NO323413B1 - Pluraflaviner og derivater derav, prparater omfattende disse, fremgangsmate for fremstilling av disse og deres anvendelse, samt en type actinomycetales. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører nye forbindelser av formel I

hvori Ri, R2, R3, R4, R5, R6, R«, Rio og n er som definert nedenfor. Forbindelsene av formel I inhiberer transkriptase, har en cytostatisk virkning og er spesielt egnet for behandling av tumorer. Forbindelsen av formel I kan oppnås ved dyrkning av Actinomycetalesarten HAG 003959, DSM 12931, i et dyrkningsmedium. Følgelig vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsen av formel I, anvendelsen av forbindelsen for fremstilling av et farmasøytiske middel for behandling av ondartede forstyrrelser, og av sykdommer som kan behandles ved inhibering av transkriptase, farmasøytiske preparater omfattende minst en forbindelse av formel I og Actinomycetales type HAG 003959.

Kreft er en sykdom i mennesker og dyr som i de fleste tilfelle er fatal og som generelt er forårsaket av den ukontrollerte vekst av endogene celler. Kreft er betegnelsen anvendt for dannelsen av ondartede tumorer (malignus), av neoplasmer (tumorer eller carcionomer) eller den ondartede degenerasjonen og ugrei modning (dysmaturity) av hvite blodceller (leukemi). Kreft og tumorceller dannes generelt ved transformasjon av endogene celler. Ondartetheten til kreftcellen uttrykker seg selv i den autonome vekst, dvs. dens evne til å vokse uhindret og uten integrasjon med organsystemet og infriltering, med destruksjon av vev. Et sikkert tegn på ondartethet er dannelsen av metastaser langt vekk fra tumoren etter hematogenisk eller lymfogenisk spredning av tumorceller. Kreft er en av de mest frekvente årsaker til menneskers død, og det er derfor et stort behov for fremgangsmåter og midler for helbredelse eller behandling av ondartede degenerasjoner.

I tillegg til det radikale tiltak med kirurgisk fjernelse av tumoren, omfatter valget av terapi mot ondartede tumorer strålingsterapi med røntgenstråler, a-, f}-, y-stråler, immunoterapi og kjemoterapi. På nåværende tidspunkt er anvendelsen av immunoterapi begrenset. Kjemoterapi på tumorer forstås å bety administrering av celletoksiner (cytostatika) for behandling av tumorer og resterende tumorceller generelt etter lokal kirurgisk behandling eller bestråling. Disse substanser interveneres spesifikt i bestemte prosesser av celledeling slik at vev med en høy andel av celler som deler seg slik som det hurtigvoksende tumorvev reagerer følsomt. De anvendte midlene er alkyleringsforbindelser slik som for eksempel cyklofosfamid (The Merck Index, 12. utg. side 463), antimetabolitter slik som metotreksat (The Merck Index, 12. utg. side 1025), alkaloider, slik som vincristine (The Merck Index, 12. utg. side 1704) og antibiotika slik som daunomycin (The Merck Index, 12. utg. side 479), og adriamycin (The Merck Index, 12. utg. side 581-582). Imidlertid, p.g.a. massive bivirkninger, har alle disse midlene signifikante ulemper slik at døden til den syke personen i mange tilfeller kun kan forsinkes, men ikke hindres. Videre blir degenererte (cancer) celler resistente for de anvendte midlene; i dette tilfellet har konvensjonelle farmasøytiske midler ikke lenger noen cytostatisk virkning, men de er toksiske p.g.a. bivirkningene. Derfor er det blitt funnet at en kombinert og/eller sekvensiell anvendelse av cytostatika øker aktiviteten av det individuelle cytostatika (monoterapi), og det er derfor mulig at de betydelige bivirkningene i polykjemoterapi er ikke-additive. Av disse grunner er nye kjemoterapeutiske midler inntrengende påkrevet og disse undersøkes verden over.

Overraskende er det blitt funnet at mikroorganismestammen Actinomycetalestypen HAG 003959, DSM 12931, er i stand til å produsere høyt effektive nye cytostatika som inhiberer cellevekst selv ved meget lave konsentrasjoner. Heri nedenfor refereres de nye forbindelsene som pluraflaviner og de danner sammen med pluraflavinderivater en del av innholdet av oppfinnelsen. Pluraflaviner er antibiotika som omfatter et p-kinoidringskjelett og forskjellige sukkerdannende blokker. De inhiberer transkripsjon ved innskytning/innleiring i nukleinsyre dobbeltstrenger og hvis passende ytterligere alkylering. Ringskjelettet ble beskrevet første gang av S. Kondo et al. i Journal of Antibiotics, bånd 30, side 1143-1145,1977, som en del av pluramycin. Senere ble dette ringskjelettet funnet i et flertall av antibiotika, i tillegg til pluramycin og neopluramycin, forbindelsene saptomyciner (N. Abe et al. J. Antibiotics, 46,1536-1549,1993), ankinomycin (Y. Sato et al. J. Antibiotics 42,149,1989), kidamycin (N. Kanada et al. J. Antibiotics, 24, 599,1971), hedamycin (U. Sequin et al. Tetrahedron, 34, 761,1978( og altromyciner (G. M. Brill et al. J. Antibiotics, 43, 229-237, 1990) er blitt beskrevet som strukturelt relaterte forbindelser. Forbindelsene ifølge den kjente teknikk har ofte ulemper som manifisterer seg i en utilfredsstillende effektivitet, høy toksisitet og/eller uønskede bivirkninger.

Følgelig vedrører den foreliggende oppfinnelsen forbindelser av formel I

hvori

Ri er en sukkergruppe;

R2 er -COOH eller -CH2-0-(R7)m, hvori R7 er en sukkergruppe, og R3 er valgt fra epoksidomfattende grupper,

Ci-Ce-alkylgrupper og C2-C6-alkenylgrupper hvori nevnte alkyl- og alkenylgrupper eventuelt er substituert med minst en OH-gruppe,

Rs er valgt blant et hydrogenatom, Ci-Ce-alkylgrupper, C2-C6-alkenylgrupper og C2-C6-alkynylgrupper;

R», Re, Rs og Rio er hver uavhengig valgt blant hydrogenatomer, Ci-Cé-alkylgrupper, C2-C6-alkenylgrupper, C2<)6-alkynylgrupper, -X2H-grupper hvor H er direkte bundet til det første atomet til X2) og -X2Ri2-grupper hvor R12 er direkte bundet til det første atomet til X2, og eventuelt er R4 og Re sammen en dobbeltbundet -X2-gruppe, og eventuelt er Rg og Rio sammen en dobbeltbundet -X2-gruppe, hvor hver X2 er uavhengig valgt blant oksygenatomer, -NH-grupper, -N-Ci-Ce-alkylgrupper, -N-C2-C6-alkenylgrupper, -N-C2-C6-alkynylgrupper og svovelatomer,

hvor hver R12 er uavhengig valgt blant Cj-C6-alkylgrupper, C2-C6-alkenylgrupper, C2-Cé-alkynylgrupper, arylgrupper og acylgrupper; og

m og n er hver uavhengig valgt blant 1 og 2;

i alle dets stereokjemiske former og blandingen av disse former i et hvilket som helst forhold, og dets fysiologisk akseptable salter og derivater.

