JP2002525029A - 穀類作物中でデンプンを生産するためのデンプン生合成酵素遺伝子発現の改質 - Google Patents

穀類作物中でデンプンを生産するためのデンプン生合成酵素遺伝子発現の改質

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、トウモロコシ中のデンプン合成酵素活性の抑制のためのセンスおよびアンチセンス遺伝子を構築するためのｃＤＮＡクローンの利用を開示する。さらに具体的には、本発明は、穀類作物の穀粒に由来するデンプンのデンプン微細構造の制御の方法に関し、これは（１）デンプン合成酵素構造遺伝子をコードする核酸断片またはその断片を含んでなり、トウモロコシ内胚乳組織内の遺伝子発現を支配するプロモーターをコードする核酸断片の上流側においてセンスまたはアンチセンスのいずれかの配向に操作可能に連結され、そして転写終止のための適合する調節配列をコードする核酸断片の下流側において操作可能に連結されているキメラ遺伝子を調製し、そして（２）該キメラ遺伝子を用いて穀類作物を形質転換し、ここで、該キメラ遺伝子の発現が、該キメラ遺伝子を有していない穀類作物に由来するデンプンの微細構造と比較して、該形質転換穀類作物の穀粒に由来するデンプンの微細構造の改変をもたらすことを含んでなる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、植物分子生物学の分野内にある。さらに具体的には、本発明は、植
物および種子内でデンプンを生産するためのデンプン生合成遺伝子発現の改質に
関する。
【０００２】
【発明の背景】
デンプンは、２種の多糖類、すなわちアミロースとアミロペクチンとの混合物
である。アミロースは、α−１，４−グリコシド結合により連結されている数千
個までのα−Ｄ−グルコピラノース単位の非分枝連鎖である。アミロペクチンは
、α−１，４−およびα−１，６−グリコシド結合により連結されている５０，
０００個までのα−Ｄ−グルコピラノース残基からなる高度に分枝した連鎖であ
る。アミロペクチン内のグリコシド連結の約５％がα−１，６−結合であり、こ
れがポリマーの枝分かれ構造をもたらす。
【０００３】 アミロースおよびアミロペクチン分子は、色素体中に貯蔵される粒に組織化さ
れる。大部分の植物により生産されるデンプン粒は、１５〜３０％がアミロース
、７０〜８５％がアミロペクチンである。アミロースとアミロペクチンとの比率
およびアミロペクチンの分枝度は、デンプンの物理的および機能的性質に影響を
及ぼす。機能的性質、例えば糊化したデンプンの粘度および安定性は有用性、従
って食料品および産業用途におけるデンプンの価値を決定する。特定の機能的性
質が必要な場合には、各種作物、例えばトウモロコシ、コメ、バレイショまたは
コムギから得られるデンプンは、機能的要求に適合しなければならない。デンプ
ンが所要の機能的性質、例えば高温および酸性条件下における安定な粘度に対す
る要求に適当しない場合には、その機能性は通常デンプンの化学的改質により達
成できる。化学的改質の種々の形式および程度が産業において使用され、そして
化学改質したデンプンの表示および使用は、政府の規制に適合しなければならな
い。
【０００４】 植物のデンプン産生器官内で、アミロースとアミロペクチンとの比率およびア
ミロペクチンの分枝の程度は、遺伝子的に制御されている。例えば、劣性ワキシ
ー（ｗｘ）変異に対してホモ接合性のトウモロコシ植物は、粒結合デンプン合成
酵素を欠失し、アミロペクチンをほぼ１００％生産する。劣性アミロースエクス
テンダー（ａｅ）変異および特性不明の改質遺伝子に対してホモ接合性のトウモ
ロコシ植物は、報告によると、約８０〜９０％がアミロースのデンプン粒を生産
できる（米国特許第５，３００，１４５号参照）。トウモロコシのｄｕｌｌ変異
体は、ワキシー(waxy)株に欠けるものとはとは明らかに異なるデンプン合成酵素
を欠き、また正常なデンプンよりもアミロースが多く、アミロペクチン上の短い
分枝の比率が高いことを特徴とするデンプンを有する。
【０００５】 大部分の穀類作物は商品として取り扱われ、これらの作物に対する多数の産業
用および動物用飼料の要求は、広範囲に栽培され大量生産されている通常の品種
により満足できる。しかし、標準組成の穀物では満足できない特殊な最終用途特
性を有する作物に対する市場が現在では増大している。最も一般的には、特殊用
途トウモロコシは、「正常」トウモロコシから、改変された内胚乳の性質、例え
ばワキシーまたは高アミローストウモロコシにおけるようなアミロースとアミロ
ペクチンとの比率の全体的変化、スイートコーンにおけるような糖類の蓄積増加
、または食品用トウモロコシまたはポップコーンにおけるような内胚乳硬度の程
度の改変により差別化されている〔Ｄ．Ｖ．グロヴァーおよびＥ．Ｔ．メルツ(G
lover, D.V., E.T. Mertz(1987))「トウモロコシ: 穀類の栄養品質; 遺伝および
作物栽培学的改善」中(Corn: Nutritional Quality of Cerial Grains; Genetic
and Agronomic Improvement, R.A. Olson and K.J. Frey, 編集 American Soci
ety of Agronomy, Madison, Wisconsin, pp183-336) 、Ｌ．Ｗ．ルーニーおよび
Ｓ．Ｏ．サーナ−サルジヴァー(Rooney, L.W., S.O. Serna-Saldivar(1987)、「
全粒トウモロコシおよび乾式ミル画分の食品利用」(Food Uses of Whole Corn a
nd Dry-milled Fractions)「トウモロコシ: 化学と技術」中(Corn: Chemistry a
nd Technology, S.A.Watson and P.E. Ramstead 編集 American Association
of Cerial Chemists, Inc., St. Paul, Minnesota, pp399-429) 〕。本発明は、
特殊穀物バイヤーに対して、ワキシーデンプンとは区別される性質を有するデン
プンの供給源を提供し、また農業者には通常またはワキシートウモロコシよりは
付加価値が大きい作物を栽培する機会を提供する。
【０００６】 精製デンプンは、ミリング法により植物から得られる。トウモロコシデンプン
は、穀粒から湿式ミリング法を用いて抽出される。湿式ミリング法は、穀粒の浸
漬および破砕およびデンプン、タンパク質、油分および繊維部分の分離を含む多
段法である。トウモロコシ湿式ミリング法の概説は、Ｓ．Ｒ．エクホフ(S.R. Ec
khoff(1992), Proceedings of the Fourth Corn Utilization Conference, June
24-26, St. Louis, MO., National Corn Growers Association, CIBA-Geigy Se
ed Division and the United States Department of Agriculture 印刷) が提供
している。コムギも精製デンプンの重要な供給源である。コムギデンプン生産は
、Ｊ．Ｗ．ナイトおよびＲ．Ｍ．オルソン「デンプン：化学と技術、第二版」(J
.W. Knight, R.M. Olson(1984) Starch: Chemistry and Technology, 2nd.Editi
on, Academic Press, Whisatler et al. 編集) 中に概説されている。
【０００７】 デンプンは、多くの食品および産業用途に使用されており、ヒト食料の主要な
炭化水素源である。代表的には、デンプンを水と混合し、濃厚なゲルを形成する
ように調理する。この方法は糊化と呼ばれる。デンプンの３つの主要な性質は、
糊化が起きる温度、ゲルが到達する粘度、および時間経過に対するゲル粘度の安
定性である。非改質デンプンの加熱および冷却の間の物理的性質が、多くの用途
におけるその有用性を制限する。その結果、デンプンのこれらの制限を克服し、
また産業用途におけるデンプンの有用性を拡大するために、かなりの努力がデン
プンを化学的に改質するために必要とされている。
【０００８】 非改質デンプンのある種の制限および改質デンプンの性質は、「改質デンプン
：性質および用途」Ｏ．Ｂ．ビュルツブルグ編集(Modified Starches: Properti
es and Uses, O.B. Wurzburg ed., (1986)， CRC Press Inc. Boca Raton, FL.)
