izomer 1:<1>H NMR (500 MHz, CD2Cl2, 27°C) 1,13 (3H, d), 1,17 (3H, d), 1,66 - 1,78 (3H, m), 2,54 (2H, t), 2,69 (1H, dd), 2,81 - 2,94 (3H, m), 3,00 (1H, dd), 3,31 (1H, dd), 3,51 - 3,59 (1H, m), 3,60 - 3,71 (4H, m), 3,95 - 4,03 (1H, m), 4,38 (1H, br s), 4,46 (2H, dt), 5,26 (1H, s), 6,01 (2H, br d), 6,84 (1H, d), 7,21 (1H, d), 8,03 (1H, s), 10,19 (1H, br s). M/z: ES+ [M+H]+ 520. Izomer 2:<1>H NMR (500 MHz, CD2Cl2, 27°C) 1,05 (3H, d), 1,09 (3H, d), 1,65 - 1,80 (2H, m), 2,54 (2H, t), 2,62 (1H, dd), 2,83 - 2,88 (2H, m), 2,91 - 3,00 (1H, m), 3,13 - 3,24 (1H, m), 3,33 - 3,46 (2H, m), 3,48 - 3,58 (1H, m), 3,66 (2H, q), 3,96 - 4,04 (2H, m), 4,40 (1H, dt), 4,41 -4,53 (2H, m), 4,64 (1H, br d), 5,03 (1H, s), 6,06 (2H, br d), 6,76 (1H, d), 7,19 (1H, d), 8,03 (1H, s), 10,19 (1H, br s). M/z: ES+ [M+H]+ 520.

[0579] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala N-(4-((6S,8R)-7-(3-((tercbutildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin su opisane u nastavku.

Priprema dimetil 2-fluoro-2-metil-propandioata

[0580]

[0581] Natrijum hidrid (60% disperzija u mineralnom ulju; 2,93 g, 73,3 mmol) je dodat rastvoru dimetil 2-fluoromalonata (10,0 g, 66,6 mmol) u THF (218 mL) sa energičnim mešanjem. Nakon 30 minuta jodometan (4,56 mL, 73,3 mmol) je dodat. Reakcija je mešana tokom dodatna 3 sata. Reakcija je ugašena sa vodom i zatim ekstrahovana sa EtOAc (4 x 100 mL). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio dimetil 2-fluoro-2-metil-propandioat (8,4 g, 77%) kao narandžasto ulje.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,72 (3H, d), 3,77 (6H, s).

Priprema 2-fluoro-2-metilpropan-1,3-diola

[0582]

[0583] Litijum aluminijum hidrid (4,50 g, 112,6 mmol) je dodat iz delova mešanom rastvoru dimetil 2-fluoro-2-metil-propandioata (8,40 g, 51,2 mmol) u THF (205 mL) na 0°C. Reakcija je zagrejana do sobne temperature i mešana pod tim uslovima tokom 1 sata. Reakciona smeša je zatim ohlađena do 0°C i pažljivo ugašena sekvencijalnim dodavanjem kapanjem vode (5,85 mL), 15% težine vodenog NaOH (5,85 mL), i vode (18 mL). Rezultujuća želatinasta suspenzija je mešana brzo tokom 1 sata. Talog je uklonjen filtriranjem, i filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je rastvoren u smeši CHCl3/IPA (3:1), osušen preko Na2SO4, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 2-fluoro-2-metilpropan-1,3-diol (3,28 g, 46%) kao narandžasto ulje. Ovo ulje je korišćeno u narednom koraku bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,18 (3H, d), 3,42 (4H, dd), 4,80 (2H, t).

Priprema 3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropan-1-ola

[0584]

[0585] Natrijum hidrid (60% disperzija u mineralnom ulju; 1,1 g, 27,5 mmol) je dodat mešanom rastvoru 2-fluoro-2-metilpropan-1,3-diola (2,7 g, 25 mmol) u THF (93 mL) na 0°C i reakcija je mešana tokom 1 sata. Terc-butilhlorodifenilsilan (6,5 mL, 25 mmol) je dodat, i reakcija je mešana tokom dodatnog 1 sata. Reakcija je ugašena sa vodom, slojevi su razdvojeni, i vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (2 x 100 mL). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani, i adsorbovani na silika gelu pod redukovanim pritiskom. Prečišćavanje fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heksanima, dalo je 3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropan-1-ol (4,4 g, 51%) kao bistru gumu.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,00 (9H, s), 1,27 (3H, d), 3,48 (1H, dd), 3,53 (1H, dd), 3,66 (1H, d), 3,73 (1H, br s), 4,93 (1H, t), 7,40 - 7,48 (6H, m), 7,59 - 7,66 (4H, m). M/z: ES+ [M+H]+ 347.

Priprema 3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil trifluorometansulfonata [0586]

[0587] Trifluorometansulfonski anhidrid (1,3 mL, 7,6 mmol) je dodat kapanjem mešanom rastvoru 3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropan-1-ola (2,2 g, 6,35 mmol) i 2,6-dimetilpiridina (1,28 mL, 7,6 mmol) u DCM (22 mL) na -10°C (so/ledena kada). Reakcija je održavana pod tim uslovima tokom 1,5 sata. Reakcija je zatim razređena sa DCM (100 mL) i oprana sukcesivno sa vodenim HCl (1N), zasićenim vodenim NaHCO3, i zasićenim vodenim NaCl. Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran, i koncentrovana pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil trifluorometansulfonat (3,2 g) kao crveno ulje. Ovo ulje je korišćeno u narednom koraku bez daljeg prečišćavanja.

Priprema dijastereoizomerne smeše 3-((2R)-2-((3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)amino)propil)-2-metilanilina

[0588]

[0589] 3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil trifluorometansulfonat (3,04 g, 6,35 mmol) je dodat rastvoru (R)-3-(2-aminopropil)-2-metilanilina (1,04 g, 6,35 mmol) i diizopropiletilamina (1,65 mL, 9,53 mmol) u 1,4-dioksanu (24 mL). Reakcija je zagrejana na 85°C tokom 18 sati. Nakon hlađenja, reakcija je razblažena sa DCM (250 mL) i oprana sa vodom. Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (2 x 100 mL), i kombinovana organska materija je osušena preko Na2SO4, filtrirana, i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 25% MeOH u DCM. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 3-((2R)-2-((3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)amino)propil)-2-metilanilin (2,10 g, 95%) kao guma.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 0,90 (3H, dd), 1,01 (9H, d), 1,29 (3H, dd), 1,41 (1H, br s), 1,97 (3H, d), 2,29 - 2,43 (1H, m), 2,65 - 2,91 (4H, m), 3,62 - 3,82 (2H, m), 4,67 (2H, s), 6,28 - 6,36 (1H, m), 6,47 (1H, dd), 6,69 - 6,81 (1H, m), 7,40 - 7,52 (6H, m), 7,61 - 7,69 (4H, m). M/z: ES+ [M+H]+ 494.

Priprema dijastereoizomerne smeše (1S,3R)-1-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-2-(3-((tercbutildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina

[0590]

[0591] 4-bromo-2,6-difluorobenzaldehid (628 mg, 2,84 mmol) je dodat mešanom rastvoru 3-((2R)-2-((3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)amino)propil)-2-metilanilina (700 mg, 1,42 mmol) i vode (0,128 mL, 7,10 mmol) u smeši sirćetne kiseline (10 mL) i toluena (4 mL). Reakcija je zagrejana na 90°C tokom 18 sati pre nego što je zagrejana na uslove refluksa tokom dodatna 4 sata. Reakciji je omogućeno da se ohladi i koncentrovana je pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je rastvoren u DCM i opran sa zasićenim vodenim NaHCO3. Vodena faza je ekstrahovana sa DCM (20 mL) i kombinovani organski slojevi su koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je rastvoren u smeši MeOH/DCM (5:1, 18 mL) i zatim su dodati hidroksilamin hlorovodonik (148 mg, 2,13 mmol) i natrijum acetat (233 mg, 2,84 mmol). Smeša je mešana na 35°C tokom 5 minuta i zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je rastvoren u EtOAc i opran sekvencijalno sa zasićenim vodenim NaHCO3i zasićenim vodenim NaCl, pre nego što je osušen preko MgSO4, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 35% EtOAc u heksanima kako bi se dobio (1S,3R)-1-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-2-(3-((tercbutildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (339 mg, 34%) kao bledo žuti film.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,05 (9H, d), 1,19 (3H, dd), 2,08 (3H, s), 2,35 (1H, dd), 2,47 - 2,67 (2H, m), 2,84 - 3,01 (1H, m), 3,02 - 3,14 (1H, m), 3,22 (1H, dd), 3,40 - 3,63 (3H, m), 3,66 - 3,79 (1H, m), 3,92 (1H, dd), 5,15 (1H, d), 6,38 - 6,47 (2H, m), 6,83 (1H, d), 6,93 - 7,00 (1H, m), 7,38 - 7,49 (6H, m), 7,59 - 7,71 (4H, m), 8,69 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 695.

