RS52011B

RS52011B - Nova primena derivata taksoida

Info

Publication number: RS52011B
Application number: YU7901A
Authority: RS
Inventors: Marie-Christine Bissery; Patricia Vrignaud; Simon Roberts; Clive Brealey
Original assignee: Aventis Pharma S.A.
Priority date: 1998-08-17
Filing date: 1999-08-13
Publication date: 2012-04-30
Also published as: NO20010654L; WO2000009120A8; SK285212B6; CA2340921C; KR100710533B1; NO20010654D0; AU5741999A; NO327296B1; JP2002522490A; EE200100079A; EE04903B1; CZ2001604A3; NZ509965A; BG65365B1; WO2000009120A1; CA2340921A1; HU230235B1; TR200100557T2; AU766168B2; IL141238A0

Abstract

Primena 4α-acetoksi-2α-benzoiloksi-5β, 20-epoksi-1β-hidroksi-7β, 10β-dimetoksi-9-okso-ll-taksen-13α-il- (2R, 3S) -3-terc-butoksikarbonilamino-2-hidroksi-3-fenilpropionata za dobivanje leka za lečenje abnormalne proliferacije ćelija u mozgu, naznačena time, što se pomenuti lek daje intravenskim putem.Prijava sadrži još 1 patentni zahtev.

Description

Ovaj pronalazak se odnosi na novu primenu derivata taksoida. Preciznije se odnosi na postupak za lečenje abnormalne proliferacije ćelija u mozgu sisara uključujući čoveka davanjem jedinjenja opšte formule (I) ili neke njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvata:

u kojoj

Z označava atom vodonika ili radikal opšte formule:

u kojoj

Rioznačava

benzoil-radikal koji je opciono supstituisan sa

jednim ili više identičnih ili različitih atoma ili radikala odabranih između atoma halogena i alkil-radikala koji sadrže 1-4 atoma ugljenika, alkoksi-radikala koji sadrže 1-4 atoma ugljenika ili trifluormetil-radikala,

tenoil- ili furoil-radikal ili

radikal R2--0-CO- u kojem R2označava

- aJkil-radikal koji sadrži 1-8 atoma ugljenika, - alkenil-radikal koji sadrži 2-8 atoma ugljenika, - alkinil-radikal koji sadrži 3-8 atoma ugljenika, - cikloalkil-radikal koji sadrži 3-6 atoma ugljenika, - cikloalkenil-radikal koji sadrži 4-6 atoma ugljenika ili - bicikloalkil-radikal koji sadrži 7-10 atoma ugljenika,

pri čemu su ovi radikali opciono supstituisani sa jednim ili više supstituenata odabranih između atoma ha.logena i hidroksilnih radikala, alkoksi-radikala koji sadrže 1-4 atoma ugljenika, dialkilamino-radikala u kojima svaki alkil-deo sadrži 1-4 atoma ugljenika, piperidino ili morfolino radikala, 1-piperazinil-radikala (koji su opciono supstituisani u položaju 4 sa alkil-radikalom koji sadrži 1-4 atoma ugljenika ili sa fenilalkil-radikalom u kojem alkil-deo sadrži 1-4 atoma ugljenika), cikloalkil-radikala koji sadrže 3-6 atoma ugljenika, cikloalkenil-radikala koji sadrže 4-6 atoma ugljenika, fenil-radikala (koji su opciono supstituisani sa jednim ili više atoma ili radikala odabranih između atoma halogena i alkil-radikala koji sadrže 1-4 atoma ugljenika ili alkoksi-radikala koji sadrže 1-4 atoma ugljenika), cijan-grupe ili karboksilnih radikala ili alkoksikarbonil-radikala u kojima alkil-deo sadrži 1-4 atoma ugljenika,

- fenil ili a- ili P-naftil-radikal koji je opciono supstituisan sa jednim ili više atoma ili radikala odabranih između atoma halogena i

alkil-radikala koji sadrže 1-4 atoma ugljenika ili alkoksi-radikala koji sadrže 1-4 atoma ugljenika ili - petočlani aromatični heterociklični-radikal koji je pogodno odabran između furil- i tienil-radikala ili - zasićen heterociklični-radikal koji sadrži 4-6 atoma ugljenika koji je opciono supstituisan

sa jednim ili više alkil-radikala koji sadrže

1-4 atoma ugljenika,

R3označava

neračvast ili račvast a.lkil-radikal koji sadrži 1-8 a toma ug1j en i ka,

neračvast ili račvast alkeni1-radikal koji sadrži 2-8 atoma ugljenika,

neračvast ili račvast alkinil-radikal koji sadrži 2-8 atoma ugljenika,

cikloalkil-radikal koji sadrži 3-6 atoma ugljenika, fenil ili a- ili p-naftil-radikal koji je opciono supstituisan sa jednim ili više atoma ili radikala odabranih između atoma halogena 1 alkil-, alkenil-, alkinil-, aril-, aralkil, alkoksi-, alkiltio-, ariloksi-, ariltio-, hidroksil-, hidroksialkil-, merkapto-, formil-, acil-, acilamino-, aroilamino, alkoksikarbonilamino-, amino-, alkilamino-, dialk.ilamino-, karboksil-, alkoksikarbonil-, karbamoil-, alkilkarbamoil-, dialkilkarbamoil-, cijan-, nitro- i trifluormetil-radikala, ili - petočlani aromatični heterociklus koji sadrži jedan ili više identičnih ili različitih hetero-atoma odabranih između atoma azota, kiseonika i sumpora i koji je opciono supstituisan sa jednim ili više identičnih ili različitih supstituenata odabranih između atoma halogena i alkil-, aril-.

