RS56418B2 - Metodi evaluacije imunskog odgovora na terapijsko sredstvo - Google Patents

Description

Opis

Srodne patentne prijave

Oblast pronalaska

[0001] Pronalazak se odnosi na evaluaciju imunskog odgovora pacijenata na terapijsko sredstvo, posebno na terapijski protein natalizumab.

Osnov pronalaska

[0002] Biološka terapijska sredstva trenutno su na raspolaganju za lečenje bolesti i poremećaja kao što su odbacivanje transplantata, leukemija, kancer dojke, artritis, multipla skleroza i Kronova bolest; a razvijaju se i brojni drugi načini lečenja bazirani na proteinima. Raspoloživa biološka terapijska sredstva uključuju AMEVIVE<®>(alefacept), ZEVALIN<®>(ibritumomab tiuksetan), ORTHOCLONE<®>(muromonab-CD3), ENBREL<®>(etanercept), REOPRO<®>(abciksimab), RITUXAN<®>(rituksimab), SIMULECT<®>(baziliksimab), REMICADE<®>(infliksimab), SYNAGIS<®>(palivizumab), HERCEPTIN<®>(trastuzumab), ZENAPAX<®>(daklizumab), CAMPATH<®>(alemtuzumab); MYLOTARG<®>(gemtuzumab ozogamicin), HUMIRA<®>(adalimumab), AVONEX<®>(interferon beta-la) i TYSABRI<®>(natalizumab). Natalizumab je humanizovano monoklonsko antitelo protiv α4β1 integrina (VLA-4). Natalizumab se vezuje za α4 podjedinicu α4β1 i α4β7 integrina. Natalizumab se koristi za lečenje određenih zapaljenskih oboljenja i stanja uključujući multiplu sklerozu, Kronovu bolest i reumatoidni artritis.

[0003] S obzirom na to da imunski odgovori na biološka terapijska sredstva mogu imati kliničke posledice, razvijanje i validacija testova imunogenosti od velikog su značaja u oblasti bioloških terapijskih sredstava.

Kratak opis pronalaska

[0004] Pronalazak se odnosi na primere izvođenja kako je definisano u patentnim zahtevima.

[0005] Preciznije, pronalazak se odnosi na postupak za detektovanje klinički značajnog imunskog odgovora na natalizumab kod subjekta, gde postupak uključuje utvrđivanje da li najmanje dva biološka uzorka uzeta u različitim vremenskim tačkama od subjekta kod kojeg je primenjen natalizumab sadrže u uzorku seruma bar klinički značajan nivo praga od 500 ng/ml solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab, pri čemu su navedene vremenske tačke razdvojene najmanje 42 dana, i pri čemu prisustvo najmanje nivoa praga solubilnog antitela ukazuje na smanjenje efikasnosti ili izostanak efikasnosti natalizumaba.

[0006] Opis obezbeđuje postupke i kompozicije za identifikovanje, praćenje i/ili evaluiranje imunskog odgovora na natalizumab. Činjenica da pacijent razvija bilo kakva antitela na natalizumab može, ali ne mora biti u korelaciji sa kliničkim odgovorom na natalizumab. Pronalazak se zasniva, delom, na otkriću neočekivanog nivoa odgovora antitelima, koji može da se koristi kao prag za detektovanje klinički značajnog odgovora na natalizumab. U nekim primerima izvođenja, nivo praga je viši nego što je bilo predviđeno na osnovu statističkog analiziranja pacijenata koji nisu primili natalizumab. Klinički značajan prag je uglavnom viši od najnižeg detektabilnog nivoa imunskog odgovora kod pacijenta. Na primer, klinički značajan nivo praga je obično bar 2 standardne devijacije iznad negativnog kontrolnog nivoa, tj. iznad prosečnog nivoa pre tretmana kod netretirane populacije pacijenata. U nekim primerima izvođenja, viši nivoi praga korišćeni u postupcima prema pronalasku za rezultat imaju manji broj lažno pozitivnih rezultata nego što bi ih bilo identifikovano ako bi se nivo praga bazirao na graničnoj vrednosti od 5% (npr. 1.645 standardnih devijacija iznad prosečne vrednosti) za imunske odgovore zapažene kod pacijenata koji nisu primili natalizumab. Prema pronalasku, prisustvo detektabilnog imunskog odgovora u uzorku uzetom od pacijenta nije klinički značajno sve dok imunski odgovor ne dostigne bar prethodno određeni nivo praga. Pronalazak obezbeđuje, između ostalog, postupke za identifikovanje klinički značajnog nivoa praga odgovora antitelima na natalizumab i postupke za identifikovanje pacijenata koji imaju klinički značajan odgovor antitelima na natalizumab. Pronalazak, delom, obezbeđuje i nivo praga kojim će se kod subjekta identifikovati klinički značajna antitela.

[0007] Imunski odgovor na natalizumab ne mora biti klinički značajan (npr. ne mora biti značajno udružen sa smanjenom kliničkom efikasnošću) sve dok magnituda imunskog odgovora ne dostigne nivo praga koji može biti prethodno određen (npr. na osnovu imunskih odgovora dobijenih za različite grupe pacijenata). Iznenađujuće, postupci opisani u ovom tekstu ne počivaju na upoređivanju uzoraka dobijenih od svakog pojedinačnog pacijenta pre i posle tretmana, niti počivaju na identifikovanju pukog prisustva detektabilnog imunskog odgovora na natalizumab. Naprotiv, postupci opisa odnose se na detektovanje bar nivoa praga imunskog odgovora na natalizumab, pri čemu nivo praga može biti viši od najnižeg detektabilnog nivoa imunskog odgovora, i pri čemu su pozitivni rezultati testa klinički značajni, delom, zbog toga što se testom izbegavaju lažno pozitivni rezultati koji nisu udruženi sa kliničkom značajnošću.

[0008] Trenutno ne postoji opšte primenljiva tehnika ili standard za detektovanje klinički značajnog odgovora antitelima na terapijski protein. Različiti terapijski proteini mogu da indukuju različite tipove antitela, a prisustvo takvih antitela može, ali ne mora uticati na bezbednost, farmakokinetiku i/ili efikasnost terapijskog proteina. Današnji postupci za praćenje odgovora pacijenta na terapijsko antitelo tipično uključuju upoređivanje nivoa serumskih antitela pre i posle tretmana, za svakog pacijenta, utvrđivanjem prisustva ikakvog detektabilnog imunskog odgovora, i evaluiranje pacijenata da bi se odredilo da li je detektabilni imunski odgovor u nekoj korelaciji sa pitanjima bezbednosti, farmakokinetike i/ili efikasnosti. Nasuprot tome, postupci opisa korisni su za identifikovanje pacijenata sa klinički značajnim imunskim odgovorom obezbeđivanjem skrining testova za detektovanje klinički značajnih nivoa praga odgovora.

[0009] Prema pronalasku, klinički značajan imunski odgovor na natalizumab je odgovor antitelima, koji može da utiče na jedan ili više kliničkih parametara kod pacijenta i/ili na farmakokinetiku i/ili na efikasnost natalizumaba. Obično, klinički značajan odgovor antitelima ukazuje na smanjenje efikasnosti ili na izostanak efikasnosti natalizumaba, ili na neželjenu reakciju na natalizumab. Na primer, u slučaju multiple skleroze, klinički značajan odgovor antitelima na terapijski protein uključuje jedno ili više od sledećeg: (a) izostanak efikasnosti ili najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ili veće smanjenje efikasnosti natalizumaba u smanjenju broja, jačine ili stope relapsa kod pacijenta; (b) izostanak efikasnosti ili najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ili veće smanjenje efikasnosti natalizumaba u usporavanju razvoja onesposobljenosti prema proširenoj skali funkcionalne onesposobljenosti (EDSS) ili skali funkcionalnog kompozitnog testa za multiplu sklerozu (MSFC); (c) izostanak efikasnosti ili najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ili veće smanjenje efikasnosti u redukovanju broja ili volumena novih ili novorastućih T2 hiperintenzivnih lezija ili usporavanju porasta volumena T2 hiperintenzivnih lezija na MRI mozga, (d) izostanak efikasnosti ili najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ili veće smanjenje efikasnosti u smanjenju broja ili volumena gadolinijumom pojačanih lezija na MRI mozga; (e) izostanak efikasnosti ili najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 60% ili veće smanjenje efikasnosti u poboljšavanju vizuelne funkcije; (f) prisustvo ozbiljnih neželjenih događaja (npr.; reakcija preosetljivosti, npr. anafilaksa). Izuzev (f), takvi odgovori se evaluiraju u okviru specifikovanog vremenskog perioda posle primene natalizumaba, npr. u okviru 3 meseca, 6 meseci, 9 meseci, ili najmanje godinu dana.

[0010] U jednom aspektu, opis obezbeđuje postupke za identifikovanje klinički značajnog nivoa praga odgovora antitelima na natalizumab. Postupak uključuje (a) evaluiranje nivoa antitela na natalizumab u kontrolnoj populaciji pacijenata koji imaju poremećaj (npr. određivanje prosečnog nivoa ili medijane antitela na natalizumab u populaciji od najmanje 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, 100 ili više pacijenata koji imaju poremećaj i koji nisu bili lečeni natalizumabom najmanje 3 meseca, 6 meseci ili duže); i (b) selektovanje nivoa praga od najmanje 2 (npr. 2.5, 3, 4, 5 ili 6) standardne devijacije iznad nivoa antitela na natalizumab u kontrolnoj populaciji. Prisustvo najmanje nivoa praga antitela na natalizumab kod pacijenta kod kojeg je bio primenjen natalizumab (tretirani pacijent) u korelaciji je sa klinički značajnim odgovorom kod tretiranog pacijenta. Poželjno, za evaluaciju tretiranog pacijenta koristi se isti detekcioni reagens (npr. obeleženo antitelo na natalizumab) kao onaj koji se koristi za identifikovanje nivoa antitela na natalizumab u kontrolnoj populaciji. U jednom primeru izvođenja, poremećaj je multipla skleroza. U nekim primerima izvođenja, poremećaji su zapaljenje centralnog nervnog sistema (npr. meningitis, neuromijelitis optika, neurosarkoidoza, vaskulitis CNS, encefalitis ili transverzni mijelitis, pored ili umesto multiple skleroze), odbacivanje kalema tkiva ili organa ili bolest kalema protiv domaćina, akutna povreda CNS (npr. moždani udar ili povreda kičmene moždine); hronična bolest bubrega; alergija (npr. alergijska astma); dijabetes tipa 1; zapaljenske bolesti creva (npr. Kronova bolest ili ulcerativni kolitis); mijastenija gravis; fibromijalgija; artritični poremećaj (npr. reumatoidni artritis ili psorijatički artritis); zapaljenski/imunski poremećaj kože (npr. psorijaza, vitiligo, dermatitis, ili lichen planus); sistemski eritemski lupus; Sjögren-ov sindrom; hematološki kancer (npr. multipli mijelom, leukemija, ili limfom); solidni kancer kao sarkom ili karcinom (npr. pluća, dojke, prostate, ili mozga); ili fibrozni poremećaj (npr. plućna fibroza, mijelofibroza, ciroza jetre, mezangijski proliferativni glomerulonefritis, srpasti glomerulonefritis, dijabetesna nefropatija ili bubrežna intersticijalna fibroza). U nekim primerima izvođenja, poremećaj je oboljenje koje uključuje modulaciju α4β1 i/ili α4β7 podjedinice.

[0011] Opis obezbeđuje postupke za identifikovanje pacijenta koji ima klinički značajan odgovor antitelima na terapijski protein, npr. terapijsko antitelo. Postupak uključuje identifikovanje, u biološkom uzorku dobijenom od subjekta koji ima poremećaj i kod kojeg je primenjen terapijski protein, prisustva nivoa praga jednog ili više antitela koja se specifično vezuju za terapijski protein, pri čemu je nivo praga najmanje 2 (npr.2.5, 3, 4, 5, ili 6) standardne devijacije iznad nivoa antitela koja se specifično vezuju za terapijski protein u kontrolnoj populaciji (npr. populaciji pacijenata koji imaju poremećaj, ali kod kojih nije bio primenjen terapijski protein najmanje 3 meseca, 6 meseci ili duže). Terapijski protein je natalizumab. U jednom primeru izvođenja, poremećaj je multipla skleroza. U nekim primerima izvođenja, poremećaj je reumatoidni artritis. U određenim primerima izvođenja, poremećaj je Kronova bolest. U jednom primeru izvođenja, postupak uključuje još i modifikovanje režima lečenja pacijenta za kojeg je na taj način utvrđeno da ima klinički značajan odgovor antitelima na terapijski protein.

[0012] U jednom aspektu, opis obezbeđuje postupke i kompozicije za identifikovanje, u biološkom uzorku dobijenom od subjekta, prisustva klinički značajnog nivoa jednog ili više antitela koja se specifično vezuju za natalizumab primenjen kod subjekta. Aspekti opisa uključuju upotrebu ELISA testova za detektovanje nivoa indukovanih antitela, koji ukazuje na klinički značajan imunski odgovor subjekta na primenu natalizumaba. U jednom primeru izvođenja, opis obezbeđuje postupke i kitove za identifikovanje klinički značajnih nivoa antitela protiv natalizumaba koja ukazuju na imunski odgovor na natalizumab, kod subjekta koji je primio najmanje jednu dozu natalizumaba.

[0013] U jednom aspektu, opis obezbeđuje postupke za evaluaciju i/ili modifikovanje terapijskog režima, na osnovu subjektovog imunskog odgovora na natalizumab.

[0014] Prema jednom aspektu opisa, obezbeđeni su postupci za detektovanje klinički značajnog imunskog odgovora na natalizumab kod subjekta. Postupci uključuju određivanje da li najmanje dva biološka uzorka, uzeta u različitim vremenskim tačkama od subjekta kod kojeg je bio primenjen natalizumab, sadrže klinički značajan nivo praga solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab, pri čemu su navedene vremenske tačke razdvojene najmanje 42 dana i pri čemu prisustvo bar nivoa praga solubilnog antitela ukazuje na klinički značajan imunski odgovor na natalizumab. U nekim primerima izvođenja, bar nivo praga solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab prisutan je u dva biološka uzorka uzeta od subjekta u dve uzastopne vremenske tačke. U nekim primerima izvođenja, nivo solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab utvrđuje se: određivanjem nivoa solubilne vezujuće aktivnosti za natalizumab u prvom alikvotu biološkog uzorka; i određivanjem da li je solubilna vezujuća aktivnost specifična za natalizumab. U određenim primerima izvođenja, specifičnost solubilne vezujuće aktivnosti određuje se u drugom alikvotu biološkog uzorka. U nekim primerima izvođenja, nivo solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab u biološkom uzorku određuje se upoređivanjem nivoa vezujuće aktivnosti za obeleženi natalizumab merene u prisustvu dve ili više različitih količina neobeleženog natalizumaba (npr. nivoi mereni u odsustvu neobeleženog natalizumaba mogu da se uporede sa nivoima merenim u prisustvu kompetirajuće količine neobeleženog natalizumaba). U određenim primerima izvođenja, nivo solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab u biološkom uzorku određuje se upoređivanjem nivoa vezujuće aktivnosti za imobilisani natalizumab merene u prisustvu dve ili više različitih količina solubilnog natalizumaba (npr. nivoi mereni u odsustvu solubilnog natalizumaba mogu da se upoređuju sa nivoima merenim u prisustvu kompetirajuće količine solubilnog natalizumaba). U nekim primerima izvođenja, prvi nivo vezujuće aktivnosti za obeleženi natalizumab meren u prisustvu prve količine neobeleženog VLA-4 upoređuje se sa drugim nivoom vezujuće aktivnosti za obeleženi natalizumab merenim u prisustvu druge količine neobeleženog natalizumaba. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi nivo vezujuće aktivnosti određuju se u prvom i drugom alikvotu biološkog uzorka. U određenim primerima izvođenja, količina solubilnog antitela na natalizumab određuje se korišćenjem premošćujućeg ELISA testa. U nekim primerima izvođenja, prvi nivo vezujuće aktivnosti za natalizumab određuje se u prvom imunotestu za prvi alikvot biološkog uzorka, i drugi nivo vezujuće aktivnosti za natalizumab određuje se u drugom imunotestu za drugi alikvot biološkog uzorka, pri čemu se drugi imunotest „spajkuje“ većom količinom neobeleženog solubilnog natalizumaba nego prvi imunotest, i pri čemu je na prisustvo u biološkom uzorku bar nivoa praga solubilnog antitela na natalizumab ukazano ako je prvi nivo vezujuće aktivnosti veći nego referentni nivo i drugi nivo vezujuće aktivnosti je manji nego prethodno određeni procenat prvog nivoa vezujuće aktivnosti. U određenim primerima izvođenja, referentni nivo je nivo vezujuće aktivnosti izmeren za referentnu količinu solubilnog antitela na natalizumab. Referentna količina iznosi oko 500 ng/ml (npr. u uzorku seruma) solubilnog antitela na natalizumab. Na primer, referentna količina može biti oko 500 ng/ml, oko 525 ng/ml, oko 550 ng/ml, oko 575 ng/ml, ili oko 600 ng/ml. Treba imati u vidu da referentni nivo vezujuće aktivnosti, koji odgovara referentnoj količini, može biti izmeren u razblaženom uzorku (na primer, uzorak koji odgovara 10-strukom razblaženju i sadrži npr. oko 50 ng/ml, solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab). Referentni nivo vezujuće aktivnosti u testu može biti dat nekom prethodno određenom količinom solubilnog antitela na natalizumab, koja odgovara pogodnom razblaženju referentne količine. VLA-4-vezujuće antitelo je natalizumab. U nekim primerima izvođenja, solubilno antitelo na natalizumab je referentno antitelo koje se vezuje za natalizumab sa visokim afinitetom. U nekim primerima izvođenja, referentno antitelo blokira interakciju između natalizumaba i VLA-4. U određenim primerima izvođenja, prvi i drugi imunotest su premošćujući ELISA testovi. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi test uključuju imobilisani neobeleženi natalizumab i solubilni obeleženi natalizumab, pri čemu je solubilni obeleženi natalizumab obeležen enzimom, fluorescentnim markerom, biotinskim markerom (npr. natalizumab može biti biotinizovan) ili radioaktivnim markerom. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi imunotest se izvode u paralelnim reakcionim zapreminama na jednom reakcionom supstratu. U nekim primerima izvođenja, biološki uzorak je uzorak seruma. U određenim primerima izvođenja, subjekt je humani pacijent. U nekim primerima izvođenja, pacijent ima multiplu sklerozu. U nekim primerima izvođenja, pacijent ima reumatoidni artritis. U određenim primerima izvođenja, pacijent ima Kronovu bolest. Vremenske tačke za najmanje dva ili više bioloških uzoraka dobijenih od subjekta razdvojene su najmanje 42 dana, npr. 45 dana, 60 dana, 90 dana, ili više. U određenim primerima izvođenja, postupak takođe uključuje izbor režima lečenja subjekta, ako je klinički značajan nivo praga solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab detektovan u najmanje dva biološka uzorka dobijena od subjekta. U nekim primerima izvođenja, izbor režima lečenja uključuje evaluaciju trenutnog načina lečenja subjekta, određivanje novog načina lečenja subjekta, modifikovanje trenutnog načina lečenja subjekta ili prekid trenutnog načina lečenja subjekta. U nekim primerima izvođenja, trenutni način lečenja uključuje primenu natalizumaba kod subjekta.