Priprema dijastereoizomerne smeše (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-(3-((tercbutildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0592]

[0593] Natrijum nitrit (33,6 mg, 0,49 mmol) kao rastvor u vodi (0,400 mL) je dodat kapanjem ohlađenom rastvoru (1S,3R)-1-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-2-(3-((tercbutildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina (339 mg, 0,49 mmol) u propinonskoj kiselini (4 mL) na -20°C, i reakcija je mešana tokom 30 minuta pod tim uslovima. Ledeno hladni EtOAc (20 mL) je dodat praćen dodavanjem iz delova zasićenog vodenog NaHCO3(5 mL). Dvofazna smeša je mešana energično i neutralizovana je laganim dodavanjem čvrstog Na2CO3. Faze su razdvojene, i organski slojevi su oprani sa zasićenim vodenim NaHCO3(2 x 30 mL) i zasićenim vodenim NaCl (30 mL) pre nego što su osušeni preko MgSO4, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 40% EtOAc u heksanima, kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (206 mg, 60%) kao bledo žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 0,98 (4,5H, s), 1,00 (1,5H, d), 1,02 (1,5H, d), 1,04 (4,5H, s), 1,15 (1,5H, d), 1,23 (1,5H, d), 2,30 - 2,47 (0,5H, m), 2,60 (0,5H, dd), 2,81 (0,5H, dd), 2,89 (0,5H, dd), 3,02 (0,5H, dd), 3,06 - 3,21 (1H, m), 3,22 - 3,33 (0,5H, m), 3,37 - 3,51 (1H, m), 3,51 - 3,60 (0,5H, m), 3,61 - 3,72 (0,5H, m), 3,73 - 3,83 (0,5H, m), 3,89 (0,5H, dd), 5,22 (0,5H, s), 5,27 (0,5H, s), 6,70 (1H, dd), 6,81 (1H, br d), 6,91 - 7,00 (1H, m), 7,14 (1H, t), 7,33 - 7,47 (6H, m), 7,55 - 7,67 (4H, m), 8,07 (1H, br d). Indazol NH nije primećen. M/z: ES+ [M+H]+ 706.

Priprema dijastereoizomerne smeše (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-(3-((tercbutildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0594]

[0595] 3,4-Dihidro-2H-piran (0,129 mL, 1,41 mmol) i monohidrata para-toluensulfonske kiseline (2,7 mg, 0,01 mmol) su dodati mešanom rastvoru (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (200 mg, 0,28 mmol) u DCM (2 mL). Reakcija je zagrejana na 45°C tokom 21 sata. Reakciji je omogućeno da se ohladi i zatim je razređena sa DCM, oprana sa zasićenim vodenim NaHCO3, osušena preko MgSO4, filtrirana, i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 5 do 30% EtOAc u heksanima, kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (176 mg, 79%) kao bezbojni film. M/z: ES+ [M+H]+ 790.

Priprema dijastereoizomerne smeše terc-butil 3-((4-((6S,8R)-7-(3-((tercbutildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)amino)azetidin-1-karboksilata

[0596]

[0597] Bočica opremljena šipkom za mešanje je napunjena sa (6S,8R)-6-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolinom (126 mg, 0,16 mmol), tercbutil 3-aminoazetidin-1-karboksilatom (41 mg, 0,24 mmol), Pd2dba3(9,3 mg, 0,01 mmol), 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilksantenom (Xantphos) (16 mg, 0,02 mmol), i cezijum karbonatom (156 mg, 0,48 mmol). Bočica je zapečaćena, evakuisana i ponovo napunjena sa azotom (3x) pre dodavanja 1,4-dioksana (1 mL) pomoću šprica. Smeša je mešana na temperaturi okruženja tokom 2 minuta i zatim zagrejana na 90°C tokom 16 sati. Smeši je omogućeno da se ohladi i zatim je razređena sa EtOAc, filtrirana kroz dijatomejsku zemlju, i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 40% EtOAc u heksanima, kako bi se dobio tercbutil 3-((4-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)amino)azetidin-1-karboksilat (95 mg, 68%) kao bledo žuta čvrsta supstanca. M/z: ES+ [M+H]+ 883.

Priprema dijastereoizomerne smeše N-(4-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)azetidin-3-amina

[0598]

[0599] Mravlja kiselina (0,5 mL, 13,04 mmol) je dodata terc-butil 3-((4-((6S,8R)-7-(3-((tercbutildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)amino)azetidin-1-karboksilatu (53 mg, 0,06 mmol) i rezultujući rastvor je mešan na temperaturi okruženja tokom 18 sati. Reakcija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je rastvoren u THF (0,5 mL) i tretiran sa vodenim NaOH (5N; 0,081 mL, 2,40 mmol). Smeša je mešana na 30°C tokom 20 sata i zatim održavana na 40°C tokom 4 sata. Dodatni vodeni NaOH (5N; 0,081 mL, 2,40 mmol) je dodat, i reakcija je mešana na 40°C tokom 46 sati pre nego što je zagrejana na 55°C tokom 5 sati. Reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi do temperature okruženja. Za to vreme, u zasebnoj bočici, HCl u dioksanu (4N; 0,38 mL, 1,5 mmol) je dodat mešanom rastvoru terc-butil 3-((4-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)amino)azetidin-1-karboksilata (89 mg, 0,10 mmol) u MeOH (0,5 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 5 sati i zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je kombinovan sa prethodnom reakcijom (kao smeša u vodenom NaOH (5N) i THF). Nova smeša je razblažena sa DCM (5 mL), faze su razdvojene, i vodena faza je ekstrahovana sa DCM (2 x 5 mL). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio N-(4-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5difluorofenil)azetidin-3-amin (177 mg) kao bledo žuta čvrsta supstanca, koji je korišćena u narednom koraku bez daljeg prečišćavanja. M/z: ES+ [M+H]+ 698.

Priprema dijastereoizomerne smeše N-(4-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina

[0600]

[0601] 1-Fluoro-3-jodopropan (0,026 mL, 0,16 mmol) je dodat mešanom rastvoru N-(4-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)azetidin-3-amina (115 mg, 0,16 mmol) i diizopropiletilamina (0,058 mL, 0,33 mmol) u NMP (0,75 mL). Reakcija je mešana tokom 16 sati na sobnoj temperaturi pre nego što su razređena sa EtOAc i oprana sa zasićenim vodenim NaHCO3. Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc. Kombinovani organski slojevi su oprani sa zasićenim vodenim NaCl (2 x 5 mL), osušeni preko MgSO4, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 1 do 20% MeOH u DCM kako bi se dobio N-(4-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2-fluoro-2-metilpropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-3,5-difluorofenil)-1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amin (82 mg, 66%) kao bledo žut film. M/z: ES+ [M+H]+ 758.

Primer 25

Priprema 6-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)piridin-3-amina

[0602]

[0603] HCl u dioksanu (4N; 0,86 mL, 3,4 mmol) je dodat kapanjem rastvoru terc-butil 3-((6-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-il)amino)azetidin-1-karboksilata (0,20 g, 0,34 mmol) u MeOH (2,5 mL), i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Reakcija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio N-(azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin hlorovodonik (200 mg) kao čvrsta supstanca. M/z: (ES+), [M+H]+ 399.

[0604] DMF (0,5 mL) i 1-fluoro-3-jodopropan (0,036 mL, 0,34 mmol) su dodati sekvencijalno na temperaturi okruženja. Zatim je višak diizopropiletilamina (1,2 mL, 6,80 mmol) dodat kapanjem. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati i zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš C18 hromatografijom reverzne faze, gradijent eluiranja 20 do 75% acetonitrila u (voda koja sadrži 0,2% NH4OH), kako bi se dobio 6-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)piridin-3-amin (45 mg, 29%) kao čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,04 (3H, d), 1,60 - 1,75 (2H, m), 2,51 - 2,70 (3H, m), 2,79 - 2,96 (3H, m), 3,03 (1H, dd), 3,13 (1H, br dd), 3,41 - 3,53 (1H, m), 3,74 (2H, br s), 3,98 (1H, br d), 4,45 (2H, dt), 4,86 (1H, s), 5,83 (1H, tt), 6,26 (1H, d), 6,74 (1H, d), 6,81 (1H, dd), 6,96 (1H, d), 7,18 (1H, d), 7,76 (1H, d), 8,04 (1H, s), 12,95 (1H, s). M/z: (ES+), [M+H]+ 459.

[0605] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala terc-butil 3-((6-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-il)amino)azetidin-1-karboksilata su opisane u nastavku.

