EA005135B1

EA005135B1 - Новое применение таксоидных производных

Info

Publication number: EA005135B1
Application number: EA200100248A
Authority: EA
Inventors: Мари-Кристин Биссери; Патрисиа Вриньо; Саймон Робертс; Клайв Брили
Original assignee: Авентис Фарма С.А.
Priority date: 1998-08-17
Filing date: 1999-08-13
Publication date: 2004-12-30
Also published as: ZA200101292B; CN1200707C; UA70332C2; CN1367691A; EA200100248A1; PL346113A1; EP0982027A1; BR9913025A

Abstract

Настоящее изобретение относится к новому применению таксоидных производных. Более конкретно, оно относится к способу лечения аномальной пролиферации клеток головного мозга у млекопитающих, в том числе у человека, путем введения таксоидного производного.

Description

Настоящее изобретение относится к новому применению таксоидных производных, а именно к 4а-ацетокси-2а-бензоилокси-5в,20эпокси-13-гидрокси-73,103-диметокси-9-оксо11-таксен-13а-ил-(2К,38)-3-трет-бутоксикарбониламино-2-гидрокси-3-фенилпропионату фор-

для лечения аномальной (патологической) пролиферации клеток головного мозга млекопитающих, включая человека, путем внутривенного введения.

Из патента АО 96/30355 известно, что соединение настоящего изобретения можно получить двумя способами. В соответствии с первым, многостадийным способом, если исходить из 10-деацетилбаккатина III формулы

то последний селективно защищают в положениях 7 и 13, например, в форме простого силилового диэфира, а затем действуют веществом общей формулы

К-Х (IV) где заместитель К представляет собой метильный радикал, а Х представляет собой реакционно-способный сложноэфирный остаток, такой как остаток эфира серной или сульфоновой кислоты, или атом галогена, с получением продукта, содержащего группу -ОСН₃ в положении 10 и силильные группы в положениях 7 и 13. Затем защитные силильные группы заменяют на атомы водорода, получают соединение, все еще содержащее группу -ОСН₃ в положении 10 и ОНгруппы в положениях 7 и 13. Последнее производное селективно превращают в простой эфир в положении 7 реакцией с производным формулы IV, получая соединение формулы (Ы), в котором в 13 положении находится группа -ОН.

Конечная стадия заключается в этерификации в положении 13 способом, который сам по себе известен, производных формулы (Ы), где в положении 13 находится ОН, в присутствии β-лактама, например по методике, описанной в патенте ЕР 617018, или в присутствии оксазолидина, как описано, например, в упомянутом выше патенте АО 96/30355. После сня тия защиты удалением защитных групп в положениях 7 и 10 получают сложный эфир формулы (!а). Следующая стадия состоит во взаимодействии одновременно положений 7 и 10 под действием реагента, образующегося непосредственно в реакционной смеси из сульфоксида формулы (V) и уксусного ангидрида (реакция Пуммерера),

К-8О-К (V), где заместитель К имеет указанное выше значение, с образованием промежуточного соединения алкилтиоалкилокси-типа в положениях 7 и 10.

Конечную стадию, позволяющую получить желаемое соединение формулы (Ы), проводят с использованием полученного выше промежуточного соединения, при взаимодействии его с активированным никелем Ренея.

В общем случае, обработку реагентом, образующимся непосредственно в реакционной смеси из сульфоксида общей формулы (V), предпочтительно диметилсульфоксида, и уксусного ангидрида, проводят в присутствии уксусной кислоты или производного уксусной кислоты, такого как галогенуксусная кислота, при температуре в интервале от 0 до 50°С.

Обычно обработку активированным никелем Ренея в присутствии алифатического спирта или простого эфира осуществляют при температуре между -10 и 60°С.

В публикации ЕК 97-14442 описан еще один способ. Это изобретение позволяет в одну стадию, напрямую, селективно и одновременно алкилировать две гидроксильные функциональные группы в положениях 7 и 10 10-деацетилбаккатина или его этерифицированных в положение 13 производных формулы (VI)

где А, в частности, представляет собой боковую цепь формулы (Па), представленную ниже,

где О представляет собой защитную группу для гидроксильной функциональной группы.

В качестве исходного соединения предпочтительно использовать 10-деацетилбаккатин, то есть продукт формулы (III), что дает заметную экономию, что касается способа, и, более того, позволяет исключить стадии введения защиты и снятия защиты с промежуточного соединения, которые необходимы в старых способах.