[0015] Prema još jednom aspektu opisa, obezbeđeni su postupci za izbor režima lečenja subjekta. Postupci uključuju testiranje, kod subjekta kod kojeg je primenjen natalizumab, prisustva pozitivnog imunskog odgovora na natalizumab u prvoj i drugoj vremenskoj tački, biranje načina lečenja subjekta na osnovu rezultata testa u prvoj i drugoj vremenskoj tački, pri čemu je prisustvo pozitivnog imunskog odgovora u vremenskoj tački naznačeno prisustvom bar klinički značajne pražne količine vezujuće aktivnosti u biološkom uzorku dobijenom od subjekta u vremenskoj tački. Prva i druga vremenska tačka razdvojene su najmanje 42 dana. U nekim primerima izvođenja, terapija natalizumabom se nastavlja ako se u drugoj vremenskoj tački detektuje negativan imunski odgovor. U nekim primerima izvođenja, ako se pozitivan imunski odgovor detektuje i u prvoj i u drugoj vremenskoj tački, bira se terapija različita od terapije natalizumabom. U nekim primerima izvođenja, subjekt ima multiplu sklerozu. U određenim primerima izvođenja, subjekt ima Kronovu bolest. U nekim primerima izvođenja, subjekt ima reumatoidni artritis.

[0016] Prema još jednom aspektu opisa, obezbeđeni su postupci za izbor režima lečenja subjekta. Postupci uključuju detektovanje prisustva klinički značajnog imunskog odgovora na natalizumab u najmanje dva biološka uzorka dobijena od subjekta, pri čemu je kod subjekta bio primenjen natalizumab i najmanje dva biološka uzorka dobijena su od subjekta u vremenima razdvojenim bar 42 dana, i izbor terapijskog režima na osnovu detekcije klinički značajnog imunskog odgovora na natalizumab kod subjekta, u vremenima kada su bar dva biološka uzorka dobijena od subjekta. U nekim primerima izvođenja, klinički značajan interval između vremena dobijanja uzoraka od subjekta iznosi najmanje 45 dana, 60 dana, 90 dana ili više. U određenim primerima izvođenja, izbor režima lečenja uključuje evaluaciju trenutnog načina lečenja subjekta, određivanje novog načina lečenja subjekta, modifikovanje trenutnog načina lečenja subjekta ili prekid trenutnog načina lečenja subjekta. U nekim primerima izvođenja, trenutni način lečenja uključuje primenu natalizumaba kod subjekta. U nekim primerima izvođenja, detektovanje prisustva klinički značajnog imunskog odgovora na natalizumab uključuje određivanje da li biološki uzorak dobijen od subjekta kod kojeg je primenjen natalizumab sadrži nivo praga solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab, pri čemu prisustvo bar nivoa praga solubilnog antitela ukazuje na klinički značajan imunski odgovor na natalizumab. U određenim primerima izvođenja, bar nivo praga solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab prisutan je u dva biološka uzorka uzeta od subjekta u dve uzastopne vremenske tačke. U nekim primerima izvođenja, nivo solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab određuje se na sledeći način: određivanjem nivoa solubilne vezujuće aktivnosti za natalizumab u prvom alikvotu biološkog uzorka i određivanjem da li je solubilna vezujuća aktivnost specifična za natalizumab. U nekim primerima izvođenja, specifičnost solubilne vezujuće aktivnosti određuje se u drugom alikvotu istog biološkog uzorka. U određenim primerima izvođenja, nivo solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab u biološkom uzorku utvrđuje se upoređivanjem nivoa vezujuće aktivnosti za obeleženi natalizumab merene u prisustvu dve ili više različitih količina neobeleženog natalizumaba (npr. nivoi mereni u odsustvu neobeleženog natalizumaba mogu da se upoređuju sa nivoima merenim u prisustvu kompetirajuće količine neobeleženog natalizumaba). U nekim primerima izvođenja, nivo solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab u biološkom uzorku određuje se upoređivanjem nivoa vezujuće aktivnosti za imobilisani natalizumab merene u prisustvu dve ili više različitih količina solubilnog natalizumaba (npr. nivoi mereni u odsustvu solubilnog natalizumaba mogu da se upoređuju sa nivoima merenim u prisustvu kompetirajuće količine solubilnog natalizumaba). U nekim primerima izvođenja, prvi nivo vezujuće aktivnosti za obeleženi natalizumab meren u prisustvu prve količine neobeleženog VLA-4 upoređuje se sa drugim nivoom vezujuće aktivnosti za obeleženi natalizumab merenim u prisustvu druge količine neobeleženog natalizumaba. U određenim primerima izvođenja, prvi i drugi nivo vezujuće aktivnosti određuju se u prvom i drugom alikvotu istog biološkog uzorka. U nekim primerima izvođenja, količina solubilnog antitela na natalizumab određuje se korišćenjem premošćujućeg ELISA testa. U nekim primerima izvođenja, prvi nivo vezujuće aktivnosti za natalizumab određuje se u prvom imunotestu za prvi alikvot biološkog uzorka, i drugi nivo vezujuće aktivnosti za natalizumab određuje se u drugom imunotestu za drugi alikvot biološkog uzorka, pri čemu se drugi imunotest „spajkuje“ većom količinom neobeleženog solubilnog natalizumaba nego prvi imunotest, i pri čemu je na prisustvo u biološkom uzorku bar nivoa praga solubilnog antitela na natalizumab ukazano ako je prvi nivo vezujuće aktivnosti veći nego referentni nivo i drugi nivo vezujuće aktivnosti je manji nego prethodno određeni procenat prvog nivoa vezujuće aktivnosti. U nekim primerima izvođenja, referentni nivo je nivo vezujuće aktivnosti izmeren za referentnu količinu solubilnog antitela na natalizumab. U određenim primerima izvođenja, referentna količina iznosi oko 500 ng. U određenim primerima izvođenja, prvi i drugi imunotest su premošćujući ELISA testovi. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi test uključuju imobilisani neobeleženi natalizumab i solubilni obeleženi natalizumab, pri čemu je solubilni obeleženi natalizumab obeležen enzimom, fluorescentnim markerom, biotinskim markerom (npr. natalizumab može biti biotinizovan) ili radioaktivnim markerom. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi imunotest izvode se u paralelnim reakcionim zapreminama na jednom reakcionom supstratu (npr. u zasebnim bunarčićima ploče sa više bunarčića). U određenim primerima izvođenja, biološki uzorak je uzorak seruma. U nekim primerima izvođenja, subjekt je humani pacijent. U nekim primerima izvođenja, pacijent ima multiplu sklerozu. U nekim primerima izvođenja, pacijent ima reumatoidni artritis. U određenim primerima izvođenja, pacijent ima Kronovu bolest.

[0017] Obezbeđeni su postupci za identifikovanje klinički značajnog nivoa praga odgovora antitelima na natalizumab kod pacijenta koji ima poremećaj. Postupci uključuju (a) evaluiranje nivoa antitela na natalizumab u kontrolnoj populaciji pacijenata koji imaju poremećaj i koji nisu bili lečeni natalizumabom i (b) biranje nivoa najmanje 2 standardne devijacije iznad nivoa antitela na natalizumab u kontrolnoj populaciji kao klinički značajnog nivoa praga odgovora antitelima kod pacijenata koji imaju poremećaj i koji su lečeni natalizumabom.

[0018] Prema još jednom aspektu opisa, obezbeđeni su postupci za identifikovanje pacijenta koji ima klinički značajan odgovor antitelima na terapijski protein. Postupci uključuju testiranje, u biološkom uzorku dobijenom od pacijenta koji ima poremećaj i kod kojeg je primenjen terapijski protein, na prisustvo nivoa praga antitela koja se specifično vezuju za terapijski protein, pri čemu je nivo praga najmanje 2 standardne devijacije iznad nivoa antitela koja se specifično vezuju za terapijski protein u kontrolnoj netretiranoj populaciji pacijenata koji imaju poremećaj. U nekim primerima izvođenja, terapijski protein je terapijsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. Prema tome, pronalazak obezbeđuje postupke za detektovanje klinički značajnog imunskog odgovora na natalizumab kod subjekta, određivanjem da li biološki uzorak uzet od subjekta kod kojeg je bio primenjen natalizumab sadrži nivo praga solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab, pri čemu prisustvo bar nivoa praga solubilnog antitela ukazuje na klinički značajan imunski odgovor na natalizumab.

[0019] Svako ograničenje opisa može obuhvatiti različite primere izvođenja opisa. Predviđeno je, dakle, da svako ograničenje opisa, koje uključuje neki element ili kombinacije elemenata može biti uključeno u svaki aspekt opisa.

Kratak opis crteža

[0020]

• Slika 1 ilustruje interferenciju slobodnog natalizumaba u imunotestu.

• Slika 2 ilustruje interferenciju slobodnog natalizumaba u blokirajućem testu.

• Slika 3 pokazuje verovatnoću klinički značajnog imunskog odgovora u funkciji vremena posle inicijalne primene natalizumaba.

• Slika 4 ilustruje ukupan efekat pozitivnih imunskih odgovora na stope relapsa. P=Placebo, n=315. AN=Antitelo-negativno, n=569. PP=Prolazno pozitivno, n=19. TP=Trajno pozitivno, n=37.

• Slika 5 ilustruje efekat pozitivnih imunskih odgovora na stope relapsa tokom određenih vremenskih intervala posle inicijalne primene natalizumaba (A: 0-3 meseca, B: 3-6 meseci, C: 6-9 meseci i D: 9-12 meseci). P=Placebo, n=315. AN=Antitelo-negativno, n=569. PP=Prolazno pozitivno, n=19. TP=Trajno pozitivno, n=37.

Detaljan opis pronalaska

[0021] Predmetni opis odnosi se, delom, na postupke, kompozicije i kitove za detektovanje i

1

praćenje imunskog odgovora na natalizumab primenjen kod subjekta. U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupke za identifikovanje pacijenata sa klinički značajnim imunskim odgovorom na natalizumab. Prema pronalasku, prisustvo detektabilnog imunskog odgovora nije klinički značajno sve dok imunski odgovor ne dostigne klinički značajan nivo praga. Na primer, u kliničkim ispitivanjima natalizumaba, klinički značajan nivo praga imunskog odgovora iznosio je, neočekivano, više od 1.645 standardnih devijacija (npr. više od oko 2 standardne devijacije) iznad kontrolnog nivoa imunskog odgovora zapaženog kod subjekata koji nisu primili natalizumab.

[0022] Određeni aspekti opisa odnose se na postupke za detektovanje klinički značajnog imunskog odgovora na natalizumab primenjeno kod subjekta. Aspekti opisa posebno su korisni za detektovanje i praćenje imunskih odgovora kod subjekta koji je primio najmanje jednu dozu (npr. jednu terapijsku dozu) natalizumaba. Aspekti opisa uključuju identifikovanje i/ili praćenje subjekta sa klinički značajnim imunskim odgovorom na natalizumab, evaluiranje imunskog odgovora i/ili određivanje odgovarajućeg kliničkog tretmana (npr. određenog režima lečenja) na osnovu prirode i/ili obima imunskog odgovora. Informacije o subjektovom odgovoru na primenu natalizumaba mogu da se koriste za podešavanje, dizajniranje i/ili optimizovanje režima lečenja subjekta. Prema tome, pronalazak se odnosi na identifikovanje subjekta koji ima klinički značajan imunski odgovor na natalizumab. Sledeći aspekt opisa odnosi se na praćenje subjektovog imunskog odgovora na natalizumab. Još jedan aspekt opisa odnosi se na određivanje odgovarajućih terapijskih strategija za lečenje određenih oboljenja (npr. multiple skleroze, Kronove bolesti, ili reumatoidnog artritisa, itd.) na osnovu subjektovog imunskog odgovora na natalizumab.

[0023] VLA-4-vezujuća antitela mogu da se koriste za lečenje brojnih oboljenja i poremećaja udruženih sa zapaljenjem. Takvi poremećaji uključuju, npr. zapaljenje centralnog nervnog sistema (npr. pored multiple skleroze, meningitis, neuromijelitis optika, neurosarkoidozu, vaskulitis CNS, encefalitis, ili transverzni mijelitis), odbacivanje kalema tkiva ili organa ili bolest kalema protiv domaćina, akutnu povredu CNS (npr. moždani udar ili povredu kičmene moždine); hroničnu bolest bubrega; alergiju (npr. alergijsku astmu); dijabetes tipa 1; zapaljenske bolesti creva, npr. Kronovu bolest, ulcerativni kolitis; mijasteniju gravis; fibromijalgiju; artritične poremećaje, npr. reumatoidni artritis, psorijatički artritis; zapaljenske/imunske poremećaje kože, npr. psorijazu, vitiligo, dermatitis, lichen planus; sistemski eritemski lupus; Sjögren-ov sindrom; hematološke kancere, npr. multipli mijelom, leukemiju, limfom; solidne kancere npr. sarkome ili karcinome, npr. pluća, dojke, prostate, mozga; i fibrozne pormećaje, npr. plućnu fibrozu, mijelofibrozu, cirozu jetre, mezangijski proliferativni glomerulonefritis, srpasti glomerulonefritis, dijabetesnu nefropatiju i bubrežnu intersticijalnu fibrozu. U nekim primerima izvođenja, poremećaj je bolest izazvana modulacijom α4β1 i/ili α4β7 podjedinice.

[0024] Prema tome, aspekti opisa odnose se na evaluiranje subjektovog odgovora na natalizumab i određivanje odgovarajućih tretmana za multiplu sklerozu i druga zapaljenska stanja ili oboljenja koja mogu da se leče natalizumabom.

[0025] Pronalazak se delom odnosi na identifikovanje imunskog odgovora na natalizumab kod subjekta, i utvrđivanje da li je odgovor klinički značajan.

[0026] Kako se koristi u ovom tekstu, „identifikovanje“ subjekta sa imunskim odgovorom znači detektovanje ili dijagnostikovanje prisustva imunskog odgovora kod subjekta. Prema tome, identifikovanje subjekta sa klinički značajnim imunskim odgovorom znači detektovanje ili dijagnostikovanje prisustva klinički značajnog imunskog odgovora kod subjekta.