Priprema (1S,3R)-1-(5-bromopiridin-2-il)-2-(2,2-difluoroetil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina

[0606]

[0607] 5-Bromopikolinaldehid (2,74 g, 14,7 mmol) je dodat rastvoru (R)-3-(2-((2,2-difluoroetil)amino)propil)-2-metilanilina (1,6 g, 7,0 mmol) u sirćetnoj kiselini (34,4 mL) i vodi (0,631 mL, 35,0 mmol). Reakcija je zagrejana na 80°C tokom 3 sata i zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je rastvoren u MeOH (40 mL) i dodati su natrijum acetat (1,15 g, 14,0 mmol) i hidroksilamin hlorovodonik (0,730 g, 10,5 mmol). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata i zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je rastvoren u vodi, neutralizovana sa zasićenim vodenim NaHCO3, i zatim ekstrahovan sa EtOAc. Kombinovani organski slojevi su koncentrovani pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 90% EtOAc u heksanima. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je dalje prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 90% EtOAc u heksanima, kako bi se dobio (1S,3R)-1-(5-bromopiridin-2-il)-2-(2,2-difluoroetil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (1,40 g, 49%) kao guma.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 0,99 (3H, d), 1,93 (3H, s), 2,38 - 2,47 (1H, m), 2,51 - 2,62 (1H, m), 2,72 (1H, dd), 2,92 - 3,14 (1H, m), 3,23 -3,29 (1H, m), 4,65 (2H, s), 4,79 (1H, s), 5,98 (1H, tt), 6,39 (2H, s), 7,22 (1H, d), 7,91 (1H, dd), 8,55 (1H, d). M/z: ES+ [M+H]+ 396.

Priprema (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0608]

[0609] Sirćetna kiselina (541 mg, 9,01 mmol) je dodata mešanom rastvoru (1S,3R)-1-(5-bromopiridin-2-il)-2-(2,2-difluoroetil)-3,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina (714 mg, 1,80 mmol) u CHCl3(8 mL). Reakcija je ohlađena do 0°C, i rastvor izopentil nitrita (422 mg, 3,60 mmol) u CHCl3(1 mL) je dodat kapanjem. Reakcija je mešana na 0°C tokom 2 sata i zatim ugašena sporim dodavanjem rastvora NaHCO3(1,5 g, 18 mmol) u vodi (20 mL). Faze su razdvojene, i organski sloj je koncentrovane pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 5 do 35% EtOAc u heksanima, kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (438 mg, 60%) kao svetlo braon čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3, 27°C) 1,13 (3H, d), 2,68 - 2,85 (1H, m), 2,91 (1H, dd), 2,98 - 3,17 (1H, m), 3,34 (1H, dd), 3,47 - 3,63 (1H, m), 5,05 (1H, s), 5,63 (1H, tt), 6,87 (1H, d), 7,19 (1H, d), 7,28 (1H, d), 7,71 (1H, dd), 8,04 (1H, d), 8,57 (1H, dd). Indazol NH nije primećen. M/z: ES+ [M+H]+ 405.

Priprema (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0610]

[0611] 3,4-Dihidro-2H-piran (0,294 mL, 3,23 mmol) je dodat rastvoru (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (438 mg, 1,08 mmol) i monohidrata para-toluensulfonske kiseline (21 mg, 0,11 mmol) u DCM (4 mL). Reakcija je zagrejana na 100°C tokom 6 sati pod mikrotalasnim uslovima (300W). Reakciji je zatim omogućeno da se ohladi i zatim je oprana sa zasićenim vodenim NaHCO3, osušena preko Na2SO4, filtrirana, i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 10 do 30% EtOAc u heksanima, kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (441 mg, 83%) kao svetlo braon gumasta čvrsta supstanca. M/z: ES+ [M+H]+ 491.

Priprema terc-butil 3-((6-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-il)amino)azetidin-1-karboksilata

[0612]

[0613] Bočica opremljena šipkom za mešanje je napunjena sa (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolinom (0,22 g, 0,44 mmol), terc-butil 3-aminoazetidin-1-karboksilatom (0,151 g, 0,88 mmol), cezijum karbonatom (0,29 g, 0,88 mmol), i BrettPhos predkatalizatorom treće generacije (0,040 g, 0,040 mmol). Bočica je zapečaćena, evakuisana, i napunjena sa azotom.1,4-Dioksan (4 mL) je dodat, i bočica je ponovo evakuisana i ponovo napunjena sa azotom. Reakcija je mešana na 110°C tokom 13 sati i zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 10 do 30% EtOAc u heksanima, kako bi se dobio terc-butil 3-((6-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-il)amino)azetidin-1-karboksilat (0,20 g, 78%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, CD3OD, 27°C) 1,10 (3H, dd), 1,43 (9H, s), 1,56 - 1,72 (2H, m), 1,72 - 1,87 (1H, m), 1,92 - 1,99 (1H, m), 2,03 - 2,17 (1H, m), 2,38 - 2,53 (1H, m), 2,62 -2,82 (1H, m), 2,88 - 3,14 (2H, m), 3,33 - 3,44 (1H, m), 3,49 - 3,60 (1H, m), 3,67 - 3,83 (3H, m), 3,92 - 4,02 (1H, m), 4,17 - 4,33 (3H, m), 4,91 (1H, s), 5,34 - 5,57 (1H, m), 5,69 - 5,77 (1H, m), 6,79 (1H, d), 6,89 (1H, dd), 7,05 (1H, dd), 7,34 (1H, d), 7,78 - 7,81 (1H, m), 8,07 (1H, s), anilin NH, nije primećen. M/z: ES+ [M+H]+ 583.

Primer 26

Priprema (6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-6-(5-((1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)oksi)piridin-2-il)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0614]

[0615] HCl u dioksanu (4N; 0,97 mL, 3,9 mmol) je dodat kapanjem rastvoru terc-butil 3-((6-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-il)oksi)azetidin-1-karboksilata (0,227 g, 0,39 mmol) u MeOH (3 mL), i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati. Reakcija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-(azetidin-3-iloksi)piridin-2-il)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin hlorovodonik (0,235 g; broj ekvivalenata od HCl nije određen) kao čvrsta supstanca, koja je korišćena bez daljeg prečišćavanja. M/z: (ES+), [M+H]+ 400.

[0616] 1-Fluoro-3-jodopropan (0,041 mL, 0,34 mmol) je dodat mešanom rastvoru (6S,8R)-6-(5-(azetidin-3-iloksi)piridin-2-il)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin hlorovodonika (235 mg) u DMF (0,6 mL) na temperaturi okruženja. Višak diizopropiletilamina (1,36 mL, 7,80 mmol) je dodat kapanjem. Reakcija je mešana tokom 18 sati na sobnoj temperaturi i zatim je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš C18 hromatografijom reverzne faze, gradijent eluiranja 20 do 75% acetonitrila u (voda koja sadrži 0,2% NH4OH). Fragmenti proizvoda su kombinovani i liofilizovani kako bi se dobio (6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-6-(5-((1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)oksi)piridin-2-il)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (53 mg, 30%) kao čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,05 (3H, d), 1,60 - 1,77 (2H, m), 2,54 - 2,70 (3H, m), 2,85 (1H, dd), 2,97 - 3,22 (4H, m), 3,39 -3,50 (1H, m), 3,87 (2H, br s), 4,45 (2H, dt), 4,80 - 4,92 (1H, m), 5,00 (1H, s), 5,93 (1H, tt), 6,78 (1H, d), 7,19 - 7,26 (3H, m), 8,05 (1H, s), 8,06 (1H, d), 12,97 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 460.

[0617] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala terc-butil 3-((6-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-il)oksi)azetidin-1-karboksilata su opisane u nastavku.

Priprema terc-butil 3-((6-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-il)oksi)azetidin-1-karboksilata

[0618]

[0619] Terc-butil 3-hidroksiazetidin-1-karboksilat (227 mg, 1,31 mmol), (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (215 mg, 0,44 mmol), RockPhos pred-katalizator treće generacije (37,1 mg, 0,04 mmol), i cezijum karbonat (285 mg, 0,88 mmol) su suspendovani u toluenu (4 mL) u zapečaćenoj mikrotalasnoj bočici. Reakcija je zagrejana na 110°C tokom 1 sata pod mikrotalasnim uslovima (300W). Reakcija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, i rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 20 do 60% EtOAc u heksanima, kako bi se dobio terc-butil 3-((6-((6S,8R)-7-(2,2-difluoroetil)-8-metil-3-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-il)oksi)azetidin-1-karboksilat (227 mg, 89%) kao čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, CD3OD, 27°C) 1,11 (3H, dd), 1,41 - 1,43 (9H, m), 1,61 - 1,66 (1H, m), 1,66 - 1,86 (2H, m), 2,04 - 2,17 (1H, m), 2,36 - 2,54 (1H, m), 2,59 - 2,79 (1H, m), 2,89 - 3,02 (1H, m), 3,03 - 3,17 (1H, m), 3,31 - 3,43 (1H, m), 3,48 - 3,60 (1H, m), 3,70 (2H, dd), 3,88 - 3,95 (2H, m), 4,09 -4,13 (1H, m), 4,27 - 4,39 (2H, m), 4,99 - 5,08 (2H, m), 5,64 (1H, tt), 5,73 (1H, dt), 6,81 (1H, dd), 7,20 (1H, dd), 7,27 (1H, dd), 7,36 (1H, d), 8,04 - 8,10 (2H, m). M/z: ES+ [M+H]+ 584.

