CN114177177B - 一种乏氧肿瘤选择性激活前药的制备方法 - Google Patents

一种乏氧肿瘤选择性激活前药的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114177177B
CN114177177B CN202111277266.7A CN202111277266A CN114177177B CN 114177177 B CN114177177 B CN 114177177B CN 202111277266 A CN202111277266 A CN 202111277266A CN 114177177 B CN114177177 B CN 114177177B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tumor
azide
selective activation
hypoxic
prodrug
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111277266.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114177177A (zh
Inventor
汤朝晖
孙佳丽
刘芷麟
沈娜
陈学思
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Original Assignee
Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS filed Critical Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Priority to CN202111277266.7A priority Critical patent/CN114177177B/zh
Publication of CN114177177A publication Critical patent/CN114177177A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114177177B publication Critical patent/CN114177177B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/454—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pimozide, domperidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了一种乏氧肿瘤选择性激活前药的制备方法，包括：将包含芳香氨基的抗肿瘤药物与叠氮化试剂进行叠氮化反应，得到叠氮化的乏氧肿瘤选择性激活前药。与现有技术相比，本发明将小分子药物的活性芳香氨基转化为叠氮化物，在常氧下可以保持稳定，而在缺氧肿瘤中，前药的叠氮基可以还原为氨基，释放出活性药物，并且氮气是其唯一产物，不会产生任何可能对身体有害的其他物质，从而可减轻其对全身的毒副作用，实现乏氧肿瘤选择性激活，有效避免了小分子原药的全身炎性反应。

Description

一种乏氧肿瘤选择性激活前药的制备方法
技术领域
本发明属于肿瘤治疗技术领域，尤其涉及一种乏氧肿瘤选择性激活前药的制备方法。
背景技术
近年来，癌症已经成为影响全球人类健康的第一杀手，每年有近千万人死于癌症。癌症的治疗方法主要有手术治疗、放疗和化疗。随着抗癌药物的不断研发，化疗在临床治疗中的应用也更加广泛。但是目前临床使用的抗癌药物对肿瘤的选择性均不高，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会损害机体的正常细胞，产生严重的毒副作用，如骨髓抑制和对消化系统、泌尿系统、呼吸系统、肝脏、心脏、皮肤等产生的毒性。
大量证据表明，肿瘤缺氧在放疗和化疗耐药中起着重要作用。分子氧是一种有效的放射增敏剂，因为它有助于氧化在组织照射中DNA中产生的自由基，因此，肿瘤中的缺氧细胞对放射治疗有直接和显著的抵抗。并且，肿瘤微环境也影响了实体肿瘤对化疗的耐药性。肿瘤微环境的特征主要在于药物浓度的显著梯度和细胞增殖速率的梯度，以及缺氧和酸性区域的梯度，所有这些都会影响肿瘤细胞对药物治疗的敏感性。并且肿瘤对化疗的反应性直接或间接地受到脉管系统的影响，因为抗癌药物会通过血液进入肿瘤，所以实体瘤中异常的脉管系统会影响肿瘤中营养物质的供应有限，从而会发生代谢变化(如缺氧)以及影响药物敏感性的细胞增殖梯度。