[0027] Kako se koristi u ovom tekstu, „klinički značajan prag“ za odgovor antitelima na terapijski protein iznosi najmanje 2 standardne devijacije iznad kontrolnog referentnog nivoa. U jednom primeru izvođenja, nivo praga za klinički značajan imunski odgovor na terapijski protein može biti između 3 i 6 (npr. oko 4 ili 5) standardnih devijacija iznad kontrolnog nivoa. Kontrolni nivo može biti prosečan ili srednji nivo vezujuće aktivnosti prisutne u populaciji pacijenata (npr. populaciji subjekata sa oboljenjem ili stanjem kao što su multipla skleroza, Kronova bolest ili reumatoidni artritis) pre izlaganja terapijskom proteinu. Klinički značajan prag za antitela na natalizumab iznosi 500 ng/ml pacijentovog seruma (npr. 50 ng/ml je prag u testu 10-struko razblaženog seruma).

[0028] Kako se koristi u ovom tekstu, imunski odgovor je imunogeni odgovor na terapijski protein, koji se karakteriše povećanim nivoima, kod subjekta, jednog ili više antitela koja se vezuju za protein. Tako, imunski odgovor može da se karakteriše indukcijom povećanih nivoa solubilnih antitela koja prepoznaju (npr. specifično prepoznaju) i vezuju se za natalizumab. Tipičan imunski odgovor je poliklonski i može uključivati antitela sa različitim afinitetima (a tako i različitim stepenima specifičnosti) za terapijski protein. Prema tome, postupci opisa mogu uključivati detektovanje prisustva, kod subjekta, jednog ili više indukovanih antitela koja se vezuju za terapijski protein (npr. natalizumab) primenjen kod subjekta. U nekim primerima izvođenja, indukovana antitela mogu da se detektuju kao solubilna antitela prisutna u biološkom uzorku (npr. uzorku seruma).

[0029] Aspekti opisa odnose se na testove za detektovanje klinički značajnog nivoa praga vezujuće aktivnosti u biološkom uzorku dobijenom od pacijenta. Nivo praga predstavlja nivo ispod kojeg se svaka detektabilna vezujuća aktivnost smatra klinički beznačajnom. Kako se koristi u ovom tekstu, vezujuća aktivnost označava detektovanu količinu vezivanja za terapijski protein u biološkom uzorku. Kako je opisano u ovom tekstu, prisustvo vezujuće aktivnosti u biološkom uzorku može da odražava poliklonski odgovor na primenu terapijskog proteina. Prema tome, količina vezivanja može da odražava ukupno vezivanje različitih antitela sa različitim afinitetima, za protein. U određenim primerima izvođenja, vezujuća aktivnost se dodatno analizira da bi se sa većom pouzdanošću odredilo da li je nivo vezivanja posledica prisustva specifičnih antitela na terapijski protein, ili drugih faktora kao što su reumatoidni faktori. Specifičnost vezujuće aktivnosti može da se evaluira kompetitivnim testovima, kako je opisano u ovom tekstu.

[0030] U jednom aspektu opisa, subjekt se identifikuje kao pozitivan (tj. kao da ima klinički značajan imunski odgovor na terapijski protein) samo ako jedan ili više uzoraka dobijenih od subjekta budu testirani kao pozitivni u testu opisa. Rezultat testa se određuje kao pozitivan kada uzorak dobijen od subjekta sadrži bar klinički značajan nivo praga vezujuće aktivnosti za terapijski protein, npr. natalizumab. Neočekivano, nije klinički značajno prisustvo svakog detektabilnog imunskog odgovora na terapijsko antitelo. Prema opisu, postupci bazirani na skriningu pacijenata u cilju detektovanja svakog nivoa imunskog odgovora na terapijsko antitelo, otkrivaju mnogo lažno pozitivnih pacijenata, što za rezultat ima nepotrebno dodatno kliničko praćenje i potencijalnu uznemirenost pacijenata koji nemaju klinički značajan imunski odgovor. Na primer, veliki broj lažno pozitivnih rezultata detektuje se kada se pacijenti označe kao pozitivni na osnovu imunskog odgovora na terapijsko antitelo koji je više od 1.645 standardnih devijacija iznad prosečnog nivoa vezujuće aktivnosti prisutne kod subjekata koji nisu primili terapijsko antitelo. Prema opisu, teorijska stopa od 5% lažno pozitivnih dobijena korišćenjem granične vrednosti od 1.645 standardnih devijacija je potcenjivanje broja lažno pozitivnih, jer 5% predstavlja stopu lažne detekcije svakog imunskog odgovora i nije stopa lažno pozitivnih rezultata za klinički značajan imunski odgovor. Neočekivano, podizanjem graničnog nivoa (nivo ispod kojeg se odgovor smatra kao negativan) na više od 1.645 standardnih devijacija iznad kontrolnog referentnog nivoa, broj lažno pozitivnih rezultata se smanjuje, bez uticaja na identifikovanje subjekata sa klinički značajnim imunskim odgovorima. Treba imati u vidu da prag treba da se postavi na nivo koji rezultuje prihvatljivim stopama detekcije pacijenata sa klinički značajnim imunskim odgovorom. Dakle, iako klinički značajan prag treba da se postavi na više od 1.645 standardnih devijacija iznad preimunskog referentnog nivoa, prag ne treba da se postavi tako visoko da se smanji efikasnost detektovanja istinski pozitivnih rezultata.

[0031] U jednom aspektu opisa, subjektov imunski odgovor može da se klasifikuje kao negativan ako uzorci dobijeni od subjekta nisu testirani kao pozitivni u testu ovog pronalaska, npr. ne dostižu klinički značajan nivo praga odgovora antitelima. Nasuprot tome, ako se subjekt identifikuje kao pozitivan na osnovu pozitivnog nivoa (nivo klinički značajnog praga ili iznad toga) vezujuće aktivnosti u jednom testu, pacijent može biti „prolazno“ ili „trajno“ pozitivan. Prolazno pozitivan

1

je pacijent koji ima pozitivan imunski odgovor na terapijsko antitelo tokom određenog vremenskog perioda, posle kojeg pacijent postaje negativan. Nasuprot tome, trajno pozitivan pacijent je onaj pacijent koji je pozitivan na klinički značajne nivoe imunskog odgovora duže od određenog vremenskog perioda. Treba imati u vidu da su „prolazno“ i „trajno“ relativni pojmovi. Prema tome, pacijent može prvobitno da se klasifikuje kao trajno pozitivan ako u testu bude pozitivan na imunski odgovor u dve ili više vremenskih tačaka (npr. u 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više vremenskih tačaka) razdvojenih najmanje 42 dana. Međutim, pacijent zatim može da se naknadno klasifikuje kao prolazno pozitivan ako se testira kao negativan na imunski odgovor u sledećem testiranju. Prisustvo prolaznog imunskog odgovora može da ukazuje na prolazno smanjenje terapijske efikasnosti. Prisustvo trajnog imunskog odgovora može da ukazuje na trajno smanjenje terapijske efikasnosti. Prema tome, prisustvo prolaznog ili trajnog imunskog odgovora može biti klinički relevantno i može uticati na prirodu režima lečenja subjekta koji je identifikovan kao prolazno pozitivan ili trajno pozitivan. Trajni imunski odgovor može zahtevati modifikaciju režima lečenja subjekta.

[0032] Kako se koristi u ovom tekstu, pojam „režim lečenja“ označava tok lečenja subjekta. Režim lečenja može uključivati primenu farmaceutskog sredstva/sredstava i/ili primenu terapije. Izbor režima može uključivati izbor dozne količine, vremena doziranja, učestalosti doziranja, dužinu trajanja lečenja, kombinovanog lečenja sa jednim ili više farmaceutskih sredstava ili terapija, i sve druge aspekte odlučivanja o lečenju, koje koriste stručnjaci u medicinskoj i terapijskoj struci. Režim lečenja može uključivati i upotrebu načina lečenja kao što su postupci ili uređaji koji se primenjuju ili koriste kod subjekta za prevenciju ili lečenje bolesti ili poremećaja. Primeri terapijskih postupaka, bez namere da budu ograničavajući, uključuju upotrebu medicinskih uređaja ili hirurških intervencija. Prema tome, određivanje ili menjanje režima lečenja natalizumabom može uključivati određivanje ili menjanje dozne količine terapijskog natalizumaba koja se primenjuje kod subjekta, učestalosti primene, puta primene, dužine trajanja lečenja (npr. broj doza koje se primenjuju), odlučivanje da li kombinovati tretman natalizumabom sa jednim ili više dodatnih tretmana, da li prekinuti tretman natalizumabom, da li koristiti drugačije VLA-4-vezujuće antitelo, i/ili da li koristiti kombinaciju VLA-4-vezujućih antitela, itd. U jednom primeru izvođenja, pronalazak može uključivati određivanje da li koristiti terapijsku alternativu natalizumabu, npr. da li koristiti beta interferon.

[0033] Aspekti opisa odnose se na detektovanje i/ili praćenje imunskog odgovora na natalizumab kod čoveka (npr. humanog pacijenta). Prema tome, kako se koristi u ovom tekstu, subjekt može biti humani subjekt. Subjekt može biti humani pacijent koji ima zapaljensko oboljenje ili stanje. Subjekt može biti pacijent koji je primio najmanje jednu dozu natalizumaba. Subjekt može biti pacijent koji se hronično leči (ili je bio hronično lečen) natalizumabom. Subjekt može biti pacijent koji se ponavljano leči (ili je bio ponavljano lečen) natalizumabom. Kako se koristi u ovom tekstu, hronično lečenje može uključivati primenu natalizumaba tokom dužeg vremenskog perioda (npr. za kontrolu ili upravljanje simptomima zapaljenskog oboljenja ili stanja tokom perioda vremena). Nasuprot tome, ponovljeno lečenje može uključivati ponavljanje toka lečenja (npr. period primene) natalizumabom kada je neophodno (npr. za lečenje simptoma zapaljenskog oboljenja kada se oni pogoršaju ili „rasplamsaju“). U jednom primeru izvođenja, smatra se da je pacijent podvrgnut ponovnom lečenju onda kada se subjekt ponovno leči, po prvi put natalizumabom. Prosečno obučeni stručnjak u oblasti će razumeti da subjekt može biti ili je bio podvrgnut lečenju terapijama ili postupcima u kombinaciji ili zasebno od lečenja natalizumabom. Treba imati u vidu da aspekti opisa nisu ograničeni na humane subjekte. Prema tome, subjekt može biti nehumani primat, krava, konj, svinja, ovca, koza, pas, mačka, glodar ili drugi nehumani subjekt.

Identifikovanje i praćenje imunskog odgovora

[0034] U jednom aspektu, opis uključuje identifikovanje i/ili praćenje imunskog odgovora na natalizumab kod subjekta. U određenim primerima izvođenja, identifikovanje i/ili praćenje obavljaju se testiranjem biološkog uzorka dobijenog od subjekta, poželjno krvi, na prisustvo indukovanih antitela koja se vezuju za primenjen natalizumab, kako je opisano u ovom tekstu.

[0035] U jednom aspektu opisa, kvalitativni test se obavlja na biološkom uzorku dobijenom od subjekta, a prisustvo imunskog odgovora se identifikuje ako biološki uzorak sadrži antitela protiv natalizumaba u količini većoj od pražne količine. U jednom primeru izvođenja, pražna količina je količina iznad koje se imunski odgovor identifikuje kao klinički relevantan, npr. nivo praga se određuje kako je opisano u ovom tekstu. Klinički relevantan imunski odgovor može imati kliničke implikacije, npr. ukazivati na to da subjekt treba da se evaluira da bi se odredilo da li doziranje primenjivanog natalizumaba treba da se modifikuje, da bi se odredilo da li treba pratiti druge fiziološke parametre pacijenta, da bi se odredilo da li treba obaviti dodatne testove imunskog odgovora, ili da bi se odredilo da li treba preduzeti neke alternativne ili dodatne korake u lečenju ili praćenju subjekta, itd. Klinički relevantan imunski odgovor može da se evaluira zajedno sa jednim ili više drugih faktora. Treba imati u vidu da identifikacija klinički relevantnog imunskog odgovora sama po sebi ne zahteva promenu subjektove terapije ili režima lečenja.

[0036] U sledećem aspektu opisa, na biološkom uzorku se može obaviti kvantitativni test da bi se kvantifikovala količina antitela (npr. titar antitela) na natalizumab koji je primenjen kod subjekta. Kvantitativni rezultati takođe mogu da se analiziraju da bi se odredilo da li je imunski odgovor iznad klinički značajnog nivoa praga.

[0037] Prema opisu, imunski odgovor subjekta na natalizumab može da se procenjuje tokom

1

vremena, obavljanjem testova na uzorcima dobijenim od subjekta u različitim vremenskim tačkama. Strategija višestruke procene dopušta praćenje subjektovog imunskog odgovora na natalizumab i dozvoljava da se režim lečenja natalizumabom individualno prilagodi subjektovim potrebama lečenja. Na primer, uzorak može da se dobije od subjekta, testira na imunski odgovor na natalizumab primenjen kod subjekta, i u drugo, kasnije vreme, drugi uzorak može da se dobije od subjekta i na sličan način testira. Detekcija i potvrda prisustva odgovora antitelima u subjektovim uzorcima tokom vremena putem uzastopnog određivanja, u ranije određenim vremenskim intervalima, dopuštaju praćenje imunskog odgovora na lečenje natalizumabom. Detekcija i praćenje imunskog odgovora na primenjeni natalizumab dozvoljavaju i podešavanje celokupnog lečenja subjekta, na primer podešavanjem (npr. modifikovanjem ili suspendovanjem) lečenja natalizumabom i/ili podešavanjem dodatnih terapija (npr. terapija koje modulišu imunski odgovor subjekta).

[0038] Izbor ili podešavanje terapijskog režima mogu se zasnivati na utvrđivanju klinički značajnog imunskog odgovora na natalizumab u najmanje dva biološka uzorka dobijena u različito vreme od subjekta kod kojeg je bio primenjen natalizumab. Određivanje subjektovog klinički značajnog imunskog odgovora na natalizumab može ukazivati na to da bi otpočinjanje, nastavljanje, podešavanje ili obustavljanje primene specifičnog farmaceutskog sredstva i/ili terapije kod subjekta moglo biti korisno. Na primer, određivanje klinički značajnog imunskog odgovora na natalizumab u najmanje dva biološka uzorka dobijena od subjekta može biti osnov za promenu doze farmaceutskog sredstva koje se primenjuje kod subjekta kao deo trenutnog režima lečenja. Lečenje može da se promeni tako da uključi dodatna farmaceutska sredstva ili terapije ili sniženje ili povećanje doze sredstva ili terapije, koji se trenutno primenjuju. Na primer, identifikovanje imunskog odgovora na natalizumab kod subjekta može da sugeriše otpočinjanje ili nastavljanje tretmana imunosupresivnim farmaceutskim sredstvom, itd. U nekim primerima izvođenja, početni režim lečenja može se odabrati na osnovu određivanja početnog imunskog odgovora na natalizumab u jednom biološkom uzorku dobijenom od subjekta koji je bio lečen natalizumabom. Posle izbora i primene odabranog režima lečenja, može se obaviti sledeće određivanje imunskog odgovora na natalizumab, u jednom ili više uzastopnih bioloških uzoraka dobijenih od subjekta i može se obezbediti osnov za podešavanje režima lečenja.

[0039] Određivanje klinički značajnog imunskog odgovora na natalizumab u dva ili više bioloških uzoraka dobijenih od subjekta u različitim vremenskim tačkama može da se upoređuje da bi se evaluirali ili merili uspostavljanje, progresija ili regresija imunskog odgovora kod subjekta na terapiju natalizumabom. Uspostavljanje imunskog odgovora na natalizumab kod subjekta može da se karakteriše porastom nivoa najmanje jednog antitela koje se vezuje za natalizumab, i može

1

biti udruženo sa uspostavljanjem jedne ili više fizioloških promena ili simptoma kod subjekta. Progresija imunskog odgovora na natalizumab može da se karakteriše daljim porastom nivoa najmanje jednog antitela koje se vezuje za natalizumab. Međutim, progresija imunskog odgovora može uključivati porast nivoa najmanje jednog dodatnog antitela i/ili smanjenje nivoa najmanje jednog od antitela koja su rasla pri uspostavljanju imunskog odgovora. Na primer, početni imunski odgovor može biti pretežno odgovor IgM. Kako imunski odgovor progreduje, umesto IgM preovlađujuća antitela mogu da postanu IgG antitela. Progresija imunskog odgovora može da bude udružena i sa progresijom (npr. porastom, smanjenjem, ili modifikacijom) jedne ili više fizioloških promena ili simptoma ili uspostavljanjem jedne ili više dodatnih fizioloških promena ili simptoma. Regresija imunskog odgovora subjekta na natalizumab može da se karakteriše smanjenjem nivoa jednog ili više antitela koja se vezuju za natalizumab. Regresija imunskog odgovora može da bude udružena i sa smanjenjem određenih fizioloških promena ili simptoma. Međutim, treba imati u vidu da uspostavljanje, progresija i/ili regresija imunskog odgovora na natalizumab može biti bez kliničkih simptoma, osim detektabilnih promena nivoa antitela.