Среди групп О для защиты гидроксильной функциональной группы в формуле (Па) в об щем случае предпочтительно выбирать все защитные группы, которые описаны в книгах, таких как Сгеепе аиб Аи1к, Рго1ссБус Сгоирк ίη Отдаше 8уп1йек1к (Защитные группы в органическом синтезе), 1991, Ιοίιη Абеу & 8опк, и МаеОт1е, Рто1ее11уе Сгоирк ίη Отдаше Сйетщйу (Защитные группы в органической химии), 1975, Р1епит Ргекк, и которые удаляют в условиях, при которых остаток молекулы разрушается слабо или не разрушается вообще, такие как, например простые эфиры, предпочтительно такие эфиры, как метоксиметиловый эфир, 1-этоксиэтиловый эфир, бензилоксиметиловый эфир, пметоксибензилоксиметиловый эфир, бензиловые эфиры, необязательно замещенные одной или более группами, такими как метокси-, хлор, нитро-, 1-метил-1-метоксиэтиловый эфир, 2(триметилсилил)этоксиметиловый эфир, тетрагидропираниловый эфир, и силиловые эфиры, такие как триалкилсилиловые эфиры, карбонаты, такие как трихлорэтилкарбонат.

Более конкретно, радикалы Н_а и Н_Ь в общей формуле (11Ь) выбирают из радикалов, которые описаны в патенте АО 94/07878, и более предпочтительными производными являются производные, в которых радикал Н_а представляет собой атом водорода, а радикал Н_Ь представляет собой п-метоксифенильный радикал.

Алкилирующий агент выбирают из алкилгалогенидов, предпочтительно из алкилйодидов (К1), алкилсульфатов, таких как метилсульфат, соединений оксония, таких как борные соли триалкилоксония, в частности триметилоксонийтетрафторборат (Ме₃ОВР₄).

Предпочтительно использовать метилйодид.

Алкилирующий агент используют в безводной среде в присутствии анионизирующих агентов, таких как одно или более сильное основание.

Среди оснований, которые могут быть использованы в безводной среде, можно назвать следующие:

гидриды щелочных металлов, такие как гидрид натрия или калия, алкоголяты щелочных металлов, такие как трет-бутилат калия, оксид серебра Ад2О, 1,8-бис(диметиламино)нафталин, смеси моно- или диметаллических оснований, такие как основания, описанные, например, в публикациях, таких как Р. СаиЬете, Сйет. Неу. 1993, 93, 2317-2334, или М. 8еЫоккет, Моб. 8уШ11. Мебюбк (1992), 6, 227-271; в частности предпочтительными являются сочетания алкиллитий/трет-бутилат щелочного металла или амид щелочного металла/трет.-бутилат щелочного металла. Одно из двух оснований можно получать непосредственно в реакционной смеси «ίη кйи».

Среди всех возможных сочетаний алкилирующих агентов и анионизирующих агентов предпочтительным является использование метилйодида в присутствии гидрида калия.

Реакцию предпочтительно проводят в органической среде, являющейся инертной в условиях реакции. Предпочтительно использование следующих растворителей:

простых эфиров, таких как тетрагидрофуран или диметоксиэтан, при применении оксида серебра предпочтительно использование полярных апротонных растворителей, таких как диметилформамид, или ароматических растворителей, таких как толуол, при применении 1,8-бис(диметиламино) нафталина предпочтительно использование сложных алкиловых эфиров, например этилацетата.

Для лучшего осуществления изобретения предпочтительно использовать мольное соотношение между анионизирующим агентом и субстратом больше чем 2, и предпочтительно в интервале от 2 до 20.

Также предпочтительно использовать мольное соотношение между алкилирующим агентом и субстратом больше 2, и предпочтительно в интервале от 2 до 40.

Предпочтительной является температура от -30 до 80°С.

Время реакции преимущественно находится в интервале от нескольких часов до 48 ч в зависимости от выбранных реакционных условий.

После стадии алкилирования, когда последнюю проводят с 10-деацетилбаккатином, способ известным образом переходит к стадии этерификации, например в соответствии со способами, описанными в упомянутых выше патентах ЕР 617018 или АО 96/30355.

Таким образом, в первом трехстадийном способе процесс начинают с диалкилирования 10-деацетилбаккатина с использованием алкилирующего агента в присутствии сильного основания, на второй стадии проводят сочетание 10-деацетилбаккатина, превращенного в диэфир в положениях 7 и 10, с защищенным подходящим образом β-лактамом, в присутствии активирующего агента, выбираемого из третичных аминов и металлооснований, которые обеспечивают образование алкоксильной группы в положении 13. Затем осуществляют снятие защиты боковой цепи путем обработки неорганической или органической кислотой.