对于一种能杀死实体肿瘤中大量癌细胞的抗癌药物，它必须分布于肿瘤血管系统、血管壁和肿瘤组织。然而，大多数人和动物实体瘤都含有缺氧区域，许多药物在肿瘤内的分布是异质性的，因此只有一部分靶肿瘤细胞暴露于潜在致死浓度的细胞毒性药物中，这也大大降低了药物的药效。此外，缺氧细胞还可通过多种机制对化疗表现出相当大的耐药性。例如，缺氧细胞往往由于缺氧和营养物质的缺乏而处于静止状态，可逃避具有抗增殖特性的化疗药物的作用，如抗代谢药物，这些s-期特异性的制剂通过合并到分裂细胞的DNA中而发挥作用。
实体瘤的低氧微环境作为开发用于癌症治疗的新疗法的目标已引起了广泛关注。尽管肿瘤缺氧在肿瘤对放疗和化疗的耐药性中也起着重要作用，但它也为缺氧激活的前药Hypoxia-Activated Prodrugs(HAPs)的开发提供了条件。将肿瘤中的缺氧区作为癌症治疗的有吸引力的靶点，利用HAPs可以在缺氧肿瘤部位被选择性激活为活性药物，但在正常组织部位没有明显的毒性的优势，从而解决传统化疗药物的全身毒副作用，并将肿瘤缺氧从一个问题转化为选择性治疗的优势。
到目前为止，缺氧激活前药通常有一种共同的激活机制，即它们被细胞内氧化还原酶以氧敏感的方式还原，形成细胞毒素，达到治疗效果。其中替拉扎胺(TPZ)、巴诺蒽酮(AQ4N)和依福环磷酰胺(TH-302)在内的几种药物目前正在进行II期和III期的临床评估。近年来，以硝基咪唑、N-氧化物或硝基苄氨基甲酸酯类似物为还原性敏感基团的新型前药也不断涌现，取得了抑制肿瘤生长的效果。然而，由于大多数前药在体内激活后也会产生副产物，因此前药在体内的化学还原过程将极大地影响其安全性和未来的临床应用。
除了缺氧激活前药外，还可通过对小分子药物进行担载或纳米化来降低其全身毒性，但纳米药物对肿瘤的选择性不强，且在循环过程中会产生不可避免的泄露，并不能达到对肿瘤精准的选择性治疗的目的。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种乏氧肿瘤选择性激活前药的制备方法，该方法制备的乏氧肿瘤选择性激活前药不仅可在乏氧肿瘤部位选择性激活发挥抗肿瘤作用，实现肿瘤的选择性治疗，还可减轻全身毒副作用。
本发明提供了一种叠氮化的乏氧肿瘤选择性激活前药在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了一种乏氧肿瘤选择性激活前药的制备方法，包括：
将包含芳香氨基的抗肿瘤药物与叠氮化试剂进行叠氮化反应，得到叠氮化的乏氧肿瘤选择性激活前药。
优选的，所述包含芳香氨基的抗肿瘤药物具有式(I)或式(II)所示的结构：
Figure BDA0003329899300000031
其中，R1、R2与R3各自独立地选自取代或未取代的C1～C10的烷基；
R4选自取代或未取代的C2～C6的杂环基。
优选的，所述取代的C1～C10的烷基中的取代基选自羟基与C1～C5的烷氧基中的一种或多种；
所述取代的C2～C6的杂环基中的取代基选自羰基、羟基与C1～C5的烷氧基中的一种或多种。
优选的，所述包含芳香氨基的抗肿瘤药物选自雷西莫特、来那度胺或咪喹莫特；
所述叠氮化试剂选自FSO2N3。
优选的，所述叠氮化反应的温度为25℃～35℃；所述叠氮化反应的时间为4～6h。
优选的，叠氮化反应后，用有机溶剂稀释，并依次用饱和食盐水、水与饱和食盐水洗涤，干燥，除去溶剂后，得到粗产物；将所述粗产物经硅胶层析得到叠氮化的乏氧肿瘤选择性激活前药。
本发明还提供了上述制备方法得到的乏氧肿瘤选择性激活前药。
本发明还提供了一种抗肿瘤组合物，包括上述制备方法得到的乏氧肿瘤选择性激活前药与血管阻断剂。
优选的，还包括免疫检查点抑制剂；
所述乏氧肿瘤选择性激活前药与血管阻断剂的质量比为1：(1～2)；
所述乏氧肿瘤选择性激活前药与免疫检查点抑制剂的质量比为1：(0.05～0.2)。
本发明提供了一种乏氧肿瘤选择性激活前药的制备方法，包括：将包含芳香氨基的抗肿瘤药物与叠氮化试剂进行叠氮化反应，得到叠氮化的乏氧肿瘤选择性激活前药。与现有技术相比，本发明将小分子药物的活性芳香氨基转化为叠氮化物，在常氧下可以保持稳定，而在缺氧肿瘤中，前药的叠氮基可以还原为氨基，释放出活性药物，并且氮气是其唯一产物，不会产生任何可能对身体有害的其他物质，从而可减轻其对全身的毒副作用，实现乏氧肿瘤选择性激活，有效避免了小分子原药的全身炎性反应。
附图说明
图1为本发明实施例1中R848-N3的合成与核磁质谱表征图；
图2为本发明实施例1中得到的R848-N3的体外酶还原和细胞乏氧还原表征图；
图3为本发明实施例1中得到的R848-N3乏氧条件下对DC的激活以及巨噬细胞极化的表征图；静脉注射R848-N3与R848后，小鼠体重曲线图(b)；健康鼠和荷瘤鼠静脉注射R848-N3与R848后，血清中IL-6和IFN-γ的含量图(c～d)；单药R848-N3与R848-N3+CA4-NPs不同时间的组织分布图(e)；
图4为本发明实施例1中得到的R848-N3与CA4-NPs和抗PD-1联合治疗4T1乳腺癌的抗肿瘤结果图；其中给药方案(a)；抑瘤曲线(b)和生存期曲线图(c)；治疗后肺转移的数目(d)；单个治疗组抑瘤曲线(e)；流式分析肿瘤内(f)和脾脏内(g)免疫细胞数目柱形图；
