RO120921B1 - Procedeu de obţinere a unor culturi de cereale transformate prin modificarea expresiei genei de biosinteză a amidonului - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de modificare aexpresiei genei de biosinteză a amidonului, pentru a produce amidonii în plante şi seminţe, şi prezintă aplicabilitate în domeniul biologiei moleculare a plantelor. Procedeul cuprinde etapele de obţinere a unei gene himere ce cuprinde un fragment deacid nucleic ce modifică pentru o genă structurală non-GBSSI a enzimei de biosinteză a amidonului şi transformarea unei culturi de cereale cu gena himerică.

Description

RO 120921 Β1

Prezenta invenţie se referă la modificarea expresiei genei enzimei de biosinteză a amidonului, pentru a produce amidonuri în plante şi seminţe. Invenţia prezintă aplicabilitate în domeniul biologiei moleculare a plantelor.

Amidonul este un amestec de două polizaharide, amiloză şi amilopectină. Amiloza este o catenă neramificată, cu până la câteva mii de unităţi de α-D-glucopiranoză, legate prin legături a-1,4-glicozidice. Amilopectină este o moleculă înalt ramificată, cu până la 50.000 de resturi de α-D-glucopiranoză, legate prin legături a-1,4 şi a-1,6 glicozidice. Aproximativ 5% din legăturile glicozidice în amilopectină sunt legături a-1,6, care conduc la o structură ramificată a polimerului.

Moleculele de amiloză şi amilopectină sunt organizate în granule care sunt stocate în plastide. Granulele de amidon produse de cele mai multe plante sunt constituite din 15-30% amiloză şi 70.. .85% amilopectină. Raportul de amiloză la amilopectină şi gradul de ramificare al amilopectinei afectează proprietăţile fizice şi funcţionale ale amidonului. Proprietăţile funcţionale, cum sunt: viscozitatea şi stabilitatea unui amidon gelatinizat, determină utilitatea şi prin aceasta valoarea amidonurilorîn alimente şi în aplicaţiile industriale. Atunci când este necesară o proprietate funcţională specifică, amidonurile obţinute din diferite culturi, astfel ca cele de porumb, orez, cartofi sau grâu, pot întruni cerinţele de funcţionalitate. Dacă un amidon nu întruneşte o proprietate funcţională cerută, cum ar fi, de exemplu, necesitatea unei viscozităţi stabile la temperaturi înalte şi în condiţii de aciditate, funcţionalitatea poate fi în mod uzual realizată prin modificări chimice ale amidonului. în industria amidonului sunt utilizate diferite tipuri şi grade de modificări chimice, şi marcarea şi utilizarea amidonurilor modificate chimic trebuie să îndeplinească reglementările guvernului. în organele purtătoare de amidon ale plantelor, proporţia de amiloză la amilopectină şi gradul de ramificare al amilopectinei sunt sub control genetic. De exemplu, plantelor homozigote de porumb pentru mutaţia recesivă waxy(wx) le lipseşte enzima sintazei amidonului legat în granule şi produce aproximativ 100% amilopectină. Plantele homozigote de porumb pentru mutaţia recesivă amylose extender (ae) şi genele modificatoare necaracterizate se pare că pot să producă granule de amidon care au aproximativ 80 la 90% amiloză (vezi, US 5300145). Mutantul dull al porumbului este lipsit de o sintază a amidonului distinctă de cea care lipseşte în liniile waxy şi are un amidon caracterizat prin mai multă amiloză şi printr-o proporţie mai mare a ramificaţiilor mai scurte pe molecula de amilopectină, decât în amidonul normal.

Cele mai multe culturi de cereale sunt manipulate ca mărfuri şi multe din cerinţele industriale şi ale hranei pentru animale pentru aceste culturi pot fi îndeplinite de varietăţi obişnuite, care sunt cultivate pe scară largă şi produse în cantităţi mari. Totuşi, există în prezent o piaţă în creştere pentru culturile cu proprietăţi ale produselor finite speciale care nu se întâlnesc în boabele cu compoziţie standard. Cea mai comună specialitate de porumb este diferenţiată de porumbul "normal" prin proprietăţi transformate ale endospermului, astfel ca: schimbări generale în raportul amiloză la amilopectină precum se întâlneşte în porumbul waxy (ceros) sau în porumbul cu multă amiloză, o acumulare crescută de zaharuri în porumbul dulce sau o transformare a gradului de duritate a endospermului precum în porumbul de calitate alimentară sau în popcorn (Glover, D. V. şi E. T. Mertz (1987) în Corn: Nutriţional Quality of Cereai Grains; Genetic and Agronomic Improvement, R. A. Olson şi K. J. Frey, eds. American Society of Agronomy, Madison Wisconsin, pp, 183-336; Rooney, L. W. şi S.O. Serna-Saldivar(1987) Food Usesof Whole Corn şi Dry-Miled Fractions, în Corn: Chemistry and Technology. S. A. Watson şi P. E. Ramstead, eds. American Associated of Cereai Chemists Inc. St. Paul Minnesota, pp, 329-429). Prezenta invenţie oferă cumpărătorilor de specialităţi de cereale boabe o sursă de amidon care are proprietăţi distincte de 2 RO 120921 Β1 amidonul waxy şi oferă fermierilor oportunitatea de a creşte o cultură calitativ superioară faţă 1 de a porumbului normal sau a porumbului waxy.

Amidonul purificat se obţine din plante printr-un procedeu de măcinare. Amidonul din 3 porumb este extras din miezul boabelor de porumb prin utilizarea unui procedeu de măcinare umedă. Măcinarea umedă este un procedeu în mai multe etape, care implică înmuierea şi 5 mărunţirea miezurilor boabelor de porumb şi separarea amidonului, proteinelor, uleiului şi a fracţiilor fibroase. Un model de procedeu de măcinare umedă a porumbului este redat de 7 către S. R. Eckoff (1992) în Proceedinss ofFourth Corn Utilization Conference, 24-26 iunie,

St. Louis, MO editat de National Corn Growers Association, CIBA-GEIGY Seed Division and 9 the United States Department of Agriculture. Grâul este de asemenea o sursă importantă de amidon purificat. Producerea amidonului din grâu este redată de către J. W. Knight şi R. M. 11 Olson (1984) în Starch: Chemistryand Technology Τ'0 Edition, Academic Press Eds. Whisler şi colaboratorii. 13

Amidonul este utilizat în numeroase alimente şi aplicaţii industriale şi este principala sursă de hidraţi de carbon în dieta umană. în mod caracteristic, amidonul este amestecat cu 15 apă şi încălzit, pentru a forma un gel îngroşat. Acest procedeu este denumit gelatinizare. Trei proprietăţi importante ale unui amidon sunt temperatura la care decurge gelatinizarea, visco- 17 zitatea gelurilor îmbogăţite şi stabilitatea în timp a viscozitătii gelului. Proprietăţile fizice ale amidonului nemodificat în timpul încălzirii şi al răcirii limitează utilitatea în multe aplicaţii. Ca 19 un rezultat al acestora, sunt necesare eforturi şi costuri considerabile pentru a modifica chimic amidonul, cu scopul de a depăşi aceste limitări ale amidonului şi de a extinde utilitatea 21 amidonului în aplicaţiile industriale.

Anumite limitări ale amidonurilor nemodificate şi proprietăţi ale amidonurilor modi- 23 ficate sunt date în Modified Starches: Properties and Uses, O. B. Wurzburg, ed. (1986) CRC Press Inc. Boca Raton, FL. Amidonurile nemodificate au utilizări foarte limitate în produsele 25 alimentare, din cauză că se umflă şi se rup uşor, formând astfel geluri nedorite slab structurate, fără consistenţă. Modificările chimice sunt utilizate pentru a stabiliza granulele 27 de amidon şi prin aceasta făcând amidonul adecvat pentru mii de aplicaţii în alimente şi în industrie, care includ: alimente pentru copii, frişca sub formă de pulbere pentru cafea, pudre 29 chirurgicale, cleiuri pentru hârtie şi fire şi adezivi. Modificările chimice uzuale includ reticularea, în care legăturile chimice sunt introduse pentru a acţiona la stabilizarea punţilor 31 dintre moleculele de amidon, şi substituţia, în care grupările substituente, astfel ca grupările hidroxietil, hidroxipropil sau acetil, sunt introduse în moleculele de amidon. 33

Utilizarea amidonului modificat în Statele Unite este reglementată de Food and Drug Administration (FDA). Amidonurile "modificate pentru amidon alimentar" pot fi utilizate în 35 alimente, dar trebuie să întrunească limitele specificate pentru tratament, şi amidonurile "modificate pentru amidon industrial" pot fi utilizate, de asemenea, în astfel de containere 37 care vin în contact cu alimente şi trebuie să întrunească, de asemenea cerinţele specificate de regulamente; Code of Federal Regulation, Title 21, Chapter 1, Part 172, Food Additives 39 Permitted in Food for Human Consumption, Section 172, 892, Food Starch-Modified, U.S. Government Printing Office Washington, D.C. 1981; (a) Part 178 Indirect Food Additives, 41 Sect. 1783520, Industrial Starch-Modified. Aceste reglementări limitează gradul de modificare prin definirea cantităţilor maxime de agenţi chimici care pot fi utilizaţi în etapele 43 de modificare. Nivelurile de produse secundare în amidonuri, care rezultă din procedeele de modificare, sunt de asemenea reglementate. De exemplu, resturile de propilen clorhidrină 45 în amidonurile hidroxipropilice sunt specificate (Tuschooff, J.V. (1986) Hydroxypropylated Starches, în Modified Starches; Properties and Uses, O.B. Wurzburg, ed. CRC Press, Boca 47 Raton, FL., pp 55-57). 3 RO 120921 Β1 în plus, la utilizarea ca ingredient purificat, amidonul este un component important al făinilor integrale, astfel ca făina din grâu folosită în prepararea pâinii, a bunurilor coapte şi a pastelor. Amidonul este conţinut între 50 şi 70% în greutate într-un bob de grâu şi importanţa sa în performanţa făinei din grâu este bine cunoscută specialiştilor în domeniu. Deşi geneticile complexe ale grâului au limitate variaţiile structurii fine a amidonului care este disponibilă în făinile integrale, producerea de noi structuri de amidon în grâu sau în alte făini pot conduce la îmbunătăţirea performanţei acestor făini integrale în aplicaţii în produse alimentare. Structura amidonului este de asemenea o componentă importantă a calităţii boabelor de cereale integrale consumate astfel ca orezul. Diferenţele în structura fină a amilopectinei a fost legată de textura orezului încălzit, (Reddy şi colab. (1993), Carbohydr. Polymer 22:276-275).

Diferenţele în gradul de ramificare sau de polimerizare a amidonului sunt cunoscute că produc o schimbare în proprietăţile fizico-chimice ale amidonului. S-a sugerat că amidonurile fabricate pentru aplicaţii specifice pot fi generate prin schimbarea distribuţiei catenei ramificate a moleculei de amilopectină, prin schimbarea proporţiei relative a amilozei la amilopectină sau prin schimbarea gradului de polimerizare a amilozei. Anumiţi autori (Shi and Seib (1992) Carbohidr. Res. 227:131-145; Jane şi colab. (1999), Cereai Chemistry in Press) au indicat că tendinţa de retrogradare este redusă la amidonurile din diferite surse botanice care conţin proporţii crescute de catene foarte scurte (DP 6-9) pe amilopectină lor, dar nu sugerează cum pot fi realizate acestea la porumb. Totuşi, realizarea modificării feno-tipului compoziţiei amidonului a fost problematică; în timp ce enzimele cheie în biosinteză amidonului au fost identificate, rolul lor exact rămâne încă incert. Astfel, corelarea activităţii enzimelor particulare cu caracteristicile moleculare particulare ale structurii amidonului şi cu funcţia amidonului în produsele alimentare şi cele industriale a fost dificilă. Deşi proprietăţile funcţionale dorite ale amidonului, de care un amidon are nevoie, sunt vizibile, există o înţelegere limitată a modului în care structura moleculară a amidonului ar trebui să realizeze acest lucru, precum şi o slabă înţelegere a modului în care enzimele de biosinteză, a amidonului în particular, afectează în mod specific aceşti parametri. De exemplu, rolul enzimelor individuale în determinarea modelului de ramificare şi lungimea ramificărilor sunt încă neclare şi este legat de lipsa de înţelegere a modului în care interacţionează enzimele de ramificare şi sintazele amidonului. în plus, în timp ce rolul sintazei amidonului legat în granule codificat prin gena waxy este într-adevăr bine cunoscut; vezi Denyer şi colab. (1996) PlantJ. 10.1135-1143), numărul şi funcţiunile exacte ale altor sintaze ale amidonului, solubil sau legat în granule, nu sunt bine cunoscute (Smith şi colab. (1996), Ann. Rev. PlantPhys. and Mol. Biol 48:67-87). WO 94/09144 descrie generarea plantelor de porumb cu capacitate îmbunătăţită de a sintetiza amidon la temperaturi ridicate. Această publicaţie propune că factorul de limitare a umplerii granulei la temperaturi ridicate este capacitatea anumitor enzime de biosinteză ale amidonului, în particular sintaza amidonului (SS) şi enzima de ramificare a amidonului (SBE). Introducerea enzimelor care codifică genele care au o temperatură optimă ridicată pentru activitate sau care au o toleranţă mărită la încălzirea în plante poate realiza o creştere a cantităţii de amidon depozitată în bobul de porumb. în plus, este revendicat faptul că această strategie poate fi utilizată pentru a genera amidon cu structură fină modificată, ca un rezultat al introducerii unor gene donoare, a căror expresie poate modifica balanţa dintre diferitele enzime de biosinteză ale amidonului. Genele donoare sugerate includ pe cele care codifică enzime care prezintă proprietăţi cinetice sau alosterice legate de enzima endogenă sau o extra copie a genei endogene, care va compensa piederile în activitatea enzimei create datorită labilităţii termice. Ca un mijloc de a modifica structura amidonului, 4 RO 120921 Β1 publicaţia WO 94/09144 sugerează utilizarea genelor sens şi antisens pentru a modifica 1 raportul natural al diferitelor sintaze ale amidonului şi ale enzimelor de ramificare în planta receptoare. Această publicaţie descrie efectul temperaturii asupra activităţii catalitice şi a 3 stabilităţii enzimatice pentru anumite enzime de biosinteză a amidonului. Totuşi, nu sunt prezentate date consistente privind strategiile moleculare propuse. într-adevăr, în timp ce 5 această publicaţie sugerează utilizarea unei expresiei modificate a sintazei amidonului pentru a modifica structura fină a amidonului, atât raportul amiloză/amilopectină, cât şi gradul 7 de ramificare a amilopectinei, alte publicaţii anterioare şi ulterioare sugerează că enzimele de ramificare ale amidonului nu vor fi necesare, nici chiar sintazele amidonului, sau 9 sugerează că alţi factori ar trebui nominalizaţi. De exemplu, Smith şi colab. (1995. Plant Phys 107:673-677) sugerează două puncte de vedere distincte despre determinarea modelului de 11 ramificare al amilopectinei; primul model, care reprezintă o balanţă între activităţile enzimelor de ramificare şi a celor de deramificare şi al doilea model, poate fi explicat pe larg prin 13 proprietăţile enzimelor ramificate. Nu este prevăzut nici un rol pentru sintazele amidonului.

Guan şi Preiss (1993, Plant Phys. 102:1269-1271) sugerează că un studiu al interacţiunii 15 între formele multiple ale enzimelor de ramificare şi sintazele amidonului poate fi esenţial pentru înţelegerea specificităţii şi funcţiei izozimelor individuale şi al mecanismului biosintezei 17 amilopectinei. Astfel, Guan şi Preiss implică necesitatea de a modifica odată ambele enzime.

Lastly, Van den Koornhuyse şi colab. (19966, J. Biol. Chem. 271,16281-16287) propune o 19 explicaţie, prin care concentraţiile scăzute ale zahărului în nucleozide sunt fie direct, fie indirect responsabile de diferenţele majore, observate în compoziţia sau structura amidonului 21 în timpul stocării. în concluzie, este clar din diferite puncte de vedere că nu există un consens în ceea ce priveşte factorii care afectează structura amidonului şi astfel cum poate 23 fi aceasta modificată. în plus, nici lucrările incluzând WO 94/09144, nu prezintă evidenţa care să demonstreze ca sintazele amidonului solubil limitează rata polimerizării şi de aceea 25 fiecare creştere sau scădere a nivelului acestora va schimba structura fină a amidonului. în plus, publicaţia WO 94/09144 nu ne arată cum să facem diferenţa între izoformele care 27 codifică genele care aduc o contribuţie minimă la biosinteză amidonului şi formele mult mai active. Reducerea modelului de expresie a unei enzime relativ inactive (la nivel enzimatic, 29 nu este necesar la nivel transcripteonal) este puţin probabil să aibă un efect. în concluzie, publicaţia WO 94/09144 sugerează, dar nu redă în detaliu pentru specialiştii în domeniu, cum 31 se produce un amidon modificat în structura fină.

Există diferite rapoarte privind modificarea structurii amidonului prin modificarea 33 expresiei SBR atât la cartof (Virgin şi colab. iunie 1994 la 4,h International Congress of Plant Molecular Biology, şi Cristensen şi colab. şi Kossman şi colab. (iulie 1994) la Plant 35 Polysaccharide Symposium), cât şi la porumb (Broglie şi colab., WO 97/22703). Nici una dintre aceste lucrări nu face referire la potenţialul modificării expresiei sintazelor de amidon. 37 Anumiţi autori au speculat faptul că modificarea expresiei sintazei I (non-GBSSI) a amidonului nelegat în granulă ar putea transforma structura sau compoziţia amidonului, dar 39 aceasta nu a fost clar demonstrată la cereale (Block şi colab., WO 9745545A; Frohberg şi Kossman, WO 9744472; Frohberg şi Kossman, WO 9726362). 41

Deşi etapele enzimatice sunt cunoscute, detaliile moleculare ale biosintezei amidonului nu sunt bine cunoscute. Nu este clar dacă diferitele izoforme ale SS contribuie în mod 43 egal, pe tot parcursul biosintezei, sau dacă fiecare izoformă joacă un rol distinct în asamblarea moleculei de amilopectină de-a lungul etapelor discrete pe o cale obligatorie. Ţinând cont 45 de posibila interacţiune între enzimele de ramificare ale amidonului şi multiplele sintaze ale amidonului care funcţionează în alungirea catenei de glucan, este posibil să se facă predicţii 47 5 RO 120921 Β1 clare cu privire la structura amidonului pe baza proprietăţilor catalitice ale fiecărei enzime.

Dincolo de rolul clar al GBSSI în biosinteza amilozei, rolul exact al sintazelor individuale ale amidonului nu este clar. Există evidenţe pentru anumite, dar nu pentru toate speciile izoforme individuale ale SS care au contribuţii diferite în biosinteza amilopectinei şi care pot de asemenea să contribuie la biosinteza amilopectinei în aceeaşi măsură ca şi la cea a amilozei (Smith şi colab. (1996) Ann. Rev. Plant Phys. And Mol. Biol. 48:67-87). Numeroase sintaze ale amidonului au fost donate de la diferite specii, dar Edwards şi colab. (1960, Plant Phys. 112:89-97) şi Mu-Foster şi colab. (1996, Plant Phys. 111:821-829) demonstrează că distincţia făcută anterior între sintazele amidonului legat în granulă şi sintazele amidonului solubil nu pot să reflecte situaţia in vivo şi nu va fi utilizată aici cu excepţia proteinei waxy, GBSSI. După izolarea sa iniţială din porumb (Klosgen şi colab. (1986), Mol. Gen. Genet. 203:237-244), această genă a fost donată din foarte multe specii. Numeroase alte SS au fost donate dintr-un domeniu de specii, dar acestea apar a fi specii mai puţin înrudite apropiat între ele decât GBSSI. Cartoful conţine cel puţin alte două sintaze ale amidonului, SSII şi SSIII (Marshall şi colab. (1996), Plant Cell. 8:1121-1135). Bobul de mazăre conţine o sintază desemnată SSII, care apare că este prezentă în două forme, una derivată prin procesarea celeilalte (Edwards şi colab. (1995), Plant Phys. 112:89-97). Block şi colab. (WO 9745545A) au izolat din grâu două clone ADNc ale sintazei amidonului. Au fost purificate trei forme de sintază de amidon solubil din orez. S-a arătat că acestea derivă de la o formă primară, prin izolarea genei corespunzătoare, la care se face referire ca sintaza I a amidonului solubil (SSSI) (Baba şi colab. (1993) Plant Phys. 103:565-573; Tanaka şi colab. (1995) Plant Phys. 108:677-683). Capetele Ataşate ale Secvenţelor Expresate (EST) de la orez care arată omologia secvenţelor sintazei II a amidonului din mazăre au fost identificate (AA752475, AA753266, AA751702, AA751557, AA751512A; Nahm, B.H. şi colab.). A fost izolată din porumb o secvenţă înrudită cu SSI din orez (Ham şi colab. (1995), Plant Phys. 108:S-50 Keeling şi colab., WO 9720936) şi a fost denumită SSI din porumb. Au fost izolate două clone suplimentare de ADNc ale sintazei amidonului de către Keeling şi colab. (WO 9720936). Expresia genelor care codifică aceste sintaze ale amidonului a fost studiată şi a fost raportată reprezentarea lor în genomul de porumb (Harn. şi colab. (1998) Plant Mol. Biol. 37:639-649). Frohberg şi Kossman (WO 97/44472 şi 97/26362) au raportat de asemenea izolarea a două din aceste secvenţe de sintază de amidon din porumb. Locul responsabil pentru mutaţia du//în porumb a fost recent indicat pentru a codifica o altă sintază a amidonului (Gao şi colab. (1998) Plant Cell 10:399-412). într-un studiu care caracterizează activităţile sintazei amidonului solubil în endospermul de porumb, Cao şi colab. (1999) Plant Physiol. 120:205-215) raportează că DU1 şi în aceeaşi măsură SSSI sunt răspunzătoare pentru întreaga activitate a sintazei amidonului solubil în endospermul care se dezvoltă. Organismele unicelulare conţin de asemenea sintaze multiple ale amidonului (Fontaine şi colab. (1993) J. Biol. Chem. 268:16223-16230; Buleon şi colab. (1997) Plant Physiol. 115:949-957). în timp ce pentru multe din aceste enzime autorii au făcut speculaţii asupra rolului lor, în nici un caz nu s-a elucidat cum funcţionează împreună întregul ansamblu al izo-formelor sintazei amidonului, pentru a prelungi ramificaţiile amilopectinei, sau cum interacţio-nează şi funcţionează împreună întregul sortimentul bogat de enzime de biosinteză ale amidonului într-o specie particulară, pentru a produce structura amidonului care este observată în seminţele sau în tuberculii maturi. în particular, rolul sintazelor amidonului cu abundenţă scăzută în endospermă este neclar.