Во втором трехстадийном способе процесс начинают с диалкилирования 10-деацетилбаккатина с использованием алкилирующего агента в присутствии сильного основания, на второй стадии 10-деацетилбаккатин, превращенный в простой диэфир в положениях 7 и 10, сочетают в 13 положении с оксазолидином в присутствии сочетающего агента, такого как диимиды, в присутствии активирующего агента, такого как диалкиламинопиридин. Раскрытие оксазолидина достигается действием неорганической или органической кислоты.

Третий способ начинается с этерификации в положении 13 баккатина с защищенными подходящим образом положениями 7 и 10, β-лактамом или оксазолидином в присутствии сочетающего агента и/или активирующего агента, как показано в описанных выше двух способах. После снятия защиты в 7 и 10 положениях получают простой диэфир в положениях 7 и 10 с помощью алкилирующего агента в присутствии сильного основания. Затем снятие защиты боковой цепи достигается путем обработки неорганической или органической кислотой.

4а-Ацетокси-2а-бензоилокси-5в,20-эпокси1 в-гидрокси-7в,10 в-диметокси-9-оксо-11-таксен13а-ил-(2К,38)-3-трет-бутокси-карбониламино2-гидрокси-3-фенилпропионат обладает замечательными биологическими свойствами.

Оценку биологической активности ίη νίίτο проводят на тубулине, экстрагированном из свиного головного мозга методом, описанным М.Ь. 8йе1ап5к1 οί а1., Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А, 70, 765-768 (1973). Исследование деполимеризации микротрубочек в тубулине проводят в соответствии с методом 6. Сйатаеге е1 а1., С.К. Асаб. 8с1., 293, зепе II, 501-503 (1981).

Соединение настоящего изобретения подтвердило активность ίη νΐνο при проверке на мышах, привитых меланомой В16, в дозах между 1 и 50 мг/кг (внутрибрюшинно), а также на других мягких и твердых опухолях.

Соединение обладает противоопухолевыми свойствами, более конкретно активностью против опухолей, устойчивых к Тахо1® и Тахо1еге®. К таким опухолям относятся, например, опухоли головного мозга, которые имеют повышенную экспрессию тбг1 гена (гена устойчивости к многочисленным лекарственным средствам). Определение «устойчивость к многочисленным лекарственным средствам» представляет собой обычный термин, относящийся к устойчивости опухоли к различным соединениям, имеющим различную структуру и механизм действия. Таксоиды, как общеизвестно, хорошо изучены с помощью экспериментальных опухолей, например Ρ388/ΏΟΧ, линии клеток Р388 мышиной лейкемии, выбранной по устойчивости к доксорубицину (ΌΟΧ), которая экспрессирует тбг1. Соединения в соответствии с настоящим изобретением менее изучены с помощью Ρ388/ΌΟΧ. Более конкретно, эти соединения менее изучены, чем Тахо Юге''; с помощью гена тбг1.

4а-Ацетокси-2а-бензоилокси-5в,20-эпокси1 в-гидрокси-7 в,10в-диметокси-9-оксо-11-таксен13а-ил-(2В,38)-3-трет-бутоксикарбониламино2-гидрокси-3-фенилпропионат используется при получении лекарственного средства для лечения аномальной пролиферации клеток головного мозга.

Соединение, главным образом, обладает свойством проникать через гематоэнцефалический барьер. Оно активно в сравнении с другими известными таксоидами, такими как Тахо1® и Таxοίе^е®, при лечении рака головного мозга.

Продукт формулы (1а) может быть использован одновременно с другим терапевтическим лечением. Более предпочтительно его используют с другим терапевтическим лечением, включающим использование противоопухолевых лекарств, моноклональных антител, иммунотерапию, радиотерапию или модификаторы биологических реакций. Среди модификаторов биологических реакций предпочтительно использование лимфокинов и цитокинов, интерлейкинов, α-, β- или δ-интерферонов и факторов опухолевого некроза (ТИТ).

Продукт формулы (1а) вводится внутривенно.

Пример 1.

1. Введение.

Продукт формулы (1а) проявил себя сильнодействующим противораковым агентом в доклинических моделях.

Здесь представлены аналитические результаты, полученные при фармакокинетическом исследовании на мышах одного в/в болюса.

Группам самок мышей С3Н/НеИ вводят продукт внутривенным способом в виде болюса в дозе 40 мг/кг, эквивалентной 120 мг/м². Образцы крови и головного мозга получают от всех дозированных животных, которых умерщвляют в интервале до 72 ч после введения дозы лекарства. Головной мозг и соответствующие образцы плазмы анализируют на содержание продукта (1а) с помощью ЬС-М8/М8-анализа (жидкостная хроматография/масс-спектрометрия).