中に記載されている。非改質デンプンは、粒が膨潤し、容易に破裂し、従って弱
い本体と望ましくないゲルを形成するので、食料製品には非常に限られた用途し
か持っていない。化学的改質は、デンプン粒の安定化のために使用され、これに
よりデンプンを、乳児食品、粉末コーヒー用クリーム、外科用散布剤、紙および
織物のサイジングおよび接着剤を含む数千の食品および産業用途に適合させてい
る。一般的な化学改質方法は、デンプン分子間の安定化架橋として作用するよう
に化学結合を導入する架橋、および置換基、例えばヒドロキシエチル、ヒドロキ
シプロピルまたはアセチル基をデンプン分子中に導入する置換を含んでいる。
【０００９】 米国内における化学改質デンプンの使用は、食品医薬品局〔Food and Drug Ad
ministration (FDA)〕により規制されている。「食品用デンプン−改質(Food st
arch-modified)」デンプンは、食品中に使用はできるが、規定の処理限界を満足
しなければならず、また「産業用デンプン−改質(industrial starch-modified)
」デンプンは、食品と接触する容器などの品物に使用でき、そして規定された規
制要件を満足しなければならない；連邦規制法、２１編、第１章、１７２部 食
用の食品に許容される食品添加剤、セクション１７２，８９２食品用改質デンプ
ン(Code of Federal Regulations, Title 21, Chapter 1, Part 172, Food Addi
tives Permitted in Food for Human Consumption, Section 172, 892, Food St
arch-Modified, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 1981 〕
; (a) １７８部 間接食品添加剤、セクション１７８．３５２０、産業用改質デ
ンプン(Part 178, Indirect Food Additives, Sect. 178.3520, Industrial Sta
rch-Modified) 。これらの規制は、改質工程中で使用できる化学薬品の最大量を
規定して、化学改質の程度を限定している。改質操作からもたらされるデンプン
中の副製品のレベルも規制される、例えばヒドロキシプロピルデンプン中のプロ
ピレンクロロヒドリン残留物は特に関心がある〔Ｊ．Ｖ．ツシュホフ、ヒドロキ
シプロピル化デンプン(Tuschhoff, J.V. (1986) Hydroxypropylated Starches,
Modified Starches: Properties and Uses 中, O.B. Wurzburg,編集 CRC Press
, Boca Raton, FL, pp55-57)〕。
【００１０】 精製成分としてのその使用に加えて、デンプンは、全粒粉、例えばパン生産、
ベーカリー食品およびパスタの生産に使用されるコムギ粉のための重要な成分で
ある。デンプンは、コムギ穀粒の重量の５０〜７０％を含んでなっており、コム
ギ粉の性能におけるその重要性は当該分野では良く知られている。コムギの複雑
な遺伝的性質が全粒粉に利用できるデンプン微細構造の変化を制限するけれども
、コムギまたはその他の粉中の新規のデンプン構造の調製は、食品製品用途にお
けるこれらの全粒粉の改善された性能をもたらすであろう。デンプン構造は、ま
たコメなどの全粒利用の穀類作物の品質の重要な要素である。アミロペクチン微
細構造の相違は、調理した米組織に関連する〔レッディーら(Reddy et al., (19
93) Carbohydr. Polymers 22:267-275) 〕。
【００１１】 デンプン分枝または重合の程度の相違は、デンプンの物理化学的性質に変化を
もたらすことが知られている。特定の用途に合わせて生産されたデンプンは、ア
ミロペクチン分子の分枝鎖分布、アミロースのアミロペクチンに対する相対比率
またはアミロースの重合度の改変により生成できることが示唆されている。ある
著者〔シおよびサイブ(Shi and Seib (1992) Carbohydr. Res. 227:131-145);ジ
ェーンら(Jane et al., (1999) Cereal Chemistry 印刷中) 〕は、老化性(Retro
gradation tendency) が、アミロペクチン中に非常に短い鎖（ＤＰ６−９）を高
い割合で含む種々の植物性供給源からのデンプンでは低下していることを報告し
ているが、しかしこれがトウモロコシで成功する方法については示唆していない
。しかし、デンプン組成の表現型的改変の達成には問題がある。デンプン生合成
における重要な酵素は同定されているけれども、その正確な役割は未確定である
。従って、特定の酵素活性とデンプン構造の特定の分枝特性との相関、一方では
食品および産業用製品中のデンプンの機能との相関は、困難である。理想のデン
プンが必要とする望ましい機能的性質は構想できるけれども、これを達成するた
めにデンプンの分子構造どのようでなければならないかに関して、および特定の
デンプン生合成酵素がこれらのパラメーターに特異的にどのように作用するかに
関しては、限られた知識しかない。例えば、分枝パターンおよび分枝長さを決定
するためのそれぞれの酵素の役割はまだ明らかでなく、また分枝酵素とデンプン
とがどのように相互作用するかの知識の欠如により一層著しくなっている。さら
に、ワキシー遺伝子によりコードされる粒結合デンプン合成酵素の役割はかなり
理解されているけども〔デナイヤーら(Denyer et al. (1996) Plant J. 10:1135
-1143)参照〕、他のデンプン合成酵素の数および正確な機能は、可溶性または粒
結合性を問わず解明されていない〔スミスら(Smith et al. (1996) Ann. Rev. P
lant Phys. and Mol. Biol 48:67-87)〕。
【００１２】 ＷＯ９４／０９１４４は、高温においてデンプンを合成するために改善された
能力を有するトウモロコシ植物の生成を検討している。この刊行物は、高温にお
ける穀類充実の限定因子は、ある種のデンプン生合成酵素、特にデンプン合成酵
素（ＳＳ）およびデンプン分枝酵素（ＳＢＥ）の不安定性にあることを提案して
いる。活性に対して高い最適温度を有するかまたは植物内への加熱に対して高い
耐性を有する酵素をコードする遺伝子の導入は、トウモロコシ穀粒内に沈積する
デンプンの量の増加をもたらすであろう。さらに、その発現が種々のデンプン生
合成酵素のバランスを改変するドナー遺伝子の導入の結果として、改変された微
細構造のデンプン生成のために、この戦略が利用できることを主張している。示
唆されたドナー遺伝子には、外因性酵素と比較して改善された速度的またはアロ
ステリックな性質を示す酵素をコードするものまたは加熱により起きる酵素活性
の損失を補償する外因性遺伝子の余分のコピーが含まれる。デンプン構造を改変
させる手段として、ＷＯ９４／０９１４４は、また受容する植物内の種々のデン
プン合成酵素と分枝酵素との本来の割合を改変するためのセンスおよびアンチセ
ンス遺伝子および酵素の使用を示唆している。この刊行物は、ある種のデンプン
生合成酵素における触媒活性および酵素安定性への温度の影響を開示している。
しかし、提案された分子戦略を実証するいかなるデータも提示されていない。実