[0040] Na progresiju i regresiju klinički značajnog imunskog odgovora na natalizumab mogu uopšteno ukazivati porast odnosno smanjenje nivoa antitela koje se vezuje za natalizumab u subjektovim uzorcima, tokom vremena. Na primer, ako se odredi da u prvom uzorku uzetom od subjekta nema antitela koja se specifično vezuju za natalizumab ili su na supklinički značajnom nivou, a u drugom, narednom, uzorku uzetom od subjekta odredi se prisustvo klinički značajnog praga antitela koja se specifično vezuju za natalizumab, to može da ukaže na uspostavljanje imunskog odgovora na natalizumab kod subjekta. Na progresiju imunskog odgovora na natalizumab kod subjekta može da ukaže prisustvo višeg nivoa antitela koje se specifično vezuje za natalizumab u drugom ili sledećem uzorku uzetom od subjekta, u poređenju sa nivoom prisutnim u početnom ili prethodnom uzorku uzetom od subjekta. Na regresiju imunskog odgovora na natalizumab kod subjekta može da ukaže prisustvo nižeg nivoa antitela koje se specifično vezuje za natalizumab u drugom ili sledećem uzorku uzetom od subjekta, u poređenju sa nivoom prisutnim u početnom ili prethodnom uzorku uzetom od subjekta.

[0041] U jednom aspektu opisa, imunski odgovor može da se kategoriše kao pozitivan ili negativan na osnovu toga da li je nivo antitela protiv natalizumaba iznad prethodno određenog klinički značajnog praga. U nekim primerima izvođenja, klinički značajan prag je više od 1.645 (npr. više od 2, 3, 4, 5, ili 6) standardnih devijacija iznad prosečnog nivoa vezujuće aktivnosti merene kod subjekata pre imunizacije (tj. subjekata koji nisu primili nijednu dozu natalizumaba). U nekim primerima izvođenja, subjekti su zdravi subjekti i u određenim primerima izvođenja, subjekti su oboleli pacijenti (npr. pacijenti sa multiplom sklerozom, Kronovom bolešću ili reumatoidnim

1

artritisom). Nivo praga je > 0.5 mikrograma/ml seruma. U nekim primerima izvođenja, nivo praga iznosi oko 0.5 mikrograma/ml seruma.

[0042] U jednom primeru izvođenja, subjekti kod kojih je bio primenjen natalizumab mogu da se svrstaju u jednu od najmanje tri kategorije. Jedna kategorija, ovde označena kao „negativna“, uključuje subjekte kod kojih su vezujuće aktivnosti na ili ispod klinički značajnih nivoa praga (npr. subjekt kod kojeg nisu detektovana antitela na natalizumab u koncentraciji od bar oko 500 ng/ml u biološkom uzorku (npr. serumu) dobijenom od subjekta). Druga kategorija, ovde označena kao „prolazno pozitivna“, uključuje subjekte kod kojih su samo ograničen broj puta detektovane vezujuće aktivnosti iznad nivoa praga, npr. u jednoj, dve, tri, četiri, pet vremenskih tačaka (npr. antitela na natalizumab nisu detektovana u vremenskoj tački koja je bar 42 dana odvojena od poslednje prethodne vremenske tačke). Treća kategorija, ovde označena kao „trajno pozitivna“, uključuje subjekte kod kojih su vezujuće aktivnosti iznad nivoa praga detektovane ranije određeni broj puta, npr. u jednoj, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam ili više vremenskih tačaka, koje su međusobno razdvojene bar pražnim vremenskim intervalom (npr. subjekt kod kojeg su antitela na natalizumab detektovana u koncentraciji koja iznosi bar oko 500 ng/ml u dva, tri, četiri, pet, šest, sedam ili više bioloških uzoraka dobijenih od subjekta u vremenskim tačkama koje su međusobno razdvojene najmanje 42 dana). Interval praga može da iznosi npr. najmanje oko 50, 60, 70, 80, 90 ili više dana. Kod pacijenata koji su „trajno pozitivni“ može doći do gubitka efikasnosti lečenja natalizumabom, dok se kod „prolazno pozitivnih“ pacijenata puna efikasnost uspostavlja posle samo privremenog smanjenja.

[0043] Treba imati u vidu da negativni subjekt može postati prolazno pozitivan. Isto tako, svaki od njih može postati trajno pozitivan u slučaju da se pozitivan imunski odgovor razvije i traje tokom određenog broja vremenskih tačaka, npr. u najmanje dve vremenske tačke.

[0044] U jednom primeru izvođenja, lečenje može da se promeni na osnovu određivanja pojedinačnog pozitivnog rezultata. U drugom primeru izvođenja, lečenje može da se promeni na osnovu određivanja da je subjekt prolazno pozitivan subjekt. U još jednom primeru izvođenja, lečenje može da se promeni na osnovu određivanja da je subjekt trajno pozitivan subjekt.

[0045] Kako je gore bilo reči, treba imati u vidu da su pojmovi „prolazno“ i „trajno“ relativni pojmovi i da naizgled trajno pozitivan pacijent može kasnije postati negativan. Prema tome, pacijente sa pozitivnim odgovorima treba redovno pratiti da bi se evaluirala postojanost pozitivnog odgovora, efikasnost lečenja i/ili prisustvo drugih kliničkih manifestacija pozitivnog imunskog odgovora.

[0046] Prema opisu, rizik za smanjenje terapijske efikasnosti (npr. rizik za relaps) raste sa produženjem vremena trajanja pozitivnog imunskog odgovora. Prema tome, u jednom aspektu

1

opisa, broj puta kada je pacijent testiran kao pozitivan manje je važan od dužine vremena tokom kojeg je pacijent ostajao pozitivan. U jednom primeru izvođenja, pacijent može biti identifikovan kao da je pod rizikom za smanjenje terapijske efikasnosti (npr. pod rizikom za relaps) ako se pozitivan rezultat detektuje unutar 3 meseca od prve primene natalizumaba. U jednom primeru izvođenja, ovaj rizik raste ako se pozitivan imunski odgovor održava 3-6 meseci, i dodatno raste ako se pozitivan imunski odgovor održava 6-9 meseci, i dodatno raste sa održavanjem tokom 9-12 meseci od prve primene natalizumaba. Treba imati u vidu da održavanje koje traje više od godinu dana još dodatno povećava verovatnoću relapsa. Prema tome, pacijentima sa trajno pozitivnim imunskim odgovorom mogu odgovarati različiti režimi lečenja. Međutim, treba imati u vidu da čak i u prisustvu trajno pozitivnog imunskog odgovora, lečenje terapijskim antitelima ne mora biti prekinuto, osim ako ne postane neefikasno (npr. gubitak suštinski svake efikasnosti) ili ne dovede do drugih negativnih kliničkih manifestacija.

[0047] U nekim primerima izvođenja, lečenje natalizumabom može se prekinuti ako je lečenje neefikasno ili ako je izgubilo efikasnost kod pacijenta sa nivoom imunskog odgovora koji odgovara nivou praga ili je na nivou praga. Izostanak efikasnosti (ili smanjenje efikasnosti) u odsustvu klinički značajnog imunskog odgovora može ukazivati na to da je neefikasnost posledica jednog ili više faktora različitih od pacijentovog imunskog odgovora na natalizumab. Pacijent neće biti prolazno pozitivan ako se ne detektuje pozitivan odgovor. Prema tome, mogu se razmotriti alternativni načini lečenja.

[0048] Treba imati u vidu da vezujuće aktivnosti ili nivoi antitela mogu da se upoređuju sa preimunizacionim aktivnostima ili nivoima (tj. merenim pre primene prve doze natalizumaba). Međutim, upoređivanje sa preimunizacionom količinom nije neophodno, kao što je rečeno ovde, zbog toga što pozitivan imunski odgovor može da se identifikuje kada su u pacijentovom uzorku prisutni klinički značajna pražna količina (ili iznad praga) vezujuće aktivnosti ili nivoa antitela. Testovi i postupci za detekciju

[0049] Prema aspektima opisa, testira se pražna količina odgovora antitela. Kako je rečeno u ovom tekstu, može se izvesti kvalitativni test. Alternativno, može se izvesti kvantitativni test i, u jednom primeru izvođenja, kvantitativni podaci mogu da se prevedu u kvalitativne (npr. da li je količina antitela veća od pražne količine).

[0050] Može se koristiti svaki pogodan postupak za detektovanje količine antitela ili vezujuće aktivnosti da bi se odredilo da li je u pitanju bar pražna količina ili aktivnost. Testovi za detekciju mogu uključivati sve poznate imunodetekcione metode za detektovanje, potvrdu, vezivanje, prečišćavanje, uklanjanje, kvantifikovanje i/ili na drugi način uopšteno detektovanje antitela koja se specifično vezuju za specifikovani terapijski protein, npr. na natalizumab, ili njegove fragmente.

1

Na primer, tehnike imunodetekcije mogu uključivati, ali se ne ograničavaju na enzimske imunotestove (ELISA) (uključujući, ali ne ograničavajući se na standardni sendvič ELISA ili premošćujući ELISA), radioimunotestove (RIA), imunoradiometrijske testove, fluoroimuno testove, hemiluminiscentne testove, bioluminiscentne testove, radioimunoprecipitacione testove (RIPA) i Western blotove. Pored toga, tehnike imunodetekcije mogu uključivati postupke zasnovane na optičkim senzorima, kao što su rezonancija površinskog plazmona (SPR) ili talasovodni rezonancioni filter (BIND). Iako se određeni ovde dati primeri odnose na testove koji koriste imobilisani natalizumab prikačeno za podlogu (npr. ELISA), prosečno obučeni stručnjak u oblasti prepoznaće da opis u nekim aspektima može uključivati testove bez prikačinjanja natalizumaba za podlogu (npr. protočno-citometrijske testove, itd.). Druge tehnike imunodetekcije mogu uključivati imunoradiometrijske testove (IRMA), fluorometriju razloženu tokom vremena (TRF) ili elektrohemiluminicenciju (ECL). Brojni korisni imunodetekcioni postupci opisani su u naučnoj literaturi, kao npr. Doolittle M H and Ben-Zeev 0, 1999; Gulbis B and Galand P, 1993; De Jager R et al., 1993; i Nakamura et al., 1987.

[0051] U jednom aspektu, test se obavlja da bi se u biološkom uzorku detektovalo prisustvo vezujuće aktivnosti za natalizumab. U jednom primeru izvođenja, specifičnost vezujuće aktivnosti može da se evaluira određivanjem da li je zapažena vezujuća aktivnost specifična za natalizumab ili je rezultat interferirajućih faktora koji mogu biti prisutni u biološkom uzorku, kao što su reumatoidni faktor ili neki drugi vezujući faktor.

[0052] Aspekti opisa mogu uključivati test koji podrazumeva dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa imobilizacionom komponentom da bi se imobilisala sva vezujuća aktivnost prisutna u biološkom uzorku. Imobilisana vezujuća aktivnost može da se detektuje korišćenjem detekcione komponente. Imobilizaciona i detekciona komponenta mogu biti predstavljene imobilisanim neobeleženim odnosno neimobilisanim obeleženim natalizumabom, kako je opisano u ovom tekstu. U jednom primeru izvođenja, imobilizaciona komponenta može biti vezana za čvrst supstrat ili površinu (npr. u bunarčiću ploče sa više bunarčića, na površini ELISA ploče, itd.). U sledećem primeru izvođenja, imobilizaciona komponenta može biti prikačena za perlicu (npr. magnetna perlica) preko kovalentne ili druge veze (npr. imobilizaciona komponenta može biti konjugovana sa molekulom biotina i prikačena za perlicu obloženu streptavidinom preko interakcije biotin-streptavidin). U nekim primerima izvođenja, perlica može biti prikačena za podlogu ili matriks. Na primer, magnetna perlica može biti imobilisana na magnetnoj podlozi. Slično tome, naelektrisana perlica može biti imobilisana na naelektrisanoj podlozi (npr. elektroda).

[0053] Pozitivan rezultat može da se utvrdi ako je detektovana količina vezujuće aktivnosti (npr. količina vezujuće aktivnosti koja se zadrži na imobilizacionoj komponenti) veća od prethodno

2

određenog praga. Specifičnost detektovane vezujuće aktivnosti može da se evaluira tako što se kompeticiona komponenta uključi u test. Kompeticiona komponenta može biti neimobilisani neobeleženi natalizumab koje može biti uključeno da bi kompetiralo sa imobilizacionim i/ili detekcionim koracima testa. Ako prisustvo kompeticione komponente smanji vezujuću aktivnost za najmanje prethodno određeni procenat ili graničnu vrednost, vezujuća aktivnost se određuje kao specifična i potvrđuje se pozitivan rezultat. Ako prisustvo kompeticione komponente ne smanji vezujuću aktivnost za najmanje prethodno određeni procenat ili graničnu vrednost, vezujuća aktivnost se određuje kao nespecifična i prvobitni pozitivni rezultat se sada određuje kao negativni rezultat za imunski odgovor.

[0054] Prema aspektima opisa, mogu se koristiti prethodno određene količine imobilizacionih, detekcionih i/ili kompeticionih komponenti. Slično tome, prvobitni nivo praga vezujuće aktivnosti može da se uspostavi korišćenjem uzorka koji sadrži prethodno određenu količinu antitela za koje se zna da se vezuje za natalizumab. Na primer, nivo praga može da se uspostavi korišćenjem npr. oko 500 ng kontrolnih antitela po ml testa. Količina antitela upotrebljenog za određivanje nivoa praga odrediće osetljivost testa. Uopšteno, može se smatrati da je osetljivost testa slična količini antitela koje se koristi za određivanje prvobitnog praga. Treba imati u vidu da količina vezivanja u kontroli može služiti kao referentna vrednost koja se koristi za određivanje praga (npr. pražna količina može biti višestruka vrednost ili deo vrednosti signala dobijenog u kontroli). Međutim, u jednom primeru izvođenja, signal dobijen u kontrolnom testu koristi se kao pražna količina. Isto tako, treba imati u vidu da na osetljivost testa mogu uticati brojni faktori, uključujući afinitet i specifičnost kontrolnog antitela.

[0055] U jednom primeru izvođenja, specifičnost vezujuće aktivnosti može da se evaluira „spajkovanjem“ testa količinom kompeticione komponente koja je slična količini kontrolnog antitela upotrebljenog za uspostavljanje nivoa praga vezivanja. Na primer, test može da se „spajkuje“ sa između oko 10 ng i 1000 ng (npr. oko 50 ng, ili oko 500 ng) neobeleženog solubilnog natalizumaba po ml testa. Međutim, mogu se koristiti i druge količine kompeticione komponente.

[0056] Prema tome, u nekim primerima izvođenja opisa, prvi nivo vezujuće aktivnosti, u biološkom uzorku, za natalizumab određuje se u prvom imunotestu za prvi alikvot biološkog uzorka, a drugi nivo vezujuće aktivnosti za natalizumab određuje se u drugom imunotestu za drugi alikvot biološkog uzorka, pri čemu se drugi alikvot „spajkuje“ većom količinom neobeleženog solubilnog natalizumaba nego prvi imunotest, i na prisustvo bar nivoa praga solubilnog antitela na natalizumab ukazano je ako je prvi nivo vezujuće aktivnosti veći od referentnog nivoa, a drugi nivo vezujuće aktivnosti manji od prethodno određenog procenta prvog nivoa vezujuće aktivnosti.

[0057] Uobičajeno obučeni stručnjak u oblasti prepoznaće da se mogu koristiti različiti postupci da bi se procenio i/ili pratio imunski odgovor subjekta koji je bio lečen terapijskim antitelom, kao što je natalizumab. Na primer, kao što je gore opisano, procenjivanje i/ili praćenje mogu se vršiti određivanjem količine antitela koje se specifično vezuje za natalizumab, korišćenjem jednostepene „granične vrednosti“. Kako se koristi u ovom tekstu, granični nivo vezivanja je nivo iznad kojeg se povećana detekcija ocenjuje kao značajna i/ili pozitivna i potvrđuje se da detekcija nivoa solubilne vezujuće aktivnosti u biološkom uzorku odražava nivo antitela koje se specifično vezuje za natalizumab u uzorku. U drugim primerima izvođenja, identifikacija imunskog odgovora na natalizumab može da se izvede kvantitativno, određivanjem titra antitela koje se specifično vezuje za natalizumab u biološkom uzorku dobijenom od subjekta.