图5为本发明实施例1中ELISA分析治疗后血清中细胞因子的变化图(a)；治疗后肺转移切片与肺转移结节数(b)；小鼠治疗后肝肾功检测，血清中肌酐、尿素氮、谷草转氨酶和谷丙转氨酶的含量图(c)；
图6为本发明实施例1中三药治疗后小鼠各脏器与肿瘤HE切片图；
图7为本发明实施例2中Lenalidomide-N3的合成与核磁质谱表征图；
图8为本发明实施例2中Lenalidomide-N3体外还原表征结果图；
图9为本发明实施例3中R837-N3的合成与核磁质谱表征图；
图10为本发明实施例3中R837-N3在CYP2D6和NADPH酶中的还原测试结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种叠氮化的乏氧肿瘤选择性激活前药在制备抗肿瘤药物中的应用；在本发明中，所述叠氮化的乏氧肿瘤选择性激活前药优选按照以下方法制备：将包含芳香氨基的抗肿瘤药物与叠氮化试剂进行叠氮化反应，得到叠氮化的乏氧肿瘤选择性激活前药。
本发明还提供了一种乏氧肿瘤选择性激活前药的制备方法，包括：将包含芳香氨基的抗肿瘤药物与叠氮化试剂进行叠氮化反应，得到叠氮化的乏氧肿瘤选择性激活前药。
其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。
所述包含芳香氨基的抗肿瘤药物为小分子抗肿瘤药物，优选具有式(I)或式(II)所示的结构：
Figure BDA0003329899300000051
其中，R1、R2与R3各自独立地优选为取代或未取代的C1～C10的烷基，更优选为取代或未取代的C1～C6的烷基，再优选为取代或未取代的C1～C4的烷基；该烷基可为直链烷基也可为支链烷基，并无特殊的限制；所述取代的C1～C10的烷基中的取代基优选为羟基与C1～C5的烷氧基中的一种或多种，更优选为羟基与C1～C4的烷氧基中的一种或多种，再优选为羟基与C1～C3的烷氧基中的一种或多种，最优选为羟基与C1～C2的烷氧基中的一种或多种。
R4优选为取代或未取代的C2～C6的杂环基，更优选为取代或未取代的C3～C5的杂环基；所述取代的C2～C6的杂环基中的取代基优选为羰基、羟基与C1～C5的烷氧基中的一种或多种，更优选为羰基、羟基与C1～C4的烷氧基中的一种或多种，再优选为羰基、羟基与C1～C3的烷氧基中的一种或多种，最优选为羰基、羟基与C1～C2的烷氧基中的一种或多种。
在本发明中，所述式(II)所示的结构具体可为：
Figure BDA0003329899300000061
最优选地，所述包含芳香氨基的抗肿瘤药物为雷西莫特、来那度胺或咪喹莫特。
所述叠氮化试剂优选为氟磺酰叠氮化物，更优选为FSO2N3。
将包含芳香氨基的抗肿瘤药物与叠氮化试剂进行叠氮化反应；其中，所述包含芳香氨基的抗肿瘤药物与叠氮化试按照化学当量比添加即可；所述包含芳香氨基的抗肿瘤药物与叠氮化试剂优选分别溶于溶剂中然后再混合进行反应；其中溶解含芳香氨基的抗肿瘤药物的溶剂优选为二甲基甲酰胺；溶解叠氮化试剂的溶剂优选为二甲基甲酰胺与甲基叔丁基醚的混合液；所述二甲基甲酰胺与甲基叔丁基醚的体积比优选为1：1；本发明中，优选在反应体系中还加入碱金属碳酸氢盐水溶液；所述碱金属碳酸氢盐水溶液优选为碳酸氢钾水溶液；所述碱金属碳酸氢盐水溶液的浓度优选为1～5mol/L，更优选为2～3mol/L；所述碱金属碳酸氢盐与包含芳香氨基的抗肿瘤药物的摩尔比优选为(3～5)：1，更优选为4：1；所述叠氮化反应的温度优选为25℃～35℃，更优选为30℃；所述叠氮化反应的时间优选为4～6h，更优选为5h。
反应结束后，优选用有机溶剂稀释，并依次用饱和食盐水、水与饱和食盐水洗涤，干燥，除去溶剂后，得到粗产物；将所述粗产物经硅胶层析得到叠氮化的乏氧肿瘤选择性激活前药；所述硅胶柱层析的溶剂优选为二氯甲烷与甲醇混合溶液；所述二氯甲烷与甲醇混合溶液中两者的体积比优选为100：(1～5)，更优选为100：(2～4)，再优选为100：3。
本发明将小分子药物的活性芳香氨基转化为叠氮化物，在缺氧肿瘤中，前药的叠氮基可以还原为氨基，释放出活性药物，并且氮气是其唯一产物，不会产生任何可能对身体有害的其他物质，从而可减轻其对全身的毒副作用，实现乏氧肿瘤选择性激活，有效避免了小分子原药的全身炎性反应。
本发明还提供了一种上述制备方法得到的乏氧肿瘤选择性激活前药，优选包括式(III)或式(IV)所示的结构：
Figure BDA0003329899300000071
其中，R1、R2、R3与R4均同上所述，在此不再赘述。
本发明提供了一种抗肿瘤组合物，包括上述的乏氧肿瘤选择性激活前药与血管阻断剂；所述乏氧肿瘤选择性激活前药与血管阻断剂的质量比优选为1：(1～2)，更优选为1：(1～1.5)，再优选为1：1.25；所述血管阻断剂优选为高分子血管阻断剂康普瑞汀A4。