際、この刊行物は、アミロース／アミロペクチン比およびアミロペクチン分枝度
の両方のデンプンの微細構造を改変させるための改変されたデンプン合成酵素発
現の使用を示唆しているが、その前後の他の刊行物は、デンプン合成酵素だけで
なく、デンプン分枝酵素も必要であり、またはその他の因子も検討しなければな
らないことを示唆している。例えば、スミスら(Smith et al. (1995) Plnat Phy
s. 107:673-677) 〕は、アミロペクチンの分枝パターンの決定に関して２種の異
なる見解を示唆している。すなわち、第一は、パターンは、分枝と脱分枝酵素と
の間のバランスを表しているとし、第二は、パターンは、分枝酵素の性質により
大部分が説明できるとしている。デンプン合成酵素の役割は述べられていない。
グアンおよびプライス(Guan, Preiss (1993) Plant Phys. 102:1269-1271)は、
分枝酵素およびデンプン合成酵素の多型の間の相互作用の研究が個別のイソ酵素
の特異性および機能およびアミロペクチン生合成の機構の理解に重要であろうと
示唆している。このように、グアンおよびプライスは、両方の酵素の同時改変の
必要性を暗示している。最後に、ヴァン・デン・コルンホイスら(Van den Koorn
huyse et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:16281-18287) 〕は、低ヌクレオチド
糖類濃度が、貯蔵の間のデンプンの組成または構造に観察される主要な相違に直
接または間接に関与することを提示している。総括すると、種々の見解から、正
確にどの因子がデンプン構造に影響するか、従ってどのように改変するかに関し
て合意がないことが明らかである。さらに、可溶性デンプン合成酵素が重合速度
を制限し、従ってこれらのレベルの上昇または低下が実際にデンプン微細構造を
改変することを証明する証拠は、ＷＯ９４／０９１４４も含めて、どの研究も提
示していない。さらに、ＷＯ９４／０９１４４は、デンプン生合成へ最小の寄与
を行うイソ型およびさらに活性な形をコードする遺伝子の間の差別化をする方法
に関して教示していない。比較的不活性（酵素レベルにおいて、必ずしも転写レ
ベルにおけるものではない）な酵素の発現パターンを低下させることは、効果が
あるとは思われない。総括すると、ＷＯ９４／０９１４４は、微細構造が改変さ
れたデンプンを実際に生産することに関して、熟練者に示唆はしているが、十分
詳細には教示していない。
【００１３】 ＳＢＥ発現の改質によるデンプン構造改変の数件の報告が、バレイショ〔バー
ジンら(Virgin et al. (June, 1994), 4th, Internatinal Congress of Plant M
olecular Biology) およびクリステンセンら、およびコスマンら(Christensen e
t al., Kossmann et al. (July, 1994) Plant Polysaccharide Symposium) 〕お
よびトウモロコシ〔ブロリーら(Broglie et al.; WO97/22703)〕の両者に関して
ある。これらのいずれの研究も、デンプン合成酵素の発現を改変する能力は取り
扱っていない。数人の研究者は、非−粒結合デンプン合成酵素Ｉ（非−ＧＢＳＳ
Ｉ）合成酵素の発現は、デンプン構造または組成を改変するとを推測しているが
、しかしこれは穀類中で明確には証明されていない〔ブロックら(Block et al.,
WO9745545A); フローベルグおよびコスマン(Frohberg, Kossman, WO9744472);
フローベルグおよびコスマン(Frohberg, Kossman, WO9726362)〕。
【００１４】 酵素段階は既知であるが、デンプン生合成の分子的な細部は十分には理解され
ていない。種々のＳＳイソ型がデンプン生合成の間に均等に貢献するのかどうか
、またはそれぞれのイソ型がアミロペクチン分子の構築にあたって必須の経路に
沿う分離した段階で明確な役割を持つかどうに関しては明らかではない。グルカ
ン鎖延長において機能するデンプン分枝化酵素と複数のデンプン合成酵素との間
の可能な相互作用を考慮すると、各酵素の触媒性質に基づいてデンプン構造に関
する正確な予測をすることは不可能である。
【００１５】 アミロース生合成におけるＧＢＳＳＩの明確な役割以外には、個別のデンプン
合成酵素の正確な役割は明らかではない。全部ではないが一部の種から、ＳＳの
個別のイソ型がアミロペクチン生合成に定性的に異なる貢献をしており、またＧ
ＢＳＳＩもアミロペクチンならびにアミロースの生合成にも貢献している証拠が
ある〔スミスら(Smith et al.(1996) Ann. Rev. Plant Phys. and Mol. Biol. 4
8:67-87)〕。多数のデンプン合成酵素が種々の種からクローニングされているが
、しかしエドワーズら(Edwards et al., 1960, Plant Phys. 112:89-97) 、およ
びム−フォスターら(Mu-Foster et al., 1996, Plant Phys. 111: 821-829)は、
粒結合と可溶性デンプン合成酵素の間の従来なされていた差別は、生体内の状況
を反映せず、ワキシータンパク質、ＧＢＳＳＩを除いて、ここには使用されない
ことを証明した。トウモロコシからの最初の単離以来〔クレスゲンら(Kloesgen
et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 203:237-244) 〕、この遺伝子は、多くの種か
らクローニングされている。多くのその他のＳＳは、一連の種からクローニング
されているが、しかしこれらは、種の間ではＧＢＳＩほど緊密には関連していな
いように思われる。バレイショは、少なくとも２種の他のデンプン合成酵素、Ｓ
ＳＩＩおよびＳＳＩＩＩを含む〔マーシャルら(Marshall et al. (1996) Plant
Cell 8: 1121-1135)。エンドウは、ＳＳＩＩと呼ばれる構成酵素を含み、これは
、一方が他方のプロセッシングにより誘導される２種の形で存在すると考えられ
る〔エドワーズら(Edwards et al. (1995) Plant Phys. 112:89-97) 〕。ブロッ
クら(Block et al. WO9745545A) は、コムギから２種のデンプン合成酵素ｃＤＮ
Ａクローンを単離した。可溶性デンプン合成酵素の３種の形がコメから精製され
た。これらは可溶性デンプン合成酵素Ｉ（ＳＳＳＩ）と呼ばれる相応する遺伝子
の単離による一次形に由来することを証明された〔ババら(Baba et al. (1993)
Plant Phys. 103:5655-573);タナカら(Tanaka et al. (1995) Plant Phys. 108:
677-683)〕。エンドウおよびバレイショのデンプン合成酵素ＩＩ配列と相同性を
示すコメ発現配列タグ（ＥＳＴ）が同定された〔AA752475, AA753266, AA751702
, AA751557, AA751512A;ナームら(Nahm et al.,)〕。コメＳＳＩに関係する配列
が、トウモロコシから単離され〔ハーンら(Harn et al. (1995) Plant Phys.