amino-, alk.il.ami.no-,di.a.lki 1 amino-, alkoksikarbonilamino-, acil-, arilkarbonil-, cijan-, karboksil-, karbamoil-, alkilkarbamoil-, dialkilkarbamoil- ili a1 koksi karboni 1-radi kala,

pri. čemu se pndrazumeva da1.1supslituent. ima fenil-, a- ili (J-naftil- i aromatičnih heterocikličnih radikala, alkil-radikali i alkil-delovi drugih radikala sadrže 1-4 atoma ugljenika i da alkenil- i alkinil-radikali sadrže 2-8 atoma ugljenika i da su aril-radikali ustvari fenil- ili a- ili p-naft.i.l- radi kali,

R*označava

alkoksi-radikal koji sadrži 1-6 atoma ugljenika u neračvastom ili račvastom nizu,

alkeniloksi-radikal koji sadrži 3-6 atoma ugljenika u neračvastom ili račvastom nizu,

alkiniloksi-radikal koji sadrži 3-6 atoma ugljenika u neračvastom ili račvastom nizu,

cikloalkiloksi-radikal koji sadrži 3-6 atoma ugljenika ili

cikloalkeniloksi-radikal koji sadrži 4-6 atoma ugljenika,

pri čemu su ovi radi ka li opciono supstituisani sa jednim ili više atoma halogena ili sa alkoksi-radikalom koji sadrži 1-4 atoma ugljenika, alkiltio-radikalom koji sadrži 1-4 atoma ugljenika ili karboksil-radikalom, alkiloksikarbonil-radikalom u kojem alkil-deo sadrži 1-4 atoma ugljenika, cijan- ili karbamoil-radikalom ili N-alkilkarbamoil- ili N,N-dialkilkarbamoil-radikalom u kojem svaki alkil-deo sadrži 1-4 atoma ugljenika, ili zajedno sa atomom azota za koji je vezan formira zasićen petočlani ili šestočlani heterociklični radikal koji opciono sadrži drugi hetero atom odabran između atoma kiseonika, sumpora ili azota, koji je opciono

supstituisan sa alkil-radikalom koji sadrži 1-4 atoma ugljenika ili sa fenil- ili fenilalkil-radikalom u kojem alkil-deo sadrži 1-4 atoma ugljenika,

Rs označava

alkeniloksi-radikal koji sadrži 3-6 atoma ugljenika, alkiniloksi-radikal koji sadrži 3-6 atoma ugljenika,

cikloalkiloksi-radikal koji sadrži 3-6 atoma ugljenika ili

cikloalkeniloksi-radikal koji sadrži 3-6 atoma ugljenika,

pri čemu su ovi radikali opciono supstituisani sa jednim ili više atoma halogena ili sa alkoksi-radikalom koji sadrži 1-4 atoma ugljenika, alkiltio-radikalom koji sadrži 2-4 atoma ugljenika ili karboksil-radikalom, alkiloksikarbonil-radikalom u kojem alkil-deo sadrži 1-4 atoma ugljenika, cijan- ili karbamoil-radikalom ili N-alkilkarbamoil- ili N,N-dialk.ilkarbamoil-radlkalom u kojem svaki alkil-deo sadrži 1-4 atoma ugljenika, ili zajedno sa atomom azota za koji je vezan formira zasićen petočlani ili šestočlani heterociklični radikal koji opciono sadrži drugi hetero atom odabran između atoma kiseonika, sumpora ili azota, koji je opciono supstituisan sa alkil-radikalom koji sadrži 1-4 atoma ugljenika ili fenil-radikalom ili fenilalkil-radikalom u kojem alkil-deo sadrži 1-4 atoma ugljenika.

Aril-radikali koji se mogu predstaviti sa R3su pogodno fenil- ili a- ili p-naftil-radikali koji su opciono supstituisani sa jednim ili više atoma ili radikala odabranih između atoma halogena (fluora, hlora, broma, joda) i alkil-, alkenil-, alkinil-, aril-, aralkil-, alkoksi-, alkiltio-, ariloksi-, ariltio-, hidroksil-, hidroksia.lki.L-, merkapto-, formil-, acil-, acilamino-, aroilamino-, alkoksikarbonilamino-, amino-, alkilamino-, d.ialkilamino-, karboksi.]-, alkoksikarbonil-, karbamoil-, dialkilkarbamoj1-, cijan-, nitro- i trif 1uormetil-radi kala, pri čornu se podrazumeva da alkil-radikali i alkil-delovi drugih radikala sadrže 1-4 atoma ugljenika, da alkenil- i alkinil-radikali sadrže 2-8 atoma ugljenika i da su ovi ar.il-radikali ustvari fenil-ili «- ili fl-nafti1-radikali.

Heterociklični radikaii koji se mogu predstaviti sa R3su pogodno petočlani aromatični heterociklični radikaii koji sadrže jedan ili više identičnih ili različitih atoma odabranih između atoma azota, kiseonika i sumpora, koji su opciono supstituisani sa jednim ili više identičnih ili. različitih supstituenata odabranih između atoma halogena (fluora, hlora, broma, joda) i alkil-radikala koji sadrže 1-4 atoma ugljenika, aril-radikala koji sadrže 6-10 atoma ugljenika, alkoksi-radikala koji sadrže 1-4 atoma ugljenika, ariloksi-radikala koji sadrže 6-10 atoma ugljenika, amino-radikala, alkilamino-radikala koji sadrže 1-4 atoma ugljenika, dialkilamino-radikala u kojima svaki alkil-deo sadrži 1-4 atoma ugljenika, acilamino-radikala u kojima acil-deo sadrži 1-4 atoma ugljenika, alkoksikarbonilamino-radikala koji sadrže 1-4 atoma ugljenika, acil-radikala koji sadrže 1-4 atoma ugljenika, arilkarboni1-radikala u kojima aril-deo sadrži 6-10 atoma ugljenika, cijan-, karboksil- ili karbamoil-radikala, alkilkarbamoil-radikala u kojima alkil-deo sadrži 1-4 atoma ugljenika, dialkilkarbamoil-radikala u kojima svaki alkil-deo sadrži 1-4 atoma ugljenika ili alkoksikarbonil-radikala u kojima alkoksi-deo sadrži 1-4 atoma ugljenika.