Este bine cunoscut faptul că mutaţia waxy în porumb conduce la lipsa unei enzime funcţionale GBSSI şi la compoziţia modificată a amidonului în mod similar. în grâu au fost selectate varietăţile de amiloză inferioară în care lipseşte GBSS. Formele dominante de 6 RO 120921 Β1 mutaţie analoagă în cartof au fost realizate prin genele antisens care exprimă GBSSI în 1 plantele de cartof transgenic (Viser şi colab. (1989) Plant Mol Biol. 17:691-699). Shemaker şicolab. (1994, Plant Physiol. 104:1159-1166) au raportat structuri de amidon modificat prin 3 expresia £. coli glicogen sintazei în tuberculi. Expresia modificată a sintezelor amidonului non -GBSSI a fost de asemenea raportată. Reducerea expresiei SSII în tuberculii de cartofi 5 transgenici a fost realizată utilizând tehnologia antisens. Descreşterea nivelurilor de proteină SSII nu a fost corelată cu nici o schimbare detectabilă în conţinutul de amidon sau în compo- 7 ziţia amidonului, iar morfologia granulelor de amidon apare normală (Edwards şi colab. (1995) Plant J. 8:283-294). Recent, au fost raportate mici transformări în distribuţia catenei 9 ramificate de amilopectină (dp 6-35) în plantele de cartof antisens SSII (Edwards şi col. (1999) Plant J. 17:251-261). Rezultate diferite au fost observate când activitatea sintazei 11 amidonului majoritar, solubil din tuberculii de cartof, SSIII, a fost inhibată pe calea antisens. în aceste plante transgenice, conţinutul şi compoziţia de amidon nu s-au schimbat, totuşi 13 morfologia granulelor nu a fost afectată în mod exemplar (Marshall şi colab. (1996) Plant Cell 8:1121 -1135). Au fost observate schimbări ale distribuţiei catenei ramificate în amilopectină, 15 dar acestea au fost distincte de cele găsite în plantele antisens SSII (Edwards şi colab. (1999) Plant J. 17:251 -261). A fost găsită o mutantă de mazăre, rug5, ca fiind lipsită de o izo- 17 formă a sintazei amidonului, care este înalt omoloagă cu SSII a cartofului. Deşi două sintaze ale amidonului prezintă omologie în secvenţa de aminoacizi, când această izoformă a sin- 19 tezei amidonului a fost inhibată la mazăre, s-au obţinut rezultate diferite. Schimbări notabile au apărut în catenele scurte (dp<15), mediii (dp 15-45) şi foarte lungi (dp~1000), ramificate 21 de amilopectină. în plus, aceste schimbări structurale au fost asociate cu schimbări mari în morfologia granulelor de amidon. Astfel, în timp ce rezultatele transgenice de la cartof suge- 23 rează că într-un organ specific, diferitele izoforme ale sintazei amidonului îndeplinesc roluri diferite în biosinteza amidonului, rezultatele obţinute de la mutanta de mazăre rug5 arată că 25 izoformele omoloage nu pot îndeplini în mod necesar aceeaşi funcţie în diferite organe care stochează amidon. Generalizarea privind rolul izoformelor specifice şi prezicerea schimbă- 27 rilor fenotipice ale amidonului, care însoţesc expresia modificată, este dificil de raportat, datorită diferenţelor în numărul izoformelor reprezentate în diferite organe, şi în aceeaşi 29 măsură, datorită diferenţelor cantitative relative ale activităţii aduse de diferitele izoforme. în timp ce lucrările transgenice, care au avut drept ţintă modificarea expresiei sintazei 31 amidonului, au fost raportate în cazul cartofului, în ceea ce priveşte porumbul, nu au fost descrise asemenea experimente. 33

Brevetul US 5824790 raportează izolarea a 3 clone ADNc non-waxy a sintazei amidonului. Se sugerează utilizarea acestei secvenţe pentru a genera construcţii desemnate 35 pentru a modifica expresia acestor sintaze ale amidonului în plantele transgenice. în plus, se sugerează că expresia proteinei modificate poate da naştere la o schimbare în structura 37 fină a amidonului. în timp ce sunt prevăzute secvenţele de nucleotide şi proteine din 3 sintaze ale amidonului, nu sunt raportate nici un fel de date referitoare la generarea şi 39 caracterizarea plantelor transgenice purtătoare de construcţii de ADN în plantele transgenice. în absenţa rolului specific al diferitelor izoforme ale sintazei amidonului solubil 41 în endospermul cerealelor şi cu previziunea activităţilor pentru enzimele din clasa SSIIa şi SSIIb în endospermul în chestiune (Cao şi colab. (1999) Plant Physiol. 120:205-215), este 43 clar că secvenţele genelor nu furnizează ele singure indicaţii clare despre tipul de schimbare, dacă există vreo schimbare, în structura amidonului, poate fi realizată prin modificarea 45 expresiei unei gene particulare a sintazei amidonului solubil. Şi în absenţa acestei puteri prezicătoare sau a producţiei de amidon, utilitatea oricărei schimbări date este neclară. De 47 fapt, în termenii atribuţiilor funcţionale specifice, astfel ca tendinţa retrogradării, este clar că 7 RO 120921 Β1 anumite schimbări structurale sunt în detrimentul utilităţii. Qiange şi Thompson (1998, Carbohidr. Res. 314:221-235) au examinat retrogradarea a trei duble mutante de porumb, duwx, aewx şi su2wx, în comparaţie cu amidonul waxy normal şi au arătat tendinţa de creştere a retrogradării în două din trei tipuri de amilopectină. Astfel, este clar că numai schimbarea singură nu este suficientă pentru a îmbunătăţi utilitatea amidonului din cereale şi că anumite schimbări pot fi îmbunătăţite, în timp ce altele sunt neutre sau chiar în detrimentul utilităţii, în absenţa capacităţii de a prezice în mod semnificativ schimbarea structurală care poate fi produsă printr-o modificare genetică dată, numai calea prin care sunt identificate schimbările utile este de fapt calea pentru a produce amidon modificat.

Soluţiile modificării genetice la generarea amidonurilor din culturile de cereale cu structuri fine modificate au un avantaj decisiv asupra căilor mai tradiţionale de reproducere a plantelor. Schimbările în structura fină a amidonului pot fi produse prin expresia care inhibă în mod specific una sau mai multe din izoformele SS sau SBE prin inhibare antisens sau prin cosupresie (WO 94/09144). O construcţie antisens sau de cosupresie ar acţiona ca un regulator negativ, dominant, al activităţii genei. în timp ce mutaţiile convenţionale pot da reglări negative ale activităţii genei, aceste efecte sunt cele mai recesive. Reglarea dominantă negativă, disponibilă pe o cale transgenică, poate fi avantajoasă pentru anumite metode de producere a granulelor. în plus, capacitatea de a restricţiona expresia fenotipului de amidon modificat la ţesuturi reproductive ale plantelor, prin utilizarea de promotori specifici, poate conferi avantaje agronomice înrudite cu mutaţiile convenţionale care vor avea un efect în toate ţesuturile în care gena mutantă este expresată în mod obişnuit. în final, nivelurile variabile de inhibiţie antisens sau de cosupresie, care apar din efectele de poziţie cromozomiale, ar produce un domeniu larg de fenotipuri de amidon, decât acelea care rezultă din efectele de dozaj ale unui mutant alele în endospermul cerealelor. înţelegerea incompletă a rolului diferitelor enzime ale sintazei amidonului în culturile de cereale recomandă încercarea de a manipula structura fină a amidonului prin inhibarea expresiei dificile a genei sintazei amidonului. Totuşi, manipularea expresiei genei enzimei sintazei amidonului, prin tehnologia de cosupresie şi tehnologia antisens, este posibilă şi ar putea produce un fenotip dorit. Astfel, un specialist în domeniu trebuie numai să selecteze plante transgenice multiple pentru modificarea dorită în structura fină a amidonului.

Prezenta invenţie descrie utilizarea clonelor ADNc pentru a construi gene himerice sens şi antisens pentru modificarea activităţii enzimatice a sintazei amidonului în bobul de porumb sau în endospermul porumbului şi în bobul sau endospermul altor culturi de cereale. Mai specific, această invenţie se referă la un procedeu de producere a unei culturi transformate de cereale, în care structura fină a amidonului, derivată de la un bob dintr-o cultură de cereale, este modificată, comparativ cu o structură fină a amidonului derivat de la o cultură de cereale netransformată, cuprinzând: (1) prepararea unei gene himerice care cuprinde un fragment de acid nucleic care codifică o genă structurală non-GBSSI a enzimei sintazei amidonului sau a unui fragment al acesteia, legat operabil fie în orientare sens, fie antisens, pe partea din amonte a unui fragment de acid nucleic care codifică un promotor care direcţionează expresia genei în ţesutul endospermului şi care este legat în mod operabil în partea din aval al unui fragment de acid nucleic care codifică o secvenţă regulatoare potrivită pentru terminarea transcripţională şi (2) transformarea culturilor de cereale cu gena himerică menţionată, în care expresia genei himerice conduce la modificarea structurii fine a amidonului derivat din bobul culturilor de cereale transformate, comparativ cu structura fină a amidonului derivat din culturile de cereale care nu posedă asemenea gene himerice.

Invenţia se referă de asemenea la un procedeu de producere a unei culturi de cereale transformate, în care structura fină a amidonului derivat de la un bob dintr-o cultură de 8 RO 120921 Β1 cereale are o schimbare în proporţia relativă a amilozei la amilopectină, referitoare la cea a amidonului derivat de la culturile de cereale care nu posedă gena himerică de mai sus, sau o schimbare în gradul de polimerizare al componentei amiloză în amidonul derivat de la cultura de cereale transformată, referitor la gradul de polimerizare al amilozei amidonului derivat din culturile de cereale care nu posedă gena himerică de mai sus. Până în prezent, nici un raport nu a demonstrat o modificare în structura moleculară a amidonului creat prin modificarea nivelului de expresie a sintazei non-GBSSI a amidonului într-o plantă transgenică. Prezenta invenţie descrie modificările specifice în structurile de amidon, în schimbările raportului amiloză la amilopectină, în schimbările în structura fină a amilopectinei, în creşterea abundenţei catenelor foarte scurte ale amilopectinei (DP 6-9) şi schimbarea în gradul de polimerizare a amilozei, care pot fi create prin controlul expresiei sintazelor non-GBSSI ale amidonului în plantele transgenice.

Invenţia se referă de asemenea la varietăţi de culturi de cereale, preparate prin transformare, utilizând metoda menţionată, la amidon izolat din boabele dintr-o cultură de cereale preparate utilizând procedeul descris mai sus.

Prezenta invenţie se referă de asemenea la varietăţi de culturi de cereale, preparate prin transformare, utilizând procedeul de mai sus, se referă la făini preparate din boabele varietăţilor de culturi de cereale menţionate şi la prepararea pâinii, a bunurilor coapte şi a pastelor, prin combinarea apei, ingredientelor pentru alimente şi a unei cantităţi eficiente de făină din boabele varietăţilor din culturile de cereale preparate utilizând metoda şi încălzirea compoziţiei care rezultă, necesară pentru a produce o pâine, bunuri coapte sau produse din paste.

Prezenta invenţie poate fi mai uşor înţeleasă din următoarea descriere detaliată şi din desenele care o însoţesc şi din descrierile secvenţelor care formează o parte a acestei invenţii.

Fig. 1 prezintă o hartă de restricţie a plasmidei pSS43.

Fig. 2 prezintă o hartă de restricţie a plasmidei pSS64-C5.

Fig. 3 prezintă o hartă de restricţie a plasmidei pSS64-C11.

Fig. 4 prezintă o hartă de restricţie a plasmidei pSPB40.

Fig. 5 prezintă o hartă de restricţie a plasmidei pSPB47.

Fig. 6 prezintă o distribuţie a greutăţii moleculare a amidonului deramificat din miezul Rl din boabele plantelor de porumb ale segregantului 944-1 modificat şi ale segregantului normal 944-7.

Fig. 7 prezintă o distribuţie a greutăţii moleculare a amidonului deramificat din miezul boabelor de porumb ale segregantului XGB01717-2 modificat, aparţinând liniei S064.1.2.1 şi segregantului normal XGB01717-9.

Fig. 8 prezintă distribuţia procentul molar relativ al lungimii catenei între DP7 şi DP30 pentru amidonul derivat de la un miez de bob de porumb segregant modificat şi de la un amidon derivat de la un miez de bob de porumb segregant nemodificat. SEQ ID Nr: 1 redă secvenţa de nucleotide a primerului BE62 PCR. SEQ ID Nr: 2 redă secvenţa de nucleotide a primerului BE61 PCR. SEQ ID Nr: 3 redă secvenţa de nucleotide a primerului SS7 PCR. SEQ ID Nr: 4 redă secvenţa de nucleotide a primerului SS8 PCR. SEQ ID Nr: 5 redă secvenţa de nucleotide a secvenţei genei compozite SS1. SEQ ID Nr: 6 redă secvenţa de nucleotide a secvenţei SS1 ADN inserată în pSS43. SEQ ID Nr: 7 redă secvenţa de nucleotide a primerului MM50 PCR. SEQ ID Nr: 8 redă secvenţa de nucleotide a primerului BE56 PCR. SEQ ID Nr: 9 redă secvenţa de nucleotide a primerului MM62 PCR. 9 RO 120921 Β1 SEQ ID Nr: 10 redă secvenţa de nucleotide a primerului MM60 PCR. SEQ ID Nr: 11 redă secvenţa de nucleotide a secvenţei SS1 ADN inserată în pSS64 - C5. SEQ ID Nr: 12 redă secvenţa de nucleotide a secvenţei SS1 ADN inserată în pSS65 - C11. SEQ ID Nr: 13 redă secvenţa de nucleotide a primerului SS9 PCR. SEQ ID Nr: 14 redă secvenţa de nucleotide a primerului SS10 PCR. SEQ ID Nr: 15 redă secvenţa de nucleotide a secvenţei SSb inserată în pSPB37. SEQ ID Nr: 16 redă secvenţa de nucleotide a secvenţei SSb ADN inserată în pSPB40. SEQ ID Nr: 17 redă secvenţa de nucleotide a primerului OSPB104 PCR. SEQ ID Nr:18 redă secvenţa de nucleotide a primerului OSPB105 PCR. SEQ ID Nr: 19 redă secvenţa de nucleotide a primerului OSPB106 PCR. SEQ ID Nr: 20 redă secvenţa de nucleotide a secvenţei SSb ADN inserată în pSPB47.

Secvenţele descrise conţin codul de o literă pentru caracterele secvenţei nucleotidice şi codul de trei litere pentru aminoacizii definiţi în conformitate cu standardele IUPAC-IUB (1985, Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 şi 1984, Biochem. J. 219:345-373), care sunt încorporate printre referinţe. în contextul prezentei invenţii, au fost utilizaţi un număr de termeni. Aşa cum este utilizat aici, termenul "amidon" se referă la un polizaharid care constă din a-D-(1,4) glucan care poate conţine proporţii variabile de ramificaţii a-D-(1,6). Aşa cum se utilizează aici, termenul "structură fină a amidonului" se referă la structura moleculară a unui polimer de amidon, prezenţa, abundenţa şi distribuţia legăturilor a-D-(1,6) şi prezenţa, abundenţa şi lungimea atât a ct-D-(1,4) glucanilor ramificaţi, cât şi a celor neramificaţi. Structura fină a amidonului este descrisă prin distribuţia catenei ramificate a amilopectinei sau prin proporţia relativă a amilozei la amilopectină sau prin gradul de polimerizare al amilozei. Modificarea oricăreia dintre aceste componentele moleculare structurale conduce la o structură fină modificată a amidonului. Unul, doi sau trei dintre aceşti parametri pot fi modificaţi în mod independent unul de ceilalţi. Termenul "grad de polimerizare" se referă la numărul de unităţi de α-D-glucopiranoză într-o moleculă sau într-o porţiune desemnată a unei asemenea molecule, astfel ca o catenă ramificată de amilopectină. Aşa cum se utilizează aici, termenul "distribuţie a catenei ramificate" se referă la distribuţia catenelor de glucan a-1,4-legate, care este detectată după digestia amilopectinei la izoamilază şi fracţionarea ulterioară a ramificărilor degajate, prin cromatografie de excluziune a dimensiunilor. Aşa cum se utilizează aici, "culturi de cereale" semnifică o plantă care dă o sămânţă care conţine un amidon adecvat pentru utilizare în alimente sau în industrie, exemplificată prin porumb, orez, sorg, grâu şi orz. Aşa cum se utilizează aici, un "fragment de acid nucleic izolat" este un polimer de ARN sau de ADN, care este simplu sau cu dublă elice, care conţine opţional baze nucleotidice sintetice, nenaturale sau modificate. Un fragment de acid nucleic izolat sub forma unui polimer de ADN poate cuprinde unul sau mai multe segmente de ADNc, ADN genomic sau ADN de sinteză. Aşa cum se utilizează aici, "similar în mod esenţial" se referă la fragmente de acid nucleic, în care schimbările în una sau mai multe baze nucleotidice conduce la substituirea unuia sau a mai multor aminoacizi, dar care nu afectează proprietăţile funcţionale ale proteinei codificate de către secvenţa de ADN. Expresia "similar în mod substanţial" se referă de asemenea la fragmente de acizi nucleici, în care schimbările în una sau mai multe baze nucleotidice afectează capacitatea fragmentului de acid nucleic pentru a media modificarea 10 RO 120921 Β1 expresiei genei prin tehnologie antisens sau prin cosupresie. Expresia "similar în mod 1 substanţial" se referă de asemenea la modificările fragmentelor de acid nucleic ale prezentei invenţii, astfel încât deleţia sau inserţia uneia sau a mai multor baze nucleotidice care nu 3 afectează proprietăţile funcţionale ale transcriptului care rezultă vis-a-vis de capacitatea de a media modificarea expresiei genei prin tehnologii antisens sau de cosupresie sau prin 5 modificarea proprietăţilor moleculei de proteină care rezultă. De aceea se subînţelege că invenţia cuprinde mai mult decât secvenţe specifice exemplare. De exemplu, este bine 7 cunoscut în domeniu că supresia antisens şi cosupresia expresiei genei poate fi realizată utilizând fragmente de acid nucleic care reprezintă mai puţin decât întreaga regiune de 9 codificare a unei gene şi poate fi realizată prin fragmente de acid nucleic care nu sunt 100% identice cu gena ce va fi supresată (US 5107065). în plus, modificarea unei gene care con- 11 duce ia producerea unui aminoacid echivalent chimic la un situs dat, dar care nu afectează proprietăţile funcţionale ale proteinei codificate, sunt bine cunoscute în domeniu. Astfel un 13 codon pentru aminoacidul alanină, un aminoacid hidrofob, poate fi substituit printr-un codon care codifică un alt rest mai puţin hidrofob precum este glicina. La fel, un codon pentru 15 aminoacidul alanină poate fi substituit printr-un codon care codifică un rest mai hidrofob, astfel ca valina, leucina sau izoleucina. în mod similar, schimbările care conduc la substituţia 17 unui rest încărcat negativ de către altul, astfel ca acidul aspartic, de către acidul glutamic sau substituţia unui rest încărcat pozitiv de către altul, astfel ca lizina de către arginină, sunt de 19 aşteptat că produc un produs echivalent funcţional. Schimbările nucleotidelor care conduc la modificarea porţiunilor N-terminale şi C-terminale ale moleculei de proteină nu ar fi de 21 aşteptat să modifice activitatea proteinei. Fiecare dintre modificările propuse sunt în concordanţă cu rutina specialiştilor în domeniu, ca fiind determinantă a retenţiei activităţii 23 biologice a produşilor codificaţi. în plus, specialiştii în domeniu recunosc că secvenţele similare în mod substanţial, cuprinse în prezenta invenţie, sunt definite de asemenea prin 25 capacitatea lorde a hibridiza în condiţii stringente (0.1XSSC, 0,1%SDS, 65°C)cu secvenţele exemplificate aici. Fragmentele de acid nucleic similar, în mod substanţial preferate, ale 27 prezentei invenţii, sunt fragmente ale acestor acizi nucleici, ale căror secvenţe ADN sunt 80% identice cu secvenţa ADN a fragmentelor de acid nucleic raportate aici. Fragmente de 29 acid nucleic mai preferate sunt 90% identice cu secvenţa fragmentelor de acid nucleic raportate aici. Cele mai preferate fragmente de acid nucleic sunt cele 95% identice cu 31 secvenţa ADN a fragmentelor de acid nucleic, raportate aici. Procentul de identitate, utilizat aici, poate fi determinat cu precizie, prin protoclolul de aliniere a proteinei ADNSTAR, utili- 33 zând algoritmul Jotun-Hein (Hein, J.J. (1990), Meth. Enz. 183.626-645). Parametrii necesari pentru metoda Jotun-Hein pentru aliniamente multiple sunt: GAP PENALTY = 11m GAP 35 LENGTH PENALTY = 3; pentru aliniamente pereche KTUPLE 6.