108:S-50);キーリングら(Keeling et al., WO9720936) 〕、ＳＳＩと名付けられ
た。２種の別のデンプン合成酵素ｃＤＮＡクローンが、キーリングら(Keeling e
t al., WO9720936) により単離された。これらのデンプン合成酵素をコードする
遺伝子の発現が研究され、これらのトウモロコシゲノム内での存在が報告された
〔ハーンら(Harn et al. (1998) Plant Mol. Biol. 37:639-649)〕。フローベル
グおよびコスマン(Frohberg, Kossman, WO97/44472およびWO97/26362) も、これ
らのトウモロコシデンプン合成酵素配列２種の単離を報告している。トウモロコ
シ内のdull変異に寄与する座は、他のデンプン合成酵素をコードすることが最近
分かった〔ガオら(Gao et al. (1998) Plant Cell 10:399-412) 〕。メイズ内胚
乳中の可溶性デンプン合成酵素活性の特性研究において、カオら(Cao et al.
1999, Plant Physiol. 120:205-515) は、ＤＵ１およびＳＳＳＩが、発生中の内
胚乳内の可溶性デンプン合成酵素活性のすべてに寄与しているらしいと報告して
いる。単細胞生物体も複数のデンプン合成酵素を含んでいる〔フォンテーンら(F
ontaine et al.(1993) J. Biol. Chem. 268:16223-16230); ブレオンら(Buleon
et al. (1997) Plant Physiol. 115:949-957) 〕。これらの酵素の一部に対して
、研究者はその特定の役割を推測しているが、どの場合にも、デンプン合成酵素
のイソ型の全体がアミロペクチン分枝を延長するためにどのように一緒に働くか
、または特定の種内のデンプン生合成酵素の全系列が、成熟種子または塊茎中で
観察されるデンプン構造を生成するためにどのように一緒に相互作用および機能
するかは解明されていない。特に、内胚乳中の存在率が低いデンプン合成酵素の
役割が明確でない。
【００１６】 トウモロコシ内のワキシー変異は、機能性ＧＢＳＳＩ酵素の欠失および改変さ
れたデンプン組成をもたらすことはよく知られている。同様にコムギ内で、低ア
ミロース品種は、ＧＢＳＳを欠失している品種から選択されている。バレイショ
中の相似変異の優性型は、トランスジェニックバレイショ植物中でＧＢＳＳＩア
ンチセンス遺伝子を発現させて作製されている〔ヴィッサーら(Visser et al. (
1989) Plant Mol. Biol. 17:691-699)〕。シューメーカーら(Shewmaker et al (
1994) Plant Physiol. 104:1159-1166) は、塊茎内の大腸菌(E. coli) グリコー
ゲン合成酵素の発現を通じてバレイショ内の改変されたデンプン構造を報告して
いる。非−ＧＢＳＳＩデンプン合成酵素の改質された発現もバレイショ内で報告
されている。トランスジェニックバレイショ塊茎内のＳＳＩＩ発現の低下は、ア
ンチセンス技術の利用により達成されている。ＳＳＩＩタンパク質の低下したレ
ベルは、デンプン含有量または組成のいかなる検出できる変化とも相関せず、ま
たデンプン粒の形態は正常に見えた〔エドワーズら(Edwards et al.(1995) Plan
t J. 8:283-294) 〕。最近、アミロペクチン分枝鎖分布（ｄｐ６−３５）に小さ
い変化がＳＳＩＩアンチセンスバレイショ植物中で報告されている〔エドワーズ
ら(Edwards et al.(1999) Plant J. 17:251-261)〕。バレイショ塊茎の主要な可
溶性デンプン合成酵素活性、ＳＳＩＩＩがアンチセンス法により阻害されている
場合には、種々の結果が観察された。これらのトランスジェニック植物内で、デ
ンプン含有量および組成は変化しないが、しかし、デンプン粒の形態は認められ
るほど影響された〔マーシャルら(Marshall et al. (1996) Plant Cell 8:1121-
1135) 〕。アミロペクチン分枝鎖分布の変化も観察されたが、しかしこれらはＳ
ＳＩＩアンチセンス植物内で見られたものよりは明確であった〔エドワーズら(E
dwards et al.(1999) Plant J. 17:251-261)〕。エンドウ変異体ｒｕｇ５ＮＩは
、バレイショのＳＳＩＩと高度に相同性であるデンプン合成酵素イソ型の欠失が
認められた。２種のデンプン合成酵素はアミノ酸配列で相同性を共有しているが
、このデンプン合成酵素イソ型がエンドウ内で阻害されると、異なる結果が生ま
れる。著しい変化が、短い（ｄｐ＜１５）、中間（ｄｐ１５−４５）および非常
に長い（ｄｐ約１０００）アミロペクチン分枝鎖中に現れた。さらに、これらの
構造変化は、デンプン粒形態の全体的変化と関連していた。従って、バレイショ
からの形質転換の結果は、特定の器官内で、デンプン合成酵素の種々のイソ型は
、デンプン生合成において種々の役割を持ち、エンドウｒｕｇ５変異体から得ら
れた結果は、相同性イソ型は、種々のデンプン貯蔵器官内で必ずしも同じ機能を
果たしていないことを示していることを示唆している。特定のイソ型の役割に関
する一般化および改質された発現を伴うデンプン表現型変化の予測は、異なる器
官内に存在するイソ型の相対数の相違ならびに異なるイソ型が寄与する活性の相
対量の相違のために困難をもたらす。デンプン合成酵素発現の改質を目的とする
トランスジェニック研究がバレイショについて報告されているけれども、トウモ
ロコシでは同様の研究は報告されていない。
【００１７】 米国特許（ＵＳ）第５８２４７９０号は、メイズから３種の非−ワキシーデン
プン合成酵素ｃＤＮＡクローンの単離および配列を報告している。これは、トラ
ンスジェニック植物内でのこれらのデンプン合成酵素の発現を改質するために設
計された構築物を生成させるためのこれらの配列の使用を示唆している。さらに
、これは改質されたタンパク質発現が、デンプンの微細構造内に変化を起こさせ
るであろうことも示唆している。３種のデンプン合成酵素のヌクレオチドおよび
タンパク質配列が提出されているけれども、これらの配列に由来するＤＮＡ構築
物を有するトランスジェニック植物の生成および特性に関するデータは提出され
ていない。同様にトランスジェニック植物中のデンプン組成および構造も報告さ
れていない。穀物内胚乳中の可溶性デンプン合成酵素の種々のイソ型の特異的な
役割がなく、そして問題となっている内胚乳中のＳＳＩＩａおよびＳＳＩＩｂク
ラス酵素に対する活性が存在する場合に〔カオら(Cao et al.(1999) Plant Phys
iol. 120:205-215) 〕、遺伝子配列単独では、存在するとして、デンプン構造に
対する変化のその形式が、特定の可溶性デンプン合成酵素遺伝子の発現の改変に
より達成されるかについて明確な指標が得られないことは明らかである。また、