Radikaii R4i R5, koji mogu biti identični ili različiti, pogodno označavaju neračvaste ili račvaste alkoksi-radikale koji sadrže 1-6 atoma ugljenika, koji su opciono supstituisani sa metoksi-, etoksi-, etiltio-, karboksil-, metoksikarbonil-, etoksikarbonil-, cijan-, karbamoil-, N-metilkarbamoi1-, N-etilkarbamoil-, N,N-dimetilkarbamoil-, N,N-dieV.ilkaibamoi 1 -, N-pirolidinokarbonil- ili N-piperidinokarbonil-radikalom.

Specijalnije se ovaj pronalazak odnosi na proizvode opšte formule (1) u kojoj7,označava atom vodonika ili radikal opšte formule (II) u kojoj Rioznačava benzoil-radikal ili radikal R2-0-CO- u kojem R2označavaterc-butil-radikal i R3označava alkil-radikal koji sadrži 1-6 atoma ugljenika, alkenil-radikal koji sadrži 2-6 atoma ugljenika, cikloalkil-radikal koji sadrži 3-6 atoma ugljenika, feni1-radi kal koji je opciono supstituisan sa sa jednim ili više identičnih ili različitih atoma ili radikala odabranih između atoma halogena (fluora, hlora) i alkil (metil), alkoksi (metoksi), dialkilamino (dimetilamino), acilamino (acetilamino), alkoksikarbonilamino (terc-butoksikarbonilamino) ili trifluormetil radikala, ili označava 2- ili 3-furil-, 2- ili 3-tienil ili 2-, 4- ili 5-tiazolil-radikal, i R,| i R<-,, koji mogu biti identični ili različiti, svaki nezavisno jedan od drugog označava neračvast ili račvast alkoksi-radikal koji sadrži 1-6 atoma ugljenika.

Još specijalnije ovaj pronalazak se odnosi na proizvode opšte formule (I) u kojoj Z označava atom vodonika ili radikal opšte formule (IT) u kojoj Rioznačava benzoil-radikal ili radikal R2-0-CO- u kojem R2označava terc-butil-radikal i. R3označava izobutil, izobutenil, butenil, cikloheksil, fenil, 2-furil, 3-furil, 2-tienil, 3-tienil, 2-tiazolil, 4-tiazolil ili 5-tiazolil radikal, i R4i R5, koji mogu biti identični ili različiti, svaki nezavisno jedan od drugog označava metoksi, etoksi ili propoksi radikal.

Od naročito specijalnog interesa su proizvodi opšte formule (I) u kojoj R3označava fenil-radikal i Rioznačava terc-butoksikarbonil-radikal, R« i R5, koji mogu biti identični ili različiti, svaki nezavisno jedan od drugog označava metoksi, etoksi ili propoksi radikal.

Sa aspekta još većeg interesa, ovaj pronalazak se odnosi na 4a-acetoksi-2a-benzoiloksi-5P,20-epoksi-lp-hidroksi-7p,10<p->dimetoksi-9-okso-ll-taksen-13a-il-{ 2R, 3S) -3-terc-butoksikarbonilamino-2-hidroksi-3-

fenilpropionat formule (Ia)

Iz patenta W0 96/30355 je poznato da se derivat prema ovom pronalasku dobiva pomoću dva postupka. Prema prvom, višestepenom postupku polazeći od 10-deacetil-bakatina III formule: ovaj se selektivno štiti u položajima 7 i 13, na primer, u obliku silil-dietra, čemu sledi dejstvo proizvoda opšte formule:

u kojoj R označava radikal definisan kao što je gore dato i X označava reaktivni estarski ostatak kao što je ostatak estra sumporne ili sulfonske kiseline ili atom halogena, dajući proizvod koji nosi jedinicu -0R u položaju 10 i silil-grupe u položajima 7 i 13. Dalje se silil zaštitne grupe zamenjuju atomima vodonika dajući jedinjenje koje još nosi grupu -OR u položaju 10 i OH grupe u položajima 7 i 13. Ovaj poslednji derivat se selektivno eterifikuje u položaju 7 reakcijom sa derivatom formule IV dajući derivat formule (I) u kojoj Z označava vodonik.

Finalni stupanj se sastoji u esterifikovanju u položaju 13, prema postupku koji je sam po sebi poznat, derivata formule (Ia), u kojoj Z označava vodonik, u prisustvu |3-laktama prema, na primer, postupku koji je opisan u patentu EP 617.018, ili u prisustvu oksazolidina kao što je opisano, na primer, u gore pomenutom patentu

. WO 96/30355. Posle deprotekcije (odcepljenja) zaštitnih grupa u položajima 7 i 10, tako se dobiva estar formule (Ia) u kojoj je Z različit od vodonika i R označava

vodonik. Sledeći stupanj se sastoji u simultanom reagovanju položaja 7 i 10 dol ovanjem reagensa formiranogin situiz sulfoksida formule (V) i anhidrida sirćetne kiseline (reakcija Pummerer-ovog tipa),

u kojoj R ima gore dato značenje, tako da se formira intermedijer alkiltioalkiloksi-t.ipa na položajima 7 i 10.

Finalni stupanj, koji omogućava da se dobije željeno jedinjenje formule (Ia), vrši se na gore dobivenom intermedijernom jedinjenju dejstvom aktiviranog Raney nikla.

Uopšte uzevši, dejstvo reagensa formiranog in situ iz sulfoksida opšte formule (V), prvenstveno dimetil-sulfoksida i anhidrida sirćetne kiseline, vrši se u prisustvu sirćetne kiseline ili nekog derivata sirćetne kiseline kao što je halogens.i rćetna kiselina, pri temperaturi između 0 i 50°C.