优选地，所述抗肿瘤组合物还包括免疫检查点抑制剂；所述乏氧肿瘤选择性激活前药与免疫检查点抑制剂的质量比优选为1：(0.05～0.2)，更优选为1：(0.08～0.15)，再优选为1：0.1；所述免疫检查点抑制剂优选为PD-1抑制剂。
本发明提供的乏氧激活前药可以在肿瘤部位选择性激活，有效避免了小分子原药的全身炎性反应，将其与血管阻断剂及免疫检查点抑制剂联用用于肿瘤治疗则可以显著抑制肿瘤的生长和转移，不产生任何毒副作用。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种乏氧肿瘤选择性激活前药的修饰方法进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售。
实施例1
雷西莫特(Resiquimod，R848)是可以被Toll样受体(TLR)7/8识别的小分子化合物。据报道，R848具有刺激免疫和调节免疫抑制的功能。内体对R848的识别导致树突状细胞(Dendritic Cells，DCs)的激活并诱导促炎性细胞因子和趋化因子的分泌。此外，R848还可以调节免疫抑制细胞，例如肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-Associated Macrophages，TAMs)和骨髓来源的免疫抑制细胞(Myeloid-Derived Suppressor Cells，MDSCs)，R848可以将MDSCs转换为抗原呈递细胞(Antigen Presenting Cells，APCs)，例如DCs和巨噬细胞，将TAMs从M2表型极化为M1表型。然而，临床试验和研究数据表明，无论是局部给药还是全身给药，R848都会产生严重的全身炎症反应，这也是限制其给药剂量和临床应用的重要原因。
本发明通过将R848的活性氨基更改为叠氮基(R848-N3)进行修饰，来避免其全身性炎症反应。并且与已经报道的高分子血管阻断剂康普瑞汀A4(CombretastatinA4Nanoparticles，CA4-NPs)进行联合治疗，CA4-NPs具有出色的血液循环时间，并且可以在实体肿瘤血管周围积聚以选择性地破坏肿瘤血管，从而显著增加肿瘤部位的乏氧水平，同时CA4-NPs治疗后肿瘤内CYP450酶的含量会明显升高，这也可以进一步催化R848-N3的还原。
R848-N3的制备示意图如图1a所示。
首先通过点击反应，利用FSO2N3与R848进行反应(FSO2N3是根据文献报道制备的氟磺酰叠氮化物)。向50mL玻璃圆底烧瓶中依次添加R848(1.0mmol，314.17mg，溶于2mL二甲基甲酰胺(DMF)中)，FSO2N3溶液(含1.0mmolFSO2N3，200mM，溶于DMF/甲基叔丁基醚(MTBE)＝1：1中，约5mL)，并加入KHCO3水溶液(3.0M，1.33mL，含有4.0mmolKHCO3)。将反应混合物在30℃下搅拌5小时。反应完成后，加入乙酸乙酯(40mL)，并依次用饱和食盐水(60mL×6)，水(60mL×2)和饱和食盐水(60mL)洗涤混合物，经无水Na2SO4干燥，通过旋转蒸发浓缩并真空干燥。粗产物经硅胶层析(CH2Cl2/MeOH＝100:3)进一步纯化得到R848-N3。
使用CDCl3作为溶剂通过1H NMR(图1b)和13C NMR确定结构(图1c)，还使用ESI-MS(ESI+)表征R848-N3与R848，[M+H]+＝341.0，[M+Na]+＝362.9(图1d)。
由图1b与图1c可知，在R848-N3的1H NMR光谱中，-CH3的信号位于δ1.23ppm(t,3H)，-H2COCH2-的信号位于δ3.66ppm(q,2H)和δ5.00ppm(s,2H)，＝N-CH2-的信号在δ4.87ppm(s,2H)，-(OH)C(CH3)2的信号在δ1.41ppm(s,6H)，Ar-H的信号向低场移动至δ7.75ppm(m,2H)、δ8.83ppm(d,1H)和δ8.42ppm(d,1H)。对于13C NMR光谱中的R848-N3，-CH3(a)的信号在δ15.41ppm，-CH3(f)的信号在δ28.89ppm，R848-N3中的C-N3信号向低场移动到δ152.84ppm，而R848中C-NH2的信号位于δ151.44ppm，R848-N3的Ar-C(m,j)信号分别向高场移动至δ143.26ppm和δ131.04ppm。
对R848-N3在体外和细胞内的还原效果进行检测