I formel I er Ci-Cs-alkyl et rettkjedet eller forgrenet alkyl med fra 1 til 6 karbonatomer, for eksempel metyl, etyl, isopropyl, tert-butyl og heksyl.

C2-C6-alkenyl er et rettkjedet eller forgrenet alkenyl med fra 2 til 6 karbonatomer, for eksempel allyl, crotyl og pentenyl.

C2-C6-alkynyl er et rettkjedet eller forgrenet alkynyl med fra 2 til 6 karbonatomer, for eksempel propynyl, butynyl og pentynyl.

Aryl er en aromatisk ringstruktur, for eksempel fenyl, benzyl eller 1- eller 2-naftyl. Aryl kan eventuelt være substituert for eksempel med halogen slik som klor, brom, fluor, med alkyl med 1-4 karbonatomer, for eksempel metyl, med hydroksyl, med alkoksy med 1-4 karbonatomer for eksempel metoksy og/eller med trifluormetyl.

Acyl kan være alifatiske eller aromatiske acylgrupper. Den alifatiske acylen kan ha 1-7 karbonatomer, fortrinnsvis 1-4 karbonatomer slik som formyl, acetyl, propionyl, butyryl, heksanoyl, akryloyl, crotonoyl, propiolyl som videre kan være substituert for eksempel med halogen slik som klor, brom, fluor, med amino og/eller med alkylamino med 1-4 karbonatomer slik som metyl- eller etylaminogrupper. Aromatisk acyl kan for eksempel være benzoyl eller naftoyl, som også kan være substituert ytterligere for eksempel med halogen slik som klor, brom, fluor, med alkyl med 1-4 karbonatomer for eksempel metyl, med hydroksyl, med aminogrupper slik som for eksempel etylamino eller med alkoksygrupper med 1-7 karbonatomer slik som 1-4 karbonatomer for eksempel metoksy.

Sukkeret (R1/R7) er et monosakkarid (n=l) eller disakkarid (n=2), hvor to monosakkarider er bundet glycosidalt. Monosakkaridet kan være en heksose (C6H12O6), for eksempel aldoheksose, slik som D-(+)-glukose, D-(+)-mannose eller D-(+)-galaktose. Monosakkaridet kan være mono-, di- eller tri-substituert, uavhengig av hverandre med H, OH, NH2, NH(alkyl), N(alkyl)2, alkyl og alkoksy, hvor H og/eller OH til monosakkaridet eventuelt kan være erstattet med substituenter. Betegnelsen "sukker" som anvendt her, omfatter aminosukker. Aminosukker er monosakkarid eller disakkarid, eventuelt substituert som beskrevet hvor minst en OH- eller H-gruppe til mono- eller disakkaridet er erstattet med en aminogruppe slik som NH2, NH(alkyl) eller N(alkyl)2.

I en utførelsesform er m 1.

R7 kan være en aminosukkergruppe av formelen II

hvori

Rb, Rh, Rie, Ris, R20, R22, R24, R26 og R28 er uavhengig valgt fra H, OH, NH2, NHalkyl, N(alkyl)2 og alkoksy, hvor alkyl og alkoksy har fra 1 til 4 karbonatomer.

Eksempler på Ci-C4-alkyl er for eksempel metyl, etyl, propyl, isobutyl og butyl i spesielt metyl, og eksempler på Ci-Gi-alkoksy er for eksempel metoksy, etoksy, isopropoksy eller butoksy, spesielt metoksy.

R7 kan være et aminosukker av formelen ILA.

Ri kan også være et aminosukker. I en utførelsesform er n 2.

Ri kan være en gruppe av formelen ILI

hvor R30 til Reo uvhengig av hverandre er H, OH, NH2, NHalkyl, N(alkyl)2 eller O-alkyl, hvori alkyl er en Ci-C4-gruppe slik som metyl, etyl, propyl, isobutyl og butyl, spesielt metyl, og O-alkyl er Ci-C4-alkoksy, for eksempel metoksy, etoksy, isopropoksy eller butoksy, spesielt metoksy.

Ri har i en utførelsesform formelen HIA

R3 kan være en epoksidholdig gruppe. Den epoksidomfattende gruppen kan være en rettkjedet eller forgrenet alkyl- eller alkenylgruppe med fra 2 til 12 karbonatomer, slik som fra 2 til 6 karbonatomer, som omfatter en eller to epoksidringer (oksiraner). Mulige eksempler er:

I tillegg til en epoksidomfattende gruppe kan R3 være en rettkjedet eller forgrenet alkyl med fra 1 til 12 karbonatomer slik som 1 til 6 karbonatomer for eksempel metyl, etyl, isopropyl, tert-butyl, heksyl og også for eksempel oktyl, dodecyl eller et rettkjedet eller forgrenet alkenyl med fra 2 til 12 karbonatomer, slik som 2 til 6 karbonatomer, for eksempel allyl, krotyl, pentenyl og også dodecenyl, hvor disse alkyl- eller alkenylgrupper også kan være mono- eller polysubstituerte slik som di- eller tri-substituerte, for eksempel med hydroksyl.

Oppfinnelsen vedrører følgelig pluraflavin A av formelen IA

til pluraflavin B av formelen IB og til pluraflavin E av formel IE

hvor heksose I er en 2,6-dideoksyaldoheksose,

heksose II er en 2,3, 6-trideoksy-3-dimetylaminoheksose og heksose III er en 2, 3, 6-trideoksy-3-amino-3-metylaldoheksose, i alle deres stereokjemiske former og blandinger av disse former i et hvilket som helst forhold og deres fysiologiske akseptable salter.

I en utførelsesform er forbindelsene valgt blant formlene IA, LB og IE hvori heksose I er oliose,

heksose II er rodosamin og

heksose III er 3-epi-vankosamin.

Ifølge oppfinnelsen er forbindelsene av formel I oppnåelig ved dyrkning, for eksempel fermentering av Actinomycetales type HAG 003959, DSM 12931, eller dens varianter eller mutanter under egnede betingelser i et dyrkningsmedium, inntil minst en av pluraflavinene av formel I er tilstede i dyrkningsmediumet. Pluraflavinene kan etterfølgende isoleres fra dyrkningsmediumet, renses og hvis passende, omdannes til kjemiske derivater og/eller til deres fysiologiske akseptable salter.

Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse av

formel I eller et fysiologisk salt derav som omfatter dyrkning for eksempel fermentering av mikroorganismen Actinomycetales typen HAG 003959, DSM 12931, eller en av dets varianter eller mutanter under egnede betingelser i dyrkningsmedium inntil minst en av pluraflavinene av formel I er tilstede i dyrkningsmediumet, etterfulgt av isolering av forbindelsen, og hvis passende omdanne til kjemiske derivater og/eller fysiologiske akseptable salter.

Stammen HAG 003959, DSM 12931, dens mutanter og/eller varianter dyrkes i en utførelsesform, i en næringsoppløsning (også referert til som et dyrkningsmedium) omfattende minst en kilde til karbonatomer, og minst en kilde til nitrogenatomer, og de vanlige uorganiske saltene inntil minst et nytt ploraflavin er tilstede i dyrkningsmediummet, ploraflavinene kan etterfølgende isoleres fra dyrkningsmediumet og hvis passende, utskilles i de individuelle aktive komponentene.

Oppfinnelsen angår også Actinomycetales HAG 003959, DSM 12931.

Dyrkningen kan utføres under aerobe betingelser. Dyrkningen kan utføres ved en temperatur varierende fra 18 til 35°C, og i et pH-område fra 6 til 8.

I litteraturen er det blitt beskrevet et stort antall av reaksjoner for kjemisk derivatdannelse av kinoner. Følgelig kan derivatiseringen av kinonformene av de foreliggende forbindelsene utføres anvendende kjemiske reaksjoner som er for så vidt kjente. En reduksjon til hydrokinonformene av forbindelsene kan for eksempel oppnås katalytisk med hydrogen eller med metallhydrider slik som aluminiumhydrider eller borhydrider. Et ytterligere egnet eksempel er omdannelsen av kinoner med hydroksylamin eller med dets derivater til oksimer som for deres del videre kan omdannes kjemisk.

Oppfinnelsen vedrører følgelig en forbindelse av formel IV

hvori Ri, R2, R3 og n er som definert over i alle dens stereokjemiske former, blandingen av disse fonnene i et hvilket som helst forhold og dets fysiologiske akseptable salter.

Pluraflavinderivatene av formel IV A, IVB og I VE (nedenfor) er respektivt avlet av pluraflavinene av formel IA, IB og IE, og de danner også en del av denne oppfinnelsen.

Oppfinnelsen vedrører videre en forbindelse av formel IVA

en forbindelse av formel IVB og en forbindelse av formel IVE

i alle deres stereokjemiske former og blandinger av disse formene i et hvilket som helst forhold og deres fysiologiske akseptable salter.

Heretter er oppfinnelsen beskrevet i detalj, for eksempel i minst en utførelsesform.

Pluraflavinene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles av Actinomycetales i en utførelsesform av Actinomycetales type HAG 003959, DSM 12931. Actinomycetales typen HAG 003959, DSM 12931 har et beige-rødt mycellium og kan identifiseres med conidioforer som er typisk for Actinomycetes.

En taksonimisk eksaminisasjon av mikroorganismen Actinomycetales type HAG 003959, DSM 12931, ga det følgende resultat av bestemmelsen av dens stamme: den dianostisk viktige fettsyreanalysen ved gasskromatografi viste høye andeler av:

anteiso 15:0 fettsyre,

iso 16:0 fettsyre (isopalmitinsyre),

iso 17:0 fettsyre (anteisomargarinsyre)

anteiso 17:0 fettsyre (anteisomargarinsyre) og

cis[9] 18:1 fettsyre (oleinsyre) i tillegg til lavere konsentrasjoner av andre fettsyrer.

Denne fettsyresammensetningsprofil tillater at Actinomycetales HAG 003959 (DSM 12931) taksonomisk tilordnes til slekten Saccharothrix.

Et isolat av mikroorganismen ble deportnert ved Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkurlutren GmbH, Mascheroder Weg IB, D 38124 Braunschweig, Tyskland, ifølge reglene til Budapestkonvensjonen av den 16. juli 1999 under det følgende nummer: Actinomycetales type HAG 003959, DSM 12931.

I stedet for stammen Actinomycetales type HAG 003959, DSM 12391, er det også mulig å anvende dets mutanter og varianter som syntetiserer minst en forbindelse av prulaflavinene ifølge oppfinnelsen. Slike mutanter kan fremstilles på en for så vidt kjent måte på fysiske måter for eksempel bestråling, for eksempel med ultraviolett eller røntgenstråler, eller kjemisk mutagenese slik som for eksempel etyl metansulfonat (EMS), 2-hydroksy-4-metoksybenzofenon (MOB) eller N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG).

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes for fermentering i laboratorieskalaer (milliliter til literområdet) eller på en industriell skala (kubikkmeterskala). Med mindre annet er indikert er alle prosenter basert på vekt. I tilfellet med væsker er blandingsforholdet basert på volum med mindre annet er angitt.

I en utførelsesform er kilden til karbonatomer for aerob fermentering assimilerbare karbohydrater og sukkeralkoholer slik som glykose, laktose, sukrose eller D-mannitol, og hydrokarbonholdige naturlige produkter slik som for eksempel maltekstrakt. Egnede kilder til nitrogenatomer for dyrkning er: aminosyrer, peptider og proteiner og deres degradasjonsprodukter slik som peptoner eller tryptoner, videre kjøttekstrakter, gjærekstrakter, malt korn, for eksempel av mais, hvete, bønner, soya eller bomull, destillasjonsrester fra alkoholproduksjon, kjøttmei eller gjærekstrakter, men også ammoniumsalter og nitrater. Uorganiske salter inneholdt i næringsløsningen kan for eksempel være klorider, karbonater, sulfater eller fosfater av alkalimetaller eller jordalkalimetaller, jern, sink, kobolt og mangan.

Dannelsen av pluraflavinene ifølge oppfinnelsen forløper i et dyrkningsmedium som omfatter omkring 0,1 til 5 % slik som 0,3 til 2 % glykose, og 0,2 til 5 % slik som 0,5 til 3 % soyamel, og 0,05 til 2 % slik som 0,2 til 1,0 g/l maisstøp og 0,05 til 1,0 g/l slik som 1,0 til 0,5 % kalsiumkarbonat og 0,5 til 1,0 g/l slik som 0,1 til 1,0 g/l natriumklorid. Prosentene er i hvert tilfelle basert på vekten av hele dyrkningsmediumet.

I dyrkningsmediumet produserer Actinomycetales type HAG 003959, DSM 12931, en blanding av pluraflaviner. Avhengig av sammensetningen av dyrkningsmediumet, kan andelen av minst en av pluraflavinene ifølge oppfinnelsen variere. Videre via sammensetningen av mediummet er det mulig å kontrollere syntesen av individuelle pluraflaviner slik at en eller enda flere av pluraflavinene ikke produseres i det hele tatt av mikroorganismen eller i en mengde under deteksjonsgrensen.

I en utførelsesform omfatter dyrkningsmediumet en detekterbar pluraflavin. I ytterligere utførelsesformer dannes pluraflavinene A, B eller E.

I tillegg til pluraflavinene A, B og E (forbindelser respektivt av formel IA, IB og IE), dannes andre relaterte forbindelser som adskiller seg fra forbindelsene representert ved formlene IA, IB og IE idet de er glykosylert forskjellig, også i dyrkningsmediummet til Actinomycetales type HAG 003959, DSM 12931. Således ble det som biprodukt dedektert en ytterligere pluraflavin (pluraflavin C) med en molekylvekt på 974 Da og et degenereringsprodukt av pluraflavin A, molekylvekt 692.77, C37H44N2O11.1 den sist nevnte forbindelsen mangler heksose I; under syrebetingelser kan 2,6-dideoksyaldoheksose hydrolytisk spaltes fra pluraflavin A.

Mikroorganismen dyrkes aerobisk, dvs. for eksempel nedsenket med risting eller omrøring i ristede flasker eller fermentorer, hvis passende med innføring av luft eller oksygen. Den kan utføres i temperaturområdet fra 18 til 35°C slik som fra 25 til 32°C, inklusive fra 27 til 30°C. pH'en bør generelt variere fra 6 til 8 slik som fra 6,5 til 7,5. Under disse betingelser dyrkes mikroorganismen generelt i en periode rangert fra 24 til 300 timer slik som fra 36 til 140 timer.

Dyrkningen utføres fordelaktig i flere trinn, dvs. minst en forkultur fremstilles i et flytende næringsmedium som deretter inokuleres i det aktuelle produksjonsmediumet, hovedkulturen for eksempel i volumforhold 1:10. Prekulturen oppnås for eksempel ved inokulering av et mycelium i en næringsoppløsning og tillater denå vokse i ca. 36 til 120 timer, slik som i 48 til 96 timer. Myceliumet kan oppnås for eksempel ved å tillate at stammen vokser i omkring 3 til 40 dager, slik som 4 til 10 dager på et fast eller flytende næringsmedium, for eksempel malt-gjæragar eller havremelsagar.

Fermenteringsfremgangsmåten kan overvakes med pH'en til kulturen eller myceliumvolumet, og også ved kromatografiske måter slik som for eksempel tynnskiktskromatografi, høytrykksvæskekromatografi eller testing av den biologiske aktivitet. Pluraflavinene ifølge oppfinnelsen kan finnes både i myceliumet og i dyrkningsfiltratet. Isoleringsfremgangsmåten beskrevet under tjener generelt til å rense pluraflavinene ifølge oppfinnelsen slik som å rense pluraflavinene A, B og E.

Isolasjon og/eller rensing av pluraflavinene ifølge oppfinnelsen utfra dyrkningsmediumet utføres ved de kjente fremgangsmåtene ved at man tar de kjemiske, fysiske og biologiske egenskapene til de naturlige produktene i betraktning. For å teste prolaflavinkonsentrasjonen i dyrkningsmediumet, eller i de individuelle isolasjonstrinnene, er det mulig å anvende tynnskiktskromatografi, for eksempel på silikagel anvendende kloroform/metanol/iseddikk/vann-blandinger (for eksempel i forholdet 8:1:1:0,2) som mobil fase eller HPLC. I tynnskiktskromatografisk separering kan deteksjon for eksempel utføres anvendende fargene reagenser slik som o> naftol/svovelsyre, hvor mengden av dannet substans formålstjenelig sammenlignet med en kalibreringsløsning.

Ifølge oppfinnelsen kan pluraflaviner isoleres fra enten mycelium eller dyrkningsmedium. Generelt avskilles innledningsvis myceliumet fra dyrkningsmediumet ved vanlige fremgangsmåter og pluraflavinene ekstraheres etterfølgende fra cellematerialet anvendende et vanlig vann blandbart organisk løsemiddel. Den organiske løsemiddelfasen inneholder pluraflaviner ifølge oppfinnelsen, hvis passende, kan de konsentreres under redusert trykk og renses ytterligere som beskrevet under.

Hvis passende kombineres dyrkningsfiltratet med konsentratet av mycelliumekstraktet og ekstraheres med et egnet ikke vannblandbart organiske løsemiddel for eksempel n-butanol. Den organiske fasen separeres deretter fra, og hvis passende konsentreres under redusert trykk. For å fjerne det verdifulle produktet kan konsentratet fortynnes i et ikke polær løsemiddel hvori pluraflavinene ifølge oppfinnelsen kun er lite oppløselig slik som for eksempel heksan, pretoleumeter og dietyleter. Dette forårsaker at pluraflavinene feller ut og lipofile urenheter forblir oppløst og fjernes ved vanlig fast-væskefaseadskillelse. Presipitatet som inneholder alle pluraflaviner som skal isoleres oppløses i 1/30 av det opprinnelige volum vann/metanol. Presipitatet oppløses fullstendig og lyofiliseres. Lyofilisatet som refereres til som råprodukt heri nedenfor omfatter 0,5 til 50% pluraflavin og anvendes for ytterligere isolering.

Den videre rensing av en eller flere av pluraflavinene ifølge oppfinnelsen utføres med kromatografi på egnede materialer slik som på molekylsikter, på normal fasebærer slik som for eksempel silikagel, alumina, på ionbyttere eller på adsorberresiner og/eller omvendt fasemediumer (RP). Ved hjelp av denne kromatografi adskilles pluraflavinene. Kromatografien av pluraflavinene utføres anvendende buffrede vandige løsninger eller blandinger av vandige eller organiske løsninger.

Blandinger av vandige eller organiske løsninger skal forstås å bety alle vann-blandbare organiske løsemidler slik som metanol, propanol og acetonitril, i en konsentrasjon varierende fra 10 til 80% løsemiddel, for eksempel fra 40 til 60% løsemiddel eller ellers alle buffrede vandige løsninger som er blandbare med organiske løsemidler. Buffrene som anvendes kan være de samme som anført over.

Separasjon av pluraflavinene basert på deres forskjellige polaritet kan utføres ved hjelp av motsatt fasekromatografi, for eksempel på "MCI" (adsorberresin fra Mitsubishi, Japan) eller "Amberlit XAD" ("TOSOHAAS"), og videre på hydrofobe materialer slik som på RP-8 eller RP-18-faser. Videre kan separasjon utføres ved hjelp av normal fasekromatografi, for eksempel på silikagel, alumina og lignende.

Kromatografien av pluraflavinene kan utføres anvendende buffrede eller sure vandige løsninger eller blandinger av vandige løsninger med alkoholer eller andre vann-blandbare organiske løsemidler. Det anvendelige organiske løsemiddelet kan være propanol og acetonitril.

Buffrede eller forsurede vandige løsninger skal forstås å bety for eksempel vann, fosfatbuffer, ammoniumacetat, sitratbuffer i konsentrasjon var 1 mM til 0,5 M, og også maursyre, eddikksyre, trifluoreddikksyre eller alle kommersielle syrer kjent for en fagperson innen fagfeltet for eksempel i en konsentrasjon varierende fra 0,01 til 3%, slik som fra 0,1%.

Kromatografi kan utføres anvendende en gradient startende med 100% vandig buffer og sluttende med 100% løsemiddel, for eksempel en lineær gradient rangert fra 10 til 50% anvendende 2-propanol eller acetonitril.

Alternativt er det også mulig å utføre gelkromatografi eller kromatografi på hydrofobe baser.

Gelkromatografi kan utføres på polyakrylamid eller blandede polymergeler slik som for eksempel "Biogel-P 2" (Biorad), "Fractogel TSK HW 40" (Merck, Tyskland eller Toso Haas, USA) eller på "Sephadex" (Pharmacia, Uppsala, Sverige).

Rekkefølgen av kromatografiene nevnt over kan snus om.

Et videre høyeffektivt rensingstrinn for pluraflaviner er krystallisering. Pluraflavinene krystalliserer fra oppløsninger i organiske løsemidler og fra blandinger fra vann med organiske løsemidler. Krystallisasjon kan utføres på en for så vidt kjent måte, for eksempel ved konsentrasjon eller kjøling av mettede pluraflavinoppløsninger.

Pluraflavinene ifølge oppfinnelsen er stabile i den faste tilstanden, og i løsninger med en pH veiende fra 3 til 8, for eksempel fra pH 4 til 6, og de kan derfor inkorporeres i vanlige farmasøytiske preparater.

Pluraflavinene av formel I og de kjemiske derivatene derav kan omdannes ved fremgangsmåter kjent av fagpersoner innen fagfeltet til korresponderende fysiologisk akseptable salter.

Med fysiologiske akseptable salter av forbindelse av formel I forstås både deres organiske og uorganiske salter slik som de er beskrevet i Rernington's Pharmaceutical Sciences (17. utg. side 1418 (1985). Basert på den fysikalske og kjemiske stabilitet og oppløseligheten er natrium, kalium, kalsium og ammoniumsalter, bl.a. mulige utførselsformer av syregrupper, salter av saltsyre, svovelsyre, fosforsyre, karboksylsyrer eller sulfonsyre slik som for eksempel eddikksyre, sitronsyre, benzosyre, maleinsyre, fumarsyre, vinsyre og p-toluensulfonsyre, er bl.a. mulige utførselsformer av basiske grupper.

Oppfinnelsen omfatter videre åpenbare kjemiske ekvivalenter (heri også referert til som "derivater") av forbindelsene av formel I som har en liten kjemisk forskjell, dvs. som har den samme aktiviteten eller som kan omdannes til forbindelsen ifølge oppfinnelsen under milde betingelser. De nevnte ekvivalentene omfatter for eksempel estere eller etere, komplekser og også reduksjonsprodukter av forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Estere, eterderivater og reduksjonsprodukter kan fremstilles ved fremgangsmåter beskrevet i litteraturen for eksempel i "Advanced Organic Synthesis", 4. utg. J. March, John Wiley & Sons, 1992. Karboksygruppen (formel IE, IVE) og hydroksygrupper til forbindelsene av formel I kan f.eks. omdannes til en estergruppe eller etergruppe. Slike estere omfatter for eksempel (Ci-C4)-alkylestere. Slike etere omfatter for eksempel acetaler og ketaler av hydroksygruppene.

Stabile komplekser av forbindelsene av formel I kan dannes med fysiologisk akseptable uorganiske kationer slik som kalsium eller magnesium.

Den foreliggende oppfinnelsen omfatter alle stereoisomere former av forbindelsene av formel I. Asymetrisenterne til forbindelsene av formlene IA, IB og IE, kan uavhengig av hverandre i hvert tilfelle, ha S-konfigurasjon eller R-konfigurasjon. Oksiranene av den epoksidhoIdige gruppen kan være på en hvilken som helst posisjon, for eksempel oksiraner som inkorporerer karbonatomene 2' og 3'. Oppfinnelsen omfatter alle mulige enantiomerer og diasteromerer, og også blandinger av minst to stereoisomere former som for eksempel blandinger av enantiomerer og/eller diaesteromerer i et hvilket som helst forhold. Således tilveiebringer oppfinnelsen enantiomerer i enantiomerren form, både som venstre dreide og som høyre dreide antipder, R- og S-konfigurasjoner, på formen av racemater og på formen av blandinger av de to enantiomerene i et hvilket som helst forhold. Hvis det er en cis/trans isomeri, omfatter oppfinnelsen både cisformen og transformen, og blandingen av disse former i et hvilket som helst forhold.

Med hensyn til deres nyttige farmakologiske egenskaper er forbindelsen ifølge oppfinnelsen egnet for anvendelse som farmasøytiske midler innen human og/eller veterinærmedisin. De har antibiotisk aktivitet og i tillegg til den antibakterielle virkningen, antimykotisk, dvs. fungi-inhiberende, inklusive fytopatogene fungi, antiprotozoiske og antiparasitiske egenskaper.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan anvendes ved kreftsykdommer, for eksempel som kjemoterapeutiske midler. P.g.a. deres cytostatiske egenskaper, slik som deres potente antitumoraktivitet og en antimikrobiell virkning, kan de anvendes f.eks. som cytostatika for skadelige degenereringer i dyr og mennesker.

I tilfelle med tumorceller som har utviklet resistens mot konvensjonelle midler har kun nye midler en tilstrekkelig terapeutisk virkning. Således har pluraflavinene ifølge oppfinnelsen og derivatene derav av formel I, en potensiell fortreffelig virkning selv mot disse problemcelletyper.

Oppfinnelsen vedrører også farmasøytiske preparater som omfatter minst en av pluraflavinene av formel I ifølge oppfinnelsen eller et fysiologisk akseptabelt salt eller derivat derav og en akseptabel vehikkel. Pluraflaviner kan anvendes i en blanding med minst et egnet hjelpe- eller tilsetningsstoff. Tilsetningsstoffene anvendt for mennesker kan være alle farmakologisk akseptable tilsetningsstoffer og/eller hjelpestoffer.

Oppfinnelsen kan anvendes ved en fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen som omfatter å bringe minst en forbindelse ifølge oppfinnelsen på en egnet administrerbar form anvendende et farmasøytisk egnet og fysiologisk akseptabelt tilsetningsstoff, og hvis passende, videre egnede aktive forbindelser, additiver eller hjelpestoffer.

Farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen administreres generelt oralt, topisk eller parenteralt, men rektal administrering er også mulig. Egnede faste eller flytende farmasøytiske preparatformer er for eksempel granulater, pulvere, tabletter, belagte tabletter, (mikro)kapsler, suppositorier, siruper, emulsjoner, suspensjoner, aerosoler, dråper eller injekterbare løsninger på ampullform, og preparater med en langvarig frigivning av aktiv forbindelse, ved fremstilling hvor det vanligvis anvendes tilsetningsstoffer og additiver og/eller hjelpestoffer slik som sprengmidler, bindemidler, belegningsmidler, oppsvulmingsstoffer, glide- eller smøremidler, smaksstoffer, søtningsstoffer eller oppløsningshjelpestoffer. Ofte anvendte tiUétningsstoffer eller hjelpestoffer som for eksempel kan nevnes her er magnesiumkarbonat, titandioksid, laktose, mannitol og andre sukkere, talkum, laktoprotein, elatin, stivelse, vitaminer, cellulose og dets derivater, animalske og vegetabilske oljer, polyetylenglykoler og løsemidler slik som for eksempel sterilt vann, alkoholer, glyserol og polyoler.

Hvis passende, kan dosisenhetene være mikroinnkapslede for oral administrering for å forsinke frigivning eller for å strekke ut frigivningen over en relativt lang tidsperiode slik som for eksempel ved belegning eller innleiring av partikulære aktive forbindelser i egnede polymerer, voks eller lignende.

De farmasøytiske preparatene kan fremstilles og administreres i dosisenheter, hver enhet omfattende som aktiv ingrediens i en bestemt dose av minst en forbindelse av pluraflavinene ifølge oppfinnelse og/eller kjemiske derivater derav. I tilfellet med fastfasedosisenheter slik som tabletter, kapsler og suppositorier, kan denne dose være opptil ca. 200 mg, men kan være fra ca. 0,1 til 100 mg, og i tilfellet med oppløsninger for injeksjon på ampullform på opptil omtrent 200 mg, men kan være omtrent 0,1 til 100 mg per dag.

Den daglige dosen som administreres avhenger av kroppsvekten, alderen, kjønn og tilstand til pattedyrsubj ektet. Imidlertid kan høyere eller lavere daglige doser også være nødvendig. Den daglige dosen kan enten administreres ved en anledning i form av en enkeltdoseenhet, på formen av adskillige mindre doseenheter eller ellers bli gitt ved adskillige anledninger, i forutbestemte intervaller i form av underoppdelte doser.

Oppfinnelsen angår også en forbindelse av formel I ifølge oppfinnelsen eller et fysiologisk akseptabelt salt eller derivat derav, for anvendelse ved inhiberingen av transkripsjonen av minst en dobbeltbundet nukleinsyre.

Oppfinnelsen angår videre anvendelse av en forbindelse av formel I ifølge oppfinnelsen eller et fysiologisk akseptabelt salt eller derivat derav, for fremstilling av et cytostatika.

Oppfinnelsen vedrører anvendelse av en forbindelse av formel I ifølge oppfinnelsen eller fysiologisk akseptabelt salt eller derivat derav, for fremstilling av et medikament for behandling av tarmtumorer.

Oppfinnelsen angår anvendelse av en forbindelse av formel I ifølge oppfinnelsen eller et fysiologisk akseptabelt salt eller derivat derav, for fremstilling av et medikament for behandling av mamma-(bryst) tumorer.

Oppfinnelsen angår anvendelse av en forbindelse av formel I ifølge oppfinnelsen eller et fysiologisk akseptabelt salt eller derivat derav, for fremstilling av et medikament for behandling av lungetumorer.

Oppfinnelsen angår anvendelse av en forbindelse av formel I ifølge oppfinnelsen eller et fysiologisk akseptabelt salt eller derivat derav, for fremstilling av et medikament for behandling av prostatatumorer.

Videre angår oppfinnelsen anvendelse av en forbindelse av formel I ifølge oppfinnelsen eller et fysiologisk akseptabelt salt eller derivat derav, for fremstilling av et medikament for behandling av leukemi.

Oppfinnelsen angår videre anvendelse av en forbindelse av formel I ifølge oppfinnelsen eller et fysiologisk akseptabelt salt eller derivat derav, for fremstilling av et medikament for behandling av mikrobielle infeksjoner.

Oppfinnelsen er illustrert ytterligere i eksemplene som følger. Prosentangivelse er basert på vekt. I tilfellet med væsker, er blandingsforhold basert på volum med mindre annet er angitt.

De følgende er illustrative eksempler av den foreliggende oppfinnelsen.

Eksempler

Eksempel 1

Fremstilling av en glyserolkultur av Actinomycetales type HAG 003959, DSM 12931.

100 ml næringsoppløsning (maltekstrakt 2,0%, gjærekstrakt 0,2%, glukose 1,0%, (NH4)2HP04 0,05%, pH 6,0) i en steril 300 ml Erlenmeyerkolbe ble inokulert med stammen Actinomycetales type HAG 003959, DSM 12931, og inkubert på en roterende rister ved 28°C og 180 rpm i 7 dager. 1,5 ml av denne kultur ble deretter fortynnet med 1,5 ml 99% sterkt glycerol og lagret ved -20°C.

Eksempel 2

Fremstilling av en kultur eller en prekultur i en Erlenmeyerkolbe av Actinomycetales type HAG 003959, DSM 12931.

En steril 300 ml Erlenmeyerkolbe som inneholdt 100 ml av den følgende næringsløsning: 15 g glukose/l, 15 g soyamel/1, 5 g maisstøp/1,2 g CaC03/l og 5 g NaCl/1 ble inokulert med en kultur dyrket på et skrått rør (samme næringsløsning, men med 2% agar) eller med 1 ml av en glycerolkultur (se eksempel i) og inkubert på en rister ved 180 rpm og 30°C. Maksimumlproduksjonen av minst en forbindelse av pluraflavinene ifølge oppfinnelsen ble oppnådd etter omtrent 120 timer. For inokuleringa i 10 og 2001 fermentorer var en 48- til 96-timer gammel nedsenket kultur (inokuleringsmengde omkring 10%) fra den samme næringsløsning nødvendig.

Eksempel 3

Fremstilling av pluraflaviner.

En 91 fermenter ble drevet under de følgende betingelser:

Næringsmedium: 15 g glukose/l; 15 gsoyamel/; 5 g maisstøp, fast/l;

2gCaC03/l;

5gNaCl/l;

pH 7,0 (før sterilisasjon)

Varighet av prosessen: 92 timer

Inkuberingstemperatur: 28°C

Omrøringshastighet: 300 rpm

Beluftning: 5 1 min'<1>

Ved gjentatt tilsetning av etanolsk polyol løsning var det mulig valgfritt å undertrykke dannelsen av skum. Produksjonsmaksimum ble oppnådd etter omkring 70 til 96 timer.

Eksempel 4

Isolering av pluraflavinblandingen fra dyrkningsløsningen av Actinomycetales type HAG 003959, DSM 12931.

Etter fermenteringen av Actinomycetales type HAG 003959, DSM 12931, var avsluttet ble dyrkningssuppen fra fermenteren oppnådd ifølge eksempel 3 (90 liter) filtrert med tilsetning omkring 2% filtreringshjelpestoff (for eksempel "Celite"), og cellematerialet (0,6 liter) ble ekstrahert med 3 liter metanol. Den aktivforbindelsesholdige metanolske løsningen ble frigitt fra mycelium ved filtrering og konsentrering under redusert trykk. Konsentratet ble satt sammen med dyrkningsfiltratet (7 liter), tilført til en forberedt 0,4 liter "MCI GEL", CHP20P-kolonne. Eluering ble utført anvendende en gradient på 0,1% eddikksyre i vann til 0.1% eddikksyre i propanol. Kolonnegjennomstrømningen (1,2 liter per time) ble oppsamlet i fraksjoner (på hver 0,25 liter), og de pluraflavinholdige fraksjonene (20 til 23) ble samlet. Konsentrasjon under redusert trykk og frysetørking ga 1,4 g av et brunt pulver.

Eksempel 5

Anrikning av pluraflavinforbindelsene ved gelkromatografi.

1,4 g av produktet oppnådd ifølge eksempel 4 ble påført til kolonne med en kapasitet på 3,9 liter (bredde x høyde = 10 cm x 50 cm) fylt med "Fractogel" TSK HW-40 s. Den mobile fasen vann/acetonitril (1:1) ble pumpet gjennom kolonnen med en strømningsrate på 50 ml per minutt, og det som strømmet gjennom kolonnen ble oppsamlet i fraksjoner (65 ml). Pluraflavinene var hovedsakelig i fraksjonene 13 til 16. De ble samlet og befriet for løsemiddelet under redusert trykk. De ga 130 mg pluraflavinb landing.

Eksempel 6

Separasjon av pluraflavinkomponentene ved motsatt fase RP-18.

En preparativ HPLC-kolonne med en kapasitet på 122 ml (1.25 cm (ID) x 25 H) ble fylt med "Nucleosiri00-7 C18 HD, og 130 mg av pluraflavinblandingen oppnådd ifølge eksempel 5 ble tilført. Eluering ble utført anvendende 10% acetonitril og 0,1 M vandig ammoniumacetatløsning. Kolonnegjennomstrømningen var 50 ml/minutt og fraksjoner av i hvert tilfelle 50 ml innhold ble oppsamlet. Fraksjon 6 omfattet pluraflavinen E, pluraflavinen C var i fraksjonene 12-17, pluraflavin B var i fraksjonene 25 til 27 og pluraflavin A i fraksjonene 35 til 37. Etter konsentrasjon under redusert trykk og frysetørking ble de følgende mengder oppnådd:

pluraflavin A: 22 mg, ESI + MS: 823 Da (M+Hf,

pluraflavin B: 18 mg, ESI + MS: 841 Da (M+H)<+>,

pluraflavin C: 11 mg, ESI + MS: 974 Da (M+H)<+>,

pluraflavin E: 5 mg, ESI + MS: 712 Da (M+H)<+>.

Eksempel 7

Endelig rensing av pluraflavin A og omdannelse til trifluoracetatsaltformen.