Expresia "degenerarea codonului” se referă la divergenţa în codul genetic, care 37 permite variaţia secvenţei de nucleotide fără a afecta secvenţa de aminoacizi a polipeptidei codificate. în concordanţă cu aceasta, prezenta invenţie se referă la orice fragment de acid 39 nucleic care codifică toată porţiunea sau o porţiune substanţială a proteinelor SS1 sau SSb care codifică secvenţa de aminoacid, aşa cum se stabileşte în SEQ ID Nr: 5,11,12,15,16 41 şi 20. Specialistul în domeniu este conştient de "codon-bias” manifestat de o celulă gazdă în codonii nucleotidelor, pentru a specifica un aminoacid dat. De aceea, când se sintetizează 43 o genă pentru expresia îmbunătăţită într-o celulă gazdă, este de dorit să se desemneze gena, astfel încât frecvenţa căilor de utilizare a codonului să fie frecvenţa de utilizare a 45 codonului preferat al celulei gazdă.

Termenul "genă" se referă aici la fragmentul de acid nucleic care exprimă o proteină 47 specifică, incluzând secvenţele regulatoare care preced (secvenţele 5' care nu codifică) şi 11 RO 120921 Β1 secvenţa următoare care codifică (secvenţele 3' care nu codifică). Expresia "genă nativă" se referă la o genă aşa cum există aceasta în natură, cu propriile sale secvenţe regulatoare. Expresia "genă himerică" se referă la orice genă care nu este o genă nativă, care cuprinde secvenţe regulatoare şi secvenţe codificatoare, care nu se găsesc împreună în natură. în concordanţă cu aceasta, o genă himerică poate cuprinde secvenţe regulatoare şi secvenţe codificatoare, care sunt derivate din diferite surse, sau secvenţe regulatoare şi secvenţe codificatoare ce sunt derivate din anumite surse, dar care sunt aranjate într-o manieră diferită decât cea găsită în natură.

Expresia "genă endogenă" se referă aici la o genă nativă în poziţia sa naturală în genomul unui organism. Termenul genă "străină" se referă la o genă care nu se găseşte în mod normal în organismul gazdă, dar care este introdusă în organismul gazdă prin transfer de gene. Genele străine pot cuprinde gena nativă inserată într-un organism care nu este nativ sau pot cuprinde gene himerice. Termenul "transgenă " este o genă care a fost introdusă într-un genom printr-o procedură de transformare.

Expresia "secvenţă codificatoare" se referă la o secvenţă ADN care codifică o secvenţă specifică de aminoacizi. Expresiile "codon de iniţiere" şi "codon de terminare" se referă la o unitate de trei nucleotide adiacente într-o secvenţă codificatoare care specifică iniţierea şi respectiv terminarea catenei în sinteza proteinei (translaţia ARNm). Expresia "cadru deschis de citire" se referă la secvenţa de aminoacizi codificată între codonii de iniţiere şi cei de terminare a translaţiei a unei secvenţe codificatoare. Expresia "secvenţe regulatoare" se referă la secvenţe de nucleotide localizate în amonte (secvenţe 5' care nu codifică), în interiorul sau în avalul (secvenţe 3' care nu codifică) unei secvenţe codificatoare şi care influenţează transcriptea, procesarea sau stabilitatea ARN, sau translaţia genelor asociate codificatoare. Secvenţele regulatoare pot include promotori, secvenţe lider de translaţie, introni şi secvenţe de recunoaştere a poliadenilării.

Termenul "promotor" se referă la o secvenţă ADN capabilă de a controla expresia unei secvenţe codificatoare sau a ARN funcţional. în general, o secvenţă codificatoare este localizată în poziţia 3' la o secvenţă promotor. Secvenţa promotor constă din elemente în amonte, la distanţă mai depărtată sau mai apropiată, ultimile elemente referindu-se adesea la o îmbunătăţire. în concordanţă cu acestea, termenul "îmbunătăţire" este o secvenţă ADN care poate stimula activitatea promotorului şi care poate fi un element ereditar al promotorului sau un element heterolog inserat pentru a îmbunătăţi nivelul sau specificitatea de ţesut a unui promotor. Promotorii pot fi derivaţi în întregime de la o genă nativă sau pot fi compuşi din elemente diferite derivate de la promotorii găsiţi în natură sau pot chiar să cuprindă segmente de ADN de sinteză. Se va subînţelege de către specialiştii în domeniu că diferiţi promotori pot direcţiona expresia unei gene în tipuri diferite de ţesuturi sau celule sau în etape diferite ale dezvoltării sau în răspunsul la diferite condiţii de mediu. Promotorii care determină ca o genă să fie exprimată în cele mai multe tipuri de celule şi la cele mai multe momente sunt denumiţi ca "promotori constitutivi". Noi promotori de tipuri diferite, folositori în celulele plantelor, sunt descoperiţi în mod constant; numeroase exemple pot fi găsite în lucrarea lui Okamuro şi Goldberg (1989), Biochem. Plants 15:1-82. în plus, este recunoscut faptul că, deşi în cele mai multe cazuri nu au fost definite complet limitele exacte ale secvenţelor regulatoare, fragmentele de ADN de diferite lungimi pot avea activitate promotoare identică.

Expresia "secvenţă conducătoare a translaţiei" se referă la secvenţa de ADN localizată între secvenţa pormotoare a unei gene şi secvenţa codificatoare. Secvenţa conducătoare a translaţiei este prezentă în ARNm procesat în întregime, în amonte pe secvenţa de 12 RO 120921 Β1 iniţiere a translaţiei. Secvenţa conducătoare a translaţiei poate afecta procesarea 1 transcriptului primar în ARNm, stabilitatea ARNm sau eficienţa translaţiei. Exemple de secvenţe conducătoare de translaţie sunt descrise de Turner, R. şi Foster, G.D (1995) în 3 Molecular Biotechnology 3:225.

Expresia "secvenţe 3' care nu codifică" se referă la secvenţe ADN localizate în aval, 5 pe o secvenţă codificatoare, şi include secvenţe de recunoaştere a poliadenilării şi alte secvenţe codificatoare de semnale regulatoare capabile de a afecta procesarea ARNm sau a 7 expresiei genei. Semnalul de poliadenilare este caracterizat în mod uzual prin afectarea adi-ţiei acidului poliadenilic la capătul 3' al precursorului ARNm. Utilizarea diferitelor secvenţe 9 3' care nu codifică este exemplificată de către Ingelbrecht şi colab. (1989), Plant Ce/M :671-680. 11

Expresia "transcript ARN” se referă la un produs care rezultă din ARN, prin transcrierea unei secvenţe ADN catalizată de polimerază. Când transcriptul ARN este o 13 copie perfect complementară a secvenţei ADN se face referire ca la un transcript primar sau acesta poate fi o secvenţă ARN derivată din procesul posttranscripţional al transcriptului 15 primar şi atunci se face referire ca la un ARN matur. Expresia "mesager ARN (ARNm)" se referă la un ARN care este fără introni şi care poate fi translatat în proteină de către celulă. 17

Termenul "ADNc" se referă la un ADN dublu helical care este complementar cu, şi derivat de la ARNm. Termenul ARN "sens” se referă la un transcript ARN care include ARNm şi 19 astfel poate fi translatat într-o proteină de către celulă. Termenul ARN "antisens" se referă la un ARN transcript care este complementar cu toţi sau cu o parte dintr-un transcript primar 21 ţintă sau cu un ARNm ţintă şi care blochează expresia unei gene ţintă (US 5107065). Complementaritatea unui ARN antisens poate fi cu orice parte a transcriptului specific genei, 23 de exemplu, la secvenţa 5' care nu codifică, secvenţa 3' care nu codifică, introni sau secvenţe codificatoare. Expresia "ARN funcţional" se referă la ARN antisens, la ARN 25 ribozomal sau la alţi ARN care nu sunt încă translataţi şi care au un efect în procesul celular.

Termenul "legat operabil" se referă la asocierea secvenţelor de acid nucleic pe un 27 singur fragment de acid nucleic, astfel încât funcţia unuia este afectată de către celălalt. De exemplu, un promotor este legat operabil de o secvenţă codificatoare, când este capabil de 29 a afecta expresia acestei secvenţe codificatoare (adică secvenţa codificatoare este sub controlul transcripteonal al promotorului). Secvenţele codificatoare pot fi legate operabil la 31 secvenţele regulatoare cu orientare sens sau antisens.

Termenul "expresie", aşa cum este utilizat aici, se referă la transcriptea şi acumularea 33 stabilă a (ARNm) sens sau ARN antisens derivaţi de la fragmentul de acid nucleic al invenţiei. Expresia se poate referi de asemenea la translaţia ARNm într-o polipeptidă. 35

Expresia "inhibitori antisens" se referă la producerea transcriptelor antisens ARN capabile de supresarea expresiei proteinei ţintă. Termenul "supraexpresie" se referă la 37 producerea unui produs genă într-un organism transgenic care excede nivelurile producerii în organisme normale sau netransformate. Termenul "cosupresare" se referă la un fenomen 39 în plante prin care genele străine şi genele endogene sunt silenţioase prin introducerea de suficiente transgene omoloage. Mecanismul(mele) de inactivare ale genei nu sunt bine 41 cunoscute, dar pot decurge fie prin blocarea transcripteei, fie prin inhibarea acumulării de ARNm. De exemplu, US 5231020 descrie producerea de transcripte ARN sens capabile de 43 a supresa expresia genelor străine sau endogene identice sau similare în mod esenţial.

Expresia "niveluri modificate" se referă la producerea de produs (şi) genă(e) în 45 organisme transgenice, în cantităţi sau în proporţii care diferă de cele din organisme normale sau din organisme netransformate. 47 13 RO 120921 Β1

Termenul "transformare" se referă la transferul unui fragment de acid nucleic geno-mul organismului gazdă care rezultă într-o ereditate stabilă din punct de vedere genetic. Organismele gazdă conţinând fragmente de acizi nucleici transformate sunt desemnate ca organisme "transgenice". Exemple de metode de transformare a plantelor includ transformarea mediată de Agrobacterium (De Blaere şi colab. (1987) Meth. Enzymoi 143:277) şi tehnologii de transformare cu particule accelerate sau tehnologie de transformare "genă-armă" (Klein şi colab. (1987) Nature (London) 327:70-73; US 4945050).

Tehnicile standard cu ADN recombinant şi cea de donare moleculară, utilizate aici, sunt bine cunoscute specialiştilor în domeniu şi sunt descrise în întregime de Sambrook, J. Fritsch, F.F. şi Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (aici "Maniatis”).

Termenul "pastifiere" se referă la o schimbare fizică ireversibilă în granulele de amidon sau într-o suspensie de granule de amidon, caracterizată prin umflarea şi hidratarea granulelor, o rapidă creştere a viscozităţii suspensiei şi formarea unui sol din suspensie. Această schimbare este cunoscută de asemenea ca încălzire sau gelatinizare. Prescurtarea "SNU" se referă la unitatea numărului de agitare, aproximativ egal cu 10 centipoise, care este o măsură a vscozităţii. Pentru conversia unităţilor SI (pascal secunde) se înmulţeşte valoarea în centipoise cu 1000, adică 1PaSec=1000cP. Deci 1SNU=0,01PaSec. Termenul "sol" se referă la un sistem coloidal fluid. Termenul "viscozitate" este o măsurătoare a fricţiunilor interne ale unui fluid care poate fi conceput ca având consistenţa sau grosimea unui fluid.

Invenţia se referă la obţinerea plantelor care poartă boabe transgenice, în care expresia genelor care codifică enzimele implicate în sinteza amidonului, în mod specific formarea polimerului amidon (sintazele amidonului), este modulată pentru a efectua o schimbare în distribuţia catenei ramificate a amilopectinei, proporţia relativă a amilozei la amilopectină sau gradul de polimerizare al componentei amiloză a amidonului. Asemenea modificări ale structurii fine a amidonului conduc la modificări ale proprietăţilor fizice ale amidonului izolat din culturile de boabe transgenice. Această modificare în structura fină a amidonului va conduce la generarea unui nou amidon, care va poseda proprietăţi care sunt benefice în aplicaţiile din alimentaţie şi cele industriale.

Preferate printre aceste gene sunt genele care codifică sintaza amidonului monocot, altele decât GBSSI, a căror donare a fost descrisă mai sus. Aceste gene pot fi izolate prin tehnici de rutină folosite de specialiştii în domeniu pentru izolarea genelor când secvenţa de nucleotide a genei dorite este cunoscută sau când este cunoscută secvenţa unei gene omoloage de la alt organism. Informaţia referitoare la secvenţele genei dorite poate fi utilizată pentru a prepara probe de oligonucleotide pentru identificarea şi izolarea întregii gene a enzimelor sintazei amidonului dintr-o colecţie genetică adecvată. Această colecţie poate fi o colecţie genomică în care regiunea care codifică poate fi conţinută într-un singur fragment ADN sau poate fi conţinută pe anumite fragmente ADN distincte. în plus, doi sau mai mulţi exoni care codifică enzima sintazei amidonului poate fi separată de unul sau mai mulţi introni. în mod alternativ, colecţia poate fi o colecţie ADNc, în care probabilitatea de izolare a clonei ADNc cuprinzând întreaga regiune codificatoare ca o secvenţă Învecinată este mai mare. în fiecare caz, clona(nele) adecvate pot fi identificate prin hibridizare ADN-ADN cu sonde care corespund la una sau mai multe porţiuni ale genelor dorite. în mod alternativ, primerii oligonucleotidelor pot fi preparaţi şi folosiţi ca primeri PCR, în scopul de a amplifica şi ulterior de a izola toată regiunea sau o parte din regiunea care codifică enzima sintazei amidonului, din ADN genomic sau din colecţiile de genomuri sau de ADNc genomic descrise mai sus. 14 RO 120921 Β1

Pentru a măsura activitatea enzimei sintazei amidonului, pot fi utilizate anumite teste 1 diferite. Activitatea poate fi testată utilizând o varietate de metode care evaluează încorporarea ADP-glucozei radiomarcate (14C-Glucoză) într-un polimer insolubil în alcool 3 (Pollock şi Priess (1980) Arch. Biochem. Biphys. 204,578-588; Keeling şi colab. (1994) Au st. J. Plani Physiol. 21:807-827; Fontaine şi colab. 1993, J. Biol. Chem. 268:16223-16230). 5

Metoda lui Keeling şi colab. este caracteristică. Ţesutul endospermic din boabele de porumb în dezvoltare este disecat, liofilizat şi măcinat în azot lichid. Se prepară un extract prin sus- 7 pendarea a 100 mg de ţesut măcinat în 2 ml tampon (50 mM Hepes, pH 7,5, 5mM MgCI2, 1mM DTT) şi se omogenizează cu un omogenizator mecanic. Omogenizatul se centrifu- 9 ghează la 30000xg şi supematantul este testat pentru activitatea sintazei amidonului solubil.

Pe scurt, activitatea sintazei solubile este testată în tuburi de 1,5 ml cu 25 ml glicogen din 11 ficat de iepure (2 mg) şi 100 ml tampon (200 mM Bicine, 9mM EDTA, 50mM KCI şi 20 mM glutation redus, pH 8,3). Se adaugă 50 ml extract solubil şi preincubat timp de 2 min. Testul 13 este început prin adăugarea a 25 ml de ADP-Glucoză 8,0 mM (14C, 444 dpm nmol-1) şi se lasă 10 min înainte de adăugarea a 100 ml de 0,25 M NaOH. Se precipită glucanul prin 15 adăugare de 1,0 ml metanol, congelare în gheaţă, timp de 5 min şi centrifugare. Glucanul este resolubilizat în NaOH 0,1 M şi precipitat a doua oară cu metanol. Precipitatul este apoi 17 gelatinizat prin încălzire, înainte de adăugarea unui amestec de scintilare şi apoi măsurarea radioactivităţii într-un contor de scintilaţie. 19

Pentru a modifica structura fină a amidonului din porumb, este construită o genă himerică, în care expresia genei care codifică enzima sintazei amidonului este sub controlul 21 elementelor regulatoare adecvate pentru a exprima gena 1) în ţesuturile dorite ale plantei, 2) în etapele de dezvoltare care furnizează maximum de efect dorit şi 3) la niveluri ale 23 expresiei genei care conduc la modificarea funcţiei enzimei sintazei amidonului, astfel încât expresia afectează o schimbare măsurabilă şi semnificativă în structura fină a amidonului. 25 Expresia genelor străine în plante este bine stabilită (Klein şi colab. (1987) Nature (London) 327:70-73 şi De Blaere şi colab. (1987) Meth. Enzymol. 143:277-291). Nivelul adecvat pentru 27 expresia genelor sens şi antisens ale sintazei amidonului în porumb pot să necesite utilizarea diferitelor gene himerice utilizând diferite elemente regulatoare. în plus, modularea 29 eficientă a expresiei genei endogene a sintazei amidonului prin cosupresie sau prin supresie antisens poate să necesite construcţia genelor himerice care codifică diferite regiuni ale 31 secvenţelor sens şi antisens ale sintazei amidonului. Bine cunoscuta variabilitate a tehnicilor de cosupresie şi a celei antisens indică faptul că, chiar dacă se utilizează construcţii genetice 33 diferite, trebuie să se selecteze multe plante, cu scopul de a identifica pe cele cu fenotip dorit. 35

Promotorii utilizaţi pentru a conduce expresia genei în plantele transgenice pot fi derivaţi de la multe surse atât de lungi, încât promotorul(ii) ales (şi) să aibă activitate 37 transcripţională suficientă, pentru a realiza invenţia prin expresia ARNm translatabil, a ARNm adecvat pentru cosupresie sau prin expresia ARN antisens în ţesutul gazdă dorit. De 39 exemplu, promotorii de expresie într-un sortiment bogat de organe de plante, care includ pe aceia care se referă la transcriptul 19S şi transcriptul 35S în virusul mozaicului conopidei 41 (Odell şi colab. (1985) Nature 313:810-812; Huli şi colab. (1987) Virology 86:482-493), subunitatea mică a ribulozo-1,5-bisfosfat carboxilazei (Morelli şi colab. (1985) Nature 43 315:200-204; Broglie şi colab. (1984) Science 224:838-843; Hererra-Estrella şi colab. (1984)

Nature 310:115-120; Coruzzi şi colab. (1984) EMBO J. 3:1671 -1679; Faciotti şi colab. (1985) 45

Bio/Technology 3:241) şi proteina care leagă clorofila a/b (Lamppa şi colab. (1986) Nature 316:750-751). 47 în funcţie de aplicaţie, este de dorit să se selecteze promotorii care sunt specifici pentru expresia în unul sau mai multe organe din plante. Exemplele includ promotori ai 49 15 RO 120921 Β1 subunităţii mici a ribulozo-1,5- bisfosfat carboxilazei care sunt induşi în condiţii de luminozitate, dacă expresia este dorită în organele fotosintetice sau promotori activi în special în seminţe.