R848-N3(1.0mg/mL)用乙醇与蓖麻油(1:1，v/v)溶解，PBS(pH＝7.4)稀释至50μM，取稀释后的R848-N3 240μL与25μL 0.1mM NADPH(还原辅酶)和20μL 0.1mg/mL CYP2D6(CYP450酶亚型之一)反应。样品在反应前用氮气脱气，并密封以保持缺氧条件。对照实验中，将样品、CYP2D6和NADPH溶于pH＝7.4的PBS中，不脱气。每个时间点样品独立反应，在37℃振荡箱中轻轻摇晃10分钟、30分钟、1小时、3小时或24小时，反应后每个反应加入195μL乙腈终止，通过紫外-高效液相色谱(HPLC)检测R848的含量(图2a和图2b)。HPLC检测用乙腈：H2O(65:35，v/v)和0.05％(vt％)乙酸洗脱，并在210nm处以1.0mL/min的流速进行检测。结果表明，在乏氧条件下，R848-N3在3h内可还原91.34％，且所有样品的回收率均在90％以上。相反，R848-N3在CYP450酶和NADPH的存在下常氧可以保持24小时稳定。
为了确定是否可以在细胞中乏氧条件下还原R848-N3，对R848-N3在四种肿瘤细胞(4T1，C26，CT26，LLC)中的生物还原性进行检测。
在细胞培养液中加入5μg/mL R848-N3后，分别在常氧(21％O2)和低氧(0.1％O2)下培养，24小时后通过HPLC分析胞内R848的含量(图2c)。在四种肿瘤细胞中，R848-N3在乏氧条件下可还原为R848，其中4T1细胞可还原62.85％。在常氧条件下，24小时后未观察到R848的产生。
对R848-N3在乏氧条件下对DCs的激活和对TAMs表型转变的影响进行检测，通过表面活化标记物的表达来研究R848对APCs的免疫刺激作用。
用R848和R848-N3处理骨髓来源的树突状细胞(bone marrow dendritic cells,BMDCs)和骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDMs)，在细胞培养液中加入5μg/mL R848-N3和R848后，分别在常氧和低氧条件下培养24小时，然后用流式细胞术检测DCs和TAMs表面标记物的表达。R848-N3处理24小时后，发现乏氧条件下DCs的CD80和MHCⅡ表达明显高于常氧处理后，并且M1型巨噬细胞(CD11c+CD80+标记)的表达上调，M2型巨噬细胞(CD11c+CD206+标记)的表达下调(图3a)。说明在低氧条件下，R848-N3可被还原并显著激活DCs，增加M1型TAMs数量，减少M2型TAMs数量。
限制R848给药剂量和临床应用的重要原因是全身给药可引起严重的全身炎症，产生大量促炎细胞因子，如白介素-6(IL-6)和Ⅱ型干扰素(IFN-γ)等。因此，除了验证R848-N3的乏氧还原外，本发明还对其系统给药后的全身毒性进行了评估。R848静脉给药后，R848给药剂量从10mg·kg-1到70mg·kg-1均显著降低健康BALB/c小鼠的体重，并导致小鼠死亡(图3b)。此外，在健康小鼠和4T1荷瘤小鼠6小时内，均能引起血清IL-6和IFN-γ水平显著升高，从而引起炎症(图3c和图3d)。与之相反，与注射相同剂量的R848相比，健康小鼠注射R848-N3后，小鼠体重没有下降，无小鼠死亡，IFN-γ和IL-6水平分别降低了57倍和26倍(图3b和图3c)。在4T1荷瘤小鼠中，血清IL-6和IFN-γ水平略有升高(图3d)。这些结果证实了R848-N3作为免疫调节剂在提高治疗效果和避免全身炎症反应方面有巨大潜力。
为了验证R848-N3在体内的还原，并比较肿瘤缺氧对R848-N3还原的影响，本发明比较了两种药物在4T1乳腺癌模型中的生物分布。当4T1肿瘤达到约300mm3，给小鼠静脉注射R848-N3(40mg·kg-1)和R848-N3(40mg·kg-1)+CA4-NPs(30mg·kg-1，以CA4的量计算)，分别在1h，4h和10h取出器官和肿瘤通过HPLC检测R848和R848-N3的含量。结果表明，R848-N3可在荷瘤小鼠体内被还原为R848，与CA4-NPs联用1h后肿瘤内R848含量与各器官的比值超过单药R848-N3组3.72倍(图3e)。这表明R848-N3具有良好的肿瘤乏氧选择性激活能力，R848的产生量与肿瘤缺氧程度呈正相关。
本发明将乏氧激活的R848-N3与CA4-NPs和抗PD-1联合研究在4T1乳腺癌上的抗肿瘤作用(图4)。当肿瘤体积达到120mm3左右时，将小鼠随机分为8组：PBS，anti-PD1(每只100μg)，CA4-NPs(25mg·kg-1，以CA4的量计算)，CA4-NPs+anti-PD1(25mg CA4·kg-1+100μg)，R848-N3(20mg·kg-1)，R848-N3+anti-PD1(20mg·kg-1+100g)，R848-N3+CA4-NPs(20mg·kg-1+25mg CA4·kg-1)和R848-N3+CA4-NPs+anti-PD1(20mg·kg-1+25mgCA4·kg-1+100μg)。CA4-NPs和anti-PD1每3天注射一次，R848-N3每3天注射2次，3天一疗程一共连续三个疗程(图4a)。如图4b～图4d所示，PBS组生长最快，肿瘤体积在第22天达到约2000mm3。