Uopšte uzevši, dejstvo aktiviranog Raney nikla u prisustvu alifatičnog alkohola ili etra vrši se pri temperaturi između -10 i 60°C.

U patentnoj prijavi FR 97-14442 opisan je jedan dalji postupak. Ovaj pronalazak omogućava, u jednom stupnju, direktno, selektivno i simultano alkilovanje dve hidroksilne funkcije u položajima 7 i 10 10-deacetil-bakatina ili njegovih derivata esteriCikovanih u položaju 13, formule (VI) u kojoj A označava vodonik ili bočni niz dole date formule (Ha) :

u kojoj G označava zaštitnu grupu za hidroksilnu funkciju, Rii R3imaju isto značenje kao u formuli (II)

ili oksazolidinsku jedinicu formule (Id):

u kojoj Ri i R3imaju isto značenje kao u formuli (II), Rai Rb, koji mogu biti identični ili različiti, označavaju vodonik ili alkil, aril, halogen, alkoksi, arilalkil, alkoksiaril, halogenalkil, halogenaril, pri čemu je moguće da supstituenti opciono formiraju četvoročlani do sedmočlani prsten.

Kao polaznu materiju je pogodno primeniti 10-deacetilbakatin, tj. proizvod formule (III), koji omogućava znatnu ekonomičnost, što se tiče ovog postupka i čak šta više izbegava stupnjeve intermedijarne zaštite i deprotekcije (odcepljenja zaštitnih grupa) koji su neophodni, u starim postupcima.

Između grupa G za zaštitu hidroksilne funkcije formule (Ha), uopšte je pogodno odabrati sve one zaštitne grupe koje su opisane u knjigama kao što su Greene and Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,1991, John Wiley & Sons, i MacOmie,Protective Groups in Organic Chemistry,1975, Plenum Press, i koje se odcepljuju pod us.lov.ima koji. malo ili nimalo ne razgrađuju ostatak molekula, kao što su, na primer: - etri, i prvenstveno etri kao što su metoksimetil-etar, 1-etoksietil-etar, benziloksimetil-etar, p-metoksi-benziloksimetil-etar, benzil-etri koji su opciono supstituisani sa jednom ili više grupa kao što su metoksi, hlor, nitro, 1-metil-l-metoksietil-etar, 2-(trimetilsilil)etoksimetil-etar, tetrahidropiranil-etar i sil i 1-etri kao ft to su tr i a.l. ki l.s i..1 il-efcri, - karbonati, kao šl.o su l. r.i hl orei: i .1 -karbonati .

Naročito se radikaii Rai Rhiz opšte formule (Ilb) odabiraju između onih radikala koji su opisani u patentu W0 94/07878 a naročito su pogodni derivati u kojima Raoznačava vodonik i R|, označava p-metoksifenil-radikal.

Alkilujući agens je odabran između:

- alkil-halogenida, a prvenstveno između alkil-jodida (RJ),

- alkil-sulfata kao što je metil-sulfat,

- oksonijum-jedinjenja kao što su trialkiloksonijum-borne soli, naročito trimetiloksonijum-tetrafluorborat (Me.iOBF*) .

Prvenstveno se koristi pipI:i 1 -jođid.

Alkilujući agens se koristi u prisustvu agensa za anjonizaciju kao što je jedna ili ili više jakih baza, u anh i drovanom medi j umu.

Između baza koje se mogu koristiti u anhidrovanom medijumu mogu se pomenuti: - alkalno-metalni hidridi kao što su natrijum- ili kal. i jum-hidrid, - alkalno-metalni alkoksidi kao što je kalijum-terc-butoksid,

- srebro-oksid Ag20,

- 1,8-bis(dimetilamino)naftalen,

- smeše mono- ili dimetalnih baza kao što su one

koje su opisane, na primer, u publikacijama kao što su P. Caubčre,Chem. Rev.93 (1993) 2317-2334 ili M. Schlosser,Mod. Synth. Methods6 (1992) 227-271; naročito su pogodne kombinacije alkillitijum/alkalnometalni terc-butoksid ili alkalnometalni amid/alkalnometalni terc-butoksid. Jedna

od ove dve baze može se generisati»in situ«.

Između svih mogućih kombinacija alkilujućeg agensa i agensa za anjonizaciju, pogodno je primeniti metil-jodid u prisustvu kalijum-hidrida.

Reakcija se pogodno vrši u organskom medijumu koji je inertan pod ovim reakcionim uslovima. Između rastvarača, pogodno je upotrebiti:

- etre kao što je tetrahidrofuran ili dimetoksietan, - kada se upotrebljava srebro-oksid, pogodno je da se koriste polarni aprotični rastvarači kao što je dimetilformamid, ili aromatični rastvarači kao što je toluen, - kada se upotrebljava 1,8-bis(dimetilamino)-naftalen, pogodno je da se koriste alkil-estri kao što je etilacetat.

Za bolju implementaciju ovog pronalaska, pogodno je da se koristi molarni odnos između agensa za anjonizaciju i supstrata veći od 2 i prvenstveno između 2 i 20.

Takođe je pogodno da se koristi molarni odnos između alkilujućeg agensa i supstrata veći od 2 i prvenstveno između 2 i 40.

Pogodno je da se koristi reakciona temperatura između -30°C i 80°C.

Vreme trajanja reakcije se pogodno nalazi u opsegu između nekoliko sati i 48 sati u zavisnosti od odabranih reagenasa.

Posle stupnja alkilovanja, kada se ovaj poslednji vrši na 10-deacetilbakatinu, ovaj postupak se zatim vrši, na poznat način, do stupnja esterikacije prema, na primer, postupcima koji su opisani u gore pomenutim patentima EP 617.018 ili W0 96/30355.