Promotori preferaţi sunt aceia care permit expresia în mod specific în seminţe. Aceasta poate fi folositor, în special, dacă seminţele reprezintă localizare primară a acumulărilor de amidon pe termen lung. în plus, expresia specifică pentru seminţe poate evita orice efecte cu potenţial dăunător, pe care modularea enzimei sintazei amidonului o poate avea asupra organelor fără seminţe. Exemple de promotori specifici pentru seminţe includ, dar nu sunt limitate la promotorii proteinelor de depozit din seminţe. Expresia proteinelor de depozit în seminţe este strict reglată în plante, fiind exprimată aproape exclusiv în seminţe, într-o manieră specifică pentru organ şi într-o manieră specifică pentru etapă (Higgins şi colab. (1984) Ann. Rev. Plant Physiol. 35:191-221; Goldberg şi colab. (1989) Cell 56:149-160; Thompson şi colab. (1989) BioEssays 10:108-113). în plus, diferite proteine de depozit din seminţe pot fi exprimate în etape diferite în dezvoltarea seminţelor. Există numeroase exemple de expresie specifică pentru seminţe, a genelor proteinei de depozit din seminţe ale plantelor transeenice. Acestea includ gene din plante monocotiledonate, astfel ca orz β- hor-dein (Marris şi colab. (1988) Plant Mol. Biol. 10:359-366) şi gluteina din grâu (Colot şi colab. (1987) EMBO J. 6:3559-3564). în plus, promotorii genelor, specifici pentru seminţe, legaţi operabil la secvenţele codificatoare în mod heterolog, în construcţiile genelor himerice, îşi menţin de asemenea modelul de expresie temporal şi spaţial în plantele transgenice (Goldberg şi colab. (1989) Cell56:149-160). Astfel de exemple includ fie legarea promotorilor faseolinei, fie a promotorilor albuminei 2S din Arabidopsis la secvenţa codificatoare a albu-minei 2S din nuca de Brazilia şi exprimă astfel de combinaţii în tutun, Arabidopsis, sau Brassica napus (Altenbach şi colab. (1989) Plant Mol. Biol. 13:513-522, Altenbach şi colab. (1992) Plant Mol. Biol. 18:235-245; De Clercq şi colab. (1990) Plant Physiol. 94:970-979), utilizarea promotorilor lectinei din fasole şi ai b-faseolinei pentru a exprima luciferaza (Riggs şi colab. (1989) Plant Sci. 63:41-61), şi a promotorilor gluteinei din grâu, pentru a exprima cloramfenicol acetil transferaza (Colot şi colab. (1987) EMBO J. 6:3559-3564).

De o utilizare particulară în expresia fragmentului(elor) de acid nucleic conform invenţiei vor fi promotorii pentru anumite gene ale proteinelor de depozit din seminţe de porumb, caracterizate în mod extensiv, astfel ca promotorii specifici pentru endosperm din gena zein de 10kD (Kirihara şi colab. (1988) Gene 71:359-370), gena zein de 15kD (Hoffman şi colab. (1987) EMBO J. 6:3213-3221; Schernthaner şi colab. (1988) EMBO J. 7:1249-1253; Williamson şi colab. Plant Physiol. (1987) 88:1002-1007), gena zein de 27kD (Prat şi colab. (1987) Gene 52:51 -49; Gallard şi colab. (1988) Plant Sci. 54:211 -281), şi gena zein de 19kD (Marks şi colab. (1985) J. Biol. Chem. 260:16451-16459). Activităţile relativ transcripţionale ale acestor promotori în porumb au fost raportate (Kodrzyck şi colab. (1989) Plant Cell 1:105-114), furnizând o bază pentru alegerea unui promotor pentru utilizarea în construcţii de gene himerice de porumb. în plus, promotorii care conduc expresia enzimelor care codifică gene implicate în biosinteza amidonului potfi utilizaţi în practica prezentei invenţii. Aceştia includ, dar nu sunt limitaţi la secvenţele 5' regulatoare ale sintazei sucrozei (Yang, N.S. şi Russell, D (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-4148), genele sintazei I a amidonului waxy sau a amidonului legat în granule (Unger şi colab. (1991) Plant Physiol. 96:124), genele sh2 (Bhave şi colab. (1990) Plant Cell 2:581-588) şi bt2 (Bae şi colab. (1990), Maydica 35:317-322) ale căror produşi constituie enzima ADP-glucoza pirofosforilază. Specialiştii în domeniu recunosc că exemplele anterioare pot fi acum suplimentate prin pletora genelor biosintetice ale amidonului şi a altor gene specifice pentru seminţe izolate utilizând tehnici moderne genomice, care furnizează o sursă aproape nelimitată de promotori specifici pentru seminţe, care pot fi utilizaţi pentru scopurile conform invenţiei. 16 RO 120921 Β1

Acolo unde este necesar, pot fi utilizate clone ADNc, pentru a izola clonele genomice 1 care conţin secvenţele regulatoare, care prezintă interes. Expresia de la oricare dintre aceşti promotori poate fi crescută prin utilizarea de secvenţe de amplificare care includ pe acelea 3 găsite în secvenţele intron (vezi, de exemplu, Callis şi colab. (1987) Genes Dev. 1:1183-1200; Maas şi colab. (1991) Plant Mol. Biol. 16:199-207; Luehrsen, K.R. şi Walbot. V. (1991), 5

Mol. Gen. Genei. 225:81-93, Oard şi colab. (1989) Plant Cell Rep. 8:156-160).

Orice regiune 3' care nu codifică, capabilă de a furniza un semnal de poliadenilare 7 şi alte secvenţe regulatoare care pot fi cerute pentru o expresie adecvată, pot fi utilizate pentru realizarea invenţiei. Aceasta va include capătul 3' din oricare proteină de depozit 9 precum sunt capătul 3' al genelor zein de 10kD, 15kD, 27kD şi a genei alfa zein, capătul 3' al genei faseolinei din fasole, capătul 3' al genei β-congticininei din soia, capătul 3' din genele 11 virale precum sunt capătul 3’ din transcriptele de 35S şi 19S ale virusului mozaicului conopidei şi capătul 3' din genele de sinteză a opiumului, capătul 3' al genelor care codifică 13 ribulozo-1,5-bisfosfat carboxilaza sau proteina de legare a clorofilei a/b sau secvenţele de la capătul 3' de la orice genă, astfel încât secvenţa folosită să furnizeze informaţii regulatoare 15 necesare în secvenţa sa de acid nucleic, pentru a conduce la expresia adecvată a combinaţiei regiunii promotor/codificatoare, la care este operabil legată. Există exemple 17 numeroase în domeniu, care indică utilitatea diferitelor regiuni 3’ care nu codifică (de exemplu, vezi, Ingelbrecht şi colab. (1989) Plant Cell 1:671-680). Diferite metode de 19 introducere a unei secvenţe ADN (de exemplu, de transformare) în celule eucariote ale plantelor mai mari sunt disponibile specialiştilor în domeniu (vezi, publicaţiile EPO 21 0295959A2 şi 0138341A1). Asemenea metode includ bombardament balistic cu viteză mare, cu particule de metal acoperite cu construcţii de acid nucleic (vezi, Klein şi colab. 23 (1987), Nature (London) 327:70-73; şi vezi US 4945050) şi în aceeaşi măsură includ pe acelea bazate pe transformare pe bază de plasmide Ti şi Ri ale speciei Agrobacterium, în 25 particular, tipul binar al acestor vectori. Vectorii derivaţi de la Ti transformă o mare varietate de plante mari, incluzând plante dicotiledonate, astfel ca soia, bumbacul şi rapiţa (Pacciotti 27 şi colab. (1985) Bio/Technology 3:241; Byrne şi colab. (1987) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 8:3; Sukhapinda şi colab. (1987) Plant Mol. Biol. 8:209-216; Lorz şi colab. (1985) 29

Mol. Gen. Genet. 199:178-182; Potrykus şi colab. (1985)Mol. Gen. Genet. 199:183-188; Qu, R. şi colab. (1996) Dev. Bio-Plant 32:233-240; Vasil, V şi colab. (1993) Bio/Technology 31 11:1553-1558 şi mai recent monocotiledonate, astfel ca orez şi porumb Hiei, Y şi colab. (1994), Plant J. 6:271-282. 33

Alte metode de transformare sunt disponibile specialiştilor în domeniu, astfel ca absorbţia construcţiilor ADN străine (EPO 0295959A2) şi tehnicile de electroporare (Fromm 35 şi colab. (1986) Nature (London) 319:791-793). Odată transformate, celulele pot fi regenerate în plante mature de către specialiştii în domeniu. Relevante, de asemenea, sunt 37 metodele descrise recent, de introducere a fragmentelor de acid nucleic în culturi importante din punct de vedere comercial, astfel ca cele de seminţe de răpită (De Block (1989) Plant 39 Physiol. 91:694-701), floarea soarelui (Everettşi colab. (1987) Bio/Technology 5:1201-1204), soia (McCabe şi colab. (1988) Bio/Technology 6:923-926; Hinchee şi colab. (1988) 41

Bio/Technology 6:915-922; Chee şi colab. (1989) Plant Physiol. 91:1212-1218; Christou şi colab. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:7500-7504; EPO 0301749A2), orez (Qu, R. şi 43 colab. (1996), Dev. Bio-Plant 32:233-240; Hie Y şi colab. (1994), Plant J. 6:271-282), grâu (Vasel, V. şi colab. (1993) Bio/Technology 11:1553-1558) şi porumb (Gordon-Kamm şi colab. 45 (1990) Plant Cell 2:603-618; Fromm şi colab. (1990) Bio/Technology 8:833-839).

Un specialist în domeniu este familiar cu alte mijloace de producere a plantelor de 47 porumb transgenic, care includ introducerea de ADN în protoplaşti şi regenerarea plantelor 17 RO 120921 Β1 din protoplaştii menţionaţi (Omirulleh şi colab. (1993) Plant Mol. Biol. 21:415-423), electroporarea ţesuturilor intacte (D'Halluin şi colab. (1992) Plant Cell4:1495-1505; Laursen şi colab. (1994) Plant Mol. Biol. 24:51-61), transformarea fibrei celulelor de porumb mediată de carbură de siliciu (Kaepller şi colab. (1992)77?eor. Appl. Genet. 84:560-566; Frame şi colab. (1994) Plant J. 6:941-948). în plus faţă de metoda bombardamentului celulelor de calus de porumb, descrise mai sus, un specialist în domeniu este familiarizat cu bombardamentul particulelor de culturi de porumb scutelar sau de culturi sub formă de suspensii, pentru a da plante transgenice fertile (Koziel şi colab. (1993) Bio/Technology 11:194-200; Walters şi colab. (1992) Plant Mol. Biol. 18:189-200).

Specialistul în domeniu va şti că din considerente speciale sunt asociate cu utilizarea de tehnologii antisens sau de cosupresie, cu scopul de a reduce expresia genelor particulare. US 5190931, 5107065 şi 5283323 descriu fezabilitatea acestor tehnici. Odată ce plantele sunt obţinute printr-una din metodele descrise mai sus, va fi necesar să se testeze transgenicele individuale, pentru acelea care indică cele mai eficiente fenotipuri dorite. Este bine cunoscut specialiştilor în domeniu că plantele transgenice individuale, care poartă acelaşi construct, pot diferi în nivelurile de expresie; acest fenomen este în mod obişnuit denumit ca "efect de poziţie". De exemplu, când constructul în cauză este desemnat pentru a exprima niveluri mai mari ale genei de interes, plantele individuale vor varia în ceea ce priveşte cantitatea de proteină produsă, şi în acest mod în activitatea enzimei; acesta în schimb va afecta fenotipul. Astfel, în utilizarea acestor tehnici, eficienţa lor într-o plantă transgenică individuală nu poate fi prezisă, dar se vor obţine populaţii individuale mari transgenice cu expresia genei supresate. în fiecare caz, cu scopul de a scuti timp, specialiştii în domeniu vor face constructe genetice multiple, care conţin una sau mai multe părţi diferite din gena ce va fi supresată, chiar dacă domeniul nu indică o metodă pentru a prezice care va fi cea mai eficientă pentru o genă particulară. în plus, chiar cele mai eficiente constructe vor da un fenotip eficient de supresie, numai într-o fracţie dintr-o linie transgenică individuală izolată. De exemplu, WO 93/11245 şi 94/11516 descriu că atunci când s-a încercat supresia expresiei genelor desaturaze ale acidului gras în canola, s-a obţinut de fapt supresie în mai puţin de 1% din liniile testate. La alte specii, procentul este uneori mai mare, dar în nici un caz procentul nu atinge 100%. Aceasta nu ar trebui interpretată ca o limitare a prezentei invenţii, dar într-adevăr problemele practice vor fi apreciate şi anticipate de specialiştii în domeniu. în concordanţă cu aceasta, specialiştii în domeniu vor dezvolta metode pentru selectarea unui număr mare de tranformanţi. Natura acestor selecţii va fi în general aleasă pe considerente practice şi nu este parte inerentă a invenţiei. în cazul de faţă, de exemplu, se poate selecta căutând schimbările în fenotipul de amidon, utilizând cromatografia pentru a determina proporţiile de amiloză la amilopectină, distribuţia catenei ramificate a amilo-pectinei, gradul de polimerizare Analiza Visco Rapidă, o tehnică industrială standard pentru a măsura funcţionalitatea hidrocoloiziloralimentari, în particulara amidonurilor (aşa cum este dat în exemple) sau alte semnificaţii. Se pot de asemenea utiliza anticorpi specifici pentru proteina codificată prin gene care sunt supresate sau se pot stabili teste care măsoară în mod specific activitatea enzimatică. O metodă preferată va fi una care permite unui mare număr de probe să fie procesate rapid, chiar dacă va fi de aşteptat ca majoritatea de probe să fie negative.

Plantele care sunt identificate ca având structura fină a amidonului modificată în materialul genetic unic, prezent în boabe, furnizează avantaje faţă de liniile de culturi tradiţionale de cereale şi de mutanţii de amidon cunoscuţi. Utilizarea unor linii ale prezentei invenţii cu expresia inhibată a izoformelorde SS în culturile de cereale care se reproduc furnizează o trăsătură dominantă care poate simplifica şi face mai rapid procesul de reproducere. Pot fi utilizaţi mutanţii cunoscuţi ai amidonului, dar ei sunt adesea recesivi şi 18 RO 120921 Β1 prezintă mai multe complicaţii. în plus, pentru culturile de cereale, astfel ca grâu, există o 1 limită a numărului de mutanţi cunoscuţi. în plus, utilizarea tehnicilor antisens şi de cosupresie, pentru a inhiba izoformele SS, conduce la niveluri variabile ale inhibiţiei, datorită 3 efectelor pozitive cromozomiale. Nivelurile variabile ale activităţii SS care rezultă, vor conduce la un domeniu larg de fenotipuri, care nu sunt posibile utilizând mutanţi tradiţionali 5 care pot rezulta într-o serie limitată de dozaj a unei alele mutante în endospermul culturilor de cereale. în plus, structuri fine de amidon unice, potenţial valoroase, pot rezulta din 7 încrucişarea de noi linii dezvoltate de porumb cu activităţi SS modificate cu fiecare alţi mutanţi şi/sau cunoscuţi precum wx sau ae. 9

Exemple

Prezenta invenţie este în plus definită în exemplele care urmează. Se va subînţelege 11 că exemplele sunt date numai pentru ilustrare şi prezenta invenţie nu este limitată la utilizările descrise în exemple. Valorile temperaturii sunt redate în grade celsius şi valorile 13 procentuale sunt redate în greutate pe volum, acolo unde nu există alte precizări. Prezenta invenţie poate fi utilizată pentru a genera culturi de cereale transgenice, al căror amidon 15 modificat poate fi utilizat în orice scop, în domenii în care proprietăţile acestuia sunt folositoare, astfel ca în alimente, hârtie, plastice, adezivi sau vopsele, fără însă ca să fie 17 limitate la acestea. Din discuţiile de mai sus şi din următoarele exemple, un specialist în domeniu poate aprecia, fără a se îndepărta de spiritul şi întinderea acestei invenţii, că se vor 19 putea face diferite schimbări şi modificări ale invenţiei, pentru a o putea adapta diferitelor utilizări şi condiţii. Toate aceste utilizări se intenţionează să fie în cadrul întinderii acordate 21 de revendicări.

Exemplul 1. Preparare de porumb transgenic exprimând un construct antisens al 23 sintazei amidonului de porumb.

Izolarea clonelor sintazei I a amidonului de porumb. 25

Secvenţa ADNc a unei sintaze a amidonului solubil provenit de la orez (Baba T, şi colab. (1993) Plant Physiol. 103:565-573) este utilizată pentru a genera sonde ADN pentru 27 detecţia secvenţelor omoloage ale sintazei amidonului în porumb. Se sintetizează oligo-nucleotidele BE62 (SEQ ID NR: 1) şi BE61 (SEQ ID NR: 2) într-un Sintetizator pentru Oligo- 29 nucleotide de tip Beckman Oligo 1000™. Aceşti primeri cuprind nucleotidele (nt) 1600-1619 şi respectiv 1826 -1808 din secvenţa de orez publicată. 31 5'- AAGCTTGAATTCCACAGAATCAGGGTACAGG-3’ [SEQ ID NR: 1] 33 5'- GAAGGAACTGGCACTAGACTGG-3' [SEQ ID NR: 2] 35

Perechea de primeri este utilizată pentru a amplifica un fragment ADN de 429 bp din ADN genomic din orez, utilizând condiţii standard PCR, specificate în trusa GeneAmp® PCR 37 (Perkin Elmer). Amplificarea este condusă 30 de cicluri care constau din 1 min la 94°C, 2 min la 55°C şi 3 min la 72°C, urmat de o prelungire de 7 min la 72°C, după ultimul ciclu. Analiza 39 secvenţei de nucleotide indică faptul că fragmentul amplificat (SSI) conţine secvenţa aşteptată ADNc şi în aceeaşi măsură un intron de 124 bp urmat de nt 1678 şi un intron de 81 bp 41 urmat de nt 1788 din secvenţa publicată. Fragmentul ADN este marcat prin translaţie în crestătură şi utilizat pentru a sonda spoturile Northern din totalul de ARN din miezurile de 43 porumb care se dezvoltă. Este detectată prezenţa unui transcript de 2,6 kb de porumb mai devreme de 10 zile după polenizarea (DAP) şi atingerea nivelului maxim la 22 DAP. 45 Fragmentul SS1 din orez este desemnat să conţină 2 regiuni omoloage de secvenţe găsite de a fi comune în amidonul din plante şi în amidonul bacterian sau în sintazele glicogenului 47 (Baba T. şi colab. (1993) Plant Physiol. 103:565-573 ). Un al doilea fragment al sintazei 19 RO 120921 Β1 amidonului solubil (SS2), care lipseşte din aceste regiuni ale conservării de aminoacizi, se obţine prin amplificarea PCR de la ADN din orez, utilizând o pereche de primeri care cuprinde nt 1083-1103 (SS7; SEQID NR: 3) şi nt 1440-1459 (SS8; SEQID NR: 4) din ADNc. 5'- GGATCCGAATTCTCCTTTCTCAGCAAACGG-3' [SEQ ID NR: 3] 5’- AAGCTTGAATTCCTGGGATTGCCACCTGAATTG-3' [SEQ ID NR: 4]

Se obţine un fragment ADN de 900 bp, conţinând în mod aparent unul sau mai mulţi introni. Când este utilizat ca o sondă de hidridizare pe spoturile din ARN total din porumb, acest fragment a detectat un transcript cu dimensiuni similare (2,7 kb), al cărui profil de expresie se potriveşte cu cel observat în sonda SS1. Fragmentul SS2 este apoi utilizat pentru a testa o colecţie ADNc din endospermul de porumb 19 DAP, pentru secvenţele omoloage cu cele ale sintazei amidonului solubil. O colecţie ADNc de porumb se construieşte prin tehnica donării (Clontech), utilizând poliA+ARN din ţesutul endospermic recoltat 19DAP. ADNc-urile sunt donate ca inserte EcoRI-Xhol în vectorul lambda-ZAPII (Stratagene). Aproximativ 120000 de unităţi formatoare din colecţia neamplificată se întind pe plăci de agar NZY şi se transferă în duplicat pe membrane de nitroceluloză (Sambrook, J. Fritsch, E. F. şi Maniatis, (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; aici "Maniatis"). ADN imobilizat se hihridizeazâ timp de 16 h la 51 °C la SS2 translatat prin crestătură (2x105 dpm/ml) în 6XSSPE, 5X Denhardt's 0,5% SDS, 100 mg/ml ADN denaturat din spermă de somon (Maniatis). Filtratele se spală de două ori cu 2X SSC, 0,1% SDS, 0,1% SDS la temperatura camerei, timp de 30 min de fiecare dată şi o dată în 1 X SSC, 0,1% SDS timp de 15 min la 50°C (Maniatis). Din această selecţie iniţială, sunt identificate probabil 38 de plăci pozitive. Dintre acestea, 24 se purifică şi se supun unei caracterizări suplimentare, prin digestie cu enzime de restricţie şi prin analiza parţială a secvenţei de nucleotidă. Sunt selectate două clone, desemnate pSS23 şi pSS31, conţinute în inserţiile cele mai lungi ADNc şi sunt caracterizate pentru mai multe detalii. Plasmida pSS31 este găsită că conţine un insert ADNc de 2,2 kb, care cuprinde ADN 5' netranslatat de 144 bp, un cadru de citire deschis de 1923 bp şi ADN 3' netranslatat de 168 bp. Plasmida pSS31 codifică astfel o copie completă a polipeptidei sintazei amidonului de porumb. Compararea secvenţei de aminoacizi deduse cu cea a sintazei amidonului solubil din orez prezintă două proteine 80% identice pe întreaga lor lungime. pSS23 conţine un insert de 1954 bp, a cărui secvenţă pe primele 1715 nucleo-tide este identică cu nt 521 la 2235 din pSS31. Totuşi insertul ADNc al pSS23 se extinde 239 bp peste capătul 3' al pSS31. Astfel pSS23 conţine o copie incompletă a polipeptidei sintazei amidonului, lipsind 126 aminoacizi la capătul terminal aminic. Secvenţa consens SSI ADNc se obţine prin compararea secvenţelor pSS23 şi pSS31 şi este indicată în SEQ ID NR: 5. Atât pSS23, cât şi pSS31 sunt utilizate pentru a genera constructele pentru modificarea expresiei acestei sintaze a amidonului în plantele de porumb.