R848-N3+CA4-NPs组的肿瘤抑制率(tumor suppression rate，TSR)达到80.8％，而R848-N3和CA4-NPs单药组的TSR分别为22.2％和35.8％。特别地是，R848-N3+CA4-NPs+anti-PD1组在观察结束时能有效抑制肿瘤生长，几乎完全根除肿瘤。同时，治疗期间体重没有明显变化(图4b与图4c)。除抗肿瘤作用外，还对不同治疗组小鼠的生存率进行了监测，发现与其他治疗组相比，R848-N3+CA4-NPs+anti-PD1联合治疗组明显延长了小鼠的总生存率(图4e～图4g)。以上结果表明R848-N3+CA4-NPs+抗PD-1组对4T1肿瘤具有完全抑制作用，说明R848-N3与CA4-NPs联合抗PD-1可有效选择性治疗4T1肿瘤，且无全身毒性。
本发明进一步利用流式细胞术评估不同治疗组肿瘤免疫微环境的变化(图4d)。经R848-N3+CA4-NPs+抗PD-1治疗后，在肿瘤内检测到了更多的CD4+T细胞(占总细胞数的6.59％)和CD8+T细胞(占总细胞数的4.61％)。同时也观察到了更多活化的DCs(CD11c+MHCⅡ+标记)，这表明三药联合治疗有效激活了抗肿瘤免疫(图4d)。此外，肿瘤内部的免疫抑制微环境也发生了改变，与其他治疗组相比，三药治疗组M2型巨噬细胞与MDSCs的比例明显降低(图4d)。除了肿瘤中的免疫细胞外，本发明还用流式细胞术分析了脾脏中的免疫细胞。由结果可知，三药治疗组的CD4+T细胞比例(占总细胞数的12.25％)和CD8+T细胞比例(占总细胞数的8.03％)明显高于其他治疗组，免疫记忆细胞的比例(占总细胞数的5.7％)也有所增加(图4e)。与免疫细胞的分析一致，三种药物治疗后血清中促炎细胞因子(IL-6、TNF-α和IFN-γ)的分泌也有所增加(图5a)。本发明还评价了R848-N3和CA4-NPs的抗转移作用。与PBS或单药治疗组相比，苏木素伊红(hematoxylin and eosin，H&E)和印度墨水检测显示，联合治疗显著抑制了肺转移(图5b)。可见，与CA4-NPs单药治疗组相比，R848-N3+CA4-NPs联合治疗可显著减少肺部转移病灶。
本发明还对三种药物治疗的安全性进行了评价。血化学分析ALT/AST/BUN/CRE未见明显变化(图5c)，说明三药治疗未引起肝肾功能的明显改变，H&E染色分析小鼠主要脏器未见明显损伤(图6)。这些结果表明，R848-N3+CA4-NPs+抗PD-1联合治疗是安全有效的，具有很大的临床转化潜力。
实施例2
利用与实施例1同样的方法，FSO2N3与来那度胺(Lenalidomide)进行反应(FSO2N3是根据文献报道制备的氟磺酰叠氮化物)制备Lenalidomide-N3(图7a)。向50mL玻璃圆底烧瓶中依次添加来那度胺(1.0mmol，259.10mg，溶于2mL二甲基甲酰胺(DMF)中)，FSO2N3溶液(含1.0mmolFSO2N3，200mM，溶于DMF/甲基叔丁基醚(MTBE)＝1：1中，约5mL)，并加入KHCO3水溶液(3.0M，1.33mL，含有4.0mmolKHCO3)。将反应混合物在30℃下搅拌5小时。反应完成后，加入乙酸乙酯(40mL)，并依次用盐水(60mL×6)，水(60mL×2)和盐水(60mL)洗涤混合物，经无水Na2SO4干燥，通过旋转蒸发浓缩并真空干燥。粗产物经硅胶层析(CH2Cl2/MeOH 100:3)进一步纯化，获得Lenalidomide-N3。并使用氘代DMSO作为溶剂通过1H NMR确定结构(图7b)，还使用ESI-MS(ESI+)表征Lenalidomide-N3，[M+H]+＝286.2，[M+Na]+＝308.2(图7c)。
对Lenalidomide-N3在体外和细胞内的还原效果进行检测(与R848-N3体外还原方法一致)。Lenalidomide-N3(1.0mg/mL)用乙醇与蓖麻油(1:1，v/v)溶解，PBS(pH＝7.4)稀释至50μM，取稀释后的Lenalidomide-N3 200μL与25μL 0.1mMNADPH(还原辅酶)和20μL0.1mg/mL CYP2D6反应。样品在反应前用氮气脱气，并密封以保持缺氧条件。每个时间点样品独立反应，在37℃振荡箱中轻轻摇晃10分钟、20分钟、30分钟、3小时或24小时，反应后每个反应加入155μL乙腈终止，通过紫外-高效液相色谱(HPLC)检测Lenalidomide的含量(图8a)。HPLC检测用乙腈：H2O(50:50，v/v，pH＝4.3)，并在210nm处以1.0mL/min的流速进行检测。结果表明，在乏氧条件下，Lenalidomide-N3在3h内可还原90.22％，且所有样品的回收率均在90％以上。