Tako, prema prvom, trostepenom postupku, procedura prvo počinje sa dialkilovanjem 10-deacetil-bakatina, uz primenu alkilujućeg agensa u prisustvu jake baze, u drugom stupnju, 10-deacetilbakatin koji je dieterifikovan u položajima 7 i 10 kupluje se, u položaju 13, sa pogodno zaštićeniom p-laktamom u prisustvu aktivirajućeg agensa odabranog između tercijarnih amina i metalnih baza koji obezbeđuje formiranje alkoksida u položaju 13. Deprotekcija (odcepljenje zaštitne grupe) bočnog niza se zatim postiže dejstvom neorganske ili organske kiseline.

Tako, prema drugom, trostepenom postupku, procedura prvo počinje sa dialkilovanjem 10-deacetilbakatina, uz primenu alkilujućeg agensa u prisustvu jake baze, u drugom stupnju, 10-deacetilbakatin koji je dieterifikovan u položajima 7 i 10 kupluje se, u položaju 13, sa oksazolidinom u prisustvu agensa za kuplovanje kao što su diimidi u prisustvu aktivirajućeg agensa kao što su dialkilaminopiridini. Otvaranje oksazolidina se postiže dejstvom neorganske ili organske kiseline.

Prema trećem postupku, procedura počinje sa esterifikacijom u položaju 13 bakatina koji je pogodno zaštićen u položajima 7 i 10, sa p-laktamom ili sa oksazolidinom u prisustvu agensa za kuplovanje i/ili aktivirajućeg agensa kao što je opisano u gore data dva postupka. Posle deprotekcije (odcepljenja zaštitnih grupa) u položajima 7 i 10, dieterifikacija u položajima 7 i 10 se vrši pomoću alkilujućeg agensa u prisustvu jake baze. Deprotekcija (odcepljenje zaštitne grupe) bočnog niza se zatim postiže dejstvom neorganske ili organske kiseline.

Proizvodi opšte formule (I) imaju značajne biološke osobine.

Merenje biološke aktivnostiin vitrose vrši na tubulinu ekstrahovanom iz svinjskog mozga pomoću postupka iz reference M.L. Shelanski et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA70(1973) 765-768. Proučavanje depolimerizacije mikrotubula u tubulin se vrši prema postupku iz reference G. Chauviere et al.,C. R. Acad. Sci.,serija II,293

(1981) 501-503.

Proizvodi opšte formule (I) pokazali su sein vivoaktivnim u miševima kalemljenim sa B16 melanomima pri dozama između 1 i 50 mg/kg intraperilonalno, kao i na drugim tečnim ili čvrstim tumorima.

Ova jedinjenja imaju antitumorske osobine, naročito, aktivnost protiv tumora koji su otporni prema agensima Taxol® i Taxotere®. Takvi tumori uključuju, na primer, moždane tumore koji imaju povišenu ekspresiju (ižimanje) mdr 1 gena (gena otpornog prema više lekova). Otpornost prema više lekova je uobičajeni termin koji se odnosi na otpornost tumora protiv različitih jedinjenja koja imaju različite strukture i mehanizme delovanja. Opšte je poznato da se taksoidi visoko prepoznaju pomoću eksperimentalnih tumora kao što je P388/DOX, ćelijski niz P388 mišje leukemije koji je selekcionisan za otpornost prema doksorubicinu (DOX) koji ižima mdr 1. Jedinjenja prema ovom pronalasku se manje prepoznaju pomoću P388/DOX. Ova jedinjenja se posebno manje prepoznaju pomoću mdr 1 nego Taxotere®.

Jedinjenja formule (I) se uglavnom primenjuju za proizvodnju leka za lečenje abnormalne proliferacije ćelija u mozgu.

Ovo jedinjenje i uglavnom jedinjenje formule (I) u kojoj R4i R5svaki označava metoksi, ima osobinu da prelazi barijeru krvi mozga. U poređenju sa drugim poznatim taksoidima kao što su Taxol® i Taxotere® ovo jedinjenje je aktivno u lečenju kancera mozga.

Proizvod formule (I) se može primeniti konkurentno sa najmanje jednim drugim terapeutskim tretmanom (lečenjem). Pogodnije se primenjuje sa drugim terapeutskim tretmanom koji obuhvata antineoplastične lekove, monoklonalna antitela, imunoterapije, radioterapije ili modifikatore biološkog odgovora. Između modifikatora bioloških odgovora pogodno se primenjuju limfokini i citokini, intpr1eukini, a-, p- ili 8-interferoni i TNF.

Proizvod formule (I) se pogodno daje pomoću parenteralnog davanja kao što je intravenozno, intraperitonalno, intramuskularno ili potkožno (subkutano) davanje.

Primer 1

1. UVOD

Proizvod formule (Ia) je snažan antikancerogeni agens u pred-kliničkim modolima.

Ovde su saopšteni analitički rezultati koji su dobiveni iz jednodoznog i.v. bolusnog farmakokinetičkog proučavanja u mišu.

Grupe ženki C3H/HeN miševa su primile ovaj proizvod intravenoznim putem u obliku bolusa pri koncentraciji doze od 40 mg/kg što je ekvivalentno 120 mg/m<2>. Uzorci krvi i mozga su dobiveni iz svih doziranih životinja koje su žrtvovane (usmrćene) pri intervalima do 72 sata posle davanja doze. Uzorci mozga i odgovarajuće plazme su analizirani na sadržaj proizvoda Ia pomoću LC-MS/MS analize (probe).

2. POSTUPCI

Formulacija: 2,25 mg/ml rastvora koji sadrži 5% polisorbata 80, 5% etanola i 90% vodenog 5%-nog rastvora glukoze.

Svakoj od 56 ženki miševa C3H/HeN težine oko 20 g je dat formulisani proizvod II i.v. (intravenoznim) putem u obliku bolusa preko repne vene pri zapremini injekcije od 0,4 ml dajući ukupnu dozu od 40 mg/kg.