Prepararea unui vector de expresie care codifică transcriptele antisens ale porumbului SSI.

Se utilizează clona pSS23 a sintazei amidonului, pentru a genera un construct antisens pentru supresia expresiei SSI în porumb. PSS23 este în primul rând digerată cu enzima de restricţie Pvul şi capetele 5' recesate sunt rotunjite prin reacţia cu T4 ADN polimeraza. La 10 mg de pSS23 digerată cu Pvul (în 40 ml de 10mM Tris-HCI, pH 7,5, 100mM NaCI, 10 mM MgCI2, 1mM DTT), 20 unităţi de T4 ADN polimerază şi se adaugă în final deoxinucleotid trifosfati (dNTP) la o concentraţie finală de 0,1 mM. Amestecul de reacţie 20 RO 120921 Β1 este incubat timp de 15 min la 12°C, 10 min la 75°C şi ADN-ul se purifică prin extracţie cu 1 fenol: cloroform: alcool izoamilic (25:24:1), urmat de precipitarea cu etanol. Plasmida ADN reparată este apoi incubată cu enzima de restricţie Xhol, în tamponul precizat mai sus. După 3 digestie, dNTP-urile sunt adăugate la o concentraţie finală de 50μΜ şi capetele Xhol sunt completate prin reacţia cu fragmentul Klenow de E. Coli ADN polimerază I (10 unităţi) şi cu 5 dNTP-uri, timp de 15 min la temperatura camerei. Enzima este inactivată prin incubare la 75°C, timp de 10 min şi ADN-ul cu capete rotunjite se fracţionează prin electroforeză pe gel 7 de agaroză 0,7%, cu punct de topire inferior, în 40mM Tris-acetat, pH 8,5, 1mM EDTA.

Banda (insertul) de 1,55 kb este excisă din gel şi combinată cu fragmentul de 4,9 kb de la 9 plasmida pML103 (ATCC 97366). Plasmida pML103 conţine un fragment de 1,05 kb al promotorului Sal I -Nco I de la gena zein de 27 kD de porumb şi un fragment 3' Sma I -Sal 11 I de 0,96 kb din gena zein de 10kD de porumb într-un vector pGem9Zf(+) (Promega). Plasmida pML103 se digeră cu Nco I şi Sma I, ADN digerat se tratează cu Klenow şi dNTP- 13 uri, pentru a completa proeminenţele stângi lăsate de enzimă şi fragmentul de 4,9 kb al vectorului dorit este electroforat şi izolat aşa cum s-a descris mai sus. Fragmentele 15 combinate de insert şi de vector sunt topite la 68°C şi ligate peste noapte, în mod esenţial aşa cum a descris Maniatis, ADN-ul ligat se utilizează pentru a transforma celulele XL 1 -Blue 17 de E. Coli (Epicurean Coli XL -1 Blue™; Stratagene). Transformanţii bacterieni sunt testaţi pentru prezenţa şi orientarea insertului de ADN prin digestie cu enzima de restricţie Hindlll. 19 Plasmida pSS42 este identificată din această analiză. PSS42 conţine segmentul de 1,55 kb al pSS23 (SEQ ID NR: 6) în orientare antisens faţă de fragmentul promotor al genei zein de 21 27 kD şi capătul 3' al genei zein de 10kD. Pentru a genera un construct pentru transformarea plantei, gena himerică a pSS42 este eliberată prin digestie cu BamHI şi fragmentul de 3,6 23 kb este donat la situsul BamHI al vectorului pKS17. Un derivat al vectorului pSP72 (Promega), pKS17 conţine gena higromicin B fosfotransferază (HPT) care conferă rezistenţă 25 la antibioticul higromicin. PKS17 este asamblat prin adăugarea unei gene terminator T7-promotor -HPT-T7, pentru a modifica plasmida pSP72 din care a fost ştearsă gena β- 27 lactamazei. Gena himerică a pSS42 este eliberată prin digestie cu BamHI şi fragmentul de 3,6 kb este donat la situsul BamHI al vectorului pKS17. Plasmida rezultantă care conţine 29 promotorul de 27kD zein- SSI antisens - capătul 3’ al genei zein 10kD în pKS17 este denumită pSS43 (fig. 1). 31

Transformarea porumbului cu constructul antisens SSI. 33

Embrionii imaturi de porumb sunt disecaţi din cariopsele care se dezvoltă derivate din autopolenizarea germplasmei "Hi-H" de porumb, care este selectat din F2 rezultat din 35 încrucişările selective ale porumbului A188xB73 (Armstrong şi colab. (1991), Maize Genetics Cooperation Newsletter 65:92-93). Plasma germenului (germplasma) a fost larg utilizată 37 pentru transformare, deoarece este caracterizată printr-o frecvenţă înaltă a formării căluşului de "Tip ΙΓ. Acest calus este derivat din scutela embrionului zigotic imatur excizat in vitro. 39 Căluşul de Tip II este în special capabil de a fi transformat, deoarece este friabil, proliferând rapid şi foarte embriogenic. Embrionii sunt izolaţi la 10 până la 12 zile după polenizare, când 41 aceştia au cam 1,0 la 1,5 mm lungime. Embrionii sunt introduşi cu partea axială în jos şi în contact cu mediul MS solidificat - agaroză (Murashige, T. şi Skoog, F. (1962). Physiol. Ptant. 43 15:473) suplimentat cu 1 mg/ L 2,4 -D. Embrionii sunt păstraţi la întuneric la 27°C. Căluşurile embriogenice friabile, constând din masele nediferenţiate ale celulelor cu proembrioizi 45 somatici şi embrioizi purtaţi pe structuri de susţinere, proliferează din scutela acestor embrioni imaturi. Căluşurile embriogenice, izolate din explantele primare, sunt cultivate pe un 47 mediu solidificat N6 - agaroză (Chu şi colab. (1975 ), Sci. Sin. Peking 18:659-668) suplimentat cu 1 mg/ L 2,4 -D şi sub-cultivate pe acest mediu 2 la 3 săptămâni. 49 21 RO 120921 B1

Un segment al plasmidei pML108 se utilizează cu scopul de a furniza un marker selectabil în experimentele de transformare. Această plasmidă conţine gena bar (Thompson şi colb. (1987) EMBO J. 6:2519-2523), care codifică fosfinotricin acetil transferaza (PAT). Enzima PAT conferă rezistenţă la inhibitorii erbicizi ai sintetazei glutaminei, astfel ca fosfinotricinul. Gena barîn pML108 este sub controlul promotorului 35S de la Virusul Mozaicului Conopidei (Odell şi colab. (1985) Nature 313:810-812), şi conţine regiunea 3' a genei sintazei octopinei din T-ADN a plasmidei Ti din Agrobacterium tumefaciens. Un fragment Hindlll de 2116 bp, conţinând gena himerică 35S-bar-OCS, este izolat din pML108 şi este utilizat în legătură cu ADN caracteristic, în experimentele de transformare a plantelor.

Metoda bombardamentului cu particule (Klein şi colab. (1987) Nature 327:70-73) este utilizată pentru genele de transfer la celulele de cultură ale căluşului. Particule de aur (1 pm în diametru) sunt acoperite cu ADN, utilizând următoarea tehnică. Plasmida ADN (1 pg de fragment de pML108 şi 12 pg de pSS43) este adăugată la 50 pl dintr-o suspensie de particule de aur (60 mg/ml). La particule se adaugă 50 pl clorură de calciu soluţie 2,5 M) şi 20 pl de bază fără spermidină sub formă de soluţie 1,0 M. Suspensia se agită pe parcursul adăugării acestei soluţii şi timp de 5 min, după adăugarea ultimei soluţii. După alte 5 min tuburile se centrifughează (5 s la 15000 rpm) şi se îndepărtează supernatantul. Particulele se resuspendă în 140 pl de etanol absolut, se centrifughează din nou şi se îndepărtează supernatantul. Etanolul clătit este utilizat din nou şi particulele resuspendate într-un volum final de 55 pl de etanol. O parte alicotă de 6 pl de particule de aur acoperite cu ADN sunt introduse în centrul unui disc rotitor Kaoton™ (Bio-Rad Labs). Particulele sunt accelerate în ţesut de porumb cu instrument Biolistic™ PDS-1000 /He (bio-Rad Instruments, Hercules CA), utilizând o presiune de heliu de 1100 psi, o distanţă între aruncări de 0,5 cm şi o distanţă de zbor de 1,0 cm.

Pentru bombardament, ţesutul embriogenic este introdus pe o hârtie de filtru peste mediu solidificat N6 -agaroză, suplimentat cu 1 mg/L 2,4-D. Ţesutul este aranjat ca un strat neted şi se acoperă o arie circulară de 5 cm în diametru. O placă Petri, conţinând ţesut, este introdusă într-o cameră de PDS -1000/He, aproximativ 5 cm din sita opritoare. Apoi se evacuează aerul din cameră la un vid de 28 inch de Hg. Macropurtătorul este accelerat cu undă de şoc de heliu, utilizând o membrană ce poate fi perforată, care crapă când presiunea de heliu în tuburile de şoc atinge 1100 psi.

La patru zile după bombardament, ţesutul este transferat în mediul N6 suplimentat cu 1 mg/L 2,4-D plus bialafos (2-10 mg per litru) şi fără cazeină sau pralină (mediu selectiv). Ţesutul continuă să crească încet, în acest mediu. După o săptămână, ţesutul este din nou transferat în mediu selectiv proaspăt N6, care conţine 2,4-D şi bialafos. După 6...8 săptămîni pe mediu selectiv, suprafeţe de circa 1 cm în diametru, de căluşuri care cresc activ, sunt identificate pe nişte plăci care conţin mediu suplimentat cu bialafos. Aceste căluşuri continuă să crească când sunt sub-cultivate pe mediu selectiv. Căluşurile care continuă să crească viguros în mediul selectiv sunt recoltate pentru analiza PCR prin congelarea unei mase de căluşuri de aproximativ 200...500 mg din greutatea proaspătă. ADN se extrage din probele colectate prin suspendarea ţesutului mărunţii, congelat, într-un tampon constând din 50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 7M uree, 0,35 M NaCI, 20 mM EDTA, 1% n-lauril sarcosină şi incubarea la 37°C, timp de 15 min. După acest timp se extrag mostrele cu un amestec de fenol-cloroform-izoamil alcool (25:24:1) şi se concentrează prin precipitare cu izopropanol. Se resuspendă ADN în 10 mM Trsi-HCI, pH 8,0, 0,1 mM EDTA (100 pl) şi se utilizează ca tipar în PCR, folosind primeni MM50 (SEQ ID NR: 7) şi BE56 (SEQ ID NR: 8). 22 RO 120921 Β1 5' -AAGCTTGAATTCGGGCACATCGGGCCTTATGG-3' [SEQ ID NR: 7] 1 5' -GTCTAGTCCAGTCCTTC-3' [SEQ ID NR: 8] 3

Se combină 2 μΙ de ADN cu 20 μΜ din fiecare dintre primerii MM50 şi BE56, într-un amestec standard furnizat de trusa GeneAmp®PCR (Perkin Elmer). Amplificarea este con- 5 dusă 30 de cicluri, constând din 1 min la 95°C, 2 min la 55°C şi 3 min la 72°C. Mostrele sunt testate pentru prezenţa unei benzi ţintă de 546 bp, care măsoară un interval de la porţiunea 7 3' din fragmentul SS1 şi capătul 3’ zein de 10kD. Mostrele de căluşuri pozitive pentru caracteristica dorită sunt utilizate în continuare în regimul de transformare. 9

Plantele sunt regenerate din căluşurile transgenice, în primul rând transferând mănunchiurile de ţesut la mediul MS fără bialafos sau 2,4-D şi introduse la întuneric. După 11 2 săptămâni, ţesutul este transferat pe un mediu de regenerare (Frimm şi colab. (1990)

Bio/Technology8:833-839), la lumină. Un total de 35 plante de porumb sunt regenerate dintr- 13 un singur experiment de transformare, utilizând constructul pSS43.

Exemplul 2. Prepararea porumbului transgenic care exprimă constructefe sens ale 15 sintazei I a amidonului din porumb.

Plasmidele pSS64-C5 şi pSS65-C11 codifică transcriptele sens ale genei SS1. 17 Pentru ambele constructe, un situs Nco I se introduce la metionina de început a SSI ADNc prin PCR. Oligonucleotidele MM62 (SEQ ID NR: 9) şi MM60 (SEQ ID NR: 10) sunt combi- 19 nate cu matriţa de ADNpSS31, într-un amestec PCR modificat (Advantage -GC™; Clontech), desemnat pentru a facilita amplificarea în regiunile bogate în GC ale tiparului ADN. 21 5'- GAGTCACACGCATGGC-3' [SEQ ID NR: 9] 23 5'- CT CT CCGCCATGGCGACGCCCT CGGCC-3' [SEQ ID NR: 10] 25

Amplificarea a fost realizată utilizând 35 de cicluri de 1 min la 95°C, 1 min la 53°C şi 1 min la 72°C, urmate de o extensie finală de 10 min la 72°C. Fragmentul amplificat acoperă 27 nucleotidele 136-1003 ale SSI ADNc. ADN este digerat succesiv cu enzimele de restricţie Lpn I şi Nco I, este fracţionat prin electroforeză pe gel de agaroză 1% (Maniatis) şi frag- 29 mentul de Nco I -Kpnl de 537 bp este excizat din gel şi purificat prin tratament cu Gelase™ (Epicentre Technologies). Plasmida pET-SSSI (PpuMI) conţine un fragment care cuprinde 31 nucleotidele 418-2235 ale SSI ADNc inserate într-un situs rotunjit Nco I al pET24d (Novagen) orientat în direcţia sens şi în cadru faţă de promotorul T7. Situsul Nco I la capătul 5' al 33 secvenţei SSI este recreat după inserţia fragmentului SSI. PET-SSSI (PpuMI) este incubat cu Κηρ I urmat de Nco I şi digeratul este fracţionat pe gel de agaroză 1%. Banda de 7,1 kb 35 este excizată, purificată şi ligată la fragmentul Nco I -Κρη I SSI de 537 bp descris mai sus. Plasmida rezultantă, care conţine întrega regiune codificatoare a SSI în plus faţă de ADN 3' 37 netranslatat de 168 bp, este denumită pET-SSS@MAT. Această plasmida este utilizată în construct atât a pSS64-C5, cât şi a pSS65-C11. Pentru a genera pSS64-C5, este digerat 39 pET-SSSI@MAT cu Bgl II şi capetele 5' protuberante sunt completate prin reacţia cu Klenow şi dNTP-uri, în mod esenţial, aşa cum s-a descris mai sus. ADN este digerat cu Nco I şi frag- 41 mentul de 1,485 kb eliberat este donat într-un fragment de 4,35 kb Nco I -Sma I al pSPB38.

Acest segment pSPB38 conţine un fragment promotor de 1,05 kb Sal l-Nco I al genei zein 43 de 27kD şi un fragment de 0,96 kb Sma I- Pvu II de la capătul 3' al genei zein de 10 kD în vectorul pKS17, descris mai sus. Plasmida rezultantă, denumită pSS64-C5 (fig. 2), conţine 45 astfel promotorul zein de 27 kD, urmat de aminoacizii 1-494 ai regiunii care codifică SSI (SEQ ID NR: 11) şi capătul 3' zein de 10 kD. Pentru a genera pSS65-C11, se digeră 47 plasmida pET-SSS1 @MAT cu BsrGI şi capetele protuberante 5’ sunt completate prin reacţia 23 RO 120921 Β1 cu Klenow şi dNTP-uri. ADN este digerat cu Nco I, pentru a elibera un fragment de 2,0 kb, care este apoi ligat la fragmentul de 4,53 kb al pSPB38, descris mai sus. Plasmida pSS65-11 (fig. 3) constă din întreaga regiune codificatoare urmată de 84 bp din ADN SSI3' netranslatat (SEQ ID NR: 12), înconjurată de promotorul zein de 27 kD şi de fragmentul terminal 3’ zein de 0,96 kb şi 10 kD. Constructele de ADN pSS64-C5 şi pSS65-C11 sunt introduse în porumb, prin metoda descrisă în exemplul 1. Liniile de calus cu caracteristicile dorite sunt identificate prin analiză PCR (exemplul 1) şi sunt folosite mai departe pentru a regenera plantele transgenice.

Exemplul 3. Analiza amidonului din plante transformate de porumb care conţin constructul antisens PSS43.

Amidonul este extras din seminţe individuale, obţinute de la plante de porumb transformate cu constructul antisens pSS43. Seminţele sunt înmuiate într-o soluţie conţinând 1,0% acid lactic şi 0,3% metabisulfit de sodiu, pH 3,82 şi sunt ţinute la 52°C, timp de 22...24 h. Seminţele sunt scurse, clătite şi omogenizate individual, în 8...9 ml dintr-o soluţie 100 mM de NaCI. 5 ml de toluen sunt adăugaţi în fiecare eprubetă, eprubetele sunt agitate viguros, de două ori, timp de 6 min şi sunt apoi lăsate să stea 30 min. 2 ml din soluţia 100 mM NaCI sunt pulverizaţi în soluţia care se lasă să stea 30 min şi faza proteină/toluen este aspirată. Etapa de spălare cu toluen este repetată. 12 ml de apă sunt adăugaţi şi se agită într-un agitator pentru vopseluri, timp de 45 s. Această soluţie este centrifugată 10 min într-o centrifugă aşezată pe masă şi apa este îndepărtată. Spălarea este repetată, urmată de o spălare finală cu 12 ml acetonă. După etapele de agitare şi centrifugare, acetona este îndepărtată şi lăsată să se evapore 1 h. Pentru a îndepărta orice urmă de acetonă, extractele de amidon sunt incubate peste noapte într-un cuptor la 40°C. Amidonurile extrase sunt derami-ficate enzimatic după cum urmează. 7 mg din fiecare probă de amidon sunt adăugate într-o eprubetă cu dop înşurubat cu 1,1 ml apă. Eprubetele sunt încălzite la 120°C, timp de 30 min şi apoi sunt plasate într-o baie de apă la 45°C. Soluţia de deramificare este preparată prin diluarea a 50 pl de izoamilază (5 x 106 unităţi/ml, Sigma) per ml de tampon de acetat de sodiu (50 mM, pH 4,5). 40 μΙ de soluţie de deramificare sunt adăugaţi la fiecare probă de amidon şi se incubează 3 h la 45°C. Reacţiile sunt stopate prin încălzire la 110°C, timp de 5 min. Probele de amidon deramificat sunt liofilizate şi redizolvate în DMSO, pentru analiza prin cromatografie de permeaţie de gel (GPC). 10 μΙ de amidon deramificat sunt injectaţi şi trecuţi prin 3 coloane cu calibru îngust (Polymer Labs, Mini-Mix C) în serii la 100°C şi sunt eluaţi cu DMSO, la o viteză de curgere de 0,35 ml/min. Intervalul de testare este de 30 min. Un detector de indice de refracţie (Waters) este utilizat cu un calculator care rulează Waters Millenium Chromatography Manager System cu opţiunea GPC (versiunea 2.15.1, Waters Corp.) pentru detectare, colectare de date şi respectiv analiză. Timpii de retenţie ai standardelor de pululan (Standard 1: 380 kD, 100 kD, 23,7 kD, 5,8 kD, 666 şi 180 masă moleculară, Standard 2: 853 kD, 186 kD, 48 kD şi 12,2 kD) sunt utilizaţi pentru a stabili o calibrare liniară şi pentru a calcula distribuţiile maselor moleculare cu programul Millenium®. Aşa cum este cunoscut specialiştilor în domeniu, fenomenul antisens nu este în general observat în fiecare linie transgenică individuală. De aceea, miezurile individuale de la liniiile multiple sunt examinate şi, aşa cum este de aşteptat, unele, dar nu toate liniile posedă miezuri care prezintă un fenotip de amidon modificat faţă de control. Aşa cum este de asemenea cunoscut specialiştilor în domeniu, plantele transgenice de porumb, produse prin bombardament cu particule, sunt în mod tipic heterozigote pentru transgena introdusă şi transgenele vor segrega într-o manieră Mendeliană previzibilă. în spicul unei plante R0 24 RO 120921 Β1 (transformantul primar) endospermul triploid, care este ţesutul responsabil de producerea 1 amidonului, va segrega 1:1:1:1, pentru 0,1,2, şi respectiv 3 copii ale transgenelor introduse.