この予測能力またはデンプンの実際の生産が存在しないと、ある与えられた変化
の有用性が明らかでない。実際、特定の機能的特性、例えば老化性に関して、あ
るデンプン構造変化が有用性に対して有害であることが明らかである。チアンゲ
およびトムソン(Qiange and Thompson (1998) Carbohydr. Res. 314:221-235)は
、メイズの３種の二重変異体、ｄｕｗｘ、ａｅｗｘおよびｓｕ２ｗｘの老化性を
正常のワキシーデンプンと比較して試験し、３種のアミロペクチンタイプの内、
２種で老化性の増加を証明した。従って、変化単独では、穀物デンプンの有用性
を改善するためには不十分であり、ある種の変化が進歩となり、一方、他のもの
は中性または有害であることは明らかである。与えられた遺伝子改質を用いて生
成できる構造変化を有意義に推測できる能力がない場合に、有用な変化を同定す
る唯一の方法は、改質されたデンプンを実際に生産することである。
【００１８】 改変された微細構造を有する穀類作物からデンプンの生成のための分子遺伝学
的解決は、伝統的な植物育種法よりも決定的な利点を有する。デンプン微細構造
への変化は、アンチセンス阻害またはコ−サプレッションによりＳＳまたはＳＢ
Ｅイソ型の１種またはそれ以上の発現を特異的に阻害して起こすことができる（
ＷＯ９４／０９１４４）。アンチセンスまたはコ−サプレッション構築物は、遺
伝子活性の優性な負のレギュレーターとして働く。従来の変異は遺伝子活性の負
の調節を発生できるが、これらの効果は劣性であることが多い。トランスジェニ
ック法を用いて利用できる優性の負の調節は、ある種の穀物生産法には有利であ
ろう。さらに、特定のプロモーターを用いて植物の再生産組織への改変されたデ
ンプン発現型の発現を制限する能力は、変異遺伝子が規則通りに発現されるすべ
ての組織内に効果を及ぼす従来の変異と比較して実用形質的な利点を与えるであ
ろう。最後に、染色体位置効果から起きるアンチセンス阻害またはコ−サプレッ
ションの種々のレベルは、穀物内胚乳内の変異対立因子の投与効果からもたらさ
れるものよりも広範囲のデンプン表現型を生産できる。
【００１９】 穀類作物内の種々のデンプン合成酵素の役割の不完全な理解は、デンプン合成
酵素遺伝子発現の阻害によりデンプン微細構造を操作する試みに困難をもたらす
。しかし、デンプン合成酵素遺伝子発現のコ−サプレッションおよびアンチセン
ス技術による操作は可能であり、または望ましい表現型を生成する可能性がある
。従って、当該技術分野の通常の技術者は、デンプン微細構造内の希望する改変
のための多重トランスジェニック植物をスクリーニングしなければならないだけ
である。
【００２０】
【発明の要約】
本発明は、トウモロコシ穀粒または内胚乳および他の穀類作物の穀粒または内
胚乳内のデンプン合成酵素の活性の改変のためのセンスおよびアンチセンスキメ
ラ遺伝子を構築するためのｃＤＮＡクローンの利用を開示する。さらに具体的に
は、本発明は、形質転換穀類作物の生産方法に関し、ここで、穀類作物の穀粒に
由来するデンプン微細構造は、非−形質転換穀類作物に由来するデンプンの微細
構造と比較して改変されており、（１）非ＧＢＳＳＩデンプン合成酵素構造遺伝
子をコードする核酸断片またはその断片を含んでなり、上流側においてセンスま
たはアンチセンスのいずれかの配向にて内胚乳組織内で遺伝子発現を支配するプ
ロモーターをコードする核酸断片に操作可能に連結され、そして下流側において
転写終止のための適合する調節配列をコードする核酸断片に操作可能に連結され
ているキメラ遺伝子を調製し、（２）該キメラ遺伝子を用いて穀類作物を形質転
換することを含んでなり、キメラ遺伝子の発現が、該キメラ遺伝子を有していな
い穀類作物に由来するデンプンの微細構造と比較して、形質転換穀類作物の穀粒
に由来するデンプンの微細構造の改変をもたらす方法に関する。本発明は、また
穀類作物の穀粒に由来するデンプン微細構造が、アミロースのアミロペクチンに
対する相対比率が、上記のキメラ遺伝子を有していない穀類作物に由来するデン
プンと比較して変化、または形質転換穀類作物に由来するデンプンのアミロース
成分の重合度が上記のキメラ遺伝子を有していない穀類作物に由来するデンプン
のアミロース重合度と比較して変化を有する、形質転換穀類作物を生産する方法
に関する。今日まで、トランスジェニック植物中の非−ＧＮＳＳＩデンプン合成
酵素の発現レベルを改変することによる穀類作物の分子構造中の改変を証明した
報告はない、本発明は、トランスジェニック植物中の非−ＧＮＳＳＩデンプン合
成酵素の発現を制御することにより創製できる、デンプン構造中の特定の改変、
アミロースとアミロペクチンとの比率の変化、アミロペクチン微細構造の変化、
非常に短いアミロペクチン鎖（ｄｐ６−９）の存在率の変化、およびアミロース
の重合度の変化を記載する。
【００２１】 また、本発明は、該方法を用いる形質転換により調製された穀類作物品種、上
記の方法を用いて調製された穀類作物品種の穀粒から単離されたデンプン、およ
び食料品、水および本方法を用いて調製された穀類作物品種の穀粒から単離され
たデンプンの有効量を組み合わせ、そして得られた組成物を必要ならば濃厚食料
品を調製するために調理することを含んでなる濃厚食料品を調製する方法に関す
る。
【００２２】 本発明は、また上記の方法を用いる形質転換のより調製された穀類作物品種、
該穀類作物品種の穀粒から調製された穀粉、および水、食品添加剤、および本方
法を用いて調製された穀類作物品種の穀粒からの穀粉の有効量を組合せ、そして
得られた組成物を必要ならばパン、ベーカリー製品、またはパスタを生産するた
めに調理することによるパン、ベーカリー製品、およびパスタの調製にも関する
。
【００２３】 本発明は、本発明の一部をなす下記の詳細な説明および添付の図面および配列
の記載によりさらに完全に理解できる。
【００２４】 配列表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ規格(1985 Nucleic Aicds Res. 13:3021-30
30、および1984 Biochem. J. 219:345-373) に準じて、ヌクレオチド配列表示に
関しては１文字記号、またアミノ酸に関しては３文字記号を用いており、本明細
書に引用して含まれる。
【００２５】
【詳細な説明】
本開示の範囲内で、多数の用語を使用する。本明細書中で使用される用語「デ
ンプン」は、種々の割合のα−Ｄ−（１，６）分枝を含んでいてもよいα−Ｄ−
（１，４）グルカンからなる多糖類を指す。本明細書中で使用される用語「デン
プン微細構造」は、デンプンポリマーの分子構造、ポリマー中のα−Ｄ−（１，
６）結合の存在、存在率および分布および分枝および非分枝の両方のα−Ｄ−（
１，４）グルカンの存在、存在率および分布を指す。デンプン微細構造は、アミ
ロペクチン分枝鎖分布により、またはアミロースとアミロペクチンとの相対比率