U zorkovanje krvi i tkiva

Uzorkovanje: Krv je uzorkovana kardijačnom punkturom a jetra i mozak su uzorkovani sekciranjem posle žrtvovanja sa CO2.

Vremena uzorkovanja: pri 2, 5, 15, 30, 45 minuta, 1, 2, 4, 6, 8, 14, 24, 48 i 72 sata posle davanja doze.

Celokupna krv je sakupljena u heparinizirane kivete i odgovarajući uzorci plazme su dobiveni centrifugiranjem i momentalnim zamrzavanjem pri -20°C. Tkiva su osušena (upijena), izmerena i momentalno zamrznuta pri -20°C. Svi uzorci su otpremljeni zamrznuti na analizu. Nakon prijema, do analize uzorci, su sk.ladišteni zamrznuti pri približno -18°C.

LC- MS/ MS analiza uzoraka mozga i plazme

Detekcija: LC-MS/MS (Sciex API III plus) na način turbo-jonskog spreja.

Primenjeni su sledeći MS uslovi:

Kolona: 75 x 4,6 mm Supelcosil ABZ plus (3 um). Mobilna faza: acetonitr.il/metanol/amonijumacetat (10

mM); 40/25/35 zapr./zapr./zapr.

Brzina protoka: 1 ml/min

Temperatura: okoline

Ekstrakcija:Plazma:Dodati 100 ul acetonitrila u uzorak (50 ul). Vrtložiti, centrifugirati, ukloniti bistri sloj tečnosti (iznad taloga), dodati 100 ul mobilne faze i injekcijom ubrizgati 150 ul.

Mozak:Dodati 100 ul acetonitrila u homogenizovan uzorak (100 mg homogenizata mozga i vode sa odnosom 1:1 tež./tež.) i vrtložiti. Dodati 1 ml dietiletra, vrtložiti, centrifugirati, ukloniti organski sloj i sušiti pod N2. Rekonstituisati u 200 jil mobilne faze i injekcijom ubrizgati 150 jil.

Kalibracioni standardi:Plazma:Devet standarda pri koncentracijama od 5, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400 i 500 ng/ml (proizvod Ia). Dobiveni su dodavanjem pogodnih alikvotnih delova proizvoda (koncentracije =0,1, 1

ili 10 ug/ml) u etanolu u 0,5 ml

alikvotnih delova mišje plazme. Svaki uzorak je vrtložen nakon dodavanja leka;

zatim je za analizu uklonjeno 50 ul alikvota.

Mozak:11 standarda pri koncentracijama od 10, 20, 30, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2500 i 5000 ng/ml u homogenizovanom mišjem mozgu (homogenizatu mozga i vode sa odnosom 1:1 tež./tež.). Dobiveni su dodavanjem pogodnih alikvotnih delova proizvoda (koncentracije = 1, 10 ili 100 ug/ml) u etanolu u 0,5, 1, 3 ili 4 g homogen izovanog mišjeg mozga. Svaki uzorak je vrtložen nakon dodavanja leka i zatim

je 100 mg alikvota uklonjeno za analizu. Retenciona vremana: lek; proizvod Ia:~2,3 min.

Efikasnost ekstrakcije:Plazma:oko 58% pri 200 ng/ml.

Mozak:oko 41% pri 500 ng/g i 39% pri 1000 ng/g.

3. REZULTATI

3.1 Plazmatske koncentracije

Sledeća tabela sadrži plazmatske koncentracije proizvoda Ia koje su primećene posle i.v. davanja proizvoda Ic mišu pri koncentraciji doze od 40 mg/kg.

3.2 Moždane koncentracije

Sledeća tabela sadrži potpune moždane koncentracije proizvoda Ia koje su primećene posle i.v. davanja proizvoda Ia mišu pri koncentraciji doze od 40 mg/kg.

3.3. Farmak okinetički parametri

Sledeća tabela sadrži preliminarne farmakokinetičke parametre za proizvod Ic koji su izvedeni posle i.v. davanja mišu pri koncentraciji od 40 mg/kg uz primenu srednjih vrednosti plazmatskih i moždanih koncentracija.

Bieksponencijalna jednačina je podešena prema profilima uz primenu interaktivnog algoritma linearnog najmanjeg kvadrata kao dela pakovanja SIPHAR programa. AUC je izračunata pomoću trapezoidnog pravila iz vremena 0 do vremena poslednje vrednosti koja je bila jednaka ili veća od granice detekcije (g.d.)<*>(4 ng/ml) ili granice tačne kvantifikacije (g.t.k.)' (20 ng/ml) za plazmu i do 72 h posle doziranja za mozak i zatim ekstrapolisana na beskonačnost.

K ljuč:

AUCo-cc«: Površina pod krivom zavisnosti plazmatske ili moždane koncentracije od vremena od t = 0 (start infuzije) do beskonačnosti,

početni Tj/2: početni (distribucija) poluživot terminalni T]/2: terminalni (eliminacija) poluživot (trebalo bi da se smatra kao procena pri čemu je samo zavisan od frekvencije uzimanja uzoraka u terminalnoj fazi i od

osetljivosti probe)

CIt: totalno uklanjanje plazme

Vdss: zapremina distribucije pri ravnotežnom stanju n.p.: ne može se primeniti.

4. ZAKLJUČCI

- Koncentracije proizvoda Ic su bile visoke kao što bi se očekivalo posle i.v. doze od 40 mg/kg ali su brzo padale od vrha (pika) pri 2 minuta (srednja vrednost od 46,9 ng/ml) do manje od 1 ng/ml u opsegu od 4 sata (početni poluživot od <0,7 h). Međutim, koncentracije su ostale stalno iznad granice tačne kvantifikacije (g.t.k.)