2. Методы.

Препарат: 2,25 мг/мл раствора, содержащего 5% полисорбата 80, 5% этанола и 90% 5%ного водного раствора глюкозы.

Каждой из 56 самок мышей С3Н/НеИ весом приблизительно 20 г через хвостовую вену вводят препарат продукта (II) с помощью в/в болюса при объеме инъекции 0,4 мл, чтобы ввести суммарную дозу 40 мг/кг.

Отбор образцов крови и тканей

Отбор образцов: крови - путем сердечной пункции; печени и головного мозга - путем вскрытия после умерщвления с помощью СО₂.

Время отбора образцов: через 2, 5, 15, 30, 45 мин, 1, 2, 4, 6, 8, 14, 48 и 72 ч после введения дозы.

Цельную кровь собирают в гепаринизированные пробирки и получают соответствующие образцы плазмы путем центрифугирования и немедленного замораживания при -20°С. Ткани просушивают с помощью промокательной бумаги, взвешивают и немедленно замораживают при -20°С. Все образцы отправляют на анализ

Ί замороженными. После получения образцы хранят в ожидании анализа в замороженном виде приблизительно при -18°С.

Анализ образцов головного мозга и плазмы с помощью ЬС-М8/М§

Определение: ЬС-М8/М8 (8с1ех ΑΡΙ III р1ик), способ турбоионного впрыскивания.

Используются следующие условия масс спектрометрии:

Скорость вспомогательного газа

Скорость распыляющего газа

Турботемпература

Температура экранирующего газа

Скорость экранирующего газа

Время развертки

Отношение деления потока элюента л/мин

0,6 л/мин

450°С

300°С

0,6 л/мин развертка/с

1:10

Колонка: 75х4,6 мм 8ире1соя1 ΑΒΖ р1ик (3 мкм). Подвижная фаза: Ацетонитрил/метанол/ ацетат аммония (10 мМ); 40/25/35 об./об./об.

Скорость потока: 1 мл/мин.

Температура: комнатная.

Экстракция.

Плазма: к образцу (50 мкл) добавляют 100 мкл ацетонитрила. Хорошо перемешивают, центрифугируют, удаляют надосадочную жидкость, добавляют 100 мкл подвижной фазы и впрыскивают 150 мкл.

Головной мозг: добавляют 100 мкл ацетонитрила к гомогенизированному образцу (100 мг гомогената головного мозга с водой при соотношении 1:1 вес./вес.) и хорошо перемешивают. Добавляют 1 мл диэтилового эфира, перемешивают, центрифугируют, удаляют органический слой и сушат под Ν₂. Восстанавливают в 200 мкл подвижной фазы и впрыскивают 150 мкл.

Калибровочные стандарты.

Плазма: Девять с концентрациями 5, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400 и 500 нг/мл (продукт (1а)). Получают путем добавления соответствующих аликвот продукта (концентрации=0,1, 1 или 10 мкг/мл) в этаноле к аликвотам мышиной плазмы объемом 0,5 мл. Каждый образец после добавления лекарства хорошо перемешивают; затем отбирают аликвоту в 50 мкл для анализа.

Головной мозг: Одиннадцать с концентрациями 10, 20, 30, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2500 и 5000 нг/г в гомогенизированном головном мозге мышей (1:1 вес./вес. головного мозга с водой). Получают путем добавления соответствующих аликвот продукта (концентрации=1, 10 или 100 мкг/мл) в этаноле к 0,5, 1, 3 или 4 г гомогенизированного мышиного головного мозга. Каждый образец после добавления лекарства хорошо перемешивают, затем отбирают аликвоту в 100 мг для анализа.

Время удерживания: лекарство, продукт (1а) - ~2,3 мин.

Эффективность экстракции.

Плазма: приблизительно 58% при 200 нг/мл.

Головной мозг: приблизительно 41% при 500 нг/г и 39% при 1000 нг/г.

3. Результаты.

3.1. Концентрации в плазме.

В следующей таблице представлены концентрации продукта (I) в плазме, наблюдаемые после внутривенного введения мышам продукта Да) в дозе 40 мг/кг.