[0058] U jednom aspektu opisa, imunodetekcioni test može biti ELISA. Kao što će razumeti uobičajeno obučeni stručnjak u oblasti, pojam „ELISA“ obuhvata brojne protokole imunodetekcije. Na primer, ELISA metode uključuju sendvič ELISA, premošćujući ELISA test, itd. U nekim primerima izvođenja, ELISA imunotest je test koji se izvodi manuelno. Međutim, u nekim primerima izvođenja, ceo ili deo ELISA može da se izvede automatski.

[0059] U nekim primerima izvođenja pronalaska, ELISA test uključuje korišćenje natalizumaba kao imobilisane ciljne komponente kojom se oblaže ELISA ploča. Obložena ELISA ploča može zatim da se dovede u kontakt sa biološkim uzorkom kako bi se odredio nivo subjektovog antitela koje se specifično vezuje za natalizumab. U nekim primerima izvođenja, korišćenjem ELISA testa, testira se prvi alikvot biološkog uzorka da bi se utvrdilo prisustvo ili odsustvo pražne količine ili vezivanja za imobilisano ciljno natalizumab i drugi alikvot istog biološkog uzorka se takođe testira korišćenjem ELISA da se potvrdi da li nivo praga (ili iznad nivoa praga) vezivanja za imobilisani ciljni natalizumab ukazuje na antitelo specifično za natalizumab. U jednom aspektu opisa, nivo praga solubilne vezujuće aktivnosti u alikvotu je približno jednak nivou vezujuće aktivnosti prisutne u kontrolnom ili referentnom uzorku koji sadrži najmanje oko 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, ili 1000 ng po ml referentnog antitela koje se vezuje za natalizumab. U jednom primeru izvođenja, nivo praga određuje se kao približno jednak nivou vezujuće aktivnosti u kontrolnom ili referentnom uzorku koji sadrži oko 500 ng/ml referentnog antitela koje se vezuje za natalizumab. Referentno antitelo može biti poliklonsko ili monoklonsko. Referentno antitelo može biti mišje antitelo na natalizumab (npr. 12C4 opisano u Sheremata et al., 1999, Neurology 52, strane 1072-1074, uključeno u ovaj tekst kao referenca). Kako je opisano u ovom tekstu, ako je nivo vezivanja za imobilisani ciljni natalizumab najmanje na nivou praga, i solubilna vezujuća aktivnost je određena kao vezujuća aktivnost antitela koje se specifično vezuje za natalizumab, onda to označava imunski odgovor na natalizumab kod subjekta.

[0060] Uopšteno, ELISA metode korisne u postupcima prema pronalasku mogu uključivati dobijanje biološkog uzorka od subjekta kod kojeg je bio primenjeno terapijsko antitelo kao što je natalizumab i dovođenje u kontakt alikvota uzorka sa imobilizacionim antitelom. U nekim primerima izvođenja, imobilizaciono antitelo može biti natalizumab. Imobilizaciono antitelo zadržava molekule ili jedinjenja u uzorku, koji se vezuju za antitelo, i uzorak se dovodi u kontakt sa drugom detekcionom komponentom sposobnom za selektivno vezivanje ili detektovanje zadržanog molekula ili jedinjenja (npr. obeleženo drugo antitelo). Primeri komponenti sposobnih da se selektivno vežu ili detektuju kompleks uključuju, ali se ne ograničavaju na antitela ili druge ligande koji mogu da se obeleže korišćenjem različitih markera (npr. biotin/avidin ligand-vezujući aranžmani, kako je poznato u struci). Stručnjak u oblasti može koristiti i obeleženo treće antitelo. U poželjnim primerima izvođenja, druga komponenta je obeležena forma imobilizacionog antitela.

[0061] U nekim primerima izvođenja, ELISA test uključuje korišćenje natalizumaba kao imobilisane ciljne komponente kojom se oblaže ELISA ploča. Obložena ELISA ploča može zatim da se dovede u kontakt sa biološkim uzorkom kako bi se odredio nivo subjektovog antitela koje se specifično vezuje za natalizumab. U nekim primerima izvođenja pronalaska, prvi alikvot biološkog uzorka testira se korišćenjem ELISA testa da bi se odredilo prisustvo ili odsustvo pražne količine vezujuće aktivnosti za imobilisani ciljni natalizumab, a drugi alikvot istog biološkog uzorka testira se korišćenjem ELISA da se potvrdi da li nivo praga (ili iznad nivoa praga) vezivanja za imobilisani ciljni natalizumab ukazuje na antitelo specifično za natalizumab, ili ne. U jednom aspektu opisa, nivo praga solubilne vezujuće aktivnosti u alikvotu je približno jednak nivou vezujuće aktivnosti prisutne u kontrolnom ili referentnom uzorku koji sadrži najmanje oko 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, ili 1000 ng po ml referentnog antitela koje se vezuje za natalizumab. U jednom primeru izvođenja, nivo praga se određuje kao približno jednak nivou vezujuće aktivnosti u kontrolnom ili referentnom uzorku koji sadrži oko 500 ng/ml referentnog antitela koje se vezuje za natalizumab. Referentno antitelo može biti poliklonsko ili monoklonsko. Referentno antitelo može biti mišje antitelo na natalizumab (npr. 12C4 opisano u Sheremata et al.,1999, Neurology 52, strana 1072).

[0062] Referentno antitelo koje se vezuje za natalizumab može biti referentno antitelo koje se vezuje za natalizumab (na primer, antitelo koje se vezuje za natalizumab sa visokim afinitetom, npr. sa nanomolarnim afinitetom). U nekim primerima izvođenja, referentno antitelo koje se vezuje za natalizumab može blokirati vezivanje natalizumaba za VLA-4 (npr. može inhibirati vezivanje natalizumaba za VLA-4 za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, ili više). Referentno antitelo može biti mišje monoklonsko antitelo. Referentno antitelo može biti antiidiotipsko antitelo specifično za natalizumab. U nekim primerima izvođenja, referentno antitelo je 12C4 antitelo (može se nabaviti od Maine

2

Biotechnology Services, Inc., Portland ME; vidi, npr. Sheremata et al., 1999, Neurology 52, stara 1072). 12C4 je blokirajuće antitelo koje blokira vezivanje natalizumaba za VLA-4. U nekim primerima izvođenja, referentno antitelo kompetira sa 12C4 u vezivanju sa natalizumabom. Kompeticija antitela u vezivanju može da se pokaže korišćenjem standardnih postupaka za procenu sposobnosti antitela da kompetitivno inhibiraju sposobnost 12C4 antitela da blokira vezivanje natalizumaba za VLA-4. U nekim primerima izvođenja, prisustvo antitela koje se specifično vezuje za natalizumab određuje se korišćenjem premošćujućeg ELISA testa. U premošćujućem ELISA testu, antitela koja se specifično vezuju za natalizumab (npr. iz biološkog uzorka) deluju kao most između natalizumaba nanetog na ELISA ploču i detektabilno obeleženog natalizumaba u rastvoru (npr. neimobilisanog). Prema tome, ELISA signal posle standardne obrade ukazuje na to da je detektabilni obeleživač vezan za čvrstu fazu i da je u biološkom uzorku prisutna solubilna vezujuća aktivnost.

[0063] Dovođenje u kontakt alikvota biološkog uzorka sa imobilisanim antitelom pod efikasnim uslovima i tokom vremenskog perioda dovoljnog da omogući formiranje imunskih kompleksa (primarni imunski kompleksi) obično je pitanje dodavanja alikvota biološkog uzorka imobilisanom antitelu (npr. natalizumabu imobilisanom na ELISA ploči) i inkubiranja mešavine tokom vremenskog perioda dovoljno dugog da imobilisano antitelo formira imunski kompleks sa (tj. da se veže) molekulom ili jedinjenjem sa solubilnom vezujućom aktivnošću, prisutnim u alikvotu biološkog uzorka. Molekul ili jedinjenje sa solubilnom vezujućom aktivnošću može biti indukovano antitelo koje se specifično vezuje za natalizumab ili može biti neindukovano endogeno antitelo ili receptor koji se vezuje za natalizumab (npr. reumatoidni faktor [RF] ili anti-Fab antitelo). Posle tog vremena, mešavina uzorak-antitelo (npr. ELISA ploča, dot blot, ili western blot) će se obično oprati da bi se iz testne mešavine uklonile nevezane vrste antitela i/ili materijali.

[0064] Ako se detektuje vezujuća aktivnost na nivou praga, dodatni korak može obuhvatiti utvrđivanje da li vezujuća aktivnost ukazuje na indukovano antitelo koje se specifično vezuje za natalizumab, ili ne. Za ovaj korak utvrđivanja, drugi alikvot biološkog uzorka može da se pripremi i testira kao što je opisano za prvi alikvot, izuzev što se prethodno određena količina neimobilisanog neobeleženog kompeticionog natalizumaba takođe dodaje u test (npr. ELISA test). Na primer, prethodno određena količina kompeticionog antitela može biti neobeležena količina koja smanjuje specifični signal za oko 50% ili više u kontrolnom testu. Ukoliko prisustvo neobeleženog natalizumaba smanji signal za više od očekivane procentne vrednosti, onda se pražna (ili iznad praga) vezujuća aktivnost ocenjuje kao pozitivni pokazatelj prisustva antitela koje se specifično vezuje za natalizumab. Nasuprot tome, ako prisustvo neobeleženog natalizumaba smanjuje signal za manje od očekivane procentne vrednosti, onda se pražna (ili iznad praga) vezujuća aktivnost ocenjuje kao negativna za antitelo koje se specifično vezuje za natalizumab. Treba imati u vidu da nespecifični signal može biti rezultat serumskih faktora različitih od antitela koje se vezuje za natalizumab. Kako se koristi u ovom tekstu, izrazi „spajk“ ili „spajkovan“ odnose se na dodavanje neobeležnog (ili drugačije obeleženog) solubilnog kompeticionog natalizumaba u uzorak ili test.

[0065] Kako se koristi u ovom tekstu, „procentno smanjenje“ je procenat nivoa vezivanja određenog u prvom alikvotu. Tako, na primer, ukoliko se u prvom alikvotu ukaže na prisustvo oko 500 ng/ml ekvivalenta molekula ili jedinjenja sa vezujućom aktivnošću i uključivanje neobeleženog natalizumaba u drugom alikvotu smanji količinu signala za više od 40-90% (npr. za oko 50% ili više, za oko 55% ili više, za oko 60% ili više, za oko 65% ili više, za oko 70% ili više, za oko 75% ili više, za oko 80% ili više, za oko 85% ili više, za oko 90% ili više), smatra se da vezujuća aktivnost u biološkom uzorku ukazuje na prisustvo indukovanog antitela koje se specifično vezuje za natalizumab. Ali, ako uključivanje neobeleženog natalizumaba u drugom alikvotu smanji količinu signala za manje od 20-40%, onda se smatra da vezujuća aktivnost u biološkom uzorku ne ukazuje na prisustvo indukovanog antitela koje se specifično vezuje za natalizumab. U nekim primerima izvođenja, kompeticiono antitelo može da bude solubilni neobeleženi natalizumab. U nekim primerima izvođenja, solubilni neobeleženi natalizumab može da se koristi u finalnoj koncentraciji od oko 100 μg/ml. Međutim, može se koristiti bilo koja koncentracija slobodnog neobeleženog natalizumaba ako rezultuje prethodno određenim smanjenjem (npr. oko 40%, oko 50%, ili više) signala dobijenog za kontrolni uzorak koji sadrži kontrolnu količinu referentnog antitela. Na primer, kontrolni uzorak može sadržati oko 500 ng/ml, oko 3 μg/ml ili bilo koju drugu pogodnu količinu referentnog antitela (npr. 12C4). Kako je naznačeno u ovom tekstu, prisustvo, u biološkom uzorku dobijenom od pacijenta, antitela koje se specifično vezuje za natalizumab ukazuje na to da subjekt ima klinički značajan imunski odgovor na natalizumab.

[0066] U primeru „sendvič“ ELISA, natalizumab može da se koristi kao ciljno antitelo i može da se imobiliše na odabranoj podlozi koja pokazuje afinitet ka proteinu, kao što je bunarčić na polistirenskoj mikrotitarskoj ploči. Zatim se u bunarčiće doda uzorak dobijen od subjekta koji je najmanje jednom primio natalizumab. Posle vezivanja i/ili ispiranja da bi se uklonili nevezani materijali, mogu se detektovati vezujući molekuli ili jedinjenja vezana za ciljno antitelo. Detekcija može da se postigne dodavanjem drugog antitela koje je povezano sa detektabilnim obeleživačem. Pored toga, identitet vezujućeg molekula ili jedinjenja kao antitela koje se specifično vezuje za natalizumab može da se potvrdi kako je opisano ranije u ovom tekstu.

[0067] Kao što će razumeti prosečno obučeni stručnjak u oblasti, uprkos individualnim osobinama

2

(npr. koraci potvrđivanja, opisani u ovom tekstu), uopšteno, za ELISA testove određene osobine su zajedničke, npr. oblaganje, inkubiranje i vezivanje, ispiranje da bi se uklonile nespecifično vezane vrste, i detektovanje vezanih imunskih kompleksa.

[0068] Pri oblaganju ploče antigenom ili antitelom, bunarčići ploče će se obično inkubirati sa rastvorom ciljnog antitela, preko noći ili tokom određenog broja sati. Pufer za oblaganje može biti natrijum fosfat/BSA oblažući pufer ili drugi pogodan pufer za oblaganje poznat u struci. Bunarčići ploče će se zatim isprati da bi se uklonio nepotpuno adsorbovani materijal. Sva preostala raspoloživa površina bunarčića se zatim „obloži“ nespecifičnim proteinom koji je antigenski neutralan u odnosu na testni uzorak. Ovaj protein može da bude goveđi serum albumin (BSA), kazein ili rastvor mleka u prahu, itd. Oblaganje omogućava blokiranje nespecifičnih mesta apsorpcije na imobilišućoj površini i time smanjuje pozadinski signal izazvan nespecifičnim vezivanjem antiseruma za površinu.

[0069] U ELISA, mogu da se koriste sredstva sekundarne ili tercijarne detekcije ili mogu da se koriste sredstva direktne detekcije. Kada se koriste sekundarni ili tercijarni postupci detekcije, posle vezivanja proteina ili antitela za bunarčić, oblaganja nereaktivnim materijalom da bi se redukovao pozadinski signal (npr. blokirajućim puferom kao što je Tris-saharozni blokirajući pufer ili drugi blokirajući pufer poznat u struci) i ispiranja da bi se uklonio nevezani materijal, imobilišuća površina se dovodi u kontakt sa biološkim uzorkom koji se testira pod uslovima koji dopuštaju formiranje imunskog (antigen/antitelo) kompleksa. Detekcija imunskog kompleksa zatim zahteva obeleženi sekundarni vezujući ligand ili antitelo i sekundarni vezujući ligand ili antitelo zajedno sa obeleženim tercijarnim antitelom ili trećim vezujućim ligandom. U poželjnim primerima izvođenja, drugi vezujući ligand je natalizumab (npr. isti natalizumab koji je korišćen kao ciljno antitelo).

[0070] Kako se koristi u ovom tekstu, pojam „pod uslovima koji dopuštaju formiranje imunskog kompleksa“ znači da uslovi poželjno uključuju razblaživanje antigena i/ili antitela rastvorom kao što su BSA, goveđi gama-globulin (BGG), fosfatom puferisani slani rastvor (PBS)/Tween, PBS sa kazeinom i Tween 20, ili PBS/BSA pufer sa Tween 20. U postupcima prema pronalasku mogu da se koriste različiti drugi u struci poznati razblaživači za testove. Ova dodatna sredstva imaju i tendenciju da doprinesu redukciji nespecifičnog pozadinskog signala i mogu uključivati do 0.5 M NaCl.

[0071] Kako se koristi u ovom tekstu, „pogodni“ uslovi znači da se inkubacija obavlja na temperaturi ili tokom vremenskog perioda koji su dovoljni da omoguće efikasno vezivanje. Koraci inkubacije iznose tipično od oko 1 do 2 do 4 sata ili slično, na temperaturama poželjno reda 25 ºC do 27 ºC, ili preko noći na oko 4 ºC. U postupcima prema pronalasku se mogu koristiti različite

2

testne temperature i parametri vremena, poznati u struci.

[0072] Posle koraka inkubacije u ELISA, površina za kontakt se ispere da bi se uklonio nevezani materijal. Poželjan postupak ispiranja može uključivati ispiranje rastvorom kao PBS/Tween, TBS/Tween, ili boratni pufer, koji mogu uključivati i do 0.5 M NaCl. Posle formiranja specifičnih imunskih kompleksa između testnog uzorka i ciljnog antitela, i ispiranja koje sledi, može se utvrditi prisustvo čak i veoma malih količina imunskih kompleksa. Razume se da u postupcima prema opisu mogu da se koriste dodatne u struci poznate formulacije za ispiranje.