为了确定是否可以在细胞中乏氧条件下还原Lenalidomide-N3，本发明评估了Lenalidomide-N3在四种肿瘤细胞(4T1，C26，CT26，LLC)中的生物还原性。在细胞培养液中加入5μg/mL Lenalidomide-N3后，分别在常氧(21％O2)和低氧(0.1％O2)下培养，24小时后通过HPLC分析胞内Lenalidomide的含量(图8b)。在四种肿瘤细胞中，Lenalidomide-N3在乏氧条件下可还原为Lenalidomide，其中4T1细胞可还原80.21％。
实施例3
利用与实施例1同样的方法，FSO2N3与咪喹莫特(Imiquimod，R837)进行反应(FSO2N3是根据文献报道制备的氟磺酰叠氮化物)制备R837-N3(图9a)。并使用CDCl3作为溶剂通过1H NMR确定结构(图9b)，还使用ESI-MS(ESI+)表征R837-N3，[M+Na]+＝289.3(图9c)。
本发明同样评估了R837-N3在CYP2D6和NADPH酶中的还原情况，时间点为10分钟、20分钟、30分钟、3小时和24小时(图10a)，还原率分别为21.37％、43.68％、82.05％、90.41％和93.23％(图10c)。还检测了Lenalidomide-N3在4T1肿瘤细胞中的生物还原性。在细胞培养液中加入5μg/mL R837-N3后，分别在常氧(21％O2)和低氧(0.1％O2)下培养，24小时后通过HPLC分析胞内R837的含量(图10b)。在四种肿瘤细胞中，R837-N3在乏氧条件下可还原为R837，其中4T1细胞可还原78.26％。

Claims (5)

1.一种抗肿瘤组合物，其特征在于，包括下面所示的乏氧肿瘤选择性激活前药中的一种与血管阻断剂；所述血管阻断剂为高分子血管阻断剂康普瑞汀A4；
Figure FDA0004128967270000011
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤组合物，其特征在于，所述乏氧肿瘤选择性激活前药的制备方法包括：
将包含芳香氨基的抗肿瘤药物与叠氮化试剂进行叠氮化反应，得到叠氮化的乏氧肿瘤选择性激活前药；
所述包含芳香氨基的抗肿瘤药物选自雷西莫特或咪喹莫特；
所述叠氮化试剂选自FSO2N3。
3.根据权利要求2所述的抗肿瘤组合物，其特征在于，所述叠氮化反应的温度为25℃～35℃；所述叠氮化反应的时间为4～6h。
4.根据权利要求2所述的抗肿瘤组合物，其特征在于，叠氮化反应后，用有机溶剂稀释，并依次用饱和食盐水、水与饱和食盐水洗涤，干燥，除去溶剂后，得到粗产物；将所述粗产物经硅胶层析得到叠氮化的乏氧肿瘤选择性激活前药。
5.根据权利要求1所述的抗肿瘤组合物，其特征在于，还包括免疫检查点抑制剂；
所述乏氧肿瘤选择性激活前药与血管阻断剂的质量比为1：(1～2)；
所述乏氧肿瘤选择性激活前药与免疫检查点抑制剂的质量比为1：(0.05～0.2)；
所述免疫检查点抑制剂为PD-1抑制剂。
CN202111277266.7A 2021-10-29 2021-10-29 一种乏氧肿瘤选择性激活前药的制备方法 Active CN114177177B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111277266.7A CN114177177B (zh) 2021-10-29 2021-10-29 一种乏氧肿瘤选择性激活前药的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111277266.7A CN114177177B (zh) 2021-10-29 2021-10-29 一种乏氧肿瘤选择性激活前药的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114177177A CN114177177A (zh) 2022-03-15
CN114177177B true CN114177177B (zh) 2023-05-05

Family

ID=80540535

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111277266.7A Active CN114177177B (zh) 2021-10-29 2021-10-29 一种乏氧肿瘤选择性激活前药的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114177177B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114805138B (zh) * 2022-05-12 2023-10-10 中国科学院长春应用化学研究所 6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸的前药、其制备方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108395460A (zh) * 2018-01-31 2018-08-14 广州医科大学 一种乏氧激活阿霉素前药及其制备方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106748973B (zh) * 2016-12-01 2019-05-28 浙江工业大学 两种叠氮化药物及其制备方法和应用