Primer 27

1-(3-Fluoropropil)-N-(4-((6R,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)azetidin-3-amin

[0620]

[0621] Natrijum terc-butoksid (2,118 g, 22,06 mmol) i BrettPhos G3 (0,166 g, 0,18 mmol) su dodati degaziranom rastvoru 1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina (0,632 g, 4,78 mmol) i (6R,8R)-6-(4-bromofenil)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (1,56 g, 3,68 mmol) u 1,4-dioksanu (18,4 ml) i reakcija je zagrejana do 90°C i mešana preko noći. Nakon hlađenja, reakcija je razblažena sa EtOAc (20 mL) i vodom (20 mL), i slojevi su razdvojeni. Vodeni deo je ekstrahovan sa EtOAc (20 mL), zatim je kombinovana organska materija osušena i isparena. Prečišćavanje je pomoću HPLC (Waters CSH C18 OBD kolona, 5µ silika, 30 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 0,1% NH3i MeCN kao eluente) kako bi se dobila guma. Ovo je uzeto u metanolu (5mL), zatim je dodata voda (95 mL) i smeša je suspendovana preko noći na sobnoj temperaturi. Rezultujuća čvrsta supstanca je prikupljena filtriranjem, oprana sa 5% metanolom u vodi i osušena u vakuumskoj peći na 50°C preko noći kako bi se dobio 1-(3-fluoropropil)-N-(4-((6R,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)azetidin-3-amin (0,935 g, 54%) kao bezbojna čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,13 (3H, d), 1,68 - 1,83 (2H, m), 2,59 (2H, t), 2,77 (1H, dd), 2,86 (2H, t), 2,89 - 2,99 (1H, m), 3,04 (1H, dd), 3,15 - 3,26 (1H, m), 3,37 - 3,48 (1H, m), 3,71 - 3,76 (2H, m), 3,93 (1H, d), 4,10 (1H, q), 4,43 (1H, t), 4,53 (1H, t), 4,99 (1H, s), 6,41 - 6,46 (2H, m), 6,97 (1H, d), 7,00 (2H, d), 7,26 (1H, s), 8,06 (1H, d), 10,10 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 476.

[0622] (6R,8R)-6-(4-bromofenil)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin korišćen kao početni materijal je sintetisan kako sledi:

(6R,8R)-6-(4-bromofenil)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin

[0623]

[0624] Trifluorosirćetna kiselina (1,85 mL) je dodata rastvoru (R)-1-(1H-indazol-4-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amina (2,0 g, 7,77 mmol) i 4-bromobenzaldehida (7,19 g, 38,9 mmol) u toluenu (37 mL) i rezultujuća smeša je mešana na 90°C tokom 30 sata. Reakciji je omogućeno da se ohladi i podeljena je između DCM (100 mL) i zasićenog vodenog natrijum bikarbonata (50 mL). Slojevi su razdvojeni i organski sloj je koncentrovan u vakuumu.

Prečišćavanje je pomoću silika gel kolone hromatografije eluiranjem sa 0-50% etil acetata u heptanu kako bi se dobio (6R,8R)-6-(4-bromofenil)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (1,560 g, 47%) kao pena, i kao 6:1 odnos izomera.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,14 (3H, d), 2,80 (1H, dd), 2,94 (1H, dd), 3,05 (1H, dd), 3,25 (1H, dd), 3,33 (1H, ddd), 5,04 (1H, s), 6,95 (1H, d), 7,08 - 7,12 (2H, m), 7,28 - 7,33 (1H, m), 7,37 - 7,40 (2H, m), 8,08 (1H, d), 10,12 (1H, s); m/z: ES- [M-H]-422.

Primer 28

Priprema 1-(3-fluoropropil)-N-(3-metoksi-4-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)azetidin-3-amina

[0625]

[0626] BrettPhos pred-katalizator treće generacije (10 mg, 0,01 mmol) i natrijum tercbutoksid (0,127 g, 1,32 mmol) su dodati iz jednog dela degaziranom rastvoru 1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina (0,033 g, 0,25 mmol) i (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (0,10 g, 0,22 mmol) u 1,4-dioksanu (1,10 mL). Narandžasta smeša je zatim potopljena u uljanu kadu koja je prethodno zagrejana do 50°C. Nakon 5 minuta, reakcija je ohlađena do sobne temperature. U zasebnoj boci, natrijum terc-butoksid (1,81 g, 18,8 mmol) i BrettPhos pred-katalizator treće generacije (0,17 g, 0,19 mmol) su dodati iz jednog dela degaziranom rastvoru (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (1,71 g, 3,76 mmol) i 1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina (0,597 g, 4,52 mmol) u 1,4-dioksanu (18,8 mL). Svetlo narandžasta smeša je potopljena u uljanu kadu koja je prethodno zagrejana do 50°C. Nakon 5 minuta, reakcija je ohlađena do sobne temperature. Kada su ohlađene, obe reakcije su kombinovane, razređene sa etil acetatom i oprane sekvencijalno sa vodom (x2) i zasićenim vodenim natrijum hloridom. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujuće narandžasto ulje je prečišćeno fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 10% metanolom u DCM, kako bi se dobio 1-(3-fluoropropil)-N-(3-metoksi-4-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)azetidin-3-amin (1,84 g, 92%) kao čvrsta supstanca i ∼84:16 trans:cis smeša na osnovu UV HPLC profila. Ovaj materijal je rastvoren koristeći preparativni SFC (kolona: Chiralpak AD, 21,2 x 250 mm, 5 µm; 75 mL/minut), eluiranjem sa 20% (metanol sadrži 0,2% NH4OH) u CO2, kako bi se dobio 1-(3-fluoropropil)-N-(3-metoksi-4-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)azetidin-3-amin (1,01 g) kao svetlo narandžasta čvrsta supstanca i drugi vrh eluiranja. Ovaj materijal je dalje prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 30% metanolom u etil acetatu, kako bi se dobio 1-(3-fluoropropil)-N-(3-metoksi-4-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)azetidin-3-amin (0,954 g) kao bela čvrsta supstanca. Ovo materijal je prečišćen poslednji put preparativnom HPLC (kolona: Xbridge C18, 30 x 100 mm, 5 µm, 40 mL/minut), eluiranjem sa 40 do 70% acetonotrilom u (voda koja sadrži 0,2% NH4OH). Fragmenti proizvoda su kombinovani, oprani sa etil acetatom (x3), i kombinovani organski slojevi su oprani sa zasićenim vodenim natrijum hloridom, osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 1-(3-fluoropropil)-N-(3-metoksi-4-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)fenil)azetidin-3-amin (551 mg, 27%) kao beličasta penasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,04 (3H, d), 1,63 (2H, dtt), 2,44 (2H, t), 2,70 (2H, dd), 2,81 (1H, dd), 2,84 - 2,94 (1H, m), 3,09 (1H, dd), 3,34 (1H, br s), 3,44 (1H, dqd), 3,61 (2H, dd), 3,77 (3H, s), 3,90 (1H, m), 4,43 (2H, dt), 5,28 (1H, s), 5,87 (1H, dd), 6,02 (1H, d), 6,16 (1H, d), 6,32 (1H, d), 6,65 (1H, d), 7,18 (1H, d), 8,02 (1H, s), 12,95 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 506.

[0627] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin su opisane u nastavku.

Priprema (R)-N-(1-(3-amino-2-metilfenil)propan-2-il)-2,2,2-trifluoroacetamida

[0628]

[0629] Etil 2,2,2-trifluoroacetat (3,75 ml, 31,5 mmol) je dodat tamnom ćilibar-crvenom rastvoru (R)-3-(2-aminopropil)-2-metilanilina (5,17 g, 31,5 mmol) i trietilamina (4,83 mL, 34,6 mmol) u MeOH (70,1 mL). Nakon 15 minuta, reakcija je koncentrovana do tamno ćilibarnog ulja. Ulje je rastvoreno u etil acetatu, oprano sa vodom, i vodeni sloj je ekstrahovan sa etil acetatom (x2). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujuće ulje je prečišćeno fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 40% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (R)-N-(1-(3-amino-2-metilfenil)propan-2-il)-2,2,2-trifluoroacetamid (6,47 g, 79%) kao žuto-narandžasto ulje koje je kristalizovalo do svetlo narandžaste čvrste supstance nakon mirovanja.<1>H NMR (300MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,11 (3H, d), 2,01 (3H, s), 2,63 (1H, dd), 2,78 (1H, dd), 3,93 - 4,05 (1H, m), 4,71 (2H, s), 6,36 (1H, dd), 6,49 (1H, dd), 6,78 (1H, t), 9,25 (1H, br d). M/z: ES+ [M+H]+ 261.