[0073] Da bi se obezbedila sredstva za detektovanje, drugo ili treće antitelo će imati pridruženi detektabilni obeleživač. U određenim primerima izvođenja, detektabilni obeleživač je enzim koji će dovesti do razvijanja boje posle inkubiranja sa pogodnim hromogenim supstratom. Tako, na primer, prvi i drugi imunski kompleks se mogu dovesti u kontakt ili inkubirati sa antitelom koje je konjugovano sa ureazom, glukoza-oksidazom, alkalnom fosfatazom, vodonik-peroksidazom, ili drugim konjugovanim antitelom, tokom perioda vremena i pod uslovima koji favorizuju razvijanje daljeg formiranja imunskog kompleksa (npr. inkubacija tokom 2 sata na sobnoj temperaturi, u rastvoru koji sadrži PBS, kao što je PBS-Tween).

[0074] Isto tako, stručnjak u oblasti će razumeti da se u postupcima prema opisu mogu koristiti jedna ili više pozitivnih ili negativnih kontrola kvaliteta. Uzorak za pozitivnu kontrolu kvaliteta može biti normalni uzorak seruma koji sadrži prethodno određenu količinu antitela za koje je poznato da se vezuje za natalizumab. Uzorci za kontrolu kvaliteta mogu da reaguju paralelno i pod istim uslovima kao i biološki i kontrolni uzorci testa i obezbeđuju meru funkcije testa. Uzorak za negativnu kontrolu kvaliteta može biti uzorak seruma za koji se zna da ne sadrži antitelo za koje se zna da se vezuje za natalizumab. Uobičajeno obučeni stručnjak će razumeti kako da koristi pozitivne i negativne kontrolne reakcije i uzorke u ELISA da bi osigurao i validirao funkcionalnost rastvora i/ili supstrata i/ili protokola koji se koriste u testu. Na primer, pozitivna kontrola može uključivati poznatu količinu antitela koje se specifično vezuje za natalizumab tako da, kada se tretira pod istim uslovima kao testni uzorak (npr. biološki uzorak), ukazuje na to da test radi unutar očekivanih parametara. Primer negativne kontrole može biti uzorak za koji se zna da ne sadrži antitelo koje se specifično vezuje za natalizumab. Takva negativna kontrola, kada se tretira pod istim uslovima kao testni uzorak (npr. biološki uzorak), pokazaće da vezivanje detektovano u biološkom uzorku nastaje od biološkog uzorka a ne od kontaminirajućih testnih komponenti ili drugih faktora koji nisu udruženi sa biološkim uzorkom. Neograničavajući primer testa obuhvaćnog postupcima prema opisu može uključivati sledeće postupke. Oblaganje bunarčića ELISA ploče rastvorom od oko 0.25 μg/ml natalizumab-referentnog standarda u puferu i inkubiranje obložene ploče preko noći na sobnoj temperaturi; ispiranje bunarčića ploče najmanje

2

jednom, puferom za ispiranje, i inkubiranje bunarčića ploče blokirajućim puferom najmanje 1 sat na sobnoj temperaturi; razblaživanje kontrolnih uzoraka i skrining uzoraka za oko 1:10 u testnom razblaživaču; razblaživanje kompeticionih uzoraka i natalizumaba (na oko 1 mg/ml) zajedno u testnom razblaživaču do finalne koncentracije natalizumaba od oko 100 μg/ml i oko 1:10 finalnog razblaženja kompeticionih uzoraka; inkubiranje kontrolnih uzoraka, skrining uzoraka i kompeticionih uzoraka oko 1 sat na sobnoj temperaturi i najmanje jedno ispiranje bunarčića ploče puferom za ispiranje; inkubiranje uzoraka u bunarčićima ploče između oko 60 i 150 minuta na sobnoj temperaturi i ispiranje bunarčića ploče najmanje tri puta puferom za ispiranje; dodavanje oko 1001 μl/bunarčiću ploče biotinizovanog natalizumaba razblaženog na oko 1:1000 u testnom razblaživaču, inkubiranje ploče oko 60-90 min na sobnoj temperaturi, i ispiranje bunarčića ploče najmanje tri puta puferom za ispiranje; dodavanje streptavidin-peroksidaze rena razblažene oko 1:5000 u testnom razblaživaču uzorcima u bunarčićima ploče, inkubiranje ploče oko 60-90 min na sobnoj temperaturi, i ispiranje bunarčića ploče najmanje tri puta puferom za ispiranje, dodavanje dovoljne količine supstrata koji proizvodi boju u bunarčiće ploče, da bi se vizuelizovalo vezivanje antitela, razvijanje ploče tokom nekoliko minuta na sobnoj temperaturi, zaustavljanje razvijanja dodavanjem 1 N H2SO4 u bunarčiće ploče; i očitavanje bunarčića na ploči čime se mogu dobiti rezultati.

[0075] Razmatra se takođe da ovde opisani ELISA reagensi mogu biti upakovani u kit koji može komercijalno da se proizvede, kako bi se u biološkom uzorku detektovali prisustvo i/ili mera antitela koje se specifično vezuje za natalizumab, kako je ovde opisano.

[0076] Treba takođe razumeti da kontrole za korišćenje u pronalasku mogu uključivati, pored prethodno određenih vrednosti (kao što su klinički značajne vrednosti praga identifikovane kako je ovde opisano za određeni terapijski protein), uzorke materijala koji se testiraju paralelno sa eksperimentalnim materijalima. Primeri uključuju negativne kontrolne uzorke (npr. napravljene tokom izrade) koji će se testirati paralelno sa eksperimentalnim uzorcima.

[0077] Kako se koristi u ovom tekstu, biološki uzorak može biti krv, plazma ili serum. Kako se koristi u ovom tekstu, biološki uzorak se može dobiti korišćenjem metoda dobro poznatih stručnjacima koji su prosečno obučeni u srodnim oblastima medicine. Biološki uzorak se može dobiti direktno od subjekta ili se može dobiti iz kulture ćelija, tkiva ili druge kulture. Biološki uzorak može biti svež ili pre korišćenja u postupcima prema pronalasku može biti uskladišten pod pogodnim uslovima (npr. smrznut, ohlađen, itd.).

[0078] Treba imati u vidu da se biološki uzorak može dobiti od subjekta u različitim vremenskim intervalima posle primene natalizumaba. Međutim, natalizumab može imati karakteristični in vivo poluživot i količina slobodnog natalizumaba prisutnog u biološkom uzorku tipično će se smanjivati

2

u funkciji vremena, posle primene natalizumaba kod subjekta. Prisustvo slobodnog natalizumaba (neobeleženog i neimobilisanog) u biološkom uzorku može da interferira sa reakcijama vezivanja i detekcije pronalaska. Prema tome, biološki uzorci bi trebalo da se uzimaju što je moguće duže vreme posle terapijske primene, na primer pri „koncentracionom minimumu“ u ciklusu tretmana. „Koncentracioni minimum“ predstavlja najniže količine natalizumaba prisutne u subjektu tokom ciklusa tretmana. Koncentracioni minimum se zapaža, na primer, posle dužeg vremena od jedne terapijske primene i neposredno pre sledeće terapijske primene. Treba imati u vidu da na vreme uspostavljanja koncentracionog minimuma mogu uticati mnogi faktori, uključujući količinu sredstva koje se primenjuje, poluživot sredstva, učestalost primene, itd. Na primer, mesečna primena natalizumaba (npr.300 mg natalizumaba) rezultuje koncentracionim minimumom oko 30 dana posle jedne primene i neposredno pre sledeće primene. Međutim, treba imati u vidu da testovi pronalaska mogu da se obave na uzorcima koji su uzeti u različitim vremenima posle primene tretmana, uz uslov da su testovi relativno neosetljivi ili ne beleže prisustvo slobodnog natalizumaba u biološkom uzorku. Kada se nivoi vezujuće aktivnosti upoređuju za različite uzorke uzete u različitim vremenskim tačkama, može biti od posebne važnosti da se svaki uzorak dobije iz sličnog stadijuma ciklusa lečenja (npr. slična dužina vremena proteklog od terapijske primene) tako da rezultati mogu da se interpretiraju bez potrebe za korigovanjem razlika u nivoima slobodnog natalizumaba u biološkim uzorcima.

[0079] Treba imati u vidu da biološki uzorci mogu da se razblaže pre nego što se testiraju (npr.2 puta, 5 puta, 10 puta, 50 puta, 100 puta, i uključujući više ili niže vrednosti umnoška ili bilo koje doze umnoška između). U jednom primeru izvođenja, referentni uzorak koji sadrži klinički značajnu pražnu količinu referentnog antitela može da se razblaži istom količinom kao biološki uzorak koji se testira, tako da signal dobijen za biološki uzorak može direktno da se uporedi sa signalom dobijenim za referentni uzorak.

[0080] U nekim primerima izvođenja, koriste se jedan ili više alikvota biološkog uzorka. Kako se ovde koristi, pojam „alikvot“ označava porciju ili deo biološkog uzorka. U nekim primerima izvođenja, od biološkog uzorka dobijenog od subjekta mogu se uzeti dva ili više alikvota i alikvoti se mogu testirati korišćenjem postupaka prema pronalasku da bi se kod subjekta odredilo prisustvo imunskog odgovora na natalizumab. Na primer, dva suštinski ekvivalentna alikvota mogu se uzeti od biološkog uzorka dobijenog od subjekta kod kojeg je primenjen natalizumab i nivo solubilna vezujuće aktivnosti može da se detektuje u jednom alikvotu (npr. „prvi“ alikvot). Dodatno, drugi alikvot (npr. „drugi“ alikvot) može da se procenjuje korišćenjem postupaka prema pronalasku da bi se odredilo da li je solubilna vezujuća aktivnost detektovana u prvom alikvotu, koja bi trebalo da bude prisutna i u drugom alikvotu na osnovu njihovog zajedničkog uzoračkog porekla, antitelo

2

koje se specifično vezuje za natalizumab. U nekim primerima izvođenja, ako je u prvom alikvotu prisutan najmanje nivo praga vezujuće aktivnosti i solubilna vezujuća aktivnost se određuje kao aktivnost antitela koje se specifično vezuje za natalizumab, to ukazuje da je kod subjekta prisutan imunski odgovor na natalizumab.

VLA-4-vezujuća antitela

[0081] Aspekti opisa odnose se na detekcioni test/testove za identifikovanje i/ili praćenje imunskog odgovora na natalizumab primenjen kod subjekta. U određenim aspektima, detekcioni test uključuje i imobilizacionu i detekcionu komponentu. U određenim primerima izvođenja, detekcioni test može uključivati i kompeticionu komponentu. Kao što je ovde opisano, imobilizaciona komponenta može da se koristi za imobilisanje indukovanog antitela (npr. serumskog antitela) koje se vezuje za natalizumab. Detekciona komponenta može da se koristi za detektovanje imobilisanog antitela. Kompeticiona komponenta može da se koristi da kompetira sa imobilizacionom i/ili detekcionom komponentom u vezivanju sa indukovanim antitelom, da bi se odredila specifičnost vezivanja za indukovano antitelo. Imobilizaciona i detekciona komponenta mogu da se vezuju nezavisno za jedno ili više antitela koja su karakteristična za imunski odgovor na natalizumab. Prema tome, imobilizaciona i detekciona komponenta mogu biti isti natalizumab koji je primenjen kod subjekta (npr. imobilizaciona komponenta može biti imobilisana forma natalizumaba koji je bio primenjen kod subjekta i detekciona komponenta može biti obeležena forma natalizumaba koji je bio primenjen kod subjekta). Međutim, u drugim primerima izvođenja, imobilizaciona i detekciona komponenta, svaka nezavisno, mogu biti varijante natalizumaba primenjenog kod subjekta, uz uslov da se imobilizaciona i detekciona komponenta vezuju sa odgovarajućim afinitetom da bi se detektovalo jedno ili više indukovanih antitela (npr. serumska antitela) protiv natalizumaba. Kompeticiona komponenta je tipično solubilna neobeležena (ili različito obeležena) forma imobilizacione ili detekcione komponente. Međutim, kompeticiona komponenta može biti varijanta imobilizacione ili detekcione komponente, uz uslov da kompetira u zadovoljavajućoj meri za vezivanje sa natalizumabom, da bi se odredila specifičnost vezujuće aktivnosti detektovane u testu.

[0082] Prema aspektima opisa, natalizumab može da se koristi terapijski. Prema tome, u detekcionom testu opisa natalizumab može da se koristi kao imobilizaciona, detekciona i/ili kompeticiona komponenta.

[0083] Natalizumab i srodna VLA-4 vezujuća antitela opisana su, npr. u US 5,840,299. mAb 21.6 i HP1/2 su primeri mišjih monoklonskih antitela koja se vezuju za VLA-4. Natalizumab je humanizovana verzija mišjeg mAb 21.6 (vidi, npr. US patent br. 5,840,299). Humanizovana verzija HP1/2 takođe je opisana (vidi, npr. US patent br.6,602,503). Opisano je nekoliko dodatnih VLA-4 vezujućih monoklonskih antitela, kao HP2/1, HP2/4, L25 i P4C2 (npr. u US patentu br.

6,602,503; Sanchez-Madrid et al., 1986 Eur. J. Immunol., 16:1343-1349; Hemler et al., 1987 J. Biol. Chem. 2:114778-11485; Issekutz and Wykretowicz, 1991, J. Immunol., 147:109 (TA-2 mab); Pulido et al., 1991 J. Biol. Chem., 266(16):10241-10245; i US patentu br. 5,888,507). Mnoga korisna VLA-4 vezujuća antitela interaguju sa VLA-4 na ćelijama, npr. limfocitima, ali ne dovode do agregacije ćelija. Međutim, zapaženo je da druga anti-VLA-4 vezujuća antitela dovode do takve agregacije. HP1/2 ne dovodi do agregacije ćelija. HP1/2 MAb (Sanchez-Madrid et al., 1986 Eur. J. Immunol.,16:1343-1349) ima izuzetno visoku potenciju, blokira VLA-4 interakciju sa VCAM1 i fibronektinom, i ima specifičnost za epitop B na VLA-4. Ovo antitelo i druga B epitop-specifična antitela (kao B1 ili B2 epitop vezujuća antitela; Pulido et al., 1991 J. Biol. Chem., 266(16):10241-10245) predstavljaju jednu klasu korisnih VLA-4 vezujućih antitela.

[0084] Izračunavanja „homologije“ ili „identičnosti sekvenci“ između dve sekvence (pojmovi se u ovom tekstu koriste naizmenično) obavljaju se na sledeći način. Sekvence se poravnavaju u svrhu optimalnog poređenja (npr. za optimalno poravnavanje, procepi mogu da se uvedu u jednu ili obe sekvence aminokiselina ili nukleinskih kiselina, i nehomologe sekvence mogu da se zanemare u svrhu upoređivanja). Optimalno poravnavanje se određuje kao najbolji skor korišćenjem GAP programa u GCG softverskom paketu sa Blossum 62 matricom skora, sa kaznom za procep od 12, kaznom za ekstenziju procepa od 4 i kaznom za „frameshift“ (pomeraj okvira čitanja) procep od 5. Zatim se upoređuju aminokiselinske rezidue ili nukleotidi na odgovarajućim aminokiselinskim pozicijama. Kada je pozicija u prvoj sekvenci zauzeta istom aminokiselinskom reziduom ili nukleotidom kao na odgovarajućoj poziciji u drugoj sekvenci, onda su molekuli identični na toj poziciji (ovde: aminokiselinska ili nukleinskokiselinska „identičnost“ ekvivalentna je aminokiselinskoj ili nukleinskokiselinskoj „homologiji“). Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija zajedničkih za sekvence.

[0085] Obučeni stručnjak će razumeti da u VLA-4 vezujućim antitelima mogu da se naprave konzervativne supstitucije amino-kiselina da bi se obezbedile funkcionalno ekvivalentne varijante antitela, tj. varijante koje zadržavaju funkcionalne sposobnosti VLA-4 polipeptida. Kako se ovde koristi, „konzervativna aminokiselinska supstitucija“ odnosi se na aminokiselinsku supstituciju koja ne menja karakteristike relativnog naelektrisanja ili veličine proteina u kojem je aminokiselinska supstitucija napravljena. Varijante mogu da se pripreme postupcima za menjanje sekvence polipeptida poznate prosečno obučenim stručnjacima u oblasti, kao što su one koje se mogu naći u referencama u kojima su zbirno prikazani takvi postupci, npr. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, ili Current Protocols in Molecular Biology, F.M.

1

Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York. Primeri funkcionalno ekvivalentnih varijanti VLA-4 vezujućih antitela uključuju konzervativne aminokiselinske supstitucije aminokiselinskih sekvenci proteina opisanih u ovom tekstu. Konzervativne aminokiselinske supstitucije uključuju supstitucije napravljene među aminokiselinama unutar sledećih grupa: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; i (g) E, D.