(20 ng/ml) do 14 sati posle doziranja i konzistentno iznad granice detekcije (g.d.) (4 ng/ml) do 24 sata posle doziranja. - Terminalni poluživot (Ti/2) od 6,2 h je izračunat iz plazmatskih koncentracija koje se mogu detektovati (£4 ng/ml). Međutim, trebalo bi primetiti da u ovom slučaju terminalni poluživot mnogo zavisi od osetljivosti probe i ako se za izračunavanje farmakokinetičkih parametara umesto ovih plazmatskih koncentracija koje se mogu detektovati (£4 ng/ml) koriste koncentracije iznad granice tačne kvantifikacije (20 ng/ml) tada terminalni poluživot pada na 2,0 sata.

Određeno je da srednja vrednost totalnog uklanjanja plazme iznosi 1,3 l/h/kg što predstavlja značajnu frakciju srednjeg toka jetrene plazme (na bazi srednjeg toka jetrene krvi od oko 5,2 l/h/kg). - U ovim vrstama posle i.v. davanja, proizvod Ic pokazuje da lako prodire kroz barijeru moždane krvi. Visoke koncentracije su detektovane pri prvom vremenu uzorkovanja (7,9 |.ig/g pri 2 minuta) ukazujući na brzu apsorpciju u ovo tkivo. Iako su koncentracije pikova od 9,1 ug/g primećene pri 14 h, visoke koncentracije su se održavale do poslednjeg vremena uzorkovanja (5,3 ug/g pri 72 h). Nije iznenađenje da se ovaj proizvod sporo uklanjao iz mozga sa poluživotom od 31,4 h. Na bazi vrednosti AUCo-«(788 h.ug/g odnosno 30 h.ug/ml), koncentracije proizvoda Ia u mozgu su bile oko 20 puta veće od ovih vrednosti u plazmi.

Primer 2

Procena proizvoda ( Ia) na antitumorsku aktivnost protiv

intrakranijalno implantiranih humanih glioblastoma U251 i

SF- 295 u NCr- nu miševima

Započeta su četiri proučavanja da se proceni odgovor U251 i SF-295 glioblastoma na tretman sa proizvodom (Ia). U dva proučavanja, U251 i SF-295 glioblastomi su inicirani iz intrakranijalno implantiranih ćelija pri zapremini od 10<6>ćelija po mišu. Raspored tretmana intrakranijalno implantiranih ćelija U251 glioblastoma je bio iv, jedanput dnevno, svaki šesti dan za tri tretmana (q6d x 3), započinjući na dan četiri posle implantacije. Raspored tretmana intrakranijalno implantiranih ćelija SF-295 glioblastoma je bio iv, jedanput dnevno, svaki četvrti dan za tri tretmana (q4d x 3), započinjući na dan dva posle implantacije. Za ova intrakranijalno implantirana proučavanja, jedinjenja ovog pronalaska su procenjena na bazi njihove sposobnosti da povećaju životni raspon ovih životinja. Pozitivna kontrola koja je primenjena za oba ova tumorska modela bila je nitrozourea.

Predmet ovog eksperimentisanja je bio da se proceni antitumorski efekat proizvoda (Ia) protiv humanih glioblastomnih tumorskih modela.

U ovim eksperimentima su opšte DCTD, NCI tehnike i procedure zain vivoproučavanja efikasnosti modifikovane za specijalnu primenu (In Vivo Cancer Models, NIH publikacija br. 84-2635, 1984). Ova proučavanja su izvršena u poboljšanim uređajima (AAALAC registracioni broj 00064 3, AALAS članstvo br. 840723001, USDA registracioni broj 64-R-001, OPPR, PHS, NIH, AWA, osiguranje br. A3046-01). Ovi uređaji su pod sertifikatom ISO 9001. Komitet za nadledanje je bio Southern Research Institutional Animal Care and Use Committee; primenjen protokol je bio IACUC br. 96-8-50.

Razblaženja;

Proizvod (Ia) je pripremljen u 5* etanola, 5% tweena 80, 90% D5W.

Nitrozourea je pripremljena u 2% etanola, 98% fiziološkog slanog rastvora (NaCl).

Pripremanje doze: Svi rastvori za doziranje su pripremljeni u Southern Research Institutu.

Davanje jedinjenja:

Proizvod (Ia) je dat u dozi od 0,4 ml/miš na bazi srednje ukupne telesne težine.

Nitrozourea je data u dozi od 0,1 ml/10 g telesne težine.

Stabilnost jedinjenja:

Proizvod (Ia) je držan na ledu i dat u opsegu od 20 minuta nakon pripremanja.

Nitrozourea je držana na ledu i data u opsegu od 4 5 minuta nakon pripremanja.

Uslovi skladištenja: Sva jedinjenja su skladištena u hlađenim eksikatorima.

Predostrožnosti za rukovanje: Sa ovim jedinjenjima je rukovano prema procedurama koje zahteva Komitet za bezbednost Southern Research Instituta. Za vreme davanja jedinjenja svi tehničari su bili potpuno obučeni sa ogrtačima i snabdeveni sa rukavicama, maskom za lice i sigurnosnim naočarima.

Bilo koja intrakranijalno implantirana životinja za koju je nađeno da je moribundna (bez kretanja) je eutanizirana za humane svrhe. Kako proučavanja efikasnosti padaju unutar ove kategorije osnovnog istraživanja, završavanje eksperimenta je bazirano na rezultatima koji su određeni da budu optimalni.

Vrste: Za intrakranijalno implantirane U251 probe su korišćene ženke atimičnih NCr-nu miševa stare 6-8 nedelja. Za intrakranijalno implantirane SF-295 probe su korišćeni mužjaci atimičnih NCr-nu miševa stari 6-8 nedelja.

O pravdanost: Imunodeficitarni miševi su neophodni za razmnožavanje humanih tumorskih ksenokalema, koji je bio ciljno tkivo za jedinjenja koja treba razviti.