Priprema (R)-2-metil-3-(2-((2,2,2-trifluoroetil)amino)propil)anilina

[0630]

[0631] Boran tetrahidrofuran kompleks u THF (1 M; 149 mL, 149 mmol) je dodat pomoću šprica (6 x 25 mL) rastvoru (R)-N-(1-(3-amino-2-metilfenil)propan-2-il)-2,2,2-trifluoroacetamida (6,47 g, 24,9 mmol) u tetrahidrofuranu (81 mL) na 0°C. Ledena kada je uklonjena, i, nakon zagrevanja, evolucija gasa je primećena. Nakon što nije bilo vidljive dalje evolucije gasa (∼20 minuta), reakcija je zagrejana do 65°C. Nakon 4 sata, reakcija je ohlađena i održavana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati. Reakcija je zatim ohlađena do 0°C i ugašena dodavanjem kapanjem metanola (22 mL). Reakcija je zagrejana do sobne temperature, i, nakon što je evolucija gasa prestala, reakcija je zagrejana do 65°C. Nakon 14 sata, reakcija je zatim ohlađena do sobne temperature i mešana pod tim uslovima tokom 3,5 dana pre nego što je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Rezultujuće ulje je prečišćeno fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 70% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (R)-2-metil-3-(2-((2,2,2-trifluoroetil)amino)propil)anilin (5,62 g, 92%) kao svetlo žuto ulje.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 0,90 (3H, d), 1,98 (3H, s), 2,09 - 2,20 (1H, m), 2,25 - 2,40 (1H, m), 2,72 - 2,84 (2H, m), 3,17 - 3,29 (2H, m), 4,69 (2H, s), 6,36 (1H, dd), 6,49 (1H, dd), 6,78 (1H, t). M/z: ES+ [M+H]+ 247

Priprema (1S,3R)-1-(4-Bromo-2-metoksifenil)-3,5-dimetil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina

[0632]

[0633] 4-Bromo-2-metoksibenzaldehid (1,83 g, 8,53 mmol) i (R)-2-metil-3-(2-((2,2,2-trifluoroetil)amino)propil)anilin (2,00 g, 8,12 mmol) su dodati rastvoru vode (0,7 mL, 41 mmol) i sirćetne kiseline (40 mL). Rezultujući svetlo žuti rastvor je potopljen u uljanu kadu koja je prethodno zagrejana do 65°C i je održavana pod tim uslovima tokom 18 sati.

Rezultujući tamno ćilibarni rastvor je zatim koncentrovan pod redukovanim pritiskom (vodena kada: 55°C). Rezultujući ostatak je razblažen sa etil acetatom i opran sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonat dok nije potvrđeno da vodeni sloj ima pH = 8 koristeći pH traku. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je rastvoren u metanolu (20 mL) i hidroksilamin hlorovodonik (0,152 g, 2,19 mmol) i višak kalijum karbonata su dodati. Nakon 5 minuta, smeša je razblažena sa etil acetatom, filtrirana, i filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-3,5-dimetil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin kao tamno ćilibarno ulje pri 83:17 trans:cis odnosu na osnovu NMR integracije. Ulje je ponovo koncentrovano od DCM i osušeno pod vakuumom do svetlo ćilibarne penaste čvrste supstance (2,55 g, 71%). Mala količina ovog materijala (150 mg) je rastvorena koristeći preparativni SFC (kolona: (S,S) Whelk-O1, 21,2 x 250 mm, 5 µm; 75 mL/minut), eluiranjem sa 15% (metanol sadrži 0,2% NH4OH) u CO2, kako bi se dobio sporo eluirajući (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-3,5-dimetil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (101 mg) i brzo eluirajući (1R,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-3,5-dimetil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amin (18 mg) kao bledo žuta penasta čvrsta supstanca.

(1S,3R):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,00 (3H, d), 1,95 (3H, s), 2,43 (1H, dd), 2,64 - 2,85 (2H, m), 3,19 - 3,43 (2H, m), 3,86 (3H, s), 4,67 (2H, s), 5,18 (1H, s), 6,29 (1H, d), 6,41 (1H, d), 6,60 (1H, d), 6,96 (1H, dd), 7,18 (1H, d). M/z: ES+ [M+H]+ 443.

(1R,3R):<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,19 (3H, d), 1,94 (3H, s), 2,53 - 2,60 (1H, m), 2,78 (1H, br dd), 2,98 - 3,12 (1H, br m), 3,16 - 3,36 (2H, m), 3,84 (3H, s), 4,61 (2H, s), 5,31 (1H, s), 6,20 (1H, d), 6,33 (1H, d), 7,03 - 7,13 (2H, m), 7,19 (1H, d). M/z: ES+ [M+H]+ 443.

Priprema (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0634]

[0635] Rastvor natrijum nitrita (0,413 g, 5,98 mmol) u vodi (3,83 mL) je dodat kapanjem tokom 5 minuta mešanom rastvoru (1S,3R)-1-(4-bromo-2-metoksifenil)-3,5-dimetil-2-(2,2,2-trifluoroetil)-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-6-amina (2,55 g, 5,75 mmol; 83:17 trans:cis) u propinonskoj kiselini (19,2 mL) održavanoj na -15°C koristeći kadu za hlađenje koja sadrži led, čvrsti natrijum hlorid, i zasićeni vodeni natrijum hlorid. Nakon 20 minuta reakcija je razblažena sa toluenom (100 mL) koji je prethodno ohlađen do -70°C. Rezultujuća svetlo žuto smeša je mešana energično, i, nakon 5 minuta, kada za hlađenje je uklonjena. Nakon dostizanja sobne temperature, crvena reakciona smeša je održavana pod tim uslovima tokom 1,5 sata i zatim oprana sa vodom (x2). Kombinovani vodeni slojevi su ekstrahovani sa etil acetatom. Kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani, i koncentrovani pod redukovanim pritiskom do otprilike 20% početne zapremine. Ova smeša je razblažena sa EtOAc (20 mL) i oprana sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom. Čvrsti kalijum karbonat je zatim dodat dok evolucija gasa nije prestala i smeša je testirana kao bazna koristeći pH traku. Slojevi su razdvojeni i organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujuća ulje je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 70% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (6S,8R)-6-(4-bromo-2-metoksifenil)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (1,96 g, 75%) kao svetlo narandžasta penasta čvrsta supstanca i ∼9:1 trans:cis smeša na osnovu NMR integracije.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,06 (3H, d), 2,80 - 2,98 (2H, m), 3,15 (1H, br dd), 3,33 - 3,53 (2H, m), 3,90 (3H, s), 5,40 (1H, s), 6,63 (1H, d), 6,67 (1H, d), 6,96 (1H, dd), 7,20 - 7,27 (2H, m), 8,08 (1H, s), 13,00 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 454.

Primer 29

Priprema 2-fluoro-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amina [0636]

[0637] Natrijum terc-butoksid (1,08 g, 11,3 mmol) i BrettPhos pred-katalizator treće generacije (0,16 g, 0,18 mmol) su dodati degaziranom rastvoru (6S,8R)-6-(5-bromo-6-fluoropiridin-2-il)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (2,00 g, 4,51 mmol) i 1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina (0,90 g, 5,41 mmol) u 1,4-dioksanu (22,6 mL) na sobnoj temperaturi. Crveno-narandžasta smeša je potopljena u prethodno zagrejanu uljanu kadu do 44°C. Nakon 22 minuta, narandžasta smeša je sklonjena od toplote i sipana u etil acetatu i zasićen vodeni natrijum hlorid i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa etil acetatom, i kombinovani organski slojevi su oprani sa zasićenim vodenim natrijum hloridom, osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 30% metanolom u etil acetatu, kako bi se dobio 2-fluoro-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin (1,58 g) kao svetlo žuto penasta čvrsta supstanca i otprilike 84:16 trans:cis smeše na osnovu NMR integracije. Ovo materijal je rastvoren preparativnom SFC (kolona: Lux Cellulose-4, 21,2 x 250 mm, 5 µm; 70 mL/minut), eluiranjem sa 35% (metanol sadrži 0,2% NH4OH) u CO2, kako bi se dobila svetlo narandžasta penasta čvrsta supstanca. Ova čvrsta supstanca je ponovo prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 30% metanolom u etil acetatu. Fragmenti proizvoda su koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je uzet u acetonitrilu, filtriran, i koncentrovan pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 2-fluoro-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]lizohinolin-6-il)piridin-3-amin (1,03 g, 46%) kao svetlo žuto penasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,10 (3H, d), 1,64 (2H, dtt), 2,48 (2H, t), 2,83 (1H, dd), 2,86 (2H, br d), 2,97 (1H, br dq), 3,02 (1H, dd), 3,45 (1H, dqd), 3,54 (1H, dq), 3,63 (2H, br s), 3,96 (1H, dquin), 4,44 (2H, dt), 4,91 (1H, s), 6,13 (1H, br d), 6,87 (1H, d), 6,92 - 7,01 (2H, m), 7,25 (1H, d), 8,06 (1H, s), 13,00 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 495.