[0086] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz „hibridizuje se pod visoko stringentnim uslovima“, opisuje uslove hibridizacije i ispiranja. Uputstva za obavljanje reakcija hibridizacije mogu se naći u Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Vodeni i nevodeni postupci opisani su u toj referenci i mogu se koristiti i jedni i drugi. Visoko stringentni uslovi hibridizacije uključuju hibridizaciju u 6X SSC na oko 45 °C, praćeno jednim ili više ispiranja u 0.2X SSC, 0.1% SDS na 65 °C, ili suštinski slične uslove.

[0087] Antitela mogu da se testiraju u pogledu funkcionalnih osobina, npr. VLA-4 vezivanja, npr. kako je opisano u US patentu br.6,602,503.

Stvaranje antitela

[0088] Antitela koja se vezuju za VLA-4 mogu da se stvore imunizacijom, npr. korišćenjem životinje. Kao imunogen može se koristiti ceo VLA-4 ili njegov deo. Na primer, kao imunogen može da se koristi vanćelijski region alfa-4 podjedinice. U jednom primeru izvođenja, imunizovana životinja sadrži ćelije koje proizvode imunoglobulin sa prirodnim, humanim, ili delimično humanim imunoglobulinskim lokusima. U jednom primeru izvođenja, nehumana životinja sadrži bar deo humanog imunoglobulinskog gena. Na primer, moguće je inženjerisati sojeve miševa deficijentnih u proizvodnji mišjih antitela, sa velikim fragmentima humanih Ig lokusa. Korišćenjem tehnologije hibridoma, mogu da se proizvedu i selektuju antigen-specifična monoklonska antitela izvedena iz gena sa željenom specifičnošću. Vidi, npr. XenoMouse™, Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994), US objavljena patentna prijava br.2003-0070185, US patent br. 5,789,650, i WO 96/34096. Nehumana antitela na VLA-4 takođe mogu da se proizvedu, npr. u glodaru. Nehumano antitelo može biti humanizovano, npr. kao što je opisano u US patentu br.

6,602,503, EP 239400, US patentu br.5,693,761 i US patentu br.6,407,213.

[0089] EP 239 400 (Winter et al.) opisuje menjanje antitela supstitucijom (unutar datog varijabilnog regiona) njihovih regiona koji određuju komplementarnost (CDR) jedne vrste onim iz druge. Za CDR-supstituisana antitela se pretpostavlja da je manje verovatno da će izazvati imunski odgovor kod ljudi u poređenju sa istinski himernim antitelima zato što CDR-supstituisana antitela sadrže znatno manje nehumanih komponenti. (Riechmann et al., 1988, Nature 332,323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536). Tipično, CDR mišjeg antitela supstituišu se u odgovarajuće regione humanog antitela korišćenjem tehnologije rekombinantne nukleinske

2

kiseline da se proizvedu sekvence koje kodiraju željeno antitelo. Mogu se dodati genski segmenti humanih konstantnih regiona željenog izotipa (obično gama I za CH i kapa za CL), i geni za humanizovani teški i laki lanac se koeksprimiraju u sisarskim ćelijama da se proizvede solubilno humanizovano antitelo.

[0090] Queen et al., 1989 Proc Natl Acad Sci U S A. Dec; 86 (24):10029-33 i WO 90/07861 opisuju postupak koji uključuje izbor humanih V okvirnih regiona putem kompjuterske analize za optimalnu homologiju proteinske sekvence sa V okvirnim regionom originalnog mišjeg antitela, i modelovanje tercijarne strukture mišjeg V regiona za vizuelizaciju okvirnih aminokiselinskih rezidua za koje je verovatno da interaguju sa mišjim CDR. Ove mišje aminokiselinske rezidue se zatim superponiraju na homologi humani okvir. Vidi i US patente br. 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; i 5,530,101. Tempest et al., 1991, Biotechnology 9,266-271 koriste kao standard, okvire V regiona izvedene iz NEWM i REI teškog i lakog lanca, respektivno za CDR-graftovanje bez radikalnog uvođenja mišjih rezidua. Prednost korišćenja pristupa Tempest et al., za konstruisanje NEWM i REI-baziranih humanizovanih antitela je to što su trodimenzionalne strukture NEWM i REI varijabilnih regiona poznate na osnovu kristalografije x-zracima, pa tako mogu da se modeluju specifične interakcije između CDR i okvirnih rezidua V regiona.

[0091] Nehumana antitela mogu da se modifikuju tako da uključe supstitucije kojima se insertuju humane imunoglobulinske sekvence, npr. konsenzusne humane aminokiselinske rezidue na određenim pozicijama, npr. na jednoj ili više od sledećih pozicija (poželjno najmanje na pet, deset, dvanaest, ili na svim): (u FR varijabilnog domena lakog lanca) 4L, 35L, 36L, 38L, 43L, 44L, 58L, 46L, 62L, 63L, 64L, 65L, 66L, 67L, 68L, 69L, 70L, 71L, 73L, 85L, 87L, 98L, i/ili (u FR varijabilnog domena teškog lanca) 2H, 4H, 24H, 36H, 37H, 39H, 43H, 45H, 49H, 58H, 60H, 67H, 68H, 69H, 70H, 73H, 74H, 75H, 78H, 91H, 92H, 93H, i/ili 103H (prema Kabat-ovom numerisanju). Vidi, npr. US patent br.6,407,213.

[0092] Kao što će uobičajeno obučeni stručnjak u oblasti zapaziti, predmetni opis takođe obezbeđuje F(ab’)2, Fab, Fv i Fd fragmente; himerna antitela u kojima su Fc i/ili FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 i/ili lakolančani CDR3 regioni zamenjeni homologim humanim ili nehumanim sekvencama; himerna F(ab’)2 fragmentna antitela u kojima su FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 i/ili lakolančani CDR3 regioni zamenjeni homologim humanim ili nehumanim sekvencama; himerna Fab fragmentna antitela u kojima su FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 i/ili lakolančani CDR3 regioni zamenjeni homologim humanim ili nehumanim sekvencama; i himerna Fd fragmentna antitela u kojima su FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 regioni zamenjeni homologim humanim ili nehumanim sekvencama.

[0093] Karakteristike svakog od ovih tipova antitela i postupci njihove upotrebe dobro su poznati u struci. Nanobodies™ su najmanji funkcionalni fragmenti antitela i izvedeni su iz prirodnih jednolančanih antitela (vidi Ablynx, Belgium; ablynx.com). Nanobody™ tehnologija je razvijena posle otkrića da kamelide (kamile i lame) poseduju jedinstveni repertoar potpuno funkcionalnih antitela kojima nedostaju laki lanci. Struktura Nanobody™ sastoji se od jednog varijabilnog domena (VHH), zglobnog regiona, i dva konstantna domena (CH2 i CH3). Klonirani i izolovani VHH domen je stabilan polipeptid koji nosi puni antigen-vezujući kapacitet originalnog teškog lanca. Nanobodies™ kombinuju osobine konvencionalnih antitela sa osobinama lekova sa malim molekulima. Nanobodies™ pokazuju visoku specifičnost za cilj i nisku inherentnu toksičnost. Pored toga, Nanobodies™ su veoma stabilna, mogu da se daju na načine različite od injektiranja, i lako se proizvode.

Proizvodnja antitela

[0094] Potpuno humana monoklonska antitela koja se vezuju za VLA-4 mogu da se proizvedu, npr. korišćenjem in vitro-podstaknutih humanih splenocita, kao što su opisali Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147, 86-95. Oni se mogu pripremiti kloniranjem repertoara kao što su opisali Persson et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88: 2432-2436 ili Huang and Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227-236. US 5,798,230. Velike neimunizovane humane biblioteke prikazivanja na fagima takođe mogu da se koriste za izolaciju visokoafinitetnih antitela koja mogu da se razvijaju kao humani terapeutici, korišćenjem standardne tehnologije faga (vidi, npr. Vaughan et al, 1996 Nat Biotechnol. Mar;14(3):309-14; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; i Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8; US objavljena patentna prijava br. 2003-0232333). Antitela mogu da se proizvedu u prokariotskim i eukariotskim ćelijama. U jednom primeru izvođenja, antitela (npr. scFv) se eksprimiraju u ćeliji kvasca kao Pichia (vidi, npr. Powers et al. (2001) J Immunol Methods. 251:123-35), Hanseula, ili Saccharomyces. Antitela posebno antitela pune dužine, npr. IgG, proizvode se u ćelijama sisara. Primeri sisarskih ćelija-domaćina za rekombinantnu ekspresiju uključuju ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući dhfr-CHO ćelije opisane u Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, korišćene sa DHFR selektabilnim markerom, npr. kako je opisano u Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), limfocitne ćelijske linije, npr. NS0 mijeloma ćelije i SP2 ćelije, COS ćelije, K562, i ćelije iz transgene životinje, npr. transgenog sisara. Na primer, ćelija je epitelna ćelija sisara.

[0095] Pored sekvence nukleinske kiseline koja kodira domen imunoglobulina, rekombinantni ekspresioni vektori mogu nositi dodatne sekvence kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama-domaćinima (npr. mesto početka replikacije) i selektabilne markerske gene. Selektabilni markerski geni olakšavaju izbor ćelija-domaćina u koje će se vektor introdukovati

4

(vidi, npr. US patenti br.4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017). Primeri selektabilnih markerskih gena uključuju gen za dihidrofolat-reduktazu (DHFR) (za korišćenje u dhfr- ćelijama-domaćinima sa metotreksat selekcijom/amplifikacijom) i neo gen (za selekciju G418).

[0096] U sistemu za rekombinantnu ekspresiju antitela (npr. antitelo pune dužine ili njegov antigen-vezujući deo), datom kao primer, rekombinantni ekspresioni vektor koji kodira teški lanac antitela i laki lanac antitela uvede se u dhfr-CHO ćelije transfekcijom posredovanom kalcijumfosfatom. U rekombinantnom ekspresionom vektoru, geni za teški i laki lanac antitela su, svaki, operativno povezani sa enhenserskim/promotorskim regulatornim elementima (npr. izvedenim iz SV40, CMV, adenovirusa i slično, kao što su CMV enhenserski/AdMLP promotorski regulatorni element ili SV40 enhnserski/AdMLP promotorski regulatorni element) da bi se pokrenuli visoki nivoi transkripcije gena. Rekombinantni ekspresioni vektor takođe nosi DHFR gen, koji dopušta selekciju CHO ćelija koje su transfektovane vektorom, uz korišćenje metotreksatne selekcije/amplifikacije. Selektovane transformantne ćelije-domaćini kultivišu se da bi se dopustila ekspresija teških i lakih lanaca antitela i intaktna antitela se sakupljaju iz medijuma kulture. Standardne tehnike molekularne biologije koriste se za pripremanje rekombinantnog ekspresionog vektora, transfekciju ćelija-domaćina, selekciju transformanata, kultivisanje ćelija-domaćina, i preuzimanje antitela iz medijuma kulture. Na primer, neka antitela mogu da se izoluju afinitetnom hromatografijom sa Proteinom A ili Proteinom G. US 6,602,503 takođe opisuje primere postupaka za eksprimiranje i prečišćavanje natalizumaba.

[0097] Antitela mogu uključivati i modifikacije, npr. modifikacije koje menjaju, Fc funkciju, npr. za smanjenje ili uklanjanje interakcije sa Fc receptorom ili sa C1q, ili oba. Na primer, konstantni region humanog IgG1 može biti mutiran na jednoj ili više rezidua, npr. na jednoj ili više rezidua od 234 i 237, npr. prema numerisanju u US patentu br. 5,648,260. Drugi primeri modifikacija uključuju one koje su opisane u US patentu br.5,648,260.

[0098] Za neka antitela koja uključuju Fc domen, sistem za proizvodnju antitela može da bude dizajniran tako da se sintetišu antitela u kojima je Fc region glikozilovan. Na primer, Fc domen IgG molekula je glikozilovan na asparaginu 297 u CH2 domenu. Ovaj asparagin je mesto za modifikaciju oligosaharidima biantenarnog tipa. Ova glikozilacija učestvuje u efektorskim funkcijama posredovanim Fcγ receptorima i komponentom komplementa C1q (Burton and Woof (1992) Adv. Immunol. 51:1-84; Jefferis et al. (1998) Immunol. Rev.163:59-76). Fc domen može da se proizvede u sisarskom ekspresionom sistemu koji na odgovarajući način glikoziluje rezidue koje odgovaraju asparaginu 297. Fc domen takođe može da uključuje druge eukariotske postranslacione modifikacije.

[0099] Antitela mogu da proizvedu i transgene životinje. Na primer, US patent br. 5,849,992 opisuje postupak za ekspresiju antitela u mlečnoj žlezdi transgenog sisara. Konstruiše se transgen koji sadrži za mleko specifični promotor i nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo od interesa i signalnu sekvencu za sekreciju. Mleko koje proizvedu ženke takvih transgenih sisara sadrži sekretovano antitelo od interesa. Antitelo može da se prečisti iz mleka, ili da se, u nekim slučajevima primene, koristi direktno.

Obeleživači i detekcija

[0100] Aspekti opisa uključuju korišćenje neimobilisanih, antiterapijskih proteinskih antitela (npr. natalizumaba) kao detekcionih komponenti za procenu prisustva i/ili nivoa solubilne vezujuće aktivnosti vezane za imobilisano antitelo protiv terapijskog proteina (npr. natalizumaba). Postupci za evaluaciju prisustva i/ili nivoa solubilne vezujuće aktivnosti mogu uključivati upotrebu jedne ili više detekcionih komponenti (npr. natalizumab koji sadrži ili je zakačen za detektabilni obeleživač). Detektabilni obeleživač se definiše kao svaka komponenta koja može da se detektuje korišćenjem testa. Antitela i funkcionalni fragmenti antitela opisa mogu da se, standardnim postupcima kuplovanja, povežu sa specifičnim obeležavajućim sredstvima za detektovanje vezivanja. Može se koristiti široka lepeza detektabilnih obeleživača, kao što su oni koji obezbeđuju direktnu detekciju (npr. radioaktivni obeleživač, fluorofora, [npr. zeleni fluorescentni protein (GFP), crveni fluorescentni protein (RFP), itd.], hromofor, optički ili elektron-gusti obeleživač, itd.), ili indirektnu detekciju (npr. enzimski marker kao što je peroksidaza rena, itd.). Neograničavajući primeri detektabilnih obeleživača koji su prikačeni ili inkorporisani u antitela uključuju: enzime, radioobeleživače, fluorescentne obeleživače, fosforescentne molekule, hemiluminiscentne molekule, hromofore, luminiscentne molekule, fotoafinitetne molekule i obojene čestice ili ligande kao što su biotin, itd. Pored toga, postupci za detekciju prema opisu mogu uključivati elektrohemiluminiscentne (ECL) metode.

[0101] Za detektovanje obeleživača mogu da se koriste različiti postupci, zavisno od prirode obeleživača i drugih komponenti testa. Obeleživači mogu direktno da se detektuju preko optičke ili elektronske gustine, radioaktivne emisije, neradioaktivnih energetskih transfera, itd. ili da se detektuju indirektno konjugatima antitela, streptavidin-biotin konjugatima, itd. Mnogi drugi detektabilni obeleživači poznati su u struci, kao i postupci za njihovo prikačinjanje za antitela.

[0102] Obeležena antitela opisa mogu biti antitela koja se koriste in vitro, npr. u imunotestu kao što je ELISA. Takva detektabilno obeležena antitela mogu biti antitela koja imaju detektabilni obeleživač inkorporisan u antitelo ili mogu biti antitela koja su povezana sa sekundarnim vezujućim ligandom i/ili enzimom (enzimski marker) koji će generisati obojeni proizvod posle kontakta sa hromogenim supstratom. Primeri pogodnih enzima uključuju ureazu, alkalnu fosfatazu, vodonik-peroksidazu (rena) ili glukoza-oksidazu. Poželjni sekundarni vezujući ligandi su biotinska i/ili avidinska i streptavidinska jedinjenja. Upotreba takvih obeleživača dobro je poznata stručnjacima u oblasti i opisana je, na primer, u U.S. pat. br. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 i 4,366,241.

[0103] Brojni postupci za povezivanje ili konjugaciju antitela sa detektabilnim obeleživačem poznati su u struci. Postupak za povezivanje može uključivati upotrebu metalnih helatnih kompleksa koji koriste na primer, organsko helirajuće sredstvo kao što je anhidrid dietilentriaminpentasirćetne kiseline (DTPA); etilentriamintetrasirćetna kiselina; N-hloro-ptoluensulfonamid; i/ili tetrahloro-3-alfa-6-alfa-difenilglikouril-3, prikačene za antitelo (U.S. pat. br. 4,472,509 i 4,938,948). Monoklonska antitela mogu takođe da reaguju sa enzimom u prisustvu kuplujućeg sredstva kao što je glutaraldehid ili perjodat. Antitela mogu biti obeležena fluoresceinskim markerima u prisustvu ovih kuplujućih sredstava ili reakcijom sa izotiocijanatom. U drugim primerima izvođenja, antitela mogu biti obeležena derivatizacijom, na primer, selektivnim uvođenjem sulfhidrilnih grupa u Fc region antitela, korišćenjem reakcionih uslova koji ne menjaju prepoznavajuće mesto na antitelu.