WO2019238057A1 (zh) * 2018-06-13 2019-12-19 中国科学院上海有机化学研究所 Fso 2n 3在制备叠氮化合物中的应用
CN109675039A (zh) * 2018-12-21 2019-04-26 中国科学院长春应用化学研究所 药物组合、抗肿瘤的药物和应用
CN109771657B (zh) * 2019-03-27 2022-06-24 湘潭大学 一种键合血管阻断剂和免疫调节剂的高分子抗肿瘤药物及其制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108395460A (zh) * 2018-01-31 2018-08-14 广州医科大学 一种乏氧激活阿霉素前药及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114177177A (zh) 2022-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114177177B (zh) 一种乏氧肿瘤选择性激活前药的制备方法
CN109942630B (zh) 基于柳胺酚和紫檀芪的天然活性分子偶联化合物及其用途
CN112513000B (zh) 新型联苯衍生物化合物及其用途
CN116211869B (zh) 含dna损伤修复抑制剂的药物混合物及混合方法、用途
CN104592091A (zh) 一种含吲哚乙酸核心结构的化合物及其应用
CN114805138B (zh) 6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸的前药、其制备方法及应用
EP3904330A1 (en) Ethylenediamine compound and use thereof
CN106317033A (zh) 一种水飞蓟宾23‑取代衍生物及其注射剂的制备方法和用途
EP4230205A1 (en) Antitumor pharmaceutical composition and application thereof
KR102246180B1 (ko) 핵 유전자 손상을 최소화한 암 치료를 위한 변형 항생제 화합물 및 이를 포함하는 항암 약학 조성물
CN110938033A (zh) 硒氰化合物及其用途
US10639295B2 (en) Podophyllotoxin derivative with 4-position nitrogen substitution and preparation method and application thereof
Zheng et al. Hypoxia-activated glutamine antagonist prodrug combined with combretastatin A4 nanoparticles for tumor-selective metabolic blockade
CN103183722A (zh) 一种乙二醛酶ⅰ抑制剂及其制备方法和医药用途
CN102702297B (zh) 胆酸-萘酰亚胺类化合物的制备方法
CN112004799A (zh) Akr1c3抑制剂及医药用途
US11376266B2 (en) Antitumor agent
US20230416196A1 (en) Dimer of biguanidines and their therapeutic uses
CN102690313B (zh) 胆酸-萘酰亚胺类化合物及其应用
CN115990162B (zh) 4-羟基-2-吡啶酮生物碱在制备治疗胃癌药物中的应用
GB2494595A (en) Phenylbutyryl curcumin derivatives and uses for preparing anti-tumor drugs thereof
CN111499623B (zh) 一类非核苷抗肿瘤药物的噻唑酮脲衍生物及其药物用途
CN111285911B (zh) Gem-1mt两亲小分子化合物及其制剂、制备方法和应用
WO2021192726A1 (ja) コリン取り込み抑制剤、細胞死誘導剤、抗がん剤、およびその用途
CN108358953B (zh) 铜与咪唑并吡啶类化合物的配合物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant