RS49991B

RS49991B - Pluraflavini i njihovi derivati, postupci njihovog dobijanja i upotrebe

Info

Publication number: RS49991B
Application number: YUP-576/02A
Authority: RS
Inventors: Laszlo Vertesy; Klaus Ehrlich; Joachim Wink; Martin Knauf; Francis P. Barbone; Elaine A. Powers; Elizabeth A. Cashman
Original assignee: Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh.,
Priority date: 2000-02-18
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2008-09-29
Also published as: CZ303810B6; HUP0204393A2; US6500936B2; TR200302180T4; WO2001060832A3; KR100743380B1; MXPA02006919A; CA2400237C; AU4240401A; US20020028921A1; WO2001060832A2; CZ20022826A3; DE60101313T2; EE05137B1; AU2001242404B2; MEP28608A; HRP20020672B1; ME00179B; RU2002124772A; HK1052709A1

Abstract

Jedinjenje formule I naznačeno time, što su: R1 je šećema grupa, R2 je -COOH ili -CH2-0-(R7)m, gde je R7 šećema grupa, R3 se bira između grupa koje sadrže epoksid, C1-Cs-alkil grupa i C2-Cs-alkenil grupa, pri čemu su pomenute alkil i alkenil grupe opciono supstituisane sa najmanje jednom OH grupom, R5 se bira između atoma vodonika, C1-C6-alkil grupa, C2-C6-alkenil grupa i C2-C6-alkinil grupa, R4, R6, R8 i R10 se, svaki nezavisno, biraju između atorna vodonika, C1-C6- alkil grupa, C2-C6-alkenil grupa, C2-C6-alkinil grupa, -X2H qrupa, gde je H direktno vezan za prvi atom u X2 i -X2R12 grupa, gde je R12 direktno vezan za prvi atom X2, i opciono R4 i R6 zajedno su dvostruko vezana-X2grupa, i opciono R8 i R10 zajedno su dvostruko vezana-xaqrupa, X2 se nezavisno bira između atoma kiseonika, -NH grupa, -N-C1-Cs-alkil grupa, -N-C2-C6-alkenil grupa, -N-C2-C6-alkinil grupa i atorna sumpora, R12 se nezavisno bira između C1-C6-alkil grupa, C2-C6ralkenil grupa, C2-C6- alkinil grupa, aril grupa ili acil grupa, i m i n se biraju svaki nezavisno, između 1 i 2, i svi njegovi stereohemijski oblici i smeše ovih oblika u bilo kom odnosu, njegove fiziološki prihvatljive soli i derivati. Prijava sdaži 26 zahteva.

Description

Ovaj pronalazak se odnosi na nova jedinjenja formule I

gde su R-i, R2, R3, R4- R5, Re, Rs, R-iai n definisani niže. Jedinjenja formule I inhibiraju transkriptazu, imaju citostatičko dejstvo i naročito su pogodna za tretiranje tumora. Jedinjenja formule I se mogu dobiti gajenjem Actinomvcetales species HAG 003959, DSM 12931, u medijumu kulture. U skladu sa tim, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje jedinjenja formule I, upotrebu tih jedinjenja za dobijanje farmaceutskog proizvoda za tretman malignih poremećaja i bolesti koje se mogu tretirati inhibiranjem transkriptaze, i na farmaceutske preparate koji sadrže najmanje jedno jedinjenje formule I.

Kancer je bolest humanih i animalnih bića koja je u najvećem broju slučajeva fatalna i koja je obično prouzrokovana nekontrolisanim rastom endogenih ćelija. Kancer je naziv koji se koristi za formiranje malignih tumora (maligniteta), neoplazmi (tumora ili karcinoma) ili za malignu degeneraciju i nesazrevanje belih krvnih zrnaca (leukemija). Ćelije kancera ili tumora se obično formiraju transformacijom endogenih ćelija. Malignitet kancera ćelije se iskazuje u autonomnom rastu, tj. sposobnosti neinhibiranog rasta i bez integracije u sistem organa, i infiltriranjem uz destrukciju tkiva. Siguran znak maligniteta je stvaranje metastaza daleko od tumora, posle hematogenog ili limfogenog širenja ćelija tumora. Kancer je jedan od najčešćih uzroka smrti kod humanih bića, pa stoga postoji stalni zahtev za postupcima i agensima za lečenje ili tretiranje malignih degeneracija.

Pored radikalnog pristupa hirurškim uklanjanjem tumora, opcije terapije malignih tumora su radioterapija sa X-zracima, a-, p- iY-zracima, imunoterapija i hemoterapija. Do sada, imunoterapija je ograničena. Hemoterapija tumora podrazumeva ordiniranje ćelijskih toksina (citostatika) za tretman tumora i preostalih ćelija tumora, obično nakon lokalnog hirurškog tretmana ili zračenja. Te supstance intervenišu specifično u nekim procesima deobe ćelije, tako da tkiva sa visokim udelom deobe ćelija, kao što je brzo rastuće tkivo tumora, reaguju osetljivo. Agensi koji se koriste su jedinjenja za alkilovanje, kao što su na primer, ciklofosfamid (The Merck lndex, 12. izdanje, str. 463), antimetaboliti, kao stoje methotrexate (The Merck lndex, 12. izdanje, str. 1025), alkaloidi, kao što je vincristine (The Merck lndex, 12. izdanje, str. 1704) i antibiotici, kao što je daunomycin (The Merck lndex, 12. izdanje, str.479) i adriamvcin (The Merck lndex, 12. izdanje, str.581-582). Međutim, zahvaljujući jakim sorednim efektima, svi ovi agensi imaju značajne nedostatke, tako da smrt obolele osobe može, u mnogim slučajevima, biti samo odložena, ali ne i sprečena.

Pored toga, degenerisane (kancerozne) ćelije postaju otporne na agense koji se koriste; u tom slučaju, konvencionalni farmaceutski proizvodi više nemaju citostatičko dejstvo, ali su toksični, zahvaljujući njihovim sporednim efektima. Pored toga, nađeno je da kombinovana i/ili sekvencijalna upotreba citostatika povećava aktivnost pojedinačne citostatičke terapije (monoterapija), pa je stoga moguće da značajni sporedni efekti u polihemoterapiji nisu aditivni. Iz svih tih razloga, novi hemoterapeutici su hitno potrebni, pa se i istražuju širom sveta.

Sa iznenađenjem je pronađeno da je mikroorganizam Actinomvcetales species HAG 003959, DSM 12931 u stanju da proizvodi visoko efikasne nove citostatike koji inhibiraju rast ćelije, čak i u vrlo niskim koncentracijama. U nastavku, ova nova jedinjenja se navode kao pluraflavini i oni formiraju, zajedno sa derivatima pluraflavina, deo sadržine ovog pronalaska. Pluraflavini su antibiotici koji sadrže p-hinoidni prstenasti skelet i razne šećere kao gradivne blokove. Oni inhibiraju transkripciju preko interkalacije dvostrukih vlakana nukleinskih kiselina, i ako treba, dodatno alklovanje. Prstenasti skelet su prvi put opisali S. Kondo et al., uJournal of Antibiotics1977, 30, 1143-1145, kao deo pluramicina. Kasnije, ovaj prstenasti skelet je pronađen kod niza antibiotika; pored pluramicina i neopluramicina, opisana su strukturno srodna jedinjenja, ankinomvcin (Y. Sato et al.,J. Antibiotics1989, 42, 149), kiđamvcin (N.Kanda et al.,J. Antibiotics1971, 24, 599), hedamvcin (U. Sequin et al.Tetrahedron1978, 34. 761) i altromvcin (G.M. Brill et al,J. Antibiotics1990, 43, 229-237). Supstance iz prethodnog stanja tehnike često imaju nedostatak koji se manifestuje nezadovoljavajućom efikasnošću, visokom toksičnošću i/ili nepoželjnim sporednim efektima.

U skladu sa tim, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja formule (I)

R?

i Ra )<r>,<o>R6 9*^1 ;<R>8<R>10;gde su: ;Ri je šećerna grupa, ;R2je -COOH ili -CH2-0-(R7)m, gde je R7šećerna grupa, ;R3se bira između grupa koje sadrže epoksid, Ci-Ce-alkil grupa i C2-C6-alkenil grupa, pri čemu su pomenute alkil i alkenil grupe opciono supstituisane sa najmanje jednom OH grupom, ;R5se bira između atoma vodonika, Ci-Ce-alkil grupa, C2-C6-alkenil grupa i C2-Ce-alkinil grupa, ;R4, R6, Rai R10se, svaki nezavisno, biraju između atoma vodonika, Ci-Ce-alkil grupa, C2-Ce-alkenil grupa, C2-Ce-alkinil grupa, -X2H i -X2Ri2, ili R4i R6zajedno i/ili R8i R10zajedno, su =X2, ;Xzje O, NH, N-Ci-C6-alkil, N-CrCe-alkenil, N-C2-Ce-alkinil ili S, ;R12je Ci-Ce-alkil, C2-C6-alkenil, C2-Ce-alkinil, aril ili acil, i ;min su nezavisno jedan od drugog, 1 ili 2, ;i svi njihovi stereohemijski oblici i smeše ovih oblika u bilo kom odnosu, i njihove fiziološki prihvatljive soli. ;U formuli (I) su: ;Ci-Ce-alkil je alkil linearnog lanca ili račvasti alkil koji ima od 1 do 6 atoma ugljenika, na primer, metil, etil, izopropil, terc-butil i heksil. ;C2-C6-alkenil je alkenil linearnog lanca ili račvasti alkenil koji ima od 2 do 6 atoma ugljenika, na primer, alil, krotil i pentenil. ;C2-Ce-alkinil je alkinil linearnog lanca ili račvasti alkinil koji ima od 2 do 6 atoma ugljenika, na primer, propinil, butinil i pentinil. ;Aril je aromatična prstenasta struktura, na primer, fenil, benzil ili 1- ili 2-naftil. Aril može opciono biti supstituisan, na primer, sa halogenom, kao što je hlor, brom fluor, sa alkilom koji ima 1-4 atoma ugljenika, na primer sa metil, zatim sa hidroksi, sa alkoksi koji ima 1-4 atoma ugljenika, na primer sa metoksi, i/li sa trifluorometil. ;Acil može biti alifatična ili aromatična acil grupa. Alifatični acil ima 1-7 atoma ugljenika, poželjno 1-4 atoma ugljenika, kao što su formil, acetil, propionil, butini, heksanoil, akriloil, krotonoil, propiloil, koji može još biti supstituisan, na primer sa halogenom, kao što je hlor, brom, fluor, sa amino i/ili sa alkilamino, koji ima 1-4 atoma ugljenika, kao što su metil- i etilamino grupe. Aromatični acil može biti, na primer, benzoil ili naftoil, koji takođe može biti još supstituisan, na primer, sa halogenom, kao što je hlor, brom, fluor, sa alkilom koji ima 1 -4 atoma ugljenika, na primer metil, sa hidroksi, sa amino grupama, kao što je na primer etilamino, ili sa alkoksi grupama koje imaju 1-7 atoma ugljenika, kao što je 1-4 atoma ugljenika, na primer metoksi. ;Šećer (R1/R7) je monosaharid (n=1) ili disahardi (n=2), gde su dva monosaharida povezana preko glukozidne veze. Monosaharid može biti heksoza (C6Hi206), na primer, aldoheksoza, kao što je D-(+)-glukoza, D-(+)-manoza ili D-(+)-galakotoza. Monosaharid može biti mono-, di- ili tri-supstituisan sa, nezavisno jedan od drugoga, H, OH, NH2, NH(alkil), N(alkil)2, alkil i alkoksi, gde su H i/ili OH monosaharida opciono zamenjeni sa supstituentima. Naziv "šećer" ovde se koristi da označi aminošećere. Aminošećer je monosaharid ili disaharid koji je opciono susptituisan kao što je opisano, sa najmanje jednom OH- ili H-grupom mono- ili disaharida zamenjenom sa aminogrupom, kao što je NH2, NH(alkil) ili N(alkil)2. ;U jednoj realizaciji m je 1. ;R7može biti aminošećema grupa formule (II) ; ;gde se ;R13, Ru, Rib, Ris, R20, R22, R24, R26i R28, svaki nezavisno, biraju između H, OH, NH2, NHalkil, N(alkil)2i alkoksi, i gde alkil i alkoksi imaju1- 4atoma ugljenika. ;Primeri Ci-C4-alkil su, na primer, metil, etil, propil, izobutil i butil, a naročito metil, dok su primeri Ci-C4-alkoksi, na primer, metoksi, etoksi, izopropoksi ili butoksi, a naročito metoksi. ;R7može biti aminošećer formule (HA) ; ;R1može biti aminošećer. U jednoj realizaciji n = 2. ;R1može biti grupa formule (III) ; ;gde su R30do Reo, nezavisno jedan od drugog, H, OH, NH2) NHalkil, N(alkil)2ili O-alkil, gde je alkil CrC4grupa, kao što je metil, etil, propil, izobutil i butil, a naročito metil, a O-alkilgrupa je d-C4-alkoksi, na primer, metoksi, etoksi, izopropoksi ili butoksi, a naročito metoksi. ;R1u jednoj realizaciji ima formulu (IIIA) ; ;R3može biti grupa koja sadrži epoksid. Grupa koja sadrži epoksid može biti linearnog lanca ili račvasta alkil ili alkenil grupa, koja ima 2 do 12 atoma ugljenika, kao što je od 2 do 6 atoma ugljenika, koja sadrži jedan ili dva epoksidna prstena (oksirani). Mogući primeri su: ;Druge grupe R3, koje ne sadrže epoksidne grupe, mogu biti alkil linearnog lanca ili račvast, koji ima 1 do 12 atoma ugljenika, kao što je 1 do 6 atoma ugljenika, na primer metil, etil, izopropil, terc-butil, heksil, a takođe na primer oktil i dodecil, ili alkenil linearnog lanca ili račvast, koji sadrži 2 do 12 atoma ugljenika, kao što je 2 do 6 atoma ugljenika, na primer alil, krotil, pentenil, a takođe i dodecenil, pri čemu ove alkil ili alkenil grupe mogu biti mono- ili poli-supstituisane, kao di-supstituisane ili tri-supstituisane, na primer sa hidroksil. ;Ovaj pronalzak se prema tome, odnosi na pluraflavin A formule (IA) ; na pluraflavin B formula (IB) i na pluraflavin E formule (IE) ;gde su ;Heksoza I je 2,6-dideoksialdoheksoza; ;Heksoza II je 2,3,6-trideoksi-3-dimetilaminoheksoza, i ;Heksoza III je 2,3,64rideoksi-3-amino-metilaldoheksoza ;u svim njihovim stereohemiskim oblicima i smešama tih oblika u bilo kom odnosu, i njihove fiziološki prihvatljive soli. ;U jednoj realizaciji jedinjenja se biaju između formula (IA), (IB) i (IE), gde su ;Heksoza I je olioza, ;Heksoza II je rodozamin, i ;Heksoza III je 3-epi-vankozamin. ;U skladu sa ovim pronalaskom, jedinjenja formule I se dobijaju kultivisanjem, na primer fermentacijom, Actinomvcetales species HAG 003959, DSM 12931, ili njegovih varijanti ili mutanata, pod podesnim uslovima u medijumu kulture, dok ne bude najmanje jedan od pluraflavina formula (IA), (IB) i/ili (IE) prisutan u medijumu kulture. Pluraflavini se mogu naknadno izolovati iz medijuma kulture, prečistiti, i ukoliko je potrebno, konvertovati u hemijske derivate i/ili u njihove fiziološki prihvatljive soli. ;Ovaj pronalazak se još odnosi na postupak za dobijanje jedinjenja formule I koji se sastoji, na primer, u fermentaciji mikroorganizma Actinomvcetes species HAG 003959, DSM 12931, ili njegovih varijanti ili mutanata, pod pogodnim uslovima u medijumu kulture sve dok ne bude prisutan najmanje jedan od pluraflavina formule (IA), (IB) i/ili (IE) u medijumu kulture, pa ukoliko je potrebno, da se konvertuje u hemijski derivat \ f\\\ fiziološki prihvatljive soli. ;Soj HAG 003959, DSM 12931, njegovi mutanti i/ili varijante su u jednoj od realizacija, kultivisani u hranljivom rastvoru (takođe se navodi kao medijum kulture), koji se sastoji od najmanje jednog izvora atoma ugljenika i od najmanje jednog izvora atoma azota i uobičajenih neorganskih soli, sve dok najmanje jedan novi pluraflavin ne bude prisutan u medijumu kulture; pluraflavini se mogu zatim izolovati iz medijuma kulture, i ukoliko je potrebno, razdvojiti u pojedinačne aktivne komponente. ;Kultivisanje se može obaviti pod aerobnim uslovima. Kultivisanje se obavlja na temperaturi koja se kreće od 18 do 35°C, pri pH koje se kreće od 6 do 8. ;U literaturi je opisan veliki broj reakcija za hemijsku derivatizaciju hinona. U skladu sa tim, derivatizacija oblika hinona ovih jedinjenja se može obaviti korišćenjem hemijskih reakcija koje su kao takve poznate. Redukcija u oblike hidrohinona ovih jedinjenja se može, na primer, postići katalitički sa vodonikom, ili sa hidridima metala, kao što su hidridi aluminijuma ili hidridi bora, Sledeći pogodan primer je konverzija hinona sa hidroksilaminom, ili sa njegovim derivatima, u oksime, koji sa njihove strane mogu dalje da se hemijski konvertuju. ;Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenje formule (IV): ; ;gde su Ri, R2, R3i n defmisani gore, u svim njegovim stereohemijskim oblicima i smešama tih oblika u bilo kom odnosu, i njegovim fiziološki prihvatljivim solima. ;Derivati pluiraflavina sa formulama (IVA), (IVB) i (IVE) (niže) su izvedeni iz pluraflavina sa formulama (IA), (IB) i (IE), respektivno, i oni takođe čine deo ovog pronalaska. ;Dalje, ovaj pronalazak se odnosi na: jedinjenje formule (IVA) ; na jedinjenje formule (IVB): i na jedinjenje formule (IVE): ;i na sve njihove stereohemijske oblike i smeše tih oblika u bilo kom odnosu, i na njihove fiziološki prihvatljvie soli. ;U nastavku, ovaj pronalazak je detaljno opisan, na primer, samo u najmanje jednoj realizaciji. ;Pluraflavini u skladu sa ovim pronalskom proizvode Actinomvcetales species, u jednoj realizaciji Actinomvcetales spec. HAG 003959, DSM 12031. Actinomvcetales species HAG 003959, DSM 12931 ima micelijum bež-crvene boje i može se identifikovati po konidioforama koje su tipične za actinomvetes. ;Taksonomsko ispitivanje mikoroorganizma Actinomvcetales spec. HAG 003959, DSM 12931 daje sledeći rezultat za određivanje soja: analiza gasnom hromatografijom dijagnostički značajne masne kiseline pokazuje visoke udele: Anteizo 15:0 masne kiseline, ;Izo 16:0 masne kiseline (izopalmitinska kiselina), ;Izo 17.0 masne kiseline (izomargarinska kiselina) ;Anteizo 17:0 masne kiseline (anteizomargarinska kiselina) i ;cis[9] 18:1 masne kiseline (oleinska kiselina) ;pored nižih koncentracija drugih masnih kiselina. ;Ovaj profil sastava masnih kiselina dozvoljava da se Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931 testira taksonomički u rodu Saccharothrix. ;Izolat mikroorganizma se istaloži na Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D 38124 Braunschvveig, Germanv, u skladu sa pravilima Budimpeštanske konvencije od 16. jula 1999., pod sledećim brojem: Actinomvcetales species HAG 003959, DSM 12931. ;Umesto soja Actinomvcetales species HAG 003959, DSM 12931, moguće je takođe koristiti njegove mutante i varijante, koji sintetizuju najmanje jedno jedinjenje pluraflavina iz ovog pronalaska. Ti mutanti se mogu dobiti na poznat način, fizičkim sredstvima, na primer, ozračivanjem, npr. sa ultravioletnim ili X-zracima, ili hemijskim mutagenima, kao što su na primer, etilmetansulfonat (EMS), 2-hidroksi-4-metoksibenzofenon (MOB) ili N-metil-N'-nitro-N-nitrozogvanidin (MNNG). ;Postupak u skladu sa ovim pronalaskom se može koristiti za fermentaciju na laboratorijskoj skali (opseg od mililitra do litra) ili na industrijskoj skali (skala kubnog metra). Ukoliko se drugačije ne ukaže, svi procenti su maseni procenti. U slučaju tečnosti, odnosi mešanja su bazirani na zapremini, ukoliko se drugačije ne kaže. ;U jednoj realizaciji, izvori atoma ugljenika za aerobnu fermentaciju su ugljeni hidrati koji se mogu asimilovati i šećerni alkohol, kao što su glukoza, laktoza, saharoza ili D-manitol, i prirodni proizvodi koji sadrže ugljovodonike, kao što je na primer ekstrakt slada. Pogodni izvori atoma azota za kultivisanje su: aminokiseline, peptidi i proteini i njihovi proizvodi razgradnje, kao što su peptoni ili triptoni, pored toga ekstrakti mesa, ekstrakti kvasca, mleveno semenje, na primer kukuruza, pšenice, pasulja, soje ili pamuka, ostaci destilacije pri proizvodnji alkohola, mesni obroci ili ekstrakti kvasca, ali takođe i amonijumove soli i nitrati. Neorganske soli koje se nalaze u hranljivom rastvoru mogu biti, na primer, hloridi, karbonati, sulfati ili fosfati alkalnih metala, zemnoalkalnih metala, gvožđa, cinka, kobalta i mangana. ;Stvaranje pluraflavina u skladu sa ovim pronalaskom teče u medijumu kulture koji se sastoji od oko 0,1 do 5%, kao što je od 0,3 do 2%, glukoze i 0,2 do 5%, kao što je 0,5 do 3%, sojinog brašna i 0,05 do 2%, kao što je 0,2 do 1,0 g/L, namočenog kukuruza i 0,05 do 1,0 g/L, kao što je 0,1 do 0,5%, kalcijum-karbonata i 0,05 do 1,0 g/L, kao što je 0,1 do 1,0 g/L natrijum-hlorida. U svim slučajevima procenti su maseni procenti, za čitav medijum kulture. ;U ovom medijumu kulture, Actinomvcetales species HAG 003959, DSM 12931 stvara smešu pluraflavina. Zavisno od sastava medijuma kulture, udeo najmanje jednog od pluraflavina u skladu sa ovim pronalskom, može da varira. Pored toga, preko sastava medijuma, moguće je kontrolisati sintezu pojedinačih pluraflavina, tako da mikroorganizam uopšte ne proizvodi jedan, ili čak i više pluraflavina, ili se isti proizvode u količini koja je ispod granice detekcije. ;U jednoj realizaciji, kultura sadrži jedan detektabilan pluraflavin. U drugim realizacijama formiraju se pluraflavini A, B ili E. ;Pored pluraflavina A, B i E (jdinjenja formule (IA), (IB) i (IE), respektivno), stvaraju se takođe i druga srodna jedinjenja, koja se razlikuju od jedinjenja predstavljenih formulama (IA), (IB) i (IE) po tome što su različito glikozilovana, a takođe se stvaraju u medijumu kulture Actinomvcetales species HAG 003959, DSM 12931. Dakle, kao sporedni proizvod detektuje se još jedan pluraflavin (pluraflavin C) sa molekulskom masom 974 Da i proizvod razgradnje pluraflavina A, sa molekulskom masom 692,77, C37H44N2O11. U poslednjem jedinjenju nedostaje heksoza I; pod kiselim uslovima 2,6-dideoksialdoheksoza se može hidrolitički otcepiti od pluraflavina A. ;Mikroorganizam se aerobno kultiviše, tj. na primer, potapanjem uz mućkanje ili mešanje u odgovarajućim balonima ili fermentorima, prema potrebi, uz uvođenje vazduha ili kiseonika. Može se obaviti u opsegu temperature koja se kreće od približno 18° do 35°C, kao što je približno 25° do 32°C, uključujući od 27° do 30°C. Obično se pH kreće u opsegu od 6 do 8, kao što je od 6,5 do 7,5. Pod ovim uslovima mikroorganizam se obično kultiviše u periodu koji se kreće od 24 do 300 h, kao što je od 36 do 140 h. ;Pogodno je da se kultivisanje obavi u nekoliko faza, tj. prvo se pripremi najmanje jedna pred-kultura u tečnom hranljivom medijumu, koji se zatim inokulira u stvarni medijum za proizvodnju, glavnu kulturu, na primer, u zapreminskom odnosu 1:10. Pred-kultura se dobija, na primer, inokulovanjem micelijuma u hranljivi rastvor, pa ostavljanjem da raste približno 36 do 120 h, kao što je 48 do 96 h. Micelijum se može dobiti, na primer, omogućavanjem soju da raste oko 3 do 40 dana, kao što je 4 do 10 dana, u čvrstom ili tečnom hranljivom medijumu, na primer, slad-kvasac agaru ili agaru od ovsenog brašna. ;Napredovanje fermentacije se može pratiti preko pH kulture ili zapremine micelijuma, a takođe i hromatografskim metodama, kao što je na primer tankoslojna hromatografija ili tečna hromatografija pod visokim pritiskom, ili testiranjem biološke aktivnosti. Pluraflavini u skladu sa ovim pronalaskom mogu se naći i u micelijumu i u filtratu kulture. Postupak izolovanja, opisan dole, obično služi da se prečiste pluraflavini u skladu sa ovim pronalaskom, kao što je prečišćavanje pluraflavina A, B i E. ;Izolovanje i/ili prečišćavanje pluraflavina iz medijuma kulture, u skladu sa ovim pronalaskom, obavlja se poznatim postupcima, uzimajući u obzir hemijska, fizička i biološka svojstva prirodnih proizvoda. Da bi se testirala koncentracija pluraflavina u medijumu kulture, ili u pojedinim fazama izolovanja, može se koristiti tankoslojna hromatografija, na primer na silikagelu, koristeći za mobilnu fazu smeše hloroform/metanol/glacijalna sirćetna kiselina/voda (na primer u odnosu 8:1:1:0,2), ili HPLC. Kod izdvajanja tankoslojnom hromatografijom detekcija se može obaviti, na primer, korišćenjem reagenasa za bojenje, kao što su a-naftol/sumpoma kiselina, gde se količina stvorene supstance brzo poredi sa rastvorom za kalibrisanje. ;U skladu sa ovim pronalaskom pluraflavini se mogu izolovati bilo iz micelijuma ili iz medijuma kulture. Obično se prvo micelijum izdvoji iz medijuma kulture uobičajenim metodama, pa se pluraflavini zatim ekstrahuju iz ćelijskog materijala, koristeći opciono rastvarač koji je mešljiv sa vodom. Faza organskog rastvarača sadrži puraflavine iz ovog pronalaska; ukoliko je potrebno, oni se koncentrišu pod sniženim pritiskom, pa prečišćavaju dalje, kao što je opisano niže. ;Ukoliko je potrebno, filtrat kulture se kombinuje sa koncentratom ekstrakta micelijuma i sa podesnim organskim rastvaračem, nemešljivim sa vodom, na primer sa n-butanolom. Zatim se odvoji organska faza, pa ako je potrebno, koncentriše pod sniženim pritiskom. Da bi se izdvojio vredan proizvod, koncentrat se može razblažiti sa nepolarnim rastvaračem u kome su puraflavini iz ovog pronalaska teško rastvomi, kao što je na primer, heksan, petroletar, dietiletar. Ovo izaziva taloženje puraflavina, dok lipofilne nečistoće ostaju rastvorene, i uklanjanju se uobičajenim razdvajanjem čvrste i tečne faze. Talog, koji sadrži sve puraflavine koje je trebalo izolovati, rastvori se u 1/30 prvobitne zapremine vode/metanola. Talog se potpuno rastvori i liofilizuje. Liofilizat, koji se u nastavku navodi kao sirovi proizvod, čini 0,5 do 50% pluraflavina, i koristi se za dalje izolovanje. ;Dalje prečišćavanje jednog ili više pluraflavina iz ovog pronalaska se obavlja hromatografijom na podesnim materijalima, kao što su molekulska sita, na normalnim nosačima faze, ako što su na primer, silikagel, aluminijum-oksid, na jonoizmenjivačima ili na adsorberskim smolama i/ili na medijumima reversne faze (RP). Uz pomoć ovakve hromatografije izdvoje se pluraflavini. Hromatografija pluraflavina se obavlja korišćenjem puferovanih vodenih rastvora ili smeša vodenih i organskih rastvora. ;Podrazumeva se da smeše vodenih i organskih rastvora označavaju sve organske rastvarače mešljive sa vodom, kao što su metanol, propanol i acetonitril, u opsegu koncentracija od 10 do 80% rastvarača, na primer od 40 do 60% rastvarača, ili još sve puferovane vodene rastvore koji su mešljivi sa organskim rastvaračima. Puferi koji se koriste mogu biti isti kao i oni koji su pokazani gore. ;Izdvajanje pluraflavina je zasnovano na njihovoj različitoj polamosti i može se obaviti uz pomoć hromatografije reversne faze, na primer na MCI<®>(adsorberska smola iz firme Mitsubishi, Japan) ili Amberiite XAD<®>(TOSOHAAS), i na ostalim hidrofobnim materijalima, kao što su na primer faze RP-8 ili R-18. Pored toga, izdvajanje se može obaviti uz pomoć hromatografije na normalnoj fazi, na primer na silikagelu, aluminijum-oksidu i slično. ;Hromatiografija pluraflavina se može obaviti korišćenjem puferovanih ili zakišeljenih vodenih rastvora ili smeša vodenih rastvora sa alkoholima ili drugim organskim rastvaračima mešljivim sa vodom. Organski rastvarač koji se koristi može biti propanol ili acetonitril. ;Puferovani ili zakišeljeni vodeni rastvori, podrazumeva se da označavaju, na primer, fosfatni pufer, amonijum-acetatni pufer, citratni pufer, u koncentraciji od 1 rriM do 0,5 M, a takođe i mravlju kiselinu, sirćetnu kiselinu, trrfluorosirćetnu kiselinu ili sve komercijalne kiseline poznate osobi koja je verzirana u stanje tehnike, na primer u opsegu koncentracija od 0,01 do 3%, kao što je od 0,1 % ;Hromatografija se može obaviti korišćenjem gradijenta, polazeći od 100% pufera u vodi, a završavajući sa 100% rastvarača; naprimer, linearni gradijent koji se kreće od 10 do 50%, koristeći 2-propanol ili acetonitril. ;Alternativno, može se takođe obavljati gel hromatografijom ili hromatografijom na hidrofobnim fazama. ;Gel hromatgrafija se može obaviti na poliakrilamidu ili mešanim polimemim gelovima, kao što je na primer, Biogel-P2<®>(Biorad), Fractogel TSK HvV 40<®>;(Merck, Germanv ili Toso Haas, USA) ili na Sephadex<®>(Pharmacia, Uppsala, Sweden). ;Redosled hromatografija koje su gore pomenute, može biti obrnut. ;Sledeći visoko efikasan korak prečišćavanja puraflavina je kristalizacija. Pluraflavini kristališu iz rastvora u organskim rastvaračima i iz smeša vode i organskih rastvarača. Kristalizacija se može obaviti na poznat način, na primer, koncentrisanjem ili hlađenjem zasićenih rastvora pluraflavina. ;Pluraflavini u skladu sa ovim pronalskom su stabilni u čvrstom stanju i u rastvoru koji ima pH koje se kreće između 3 i 8, na primer između 4 i 6, pa se stoga mogu ugrađivati u uobičajene farmaceutske preparate. ;Pluraflavini formule (I) i hemijski derivati izvedeni iz njih, mogu se konvertovati u odgovarajuće fiziološki prihvatljive soli, po postupcima koji su poznati osobi koja je verzirana u stanje tehnike. ;Fiziloški prihvatljive soli jedinjenja formule (I) podrazumeva se da označavaju i njihove organske i njihove neorganske soli, kao što je to opisano u "Remingtons's Pharmaceutical Sciences" (17. izdanje, str. 1418, (1985)). Na osnovu fizičke i hemijske stabilnosti i rastvorljivosti, moguće realizacije kiselih grupa su između ostalog, natrijum, kalijum, kalcijum i amonijum; moguće realizacije baznih grupa su soli hlorovodonične kiseline, sumporne kiseline, fosforne kiseline ili karboksilnih kiselina, ili sulfonskih kiselina, kao što su na primer, između ostalih, sirćetna kiselina, limunska kiselina, benzoeva kiselina, maleinska kiselina, fumama kiselina, vinska kiselina i p-toluensulfonska kiselina. ;Ovaj pronalazak još obuhvata očigledne hemijske ekvivalente (ovde se takođe navode kao "derivati") jedinjenja formule (I), koji se hemijski malo razlikuju, tj. koji imaju istu aktivnost ili koji se mogu konvertovati u jedinjenje iz ovog pronalska pod blagim uslovima. Pomenuti ekvivalenti su, na primer, estri i etri, kompleksi, a takođe i proizvodi redukcije jedinjenja iz ovog pronalska. ;Estarski i etarski derivati i proizvodi redukcije se mogu dobiti postupcima koji su opisani u literaturi, naprimer u "Advanced Organic Svnthesis", 4. izdanje, J.March, John Wiley & Sons, 1992. Karboksi grupa (formule IE, IVE) i hidroksi grupa jedinjenja formule (I), mogu se, na primer konvertovati u estarsku grupu ili etarsku grupu. Ti estri su na primer, (Ci-C4)-alkilestri, a ti etri su, na primer, acetali i ketali hidroksi grupa. ;Stabilni kompleksi jedinjenja formule (I) se mogu formirati sa fiziološki prihvatljivim neorganskim katjonima, kao što su kalcijum ili magnezijum. ;Ovaj pronalazak obuhvata sve stereoizomeme oblike jedinjenja formule (I). Centri asimetrije jedinjenja sa formulema (IA), (IB) i (IE) mogu, nezavisno jedan od drugog, u svakom slučaju da imaju S konfiguraciju ili R konfiguraciju. Oksirani grupe koja sadrži epoksid mogu biti u bilo kom položaju; na primer, oksirani koji ugrađuju atome ugljenika 2' i 3'. Ovaj pronalazak obuhvata sve moguće enantiomere i dijastereomere, a takođe i smeše najmanje dva stereoizomema obilka, na primer smeše enantiomera i/ili dijastereomera u bilo kom odnosu. Tako, ovaj pronalazak daje enantiomere u enantiomemo čistom obliku, i levorotacione i desnorotacione antipode, R i S konfiguracije, u obliku racemata i u obliku smeša dva enantiomera u bilo kom odnosu. Ukoliko postoji cis/trans izomerija, ovaj pronalazak daje i cis oblik i trans oblik i smeše ova dva oblika u bilo kom odnosu. ;Na račun njihovih korisnih farmakoloških svojstava, jedinjenja u skladu sa ovim pronalaskom su podesna za upotrebu kao farmaceutski proizvodi u humanoj i/ili veterinarskoj medicini. Ona imaju antibiotičko dejstvo i pored antibakterijskog dejstva, antimikotičko, tj. koje inhibira gljivice, uključujući fitopatogene gljivice, anti-protozoa i anti-parazitska svojstva. ;Jedinjenja u skladu sa ovim pronalskom se mogu koristiti za kancerozna oboljenja, na primer, kao hemoterapeutici. Zahvaljujući njihovim citostatičkim svojstvima, kao što je njihovo snažno anti-tumorsko dejstvo, i antimikrobno dejstvo, ona se mogu koristiti, na primer, kao citostatici za maligne degeneracije kod animalnih i humanih bića. ;U slučaju ćelija tumora koje su razvile rezistentnost prema konvencionalnm agensima, samo novi agensi imaju terapeutski adekvatan efekat. Dakle, pluraflavini iz ovog pronalaska i njihovi derivati formule (I), imaju potencijalno odličnu aktivnost čak i protiv ovih problematičnih tipova ćelija. ;Ovaj pronalazak se odnosi takođe na farmaceutske preparate koji sadrže najmanje jedan pluraflavin iz ovog pronalska i/ili njegov derivat. Pluraflavini se mogu koristiti u smeši sa najmanje jednim podesnim pomoćnim sredstvom ili dodatkom. Dodaci koji se koriste za humana bića mogu biti farmakološki prihvatljivi dodaci i/ili pomoćna sredstva. ;Ovaj pronalazak se odnosi takođe na postupak za dobijanje farmaceutskog proizvoda u skladu sa ovim pronalaskom, koji se sastoji od dovođenja u kontakt najmanje jednog jedinjenja iz ovog pronalaska, u obliku podesnom za ordiniranje, koristeći farmaceutski podesan i fiziološki prihvatljiv dodatak i, ako je potrebno, ostala pogodna aktivna jedinjenja, aditive