Таблица 1

Предварительные концентрации в плазме продукта Да) после в/в введения мышам в дозе 40 мг/кг

введения дозы(час)	Концентрация в плазме продукта 1а (нг/мл)
	IV!	1У2	ιν3	1У4	Среднее значение	± ср.квад, ошибка
2 мин	52987	45942	49607	38994	46882	5994
5 мин	36734	33538	32077	34903	34313	1984
15 мин	20493	20897	21051	19459	20475	717
0,5 час	10765	10344	9170	11232	10378	883
0,75 час	7133	10948	8121	10148	9087	1764
1 час	6017	7423	6693	6079	6553	655
-	4633	4337	4600	3564	4283	498
4 часа	1072	1110	835	830	962	150
6 часов	449	316	346	336	362	59
8 часов	204	199	195	154	188	23
14 часов	65	56	50	52	56	7
24 часа	18(нпко)	15 (нпко)	15(нпко)	16(нпко)	16	1
48 часов	4 (нпко)	н.о.	н.о.	4(нпко)	2	2
72 часа	н.о.	н.о.	н.о.	н.о.	___	н.п.

н.п. - не пригодна

н.о. - не определяется (< нижнего предела обнаружения 4 нг/мл) нпко - ниже предела точного количественного определения (20 нг/мл)

3.2. Концентрации в головном мозге.

В приведенной ниже таблице представлены концентрации продукта Да) в неповрежденном головном мозге, наблюдаемые после внутривенного введения мышам продукта Да) в дозе 40 мг/кг.

Таблица 2

Предварительные концентрации в головном мозге продукта Да) после в/в введения мышам в дозе 40 мг/кг

введения доэы(час)	Ко	нцентрация	в головном	мозге пролу	кта Га (нг/г)
	ινι	ГУ2	1УЗ	1У4	значение	± ср.квад. ошибка
2 мин 5 мин 15 мин 0,5 час 0,75 час 1 час 2 часа 4 часа 6 часов 8 часов 14 часов 24 часа 48 часов 72 часа	6962 8344 5809 7262 7675 6424 7956 7909 6688 9067 9618 7905 6660 5899	8817 8473 7100 6788 8086 8964 8418 6939 7968 6977 10049 9842 8541 5511	8147 7762 7641 8317 7513 1747 6966 6712 7350 8616 7595 7885 7704 5692	7630 8091 6481 6894 7272 7489 7017 5459 3712 8342 9271 9052 7986 3894	7889 8167 6758 7315 7637 6156 7589 6755 6430 8250 9133 8671 7723 5249	786 313 791 698 342 3118 716 1008 1886 900 1074 952 789 917

н.о. - не определяется (< нижнего предела обнаружения 92 нг/г)

н.п. - не пригодна

3.3. Фармакокинетические параметры.

В следующей таблице приведены предварительные фармакокинетические параметры для продукта Да), полученные после в/в введения мышам в дозе 40 мг/кг и рассчитанные с использованием средних значений содержания в плазме и головном мозге.

Таблица 3 Предварительные средние фармакокинетические данные

Образец	ППКо-_в(час'мкг/мл или г)	Клс (л/час’кг)	Урасп. (л/кг)	Начальное Т1/2 (час)	Конечное Т1/2 (час)
Плазма+	30, 0	1, 3	1, 9	0, 7	6,2
Плазма#	29, 8	1, з	2,4	0,2	2, 0
Мозг	787,8*	Н.П.	н.о.	—	31, 4

+ рассчитано из величин > н.п.о. 4 нг/мл # рассчитано из величин > нпко 20 нг/мл * соответствующая ППК₀._{72 ч}=549,7 ч· мкг/г

Биэкспоненциальное уравнение удовлетворяет профилям, использующим интерактивный линейный алгоритм наименьших квадратов в качестве части пакета 8ΙΡΗΆΚ. Площадь под кривой (ППК, АИС) рассчитывают по правилу трапеции от нулевого времени и до времени как последнего значения, которое равно или больше, чем н.п.о. (нижний предел обнаружения)+(4 нг/мл) или нпко (нижний предел количественного определения)#(20 нг/мл) для плазмы, так и до 72 ч после введения дозы для головного мозга, а затем экстраполируют к бесконечности.

Сокращения

ППК_0-М: площадь под кривой зависимости концентрации в плазме или мозге от времени от 1=0 (начало вливания) до бесконечности.

Начальное Т_1/2: Начальный период полувыведения (распределение).

Конечное Т_/2: Конечный период полувыведения (следует рассматривать как оценку, зависящую только от частоты отбора образцов на заключительной фазе и от чувствительности анализа).

Клс - суммарный клиренс плазмы.

У_расп - объем распределения при стационарном состоянии.

н. п. - не пригодно

4. Выводы.