[0638] Procedure korišćene za pripremu početnog materijala (6S,8R)-6-(5-bromo-6-fluoropiridin-2-il)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina su opisane u nastavku.

Priprema terc-butil (R)-(1-(1H-indazol-4-l)propan-2-il)karbamata

[0639]

[0640] n-Butillitijum u heksanu (2,5 M; 96 mL, 241 mmol) je dodat rastvoru 4-bromo-1H-indazola (24,8 g, 126 mmol) u THF (200 mL) na -78°C tokom 20 minuta, i smeša je mešana na -78°C tokom 7 sati. Terc-butil (R)-4-metil-1,2,3-oksatiazolidin-3-karboksilat 2,2-dioksid (26 g, 110 mmol) je dodat, i rezultujuća smeša je mešana na - 78°C tokom 15 minuta. Kada za hlađenje je uklonjena, i smeša je mešana pod tim uslovima tokom 18 sati. Vodena limunska kiselina (1N; 130 mL) je dodata i mešanje je nastavljeno tokom 30 minuta. Smeša je ekstrahovan sa heksanima, i organski sloj je opran sa zasićenim vodenim natrijum karbonat, osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, eluiranjem sa 0 do 60% EtOAc u heksanima, kako bi se dobio terc-butil (R)-(1-(1H-indazol-4-il)propan-2-il)karbamat (17,3 g, 57%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,02 (3H, br d), 1,34 (9H, s), 2,82 (1H, br dd), 3,09 (1H, br dd), 3,82 (1H, dt), 6,82 (1H, br d), 6,88 (1H, d), 7,24 (1H, dd), 7,35 (1H, br d), 8,18 (1H, s), 12,97 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 276.

Priprema (R)-1-(1H-indazol-4-il)propan-2-amin dihlorovodonika

[0641]

[0642] HCl dioksan (4 M, 100 mL, 400 mmol) je dodat suspenziji terc-butil (R)-(1-(1H-indazol-4-il)propan-2-il)karbamata (17,3 g, 62,7 mmol) u DCM (200 mL) na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta. Rezultujuća suspenzija je mešana preko noći i zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio (R)-1-(1H-indazol-4-il)propan-2-amin (15,9 g, 102%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,14 (3H, d), 2,97 (1H, dd), 3,40 (1H, dd), 3,45 - 3,62 (1H, m), 6,96 (1H, d), 7,29 (1H, dd), 7,45 (1H, d), 7,97 - 8,27 (3H, br s), 8,29 (1H, d). M/z: ES+ [M+H]+ 176.

Priprema (R)-1-(1H-indazol-4-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amina

[0643]

[0644] Kalijum karbonat (4,75 g, 34,3 mmol) je dodat mešanoj suspenziji soli (R)-1-(1H-indazol-4-il)propan-2-amin dihlorovodonika (2,13 g, 8,58 mmol) u acetonitrilu (25 mL) zatim je 2,2,2-trifluoroetil trifluorometansulfonat (2,191 g, 9,44 mmol) u DCM (12,6 mL) dodat kapanjem. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1,5 dana. Zatim je dodatni 2,2,2-trifluoroetil trifluorometansulfonat (398 mg) u DCM (0,3 mL) dodat. Reakcija je zagrejana do 60°C i nakon 3 sata, reakcija je ohlađena do sobne temperature i dalji deo 2,2,2-trifluoroetil trifluorometansulfonata (398 mg) je dodat kao rastvor u DCM (0,3 mL). Nakon 18 sati, reakcija je koncentrovana pod redukovanim pritiskom do redukovane zapremine i zatim je razređena sa DCM. Smeša je oprana sa vodom, i organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 60% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (R)-1-(1H-indazol-4-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amin (2,06 g, 93%) kao guma. M/z: ES+ [M+H]+ 257.

Priprema (6S,8R)-6-(5-bromo-6-fluoropiridin-2-il)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina

[0645]

[0646] Trifluorosirćetna kiselina (1,7 mL) je dodata rastvoru (R)-1-(1H-indazol-4-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amina (1,83 g, 7,11 mmol) i 5-bromo-6-fluoropikolinaldehida (1,45 g, 7,11 mmol) u toluenu (33,8 mL). Reakcija je zagrejana na 90°C tokom 24 sata i zatim koncentrovana do redukovane zapremine. Smeša je zatim razređena sa dihlorometanom i bazifikovana sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% etil acetata u heksanima, kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-bromo-6-fluoropiridin-2-il)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (2,01 g, 64%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (300MHz, DMSO-d6, 27°C) 1,11 (3H, d), 2,89 (1H, br dd), 2,94 - 3,09 (2H, m), 3,31 -3,42 (1H, m), 3,52 - 3,71 (1H, m), 5,07 (1H, s), 6,96 (1H, d), 7,24 - 7,36 (2H, m), 8,06 (1H, d), 8,23 (1H, dd), 13,02 (1H, s). M/z: ES+ [M+H]+ 443.

Primer 30

5-fluoro-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin

[0647]

[0648] 1-(3-Fluoropropil)azetid<i>n-3-amin (435 mg, 3,29 mmol), (6S,8R)-6-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (730 mg, 1,65 mmol) i natrijum terc-butoksid (950 mg, 9,88 mmol) su suspendovani u 1,4-dioksanu (18,3 mL). Smeša je degazirana i Brettphos 3G pred-katalizator (149 mg, 0,16 mmol) je dodat. Reakcija je zagrejana do 80°C tokom 1 sata. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i razređena sa etil acetatom (10 mL) i oprana sa vodom (10 mL). Organski sloj je osušen preko magnezijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod vakuumom. Sirov proizvod je prečišćen preparativnom LCMS (Waters XSelect CSH C18 kolona, 5µ silika, 50 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Uzorak je rastvoren u MeOH i razdvojena pomoću SFC koristeći naredne hromatografske uslove: kolona: Phenomonex Lux C1, 30 x 250 mm, 5 mikrona, mobilna faza: 30% MeOH 0,1% NH3/70% scCO2kako bi se dobio 5-fluoro-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin (396 mg, 49%) kao žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,15 (3H, d), 1,69 - 1,81 (2H, m), 2,60 (2H, t), 2,77 (1H, dd), 2,92 - 3,03 (3H, m), 3,14 - 3,31 (2H, m), 3,65 - 3,79 (3H, m), 4,04 (1H, q), 4,43 (2H, t), 4,53 (1H, t), 5,35 (1H, s), 6,54 (1H, dd), 6,76 (1H, d), 7,00 (1H, d), 7,66 (1H, d), 7,93 (1H, d), 11,06 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 495.

[0649] (6S,8R)-6-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin korišćen kao početni materijal je sintetisan kako sledi:

(6S,8R)-6-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin

[0650]

[0651] Trifluorosirćetna kiselina (2,13 mL) je dodata rastvoru (R)-1-(1H-indazol-4-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amina (1,15 g, 4,47 mmol) i 5-bromo-3-fluoropikolinaldehida (912 mg, 4,47 mmol) u toluenu (42,6 mL) i rezultujuća smeša je mešana na 100°C tokom 30 minuta. Reakcija je isparena i ostatak je podeljen između DCM (20 mL) i 2M NaOH (20 mL). Slojevi su razdvojeni i organska faza je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 40% EtOAc u heptanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (1,15 g, 58%) kao žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,16 (3H, d), 2,86 (1H, dd), 3,01 (1H, dq), 3,19 - 3,35 (2H, m), 3,68 - 3,78 (1H, m), 5,42 (1H, s), 6,80 (1H, d), 7,20 (1H, d), 7,59 (1H, dd), 8,05 (1H, d), 8,27 - 8,5 (1H, m). M/z: ES+ [M+H]+ 443.

Primer 31

2,2-Difluoro-3-((6S,8R)-6-(3-fluoro-5-((1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)amino)piridin-2-il)-8-metil-3,6,8,9-tetrahidro-7H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-7-il)propan-1-ol

[0652]

[0653] Tetrabutilamonijum fluorid (1,0 M u THF, 0,65 mL, 0,65 mmol) je dodat rastvoru 6-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-5-fluoro-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)piridin-3-amina (320 mg, 0,43 mmol) u THF (2,66 mL) na sobnoj temperaturi i mešan je tokom 64 sata. Reakciona smeša je isparena i zatim rastvorena u DMSO i sirov proizvod je prečišćen pomoću fleš reverzne faze (Puriflash, 220 g, C18, 30 µ kolona), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 1% NH3) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željena jedinjenje su ispareni do suvoće kako bi se dobio sirov proizvod (143 mg). Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 20% MeOH u EtOAc. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio 2,2-difluoro-3-((6S,8R)-6-(3-fluoro-5-((1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)amino)piridin-2-il)-8-metil-3,6,8,9-tetrahidro-7H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-7-il)propan-1-ol (118 mg, 54%) kao smeša izomera. Materijal je ponovo prečišćen preparativnom HPLC (Waters XSelect CSH C18 kolona, 5µ silika, 30 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 0,1% mravlja kiselina) i MeCN kao eluente. Fragmenti koji sadrže željena jedinjenje su kombinovani i prečišćeni hromatografijom razmere jona, koristeći SCX-2 kolonu. Željeni proizvod je eluiran iz kolone koristeći 1M NH3/MeOH i fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio 2,2-difluoro-3-((6S,8R)-6-(3-fluoro-5-((1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)amino)piridin-2-il)-8-metil-3,6,8,9-tetrahidro-7H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-7-il)propan-1-ol (62,1 mg, 29%) kao bezbojna čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, DMSO, 27°C) 1,03 (3H, dd), 1,64 (2H, dq), 2,44 (2H, t), 2,60 - 2,66 (1H, m), 2,79 (3H, dd), 2,97 (1H, dd), 3,04 - 3,15 (1H, m), 3,50 -3,73 (5H, m), 3,89 - 3,97 (1H, m), 4,39 (1H, t), 4,48 (1H, t), 5,21 (1H, s), 5,26 (1H, t), 6,58 (1H, d), 6,65 - 6,71 (2H, m), 7,19 (1H, d), 7,55 (1H, dd), 8,03 (1H, s), 12,94 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 507.