ili pomoćna sredstva. ;Farmaceutski proizvodi u skladu sa ovim pronalaskom se obično ordiniraju oralno, površinski Ni parenteralno, ali takođe je moguće i rektalno ordiniranje. Pogodni čvrsti ili tečni farmaceutski oblici preparata su, na primer, granule, prahovi, tablete, obložene tablete, (mikro)kapsule, supozitorije, sirupi, emulzije, suspenzije, aerosoli, kapi ili rastvori za injekcije u obliku ampule, i preparati koji imaju produženo rastvaranje aktivnog jedinjenja, u kojima se obično koriste dodaci i aditivi i/ili pomoćna sredstva, kao što su dezintegranti, veziva, sredstva za oblaganje, sredstva za bubrenje, glidanti ili lubrikanti, agensi za aromatizovanje, zaslađivači ili sredstva za rastvaranje. Često korišćeni dodaci i pomoćna sredstva, koji se mogu pomenuti, su na primer, magnezijum-karbonat, titanijum-dioksid, laktoza, manitol i drugi šećeri, talk, laktoprotein, želatin, škrob, vitamini, celuloza i njeni derivati, životinjska ili biljna ulja, polietilenglikoli i rastvarači, kao što su na primer, sterilna voda, alkoholi, glicerin i polivalentni alkoholi. ;Ukoliko je potebno, jedinična doza za oralno ordiniranje se može mikroenkapsulirati, da se odloži oslobađanje ili da se produži oslobađanje na relativno duži period vremena, kao što je na primer, oblaganjem ili utiskivanjem zrnastog aktivnog jedinjenja u podesne polimere, voskove i slično. ;Farmaceutski preparati se mogu proizvoditi i ordinirati u jediničnim dozama, svaka jedinica sadrži kao aktivni sastojak izvesnu dozu najmanje jednog jedinjenja pluraflavina iz ovog pronalaska i/ili njihovih hemijskih derivata. U slučaju čvrstih jediničnih doza, kao što su tablete, kapsule i supozitorije, ova doza može biti približno do 200 mg, ali može biti približno 0,1 do 100 mg, a u slučaju rastvora za injekcije u obliku ampule, do oko 200 mg, ali može biti i oko 0,1 do 100 mg na dan. ;Dnevna doza koja treba da se ordinira zavisi od telesne mase, starosti, pola i stanja sisara-subjekta. Međutim, mogu se zahtevati takođe i više i niže dnevne doze. Dnevna doza može da se ordinira kroz jedno uzimanje u obliku jedne jedinične doze ili u obliku nekoliko manjih jediničnih doza, ili još da se uzima u više prilika, u predodređenim intervalima, u obliku podeljenih doza. ;Ovaj pronalazak je dalje ilustrovan primerima koji slede. Procenti su maseni procenti. U slučaju tečnosti, odnosi mešanja su računati na zapreminu, ukoliko nije drugačije naznačeno. ;Slede ilistrativni primeri ovog pronalska, koji ne ograničavaju njegov obim. ;Primer 1 ;Pripremanje glicerinske kulture Actinomvcetales species HAG 003959.DSM ;12931 ;Inokulira se 100 ml_ hranljivog rastvora (2% ekstrakt slada, 0,2% ekstrakt kvasca, 1% glukoza, 0,05% (NH4)2P04, pH 6) u sterilnom Ertenmajerovom balonu od 300 mL, sa sojem Actinomvcetales species HAG 003959, DSM 12931, pa se 7 dana inkubira u rotacionoj mućkalici na 28"C1pri 180 o/min. Zatim se 1,5 mL ove kulture razblaži sa 1,5 mL 99% glicerina i čuva na -20°C. ;Primer 2 ;Pripremanje kulture ili pred- kulture Actinomvcetales species HAG 003959. DSM ;12931 u Erienmaierovom balonu ;Sterilni Erienmajerov balon od 300 mL, koji sadrži 100 mL sledećeg hranljivog rastvora: 15 g/L glukoze, 15 g/L sojinog brašna, 5 g/L namočenog kukuruza, 2 g/L CaC03 i 5 g/L NaCI, inokulira se sa kulturom uzgajenom u kosoj epruveti (isti hranljivi rastvor, ali sa 2% agara), ili sa 1 mL glicerinske kulture (videti Primer 1) i inkubira, u mućkalici pri 180 o/min, na 30°C. Maksimum proizvodnje najmanje jednog jedinjenja pluraflavina iz ovog pronalaska se dostigne posle oko 120 h. Za inokulaciju fermentora od 10 i 200 L, bila je dovoljna kultura stara 48 do 96 h (količina za inokulaciju je oko 10%) iz istog hranljivog rastvora. ;Primer 3 ;Pobijanje pluraflavina ;Fermentor od 9 L radi pod sledećim uslovima: ;Ponavljanim dodavanjem etanolskog poliolnog rastvora bilo je moguće suzbiti opciono stvaranje pene. Maksimum proizvodnje je dostignut posle oko 70 do 96 h. ;Primer 4 ;Izolovanie smeša pluraflavina iz rastvora kulture Actinomvcetales species ;HAG 003959. DSM 12931 ;Po završetku fermentacije Actinomvcetales species HAG 003959, DSM 12931, čorba kulture iz fermentora, dobijena u skladu sa Primerom 3 (90 L), filtrira se uz dodatak oko 2% pomoćnog sredstva za filtriranje (na primer, Celite<®>), pa se ćelijski materijal (0,6 L) ekstrahuje sa 3 L metanola. Metanolski rastvor koji sadrži aktivno jedinjenje, oslobođen micelijuma filtriranjem, koncentriše se pod sniženim pritiskom. Koncentrat, zajedno sa filtratom kulture (7 L) se propušta kroz kolonu od 0,4 L<®>MCI GEL, CHP20P. Eluiranje se obavlja sa gradijentom, od 0,1% sirćetne kiseline u vodi, do 0,1% sirćetne kiseline u 2-propanolu. Protok kolone (1,2 L/h) se sakuplja u frakcije (svaka po 0,25 L), pa se spoje frakcije koje sadrže pluraflavin (20. do 23.). Koncentrisanje pod sniženim pritiskom i sušenje smrzavanjem, daje 1,4 g mrkog praha. ;Primer 5 ;Obogaćivanje komponenata pluraflavina gel hromatografijom ;U kolonu kapaciteta 3,9 L (širinaxvisina=10cmx50cm), ispunjenu sa Fractogel<®>TSK HW-40s, unese se 1,4 g proizvoda dobijenog u skladu sa Primerom 4. Mobilna faza, voda/acetonitril (1:1) se pumpa kroz kolonu sa protokom od 50 mL/min, pa se eluat kolone sakuplja u frakcije (65 mL). Pluraflavini su bili uglavnom u frakcijama 13. do 16. Spoje se i oslobode rastvarača pod sniženim pritiskom. To daje 130 mg smeše pluraflavina. ;Primer 6 ;Razdvajanje komponenata pluraflavina na RP- 18 sa reversnom fazom ;Preparativna kolona HPLC kapaciteta 122 mL (1,25 cm spolj. prečnik * 25 cm visina), napunjena je sa ®Nucleosil 100-7 C18 HD, pa se unese 130 mg smeše pluraflavina dobijene u skladu sa Primerom 5. Eluiranje se obavlja upotrebom 10% acetonitrila i 0,1 M rastvora amonijum-acetata u vodi. Protok kroz kolonu je 50 mL/min, a sakupljaju se frakcije od 50 mL u svakom slučaju. Frakcija 6 sadrži pluraflavin E, pluraflavin C je u frakcijama 12-17, pluraflavin B u frakcijama 25 do 27, a pluraflavin A u frakcijama 35 do 37. Posle koncentrisanja pod sniženim pritiskom i sušenja smrzavanjem, dobijene su sledeće mase:

Primer 7

Finalno prečišćavanje puraflavina A i konverzija u

oblik triflluoroacetatne soli

Frakcije 35 do 37, dobijene u skladu sa Primerom 6, posle sušenja smrzavanjem (22 mg), se rastvore u 10% acetonitrilu u vodi, kome je podešeno pH na 2,8 sa trifluorosirćetnom kiselinom, pa se unesu u kolonu 250/10 LiChrospher RP-18e (5um)<®.>Eluiranje se obavlja sa 0,05% trifluorosirćetnom kiselinom u vodi u 11 do 22% acetonitrila. Koncentrisanje pod sniženim pritiskom i sušenje smrzavanjem daje 18 mg pluraflavin A-trifluoroacetatne soli.

Primer 8

Identifikacija pluraflavina A

Izgled: tamno-žuta supstanca, rastvoma u polarnim organskim rastvaračima, a vrlo slabo rastvoma u vodi. Kisele adicione soli su rastvorne u vodi. Jedinjenje je stabilno u neutralnoj i slabo kiseloj sredini, ali je nestabilno u alkalnoj i jako kiseloj oblasti.

Maksimumi UV spektra: 214, 243, 270 (oštar), 426 nm u 8:2 voda/acetonirilu, pH 2, i 214, 243, 270 (oštar), 290 (oštar) i 426 u 6:4 voda/acetonitrilu, pH 7. IR trake: 3424,1680, 1600, 1464, 1427,1300, 1203, 1131, 1066,1009, 801, 721 cm"1.

Masenom spektrometrijom visoke rezolucije, nađena je sledeća masa molekula (M+H)<+>: 823,370631. Jonizacija raspršivanjem elektrona (ESI, pozitivna) daje, preko fragmentacije MS/MS sledeće jone: 823, 693, 680, 550, 480, 390, 320, 144 i 131 Da.

NMR signali: videti Tablicu 1.

Za aldoheksozu III, opaženi NOE-i su bili saglasni sa relativnom stereohemijom SRSS ili RSRR, u hiralnim centrima 1', 3', 4' i 5' (videti H-lll). Ovo odgovara C-3 epimeru vancosamine-a

H- lll. Relativna stereohemiia heksoze III

Efekti NOE opaženi kod heksoze II favorizuju relativnu stereohemiju RSSS ili SRRR, za hiralne centre 1", 3", 4" i 5" (videti H-ll).

H- ll. Relativna stereohemiia heksoze II

Ista relativna stereohemija (RSSS, SRRR) za asimetrične atome ugljenika 1"', 3", 4'" i 5"' saglasna je sa detektovanim NOE-ima za heksozu I (videti H-1).

H- l. Relativna stereohemiia heksoze I.

Primer 9

Identifikacija pluraflavina B

Izgled: tamno-žuta supstanca, rastvoma u polarnim rastvaračima, a vrlo slabo rastvoma u vodi. Kisele adicione soli su rastvome u vodi. Jedinjenje je stabilno u neutralnoj i slabo kiseloj sredini, a nestabilno u alkalnoj oblasti.

Maksimumi UV spektra: 214, 243, 270 (oštar), 290 (oštar) nm u 8.2 voda/acetonitrilu, pH 2, i 214, 243, 270 (oštar), 290 (oštar), 426 nm u 6:4 voda/acetonitrilu, pH 7.

Pluraflavin B ima empirijsku formulu C^HIseNaOisi masu molekula 840,9 Da. NMR signali: videti Tabelu 2

Primer 10

Finalno prečišćavanje pluraflavina E

Frakcija 6, dobijena u skladu sa Primerom 6, posle sušenja smrzavanjem (5 mg), rastvori se u 10% acetonitriiu u vodi, podesi pH na 2,8 sa trifluorosirćetnom kiselinom i unese u kolonu 250/10 LiChrospher RT-18e (5 pm)® Eluiranje se obavlja korišćenjem 0,05 % trifluorosirćetne kiseline u vodi, sa gradijentom od 11 do 22% acetonitrila. Koncentrisanje pod sniženim pritiskom i sušenjem smrzavanjem daje 2,7 mg pluraflavina E, kao trifluoroacetatnu so.

Primer 11

identifikacija pluraflavina E

Izgled: tamno-žuta supstanca, rastvoma u polarnim rastvaračima, a vrlo slabo rastvoma u vodi. Kisele adicione soli su rastvorne u vodi. Jedinjenje je stabilno u neutralnoj i slabo kiseloj sredini, a nestabilno u alkalnoj i jako kiseloj oblasti. Maksimumi UV spektra: 213, 244, 270 (oštar), 290 (oštar) nm u 8:2 voda/acetonitrilu, pH 2, i 213, 244, 270 (oštar), 290 (oštar), 426 nm u 6:4 voda/acetonitrilu, pH 7.

Sledeća masa molekula je nađena masenom spektrometrijom, za (M+H)<+>: 712 Da, što odgovara empirijskoj formuli CasH^NOiuza pluraflavin E.

NMR signali: videti Tabelu 3.

Primeri 2

( a) Ispitivanje citostatičkog deistva

Za određivanje citostatičkog dejstva, koriste se ćelije hepatokarcnioma pacova, koje su dobijene iz soja iz kolekcije American Type Culture Collection, pod brojem ATCC CRL-1548, Jo No. 223 i 228. Ovaj soj se drži u medijumu "MEM (EAGLE) sa Glutamax" [GIBCO BRL No. 4109-028] sa 10% seruma goveđeg fetusa [GIBCO BRL No. 10270-106] i 10 uL penicilin-streptomicina [GIBCO BRL No. 15140-114] na mL. Koriste se mikrotitarske ploče sa 96 bazenčića [Greiner, No. 15140-114]. Svaki bazenčić se prvo napuni sa 140 uL hranljivog rastvora za kultivisanje i u svakom od slučajeva se inokulira sa 2,15 105 ćelija. Ploče se zatim 20-24 h inkubiraju na 37°C i pri 5% CO2. Unapred se pripremi serija razblaženja pluraflavina sa koncentracijama 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625, 0,7813, 0,3906, 0,195, 0,04, 0,047 i 0 uM, pa se zatim pipetiraju odgovarajućim redom. Posle sledećih 22 h inkubacije na 37<D>C, u atmosferi5%C02, usisa se tečni medijum. Ćelije koje preostanu oboje se sa 100 uL RPMI 1640 [GIBCO BRL No. 32404-014] i 20 uL agensa Cell Titer 96 Aqueous

[PROMEGA No. G5430] u svakom bazenčiću. Meri se absorpcija svetlosti od 590 nm, direktno posle dodavanja i posle 2 h inkubacije, kao gore. Citostatički efekat se izračunava iz promene u absorpciji svetlosti.

IC50za pluraflavin A - <5GnM

IC50 za pluraflavin B = <50 nM

fb) Efekti antiproliferacije pluraflavina A i flavopiridola

na odabranom soju ćelija tumora

MTT, tetrazolijumska so rastvoma u vodi, se konvertuje u nerastvorni purpurni formazan, kada se rastvori otcepljivanjem tetrazolijumskog prstena pomoću enzima dehidrogenaze u aktivnoj mitohondriji. Mrtve ćelije ne izazivaju ovu promenu. Ovaj postupak se koristi za kvantitativno određivanje proliferacije da se utrvdi aktivnost potencijalnih hemoterapeutskih jedinjenja.