Pentru a avea o probabilitate rezonabilă de a observa dozajele oricăreia dintre aceste trans- 3 gene, din 10 miezuri din linia S048.6.1.10 (desemnată XBG00944-1 prin XBG00944-10) este extras amidon, iar amidonul din fiecare miez este deramificat şi separat, aşa cum este 5 descris mai sus. Fig. 6 arată distribuţiile maselor moleculare obţinute din amidonurile deramificate de la două miezuri reprezentative ale liniei S048.6.1.10. XGB00944-7 descrie 7 modelul corespunzător unui segregant normal, în timp ce XGB00944-1 descrie modelul corespunzător unui segregant modificat. 9

Linia S048.6.1.10 produce amidonuri cu două tipuri diferite de distribuţii ale maselor moleculare. Distribuţiile maselor moleculare ale amidonului deramificat din seminţele 944-3, 11 944-4,944-5 şi 944-7 sunt tipice distribuţiei maselor moleculare, observate pentru amidonul de porumb crestat. Distribuţiile maselor moleculare ale amidonului deramificat din seminţele 13 944-1,944-2,944-6,944-8,944-9 şi 944-10 prezintă o modificare în distribuţia maselor moleculare ale amidonului deramificat. Fig. 6 prezintă distribuţia maselor moleculare, a uneia din 15 fiecare din aceste tipuri de seminţe, 944-7 este prezentat ca un exemplu de amidon normal şi 944-1 este prezentat ca un exemplu de amidon modificat. Aşa cum reiese din fig. 6, există 17 o creştere în cantitatea de material cu masă moleculară mare (log Masă Moleculară>4) şi o descreştere în distribuţia materialului cu masă moleculară mai mică. Raportul apariţiei 19 seminţelor modificate şi normale în spicul segregant este comparată cu diferitele moduri posibile previzibile de ereditate, utilizând statistica Chi-pătrat (χ2). Frecvenţa observată de 21 60% seminţe modificate: 40% seminţe normale se potriveşte rezonabil cu ipoteza simplei dominanţe (potrivit căreia fie 1, fie mai multe doze ale transgenelor sunt suficiente pentru a 23 produce structură modificată a amidonului) (χ2=1,2) sau cu ipoteza conform căreia 2 sau mai multe doze ale transgenelor sunt necesare pentru a modifica structura amidonului (semi- 25 dominanţă, χ2=0,4).

Exemplul 4. Analiza cantitativă a modificărilor structurale ale amidonului în seminţele 27 XBG00944.

Pentru comparaţia cantitativă a amidonului transgenic modificat, amidonul 29 XBG00944-1 este ales ca fiind reprezentativ pentru modificarea cea mai drastică în structura amidonului (vezi, fig. 6) şi este utilizat pentru comparaţia cu amidonul de porumb crestat, 31 amidonul de la mutantul dull şi amidonul de la mutantul waxy. Amidonurile de la aceste patru linii (crestat, du, wx, 944-1) sunt deramificate enzimatic, aşa cum este descris mai sus, şi 33 sunt separate printr-o metodă cromatografică uşor modificată, pentru a obţine o rezoluţie mai bună a distribuţiei catenei ramificate în fracţia amilopectinică. 10 pl de amidon deramificat 35 sunt injectaţi şi trecuţi prin 3 coloane cu calibru îngust (Polymer Labs, Mini-Mix C, D, E cu coloană de control Mini-Mix C) în serii la 90°C şi sunt eluaţi cu DMSO, la o viteză de curgere 37 de 0,35 ml/min. Intervalul de testare este de 35 min. Un detector de indice de refracţie (Waters) este utilizat cu un calculator care rulează Waters Millenium Chromatography 39 Manager System cu opţiunea GPC (versiunea 2.15.1, Waters Corp.) pentru detectare, colectare de date şi respectiv analiză. Timpii de retenţie ai standardelor de pululan (Standard 1: 41 380 kD, 100 kD, 23,7 kD, 5,8 kD, 666 şi 188 masă moleculară, Standard 2: 853 kD, 186 kD, 48 kD şi 12,2 kD) sunt utilizaţi pentru a stabili o calibrare de al treilea ordin şi pentru a calcula 43 distribuţiile maselor moleculare cu programul Millenium®. Trei analize replicate sunt realizate pentru fiecare din cele patru amidonuri care sunt comparate. 45

Pentru determinarea conţinutului în amiloză (Am) şi amilopectină (Ap), ariile de sub picurile cromatografice adecvate sunt comparate. Mutantul waxy (care nu are amiloză) este utilizat 47 25 RO 120921 Β1 pentru a stabili domeniile adecvate ale maselor moleculare pentru comparaţie. Tabelul 1 arată conţinutul în amiloză şi amilopectină al fiecăreia din cele patru linii.

Conţinuturile în amiloză şi amilopectină (Eroare medie (n=3) şi standard) ale amidonurilor SSSI antisens comparate cu amidonurile du, crestat şi wx

Tabelul 1 %Am Eroare standard %Ap Eroare standard 944-1 35,40% 0,15% 64,60% 0,15% du 31,99% 0,05% 68,015 0,05% crestat 25,65% 0,14% 74,35% 0,14% wx 0,00% 0,00% 100,00% 0,00%

Conţinutul în amiloză este în mod semnificativ crescut (P>0,01), comparativ atât cu amidonul normal crestat, cât şi cu amidonul de la mutantul dull. Conţinutul în amilopectină este în mod similar semnificativ scăzut (P<0,01), comparativ cu ambele linii. Supresarea expresiei sintazei I a amidonului conduce în acest fel la modificarea structurii fine a amidonului în aceste plante, în mod specific la o schimbare semnificativă în raportul amiloză la amilopectină.

Programul Millenium® GPC este utilizat pentru a produce distribuţii independente ale maselor moleculare ale componentelor amiloză şi amilopectină, ale amidonurilor analizate şi pentru a determina mediile maselor moleculare Mn (masă moleculare medie numerică), Mw (masa moleculară medie gravimetrică), Mz şi Mz,t (masa moleculară de sedimentare a polimerului), masa moleculară a picului (MP) şi polidispersia (MJMJ pentru componentele amiloză şi amilopectină.

Tabelul 2 arată analiza cantitativă a distribuţiilor maselor moleculare ale amilozei din amidonul 944-1, crestat şi dull.

Mediile maselor moleculare (Dalton) ale componentei amiloză din amidonurile 944-1, du şi crestat

Tabelul 2

Mn (Masa moleculară medie numerică) MP (Masa moleculară a picului) Mw (Masa moleculară medie gravimetrică) 944-1 91414 ±110 278047 ± 0,00 357427 ± 278 du 82728 ± 693 183963 ±13228 283207 ± 2727 crestat 90511 ±1106 172334 ±8444 304715 ±3480

Mz (Masa moleculară de sedimentare) Mz-, (Masa moleculară de sedimentare 7=1) PD (Polidispersia, Mw/Mn) 944-1 1123204±12306 2258755 ± 48432 3,9100 ±0,0074 du 894430 ±21341 1908812 ±91646 3,4236 ± 0,0349 crestat 968529 ± 36715 2095380±176856 3,3667 ± 0,0037

Comparând valorile de sub coloana Mw din tabelul 2, se poate observa că cele mai mari molecule de amiloză în amidonul din 944-1 au în mod semnificativ o masă moleculară mai mare (P>0,01) faţă de amidonul dull sau crestat. Acest fapt se oglindeşte în creşteri semnificative ale MP, Mzşi Mz=1. Polidispersia crescută, în mod semnificativ (P<0,01) a amilozei 944-1, comparativ atât cu amidonul crestat, cât şi cu cel dull, sugerează că această 26 RO 120921 Β1 creştere în masa moleculară a amilozei nu provine din molecule mai scurte de amiloză, ci 1 mai degrabă dintr-o lărgire a distribuţiei componentei amiloză. Acest lucru este consistent cu observarea unui conţinut relativ crescut de amiloză, raportat în tabelul 1 şi conţinutul 3 crescut de amiloză al liniei 944-1 poate fi atribuit apariţiei amilozei cu masă moleculară mare, care nu este prezentă în amidonurile crestat sau dull. De aceea, efectul net este acela că 5 modificarea expresiei sintazei I a amidonului conduce la modificarea structurii fine a amidonului în seminţele acestor plante, nu numai prin producerea unei schimbări semnificative 7 în raportul amiloză la amilopectină, ci prin modificarea distribuţiei maselor moleculare ale componentei amiloză în amidon, deoarece amiloza suplimentară este mai mare în 9 dimensiuni.

Tabelul 3 prezintă analiza cantitativă a distribuţiilor maselor moleculare ale amilozei 11 din amidonul 944-1, crestat şi dull. 13

Mediile maselor moleculare (Dalton) obţinute pentru componenta amilopectinică a amidon urilor 944-1 şi de control 15

Tabelul 3

Mn (Masa moleculară medie numerică) MP (Masa moleculară a picului) Mw (Masa moleculară medie gravimetrică) 944-1 2727 ±4,5 2409 ± 8,3 3534 ± 5,8 du 2713 ±6,7 2320 ± 8,0 3557 ±11,2 crestat 2717 ±2,3 2352 ± 14,1 3739 ± 0,9 wx 2873 ± 13,0 2460 ± 8.7 4144 ±8,6 21 23 17 19

Mz (Masa moleculară de sedimentare) Mz=i (Masa moleculară de sedimentare 7=1) PD (Polidispersia, MJM„) 944-1 4803 ± 13,9 6406 ± 26,9 1,296 ±0,0019 du 4878 ± 20,2 6529 ± 35,4 1,311 ±0,0009 crestat 5311 ±7,1 7133 ±18,3 1,376 ±0,0012 wx 6196 ±20,3 8716 ± 65,8 1,442 ± 0,0043 25 27 29 31

Valoarea Mw a amilopectinei 944-1 este în mod semnificativ redusă (P<0,01), corn- 33 parativ cu crestat, aşa cum este şi cazul Mz şi Mz=1, indicând o deplasare în distribuţia lungimii catenei amilopectinice spre lungimi mai mici ale catenei. Polidispersia amilopectinei 35 944-1 este de asemenea în mod semnificativ redusă (P<0,01), comparativ cu amilopectina crestată, ca şi în dull, confirmând din nou observaţia vizuală din fig. 6, conform căreia fracţia 37 amilopectinică a amidonului 944-1 este mai omogenă în ceea ce priveşte lungimea catenei decât amilopectina crestată. 39

Astfel, analiza cantitativă confirmă o creştere semnificativă în conţinutul de amiloză şi o creştere în masa moleculară a componentei amiloză a amidonului 944-1, comparativ cu 41 amidonul crestat. Creşterea observată în masa moleculară a amilozei este realizată prin lărgirea distribuţiei maselor moleculare ale catenelor de amiloză. Scăderea observată în 43 conţinutul de amilopectină a amidonului 944-1 este însoţită de o deplasare a distribuţiei catenelor ramificate, pentru a favoriza catenele mai scurte. 45 în rezumat, analiza cantitativă confirmă faptul că modificarea expresiei sintazei I a amidonului în seminţele de porumb conduce la multiple schimbări în structura fină a amido- 47 nului din aceste seminţe, incluzând o creştere semnificativă a conţinutului în amiloză, o creştere a masei moleculare a componentei amiloză a amidonului şi o deplasare spre catene mai 49 scurte în componenta amilopectină redusă. Creşterea observată în masa moleculară a 27 RO 120921 Β1 amilozei este realizată prin lărgirea distribuţiei maselor moleculare a catenelor de amiloză.

Exemplul 5. Analiza funcţională a amidonului din liniile homozigote, pentru con-structul 3' antisens. Aşa cum este cunoscut specialiştilor în domeniu, o linie homozigotă poate fi derivată dintr-o descendenţă segregantă a unei plante heterozigote, cum ar fi linia S048.6.1.10, prin plantarea unui număr suficient de miezuri din populaţia segregantă, prin autopolenizarea plantelor care rezultă din aceste seminţe şi prin selectarea descendenţei de la o singură sămânţă produsă, pentru a identifica un spic care are fixată caracteristica de amidon modificat. Odată ce un astfel de spic homozigot este identificat, o probă mai mare de amidon poate fi extrasă din miezuri uscate mature ale liniei identificate şi ale liniilor de control care produc amidon normal din porumb crestat. Pentru fiecare linie, 15 g de miezuri pot fi cântărite într-un balon Erlenmeyer de 50 ml şi înmuiate în 50 ml dintr-o soluţie de înmuiere (exemplul 3), timp de 18 h la 52°C. Miezurile sunt apoi scurse şi clătite cu apă. Miezurile sunt omogenizate, utilizând o sondă Polytron de 20 mm (Kinematica GmbH; Kriens-Luzern, Switzerland) în 50 ml de NaCI 50 mM rece. Omogenatul este filtrat printr-o sită cu ochiuri de 72 μ. Filtratul este adus la un volum total de 400 ml cu NaCI 50 mM şi este adăugat un volum egal de toluen. Amestecul este apoi agitat cu un agitator magnetic, timp de 1 h, cu o viteză suficientă pentru a emulsiona complet cele două faze. Emulsia este lăsată să se separe peste noapte într-un pahar acoperit. Faza superioară toluenică este aspirată din pahar şi aruncată. Pasta de amidon, rămasă la fundul paharului, este resuspendată, turnată într-o sticlă de centrifugă de 250 ml şi centrifugată 15 min, la 25.000 RCF. Supenatantul este aruncat şi amidonul este spălat secvenţial, cu apă şi acetonă, prin agitare şi centrifugare, ca mai sus. După spălarea şi centrifugarea cu acetonă, acetona este decantată şi amidonul este lăsat să se usuce peste noapte într-o sticlă fumurie, la temperatura camerei. Un Analizor Rapid Visco (Newport Scientific; Sydney, Australia) cu o opţiune de înaltă senzitivitate şi programul Thermocline® poate fi folosit pentru analiza curbelor unite. Pentru fiecare linie, 1,50 g de amidon este cântărit în cupa de testare şi se adaugă 25 ml de tampon fosfat/citrat (pH 6,50) conţinând 1% NaCI. Analiza curbelor unite este realizată, utlizând următorul profil de temperatură: temperatura de control 50°C, ţinut la 50°C, timp de 0,5 min, încălzire liniară la 95°C, timp de 2,5 min, răcire liniară la 50°C, mai mult de 4 min, ţinut la 50°C, timp de 4 min.

Exemplul 6. Prepararea porumbului transgenic care exprimă construct antisens şi sens ale sintezei SSb a amidonului din porumb.

Din secvenţa de nucleotide a Capătului Secvenţei Exprimate (EST) de la porumb cu omologie cu sintazele amidonului (T14684), oligonucleotidele SS9 (SEQID NR: 13) şi SS10 (SEQ ID NR: 14) sunt desemnate şi utilizate pentru a amplifica un fragment de ADN de 351 pb prin PCR, utilizând condiţii standard specificate în trusa GeneAmp®PCR (Perkin Elmer). 5' -AAGCTTGAATTCGCAGTATGCTCGCTCTGTGC-3' [SEQ ID NR: 13] 5' -GGATCCGAATT CGGTT CCACT CGCT CAT GT CG-3' [SEQ ID NR: 14]

Fragmentul de ADN rezultat este marcat, utilizând un sistem RadPrime de marcare de ADN (BRL Life Technologies) şi apoi utilizat pentru a testa colecţia de ADNc de 19 DAP de endosperm de porumb în lambda-ZAPII. Aproximativ 500.000 de unităţi formatoare de plăci sunt întinse pe plăci de agar NZY şi transferate în duplicat pe membrane de nitroceluloză (Maniatis). ADN-ul imobilizat este hibridizat pe fragmentul marcat şi sonda în exces este îndepărtată din filtre, în mod esenţial, aşa cum este descris în Maniatis. Un total de 10 plăci pozitive sunt identificate, purificate, şi insertele de ADN sunt supuse unei caracterizări ulterioare. Analiza secvenţei de ADN arată că 9 din cele 10 clone sunt înrudite între ele şi 28 RO 120921 Β1 că sunt 84% omoloage pe mai mult de 50 bp cu secvenţa probei utilizată iniţial pentru a le 1 detecta. Clona rămasă este distinctă de restul şi prezintă 95% omologie cu T14684. Din setul de 9 clone, pSPB37 conţine un insert de 2006 bp (SEQ ID NR: 15) şi este utilizat în 3 generarea constructului antisens, pentru introducerea în porumb. Prezenţa unui T suplimentar, în secvenţa insertului de ADN al pSPB37, este mai întâi corectată prin substi- 5 tuţia unui fragment Ncol de 431 bp al unei alte clone SSb izolate, pSPB28, pentru aceeaşi regiune în pSPB37, pentru a da pDPB39. Un fragment SSb de 1,78 kb este obţinut prin 7 digestia pSPB39 cu BamHI şi BsrGI. Acest fragment SSb şi fragmentul Ncol-Smal de 4,53 kb al vectorului pSBP38 sunt rotunjite la capete, prin reacţia cu fragmentul Klenow al ADN 9 polimerazei I şi sunt ligate unul cu celălalt, urmând protocoale standard (Maniatis). Transfor-manţii bacterieni sunt testaţi pentru prezenţa şi orientarea insertului SSb de ADN, prin 11 digestie cu enzime de restricţie cu BamHI şi Xhol. Această analiză conduce la identificarea pSPB40, care conţine fragmentul 1,8 kb (SEQ ID NR: 16) în orientare antisens faţă de 13 promotorul zein de 27 kD şi capătul 3' zein de 10 kD. ADN pSPB40 purificat (fig. 4) este introdus într-o cultură de celule de calus de porumb, aşa cum este prezentat în mod esenţial 15 în exemplul 1, utilizând 1,33 pg de pSBP40 şi 0,34 pg de fragment de genă marker al pML108 per bombardament. Probele de calus sunt testate pentru prezenţa ADN-ului din 17 gena pentru caracteristică, prin analiză PCR, şi probele pozitive pentru caracteristica dorită sunt folosite mai departe în regimul de transformare. 19

Un întreg construct SSb sens este de asemenea generat şi introdus în ţesut calus de porumb, prin metoda bombardamentului cu particule. O copie completă a ADNc din SSb 21 este mai întâi obţinută, utilizând pSPB39 ca material de pornire. Analiza Northern blot a întregului ARN extras din endosperm în curs de dezvoltare indică faptul că transcriptul SSb 23 este de aproximativ 3,0 kb. Secvenţa 5' rămasă a ADNc SSb este obţinută prin Amplificare Rapidă a Capetelor ADNc (RACE), utilizând o trusă 5' RACE System (Life Technologies), cu 25 câteva modificări ale instrucţiunilor furnizate de producător. Sinteza primei catene de ADNc este realizată la 50°C, utilizând un primer OSPB104 genă-specific (SEQ ID NR: 17). 27 5' -CCATCTCCGTAGCACACACC-3' [SEQ ID NR: 17] 29

Amplificarea ADNc cu coada dl-dG este realizată cu primenii AAP furnizat de trusa 31 RACE şi primenii OSPB105 genă-specific (SEQ ID NR: 18), utilizând o trusă Advantage GC PCR (Clontech). 33 5'-GTGCCAAGGAACCT CAACAG-5' [SEQIDNR:18] 35

Reamplificarea este realizată într-o manieră similară, utilizând primenii AAP şi 37 OSPB106 (SEQ ID NR:19). 39 5' -GAGGGGCATCAATGAACACA-3' [SEQ ID NR: 19] 41

Un întreg echivalent al ADNc SSb, pSPB45, este creat prin ligarea segmentului de 1346 pb obţinut din digestia produsului RACE de 1485 bp cu Xbal şi Kpnl cu regiunea 3' SSb 43 de 1604 pb obţinută din pSPB39 prin digestia cu Xbal şi digestie parţială cu Kpnl. Un situs Ncol este introdus la codonul de iniţiere al regiunii codificatoare a pSPB45 prin PCR, pentru 45 a da pSPB46. pSPB46 este digerat cu BsrGI şi capătul 5' este rotunjit prin reacţia de umplere la capete cu fragmentul Klenow al ADN polimerazei I (Maniatis). După digestie 47 29 RO 120921 Β1 parţială cu Ncol, fragmentul SSb de 2248 pb (SEQ ID NR: 20) este izolat şi donat în segmentul Ncol-Smal de 4,53 kb al pSPB38 pentru a da pSPB47 (fig. 5). Plasmida pSPB47 conţine întregul ADNc SSb în orientarea sens înconjurat de promotorul zein de 27 kD şi de capătul 3' zein de 10 kD. ADN-ul purificat al pSPB47 este introdus în culturi de celule de calus de porumb, aşa cum este descris în mod esenţial în exemplul 1, utilizând 1,43 pg de pSPB47 şi 0,33 pg din fragmentul de genă marker al pML108 per bombardament. Probele de calus sunt testate pentru prezenţa ADN-ului genei pentru caracteristica dorită prin analiză PCR şi probele pozitive sunt utilizate în continuare în regimul de transformare.