[0654] 6-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-5-fluoro-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)piridin-3-amin korišćen kao početni materijal je sintetisan kako sledi:

(R)-N-(1-(1H-indazol-4-il)propan-2-il)-3-((terc-butildinhenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropan-1-amin

[0655]

[0656] 3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil trifluorometansulfonat (2,59 g, 5,36 mmol) je dodat rastvoru (R)-1-(1H-indazol-4-il)propan-2-amin (0,94 g, 5,36 mmol) i DIPEA (1,39 ml, 8,05 mmol) u 1,4-dioksanu (38,9 mL) i reakcija je mešana na 50°C tokom 18 sati. Reakciona smeša je isparena zatim i ostatak je razblažen sa EtOAc i opran sa vodom i vodeni sloj je dalje ekstrahovan sa EtOAc. Kombinovani organski slojevi su oprani sa zasićenim rasolom, osušeni preko magnezijum sulfata, filtrirani i ispareni do suvoće. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 50% EtOAc u heptanu. Čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio (R)-N-(1-(1H-indazol-4-il)propan-2-il)-3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropan-1-amin (1,515 g, 52%) kao bezbojna guma.

<1>H NMR (500 MHz, DMSO, 27°C) 0,92 (3H, d), 0,97 (9H, s), 1,78 - 1,86 (1H, m), 2,73 (1H, dd), 2,98 - 3,14 (4H, m), 3,83 (2H, td), 6,85 (1H, d), 7,20 (1H, dd), 7,34 (1H, d), 7,41 - 7,50 (6H, m), 7,58 - 7,64 (4H, m), 8,08 (1H, s), 12,98 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 508.

(6S,8R)-6-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin

[0657]

[0658] Trifluorosirćetna kiselina (319 µL) je dodata rastvoru (R)-N-(1-(1H-indazol-4-il)propan-2-il)-3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropan-1-amina (681 mg, 1,34 mmol) i 5-bromo-3-fluoropikolinaldehida (287 mg, 1,41 mmol) u toluenu (6,39 mL) i rezultujuća smeša je mešana na 110°C tokom 1 sata. Reakciji je omogućeno da se ohladi do sobne temperature, isparena je do suvoće i rastvorena u DMSO. Sirov proizvod je prečišćen fleš hromatografijom reverzne faze (100g Redisep Rf C18 kolona), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 0,1% mravlja kiselina) i MeCN (60 - 100%) kao eluente.

Fragmenti koji sadrže željeno jedinjenje su kombinovani i izolovani hromatografijom razmere jona, koristeći SCX-2 kolona. Željeni proizvod je eluiran iz kolone koristeći 1M NH3/MeOH i čisti fragmenti su ispareni do suvoće kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (763 mg, 82%) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, DMSO, 27°C) 0,99 (9H, s), 1,04 (3H, d), 2,74 - 2,89 (2H, m), 2,97 - 3,04 (1H, m), 3,31 (1H, s), 3,54 - 3,62 (1H, m), 3,78 (1H, q), 3,92 - 4,02 (1H, m), 5,36 (1H, s), 6,72 (1H, d), 7,23 (1H, d), 7,41 - 7,49 (6H, m), 7,57 - 7,61 (4H, m), 8,04 (1H, dd), 8,09 (1H, s), 8,38 (1H, d), 13,01 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 693.

6-((6S,8R)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il]-5-fluoro-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)piridin-3-amin

[0659]

[0660] 1-(3-Fluoropropil)azetidin-3-amin (114 mg, 0,86 mmol), (6S,8R)-6-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-7-(3-((terc-butildifenilsilil)oksi)-2,2-difluoropropil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (300 mg, 0,43 mmol) i natrijum terc-butoksid (249 mg, 2,59 mmol) su suspendovani u degaziranom 1,4-dioksanu (4,81 mL). Brettphos 3G predkatalizator (39,2 mg, 0,04 mmol) je dodat i smeša je evakuisana i isprana sa azotom (x2) i reakcija je zatim zagrejana do 80°C tokom 45 minuta. Reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i razređena je sa EtOAc i oprana sa vodom. Vodeni sloj je dalje ekstrahovan sa EtOAc i kombinovani organski slojevi su oprani sa zasićenim rasolom, osušeni preko magnezijum sulfata, filtrirani i ispareni do suvoće i korišćeni direktno bez daljeg prečišćavanja. M/z: ES+ [M+H]+ 745.

Primer 32

6-((6S, 8R)-1-fluoro-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,9,8-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohin-6-il)-N-(3-fluoropropil)azetidi-3-il)piridin-3-amin

[0661]

[0662] Natrijum terc-butoksid (116 mg, 1,20 mmol) i BrettPhos G3 (9,09 mg, 10,04 µmol) su dodati degaziranom rastvoru (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-1-fluoro-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (89 mg, 0,20 mmol) i 1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina (39,8 mg, 0,30 mmol) u 1,4-dioksanu (1,00 mL) i reakcija je zagrejana do 90°C i mešana tokom 6 sati. Nakon hlađenja, reakcija je razblažena sa EtOAc i vodom, i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc, zatim je kombinovana organska materija osušena preko natrijum sulfata i isparena. Prečišćavanje je pomoću HPLC (Waters CSH C18 OBD kolona, 5 µ silika, 30 mm prečnik, 100 mm dužina), koristeći opadajuće polarne smeše vode (sadrži 0,1% NH3i MeCN kao eluente), kako bi se dobio proizvod (42,0 mg, 42%) kao film.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,13 (3H, d), 1,69 -1,84 (2H, m), 2,61 (2H, td), 2,76 (1H, dd), 2,94 (3H, ddd), 3,16 - 3,28 (2H, m), 3,45 - 3,54 (1H, m), 3,67 - 3,76 (2H, m), 4,09 (1H, dt), 4,24 (1H, d), 4,43 (1H, td), 4,53 (1H, td), 5,02 (1H, s), 6,76 (1H, dd), 6,81 (1H, d), 6,89 (1H, dd), 7,39 (1H, d), 7,81 (1H, d), 11,10 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 495.

[0663] (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-1-fluoro-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin korišćen kao početni materijal je sintetisan kako sledi:

4-Bromo-3-fluoro-1H-indazol

[0664]

[0665] Selektfluor (49,40 g, 139,6 mmol) je dodat rastvoru 4-bromo-1H-indazola (25,0 g, 127 mmol) u DMF (254 mL) i reakcija je zagrejana do 70°C preko noći. Nakon hlađenja, reakciona smeša je sipana u vodu. Taložena čvrsta supstanca je filtrirana i osušena, zatim je sirov proizvod prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 30% EtOAc u heptanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio 4-bromo-3-fluoro-1H-indazol (4,20 g, 15%) kao bledo žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 7,24 - 7,28 (1H, m), 7,32 - 7,36 (2H, m), 9,20 (1H, s); m/z: ES- [M-H]- 213. terc-butil (R)-(1-(3-fluoro-1H-indazol-4-il)propan-2-il)karbamat

[0666]

[0667] n-Butil litijum (1,6M, 51,9 ml, 83,01 mmol) je dodat 4-bromo-3-fluoro-1H-indazolu (8,50 g, 39,5 mmol) u THF (124 mL) na -78°C i reakcija je mešana tokom 15 minuta, zagrejana do -50°C tokom 15 minuta, zatim ohlađena nazad do -78°C. Terc-butil (R)-4-metil-1,2,3-oksatiazolidin-3-karboksilat 2,2-dioksid (10,32 g, 43,48 mmol) je dodat u THF (20 mL) i reakcija je mešana tokom 15 minuta pre nego što joj je omogućeno da se zagreje do -10°C tokom 30 minuta. IN limunska kiselina (200 mL) je dodat i smeša je mešana tokom 15 minuta, pre nego što je ekstrahovana sa EtOAc (x2). Kombinovana organska materija je osušena preko magnezijum sulfata i isparena. Sirov proizvod je prečišćen fleš silika hromatografijom, gradijent eluiranja 0 do 40% EtOAc u heptanu. Fragmenti koji sadrže proizvod su ispareni do suvoće kako bi se dobio terc-butil (R)-(1-(3-fluoro-1H-indazol-4-il)propan-2-il)karbamat (5,93 g, 51%) kao bezbojna čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 2 7°C) 1,17 (3H, d), 1,35 (9H, s), 3,09 (2H, d), 4,00 - 4,09 (1H, m), 4,41 - 4,49 (1H, m), 6,97 (1H, d), 7,22 (1H, dd), 7,33 (1H, dd), 9,36 (1H, s); m/z: ES- [M-H]- 292.