Sve ćelije se drže u RPM11640 (Life Technologies, Gaithesburg, MD), koji sadrži 10% toplotno inaktiviranog seruma goveđeg fetusa, penicilin/strepiomicin i dodatak L-glutamina. Ćelije se zaseju na ploče za kultivisanje tkiva sa 96 bazenčića u sledećim gustinama:

Ćelije se ostave na 37°C i 5% C02, preko noći, da adheriraju. Pluraflavin A je razblažen u medijumu kulture sa konačnim koncentracijama kao što sledi: 50,0, 16,67, 5,56, 1,85, 0,617, 0,206, 0,069, 0,023 uM. Flavopiridol je razblažen: 2,0, 0,667, 0,222, 0,074, 0,025, 0,008, 0,003, 0,001 uM. Oba jedinjenja se testiraju u triplikatu pri svim koncentracijama. Ćelije se operu svežim medijumom, pa se dodaju jedinjenja ćelijama, u finalnoj zapemini od 100 uL. ćelije i jedinjenje se ostave da se inkubiraju približno 72 h na 37°C i 5% C02. Po isteku željenog

vremena, u svaki bazenčić se doda po 25 uL MTT (10 mg/mL U HBSS). Ploče se 2-4 h inkubiraju na 37°C. Uklone se MTT i medijumi, pa se doda 200 uL DMSO po bazenčiću. Očitavanja se obave na 570 nm. Rezultati su dati u nastavku:

U testu mekog agara, pluraflavin A i flavopiridol su testirani protiv ćelija leukemije. Vrednosti IC50su bile: 60 nM (pluraflavin A) i 0,5 0,6 uM (flavopiridol).

Claims

1. Jedinjenje formule I naznačeno time, što su: Pm je šećerna grupa, R2je -COOH ili -CH2-0-{R7)m, gde je R7šećerna grupa, R3se bira između grupa koje sadrže epoksid, d-Ce-alkil grupa i C^Ce-alkenil grupa, pri čemu su pomenute alkil i alkenil grupe opciono supstituisane sa najmanje jednom OH grupom, R5se bira između atoma vodonika, CrCe-alkil grupa, CrCe-alkenil grupa i C2-C6-alkinil grupa, R4, Re, Re i R10se, svaki nezavisno, biraju između atoma vodonika, d-Ce-alkil grupa, C2-C6-alkenil grupa, C2-C6-alkinil grupa, -X2H grupa, gde je H direktno vezan za prvi atom u X2i -X2Ri2 grupa, gde je Ri2direktno vezan za prvi atom X2, i opciono R4i Re zajedno su dvostruko vezana^grupa, i opciono R8i R10zajedno su dvostruko vezana-X2grupa, X2se nezavisno bira između atoma kiseonika, -NH grupa, -N-Ci-C6-alkil grupa, -N-C2-Ce-alkenil grupa, -N-C2-C6-alkinil grupa i atoma sumpora, R12se nezavisno bira između Ci-C6-alkil grupa, C2-C6-alkenil grupa, C2-C6-alkinil grupa, aril grupa ili acil grupa, i min se biraju svaki nezavisno, između 1 i 2, i svi njegovi stereohemijski oblici i smeše ovih oblika u bilo kom odnosu, i njegove fiziološki prihvatljive soli i derivati.

2. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što R7predstavlja aminošećer.

3. Jedinjenje prema Zahtevu 1 ili 2, naznačeno time, što R7ima formulu.

4. Jedinjenje prema bilo kom od Zahteva 1 do 3, naznačeno time, što je n jednako 2.

5. Jedinjenje prema bilo kom od Zahteva 1 do 4, naznačeno time, što R1predstavlja aminošećer.

6. Jedinjenje prema bilo kom od Zahteva 1 do 5, naznačeno time, što R1ima formulu:

7. Jedinjenje prema bilo kom od Zahteva 1 do 6, naznačeno time, što se R3bira iz grupe

8. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što ima formulu (IA) i svi njegovi stereohemijski oblici i smeše tih oblika u bilo kom odnosu, i njegove fiziološki prihvatljive soli i derivati.

9. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što ima formulu (IB) i svi njegovi stereohemijski oblici i smeše tih oblika u bilo kom odnosu, i njegove fiziološki prihvatljive soli i derivati.

10. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što ima formulu (1E) i svi njegovi stereohemijski oblici i smeše tih oblika u bilo kom odnosu, i njegove fiziološki prihvatljive soli i derivati.

11. Jedinjenje formule (I), prema bilo kom od Zahteva 1 do 10, naznačeno time, što se dobija kultivisanjem Actinomycetales species HAG 003959, DSM 12931, ili jedne od njegovih varijanti ili mutanata u medijumu kulture pod pogodnim uslovima, sve dok u medijumu kulture ne bude prisutno najmanje jedno jedinjenje formule (I), posle čega sledi izolovanje tog jedinjenja.

12. Jedinjenje prema Zahtevu 11, naznačeno time, što se pomenuto izolovano jedinjenje konvertuje u najmanje jedno jedinjenje koje se bira između derivata i fiziološki prihvatljvih soli.

13. Preparat, naznačen time, što sadrži najmanje jedno jedinjenje formule (I) prema bilo kom od Zahteva 1 do 12, ili fiziološki prihvatljivu so, ili derivat i prihvatljiv nosač.

14. Preparat prema Zahtevu 13, naznačen time, što je pomenuti nosač, farmaceutski prihvatljiv nosač.

15. Postupak za dobijanje najmanje jednog jedinjenja formule (I) ili njegove fiziološki prihvatljive soli, prema bilo kom od Zahteva 1 do 10, naznačen time, što se sastoji u kultivisanju mikroorganizma Actinomycetales species HAG 003959, DSM 12931 ili jedne od njegovih varijanti ili mutanata, u medijumu za kultivisanje pod pogodnim uslovima, sve dok u medijumu kulture ne bude prisutno najmanje jedno od jedinjenja fomrule (I), posle čega sledi izolovanje tog jedinjenja.

16. Postupak prema Zahtevu 15, naznačen time, što se pomenuto izolovano jedinjenje još konvertuje u najmanje jedno jedinjenje koje se bira imeđu derivata i fiziološki prihvatljivih soli.

17. Postupak prema Zahtevu 15 ili 16, naznačen time, što se kultivisanje obavlja pod aerobnim uslovima, na temperaturi između 18° i 35°C i pri pH između 6 i 8.

18. Postupak prema bilo kom od Zahteva 15 do 17, naznačen time što se jedinjenje formule (I) konvertuje u derivat korišćenjem redukcionog sredstva.

19. Jedinjenje formule (I) prema bilo kom od Zahteva 1 do 12, ili njegova fiziološki prihvatljiva so ili derivat, naznačeno time, što se upotrebljava za inhibiciju transkripcije najmanje jedne dvostruko uvijene nukleinske kiseline.

20. Upotreba jedinjenja formule (I) prema bilo kom od Zahteva 1 do 12, ili njegove fiziolški prihvatljive soli ili derivata, za proizvodnju citostatika.

21. Upotreba jedinjenja formule (I) prema bilo kom od Zahteva 1 do 12, ili njegove fiziolški prihvatljive soli ili derivata, za proizvodnju medikamenta za tretman tumora debelog creva.

22. Upotreba jedinjenja formule (I) prema bilo kom od Zahteva 1 do 12, ili njegove fiziolški prihvatljive soli ili derivata, za proizvodnju medikamenta za tretmana tumora dojke.

23. Upotreba jedinjenja formule (I) prema bilo kom od Zahteva 1 do 12, ili njegove fiziolški prihvatljive soli ili derivata, za proizvodnju medikamenta za tretman tumora pluća.

24. Upotreba jedinjenja formule (I) prema bilo kom od Zahteva 1 do 12, ili njegove fiziolški prihvatljive soli ili derivata, za proizvodnju medikamenta za tretman tumora prostate.

25. Upotreba jedinjenja formule (I) prema bilo kom od Zahteva 1 do 12, ili njegove fiziolški prihvatljive soli ili derivata, za proizvodnju medikamenta za tretman leukemije.

26. Upotreba jedinjenja formule (I) prema bilo kom od Zahteva 1 do 12, ili njegove fiziolški prihvatljive soli ili derivata, za proizvodnju medikamenta za tretman infekcija sa mikrobima.

27. Mikroorganizam, naznačen time, što je to Actinomvcete species HAG 003959 (DSM 12931).