により、またはアミロースの重合度により記述される。いかなるこれらの構造分
子成分の改変も、改変されたデンプン微細構造をもたらす。これらのパラメータ
ーの１個、２個または３個すべては、たがいに独立して改変できる。用語「重合
度」は、分子またはアミロペクチンの分枝鎖のような分子の指定された部分中の
α−Ｄ−グルコピラノース単位の数を指す。本明細書中で使用される用語「分枝
鎖分布」は、アミロペクチンのイソアミラーゼ消化および引き続くサイズ排除ク
ロマトグラフィーによる遊離分枝の分別により検出されるα−Ｄ−１，４−結合
グルカン鎖の分布を指す。
【００２６】 本明細書中で使用される「穀類作物」は、食料品または産業用途に適合するデ
ンプンを含む種子を産出する植物を意味し、例えばメイズ（トウモロコシ）、コ
メ、モロコシ、コムギおよびオオムギである。本明細書中で使用される「単離さ
れた核酸断片」は、一本鎖または二本鎖、場合により合成、非天然または改変さ
れたヌクレオチド塩基を含むＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポ
リマーの形の単離された核酸断片は、１種またはそれ以上のｃＤＮＡ、ゲノムＤ
ＮＡまたは合成ＤＮＡを含んでなっていてもよい。
【００２７】 本明細書中で使用される「本質的に類似」は、１個またはそれ以上のヌクレオ
チド塩基の変化が、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換をもたらすが、ＤＮＡ
配列によりコードされるタンパク質の機能的性質に影響を及ぼさない核酸断片を
指す。「本質的に類似」は、また１個またはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化
が、アンチセンスまたはコ−サプレッション技術による遺伝子発現の改変を媒介
する核酸断片の能力に影響を及ぼさない核酸断片も指す。「本質的に類似」は、
また本発明の核酸断片の改質、例えばアンチセンスまたはコ−サプレション技術
による遺伝子発現の改変または生成するタンパク質分子の機能的特性の改変を媒
介する能力に関してもたらされる転写物の機能的特性に影響を及ぼさない１個ま
たはそれ以上のヌクレオチド塩基の欠失または挿入も指す。従って、本発明は、
特定の例示した配列以上を包含すると理解される。例えば、遺伝子発現のアンチ
センス阻害およびコ−サプレッションが遺伝子のコード領域全体より狭い領域を
代表する核酸断片を用いてでも、また阻害されるべき遺伝子の１００％同一性は
共有していない核酸断片によってでも達成できることは、よく知られている（米
国特許（ＵＳ）第5,107,065 号）。さらに、化学的に等価のアミノ酸の与えられ
た部位における生成をもたらすが、しかしコードしたタンパク質の機能的特性に
は影響を及ぼさない遺伝子の改変は、当該技術分野ではよく知られている。従っ
て、アミノ酸アラニン、疎水性アミノ酸のコドンは、別の疎水性がこれより低い
他の残基、例えばグリシンをコードするコドンにより置換されてもよい。同様に
、アミノ酸アラニンのコドンは、疎水性がこれより高い他の残基、例えばバリン
、ロイシン、またはイソロイシンをコードするコドンにより置換されてもよい。
同様に、負に荷電した残基の他のもの、例えばグルタミン酸をアスパラギン酸へ
、または正に荷電した残基の他のもの、例えばアルギニンをリシンへの置換をも
たらす変化も、機能的に等価な生成物を産生すると推定できる。タンパク質分子
のＮ−末端およびＣ−末端部分の改変をもたらすヌクレオチド変化も、タンパク
質の活性を改変するとは推定されない。提出されたそれぞれの改質は、コードし
た生産物の生物学的活性の保持の決定として、当該技術分野では日常的な技術で
ある。さらに、熟練者は、本発明に包含される本質的に類似した配列は、またス
トリンジェントな条件下（０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）において
、本明細書中に例示した配列を用いてハイブリダイズするこれらの能力により規
定されることも認識している。本発明の好ましい本質的に類似した核酸断片は、
そのＤＮＡ配列が、ここに報告する核酸断片のＤＮＡ配列に８０％は等しいこれ
らの核酸断片である。さらに好ましい核酸断片は、ここに報告する核酸断片のＤ
ＮＡ配列に９０％は等しい。最も好ましいものは、ここに報告する核酸断片のＤ
ＮＡ配列に９５％は等しい。本明細書中で使用される同一性の百分率は、ジョツ
ン−ヘインアルゴリズム〔Ｊ．Ｊ．ヘイン(Hein, J.J., 1990, Meth. Enz. 183:
626-645)〕を用いるダイナスター（DNASTAR)タンパク質アラインメントプロトコ
ールにより正確に決定できる。多重アラインメントのためのジョツン−ヘイン法
のためのデフォールトパラメーターは、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１１、ＧＡＰ
ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、対アラインメントに対してはＫＴＵＰＬ
Ｅ＝６である。
【００２８】 「コドン縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響すること
なく、ヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コードの分散性を指す。従っ
て、本発明は、配列番号５、１１、１２、１５、１６および２０に記載のＳＳ１
またはＳＳｂタンパク質をコードするアミノ酸配列の全体または本質的な一部分
をコードするあらゆる核酸断片に関する。熟練者は、与えられたアミノ酸を指定
するために、ヌクレオチドコドンの使用における特定の宿主細胞により現れる「
コドンの偏り」をよく知っている。従って、宿主細胞内で改善された発現のため
の遺伝子を合成する際に、コドン使用頻度が宿主細胞内の好ましいコドン使用の
頻度に近いように遺伝子を設計することが望ましい、 「遺伝子」は、コーディング配列に先立つ（５’−非コーディング配列）およ
び後に続く（３’−非コーディング配列）調節配列を含む、特定のタンパク質を
発現する核酸断片を指す。「本来の遺伝子」は、それ自体の調節配列を伴って天
然に見いだされる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見いださ
れない調節およびコーディング配列を含んでなる、本来の遺伝子ではないいずれ
かの遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列お
よびコーディング配列、または同じ起源ではあるがしかし天然に見いだされると
は異なる様式で配列される調節配列およびコーディング配列を含んでもよい。「
内因性遺伝子」は、生物体のゲノム中のその天然の位置にある本来の遺伝子を指