(R)-1-(3-Fluoro-1H-indazol-4-il)propan-2-amin

[0668]

[0669] 4N hlorovodonična kiselina u dioksanu (23,86 ml, 95,45 mmol) je dodat do terc-butil (R)-(1-(3-fluoro-1H-indazol-4-il)propan-2-il)karbamat (5,60 g, 19,1 mmol) u MeOH (23,9 mL) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Sirov smeša je koncentrovana, zatim suspendovan u EtOAc (100 mL) i oprana sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonat (50 mL). Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (x5), zatim je kombinovana organska materija osušena preko natrijum sulfata i isparena kako bi se dobio (R)-1-(3-fluoro-1H-indazol-4-il)propan-2-amin (3,10 g, 84%) kao žuto ulje, koje je očvrsnulo nakon mirovanja.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,19 (3H, d), 2,86 (1H, dd), 3,09 (1H, dd), 3,33 (1H, dddd), 6,96 (1H, d), 7,22 (1H, dd), 7,33 (1H, dd), 9,93 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 194.

(R)-1-(3-Fluoro-1H-indazol-4-il)-N-(2,2,2-trinuoroetil)propan-2-amin

[0670]

[0671] 2,2,2-Trifluoroetil trifluorometansulfonat 0,1M rastvor u DCM (25,9 mL, 2,59 mmol) je dodat (R)-1-(3-fluoro-1H-indazol-4-il)propan-2-aminu (0,4 g, 2,07 mmol) i DIPEA (0,541 mL, 3,11 mmol) u 1,4-dioksanu (20 mL) i rezultujuća smeša je mešana na 75°C preko noći. Reakcija je koncentrovana u vakuumu i podeljena između etil acetata (25 mL) i zasićenog vodenog natrijum bikarbonata (25 mL). Slojevi su razdvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan sa etil acetatom (25 mL). Kombinovana organska materija je oprana sa zasićenim vodenim natrijum hloridom (25 mL), osušena preko natrijum sulfata, filtrirana i koncentrovana u vakuumu. Rezultujuća guma je uzeta u metanolu i primenjena na unapred ovlaženu (metanol) SCX-2 patronu. Patrona je oprana sa metanolom i eluirana sa 1M amonijakom u metanolu. Eluent je koncentrovan u vakuumu kako bi se dobio (R)-1-(3-fluoro-1H-indazol-4-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amin (0,455 g, 80%) kao braon guma.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,11 (3H, d), 2,92 (1H, dd), 3,07 - 3,22 (4H, m), 6,96 (1H, d), 7,25 (1H, dd), 7,34 (1H, dd), 9,50 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 276.

(6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-1-fluoro-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin

[0672]

[0673] Triflurosirćetna kiselina (87 µL) je dodata rastvoru (R)-1-(3-fluoro-1H-indazol-4-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amina (100 mg, 0,36 mmol) i 5-bromopikolinaldehida (67,6 mg, 0,36 mmol) u toluenu (0,87 mL) i rezultujuća smeša je mešana na 90°C tokom 1 sata. Reakciji je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i podeljena je između DCM (5 mL) i zasićenog vodenog natrijum bikarbonata (5 mL). Slojevi su razdvojeni i organski sloj je koncentrovan u vakuumu. Prečišćavanje pomoću hromatografije silika gel kolone eluiranjem sa 0-50% etil acetata u heptanu kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-bromopiridin-2-il)-1-fluoro-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin (89 mg, 55%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,16 (3H, d), 2,92 - 3,00 (2H, m), 3,25 - 3,36 (2H, m), 3,46 - 3,52 (1H, m), 5,07 (1H, s), 6,98 (1H, d), 7,09 (1H, dd), 7,43 (1H, d), 7,77 (1H, dd), 8,55 (1H, dd), 9,09 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 443.

Primer 33

5-Fluoro-6-((6S,8R)-1-fluoro-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-flizohinolin-6-il)-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)piridin-3-amin [0674]

[0675] Natrijum terc-butoksid (3,12 g, 32,52 mmol) i BrettPhos G3 (0,245 g, 0,27 mmol) su dodati degaziranom rastvoru (6S,8R)-6-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-1-fluoro-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolina (2,50 g, 5,42 mmol) i 1-(3-fluoropropil)azetidin-3-amina (1,075 g, 8,13 mmol) u 1,4-dioksanu (27,1 mL) i reakcija je zagrejana do 60°C i mešana tokom 2 sata. Nakon hlađenja, reakcija je razblažena sa EtOAc i vodom, i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc, zatim je kombinovana organska materija osušena preko natrijum sulfata i isparena. Prečišćavanje je najpre hromatografijom silika gel kolone eluiranjem sa 0-100% (10% metanolom u etil acetatu) u heptanu zatim Interchim reverznom fazom (0,1% NH3i MeCN kao eluent) kako bi se dobio proizvod kao smeša izomera. Proizvodi su razdvojeni pomoću SFC; uzorak je rastvoren u MeOH i razdvojen koristeći naredne SFC uslove: kolona: Phenomonex C4, 30 x 250 mm, 5 mikrona, mobilna faza: 25% MeOH 0,1% NH3, stopa protoka: 100 ml/minut , BPR 120 bara, temperatura kolone: 40°C kako bi se dobio 5-fluoro-6-((6S,8R)-1-fluoro-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)-N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)piridin-3-amin (1,780 g, 64%) kao pena.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,15 (3H, d), 1,67 - 1,81 (2H, m), 2,59 (2H, t), 2,81 - 3,03 (4H, m), 3,17 - 3,34 (2H, m), 3,70 (3H, q), 4,01 - 4,08 (1H, m), 4,20 (1H, d), 4,43 (1H, t), 4,53 (1H, t), 5,32 (1H, s), 6,54 (1H, dd), 6,81 (1H, d), 6,95 (1H, d), 7,64 - 7,68 (1H, m), 9,46 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 513.

[0676] (6S,8R)-6-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-1-fluoro-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin korišćen kao početni materijal je sintetisan kako sledi:

(6S,8R)-6-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-1-fluoro-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin

[0677]

[0678] Trifluorosirćetna kiselina (2,16 mL) je dodata rastvoru (R)-1-(3-fluoro-1H-indazol-4-il)-N-(2,2,2-trifluoroetil)propan-2-amina (2,50 g, 9,08 mmol) i 5-bromo-3-fluoropikolinaldehida (1,85 g, 9,08 mmol) u toluenu (43,3 mL) i rezultujuća smeša je mešana na 90°C tokom 90 minuta. Reakciji je omogućeno da se ohladi i podeljena je između DCM (50 mL) i zasićenog vodenog natrijum bikarbonata (50 mL). Slojevi su razdvojeni i organski sloj je koncentrovan u vakuumu. Prečišćavanje je pomoću hromatografije silika gel kolone eluiranjem sa 0-50% etil acetata u heptanu kako bi se dobio (6S,8R)-6-(5-bromo-3-fluoropiridin-2-il)-1-fluoro-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3f]izohinolin (2,90 g, 69%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3, 27°C) 1,15 (3H, d), 2,88 - 3,04 (2H, m), 3,24 - 3,35 (2H, m), 3,63 - 3,71 (1H, m), 5,39 (1H, s), 6,83 (1H, d), 7,08 (1H, dd), 7,60 (1H, dd), 8,36 (1H, dd), 9,13 (1H, s); m/z: ES+ [M+H]+ 461.

[0679] Primeri 34 do 73 (tabela u nastavku) su pripremljeni korišćenjem postupaka sinteze koji su analogni onim koji su opisani iznad.

Claims (6)

1. Patentni zahtevi 1. N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin,
2. ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 2. Jedinjenje patentnog zahteva 1, koje je N-(1-(3-fluoropropil)azetidin-3-il)-6-((6S,8R)-8-metil-7-(2,2,2-trifluoroetil)-6,7,8,9-tetrahidro-3H-pirazolo[4,3-f]izohinolin-6-il)piridin-3-amin,
3. 3. Farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
4. 4. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu kao lek.
5. 5. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, za upotrebu u prevenciji ili tretmanu raka kod toplokrvne životinje kao što je čovek.
6. 6. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, gde je rak rak dojke ili ginekološki rak.