[0104] Detekcija detektabilnog obeleživača u testu opisa označava se u ovom tekstu kao detektovanje „signala“. Postupci za detektovanje signala u imunotestu dobro su poznati u struci. U nekim važnim primerima izvođenja pronalaska, testni signal može da se detektuje korišćenjem čitača ploča sa više bunarčića (npr. čitač mikroploča) za procenu i/ili lokaciju signala. Detekcija signala može da bude optička detekcija ili drugi način detekcije pogodan za detektovanje detektabilnog obeleživača koji se koristi u opisu. Dodatni postupci za detektovanje obeleživača dobro su poznati u struci i mogu da se koriste u postupcima prema opisu. Postupci prema opisu uključuju ELISA sa senzitivnošću za detektovanje antitela koje se specifično vezuje za natalizumab, pri čemu senzitivnost iznosi najmanje oko 1000 ng ili 500 ng. U poželjnim primerima izvođenja, ELISA senzitivnost za detektovanje antitela koje se specifično vezuje za natalizumab iznosi najmanje oko 500 ng.

[0105] Uopšteno, detekcija formiranja imunokompleksa može da se postigne primenom brojnih pristupa. Ovi postupci su obično zasnovani na detekciji obeleživača ili markera, kao što je neki od radioaktivnih, fluorescentnih, bioloških i enzimskih markera. U.S. patenti koji razmatraju upotrebu takvih obeleživača uključuju U.S. pat. br.3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 i 4,366,241. Naravno, dodatne prednosti mogu se ostvariti upotrebom sekundarnog vezujućeg liganda kao što su drugo antitelo i/ili biotin/avidin ligand-vezujući aranžman, kako je poznato u struci.

[0106] Treba imati u vidu da tehnike dobijanja i proizvodnje natalizumaba opisane u ovom tekstu mogu da se koriste i za dobijanje i proizvodnju referentnog antitela koje se vezuje za natalizumab sa visokim afinitetom (na primer visokoafinitetno natalizumab-vezujuće antitelo (npr.12C4)). Kitovi

[0107] Opis se delom odnosi i na kitove za testiranje prisustva imunskog odgovora na natalizumab u uzorku. Primer takvog kita može uključivati natalizumab. Kit može uključivati detektabilno obeležena i/ili neobeležena antitela i može uključivati rastvore i jedinjenja za detektabilno obeležavanje antitela. Kit opisa može takođe uključivati jednu ili više od sledećih komponenti: ploče, pipete, fiole, detektabilni obeleživač, rastvore (npr. blokirajući pufer, pufer za ispiranje, vezujuće rastvore, razblažujuće rastvore, itd.), pozitivne i/ili negativne kontrolne uzorke i rastvore. Kit opisa može uključivati i pisano uputstvo za upotrebu kita za identifikovanje imunskog odgovora na natalizumab u biološkom uzorku. Kitovi opisa mogu uključivati i dodatne komponente korisne u obavljanju pozitivnih i/ili negativnih kontrolnih ELISA testova. Kit opisa može uključivati i opremu kao što su čitač ploča i/ili automatski instrument za upotrebu u postupcima prema pronalasku.

Primeri

Primer 1: Test imunogenosti natalizumaba

[0108] Format i dizajn testa zasnivaju se na premošćujućem imunoenzimskom testu (ELISA). Koriste se standardni reagensi i postupci pogodni za premošćujuće testove. Ukratko, korišćenjem standardnih postupaka, natalizumab se adsorbuje na površinu mikrotitarskih ploča, posle čega sledi korak blokiranja da bi se na najmanju moguću meru svelo nespecifično vezivanje serumskih antitela. Kontrole i uzorci se razblaže i dodaju u bunarčiće. Korišćenjem standardnih postupaka, detekcija vezanih antitela na natalizumab obavlja se inkubiranjem ploča sa biotin-natalizumabom, posle čega sledi inkubacija sa streptavidinom-alkalnom fosfatazom (SA-AP). Razvijanje boje srazmerno je količini vezanog antitela na natalizumab.

[0109] Natalizumab se razblaži do specifične koncentracije u puferu za oblaganje ploča i inkubira na mikrotitarskim ELISA pločama sa 96 bunarčića preko noći na sobnoj temperaturi. Preporučena zapremina je 100 μl/bunarčiću. Ploče se isperu puferom za ispiranje i zatim inkubiraju sa blokirajućim puferom na sobnoj temperaturi, >1 h. Zapremina blokirajućeg pufera iznosi 200 μl/bunarčiću. Ploče se isperu puferom za ispiranje i zatim inkubiraju sa uzorcima za kontrolu kvaliteta i subjektovim (pacijentovim) uzorcima razblaženim 1:10 u testnom razblaživaču, sa ili bez dodatog natalizumaba (100 μg/ml finalna koncentracija) na sobnoj temperaturi, 2 h ± 15 min. Testni pufer koji sadrži dodati natalizumab predstavlja korak potvrđivanja. Zapremina testnog razblaživača iznosi 100 μl/bunarčiću. Ploče se zatim isperu puferom za ispiranje i inkubiraju sa SA-AP na sobnoj temperaturi, 30-35 min. Zapremina za inkubiranje sa SA-AP je 100 μl/bunarčiću. Ploče se zatim isperu puferom za ispiranje i zatim inkubiraju sa AP supstratom, p-nitrofenil fosfatom (PNPP) na sobnoj temperaturi, 45-50 min. Zapremina za inkubiranje u AP supstratu je 100 μl/bunarčiću. Rastvor za prekid reakcije (npr. H2SO4, itd.) se zatim doda direktno u supstratnu reakcionu mešavinu i optička gustina (OC) se očitava na 405 nm.

[0110] Da bi se test prihvatio, pozitivne i negativne kontrole treba da daju rezultate unutar prethodno definisane vrednosti i preciznosti. Pri proceni rezultata subjektovih (pacijentovih) uzoraka, uzorci se ocenjuju kao negativni ako je njihova OD vrednost ispod definisane granične vrednosti uzorka kontrole kvaliteta. Uzorci se ocenjuju kao negativni i ako je njihova OD vrednost iznad definisane granične vrednosti uzorka kontrole kvaliteta, a inhibicija signala subjektovog (pacijentovog) uzorka posle dodavanja natalizumaba u koraku potvrđivanja je manja od prethodno definisanog procenta. Uzorci se ocenjuju kao pozitivni ako je njihova OD vrednost iznad definisane negativne granične vrednosti uzorka kontrole kvaliteta i inhibicija signala subjektovog (pacijentovog) uzorka posle dodavanja natalizumaba u koraku potvrđivanja je veća ili jednaka prethodno definisanom procentu.

Primer 2: Skrining test za imunski odgovor na natalizumab

[0111] Skrining test (kako je opisano gore) obavlja se na uzorcima uzetim od subjekata koji su primili natalizumab. Prisustvo imunskog odgovora na natalizumab ispituje se kod pacijenata koji su podvrgnuti primeni natalizumaba.

[0112] Biološki uzorci uzeti od subjekata kod kojih je bio primenjen natalizumab testirani su na prisustvo solubilnog antitela koje se specifično vezuje za natalizumab, korišćenjem postupaka opisanih u Primeru 1.

[0113] Testovi su uključivali upotrebu visokoafinitetnog mAb kao pozitivne kontrole. Visokoafinitetno mAb detektovalo je vezujuća antitela (npr. antitela koja se vezuju za natalizumab) prisutna u biološkim uzorcima uzetim od subjekata. Negativni granični nivo bio je određen na najnižoj koncentraciji koja je dala prihvatljivu pouzdanost/preciznost (25%/25%); 50 ng/ml u 10% serumu. Senzitivnost mAb bila je 500 ng/ml u čistom (nerazblaženom) serumu. U pogledu senzitivnosti, određeno je da mAb detektuje antitela na natalizumab, ali da nije senzitivno na irelevantna humana monoklonska antitela. Određeno je da interferencija drugih molekula ili komponenti uzorka sa mAb uključuje interferenciju sa slobodnim lekom pri odnosu mAb:lek većem od 1:2. Sl.1 ilustruje efekte interferencije slobodnog natalizumaba, u imunotestu za antitela na natalizumab. Nađeno je da i reumatoidni faktor interferira sa testom.

[0114] Pored skrining testa opisanog u Primerima 1 i 2, obavljeni su i karakterizacioni testovi za procenu vezivanja u skrining testovima. Biološki uzorci uzeti od subjekata kod kojih je bio primenjen natalizumab testirani su na prisustvo solubilnog antitela koje se specifično vezuje za natalizumab, korišćenjem protočno-citometrijskog blokirajućeg testa. Visokoafinitetno mAb korišćeno je kao pozitivna kontrola. Test detektuje blokirajuća antitela. Korišćen negativni granični nivo za mAb bio je određen na 3-4 standardne devijacije iznad proseka izmerenih vrednosti u serumima dobijenim od nedoziranih pacijenata. Stopa lažne pozitivnosti iznosila je 5%, a senzitivnost testa bila je 500 ng/ml čistog seruma. Testirana je specifičnost mAb i određeno je da mAb detektuje antitela na natalizumab, ali je nađeno da je nesenzitivno na irelevantna humana monoklonska antitela. Interferencija slobodnog leka sa testom takođe je ispitivana. Test je pokazao prisustvo interferencije slobodnog leka. Rezultati procenjivanja interferencije slobodnim lekom u blokirajućem testu prikazani su na Sl.2.

Blokirajući test za natalizumab

Rezultati

[0115] Upoređivani su pozitivni rezultati skrining testa i blokirajućeg testa. Bilo je 217 pozitivnih rezultata blokirajućeg testa i 222 pozitivna rezultata pretražujućeg testa, prema tome postojala je razlika od 5% i procenat konkordanse bio je 98%. Prema tome, skrining test obezbeđuje pouzdanu meru subjektovog imunskog odgovora na natalizumab.

Primer 3

[0116] Skrining test (kako je opisano u Primerima 1 i 2) obavljen je na uzorcima uzetim od 625 subjekata kod kojih je bio primenjen natalizumab. Prisustvo imunskog odgovora na natalizumab bilo je ispitivano kod pacijenata koji su bili podvrgnuti primeni natalizumaba. Incidenca antitela na natalizumab kod ispitivanih pacijenata bila je: 91% (569 pacijenata) bilo je negativno na antitela i 9% (56 pacijenata) bilo je pozitivno na „vezujuće antitelo“ u nekoj vremenskoj tački, sa 3% (19 pacijenata) „prolazno“ pozitivnih i 6% (37 pacijenata) „trajno“ pozitivnih. Prolazno pozitivni pacijenti imali su detektabilna antitela (u koncentraciji od > 0.5 μg/ml) u jednoj vremenskoj tački, ali su bili negativni na antitela u svim ostalim vremenskim tačkama. Trajno pozitivni pacijenti imali su detektabilna antitela u dve ili više vremenskih tačaka između kojih je bio razmak od najmanje 42 dana, ili u jednoj vremenskoj tački bez kasnije testiranih uzoraka.

[0117] Sl.3 pokazuje vreme prvih pozitivnih rezultata kod pacijenata koji su razvili neko antitelo. Šest procenata pacijenata razvilo je „trajna“ antitela na natalizumab. Preko 90% trajno pozitivnih pacijenata prvi put je imalo detektabilna antitela u 12. nedelji. Nije bilo subjekata koji su postali pozitivni na trajna antitela posle 36. nedelje. Prolazno pozitivni pacijenti imali su detektabilna antitela u 12. nedelji, ali su potom bili negativni na antitela.

[0118] Rezultati su analizirani da bi se odredilo prisustvo efekta antitela na stopu relapsa originalnog poremećaja kod lečenih pacijenata. Sl. 4 ilustruje ukupan efekat antitela na stopu relapsa. Stopa relapsa takođe je procenjena za subjekte u pogledu vremena koje je prošlo od primene natalizumaba. Sl.5A-D prikazuju stopu relapsa na 0-3 meseca, 3-6 meseci, 6-9 meseci, i

4

9-12 meseci, respektivno.

Rezultati

[0119] Rezultati pokazuju da nema vidljivih efekata antitela tokom prva tri meseca lečenja. Od tri do šest meseci, pacijenti „prolazno“ pozitivni na antitela pokazuju smanjenje efikasnosti lečenja natalizumabom. Pacijenti „trajno“ pozitivni na antitela pokazali su gubitak efikasnosti lečenja natalizumabom. Od šest do dvanaest meseci, puna efikasnost je ponovo uspostavljena kod pacijenata „prolazno“ pozitivnih na antitela, ali ne i kod pacijenata „trajno“ pozitivnih na antitela. Prema tome, važno je identifikovati pacijente koji su prolazno pozitivni na antitela kao ciljnu populaciju za nastavak terapije natalizumabom.

EKVIVALENTI

[0120] Upotrebljeni pojmovi i izrazi su u svrhu opisivanja, a ne ograničenja, i pri korišćenju takvih pojmova i izraza nema namere da se isključe ekvivalenti pokazanih i opisanih osobina ili njihovih delova.

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Postupak za detektovanje klinički značajnog imunskog odgovora na natalizumab kod subjekta, gde postupak obuhvata utvrđivanje da li najmanje dva biološka uzorka uzeta u različitim vremenskim tačkama od subjekta kod kojeg je primenjen natalizumab sadrže u uzorku seruma najmanje klinički značajan nivo praga od 500 ng/ml solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab, naznačen time što su navedene vremenske tačke razdvojene najmanje 42 dana, i pri čemu prisustvo najmanje nivoa praga solubilnog antitela u navedena najmanje dva uzorka ukazuje na smanjenje efikasnosti ili nedostatak efikasnosti natalizumaba.

2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što se nivo solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab utvrđuje:

određivanjem nivoa vezujuće aktivnosti solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab u prvom alikvotu biološkog uzorka; i

određivanjem da li je vezujuća aktivnost specifična za natalizumab.

3. Postupak prema zahtevu 2, naznačen time što se specifičnost solubilne vezujuće aktivnosti određuje u drugom alikvotu biološkog uzorka.

4. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 3, naznačen time što se nivo solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab u biološkom uzorku određuje upoređivanjem nivoa vezujuće aktivnosti sa vezujućom aktivnošću obeleženog natalizumaba izmerenom u prisustvu dve ili više različitih količina neobeleženog natalizumaba.

5. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 4, naznačen time što se nivo solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab u biološkom uzorku određuje upoređivanjem nivoa vezujuće aktivnosti za imobilisani natalizumab izmerenih u prisustvu dve ili više različitih količina solubilnog natalizumaba.

6. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 5, naznačen time što se količina solubilnog antitela na natalizumab određuje korišćenjem premošćujućeg ELISA testa.

7. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 6, naznačen time što se prvi nivo vezujuće aktivnosti za natalizumab određuje u prvom imunotestu za prvi alikvot biološkog uzorka, i drugi nivo vezujuće aktivnosti za natalizumab se određuje u drugom imunotestu za drugi alikvot biološkog uzorka, pri čemu se drugi imunotest „spajkuje“ većom količinom neobeleženog solubilnog natalizumaba nego prvi imunotest, i gde je na prisustvo najmanje nivoa praga solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab u biološkom uzorku ukazano, ako je prvi nivo vezujuće aktivnosti veći od referentnog nivoa vezujuće aktivnosti za 500 ng/ml solubilnog antitela koje se vezuje za natalizumab i ako je drugi nivo vezujuće aktivnosti manji od unapred određenog procenta prvog nivoa vezujuće aktivnosti.

8. Postupak prema zahtevu 7, naznačen time što su prvi i drugi imunotest premošćujući ELISA testovi.

9. Postupak prema zahtevu 7 ili 8, naznačen time što prvi i drugi test sadrže imobilisani neobeleženi natalizumab i solubilni obeleženi natalizumab, pri čemu je solubilni obeleženi natalizumab obeležen enzimom, fluorescentnim markerom ili radioaktivnim markerom.

10. Postupak prema zahtevu 8 ili 9, naznačen time što se prvi i drugi imunotest izvode u paralelnim reakcionim zapreminama na jednom reakcionom supstratu.

11. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 10, naznačen time što je biološki uzorak predstavljen uzorkom seruma.

12. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 11, naznačen time što je subjekt humani pacijent.

13. Postupak prema zahtevu 12, naznačen time što pacijent ima multiplu sklerozu, reumatoidni artritis ili Kronovu bolest.

4