Fraksjonene 35 til 37 oppnådd ifølge eksempel 6, blir etter frysetørking (22 mg) oppløst i 10% acetonitril i vann, justert til pH 2,8 med trifluoreddikksyre og tilført til en 250/10 "LiChrospher RP-18e" (5 um) kolonne. Eluering ble utført anvendende 0,05% vandig trifluoreddikksyre i 11 til 22% acetonitril. Konsentrasjon under redusert trykk og frysetørking ga 18 mg pluraflavin A-trifluoracetatsalt.

Eksempel 8

Identifikasjon av pluraflavin A.

Utseende: en dyp-gul substans som var oppløselig i polare organiske løsemidler, men kun sporadisk løselig i vann. Syreaddisjonssaltene er vann-oppløselige. Forbindelsen var stabil i nøytral til middels surt medium, men ustabil i alkalisk og sterk surt område. UV-maksimum: 214,243,270 (Sh), 290 (Sh), 426 nm i vann/acetonitril (8:2), pH 2 og 214,243,270 (Sh), 290 (Sh) og 426 nm i vann/acetonitril (6:4), pH 7,

IR bånd: 3424,1680,1600,1464,1427,1300,1203,1131,1066,1009,801,721 cm<*1>. ;Ved høy oppløsningsmassespektrometri ble de følgende molekylvektene funnet for M + H)<+>: 823.370631 Da, tilsvarende til den empiriske formen for pluraflavin A på C43H54N2O14. Elektron sprayionisering (ESI, positiv) gir via MS/MS fragmentering de følgende ioner: 823,693,680, 550,390,320,144 og 131 Da. ;NMR signaler: se tabell 1. ;For aldoheksosen III, var de observerte NOE'er i overenstemmelse med en relativt SRSS eller RSRR stereokjemi ved de kirale sentrene V, 3', 4', 5' (se H-III). Dette tilsvarer til C-3 epimeren av vancosamin. ;H-III Relativ stereokjemi for heksose III. ;NOE-effektene observert for heksose II favoriserer den relative stereokjemien RSSS eller SRRR for de kirale sentrene 1", 3", 4", 5" (se H-II). ;H-II. Relativ stereokjemi for heksose II. ;Den samme relative stereokjemien (RSSS, SRRR) for de asymmetriske karbonatomene 1"\ 3'", 4'*', 5"' var i overensstemmelse med de direkterte NOE'er for heksose I (se

H-I).

H-I. Relativ stereokjemi for heksose I.

Eksempel 9

Identifikasjon av pluraflavin B.

Utseende: en dyp-gul substans som var oppløselig i polare organiske løsemidler, men kun sparsomt løselig i vann. Syreaddisjonssaltene er vann-oppløselige. Forbindelsen var stabil i nøytral og middels surt medium, men ustabil i det alkaliske området.

UV maksimum: 214,243,270 (Sh), 426 nm i vann/acetonitril (:2), pH 2 og 214, 243, 270, (Sh), 290 (Sh) og 426 nm i vann/acetonitril (6:4), pH 7.

Pluraflavin B har den empiriske formelen (C43H56N2O15), molekylvekten var 840.9 Da. NMR-signaler: se tabell 2.

Eksempel 10

Sluttrensing av pluraflavin E.

Fraksjon 6, oppnådd ifølge eksempel 6, ble etter frysetørking (5 mg), oppløst i 10% acetonitril i vann, justert til pH 2,8 med trifluoreddikksyre og tilført til en 250/10 "LiChrospher RP-18e" (5 um) kolonne. Eluering ble utført anvendende 0,05% vandig trifluoreddikksyre i gradientmodus fra 11 til 22% acetonitril. Konsentrasjon under redusert trykk og frysetørking gir 2,7 mg pluraflavin E-trifluoracetatsalt.

Eksempel 11

Identifikasjon av pluraflavin E.

Utseende: en dyp-gul substans som var oppløselig i polare organiske løsemidler, men kun sparsomt oppløselig i vann. Syreaddisjonssaltene er vannoppløselige. Forbindelsen var stabil i nøytral til middels surt medium, men ustabil i det alkaliske og sterkt sure området. UV-maksimumer: 213,244,270 (Sh), 290 (Sh), 426 nm i vann/acetonitril (8:2), pH 2 og 213,244, 270 (Sh), 290 (Sh) og 426 nm i vann/acetonitril (6:4), pH 7. Den følgende molekylvekten ble funnet ved massespektroskopi for (M+H)<+>: 712 Da, tilsvarende den empiriske formelen C36H41NO14 for pluraflavin E.

NMR-signaler: se tabell 3.

Eksempel 12

(a) Eksaminasjon av cytostatisk aktivitet.

For å bestemme den cytostatiske aktiviteten ble rottehepatomceller anvendt som ble oppnådd fra en stamme samling American Type Culture Collection under nummeret ATCC CRL-1548, Jo No. 223 og 228. Stammen ble holdt i "MEM (EAGLE) med Glutamax" medium [GLBCO BRL nr. 4109-029] med 10% futal kalveserum [GIBCO BRL nr. 10270-106] og 10 ul av penicillin-streptomycin [GIBCO BRL nr. 15140-114]/ml. 96-brønn midrotiterplater [Greiner nr. 15140-114] ble anvendt. Hver brønn ble innledningsvis fylt med 140 ul dyrkningsnæringsløsning og i hvert tilfelle inokulert med 215.000 celler. Platene ble deretter inkubert ved 37°C og 5% C02 i 20-24 timer. En fortynningsserie av pluraflaviner med konsentrasjoner på 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125; 1,5625; 0,7813; 0,3906; 0,195; 0,094; 0,047 og 0 uM, som var blitt fremstilt på forhånd, deretter til pipettert i den korresponderende rekkefølgen. Etter en ytterligere inkuberingstid på 22 timer ved 37°C i en atmosfære med 5% C02, ble det flytende mediumet dratt ut. Cellene som var tilbake ble farget med 100 ul RPMI1640 [GIBCO BRL nr. 32404-014]/brønn og 20 ul Cell Titer 96 Aqueous [PROMEGA nr. G5430]/brønn. Lys absorbsjon ved 590 nm ble målt direkte etter tilsetning og etter 2 timers inkubasjon som over. Den cytostatiske effekten ble beregnet utfra endringen i lysabsorbsjon.

IC50 for pluraflavin A = < 50 nM;

IC50 for pluraflavin B = < 50 nM.

(b) Antiproliferasjonsvirkning av pluraflavin A og flavopiridol på utvalgte tumorcellelinjer.

MTT, et vannoppløselig tetrazoliumsalt, omdannes til et uoppløselig lilla formazan når oppløst ved spaltning av tetiazoliurnringer ved dehydrogenaseensymer i aktive mitokondria. Døde celler forsaker ikke denne endring. Metoden ble anvendt for kvantitativt å bestemme proliferasjonen for å bestemme aktiviteten til protensielle kjemoterapeutiske forbindelser.

Alle celler ble opprettholdt i RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburd, MD) inneholdende 10% varmeinnaktivert Fetal Bovine Serum, penicillin/streptomycin og supplert med L-glutamin. Celler ble belagt på 96-brønn vev dyrkningsplater ved de følgende densiteter:

Bryst 2500 celler/brønn

Prostata 2500 celler/brønn

Tarm 1000 celler/brønn

Lunge 1000 celler/brønn

Cellene fikk lov til å feste seg natten igjennom ved 37°C, 5% CO2. Pluraflavin A ble fortynnet i dyrkningsmedium med en sluttkonsentrasjon av forbindelse som følger: 50,0; 16,67; 5,56; 1,85; 0,617; 0,206; 0,069; 0,023 uM.