Izvor: FCRDC (Animal Production Area), Frederick, MD za intrakranijalno implantirane SF-295 ptobe; Taconic Animal Farms, Germantown, NY za intrakranijalno implantirane U251 probe.

Broj i pol: Za intrakranijalno implantirane SF-295 probe je u korišćeno ukupno 160 mužjaka; za intrakranijalno implantirane U251 probe je u korišćeno ukupno 154 ženke.

Tež ina i starost: Srednje težine su uzete u momentu započinjanja svake probe. Srednja težina miševa kojima je intrakranijalno implantiran U251 gliobastom je bila 21-22 g. Srednja težina miševa kojima je intrakranijalno implantiran SF-295 gliobastom je bila 24-26 g.

Identifikacija životinja: Standardne oznake na ušima.

Karantin: Pre stavljanja u test sve životinje su držane u karantinu u toku perioda posmatranja od sedam dana.

Stanovanje i sanitetske mere: Životinje su stanovale u izolovanim kavezima sa filter kapom i to pet životinja po kavezu. Kavezi i prostirke su menjani dva puta nedeljno. Hrana i voda: Mišja hrana teklad sterlizable 8656 (Harlan Teklad) je data ad libitum. Filtrirana tekuća (vodovodna) voda je obezbeđena ad libitum.

Uslovi za zaštitu okoline: Uslovi su održavani prema SRI standardnim radnim procedurama koje je potvrdio (ustanovio) IACUC komitet.

U ovo proučavanjo su uključena dv;i eksperimenta (RP-36 i RP-38).

Kao što je ranije pomenuto, ovo eksperimentisanje je koncipirano tako da se proceni aktivnost proizvoda (Ia) protiv intrakranijalno .implantiranih U251 i. SF-295 glioblastoma u atimičnim MCr-nu miševima. Doziranja proizvoda (Ia) su bila 30, 20 i 13,4 mg/kg/doza. Za dva intrakranijalno implantirana eksperimenta, ćelije su pripremljene pri koncentraciji od 3,33 x 10<7>ćelija na ml medija i ubrizgane injekcijom pri zapremini od 0,03 ml po mišu. Ćelije su ubrizgane injekcijom u cerebrum na desno od središjne linije sa špricom 25, sa iglom od nerđajućeg čelika dužine 0,95 cm (3/8 inča). Za U251 eksperiment (RP-36) su upotrebljene gajene (kultivisane) ćelije. Raspored tretmana je bio q6d x 3, iv, započinjući na dan četiri posle implantacije. Za SF-295 eksperiment (RP-38) je upotrebljena tumorska čorba koja je napravljena od čvrstog tumora. Raspored tretmana je bio q4d x 3, iv, započinjući na dan dva posle implantacije. Radi poređenja u svakom eksperimentu je data nitrozourea zbog njene poznate aktivnosti protiv CNS tumora. Doziranja su bila 27, 18 i 12 mg/kg/doza i raspored tretmana je bio isti kao raspored tretmana za proizvod (Ia) u svakom eksperimentu.

U prvom eksperimentu (RP-36), svako jedinjenje je bilo efikasno u lečenju (tretmanu) intrakranijalno implantiranog U251 glioblastoma. Tretman sa proizvodom (Ia) je rezultovao u pet od deset, četiri od deset odnosno tri od deset životinja koje su preživele 122 dana i u vrednostima IL.S od 176%, 202% odnosno 144%, za grupe sa doziranjima od 30, 20 (MTD) i 13,4 mg/kg/doza. Tretman sa nitrozoureom je rezultovao u vrednostima ILS od 205% odnosno 51% za grupe sa doziranjima od 18 odnosno 12 mg/kg/doza. Deset od deset i sedam od deset životinja je preživelo 122 dana u grupama sa doziranjima od 27 (MTD) i 18 mg/kg/doza.

U drugom eksperimentu (RP-38), svako jedinjenje je bilo efikasno u lečenju (tretmanu) intrakranijalno implantiranog SF-295 glioblastoma. Tretman sa proizvodom (Ia) pri doziranjima od 30, 20 i. 13,4 (MTD) mg/kg/doza je rezultovao u vrednostima ILS od -9%, 94% odnosno 81%. Bilo je nešto toksičnosti pri koncentracijama doziranja od 30 i 20 mg/kg/doza što je evidentirano odgovarajućim srednjim gubitkom težine od 7 g odnosno 6 g u toku perioda tretmana. Jedna od deset životinja je preživela 68 dana u grupi sa doziranjem od 13,4 mg/kg/doza. Nitrozourea je bila toksična pri najvećoj koncentraciji doziranja od 27 mg/kg/doza što je evidentirano srednjim gubitkom težine od 7 g u toku perioda tretmana. Tretman sa nitrozoureom pri doziranjima od 27, 18 i 12 mg/kg/doza je rezultovao u vrednostima ILS od 50%, 131% odnosno 106%. Dve od deset životinja su preživele 68 dana u grupi sa doziranjem od 27 (MTD) mg/kg/doza i jedna od deset životinja je preživela 68 dana u grupi sa doziranjem od 18 mg/kg/doza.

Sumarno uzevši, proizvod (Ia) je testiran protiv intrakranijalno implantiranih U251 i SF-295 glioblastoma. Ovo jedinjenje je sasvim aktivno protiv ova dva tumorska niza ćelija na oba mesta implanta.

Claims

1. Primena 4a-acetoksi-2a-benzoiloksi-5p, 20-epoksi-ip-hidroksi-70,10p-dimetoksi-9-okso-ll-taksen-13a-il-( 2R,3S)-3-terc-butoksikarbonilamino-2-hidroksi-3-fenilpropionata za dobivanje leka za lečenje abnormalne proliferacije ćelija u mozgu,naznačena time,što se pomenuti lek daje intravenskim putem.

2. Primena jedinjenja prema zahtevu 1,naznačena time,što je abnormalna proliferacija ćelija ustvari kancer mozga.