Концентрации продукта (1а) являются высокими, как и следовало ожидать, после внутривенного введения дозы 40 мг/кг, но быстро падают от максимального значения через 2 мин (среднее значение 46,9 мкг/мл) менее чем до 1 мкг/мл в пределах 4 ч (начальный период полувыведения <0,7 ч). Однако концентрации сохраняются на уровне выше предела точного количественного определения (20 нг/мл) вплоть до 14 ч после введения и стабильно выше предела обнаружения (4 нг/мл) в течение 24 ч после введения дозы.

Конечный период полувыведения 6,2 ч рассчитан из концентраций в плазме, которые могут быть определены (>4 нг/мл). Однако следует отметить, что в этом случае конечный период полувыведения зависит в значительной степени от чувствительности анализа, и, если вместо этих концентраций для расчета фармакокинетических параметров используют концентрации выше предела точного определения (20 нг/мл), то конечное время полувыведения падает до 2,0 ч.

Среднее значение суммарного клиренса плазмы, как определено, составляет 1,3 лЛткг. что представляет собой значительную часть среднего потока плазмы через печень (из расчета на средний поток крови через печень, составляющий приблизительно 5,2 л/чжг).

В этих образцах после в/в введения продукт (1а), как оказывается, легко проникает через гематоэнцефалический барьер. Высокие концентрации обнаружены при начальном времени отбора образцов (7,9 мкг/г через 2 мин), что указывает на быстрое проникновение в эти ткани. Хотя максимальные концентрации 9,1 мкг/г наблюдаются через 14 ч, высокие концентрации сохраняются вплоть до времени последнего отбора образца (5,3 мкг/г через 72 ч). Не удивительно, что продукт медленно выводится из головного мозга с периодом полувыведения 31,4 ч. Исходя из величин ППК_0-М (788 ч^мкг/г относительно 30 ч^мкг/мл), концентрации продукта (1а) в головном мозге составляют приблизительно 12-кратную концентрацию в плазме.

Пример 2. Оценка противоопухолевой активности продукта (1а) относительно интракраниально привитых глиобластом человека И251 и 8Р-295 на мышах Νίτ-ηιι.

Проведено четыре исследования для оценки реакции глиобластом И251 и 8Р-295 при лечении с помощью продукта (1а). В двух исследованиях глиобластомы И251 и 8Р-295 были стимулированы от интракраниально привитых клеток при объеме 10⁶ клеток на одну мышь. Схема лечения интракраниально привитых клеток глиобластом И251 - внутривенно, 1 раз в день, каждый шестой день при трех обработках (с.|6б х 3), начиная с четвертого дня после прививки. Схема лечения интракраниально привитых клеток глиобластом 8Р-295 - внутривенно, 1 раз в день, каждый четвертый день при трех обработках (с.|4б х 3), начиная со второго дня после обработки. При исследовании интракраниальной прививки соединения оценивают, исходя из их способности увеличивать продолжительность жизни животных. В обеих моделях этих опухолей в качестве положительного контроля используют нитрозомочевину.

Целью данного эксперимента является оценка продукта (1а) с точки зрения противоопухолевого действия в моделях опухолевых глиобластом человека.

В этих экспериментах общие методики ОСТО, Νί,Ί и методики для изучения эффективности ίη νίνο были модифицированы для конкретного применения (Ιη νίνο Сапсег Мобек, ΝΙΗ РиЬйсабоп № 84-2635, 1984). Эти исследования проведены на усовершенствованном оборудовании (АААЬАС Кедк1табоп № 000643, ААЬА8 МешЬегаЫр № 840723001, и8ЭА РеДЧгаОоп № 64-Ε-001, ΟΡΡΕ, ΡΗδ, ΝΙΗ, ААЛ, А^итапсе № А3046-01). Это оборудование имеет сертификат Ι8Ο 9001. Комиссией по надзору был

8ои111егп Некеагсй ΙηδΙίΙιιΙίοηαΙ Лшта1 Саге апй Ике СоттйТее; использовался протокол 1АСИС № 96-8-50.

Разбавители.

Продукт (Та) готовят в 5% этанола, 5% Тмееп 80, 90% Ό5№.

Нитрозомочевину готовят в 2% этанола, 98% физиологического раствора.

Приготовление доз.

Все дозирующие растворы приготовлены в

8ои!йет Некеагсй ТпьНТиТе (8ΡΙ).

Введение соединения.

Продукт (1а) вводят из расчета 0,4 мл/мышь, исходя из среднего общего веса тела.

Нитрозомочевину вводят из расчета 0,1 мл/ 10 г веса тела.