Flavopiridol ble fortynnet med: 2,0; 0,667; 0,222; 0,074; 0,025; 0,0008; 0,003; 0,001 uM. Begge forbindelser ble testet tre ganger ved alle konsentrasjoner. Cellene ble vasket med ferkst medium og forbindelsene tilsatt til cellene i et sluttvolum på 100 pl. Cellene pluss forbindelse fikk lov å inkubere ved 37°C, 5% CO2 i ca. 72 timer. Ved det ønskede tidspunktet ble 25 ul MTT (10 mg/ml i HBSS) tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert ved 37°C i 2-4 timer. MTT og medium ble fjernet, og 200 ul DMSO ble tilsatt per brønn. Avlesning fant sted ved 570 nm. Resultatene er angitt under:

I en myk agaranalyse ble pluraflavin A og flavopiridol testet mot leukemiceller. IC50-resultatene var: 60 nM (pluraflavin) og 0,5; 0,6 uM (flavopiridol).

Claims (27)

1. Forbindelse av formel I hvori Ri er en sukkergruppe; R2 er -COOH eller -CH2-0-(R7)m, hvori R7 er en sukkergruppe, og R3 er valgt fra epoksidomfattende grupper, Ci-Cs-alkylgrupper og Cj-Ce-alkenylgrupper hvori nevnte alkyl- og alkenylgrupper eventuelt er substituert med minst en OH-gruppe, R5 er valgt blant et hydrogenatom, Ci-Ce-alkylgrupper, Cj-Ce-alkenylgrupper og C2-C6-alkynylgrupper; R», R«, Rg og Rio er hver uavhengig valgt blant hydrogenatomer, Ci-Ce-alkylgrupper, C2-C6-alkenylgrupper, C2-C6-alkynylgrupper, -X2H-grupper hvor H er direkte bundet til det første atomet til X2> og -X2R]2-grupper hvor R12 er direkte bundet til det første atomet til X2, og eventuelt er R4 og Rs sammen en dobbeltbundet -X2-gruppe, og eventuelt er Rg og Rio sammen en dobbeltbundet -X2-gruppe, hvor hver X2 er uavhengig valgt blant oksygenatomer, -NH-grupper, -N-Ci-Ce-alkylgrupper, -N-C2-C6-alkenylgrupper, -N-C2-C6-alkynylgrupper og svovelatomer, hvor hver Ri2 er uavhengig valgt blant Ci-Ce-alkylgrupper, C2-C6-alkenylgrupper, C2-Ce-alkynylgrupper, arylgrupper og acylgrupper; og m og n er hver uavhengig valgt blant 1 og 2; i alle dets stereokjemiske former og blandingen av disse former i et hvilket som helst forhold, og dets fysiologisk akseptable salter og derivater.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R7 er et aminosukker.

3. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at R7 har formelen

4. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at ner 2.

5. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at Ri er et aminosukker.

6. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at Ri har formelen

7. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6, karakterisert ved at R3 er valgt blant gruppene

8. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den har formelen i alle dens stereokjemiske former og blandinger av disse former i et hvilket som helst forhold, og dets fysiologiske akseptable salter og derivater.

9. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den har formel IB i alle dens stereokjemiske former og blandinger av disse former i hvilke som helst forhold, og dens fysiologiske akseptable salter og derivater.

10. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den har formel IE i alle dens stereokjemiske former og blandinger av disse i et hvilket som helst forhold og dens fysiologiske akseptable salter og derivater.

11. Forbindelse av formel I ifølge et hvilket som helst av kravene 1-10, oppnådd ved dyrkning av Actinomycetales type HAG 003959, DSM 12931, eller en av dens varianter eller mutanter under egnede betingelser i et dyrkningsmedium inntil minst en forbindelse av formel I er tilstede i dyrkningsmediumet, etterfulgt av isolasjon av forbindelsen.

12. Forbindelse ifølge krav 11, karakterisert ved at nevnte isolerte forbindelse videre omdannes til minst en forbindelse valgt blant derivater og fysiologiske akseptable salter.

13. Preparat omfattende minst en forbindelse av formel I ifølge et hvilket som helst av kravene 1-12, eller et fysiologisk akseptabelt salt eller derivat derav, og en akseptabel vehikkel.

14. Preparat ifølge krav 13, karakterisert ved at nevnte akseptable vehikkel er en farmasøytisk akseptabel vehikkel.

15. Fremgangsmåte for fremstilling av minst en forbindelse av formel I, eller fysiologisk akseptabelt salt derav, som angitt i et hvilket som helst av kravene 1-10, som omfatter dyrkning av mikroorganismen Actinomycetales type HAG 003959, DSM 12931, eller en av dets varianter eller mutanter under egnede betingelser i dyrkningsmedium inntil minst en forbindelse av formel I er tilstede i dyrkningsmediumet, etterfulgt av isolasjon av forbindelsen.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at nevnte isolerte forbindelse videre omdannes til minst en forbindelse valgt blant derivater og fysiologisk akseptable salter.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 15 eller 16, karakterisert ved at dyrkningen utføres under aerobiske betingelser ved en temperatur mellom 18 og 35°C og en pH mellom 6 og 8.

18. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 15-17, karakterisert ved at forbindelsen av formel I omdannes i et derivat anvendende et reduksjonsmiddel.

19. Forbindelse av formel I ifølge et hvilket som helst av kravene 1-12, eller et fysiologisk akseptabelt salt eller derivat derav, for anvendelse ved inhiberingen av transkripsjonen av minst en dobbeltbundet nukleinsyre.

20. Anvendelse av en forbindelse av formel I ifølge et hvilket som helst av kravene 1-12, eller et fysiologisk akseptabelt salt eller derivat derav, for fremstilling av et cytostatika.

21. Anvendelse av en forbindelse av formel I ifølge et hvilket som helst av kravene 1-12, eller et fysiologisk akseptabelt salt eller derivat derav, for fremstilling av et medikament for behandling av tarmtumorer.

22. Anvendelse av en forbindelse av formel I ifølge et hvilket som helst av kravene 1-12, eller et fysiologisk akseptabelt salt eller derivat derav, for fremstilling av et medikament for behandling av mamma-(bryst) tumorer.

23. Anvendelse av en forbindelse av formel I ifølge et hvilket som helst av kravene 1-12, eller et fysiologisk akseptabelt salt eller derivat derav, for fremstilling av et medikament for behandling av lungetumorer.

24. Anvendelse av en forbindelse av formel I ifølge et hvilket som helst av kravene 1-12, eller et fysiologisk akseptabelt salt eller derivat derav, for fremstilling av et medikament for behandling av prostatatumorer.

25. Anvendelse av en forbindelse av formel I ifølge et hvilket som helst av kravene 1-12, eller et fysiologisk akseptabelt salt eller derivat derav, for fremstilling av et medikament for behandling av leukemi.

26. Anvendelse av en forbindelse av formel I ifølge et hvilket som helst av kravene 1-12, eller et fysiologisk akseptabelt salt eller derivat derav, for fremstilling av et medikament for behandling av mikrobielle infeksjoner.

27. Actinomycetales type HAG 003959 (DSM 12931).