す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内には通常見いだされないが、しかしそれは
遺伝子導入により宿主生物体内に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天
然生物体内に挿入された本来の遺伝子またはキメラ遺伝子を含むことができる。
「導入遺伝子」は、形質転換操作によりゲノム内に導入されている遺伝子である
。
【００２９】 「コーディング配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す
。「開始コドン」および「終止コドン」は、タンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）の
それぞれ開始および連鎖終止を規定するコーディング配列内の３個の隣接するヌ
クレオチドの単位を指す。「読み取り枠」は、コーディング配列の翻訳開始と停
止コドンの間でコードされるアミノ酸配を指す。「調節配列」は、コーディング
配列に先立ち（５’−非コーディング配列）、その中、または後に続いて（３’
−非コーディング配列）位置するヌクレオチド配列を指し、またこれは、転写、
ＲＮＡプロセッシングまたは安定性、または関連(associate)するコーディング
配列の翻訳に影響を及ぼす。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イ
ントロン、およびポリアデニル化認識配列を含んでいてもよい。
【００３０】 「プロモーター」は、コーディング配列または機能性ＲＮＡの発現を制御する
ことが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コーディング配列はプロモーター配列
の３’に位置する。プロモーター配列は、近位およびさらに遠位の上流要素から
なり、後者の要素はしばしばエンハンサーと呼ばれる。従って「エンハンサー」
は、プロモーター活性を刺激でき、またプロモーターの先天的要素またはプロモ
ーターのレベルまたは組織特異性を高めるように挿入された非相同性要素であっ
てもよいＤＮＡ配列である。プロモーターは、本来の遺伝子にその全体が由来す
るか、または天然に見いだされる種々のプロモーターに由来する種々の要素から
なっているか、または合成ＤＮＡセグメントさえ含んでいてもよい。種々のプロ
モーターは、種々の組織または細胞タイプ内で、または発生の種々の段階で、ま
たは種々の環境条件に対応して遺伝子の発現を支配してもよいことが当該分野の
専門家には理解できる。大部分の時点で大部分の細胞タイプ内で発現される遺伝
子を生成させるプロモーターは、共通的に「構成的プロモーター」と呼ばれる。
植物細胞内で有用な多様な型の新規プロモーターが常に発見されている。多数の
例は、オカムロおよびゴールドベルグの総説(Okamuro, Goldberg.(1989) Bioche
m. Plants 15:1-82)中に見出すことができる。多くの場合に調節配列の正確な境
界が完全には定義されていないために、種々の長さのＤＮＡ断片が同一のプロモ
ーター活性を有することができることがさらに認められる。
【００３１】 「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコーディング配列との
間に位置するＤＮＡ配列を指す。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流の完
全にプロセシングされたｍＲＮＡ中に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡ
に対する一次転写物のプロセシング、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響を
及ぼすことがある。翻訳リーダー配列の例は、Ｒ．ターナーおよびＧ．Ｄ．フォ
スター(R. Turner, G.D. Foster.(1995) Molecular Biotechynology 3:225)中に
記載されている。
【００３２】 表現「３’−非コーディング配列」は、コーディング配列の下流側に位置する
ＤＮＡ配列を指し、また、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセシン
グまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナルをコードする他の
配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端への
ポリアデニル酸形質の付加に影響を及ぼすことと特徴とする。種々の３’非コー
ディング配列の使用は、インゲルブレヒトら(Ingelbrecht et al.(1989) Plant
Cell 1:671-680) に例示されている。
【００３３】 「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼで触媒される転写から
生じる生産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場
合は、それは一次転写物と呼ばれるか、またはそれは一次転写物の転写後プロセ
シング由来のＲＮＡ配列であってもよく、また、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッ
センジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、イントロンを含まずかつ細胞によりタンパ
ク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに相補的であり、
かつこれに由来する二本鎖ＤＮＡを指す。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み
、従って細胞によりタンパク質に翻訳できるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセン
スＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部分に相補的であ
り、かつ標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許（ＵＳ
）第５，１０７，０６５号）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転
写物のいずれかの部分、すなわち５’−非コーディング配列、３’−非コーディ
ング配列、イントロンまたはコーディング配列であってもよい。「機能性ＲＮＡ
」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはまだ翻訳されないがしか