Exemplul 7. Analiza amidonului din plantele transformate de porumb care conţin constructul antisens SSb.

Amidonul este extras din seminţe individuale obţinute de la plante de porumb transformate cu constructul antisens SSb, aşa cum este descris anterior. Amidonurile extrase sunt deramificate enzimatic, aşa cum este descris anterior şi analizate prin cromatografie de permeaţie de gel. 10 pl de amidon deramificat sunt injectaţi şi trecuţi prin 3 coloane cu calibru îngust (Polymer Labs, Mini-Mix C, D, E cu coloană de control Mini-mix C), în serii, la 90°C şi eluaţi cu DMSO cu o viteză de curgere de 0,35 ml/min. Intervalul de testare este de 35 min. Un detector de indice de refracţie (Waters) este utilizat cu un calculator care rulează Waters Millenium Chromatography Manager System cu opţiunea GPC (versiunea 2.15.1, Waters Corp.), pentru detectarea, colectarea de date şi respectiv analiză. Timpii de retenţie ai standardelor de pululan (Standard 1: 380 K, 100 K, 23,7 K, 5,8 K, 666 şi 180 masă moleculară, Standard 2:853 K, 186 K, 48 K şi 12,2 K) sunt utilizaţi pentru a stabili o calibrare de al treilea ordin şi a calcula distribuţiile maselor moleculare cu programul Millenium. Aşa cum le este cunoscut specialiştilor din domeniu, fenomenul antisens nu este în general observat în fiecare linie transgenică individuală. De aceea, miezurile individuale de la linii multiple sunt examinate, şi aşa cum este de aşteptat, unele, dar nu toate liniile posedă miezuri care prezintă un fenotip al amidonului modificat. Aşa cum le este de asemenea cunoscut specialiştilor în domeniu, plantele transgenice de porumb, produse prin bombardament cu particule, sunt în mod tipic heterozigote pentru transgenele introduse şi vor segrega transgenele într-o manieră Mendeliană previzibilă. Pe spicul unei plante R0, endo-spermul triploid, care este ţesutul responsabil de producerea amidonului, va segrega 1:1:1.1 pentru 0,1,2, şi respectiv 3 copii ale transgenelor introduse. Pentru a obţine o probabilitate rezonabilă de observare a dozelor oricăreia dintre aceste gene din 10 miezuri individuale din linia S064.1.2.1 (desemnată XBG01717-1 prin XBG01717-10) este extras amidon şi amidonul din fiecare miez este deramificat şi separat aşa cum este descris mai sus. S064.1.2.1 produce seminţe care segregă amidonuri cu diferite tipuri de distribuţii ale maselor moleculare. Unele dintre amidonurile din seminţe (XBG01717-1,2,3,4, 5 şi 6) produc o amilopec-tină (regiunea dintre log Masă Moleculară 3 şi log Masă Moleculară 4,2) care este mai heterogenă decât amilopectina normală din porumbul crestat, în timp ce porumbul normal crestat prezintă o distribuţie tipică bimodală (XBG01717-7, 9 şi 10). Fig. 7 prezintă distribuţiile maselor moleculare obţinute pentru amidonurile deramificate, obţinute din două miezuri reprezentative, segregantul normal XBG01717-9 şi segregantul modificat XBG01717-2. Aşa cum este normal pentru un segregant normal, fig. 7 arată că XBGQ1717-9 are un singur pic dominant la log Masă Moleculară 3,5 şi un singur umăr evident la log Masă Moleculară 3,9. Fig. 7 arată de asemenea că segregantul neobişnuit (XBG01717-2) prezintă o despicare în picul principal la log Masă Moleculară 3,5 şi un umăr mai puţin proeminent la log Masă Moleculară 3,9. Segreganţii care prezintă această structură amilopectinică modificată prezintă de asemenea o creştere în abundenţa fracţiei amilozice a cromatogramei (log Masă Moleculară > 4,2), 30 RO 120921 Β1 deşi această creştere este mai mare în unii segreganţi decât în alţii. Raportul apariţiei 1 seminţelor conţinând amilopectină modificată şi normală în spicul segregant este comparat cu diferitele moduri posibile previzibile de ereditate utilizând statistica Chi-pătrat (χ2). Frec- 3 venţa observată de 70% seminţe normale: 30% seminţe modificate se potrivesc rezonabil cu ipoteza simplei dominanţe (conform căreia una sau mai multe doze ale transgenelor sunt 5 suficiente pentru a produce structura modificată a amidonului) (χ2=0,13) sau cu ipoteza conform căreia două sau mai multe doze ale transgenelor sunt necesare pentru a modifica 7 structura amidonului (semidominanţă, χ2=1,6). 9

Analiza structurii fine a amilopectinei a segreganţilor antisens SSb de porumb 11

Pentru a extinde comparaţia structurală a amidonurilor normal şi antisens SSb, un amidon din fiecare din cele două clase descrise mai sus (normal faţă de modificat) este corn- 13 parat prin ataşare de fluorofor şi electroforeză. Amidonul este preparat din miezuri individuale de porumb, deramificate şi resuspendate în DMSO, aşa cum este descris mai sus. 4 pl din 15 probele diluate sunt pipetaţi în eprubete pentru reacţii PCR de 0,2 ml şi sunt adăugaţi câte 2 μΙ de fluorofor (acid 8-amino-1,3,6-pirentrisulfonic0,2 M, sare trisodică în acid acetic 15%) 17 şi agent reducător (cianoborohidrură de sodiu 1 M în apă). Eprubetele sunt închise strâns şi centrifugate 2 min, la 4000 rpm, urmată de incubarea la 37°C, timp de 16...18 h. 19

Standardele sunt preparate cu 0,2 mg/ml maltoheptoză în apă şi ataşate la capete în aceeaşi manieră ca probele de amidon. 21

Gelurile sunt turnate între plăcuţe de sticlă de secvenţial, cu distanţa între godeuri de 36 cm, utilizând 5% poliacrilamidă (19:1 acrilamidă:bis)în uree 6M, 1XTBE, 0,05% persulfat 23 de amoniu şi 0,07% TEMED cu distanţatori de 0,2 mm. După polimerizare timp de 3 h la 4 h, un pieptene cu dinţi de rechin, cu 36 de godeuri, este inserat, şi godeurile sunt inundate 25 cu tampon de rulare (1 x TBE). Probele la care este ataşat fluoroforul sunt diluate de 200 la 500 ori în tampon de încărcare (EDTA 5 mM în 80% formamidă cu 5 mg/ml dextran albastru 27 ca marker vizual în godeuri) şi 1,5 μΙ sunt turnaţi în godeuri alternative. Standardul de maltoheptoză este utilizat pentru a localiza picul DP7. Electroforeză este realizată pe un 29 Secvenţializor de Gene Perkin-Elmer ABI 377, timp de 2 h, la 3000 volţi, la 51 °C, şi rezultatele sunt analizate, utilizând programul ABI GeneScan. Fig. 8 arată un grafic care 31 prezintă rezultatele ABI ca procent relativ al fiecărei catene între DP7 şi DP30.

Molii totali cu catene între DP7 şi DP30 sunt calculaţi pentru XBG01717-2, un 33 segregant modificat şi pentru XBG01717-7, un segregant normal şi procentul relativ de moli al acestor catene totale este calculat. Această distribuţie este descrisă în fig. 8, unde 35 segregantul modificat XBG01717-2 este prezentat ca având un procent relativ molar al catenelor mai mare între DP7 şi DP30, comparativ cu segregantul normal XBG01717-7, care 37 are un procent relativ molar al catenelor mai mare între DP12 şi DP26. Procentul relativ molar al segregantului modificat este de două ori cel al segregantului normal pentru DP7 şi 39 DP8. Aceste rezultate arată faptul că segregantul modificat este bogat în catene foarte scurte de AP (DP7 la DP10) şi sărac în catene mai mari de AP (catene DP14 la DP23). 41 31 RO 120921 Β1

Lista cu secvenţe <110> E. 1. du Pont de Nemours and Company <120> Modificarea expresiei genei enilmel de bloslnteză a amidonului <130> <14 0> <14i> BB-1147-A <150> <1S1> 060/094,436 1998-07-28 <160> 20 <170> Microsoft Office 97 <21Q> <211> <212> <213> 1 31 0ΝΆ Secvenţă artificială <220> <223> Descrierea secvenţei artificiale: PRIMER PCR <400> 1 aagcttgaat tccacagaat cagggtacag g 31 <210> <211> <212> <213> 2 21 DNA Secvenfă artificială <220> <223> Descrierea secvenţei artificiale: PRIMER PCR <4 00> 2 gaaggactgg cactagactg g 21

<210> <211> <212> <213> 3 30 DNA Secvenţă artificială <220> <223> Descrierea secvenţei artificiale: PRIMER PCR <4 00> 3 ggatccgaat tctcctttct cagcaaacgg 30

<210> <211> <212> <213> 4 33 DNA Secvenţă artificială <220> <22 3> Descrierea secvenţei artificiale: PRIMER PCR <400> 4 aagcttgaat tcctgggatt gccacctgaa ttg <210> 5 <211> 2491 32 RO 120921 Β1 <21 ?> ΛΠ\ <21J.> zea :nay3 <400> 5 agcgcgcccg

Ctcgctcget

Ccctgtctgc etcctcgcga cagcgcgtgc ceyctgecae: gagcecacgg ctcggictcg agtgageaag agcatrgtct gttcgtggtt accagatatt cacarteggrt gattcagttg gqaqa'aaqt gcatgtgagg ettgtcgcea sc.ta.ggtg ggtgtegagc =tggagtggg aattt;ttga tcgtgggagg aagagtgtat jacaaazgta qqtgcattgc attggaaggt atgcgggaag atgagatcta ccagtttecc ccttgtggtc actgggggcc gytaeagggt gcaatatcta ccaaaagact ttcatcgatc atcagttcat aaggcagacc ecaccqgcaî -ggaagrag·; ctgctatgcc taqqqctqat cacacttr.ta aggcggcacc cgctcccctc tctecetctc gggccgcctq tgcqccqceg ccgcgctgct gtgagccggc aacctga.gg attctgagat t-tgraaccgg cattgccagt -aaatqqtac Ttcrratgctt actgggtqtt ttqqtqcttt ctcctttcat atgattggca tttataaaga ctgcaaqcae attccctga aaggtgcagt eeaeaactgc gaaaeggaat tcccccgtca agaaqgagct tggAttatca atgtrcaatc cagagtcgat accgaataac tcaatcagct ttagagatac ggqcatt-cye catacagqga tcacgcggga c.ccct.tqt catcrtatag ggstattggc gc.qtyagga cargcaggea actcaetgt t aacataatqa ceccaaaaea ecaccgtcgt acttcctccc cgcaatggcg gccqgccqcc qtgcqtcgcg ggcgc=eccg atcgacgccg q.ttqctq*» tgrqqrcgga cgaagctcct tgctcttqct Ctccgataag tggcqqtqaa tqttgatcdt tqgtqataat ccttgaatlg tgccagccta ctceeyeagc atatcctgac otgggcgagg tqtgacaqca tgaaggtgga tgtaaatgga ttattctgtt gqgtttacct gaaagqcatt tgtcatgctt cttcaaqqat tgccggctgc atatgctatg cqtgqaqaac .cccctaacc acacaagtcc ccatgccgct. catgtaaaaa eaagctaaat tocattgctc ateeaqtcga gcrtcgccgt zaccttaaga ctcattaqaa aaAaeaaaaa agtagaagac cgcgegatee a;gcectcqg gtcggcqacc gagctgaqca ctcgtgcceg ccgcccgtgc qqttccatcq aaggagcaag ccttatgcaa qctcqtqqtc »*tt«tge*a caCgaagtta ccetcatatc cagttcaqat ggaggatata gtgscagtcc dLtsLtgtaa cttgggttqc aqgoatqcic qategaa^cq cagggcct ea atcgacatta gaegacctct ataaqgcctg qatctcattc ggatitggtg aaatttcgtq garatartgt cagtatggea ttcaacccţt acagaaaaca tcetgggaag gaacaatacg aaggaccaaa gatgaaagaa caacgcctgc aegacagttt getteetatg ttattacctc aateatqcct a acgggacgca aeggeeeccq cegtgggegi gqgcqcgccc qgqaqqgqei: gcrtcctcgc ccgacgccgg ataacacaqb etegagetaa agrctggggg accgtg-gaz atqcatetxa ecttcterrca acagacctgg acaeaetcCl tttatggaca ttcttgctgc tacataattt cacctgaatg ttgacaaggg tgactgtcag atqagc\.vtt at.gattggaa ctggaaaggc atqetcctct aacttatcar. acccagagct gatggqttgq taatgccate cegttcctgt tcggtgagaa tgttgtqgac ggctaatgaa aaeaaatctt qtgqtgq'.tc aaccectgta tttggctggc tcaagyatdy qaaeaaqctg tef tgttgr r. cctttttatt cccccgcagc 60 ceceecgcgc 12C cgcgtgcctc ISC gcggcggczc 24υ cqcqccgcgc 300 qeeqeeqqce 360 cctqggggee 420 agctgtggc; 4SO agLJaudc.o 540 trragiagar 630 gţctgtiatţ 6S0 cacacdaaa. 120 tgagtataqa 7S0 aaatttatac Θ40 ttgetatget S30 gaattgcate 960 aaaatataga 1020 agcacatcag 1093 gtdLyg.yc- 1140 tgaggcagtr 1200 taagggtta. 1260 aagctccaga 1320 ceetgccaea 1380 caaatgtaaa Ι4 4Γ) qa'tgqctte 1500 accaqatetc 1560 tgaaga-tgg 1620 atztagtgct 1680 caqaticqaa 1740 tqzccazqca 1800 tggagagcaq 186c attgcgaact 1920 gcqaggcatg 198C ceagtgggec 2U4(J □ttgaaqatc 2100 cattaedigq 2160 ttgcctcgat 2220 gaaggggagc 2290 qagecdsitt 2340 etttgetcgt 2400 aactgaagtg 246G 2491 <210> $ <211> 1526 <212> ΡΏΊ <213> Zea mays agatttgttc tcatcaqeec gtattgttea gccgeatgg: ccsacgtgai 63 etcccaggaq gacttgtgtt ccctgtatgt 120 yttttetqtq qttaqqqqtg cqaatgccca 130 agggtrgoaq ttctccecgq tatct.Ttaaq 24 (> gccatactgc atageatatâ gergar.tq.-ig 300 caatatateq cdqeeqqedQ taat^cggtg 3ăQ aegaaAttta tecetgeagi tcgactatqt 423 aceaqatcea agcatqacaa attgaararr 4 80 aătgagatca atqectttct qataatecaa 540 aggccttata ggtaaaeeca gctccttetq 6C0 qaggtcatca aeaqaacaat gacagcggaf 6£ 0 aatgtcaatt ccdtttacaa ttccg:ttaa 720 gaagecctgt ccaeetrcag cagttotqa-: 780 <ton^ b atcgacgaaq qtcttttgdc agatîttqca ccctgtaccc qcccecagtt accacaaggr. ggaaactgga aqacetcatc ttccagcatg cettccaata caatgeacct acanctqtet taeactcttt gcccaetgga atgccccqct gttoyciatg tgercteeat qc.tggaeaa t-gaatctgg acactaaatc caatctteaa agatetrjgta aaggcaacca ttaeatttgg qtggcagggt etgqaqctta tcCacdâCe t nctcascgaa cdjuaaetyt aeggcettaa caacccatcc qctcrqgqte tgataagtrg qaqqaaeate ccrttecaea cccaateatt aqâqCLcdvt 33 RO 120921 Β1 ctc:cacgaa -aaaaaatta

Cv*CtCC«C« etctacaccc aceatatggt yacaacaaac ctcacatqc» cttatctcc* aactgujtcL regaatgtqt atatctgggfi accacea«ea qacaatqctt raacccttac actgcctcac getceaiace T.gatgtgcta etatar.rttg atgcaattct gcatagcaaa ;*ta*atttc ct*leulcat ttttctqtgt atrareaoca tctcctagae tgtqttactt tgacagtcac ccttqtcaag atteaqgtgg •aLtalglal cagcaagaag gtccataaat ggagtgtgt* caggtctgtg ggaagaagqt aaaatqcatt tcacacggtg ccccagactt tagctcga qattcyaect gctgtcacaa ctgcacctt- ¢40 qgeatycctc ctcgcccatt caqgqaatec 900 caaceeaaqq tiagqatatg tqcttqcagg 960 tacaagaa'-g etgucyyay:: cttUUaac 1C20 gactqgcact agactggcac gccaatcatt 1090 atateetccc aattcaagga tcaaaggagc 1H0 tctgaactga ttatcaccaa sagcaccaaa 1200 atargagggs tgatcsacaa aeacccagtc 126C aacttcatct tcacCgcca» agcatgyaat 1320 tgcataattc ttatcggagg taccatttaa 1380 accacgagca qcaagagcaa etggcaatga 1440 tgcataagrga gaagcf.tcgc cggttacaaa 1500 1528 <210? 1 <211> 31

<212> AW <213> Secvenţă artificiali <220

<223> Deecrlcrca secvenţei artificiale; PRIMER PCR <4CO> 7 aagcxtgaat tcggcacatc ggqccttatg g 31 <2in> θ <2i;> 18

<212> ADM <213> Secvenţă artificiali <220>

<22J> Descrierea secvenţei artificiale; PRIMEH PCR <4C0> Θ grccagtgcc agt.r.cT.tc 1β <Z10> 9 <211> 17

<212> ADM <213> Secvenţă arţlfioljlă <220> <223> Descrierea secvenţei artificiale: PRIMER PCR <4C0> 9 gagttonracg cqatggc 17 <210> IC <2U> 27

<212> A OM <213? Secvenţa artificială <220>

<223> Descrierea secvenţei artificiale; PRIMER PCR <40O> IC ctetccgcca tgqcqaccce itcgqee 27 <210> 11 <211> 1415 <212? A OM <213? Zea mayc <400> 11 catggegaeg ccctcggc=g tcggcgccgc gtqcctcc-c ctcqjcqcqqq ccgcctggcc 60 ggzegr-qqtr: qycgaccqgg cecgcr.rgcq gcggctccag Lgcytgctgc «ccgccggtg 120 34 1RO 120921 Β1 cqtcgcggag gcccccgctc qa rgccgceg tgctgaaggt qettggAaaq agcltetcet tcttgctgct cgataagaat cggtyaacat tq»teatccc tyatasleag tgaattggga cagtctagtg ccgcagcatc tcctqacctt yg^gaggagv garagcagst ayytggacag aaatggaatt tlctgttgat macctat.i aggcatt-gat etqageaggg vlyeeey get Cccqtqr.rzg ••.eeaLey »ta r-aqeaagctc catgcaaagt cgtggtcaec -.«tgcaeirg caagctacct rcatatcasa ·« tcagat aca cgatatattc ccagtccttc cttgtaatac cgg-itqcT.se CdLyCccLtg cgaategtga cgcctcaatq cacar.caatg cacctctcgg nggcctgacy ctcattcaac agggqcccgc tcctcgcgcc acgccggcct acacagtagt gagctaaagt etgngggrrr gtgiyatggt ci\Ttctacac tcttccatga gacctggaaa cact Tr.tttg alggacagaa f tgergeaaa ataatttagc ctgaacggta acaagggtga ctgtcagLaa agctrttaag attggaaccc gaaagge.eaa ItccLctgat tratearacc gccgcg.reeg gccggccyag gggggacctc tgtggcaagt aacacaacgc agganatgtr Lgtaalgccc agaaaaaeae gtaragagat ttt.itat.gga Ctatgctqca ttycdtgttt αγ aragaece acatcagcţjl tggaqer.erg ggcagttaat gggttattcg ctceagaaag tgccacâgac atqt aaaggt Lggctttatl agate er gros cceg cccacgggig ggcctcgaac gageaagatt dttgtcttig tgtggt test agalatItaa Attrggartc tcaglLgacc gar.nagtr.tg tgtgaggctc gttgtcaatg tatqqtgttt yUyaycclg gagr.gggrar. tttttgaaag tgggaggtca aqtgtatcaa aaatgtatcc ocattgeaga qgaaggtcgg cger.nc.rgge âgccggcate Cigaagggar - tgagatt gL taaecggcga tgccagttgc aiygtacetc catgctttgg yggLytttgt grgctttcgg ctttg^Lect actggcatge staaagactc caageacata r-crctgaatc ctgcaolLyl caactgctija aCggaattgt cccgccatta aggagctggg attatcagaa <2135- 12 <211> 2003 <212 > ADU '213 ' Zaa m«ys 3 5 7 911 13 15 17 < 4 0 ϋ > 12 catggcgacg ggccqecgtc cgtcgcggag gesecegcte yacgccgcug tgct.gaaggt ggttggaaag agettctcct tcttgctgct cgataagaat eggtgaacat tgatcalccc tgataateag tgaattggga cagtctagtg ccg-agcatt tcctgacctt ggcgaggagg gacagcagat Aggtggacag aaatggaa Lt ttctgttgat tttacctata aggcat tgat catget tqga Îddyga Ldaa cggctgcgat tjcistgCâq ggaga-acttc :c:taccaca caagtcetcc tgccgctgaa gtaaaaaaag gctaaatgat cecr.cggccg cgcgaccgqg ctgagcaggg ctgeeeggct cccglgCCcg tee.irc.gata qagcaagczc tatgcaaagt cgtggtCACe tacgcaaatg caagttaeer teatatcaca ttcagataea ggatataţtt e.eagtcctte cttgtaatac gggttgccac catgcccttg cgaatcgtga qqcctcaatg yic.dUd.itq gacctrtctg aggcctyatg ctcsttcaac tclgqtgacc ttteytgqat atattgttaa tdtggeacag aicccttt cg qaiaacatqt tgggaogggc: ;aatacqa3c gaccaaagtq gaao gaajac tgggcgccvc cgcqceegeg aggggcccgc tectcgcgccacgceqgcct acacagtagt qAgccAaaqt ctggggytct gtqtgatgat CdltLtaCâc tcttecatga qîcctggeaa cartectttg Atggaeaqaa ttgctgcaaa ataacttage ctgaatggta acaagggtga ctgtcagtaa âcctettaag «ttqaaacce gaaaggccaa ttqctctoat tt 3tcatacc caqaccttga gyg LLygat t t gccatecag ttcctqţ.tgt gtgaeaatgg t gtggacatt taaitgaagcg aaatcttcca qeggttcctt ccctgtac gtgcstcctc gcggetccag yccycyceeg gecggceg.ig gggggacctc tgtggcaagt aacacaaaqc aggagatgtt tgtaatgccc agdaaaacac gta tagagat tctatalygd crargrrge.i ttgcatgttt atatacaeca acatcagggt tggagctctg ggcagttaat gggttattcg ctceiqaaag tgccacagac atgtaaagqt tggctttătt agateteat g aqattqqat g tagtgttcca attcqaacct gcdtţiCâât.l. sgageagqgt qcqaactqca oggeatgrea gtggcscttc gaagd tc.it -»· ctcgcgeggg cgcgtgctqe cLgccacccg c.eeaegggrg gglctcgaac gagea.igat”. attgtctttg tgtggttcat agatatttaa atteggăttc tcaqttgaet gacaagtttg tgtgaggcte gttqtcaătq t.itggtgtrr gt&gagcctg gagtgggtat tttttqaaag tgggaggtca agtgtattaa aa.itgtatcc qcattgcsţa yyaaggttgg egggaaqatq aga tet a cay gtttcccacc zqtggtctca •Jygggcc Lta acaqgqtqqq ătdlctaCdt aaaqacttcî «tegitcgac agttcatcac ccgectggee gccqccggtg cgctgctggc ageeggc-ate ctgaagggaL ctgagat.tgt taaccagcga tgecagttgc atggtacctc catgctttgg gggtgtttqt gtgcttctgg etttgatcct attga-catgc sraasgactc Caageacata tece.tgaatg gtgcagttgt eaactgetga acggaat tg-„ cctgt catta aggagctggg attaccagaa ttcaatttqt dgtcgatctt qaataactqc ateagetata gagat-accgt cattcqcacc acayggaaca cqtgggacca cctatgtcet ccca:agtaa 1921 23 25 27 29 31 33 35 37 39 <210 <211> 32 35 41 RO 120921 Β1

<212> ADH <21J> Secvenţă artificială <22C>

<223> Descrierea secvenţei artificiale: PRIMER nCR <400> 13 aagcttgaat tCgcagtatq ctccctctqt gc <ao> u <21U 32

'iîlîv ADN <213> Secvenţa artificială <2 2<J>

<223·» Descrierea secvenţei artificiale: PRIMER PCR <40O> 14 ggatccgaat tcggrrccac tcgatcatqt cg J2 <210> 15 <21l> 2019 <212.' A3N <213> 7.ea aiay.a <400> 15 gaattcggat caccgcetga agccattagt acgaagcgea gggacaatqa ::tga«ity (.Le aggccttacc tggaagcctt tgaactattt tccggeaccg ctttgttttg acggagatgc dtc'qaaqyc tacatsăcet =tgaacacta tctttgccgc gggagctg.a ggeagateta tgcacctgca gyjagtqcaâ tgctcggect tgccgtgga t cggaacgaat ykttcicggt cccgcttcga cggtgcacgc ccgggcr.cgg actgsctcga fţtcqcAgg* ccaagtacca tagatcgcgc tcggtagceg tagtqaaggt aataaatgao ccctccctct etcgcctgcg a caggaggcc cgatgatfcc ttetgggcct tecal.ggt.ge gagaagagga tgetatggqa cratgcattt tcaegatgăc ceeggtrgct aaattîggtq atattacaga cgcccaccag cctccaaeat gggtctgasg cacagiggaa tgqeatcgtţ gtcggacgqe ygcygccctg catcgggcgt cqcqqgqcag gctgcagcac geelatggcg gcectgcqgq cqtgggccgq gt gc.icc t11 cacctaccgg ectcagctgg gtggtgaacc gttţgacqgt tactacgggo tgtatgcaay qctactatqt ggqyacataj gttgacggag icţngqgett aggattggtg ttyqccyggg •aaacaggCg catcgcgtta atccgqaaat attgatggag atacacgggg grcgaggtts LtcaUycc* geccetgggt qqccgtgqtc ttcgagctgt atqgcagacc ggcggctggg aacggcatcg tacaccaact cagcgggagr. ctggatqga; gacgtgcags ttggagcggg catcgcatca ctgaaccagc ctcaqqgacs gaccgygccg a&CÎacqagg gaccacgcgg ctccgcccts cteqqfcgasg ttqcattgaq

titatltitL qtttcgcaaa cgccggaqac attcaaatgg tcs*q*».ata cagatgatg= agaatgttat gtcttggaga tgqttgtggc actacaaagc tcgactttgt qaagtaqqca cttggcacgt atgaltggca teatgcagts ctqtagatga

acgatcccgE gggtggtgas gcctccacga accactagga actCÎCtcga tgggcctgga agaegqqcgc tggtgatgcc agcatcccaa ccgcyyycye tctacgcget ccqtqqcqcq aggccaacaa acagctggaa

Ctgagctcra cgcatcaata eacttcatat ctgtgtcâît tttcaţtacc aaacLcgag

Ictcctccca gccccgaaqc 60 aattgcacct cctacagttg 120 catcggttct gacgagcctg 180 tggttctttt gaacattatq 220 gaacgtgatc gcgglggctg 300 tgttgtggga gctctaccca 360 accaaggtat ggggactacg 420 tgcaggacag gacctagaag 480 gttcattgat gcccctcttt S40 ggaaatcatg aagcgcatqa 600 tccatgoggt ggcgtgtgcc 660 cactgcac'tu c-gcctgltt 720 caetcgctee gtcctcctca 780 artcccgtac atggacttgc 840 cgctggr^gag cn~gr.cj%arn 900 tqtcagccqc ggc-acctgt 960 catcatccgt tciaacgact 1020 grgqaaecee aaggtggacg 1080 gaca^rcga'j gctggaaagc 1140 agtgcgcgac gacgtgccgc 1200 ggacaccecc ggggacgcga 1260 gggcaccggg cgcqccqacc 1320 caaggtgcgc ggg^gggcsg 1380 cgacg^gcLg g.gatgccct 1440 ggcatacggc accgtcc-tg 1500 qttcqacc-q t-caqcgacg 1560 yctgaţcqag gngctcaggc 1620 cegtctccag gcgcgcggca 2680 cgaggacgrc i''.tgtc:aăqg 1740 tcttcggtet gaccccatcg 180C qcaqtgacgc gccgcţgggg 1E0C âÎgtgctttc gacaggecag 1920 gatatctgga aTgrcaaCâc 19£0 2015 <213> 16 <211> 1^99 <212> AON <213> Ί\-λ mays 36 1RO 120921 Β1 <400> 16tg.acaatgg r-ggccttga gacatgccgc cagtgcctga ccggcgtcgc acraceggga cgggagggca aarccgaccc tccaggtcgg ggcatcgcgt agcagcggca tgcogctttc tgcaegtcca r.'ccagtcgt Lcutrauaggt aagatgttgg tcaggcaagt tgtatgacgo agataaacag ccgtagcaca aaaatcatgc cggaaaagag ttcacttcta tccacatagt geettgggta tcagcegcca tccccataat tcgtcaggct ggCtcaactg agtggctteg gatcaaaccg caaggaegtc gcgcctggag gcgcctcgat tgaacgggtc cggtgccgta tcaccagcac acccgcqcac cgcgcccggc crocgatgat cgtcgtcgcg cagcgtcgaq ccttggggtt tagaacggat agccgiryjcf cgtgctcgcc ccatgtacgg ggacggagcg gcaggagtgc caccaccgca gcttcatgat gggcatcaat ggtcctgtcc ccccatacct aagetcecac ccacgat-ac gttcaaaaga cgrtcaaaacc taggaggtgc gggctggcag aagatattga ctcgtagagc actcttccag cagcrcqttg gaacggcgcc tgccatcgcg gtcggcgccc stLgttggga gcccagcatc gtccacgccc Odcttccagg tggctcqagg ccactcctgg gatgtcgtgg gar.agl Crtc;i: accgacgggagaattcatcc agtgtactgs agcgtgccaa tggaacgtgc tccctgccta gaacacaaag tgcagctttg tggtaccaca aacatctcca gttcateara accagcatca gatgtattte aattccâttt gacagtctcc tgcggaoggc tcagccgcgt ctctcctcgt gqctcggcrc acggtgtccc tagagctggt g-cgtgatgc tgctcccqct accagctgea ttccgtccat cccagctccc gaqtagttggtcgccgatgc aggccccagc ar.r.cggtctg tcgtacagct acaggaccac attaacccat ccattggcaa caaggaacct cttcccccat tcgactccat tagtatttcc accataacac agaccacctg Ttrtcrrccgg tctgcaccaa ttgaaatccc gaatctccgt ggcgctatgt ggagggtttî ggtcccagct agttccggta ggtcaaaagt tgagcccgcc tcagcccgca gatgcgccat ccaagtgctg cgtcctgccc ccagacgccc getgcaggqc tgtaqecctc cgtccacgat cgccttccac Ccatetr.cag cgaaatgttg ggccccggtg ggtctetgta tgaacaccaa caacagcaac acatgtcatc caetaaatgc ggattccCat gatgccctct ttttgcacca rcaaaggncc ccetggaatc aagtggcete caaccgcagg reccagaggg ccactggtac gaggtectgc cgtqtegagg ccacccgagc cacggcgtgc gggcr.cgaag aggcaccgag cagcattcgt cgcgatecac gatgaagecg cgccttgcac cgaccgc&gg gceartgatc tgt-cttcagq ar.cr.g<:ygc.'rf aaggtagtgt ggcgatgtta atatgccttc atttceatct cttgcaaaac ttgacggtgc atggaaatag atcaaaggct tctcgctaaa tggagaaeat agaatcattg atccttcgct ctgtactaat cgattcatge aaggac=c 60 120 180 210 300 360 420 480 b40 600 660 120 780 840 800 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1330 14 40 1500 1560 1620 1680 1740 1798 <210> 17 <2ll> 20 <212> AON c213> Secvenţa artificială <220> <223> Descrierea secvenţei <400> 17 ccatctcegt agcaescacc <210> 18 <211> 20 <212>- ADN c213> Secvenţa artificială <220> <223> Descrierea secvenţei <4 0Q> ^8 gtgccaagga accrceseag <210> 19 <211> 20 <212> ADH <213> Secvenţă artificială <220> <222> Descrierea secvenţei <4 00> 19 gayggycatc aatgaacaca 20 20 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 37 RO 120921 Β1 <213> 20 <2ll> 2243 <212> ADN <213> Zea .Tiays <400> 20 ccatggcg-.c cctcccccgg gcctgagttc tggtgegcqc ccyccayyU. cggtcggccg agaacgccgc tagtgaagtt

aydJtyLceL atggaar.tgc aatacatcgg atgctggttc ttaLyaauyt. gagatgctgr tggtaccaag aagctgcagq

LLgLytLCdL ggcaggaaat acgttccatg ggcacactgc âcLacactcg atgaattccc ccgtcggtgg tgactgtcag acgacatcat aggagtggaa tcgagacact tggaagtgcg gcgcggacat rgctgggcac ccaacaaggt gcgccgacgt cgatgqcata cgcagLtcga acaagctcat ggaagagtct tctacgaqga aatatcttcy ggcggccgtg gggccgcagg cgcgttctgg cqagqctgag uv.qin.ycgc·: gtacggctcc attggcggac cccaqcgccg cccagccccq acc:cc:aca ctttgacgag ttttgaacat gatcgtggtg gggagcttta gtatggggac acaggaccta iga:gcccc: catgaagcgc cggtggtgtg actcctgcct ctccgtcctc gtacatggac cgagcacgcc ccgcggctac ccgU.ct.aec ccccaaggtg cqacgctgga cgacgecgtg catcggggac cgggc.gcgcc gcgcgggtgg gctggtgatg cggcaccgtc cccgttcayc cgaggcgctc ccaggcgcgc cqtccttgtc gttlyclccc tcyLcctC-t. cgggr.caggg gegccaccgt gccgggcgca cggcgcaang gcgacgggaa gttgagatca ggctacagga aagccactgc gttyaaccat cctgacgaag tatggggaca gctgctqaat cccaaggctt tatgtggaag gaagtgaact cttttccggc atgattttgc rgctacggag gtctatctga gtcatacata ttyccLyaac aacatctttg ctgtgggags gactggaaga gacqLgcacc aagcggcagc ccgctgctcg gcgatgccgt gauctggaac gtcgggttet ccctcccgct cctctggtgc yaqgccyygc aggcaccgcc ggcatgtcgc aaggccaagt attgtaca

CCtCCaCCU tcggctcctr. cgccgccgcg aggacccgcc cgatctccaa acacggccag agtccatcgt tgatcctccc atoaatcgcc tagtacagga cgaaggatga atcattctgg gttctccatg tîgcgaqaag crtttgaţat atttccatgc accgtcoaga tttycaaggt atggaaattt aggcatatta acatcqcc=a actacntrza ccgcgggtct tgaagacagt tcaatggcat tgcggtcggs gcaaggcggc gcttcatcgc qgatcgcggc gaatgctgca cggtgccrar tcgagccctg acgccgtggg tcggytyyac r.cgacacgfa aggacctcac accagtcgtc L-ttcctcgcy gccgttccac cgcgccccgg gccgeagagg acggaggga: gaccggcgcc cgccgcgccg ctctggggac tqcggttgac ggccacttgy ttccagggtt gccrttggcc gtgcaaaaca aggacarcgt gcgaatccgg att:attgot tgacatatat 2gc:gt:gag ggtgttcatt cagagaccat ccagqgccqt acat-tt-cgag gaagatggca gqaaqgcggc cgtgaacggc cggctacacc cctgcagcgg gcgtctggat gcaggacgtg gcacttggag ggcgca t cgc cgggctgaac cgggctcagg '-LLtyaccyc ccggaactac ctgggaccac aaccctcccc ctcgcctccg 60 aecggcgcca 120 qacgcaccge 180 agcggcqacq 240 ccLctttciyc 300 qcgtcctgcc 360 ccgacgagca 420 ctaccgccgg 480 cqaga:tcaa 540 yatttcaaqa 000 qgtgcagatg 660 cgggagaatg 720 cgtggtcttg 760 cttatggtrg 840 aaatactaca 900 ggagtcgact 860 cggggaaqta 102Q ctrcctccgc 1000 gccaatgatt 1140 gggttaatga 1200 qqrcctgtag 1260 ctgtacgatc 1320 gaccgggtgg 1380 tqgggcctcc 1440 atcgaccacc 1500 aactactccc 1560 gagctggccc .620 ggacagaagg 1680 cagctggtga 1740 cgggagcatc 1800 atcacggcgg 1860 cagctctacg 1920 gacaccgtgg 1980 yccyayyccd 2040 gaggegagc: 2100 gcggctgagc 2160 cctccgcatc 2220 2246 38

Claims (7)

1. RO 120921 Β1 Revendicări 1 1. Procedeu de obţinere a unor culturi de cereale transformate, caracterizat prin 3 aceea că acesta cuprinde: a) prepararea unei gene himerice, cuprinzând un fragment de acid nucleic care codi- 5 fică pentru a genă structurală non-GBSSI a enzimei de sinteză a amidonului sau a unui fragment al acesteia, legată funcţional fie în orientare sens, fie în orientare antisens, în regiu- 7 nea din aval, la un fragment de acid nucleic care codifică un promotor ce direcţionează expresia genei într-un ţesut dintr-o cultură de cereale şi care este legată funcţional în 9 regiunea din amonte, la un fragment de acid nucleic care codifică o secvenţă reglatoare adecvată pentru terminarea transcrierii; şi 11 b) transformarea unei culturi de cereale cu gena himerică din etapa (a), în care expresia genei himerice, menţionate, conduce la modificarea structurii fine a amidonului provenit 13 de la un bob din numita cultură de cereale transformată atunci când se compară cu structura fină a amidonului provenit dintr-o cultură de cereale care nu conţine numita genă himerică; 15 în care cultura de cereale este o varietate de porumb şi în care fragmentul de acid nucleic codifică pentru gena structurală a enzimei de sinteză a amidonului sau un fragment 17 al acesteia este derivat de la porumb şi codifică întreaga sau o porţiune a enzimei SSb de sinteză a amidonului de la porumb. 19
2. 2. Procedeu în conformitate cu revendicarea 1, caracterizat prin aceea că modificarea structurii fine a amidonului cuprinde modificarea raportului componentei moleculare 21 amiloză la componenta moleculară amilopectină, în amidonul menţionat.
3. 3. Procedeu în conformitate cu revendicarea 1, caracterizat prin aceea că modifica- 23 rea structurii fine a amidonului cuprinde o modificare a distribuţiei masei moleculare a componentei amilopectină, în raportul menţionat. 25
4. 4. Procedeu în conformitate cu revendicarea 1, caracterizat prin aceea că modificarea structurii fine a amidonului cuprinde o modificare a distribuţiei masei moleculare a 27 componentei amiloză, în raportul menţionat.
5. 5. Procedeu în conformitate cu revendicarea 1, caracterizat prin aceea că fragmen- 29 tul de acid nucleic, care codifică pentru gena structurală a enzimei de sinteză a amidonului sau un fragment al acesteia, este legat funcţional în orientare sens sau antisens faţă de un 31 fragment de acid nucleic, care codifică un promotor care direcţioneză expresia genei în ţesutul endospermului de porumb, în regiunea din amonte, şi la un fragment de acid nucleic care 33 codifică o secvenţă reglatoare adecvată, pentru terminarea transcrierii în regiunea din aval.
6. 6. Procedeu în conformitate cu revendicarea 1, caracterizat prin aceea că frag- 35 mentul de acid nucleic, care codifică pentru gena structurală SSb de sinteză a amidonului sau un fragment al acesteia, este în mod substanţial similar cu un fragment de acid nucleic 37 izolat, menţionat ca un membru selectat din grupul care constă din SEQ ID NR:15, SEQ ID NR:16 şi SEQ ID NR:20. 39
7. 7. Procedeu în conformitate cu revendicarea 1, caracterizat prin aceea că modificarea menţionată a structurii fine a amidonului cuprinde scăderea molilor relativi ai corn- 41 ponentelor amilopectină DP7 la DP10, din amidonul menţionat. 39