Стабильность соединения.

Продукт (1а) держат во льду и вводят в течение 20 мин после получения препарата.

Нитрозомочевину держат во льду и вводят в течение 45 мин после получения препарата.

Условия хранения.

Все соединения хранят в охлажденном эксикаторе.

Меры предосторожности при работе.

С соединениями работают в соответствии с методиками, рекомендуемыми Комиссией по безопасности 8оиТйет Некеагсй 1п8ТйиТе. Все специалисты, проводящие эксперимент, при введении соединений полностью одеты, работают в перчатках и защитных масках и защитных очках.

Любое интракраниально привитое животное, которое, как кажется, умирает, безболезненно умерщвляют из гуманистических соображений. Так как исследование эффективности попадает в категорию базового исследования, окончание эксперимента базируется на результатах, которые, как определено, являются оптимальными.

Виды.

Самок атимичных мышей ДСг-пи возрастом 6-8 недель используют для опытов с интракраниально привитой И251. Самцов атимичных мышей Νίτ-ΐ'ΐιι возрастом 6-8 недель используют для опытов с интракраниально привитой 8Е-295.

Обоснование.

Для распространения человеческих опухолевых ксенотрансплантантов, которые являются целевыми тканями для разрабатываемых соединений, необходимы мыши с иммунодефицитом.

Источник.

ЕСНОС (Ашта1 Ргойисйои Агеа), Егейепск, МО - для изучения интракраниально привитой 8Е-295; Тасошс Ашта1 Еагтк, бегтапТомш, ΝΥ для исследований интракраниально привитой И251.

Количество и пол.

В опытах с интракраниально привитой 8Е295 используют суммарно 160 самцов; в опытах с интракраниально привитой И251 используют суммарно 154 самки.

Возраст и вес.

Средний вес определяют вначале каждого испытания. Средний вес мышей, привитых интракраниально глиобластомой И251, составляет от 21 до 22 г. Средний вес мышей, привитых интракраниально глиобластомой 8Е-295, составляет от 24 до 26 г.

Идентификация животных.

Стандартная маркировка на ушах. Карантин.

Перед началом испытаний всех животных содержат в течение 7-дневного периода для наблюдения.

Содержание и уход.

Животных содержат в клетках изолятора, покрытых фильтром, по 5 животных на клетку. Клетки и подстилку меняют 2 раза в неделю.

Пища и вода.

Мышам дают Тек1ай 81ег1|/аЫе 8656 Мойке О1е! (Наг1ап Тек1ай) по усмотрению проводящего эксперимент. Также дают фильтрованную водопроводную воду по усмотрению.

Окружающие условия.

Поддерживаются в соответствии со стандартными рабочими методиками 8К1, одобренными Комиссией 1АСИС.

В это исследование включено два опыта (НР-36 и КР-38).

Как упоминалось ранее, этот эксперимент разработан для оценки активности продукта (1а) в отношении интракраниально привитых глиобластом И251 и 8Е-295 у атимичных мышей Ν&-μ. Дозы продукта (1а) составляют 30, 20 и 13,4 мг/кг/доза. Для двух опытов с интракраниальной прививкой готовят клетки при концентрации 3,33х10⁷ клеток/мл среды и вводят в объеме 0,03 мл на мышь. Клетки вводят в головной мозг справа от средней линии с помощью иглы из нержавеющей стали 25 размера, 3/8 дюйма. Для опыта с И251 (КР-36) используют культивируемые клетки. Схема лечения - с.|6й х 3 (каждый шестой день, 3 раза), внутривенно, начиная с четвертого дня после прививки. В опыте с 8Е-295 (КР-36) используют опухолевый Ьге1, приготовленный из твердой опухоли. Схема лечения - с.|4й х 3, внутривенно, начиная со второго дня после прививки. Для сравнения в каждом опыте используют нитрозомочевину из-за ее известной активности в отношении опухолей центральной нервной системы. Дозировка составляет 27, 18 и 12 мг/кг/доза, а схема лечения аналогична схеме лечения с помощью продукта (1а) в каждом опыте.

В первом опыте (КР-36) каждое соединение было эффективно при лечении интракраниально привитой глиобластомы И251. Лечение с помощью продукта (1а) приводит к 5 из 10, 4 из 10 и 3 из 10 оставшихся в живых на сто двадцать второй день и к росту продолжительности жизни (РПЖ) 176, 202 и 144% соответственно для групп с дозами 30, 20 (МТО, МПД максимально переносимая доза) и 13,4 мг/кг/доза. Лечение с помощью нитрозомочевины приводит к РПЖ 205 и 51% в группах с дозами 18 и 12 мг/кг/доза соответственно. Отмечено 10 из 10 и 7 из 10 оставшихся в живых на сто двадцать второй день в группах с дозами 27 (МПД) и 18 мг/кг/доза.

