CZ303810B6

CZ303810B6 - Pluraflaviny a jejich deriváty, zpusob jejich prípravy a jejich pouzití

Info

Publication number: CZ303810B6
Application number: CZ20022826A
Authority: CZ
Inventors: Vertesy@Laszlo; Ehrlich@Klaus; Knauf@Martin; Wink@Joachim; P. Barbone@Francis; A. Powers@Elaine; A. Cashman@Elizabeth
Original assignee: Sanofi - Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2000-02-18
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2013-05-15
Also published as: EE05137B1; AU4240401A; BR0108128A; NO20023845L; HRP20020672A2; DE60101313T2; CA2400237C; IL151216A; HK1052709A1; PL204842B1; MEP28608A; RS49991B; US6500936B2; HRP20020672B1; HUP0204393A3; JP4801307B2; YU57602A; ZA200206795B; DK1259523T3; CN1404484A

Abstract

Deriváty pluraflavinu obecného vzorce I, ve kterém R.sub.1 .n.je zbytek cukru, kde cukrem je monosacharid nebo disacharid, R.sub.2 .n.je skupina -COOH nebo skupina -CH.sub.2.n.-O-(R.sub.7.n.).sub.m.n., R.sub.3 .n.je vybraný ze skupiny zahrnující skupiny obsahující epoxidový zbytek, alkylové skupiny, alkenylové skupiny, kde tyto alkylové skupiny a alkenylové skupiny jsou prípadne substituovány alespon jednou hydroxylovou skupinou a jejich fyziologicky pouzitelné soli. Slouceniny se mohou pripravit fermentací kultury mikroorganismu Actinomycetales druhu HAG 003959, DSM 12931. Popisují se farmaceutické prostredky s obsahem derivátu a pouzití derivátu pro prípravu cytostatik pro lécení nádoru tlustého streva, nádoru prostaty, nádoru plicních a prsních, pro lécení leukémie a mikrobiálních infekcí.

Description

Vertesy Laszlo, Eppstein-Vockenhausen, DE Ehrlich Klaus, Riisselsheim, DE Knauf Martin, Frankfurt, DE Wink Joachim, Rodermark, DE Barbone Francis P., Annandale, NJ, US Powers Elaine A., High Bridge, NJ, US Cashman Elizabeth A., Bridgewater, NJ, US (74) Zástupce:

Ing. Jan Kubát, Přístavní 24, Praha 7, 17000 (54) Název vynálezu:

Pluraflaviny a jejich deriváty, způsob jejich přípravy a jejich použití (57) Anotace:

Deriváty pluraflavinu obecného vzorce I, ve kterém Rje zbytek cukru, kde cukrem je monosacharid nebo disacharid, R₂je skupina -COOH nebo skupina -CH^O-IR,)^ R₃je vybraný ze skupiny zahrnující skupiny obsahující epoxidový zbytek, alkylové skupiny, alkenylové skupiny, kde tyto alkylové skupiny a alkenylové skupiny jsou případně substituovány alespoňjednou hydroxylovou skupinou ajejich fyziologicky použitelné soli. Sloučeniny se mohou připravit fermentací kultury mikroorganismu Actinomycetales druhu HAG 003959, DSM 12931. Popisují se farmaceutické prostředky s obsahem derivátů a použití derivátů pro přípravu cytostatik pro léčení nádorů tlustého střeva, nádorů prostaty, nádorů plicnfch a prsních, pro léčení leukémie a mikrobiálních infekcí.

Pluraflaviny a jejich deriváty, způsob jejich přípravy a jejich použití

Oblast techniky 5

Vynález se týká nových sloučenin obecného vzorce I

ve kterém R_b R₂, R₃, R4, R5, Ró, Rs, Rio a n mají význam uvedený níže. Sloučeniny obecného vzorce I inhibují transkriptázu, mají cytotoxické účinky a jsou zejména vhodné pro léčení nádorů.

Sloučeniny obecného vzorce I se mohou získat růstem Actinomycetales druhů HAG 003959, DSM 12931, v živném médiu. Vynález se tedy také týká způsobu přípravy sloučenin obecného vzorce I, použití sloučenin pro přípravu farmaceutických prostředků pro léčení maligních poruch a onemocnění, které se mohou léčit inhibici transkriptázy a farmaceutických prostředků, které obsahují alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I.

Dosavadní stav techniky

Rakovina je onemocnění lidí a zvířat, které je v převážné části smrtelné a které je obecně způso20 bene nekontrolovatelným růstem endogenních buněk. Rakovina je výraz používaný pro tvorbu maligních nádorů (zhoubné nádory), novotvarů (nádory nebo zhoubné nádory) nebo pro zhoubnou degeneraci a dysmaturitu bílých krevních buněk (leukemie). Rakovinné nebo nádorové buňky se obecně tvoří transformací endogenních buněk. Zhoubnost nádorových buněk se sama vyjadřuje v autonomním růstu, to je v jejich schopnosti nevázaného růstu a bez integrace do sys25 tému orgánů a infiltraci spolu s destrukcí tkání. Jistý znak zhoubného nádoru je tvorba metastází daleko od nádoru po hematogenním nebo lymfogenním rozšíření nádorových buněk. Rakovina je jedna z nejčastějších příčin úmrtí u lidí a proto je stále velká poptávka pro metody a látky pro léčení nebo ošetřování zhoubných nádorových degenerací.

Kromě radikálního chirurgického přístupu odstraněním nádoru, jsou dalšími možnostmi pro léčení zhoubných nádorů radioterapie použitím X-paprsků, alpha-, beta-, gamma-záření, imunoterapie a chemoterapie. Až dosud je použití imunoterapie omezené. Pod pojmem chemoterapie se rozumí podávání buněčných toxinů (cytostatik) pro léčení nádorů a zbylých nádorových buněk, obvykle po lokálním chirurgickém zákroku nebo ozařování. Tyto látky intervenují specificky s určitými procesy buněčného dělení tak, že tkáně, které mají vysoký poměr dělících se buněk, jako jsou rychleji rostoucí nádorové tkáně, reagují citlivěji. Takovými látkami jsou alkylační sloučeniny, jako jsou, například, cyklofosfamid (The Merck Index, 12^th Ed. strana 463), antimetabolity, jako je methotrexát (The Merck Index, 12^th Ed. strana 1025), alkaloidy, jako je vinkristin (The Merck Index, 12^th Ed. strana 1704) a antibiotika, jako je daunomycin (The Merck Index,

12^th Ed. strana 479), a adriamycin (The Merck Index, 12^th Ed. strany 581 až 582). Avšak vzhledem k tomu, že tyto látky mají značné vedlejší účinky a všechny mají nevýhodu v tom, že úmrtí nemocných je možno v mnoho případech pouze oddálit a není možné mu preventivně bránit. Dále, degenerované (rakovinné) buňky se stávají rezistentními na používané látky; a v tomto případě běžné farmaceutické prostředky nemají dále cytostatický účinek, ale jsou toxické a mají vedlejší účinky. Navíc bylo nalezeno, že kombinované a/nebo postupné používání cytostatik pře-1 CZ 303810 B6 vyšuje aktivity jednotlivých cytostatických látek (monoterapie), aje proto možné, že značné vedlejší účinky při polychemoterapii nejsou aditivní. Z těchto všech důvodů jsou nová chemoterapeutika naléhavě potřeba a proto se celosvětově stále hledají.

S překvapením bylo nalezeno, že kmen mikroorganismu Actinomycetales druh HAG 003959, DSM 12931, je schopný produkovat vysoce účinné cytostatikum, které inhibuje buněčný růst i ve velmi nízkých koncentracích. Dále zde a níže jsou nové sloučeniny uváděny jako pluraflaviny a tvoří spolu s deriváty pluraflavinu část podstaty vynálezu. Pluraflaviny jsou antibiotika, která obsahují p-chinoidní kruhový skelet a různé cukerné stavební bloky. Inhibují transkripci vložeío ním dvouvláknových řetězců nukleových kyselin a připadnou další alkylací. Kruhový skelet byl poprvé popsán v práci S. Kondo aj. in Journal of Antibiotics, vol. 30, strany 1143 až 1145, 1977, jako součást pluramycinu. Později byl tento cyklický skelet nalezen v řadě antibiotik; navíc k pluramycinu a neopluramycinu, byly ve sloučeninách saptomycinech (N. Abe aj. J. Antibiotics, 46, 1536 až 1549, 1993), ankinomycinu (Y. Sáto aj. J. Antibiotics 42, 149, 1989), kidamycinu (N. Kanda aj. J. Antibiotics, 24, 599, 1971), hedamycinu (U. Sequin aj. Tetrahedron, 34, 761,

1978) a altromycinech (G. M. Brill aj. J. Antibiotics, 43, 229 až 237, 1990) nalezeny strukturně příbuzné látky. V předešlém stavu techniky jsou tyto sloučeniny uváděny jako nevýhodné pro jejich nedostatečný účinek, vysokou toxicitu a/nebo pro jejich nežádoucí vedlejší účinky.

Podstata vynálezu

Vynález se týká sloučenin obecného vzorce I

ve kterém

Ri je zbytek cukru, kde cukrem je monosacharid nebo disacharid, ve kterém jsou dvě monosacharidové jednotky spojeny glykosidickou vazbou, přičemž monosacharid je případně di- nebo tri-substituován nezávisle na sobě atomem vodíku, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou, sku30 pinami NH(alkyl), N(alkyl)₂, alkylovou skupinou a alkoxylovou skupinou, kde atom vodíku a/nebo hydroxyiová skupina monosacharidu mohou být případně nahrazeny substituenty, kde alkylem je alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku a alkoxy lem je alkoxy lová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku,

R₂ je skupina -COOH nebo skupina -CH₂-O-(R7)_In, ve které R? je zbytek cukru, přičemž cukrem je monosacharid nebo disacharid, ve kterém jsou dvě monosacharidové jednotky spojeny glykosidickou vazbou, přičemž monosacharid je případně di- nebo tri-substituován nezávisle na sobě atomem vodíku, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou, skupinami NH(alkyl), N(alkyl)₂, alkylovou skupinou a alkoxylovou skupinou, kde atom vodíku a/nebo hydroxyiová skupina monosacharidu mohou být případně nahrazeny substituenty, kde alkylem je alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku a alkoxylem je alkoxylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku,

R₃ je substituent vybraný ze skupiny, jež zahrnuje skupiny obsahující epoxidový zbytek, kterými jsou nerozvětvené nebo rozvětvené alkylové nebo alkenylové skupiny s 2 až 12 atomy uhlíku, jako je s 2 až 6 atomy uhlíku, které obsahují jeden nebo dva oxiranové kruhy, a skupina dále

-2CZ 303810 B6 zahrnuje alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, alkenylové skupiny s 2 až 6 atomy uhlíku, kde tyto alkylové skupiny a alkenylové skupiny jsou popřípadě substituovány alespoň jednou hydroxylovou skupinou,

R₅ je substituent vybraný ze skupiny zahrnující atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkenylovou skupinu s 2 až 6 atomy uhlíku a alkynylovou skupinu s 2 až 6 atomy uhlíku,

R4, Ré, R₈ a R10, jsou substituenty nezávisle na sobě vybrané ze skupiny zahrnující atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkenylovou skupinu s 2 až 6 atomy uhlíku, alkyny10 lovou skupinu s 2 až 6 atomy uhlíku, skupinu -X2H, kde atom vodíku je přímo vázán na první atom z X₂, a skupiny -X2R12, kde substituent R12 je přímo vázán na první atom z X₂ a případně R4 a Ré dohromady tvoří dvojnou vazbou vázaný substituent -X₂, případně Rg a R10 dohromady tvoří dvojnou vazbou vázaný substituent -X₂, kde každý ze substituentů X₂ je nezávisle na sobě vybraný ze skupiny zahrnující atom kyslíku, skupiny NH, skupiny N-alkyl s 1 až 6 atomy uhlíku, skupiny N-alkenyl s 2 až 6 atomy uhlíku, skupiny N-alkynyl s 2 až 6 atomy uhlíku nebo atomy síry, a kde R_]2 jsou nezávisle na sobě vybrané ze skupiny zahrnující alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, alkenylové skupiny s 2 až 6 atomy uhlíku, alkynylové skupiny s 2 až 6 atomy uhlíku, arylové skupiny, kterou je fenylová skupina, benzylová skupina nebo 1- nebo 2-naftylová skupina případně substituované atomem halogenu, alkylovou skupinou s 1 až 4 ato20 my uhlíku, alkoxylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku a/nebo trifluormethylovou skupinou nebo acylové skupiny zvolené z alifatické C1-C7 acylové skupiny nebo aromatické acylové skupiny, která je vybrána z benzoy lové skupiny nebo naftoylové skupiny, které jsou případně substituovány atomem halogenu, alkylem s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou, ethylaminoskupinou nebo C1-C7 alkoxylovou skupinou a m a n, jsou na sobě nezávisle 1 nebo 2, ve všech jejich stereoisomemích formách a ve směsích těchto forem v libovolných poměrech ajejich fyziologicky použitelných solí.

Ve sloučeninách obecného vzorce Ije alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku nerozvětvená nebo rozvětvená alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku, například methylová skupina, ethylová skupina, isopropylová skupina, terc-buty35 lová skupina a hexylová skupina, alkenylová skupina s 12 až 6 atomy uhlíku je nerozvětvená nebo rozvětvená alkenylová skupina s 2 až 6 atomy například allylová skupina, krotylová skupina a pentenylová skupina, a alkynylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku je nerozvětvená nebo rozvětvená alkynylová skupina s 2 až 6 atomy uhlíku, například, propynylová skupina, butynylová skupina a pentynylová skupina.

Arylová skupina je skupina s aromatickým kruhovým systémem, například fenylová skupina, benzylová skupina nebo 1- nebo 2-naftylová skupina. Arylová skupina může být případně sub45 stituována, například atomem halogenu, jako je atom chloru, atom bromu, atom fluoru, alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, například methylovou skupinou, hydroxylovou skupinou, alkoxylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku a/nebo trifluormethylovou skupinou.

Acylová skupina může být alifatická nebo aromatická acylová skupina. Alifatická acylová sku50 pina má 1 až 7 atomů uhlíku, například 1 až 4 atomy uhlíku, jako je formylová skupina, acetylová skupina, propionylová skupina, butyrylová skupina, hexanoylová skupina, akryloylová skupina, krotonylová skupina, propioloylová skupina, které mohou být dále substituovány, například, atomem halogenu, jako je atom chloru, atom bromu, atom fluoru, aminoskupinou a/nebo alkylaminoskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, jako je methylaminoskupina nebo ethylaminoskupina.

Aromatická acylová skupina může být například benzoylová skupina nebo naftoylová skupina,

-3CZ 303810 B6 které mohou být dále substituovány, například atomem halogenu, jako atomem chloru, atomem bromu, atomem fluoru, alkylem s 1 až 4 atomy uhlíku, například methylem, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou, jako je například ethylaminoskupina nebo alkoxylovou skupinou s 1 až 7 atomy uhlíku, jako s 1 až 4 atomy uhlíku, například methoxyskupinou.

Sacharidem (Ri / R?) je monosacharid (n=l) nebo disacharid (n=2), ve kterém dvě monosacharidové jednotky jsou spojeny glykosidickou vazbou. Monosacharidem může být hexosa (C^H^C^), například aldohexosa, jako je D-(+)-glukóza, D-(+)-mannosa nebo D-(+)-galaktóza. Monosacharidy mohou být mono-, di- nebo tri-substituované, nezávisle na sobě atomem vodíku, io hydroxylovou skupinou, aminoskupinou, skupinami NH(alkyl), N(alkyl)₂, alkylovou skupinou a alkoxylovou skupinou, kde atom vodíku a/nebo hydroxylová skupina monosacharidu může být případně nahrazeny substituenty. Pod výrazem „sacharid“, jak je zde použit, se také rozumí aminosacharidy. Aminosacharid je monosacharid nebo disacharid, který je případně substituovaný jakje popsáno výše, ve kterém alespoň jedna hydroxylová skupina nebo jeden atom vodíku jsou nahrazeny aminoskupinou, jako je NH₂, NH(alkyl) nebo N(alkyl)₂.

V jednom konkrétném případě m = 1,

R₇ může být aminosacharid obecného vzorce II

ve kterém

Rn, R14, Ri6, Říš, R20, R22, R24, R26 a R₂s, jsou na sobě nezávisle vybrané ze skupiny zahrnující atom vodíku, hydroxylovou skupinu, aminoskupinu, skupiny NH(alkyl), N(alkyl)₂ a alkoxylovou skupinu, kde alkylové skupiny a alkoxylové skupiny mají od 1 do 4 atomů uhlíku.

Příklady alkylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku jsou, například, methylová skupina, ethylová skupina, propy lová skupina, isobutylová skupina a butylová skupina, zejména methylová skupina a příklady alkoxylových skupin s 1 až 4 atomy uhlíku jsou, například, methoxylová skupina, ethoxylová skupina, isopropoxylová skupina nebo butoxylová skupina zejména methoxylová skupina.

R₇ může být aminosacharid vzorce IIA:

(HA)

R! může také být aminosacharid.

V jednom konkrétním případě n = 2.

R] může být skupina obecného vzorce III

-4CZ 303810 B6 (III)

ve kterém

R.30 až R^o, jsou na sobě nezávisle atomy vodíku, hydroxylové skupiny, aminoskupiny, skupiny NHalkyl, N(alkyl)₂, nebo alkoxylové skupiny, kde alkylové skupiny obsahují 1 až 4 atomy uhlíku, jako je methylová skupina, ethylová skupina, propylová skupina, isobutylová skupina a butylová skupina, zejména methylová skupina, a O-alkyl je alkoxylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku, například, methoxylová skupina, ethoxylová skupina, isopropoxylová skupina nebo butoxylová skupina, zejména methoxylová skupina.

Ri v jednom konkrétním případě má vzorec IIIA

R₃ může být skupinou obsahující epoxid. Skupina obsahující epoxid může být nerozvětvená nebo rozvětvená alkenylová skupina s 2 až 12 atomy uhlíku, jako je s 2 až 6 atomy uhlíku, která obsahuje jeden až dva epoxidové kruhy (oxirany). Možnými příklady jsou:

-5CZ 303810 B6

Jiná než epoxidovou skupinu obsahující skupina R₃ může být nerozvětvená nebo rozvětvená alkylová skupina s 1 až 12 atomy uhlíku, jako je alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlí5 ku, například, methylová skupina, ethylová skupina, isopropylová skupina, terc-butylová skupina, hexylová skupina, a také, například, oktylová skupina, dodecylová skupina, nebo nerozvětvená nebo rozvětvená alkenylová skupina s 2 až 12 atomy uhlíku, jako je s 2 až 6 atomy uhlíku, například, allylová skupina, krotylová skupina, pentenylová skupiny, a také dodecenylová skupina, kde alkylové skupiny a alkenylové skupiny mohou být také monosubstituovány nebo poly10 substituovány, například hydroxylovou skupinou.

Vynález se podle toho týká pluraflavinu A vzorce IA

Hexosa I

Hexosa II

i

-6CZ 303810 B6 pluraflavinu B vzorce IB

a pluraflavinu E vzorce IE

ve kterých hexosa I je 2,6-dideoxyaldohexosa;

hexosa lije 2,3,6-trideoxy-3-dimethylaminohexosa a hexosa III je 2,3,6-trideoxy-3-amino-3-methylaldo-hexosa, ve všech jejich stereochemických formách a ve směsích těchto forem v jakémkoli poměru ajejich fyziologicky použitelných solí.

V jedné konkrétní formě jsou sloučeniny vybrané z vzorců IA, IB, ve kterých hexosa lje oliosa, hexosa lije rhodosamin a hexosa III je 3-epi-vankosamin.

-7CZ 303810 B6

Podle tohoto vynálezu jsou sloučeniny vzorce I připravitelné kultivací, například fermentací

Actinomycetales druhů HAG 003959, DSM 12931, nebo variant nebo mutantů, za vhodných podmínek v živném médiu až jsou v živném médiu přítomny pluraflaviny vzorců IA, IB a/nebo

IE. Pluraflaviny se pak z živného média mohou isolovat, popřípadě se převedou na deriváty a/nebo fyziologicky použitelné sole.

Vynález se dále týká způsobu přípravy sloučenin vzorce I, který se vyznačuje tím, že se kultivují, například fermentací, mikroorganismy Actinomycetales druhy HAG 003959, DSM 12931, nebo io jejich varianty nebo mutanty za vhodných podmínek v živném médiu, až je přítomen alespoň jeden z pluraflavinů vzorce IA, IB a/nebo IE, z živného média se izoluje alespoň jeden z pluraflavinů a popřípadě se převede na deriváty a/nebo fyziologicky použitelné sole.

Kmen HAG 003959, DSM 12931, jeho mutanty a/nebo varianty se podle jednoho konkrétního 15 provedení kultivují v živném roztoku (také uváděným jako živné médium), který obsahuje alespoň jeden ze zdrojů atomů uhlíku a alespoň jeden ze zdrojů atomů dusíku a případně anorganické sole, až je v živném médiu přítomen alespoň jeden z nových pluraflavinů; pluraflaviny se pak mohou izolovat z živného média a případně rozdělit na jednotlivé individuální složky.

Kultivace se může provádět za aerobních podmínek. Kultivace se provádí při teplotách v rozmezí od 18 do 35 °C a při pH v rozmezí od 6 do 8.

V literatuře je popsána řada reakcí pro chemickou derivatizaci chinonů. Podle toho, se derivatizace těchto sloučenin může provádět použitím chemických reakcí, které jsou známé. Redukce chinonových sloučenin na hydrochinony se může například provádět katalyticky vodíkem, nebo hydridy kovů, jako jsou hydridy hliníku nebo hydridy boru.

Dalším vhodným příkladem je konverze chinonů s hydroxylaminem nebo sjeho deriváty na oximy, které se mohou dále chemicky zpracovávat

Dále se tedy popisují sloučeniny vzorce IV:

ve kterém R_b R₂, R₃ a n mají význam definovaný výše v jakékoli jejich stereochemické formě a směsi těchto forem v jakémkoli poměru a jejich fyziologicky použitelné soli nebo jejich deriváty.

Deriváty pluraflavinů vzorců IVA, IVB a IVE (viz níže) jsou deriváty pluraflavinů vzorců IA, IB a IE a také tvoří část tohoto vynálezu.

-8CZ 303810 B6

Vynález se dále týká sloučeniny vzorce IVA

sloučeniny vzorce IVB

-9CZ 303810 B6 a sloučeniny vzorce IVE

(IVE) ve všech jejich stereochemických formách a směsích těchto forem v jakémkoli poměru a fyziologicky použitelných solí nebo jejich derivátů.

Vynález je dále popsán podrobněji, například, v alespoň jednom konkrétním provedení.

Pluraflaviny podle tohoto vynálezu jsou produkovány druhy Actinomycetales, v jednom konkrétním provedení kmenem Actinomycetales druhem HAG 003959, DSM 12931. The Actinomycetaío les druh HAG 003959, DSM 12931, má béžové červené mycelium a může být identifikován konidiofory, kteréjsou typické pro actinomycetes.

Taxonomické studium microorganísmu Actinomycetales spec HAG 003959, DSM 12931, poskytlo následující výsledky determinace kmenu: diagnostiky důležitá analýza mastných kyselin plynovou chromatografií poskytla hlavní poměry:

Anteíso 15:0 mastná kyselina,

Iso 16:0 mastná kyselina (isopalmitová kyselina),

Iso 17:0 mastná kyselina (isomargarová kyselina),

Anteiso 17:0 mastná kyselina (anteisomargarová kyselina) a cis[9] 18:1 mastná kyselina (olejová 20 kyselina), a navíc nízké koncentrace jiných mastných kyselin.

Tento profil složení mastných kyselin umožňuje klasifikovat, že Actinomycetales HAG 13

003959 (DSM 12931) patří taxonomicky do rodu Saccharothrix.

Isolát mikroorganismu byl uložen do Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und

Zelikulturem GmbH, Mascheroder Weg IB, D 38124 Braunschweig, Germany, podle pravidel

Budapešťské Konvence z 16. července 1999 pod číslem: Actinomycetales species HAG 003959,

DSM 12931.

Místo kmenu Actinomycetales druhu HAG 003959, DSM 12931, je také možné použít jeho mutanty a varianty, které syntetizují alespoň jednu ze sloučenin pluraflavinů podle tohoto vynálezu. Tyto mutanty se mohou připravit běžně známými způsoby, například ozařováním, to je ultrafialovými paprsky nebo rentgenovým zářením nebo chemickými mutageny, jako například, ethyl methansulfonátem (EMS), 2-hydroxy-4-methoxybenzofenonem (MOB) nebo N-methyl35 N'-nitro-N-nitrosoguanidinem (MNNG).

Postup podle vynálezu se může provádět fermentaci v laboratorním měřítku (v mililitrovém až litrovém rozsahu) nebo v průmyslovém měřítku) v měřítku krychlového metru). Pokud není uve-10CZ 303810 B6 děno jinak, veškerá procenta jsou uváděna na podkladě hmotnostních. V případě kapalin, jsou poměry míšení uváděny na podkladě objemovém, pokud není uvedeno jinak.

Podle jednoho konkrétního provedení se jako zdroje atomů uhlíku pro aerobní fermentací použí5 vají asimilovatelné sacharidy a cukerné alkoholy, jako jsou glukóza, laktóza, sacharóza nebo Dmannitol, a uhlovodíky obsahující přírodní produkty, jako je například sladový extrakt. Vhodnými zdroji atomů dusíku jsou: aminokyseliny, peptidy a proteiny a jejich degradační produkty, jako jsou peptony nebo tryptony, dále extrakty z masa, extrakty z kvasnic, rozemletá semena, například, kukuřice, pšenice, fazolí, sóji nebo bavlny, destilační zbytky z výroby alkoholů mas10 ných pokrmů, extrakty kvasnic, ale také amonné sole a dusičnany. Anorganickými solemi obsaženými v živném roztoku mohou být například, chloridy, uhličitany, sulfáty nebo fosfáty alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, železa, zinku, kobaltu a manganu.

Tvorba pluraflavinů podle tohoto vynálezu se provádí v živném médiu, které obsahuje asi 0,1 až

5 %, jako 0,3 až 2 %, glukózy a 0,2 až 5 %, jako 0,5 až 3 %, sojové mouky a 0,05 až 2 %, jako

0,2 to 1,0 g/1 smáčené kukuřice a 0,05 až 1,0 g/1, jako 0,1 až 0,5 %, uhličitanu vápenatého a 0,05 až 1,0 g/1, jako 0,1 až 1,0 g/1, chloridu sodného. Procenta jsou v každém případě vztažena na hmotnost celého živného média.

V živném médiu Actinomycetales druh HAG 003959, DSM 12931, produkuje směs pluraflavinů. V závislosti na složení živného média, proporce alespoň jednoho z pluraflavinů podle vynálezu se může měnit. Dále složením média je možné kontrolovat syntézu individuálních pluraflavinů tak, že jeden nebo více z pluraflavinů není produkován mikroorganismy vůbec, nebo v množství, kteréje pod detekčním limitem.

Podle jednoho konkrétního provedení, živné médium obsahuje pouze jeden detekovatelný pluraflavin. V dalším konkrétním provedení vznikají pluraflaviny A, B nebo E.

Navíc k pluraflavinům A, B a E (sloučeniny vzorců (IA), (IB) a (IE), respektive), mohou v živ30 ném médiu Actinomycetales species HAG 003959, DSM 12931, také vznikat jiné příbuzné sloučeniny, které se liší od sloučenin reprezentovaných vzorci IA, IB a IE tím, že jsou odlišně glykosylovány. Tak, jako vedlejší produkt může vznikat další pluraflavin (pluraflavin C) s molekulární hmotností 974 Da a byl také detekován degradační produkt pluraflavinů A, molekulární hmotnosti 692,77, C37H44N2O11. V posledně uvedené sloučenině není přítomna hexosa I; za kyselých podmínek se 2,6-dideoxyaldohexosa může hydrolyticky odštěpovat z pluraflavinů A.

Mikroorganismus se kultivuje aerobně, to je, například submerzně za třepání nebo míchání v třepacích baňkách nebo fermentorech, popřípadě za zavádění vzduchu nebo kyslíku. Kultivace se může provádět při teplotách v rozmezí od přibližně 18 do 35 °C, jako přibližně od 25 do

32 °C, včetně od 27 do 30 °C. Hodnota pH je obecně v rozmezí od 6 do 8, jako od 6,5 do 7,5. Za těchto podmínek se mikroorganismus obecně kultivuje po dobu v rozmezí od 24 do 300 hodin, jako od 36 do 140 hodin.

Kultivace se s výhodou provádí v několika stupních, to je připraví se alespoň jedna předkultura v kapalném živném médiu, která se pak očkuje do aktuálního produkčního média, přičemž objemový poměr předkultury k hlavní kultuře se pohybuje například 1 : 10. Předkultura se získá, například, naočkováním mycelia do živného roztoku, a nechá se růst přibližně 36 až 120 hodin, jako 48 až 96 hodin. Mycelium se může získat, například, ponecháním kmenu růst asi 3 až 40 dnů, jako 4 až 10 dnů, na pevném nebo kapalném živném médiu, například na sladovém-kvasni50 covém agaru nebo agaru s ovesnou moukou.

Průběh fermentace se může monitorovat měřením pH kultur nebo objemem mycelia a také chromatografickými metodami, jako je například chromatografie na tenké vrstvě nebo vysokotlaká kapalinová chromatografie nebo biologickými testy. Pluraflaviny podle vynálezu se mohou najít

- 11 CZ 303810 B6 jak v myceliu, tak ve filtrátu kultury. Izolační postup popsaný níže, slouží obecně pro čištění pluraflavinů A, B a E.

Izolace a/nebo čištění pluraflavinů podle vynálezu z živného média se může provádět známými metodami při kterých se berou v úvahu chemické, fyzikální a biologické vlastnosti přírodních produktů. Pro testování koncentrace pluraflavinů v živném médiu nebo při jednotlivých izolačních stupních je možné použít chromatografii na tenké vrstvě, například použitím směsi chloroform/methanol/ledová kyselina octová/voda (například v poměru 8:1:1:0,2) jako mobilní fáze nebo HPLC. Při dělení chromatografií na tenké vrstvě se detekce provádí například použitím barvicích reakčních činidel, jako je α-naftol/kyselina sírová, při kterém se množství látky vhodně srovnává s kalibračním roztokem.

Podle vynálezu se pluraflaviny mohou izolovat buď z mycelia, nebo kultivačního média. Obecně se mycelium nejprve oddělí od kultivačního média běžně známými metodami a pluraflaviny se pak extrahují z buněčného materiálu použitím případně s vodou mísitelného organického rozpouštědla. Fáze organického rozpouštědla obsahující pluraflaviny podle vynálezu se případě zahustí za sníženého tlaku a čistí se způsobem popsaným níže.

Popřípadě se kultivační filtrát spojí s koncentrátem z extraktu mycelia a extrahuje se vhodným s vodou nemísitelným rozpouštědlem, například, n-butanolem. Organická fáze se pak oddělí a případně zahustí za sníženého tlaku. Pro odstranění tuků se koncentrát zředí nepolárním rozpouštědlem, ve kterém jsou pluraflaviny podle vynálezu pouze málo rozpustné, jako například, hexanem, petroletherem, diethyletherem. To způsobí vysrážení pluraflavinů a lipofilní nečistoty zůstanou rozpuštěné a odstraní se běžnou separací pevné a kapalné fáze. Sraženina, která obsahuje veškeré pluraflaviny se rozpustí ve směsi 1/30 původního objemu vody a methanolu. Sraženina se úplně rozpustí a lyofilizuje. Lyofilizát se pak dále uvádí jako surový produkt obsahující 0,5 až 50 % pluraflavinů a použije se pro další izolace.

Další čištění jednoho nebo více pluraflavinů podle vynálezu se provádí chromatografií na vhod30 ném materiálu, jako jsou molekulární síta, na normálních fázových nosičích, jako je, například, silikagel, kysličník hlinitý na iontoměničích nebo na adsorpčních pryskyřicích a/nebo na médiích s obrácenými fázemi (RP). Pomocí těchto chromatografií se pluraflaviny rozdělí. Chromatografie pluraflavinů se provádí použitím pufrovaných vodných roztoků nebo směsí vodných a organických roztoků.

Jako směsi vodných nebo organických roztoků se rozumí všechny s vodou mísitelná organická rozpouštědla, jako je methanol, propanol a acetonitril, v koncentracích od 10 do 80 % rozpouštědla, například od 40 do 60 % rozpouštědla, nebo jiné úplně pufrované vodné roztoky, které jsou mísitelné s organickými rozpouštědly. Pufry se mohou používat stejně jaké byly uvedeny výše.

Separace pluraflavinů, která se zakládá na jejich různé polaritě, se může provádět chromatografií na obrácených fázích, například na MCI® (adsorpční pryskyřici od Mitsubishi, Japan) nebo Amberlit XAD® (TOSOHAAS), nebo jiných hydrofobních materiálech, jako jsou, například, RP-8 nebo RP-18 fáze. Navíc se separace může provádět chromatografií na normálních fázích, například na silikagelu nebo kysličníku hlinitém a podobně.

Chromatografie pluraflavinů se může provádět za použití pufrovaných nebo okyselených vodných roztoků nebo vodných roztoků s alkoholy nebo jinými s vodou mísitelnými alkoholy nebo jinými s vodou mísitelnými organickými rozpouštědly. Jako organická rozpouštědla se mohou použít propanol a acetonitril.

Jako pufrované nebo okyselené vodné roztoky se rozumí například voda, fosfátový pufr, octan amonný, citrátový pufr v koncentracích od 1 mM do 0,5 m, a také kyselina mravenčí, kyselina octová, kyselina trifluoroctová nebo všechny komerční kyseliny známé odborníkům v oboru, například v koncentracích od 0,01 do 3 %, jako od 0,1 %.

- 12CZ 303810 B6

Chromatografíe se může provádět použitím gradientu vycházeje ze 100 % vodného pufru a konče 100 % rozpouštědla, například lineárním gradientem pohybujícím se od 10 do 50 % při použití 2-propanolu nebo acetonitrilu.

Alternativně je také možné provádět gelovou chromatografii nebo chromatografii na hydrofilních fázích.

Gelová chromatografíe se může provádět na polyakrylamidu nebo smíšených polymemích ío gelech, jako je, například, Biogel-P 2® (Biorad), Fractogel TSK HW 40® (Merck, Germany nebo

Toso Haas, USA) nebo Sephadex® (Pharmacia, Uppsala, Sweden).

Pořadí chromatografií uvedených výše může být obrácené.

Další vysoce efektivní čisticí stupeň pro pluraflaviny je krystalizace. Pluraflaviny krystalizují z roztoků v organických rozpouštědlech a ze směsí vody s organickými rozpouštědly. Krystalizace se může provádět známým způsobem, jako například zahuštěním nebo ochlazením nasycených roztoků pluraflavinu.

Pluraflaviny podle vynálezu jsou stabilní v pevném stavu a v roztocích, které mají pH v rozmezí od 3 do 8, například, pH 4 až 6 a mohou proto být obsaženy v běžných farmaceutických prostředcích.

Pluraflaviny vzorce I od nich odvozené deriváty se metodami známými odborníkům v oboru mohou převést na odpovídající fyziologicky použitelné sole.

Jako fyziologicky použitelné sole sloučenin vzorce I se rozumí jak organické, tak anorganické sole, jaké jsou popsány v Remington's Pharmaceutical Sciences (17^th vydání, str. 1418 (1985)). Na podkladě fyzikální a chemické stability jsou sodné, draselné, vápenaté a amonné sole možný30 mi součástmi kyselých skupin; sole s kyselinou chlorovodíkovou, kyselinou sírovou, kyselinou fosforečnou nebo s karboxylovými kyselinami nebo sulfonovými kyselinami, jako jsou například kyselina octová, kyselina citrónová, kyselina benzoová, kyselina maleinová, kyselina fumarová, kyselina vinná a kyselina p-toluensulfonová, jsou možnými součástmi bazických skupin.

Vynález dále zahrnuje chemické ekvivalenty, zde označované také jako „deriváty“, sloučenin vzorce I, které mají stejnou nebo v podstatě stejnou aktivitu nebo které se mohou převést na sloučeniny podle vynálezu. Takovými ekvivalenty jsou, například, estery a ethery, komplexy a také produkty redukce sloučenin podle vynálezu.

Estery a etherické deriváty a produkty redukce se mohou připravit postupy popsanými v literatuře, například v „Advanced Organic Synthesis“, 4. vydání, J. March, John Wiley & Sons, 1992. Karboxylová skupina (vzorce IE, IVE) a hydroxylové skupiny sloučenin vzorce I se mohou převést na ester, jako je alkylester s 1 až 4 atomy uhlíku nebo na etherickou skupinu. Tyto ethery zahrnují, například acetaly a ketaly hydroxylových skupin.

Stabilní komplexy sloučenin vzorce I se mohou vytvořit s fyziologicky použitelnými anorganickými kationty, jako jsou kationty vápníku nebo hořčíku.

Vynález také zahrnuje veškeré stereoisomemí formy sloučenin vzorce I. Centra asymetrie slou50 cenin vzorců IA, IB a IE jsou na sobě nezávislá a mohou mít S-konfiguraci nebo R-konfiguraci. Oxirany skupin obsahujících epoxid mohou být v kterékoli poloze, například, oxirany, které zahrnují atomy uhlíku 2' a 3'. Vynález také zahrnuje veškeré možné enantiomery a diastereomery a také směsi alespoň dvou stereoisomemích forem, například směsi enantiomerů a/nebo diastereomerů, v jakémkoli poměru. Vynález tedy poskytuje enantiomery v enantiomemě čisté formě, jak ve formě levotočivých tak pravotočivých antipodů, R a S konfigurací, ve formě racemátů a ve

- 13CZ 303810 B6 formě směsí dvou enantiomerů v libovolném poměru. Jestliže je ve sloučenině možná cis/trans isomerie, vynález také zahrnuje jak cis formu, tak trans formu a směsi těchto forem v libovolném poměru.

Vzhledem k užitečným farmakologickým vlastnostem jsou sloučeniny podle vynálezu vhodné pro použití jako léčiv v lidské a nebo veterinární medicíně. Mají antibiotický účinek a navíc antibakteriální účinek, antimykotický účinek, to je inhibiční účinek na plísně, včetně íytopatogenních plísní, a mají antiprotozoální a antiparasitické vlastnosti.

Sloučeniny podle vynálezu se mohou použít na rakovinová onemocnění, například jako chemoterapeutika. Vzhledem k jejich význačným cytostatickým účinkům a antimikrobiálnímu účinku se mohou použít, například, jako cytostatika pro maligní deformace u živočichů a lidí.

V případě nádorových buněk, které mají vyvinutou rezistenci na konvenční látky, pouze nové prostředky mají terapeuticky adekvátní efekt. Tak, pluraflaviny podle vynálezu ajejich deriváty vzorce I mají potenciálně vynikající aktivitu proti těmto problémovým typům buněk.

Vynález se také týká farmaceutických prostředků, které obsahují alespoň jednu sloučeninu z pluraflavinů podle vynálezu a/nebo jejich derivátů podle vynálezu. Pluraflaviny se mohou pou20 žít ve směsi s alespoň jedním vhodným nosičem nebo inertní látkou. Jako inertní látky se mohou použít pro lidi použitelné přísady a/nebo inertní látky.

Vynález se také týká způsobu přípravy farmaceutických prostředků podle vynálezu, který se vyznačuje tím, že alespoň jedna sloučenina podle vynálezu převede na vhodnou aplikační formu použitím vhodné a fyziologicky přijatelné inertní přísady, popřípadě spolu s další aktivní látkou, přísadou nebo inertní látkou.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se obecně podávají orálně, typicky nebo parenterálně, je však také možná rektální aplikace. Vhodnými pevnými nebo kapalnými formami farmaceutic30 kých prostředků jsou, například, granule, prášky, tablety, povlečené tablety, mikrokapsle, čípky sirupy, emulze, suspenze aerosoly, kapky nebo injikovatelné roztoky ve formě ampulí a preparáty, které mají protrahované uvolňování aktivní sloučeniny a ve kterých se při jejich přípravě používají inertní látky a přísady a/nebo pomocné látky, jako jsou desintegrační látky, pojidla, látky pro povlékání, nadouvadla, klouzadla nebo mazadla, chuťové přísady, sladidla nebo solubili35 zátoiy.

Často používanými inertními látkami nebo pomocnými látkami, které je možno uvést jsou, například, uhličitan hořečnatý, kysličník titaničitý, laktóza, mannitol a jiné sacharidy, talek, laktoprotein, želatina, škrob, vitaminy, celulóza a její deriváty, živočišné nebo rostlinné oleje, poly40 ethylenglykol a rozpouštědla, jako je například sterilní voda, alkoholy, glycerol a polyhydroxylované alkoholy.

Popřípadě jednotková dávková forma může být mikroenkapsulovaná pro orální aplikace, aby se oddálilo nebo prodloužilo uvolňování účinné látky po delší dobu, jako například přípravou povle45 cením nebo vložením částeček aktivní sloučeniny do vhodných polymerů, vosků a podobně.

Farmaceutické prostředky se mohou připravovat a aplikovat v jednotkových dávkových formách, které obsahují jako aktivní látku alespoň jednu sloučeninu z pluraflavinů podle vynálezu a/nebo jejich deriváty. V případě pevné jednotkové dávkové formy, jako jsou tablety, kapsle a čípky, tato dávka může být až do přibližně 200 mg, ale může být asi 0,1 až 100 mg, a v případě roztoků pro injekce vampulích tato dávka může být až do přibližně 200 mg, ale může být asi 0,1 až 100 mg za den.

Denní dávka se aplikuje v závislosti na tělesné hmotnosti, věku, pohlaví a stavu savčího subjektu.

Mohou se však také použít dávky vyšší nebo nižší. Denní dávka se může podávat v jedné dávce

- 14CZ 303810 B6 nebo v několika menších jednotkových dávkách nebo ve vhodných dobách v předem stanovených intervalech nebo ve formě rozdělených dávek.

Vynálezje blíže objasněn následujícími příklady. Uvedená procenta jsou procenty hmotnostními. V případě kapalin, mísící poměry jsou na podkladě objemovém, pokud není uvedeno jinak. Následující příklady jsou pouze ilustrativní a vynález žádným způsobem neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava glycerolové kultury Actinomycetales druhu HAG 003959, DSM 12931.

100 ml živného roztoku (extrakt sladu 2,0 %, extrakt kvasnic 0,2 %, glukóza 1,0 %, (NH₄)₂HPO₄0,05 %, pH 6,0) ve sterilní 300 ml Erlenmeyerově baňce se naočkuje kmenem Actinomycetales druhu HAG 003959, DSM 12931, a inkubuje se v rotační třepačce při 28 °C a při 180 ot/min po dobu 7 dnů. 1,5 ml této kultury se pak zředí 1,5 ml 99% glycerolu a skladuje se při -20 °C.

Příklad 2

Příprava kultury nebo předkultury Actinomycetales druhu HAG 003959, DSM 12931 v Erlenmeyerově baňce

Sterilní 300 ml Erlenmeyer baňka obsahující 100 ml následujícího živného roztoku: 15 g glukózy, 15 g sojové mouky, 5 g kukuřičného výluhu, 2 g CaCO₃ a 5 g NaCl na litr se naočkuje kulturou pěstovanou na šikmém médiu ve zkumavce za použití stejného živného roztoku, (ale s 2 % agaru) nebo 1 ml glycerolové kultury (viz příklad 1) a inkubuje se na třepačce s 180 ot./min při 30 °C. Maximální produkce alespoň jedné sloučeniny z pluraflavinu podle vynálezu se dosáhne po 120 hodinách. Pro naočkování 10 a 200 1 fermentorů stačí 48 až 96 hodinová submerzní kultura (množství očka 10 %) při použití stejného živného roztoku.

Příklad 3

Příprava pluraflavinu

Fermentor (9 1) pracuje za následujících podmínek:

Živné médium:

Operační doba: Teplota inkubace Rychlost míchání: Provzdušňování:

g glukózy/1;

g sojové mouky/1;

g kukuřičných výluhů pevných/1; 2 g CaCO₃/l;

5gNaCl/l;

pH 7,0 (před sterilizací) hodin 28 °C.

300 ot./min.

1/min”¹

Opakovaným přidáváním ethanolického roztoku polyolů je možné případně potlačit tvorbu pěny. Maximální produkce se dosáhne po asi 70 až 96 hodinách.

-15CZ 303810 B6

Příklad 4

Izolace směsi pluraflavinů z živného roztoku kultury Actinomycetaes druhu HAG 003959, 5 DSM 12931.

Po skončení fermentace Actinomycetales druhu HAG 003959, DSM 12931, se živná půda z fermentoru, připravená podle příkladu 3 (90 1) přefiltruje za přidání 2 % pomocného filtračního prostředku, například Celitu® a buněčný materiál (0,6 litru) se extrahuje 3 litry methanolu. Aktivío ní sloučenina obsahující methanolický roztok se od mycelia oddělí filtrací a zahustí za sníženého tlaku. Koncentrát spolu s filtrátem z kultury (7 litrů) se nanese na připravenou 0,4 litrovou ®MCI

GEL, CHP20P kolonu. Eluce se provádí použitím a gradientu 0,1% kyseliny octové ve vodě až 0,1% kyseliny octové v 2-propanolu. Průtok kolonou je (1,2 litru za hodinu) a jímají se frakce po (0,25 1) a frakce obsahující pluraflavin se spojí (20 až 23). Zahuštěním za sníženého tlaku a mra15 zovou sublimací se získá 1,4 g hnědého prášku.

Příklad 5

Obohacení pluraflavinových složek gelovou chromatografií.

1,4 g produktu připraveného podle příkladu 4 se nanese na kolonu s kapacitou 3,9 litrů (šířka x výška - 10 cm x 50 cm), naplněnou Fractogel® TSK HW-40 s. Mobilní fáze voda/acetonitril (1:1) se pumpuje kolonou rychlostí 50 ml za minutu a jímají se frakce (65 ml). Pluraflaviny se hlavně eluují ve frakcích 13 až 16. Spojí se, rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a získá se 130 mg směsi pluraflavinů.

Příklad 6

Separace pluraflavinových složek na obrácených fázích RP-18.

Preparativní HPLC kolona s kapacitou 122 ml (1,25 cm, vnitřní průměr, x 25 cm, výška) se naplní ®Nucleosil 100-7 Cl8 HD, a nanese se na ní 130 mg směsi pluraflavinů získaných, podle příkladu 5. Eluce se provádí použitím 10% acetonitrilu a 0,lM vodného roztoku octanu amonného. Průtok kolonou je 50 ml/min. a jímají se 50 ml frakce. Frakce 6 obsahovala pluraflavin E, pluraflavin C byl ve frakcích 12 až 17, pluraflavin B byl ve frakcích 25 až 27 a pluraflavin A byl ve frakcích 35 až 37. Po zahuštění za sníženého tlaku a mrazové sublimaci byla získána následující množství:

pluraflavin A: 22 mg, ESI+MS: 823 Da (M+H)⁺, pluraflavin B: 18 mg, ESI+MS: 841 Da (M+H)⁺, pluraflavin C: 11 mg, ESI+MS: 974 Da (M+H)⁺, pluraflavin D: 5 mg, ESI+MS: 712 Da (M+H)⁺.

Příklad 7

Konečné čištění pluraflavinů A a převedení na sůl s kyselinou trifluoroctovou

Frakce 35 až 37, připravené podle příkladu 6, se po mrazové sublimaci (22 mg), rozpustí v 10% acetonitrilu ve vodě. Kyselinou trifluoroctovou se upraví pH na 2,8 a nanese na kolonu 250/10 LiChrospher RP-18e (5 pm)®. Eluce se provádí použití 0,05% vodné kyseliny trifluoroctové v 11 až 22% acetonitrilu. Zahuštěním za sníženého tlaku a mrazovou sublimací se získá 18 mg pluraflavinu A ve formě soli s kyselinou trifluoroctovou.

-16CZ 303810 B6

Příklad 8

Identifikace pluraflavinu A.

Vzhled: sytě žlutá látka, která je rozpustná v polárních organických rozpouštědlech, ale málo rozpustná ve vodě. Adiční sůl s kyselinou je rozpustná ve vodě. Sloučenina je stabilní v neutrálním a mírně kyselém prostředí, ale nestabilní v alkalickém prostředí a silně kyselém prostředí.

UV-Maxima: 214, 243, 270 (inflex), 290 (inflex), 426 nm ve směsi voda/acetonitril (8:2), pH 2 a io 214, 243, 270 (inflex), 290 (inflex) a 426 nm ve směsi voda/acetonitril (6:4), pH 7. IČ pásy:

3424, 1680, 1600, 1464, 1427, 1300, 1203, 1131, 1066, 1009, 801, 721 cm'¹. Hmotovou spektrometrií s vysokým rozlišením byla nalezena následující molekulární hmotnost (M+H): 823,370631 Da, odpovídající empirickému vzorci pro pluraflavin A C43H54N2O14. Elektron-sprejová ionizace (ESI, positivní) poskytla, použitím MS/MS fragmentace, následující ionty: 823, 693, 680, 550,

480,390,320, 144 a 131 Da.

NMR signály: viz Tabulka 1.

Tabulka 1 *H a ¹³C chemické posuny pluraflavinu A v methanolu-d₄ a DMSO-dó při 300 °K.

	Methanol-dí	DMSO-de
poloha	¹³c	^XH	¹³c	^XH
	δ (ppm)	δ (ppm)	δ(ppm)	δ (ppm)
2	168,39	-	165,62	-
3	111,95	6,37 s	110,39	6,27 s

- 17CZ 303810 B6

	Methanol-cU	DMSO-dg
poloha	¹³c		¹³C	¹H
	δ (ppm)	δ (ppm)	δ (ppm)	δ (ppm)
4	180,25	-	177,56
5	150,44	-	148,22	-
6	121,34	8,61 s	119,05	8,43 s
6a	138,34	-	136,28	-
7	182,68		181,12	-
7a	133,23	-	131,18	-
8	120,05	7,86 d	118,29	7,78 d
9	135,63	7,90 d	134,41	7,87 d
10	137,35	-	135,79	-
11	161,06	-	159,39	-
11-OH	-	-	-	13,38 s, š.
11a	118,14	-	116,43	-
12	189,12		187,39	-
12a	122,00	-	120,35	-
12b	157,66	-	155,50	-
13	70, 83	5,38 d, 5,63 d	68,48	5,30 d,5,51 d
14	61,17		59, 35	-
15	63, 69	3,41 q	61, 61	3,48 q
16	20,24	1,92 s	19, 32	1,86 s
17	13, 69	1,27 d	12,93	1,22 d
1'	98, 90	5,04 dd	96,57	5,06 d,š
2'	37,24	2,05, 2,12	35,50	1,87, 1,95
3'	58, 32	-	56, 33	-
3'Me	24, 57	1,50 s		1,35 s
3 'NH₂	-	-	-	8,16 s, š
4'	71,15	3,27 s, š	68,65	3,17 d
4'-OH	-	-	-	5,47 d
5'	70, 44	4,00 q	68,19	4,01 q
6'	17,21	1,34 d	16,75	1,18 d

-18CZ 303810 B6

	Methanol-dí	DMSO-de
poloha	¹³C δ(ppm)	^XH δ (ppm)	¹³C δ (ppm)	δ (ppm)
2	28,00 š	2,48 m, 2,91 m, š		2,35 š, 2,78 š
3	65,19	3,45 m, š	62,19	3,43 š

3NMe	43,24 š, 41,65 š	3,05 š,3,05 š	42,14, 39,25	2,89, 2,97
3NH⁺	-	-	-	8,78 š
	75, 13	4,32 s, š	71,88	4,20 s, š
5	72,55	3,97 q, š	70,22	3,75 q, š
6	18,09	1,40 d	17,54	l,28d
1'	101,39	5,24 m, š	98, 89	5,11 š
2'	33,40	2,05, 2,10	32, 07	1,75, 1,92
f 3 r	66,61	4,12 m	64,17	3,96 m, š
3'-OH	-	-	-	4,70 s, š
4/	71,98	3, 67	70,13	3,45 š
4'-OH	-	-	-	4,44 s, š
5'	69,52	4,16 q. š	67,05	4,10 q, š
6'	17,51	1,28 d	16,94	1, lOd

Pro aldohexózy jsou pozorované účinky NOE v souladu s relativní SRSS nebo RSRR stereochemií na chirálních centrech T, 3', 4', 5' (viz Η—III). To odpovídá C-3 epimeru vankosaminu.

Relativní stereochemie

H-III Relativní stereochemie hexózy III

-19CZ 303810 B6

NOE účinky pozorované pro hexózu II upřednostňují relativní stereochemii RSSS nebo SRRR pro chirální centra 1,3,4,5 (viz H-II).

Relativní stereochemie

HII Relativní stereochemie hexózy II

Stejná relativní stereochemie (RSSS, SRRR) pro asymetrické atomy uhlíku 1', 3', 4', 5' je v souladu s detekovaným NOE pro hexózu I (viz H-I).

Relativní stereochemie

H-I Relativní stereochemie hexózy I

Příklad 9

Identifikace pluraflavinů B 15

Vzhled:

Temně žlutá pevná látka, která je rozpustná v polárních organických rozpouštědlech, ale pouze málo rozpustná ve vodě. Adiční sůl s kyselinou je ve vodě rozpustná. Sloučenina je stabilní v neutrálním prostředí a slabě kyselém prostředí, aleje nestabilní v alkalickém rozmezí pH.

UV maxima: 214, 243, 270 (inflex), 290 (inflex), 426 nm ve směsi voda/acetonitril (8:2), pH 2 a 214, 243, 270 (inflex), 290 (inflex) a 426 nm ve směsi voda/acetonitril (6:4), pH 7.

Pluraflavin B má empirický vzorec C43H56N2O15, molekulární hmotnost 840,9 Da.

NMR signály: viz tabulka 2.

-20CZ 303810 B6

Tabulka 2 ’Η a ¹³C chemické posuny pluraflavinu B v methanolu-d₄ a srovnání s pluraflavinem A při teplotě 300 °K.

	pluraflavin ϊ	5 (methanol-dj	pluraflavin A	(methanol-d₄)
poloha	¹³C δ (ppm)	^XH δ (ppm)	13_C δ (ppm)	^XH δ (ppm)
2	176,38	-	168,39	-
3	111,10	6,73 s	111,95	6,37 s
4	181,26	-	180,25	-
4a	125,96	-	126,08	-
5	150,43	-	150,44	-
6	121,03	8, 52 s	121,34	8,61 s
6a	138,12	-	138,34	-

-21 CZ 303810 B6

	pluraflavin B (methanol-dU)	pluraflavin A (methanol-d<
poloha	¹³C δ (ppm)	^XH 5(ppm)	¹³C δ (ppm)	^XH δ (ppm)
7a	133,16	-	133,23	-
8	120,04	7,81 d	120,05	7,86 d
9	135,52	7,83 d	135,63	7,90 d
10	137,44	-	137,35	-
11	161,02	-	161,06	-
11-OH	-	-	-	-
11a	118,01	-	118,14	-
12	189,24	-	189,12	-
12a	121,89	-	122,00	-
12b	157,41	-	157,66	-
13	70, 83	5,36d, 5,60d	70,83	5,38d, 5, 63d
14	77, 67	-	61,17	-
15	72, 61	4,40 q	63, 69	3,41 q
16	23, 90	1,67 s	20,24	1,92
17	17,00	1,35 d	13,69	1,27 d
1'	98, 87	5,05 dd	98,90	5,04 dd
2'	37,20	2,09 m	37,24	2,05, 2,12
3'	58,39		58,32	-
3'Me	24, 45	1,51 s	24,57	1,50 s
3'NH₂	-	-	-	-
4'	71,08	3,29 s, š	71,15	3,27 s, š
4'OH	-	-	-	-
5'	70,42	4,01 q	70,44	4,00 q
6'	17,19	1,33 d	17,21	1,34 d
1	70,13	5,48 t	70,23	5,51 t
2	27,74	2,50 m, 2,88 m	28,00 š	1,48 m, 2,91 m, š
3	65,14	3, 46 m	65,19	3,45 m, š

-22CZ 303810 B6

	pluraflavin Σ	ϊ (methanol-dj	pluraflavin A	(methanol-dí
poloha	¹³C	^XH	¹³C	^XH
	δ (ppm)	δ(ppm)	δ (ppm)	δ (ppm)
3NH⁺	-	-	-
4	75, 02	4,32 s, š	75,13	4,32 s, š
5	72,61	3,97 q, š	72,55	3,97 q š
6	18,15	1,39 d	18, 09	1,40
l^f	101,38	5,24 m, š	101,39	5,24 m, š
2^{zz r}	33, 42	2,07	33,40	2,05, 2,10
3'	66,59	4,13 m	66, 61	4,12 m
3'-OH	-	-	-	-
4 r	71, 97	3,67 š	71,98	3, 67
4'-OH	-	-	-	-
5'	69,52	4,16 q, š	69, 52	4,16 q, š
6'	17,49	1,27 d	17,51	1,28 d

Příklad 10

Konečné čištění pluraflavinu E.

Frakce 6, získaná podle příkladu 6 se po mrazové sublimaci (5 mg) rozpustí v 10% acetonitrilu ve vodě a kyselinou trifluoroctovou se upraví pH na 2,8, načež se naleje na 250/10 LiChrospher RP-18e (5 pm)® kolonu. Eluce se provádí použitím 0,05% vodné kyseliny trifluoroctové v gradientu od 11 do 22% acetonitrilu. Zahuštěním za sníženého tlaku a mrazovou sublimací se získá 2,7mg soli pluraflavinu E s trifluoroctovou kyselinou.

Příklad 11

Identifikace pluraflavinu E.

Vzhled: temně žlutá látka, která je rozpustná v polárních organických rozpouštědlech a pouze obtížně ve vodě. Adiční sůl s kyselinou je rozpustná ve vodě. Sloučenina je stabilní v neutrálním a slabě kyselém prostředí, ale nestálá v alkalickém prostředí a silně kyselém prostředí.

UV-maxima: 213, 244, 270 (inflex), 290 (inflex), 426 nm ve směsi voda/acetonitril (8:2), pH 2, a 213, 244, 270 (inflex), 290 (inflex) a 426 nm ve směsi voda/acetonitril (6:4), pH 7.

Hmotnostní spektrometrií byla nalezena molekulární hmotnost pro (M+H): 712 Da, odpovídající empirickému vzorci C36H41NO14 pro pluraflavin E.

NMR signály jsou uvedeny v tabulce 3.

-23CZ 303810 B6

Tabulka 3 ^]H a ¹³C chemické posuny pluraflavinů E v methanolu-cb a DMSO-dé při 300 °K.

poloha	ⁱ³C δ (ppm)	^λΗ δ (ppm)
2	176,48	-
3	110,30	6,69 s
4	178,39	-
4a	124,69	-
5	149,56	-
6	121,17	7,92 s
6a	138,95	-
7	182,40	-
7a	133,21	-
8	119,82	7,60 d
9	135,61	7,74 d

-24CZ 303810 B6

poloha	¹³C δ (ppm)	^XH δ (ppm)
10	137,04	-
11	161,33	-
11-OH	-	-
11a	118,04	-
12	189,21	-
12a	121,59	-
12b	156,86	-
13	175,28	-
14	77, 69	-
15	72, 61	4,35 q
16	23,78	1,62 s
17	17,09	1,31 d
1	70,34	5,46 dd
2	27,35	2,86 m, 2,44 nt
3	64,88	3, 50 m
3NMe	42,5 š	3, 08
3NH⁺	-	-
4	75, 22	4,30 s, š
5	72,29	3,87 q, š
6	18,25	1,35 d
1'	101,40	5,23 m
2 t	33,43	2,08 m, 2,06 m
3'	66, 61	4,12 ml'
3'-OH	-	-
4'	72,03	3,67 s, š
4'-OH	-	-
5'	69,50	4,17 q, š
6'	17,52	1,28 d

Příklad 12 (a) Studium cytostatické aktivity

Pro stanovení cytostatické aktivity se použijí buňky hepatomu krys získané z kmene ze sbírky American Type Culture Collection pod číslem ATCC CRL-1548, Jo No. 223 a 228. Kmen byl udržován na médiu „MEM (EAGLE) sGlutamax“ [GIBCO BRL No.4109-02] s 10% telecím

-25CZ 303810 B6 plodovým sérem [GIBCO BRL No. 10270-106] a 10 μί směsi penicilinu a streptomycinu [GIBCO BRL No. 15140-114]/ml. Byly použity 96-jamkové mikrotitrační desky [Greiner, No.

15140-114], Každá jamka byla nejprve naplněna 140 μί roztoku živného média a v každém případě se naočkuje 215 000 buňkami. Desky se pak inkubují při 37 °C a v atmosféře 5% CO₂ po dobu 20 až 24 hodin. Předem se připraví série ředění pluraflavinů s koncentracemi 100, 50, 25,

12,5, 6,25, 3,125, 1,5625, 0,7813, 0,3906, 0,195, 0,094, 0,047 a 0 μΜ, a pipetují se v odpovídajícím pořadí. Po další inkubaci 22 hodin při 37 °C v atmosféře 5% CO₂, se kapalné médium odsaje. Zbylé buňky se obarví 100 μί RPMI 1640 [GIBCO BRL No. 32404-014]/ na jamku a 20 μί Cell Titer 96 Aqueous [PROMEGA No. G5430]/na jamku. Přímo po přidání se měří ío absorpce světla při 590 nm a pak 2 hodiny po inkubaci, jak bylo uvedeno výše. Cytostatický účinek byl vypočten ze změny ve světelné absorpci.

IC₅o pro pluraflavin A = <50 nM;

IC₅o pro pluraflavin B = <50 nM.

(b) Antiproliferační účinky pluraflavinu A a flavopiridolu na vybrané nádorové buněčné linie.

MTT, ve vodě rozpustná tetrazoliová sůl, se převede na nerozpustný purpulový formazan při rozpuštění štěpením tetrazoliového kruhu enzymy dehydrogenáz v aktivních mitochondriích. Mrtvé buňky tuto změnu nezpůsobí. Tato metoda se používá pro kvantitativní proliferaci, aby se stanovila aktivita potenciálních chemoterapeutických sloučenin.

Veškeré buňky se udržují v RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) obsahující 10 % teplem deaktivovaného plodového hovězího séra penicilin/streptomycin a obohaceného L-gluta25 minem. Buňky se nanesou do 96-jamkových desek pro tkáňové kultury s následujícími hustotami:

prsa prostata tlusté střevo plíce

2500 buněk/jamka 2600 buněk/jamka 1000 buněk/jamka 1000 buněk/jamka

Buňky se nechají ulpět přes noc při 37 °C, 5% CO₂. Pluraflavin A se zředí v živném médiu na následující konečné koncentrace sloučeniny: 50,0, 16,67, 5,56, 1,85, 0,617, 0,206, 0,069,

0,023 μΜ. Flavopiridol se zředí na koncentrace: 2,0, 0,222, 0,074, 0,025, 0,008, 0,003,

0,001 μΜ. Obě sloučeniny se testují ve třech opakováních ve všech koncentracích. Buňky se promyjí čerstvým médiem a sloučeniny se přidají k buňkám na konečný objem 100 μί. Buňky plus sloučeniny se nechají inkubovat při 37 °C, 5% CO₂ přibližně po dobu 72 hodin. V určenou dobu se přidá do každé jamky 25 μί MTT (10 mg/ml v HBSS). Desky se inkubují při 37 °C po dobu 2 až 4 hodin. MTT a média se odstraní a přidá se 200 μί DMSO na jamku. Data se snímají při 570 nm a výsledkyjsou uvedeny níže:

Buňky prsa prostata tlusté střevo plíce

Pluraflavin A IC50 <23 nM 10 nM 0,35 nM 3,0 nM

Flavopiridol IC50 nM 80 nM 30 nM 90 nM

V testu na měkkém agaru pluraflavinu A a flavopiridol byly testovány na buňky leukemie.

Hodnoty IC₅₀: byly: 60 nM (pluraflavin A) a 0,5, 0,6 μΜ (flavopiridol).

-26CZ 303810 B6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Derivát pluraflavinu obecného vzorce I &

O (I) ve kterém

Ri je zbytek cukru, kde cukrem je monosacharid nebo disacharid, ve kterém jsou dvě monoio sacharidové jednotky spojeny glykosidickou vazbou, přičemž monosacharid je případně di- nebo tri-substituován nezávisle na sobě atomem vodíku, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou, skupinami NH(alkyl), N(alkyl)₂, alkylovou skupinou a alkoxylovou skupinou, kde atom vodíku a/nebo hydroxylová skupina monosacharidu mohou být případně nahrazeny substituenty, kde alkylem je alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku a alkoxylem je alkoxylová skupina s 1 až 6

15 atomy uhlíku,

R₂ je skupina -COOH nebo skupina -CH₂-O-(R7)_m, ve které R₇ je zbytek cukru, přičemž cukrem je monosacharid nebo disacharid, ve kterém jsou dvě monosacharidové jednotky spojeny glykosidickou vazbou, přičemž monosacharid je případně di- nebo tri-substituován nezávisle na

20 sobě atomem vodíku, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou, skupinami NH(alkyl), N(alkyl)₂, alkylovou skupinou a alkoxylovou skupinou, kde atom vodíku a/nebo hydroxylová skupina monosacharidu mohou být případně nahrazeny substituenty, kde alkylem je alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku a alkoxylem je alkoxylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku,

25 R₃ je substítuent vybraný ze skupiny, jež zahrnuje skupiny obsahující epoxidový zbytek, kterými jsou nerozvětvené nebo rozvětvené alkylové nebo alkenylové skupiny s 2 až 12 atomy uhlíku, jako je s 2 až 6 atomy uhlíku, které obsahují jeden nebo dva oxiranové kruhy, a skupina dále zahrnuje alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, alkenylové skupiny s 2 až 6 atomy uhlíku, kde tyto alkylové skupiny a alkenylové skupiny jsou popřípadě substituovány alespoň jednou

30 hydroxylovou skupinou,

Rs je substítuent vybraný ze skupiny zahrnující atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkenylovou skupinu s 2 až 6 atomy uhlíku a alkynylovou skupinu s 2 až 6 atomy uhlíku,

35 Ri, Ró, Rs a Rio, jsou substituenty nezávisle na sobě vybrané ze skupiny zahrnující atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkenylovou skupinu s 2 až 6 atomy uhlíku, alkynylovou skupinu s 2 až 6 atomy uhlíku, skupinu -X₂H, kde atom vodíku je přímo vázán na první atom z X₂, a skupiny -X₂Ri₂, kde substítuent R₎₂ je přímo vázán na první atom z X₂ a případně R4 a Rs dohromady tvoří dvojnou vazbou vázaný substítuent -X₂, případně Rs a R10 dohromady tvoří

40 dvojnou vazbou vázaný substítuent -X₂, kde každý ze substituentů X₂ je nezávisle na sobě vybraný ze skupiny zahrnující atom kyslíku, skupiny NH, skupiny N-alkyl s 1 až 6 atomy uhlíku, skupiny N-alkenyl s 2 až 6 atomy uhlíku, skupiny N-alkynyl s 2 až 6 atomy uhlíku nebo atomy síry, a kde R₁₂ jsou nezávisle na sobě vybrané ze skupiny zahrnující alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, alkenylové skupiny s 2 až 6 atomy uhlíku, alkynylové skupiny s 2 až 6 atomy uhlí45 ku, arylové skupiny, kterou je fenylová skupina, benzylová skupina nebo 1- nebo 2-naftylová

-27CZ 303810 B6 skupina případně substituované atomem halogenu, alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku a/nebo trifluormethylovou skupinou nebo acylové skupiny zvolené z alifatické C1-C7 acylové skupiny nebo aromatické acylové skupiny, která je vybrána z benzoylové skupiny nebo naftoylové skupiny, které jsou případně substituovány ato5 mem halogenu, alkylem s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxylovou skupinou, aminoskupinou, ethylaminoskupinou nebo C1-C7 alkoxylovou skupinou a man, jsou na sobě nezávisle 1 nebo 2, io ve všech jeho stereoisomemích formách a ve směsích těchto forem v libovolných poměrech ajejich fyziologicky použitelné soli.

2. Derivát pluraflavinů podle nároku 1, obecného vzorce I, ve kterém R₇ je aminosacharid.

15

3. Derivát pluraflavinů podle nároku 1 nebo 2, obecného vzorce I, ve kterém R₇ je substituent vzorce

4. Derivát pluraflavinů podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, obecného vzorce I, ve kterém n je 2.

20 5. Derivát pluraflavinů podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, obecného vzorce I, ve kterém Ri je aminosacharid.

6. Derivát pluraflavinů podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, obecného vzorce I, ve kterém Ri je vzorce

7. Derivát pluraflavinů podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, obecného vzorce I, ve kterém substituent R₃ je vybraný ze skupin

-28CZ 303810 B6

8. Derivát pluraflavinu podle nároku 1, vzorce IA ve všech jeho stereoisomemích formách a ve směsích těchto forem v libovolných poměrech ajeho fyziologicky použitelné soli.

9. Derivát pluraflavinu podle nároku 1, vzorce IB ve všech jeho stereoisomemích formách a ve směsích těchto forem v libovolných poměrech a jeho fyziologicky použitelné soli.

-29CZ 303810 B6

10. Derivát pluraflavinu podle nároku 1 vzorce IE ve všech jeho stereoisomemích formách a ve směsích těchto forem v libovolných poměrech a jeho fyziologicky použitelné soli.

11. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden derivát pluraflavinu obecného vzorce I podle nároku 1 nebo jeho fyziologicky použitelnou sůl a přijatelný nosič.

ío 12. Farmaceutický prostředek podle nároku 11, vyznačující se tím, že tímto přijatelným nosičem je farmaceuticky použitelný nosič.

13. Způsob přípravy alespoň jednoho derivátu pluraflavinu obecného vzorce I nebo jeho fyziologicky použitelné soli podle nároku 1, vyznačující se tím, že se kultivuje mikroorga15 nismus Actinomycetales druh HAG 003959, DSM 12931, nebo jedna z jeho variant nebo mutantů, za vhodných podmínek v živném médiu až je v živném médiu přítomna alespoň jeden z derivátů obecného vzorce I, načež se derivát izoluje.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že se izolovaný derivát plura20 flavinu dále převede na alespoň jeden derivát pluraflavinu vybraný z fyziologicky použitelných solí.

15. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že se kultivace provádí za aerobních podmínek při teplotě mezi 18 a 35 °C a při pH mezi 6 a 8.

16. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že se derivát pluraflavinu obecného vzorce I převede na jeho derivát použitím redukčního činidla.

17. Použití alespoň jednoho derivátu pluraflavinu obecného vzorce I podle nároků 1 až 10 nebo

30 jeho fyziologicky použitelných solí pro přípravu cytostatik.

18. Použití alespoň jednoho derivátu pluraflavinu obecného vzorce I podle nároků 1 až 10 nebo jeho fyziologicky použitelných solí pro přípravu léků pro léčení nádorů tlustého střeva.

35 19. Použití alespoň jednoho derivátu pluraflavinu obecného vzorce I podle nároků 1 až 10 nebo jeho fyziologicky použitelných solí pro přípravu léků pro léčení prsních nádorů.

20. Použití alespoň jednoho derivátu pluraflavinu obecného vzorce I podle nároků 1 až 10 nebo jeho fyziologicky použitelných solí pro přípravu léků pro léčení plicních nádorů.

21. Použití alespoň jednoho derivátu pluraflavinu obecného vzorce I podle nároků 1 až 10 nebo jeho fyziologicky použitelných solí pro přípravu léků pro léčení nádorů prostaty.

-30CZ 303810 B6

22. Použití alespoňjednoho derivátu pluraflavinu obecného vzorce I podle nároků 1 až 10 nebo jeho fyziologicky použitelných solí pro přípravu léků pro léčení leukémie.

5 23. Použití alespoň jednoho derivátu pluraflavinu obecného vzorce I podle nároků 1 až 10 nebo jeho fyziologicky použitelných solí pro přípravu léků pro léčení mikrobiálních infekcí.

24. Actinomycetales druh HAG 003959, DSM 12931.

Konec dokumentu