Во втором опыте (КР-38) каждое соединение было эффективно при лечении интракраниально привитой глиобластомы 8Р-295. Лечение с помощью продукта (1а) при дозах 30, 20 и 13,4 (МПД) мг/кг/доза приводит к РПЖ 9, 95 и 81% соответственно. Наблюдается некоторая токсичность при уровнях доз 30 и 20 мг/кг/доза, которая проявляется в соответствующей средней потере веса в 7 г и 6 г в период лечения. Было 1 выжившее на шестьдесят восьмой день животное из 10 животных в группе с дозой 13,4 мг/кг/доза. Нитрозомочевина была токсична при самом высоком уровне доз 27 мг/кг/доза, что проявляется в средней потере веса 7 г в период проведения лечения. Лечение нитрозомочевиной в дозах 27, 18 и 12 мг/кг/доза приводит к РПЖ 50, 131 и 106% соответственно. Было 2 оставшихся в живых на шестьдесят восьмой день животных из 10 животных при уровне дозы 18 мг/кг/доза.

Таким образом, изучена активность продукта (1а) против интракраниально привитых глиооластом И251 и 8Р-295. Это соединение достаточно активно против этих двух линий опухоли на обоих привитых сайтах.

Реакция интракраниально привитой глиобластомы И251 на лечение с помощью продукта (1а)

ки: 17.08.98; атимичные мыши Νί'.Τ-ηι.ι - самки Тасошс Ашта1 Рагтк.

Контроль, 2% ЕЮН/физиологический раствор; объем инъекции=0,1 куб.см/10 г веса тела.

Продукт 1(а), серия ВРС611, полученная из партии № 1 в 5% Е1ОН/5% Т\уссп 80/90% Ω5\ν (растворимый); объем инъекции=0,4 куб.см.

Нитрозомочевина, полученная из партии № 2 в 2% Е1ОН /физиологический раствор (растворима); объем инъекции=0,1 куб.см/10 г веса тела.

Примечание: 1) Выживших на сто двадцать второй день животных при расчетах не используют. Срединный день смерти рассчитывают с использованием всех смертей.

2) У - умерщвленные умирающие животные (используются при расчетах).

Реакция интракраниально привитой глиобластомы 8Р-295 на лечение с помощью продукта (1а)

01/А/05Р3Т8; привита - 26.08.98; атимичные мыши Νί.Τ-ηι.ι - самцы - Ргсйспск Сапсег Рс5сагс11 Эсус1оршсп1 СсШсг.

Контроль, 2% Е1ОН /физиологический раствор; объем инъекции=0,1 куб.см/10 г веса тела.

Продукт 1(а), серия ВРС611, полученная из партии 8К1 № 1 в 5% Е1ОН/5% Т\уссп 80/90% Ό5ν (растворимый); объем инъекции=0,4 куб.см.

Нитрозомочевина, Вп81о1-Мусг8 партия БАН84, полученная из партии 8К1 № 2-4 в 2% Е1ОН/физиологический раствор (растворима); объем инъекции=0,1 куб.см/10 г веса тела.

Примечание: 1) Выживших на шестьдесят восьмой день животных при расчетах не используют. Срединный день рассчитывают с использованием всех смертей.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение 4а-ацетокси-2а-бензоилокси5в,20-эпокси-1в-гидрокси-7в,10в-диметокси-9оксо-11-таксен-13а-ил-(2В,38)-3-трет-бутоксикарбониламино-2-гидрокси-3-фенилпропионата для получения лекарственного средства для лечения аномальной пролиферации клеток головного мозга путем внутривенного введения.
2. Применение соединения по п.1, где аномальная пролиферация клеток представляет собой рак головного мозга.
3. Применение соединения по п.2, где это применение осуществляется одновременно по меньшей мере с одним другим терапевтическим лечением.
4. Применение соединения по п.3, где другое терапевтическое лечение включает противоопухолевые лекарства, моноклональные антитела, иммунотерапию, радиотерапию или модификаторы биологической реакции.
5. Применение соединения по п.4, где модификаторы реакции включают лимфокины и цитокины.
6. Применение соединения по п.5, где модификаторы реакции включают интерлейкины, α-, β- или δ-интерфероны и факторы опухолевого некроза (ЮТ).