し細胞の過程には影響を及ぼすその他のＲＮＡを指す。
【００３４】 用語「操作可能に連結」は、一方の機能が他方により影響を受けるような単一
の核酸断片上の核酸配列の関連を指す。例えば、プロモーターは、それがコーデ
ィング配列の発現に影響を及ぼすことが可能である（すなわちコーディング配列
がそのプロモーターの転写制御下にある）場合に、そのコーディング配列と操作
可能に連結されている。コーディング配列は、センスまたはアンチセンスの配向
で調節配列に操作可能に連結されることができる。
【００３５】 本明細書中で使用される用語「発現」は、本発明の核酸に由来するセンス（ｍ
ＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた
ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すこともできる。「アンチセンス阻害」は
、標的タンパク質の発現を抑制することが可能であるアンチセンスＲＮＡ転写物
の産生を指す。「過剰発現」は、正常、すなわち形質転換されていない生物体中
での産生のレベルを越えるトランスジェニック生物体内での遺伝子生産物の産生
を指す。「コ−サプレッション」は、外来または内因性遺伝子が、十分に相同性
の導入遺伝子の導入により沈黙される植物内での現象を指す。遺伝子不活性化の
機構は、よくは理解されていないけれども、転写のブロックによるかまたはｍＲ
ＮＡ蓄積の阻害により起きることがある。例えば、米国特許（ＵＳ）第５，２３
１，０２０号は、同一または本質的に類似の外来または内因性遺伝子の発現を抑
制することが可能なセンスＲＮＡ転写物の産生を記載している。
【００３６】 「改変されたレベル」は、正常または形質転換されていない生物体のものとは
異なる量または割合でのトランスジェニック生物体内での遺伝子生産物の産生を
指す。
【００３７】 「形質転換」は、遺伝子的に安定な遺伝形質をもたらす、宿主生物体のゲノム
内への核酸断片の導入を指す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物体は、「
トランスジェニック」生物体と呼ばれる。植物形質転換の方法の例は、アグロバ
クテリウム(Agrobacterium) 媒介形質転換〔デブレルら(DeBlaere et al. (1987
) Meth. Enzymol. 143:277) 〕および粒子加速(particle accelerated)または「
ジーンガン(gene gun)」形質転換技術〔クラインら(Klein et al.(1987) Nature
(London)327:70-73)；米国特許(US)第4,945,050 号〕を含む。
【００３８】 本明細書中で使用される標準的な組替えＤＮＡおよび分子クローニング技術は
、当該技術分野ではよく知られており、さらに詳細にはＪ．サンブルックら「分
子クローニング：実験室マニュアル」(Sambrook, J., Frits ch, E.F., Maniati
s, T. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"; Cold Spring Harbor Labor
atory Press: Cold Spring Harbor, 1989, 以後「マニアチス」と呼ぶ) に記載
されている。
【００３９】 用語「ペースト化」は、粒の膨潤および水和、懸濁液の粘度の急速な上昇、お
よび懸濁液からゾルの形成を特徴とするデンプン粒またはデンプン粒懸濁液の不
可逆的物理変化を指す。この変化はまた調理またはゼラチン化としても知られて
いる。略号「ＳＮＵ」は、攪拌数単位を指し、粘度の尺度として約１０センチポ
イズに等しい。ＳＩ単位（パスカル秒）への換算のためには、センチポイズに１
０００を乗じる、すなわち、１ＰａＳｅｃ＝１０００ｃｐである。従って、１Ｓ
ＮＵ＝０．０１ＰａＳｅｃである。用語「ゾル」は、液状コロイド系を指す。用
語「粘度」は、液体のコンシステンシーまたは濃密度として考えられる液体の内
部摩擦の尺度である。
【００４０】 本発明は、デンプン合成、特にはデンプンポリマー形成（デンプン合成）に関
与する酵素をコードする遺伝子の発現が、アミロペクチンの分枝鎖分布、アミロ
ースとアミロペクチンとの相対比率、またはデンプンのアミロース成分の重合度
に変化を起こすように調整される、トランスジェニック穀物を産出する植物の構
築に関する。このようなデンプン微細構造の改質は、トランスジェニック穀類作
物から単離されたデンプンの物理的性質の改変をもたらす。このデンプン微細構
造の改変は、食料品および産業用途に有益な新規のデンプン加工性の生成となる
。
【００４１】 これらの遺伝子の中で好ましいものは、ＧＢＳＳＩ以外の単子葉デンプン合成
酵素をコードする遺伝子であり、そのクローニングは、上記に考察している。こ
れらの遺伝子は、所望の遺伝子のヌクレオチド配列が既知である場合、または他
の生物体からの相同遺伝子の配列が既知である場合に、遺伝子の単離のために熟
練者により日常的に利用されている技術により単離できる。所望の遺伝子に関す
る配列情報は、適当な遺伝子ライブラリーから全デンプン合成酵素遺伝子の同定
および単離のためのオリゴヌクレオチドプローブを調製するために使用できる。
このライブラリーは、コーディング領域が単一ＤＮＡ断片に含まれていてもよい
か、または数種の区分されたＤＮＡ断片上に含まれていてもよいゲノムライブラ
リーであってもよい。さらに、デンプン合成酵素をコードする２個またはそれ以
上のエキソンは、１個またはそれ以上ののイントロンにより分離されていてもよ
い。あるいは、ライブラリーは、全コーディング領域を１個の隣接配列として含
んでなるｃＤＮＡクローンを単離する見込みが大きいｃＤＮＡライブラリーであ
ってもよい。いずれの場合でも、適当なクローンは、所望の遺伝子の１部分また
はそれ以上の部分に相当するプローブとのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ンにより同定できる。あるいは、オリゴヌクレオチドプライマーが調製でき、ま
たＤＮＡから、または上記のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーからのデンプン
合成酵素コーディング領域のすべてまたは一部分を増幅および引き続いて単離す
るためのＰＣＲプライマーとして使用できる。
【００４２】 デンプン合成酵素活性を測定するために、数種の異なる検定法が使用できる。
活性は、放射能標識ＡＤＰ−グルコース（14Ｃ−グルコース）のアルコール不溶
性ポリマー中への組み込みを検定する種々の方法を用いて検定してもよい〔ポロ
ックおよびプリース(Pollock, Pries,(1980) Arch. Biochem. Biphys. 204, 578
-588);キーリングら(Keeling et al. (1994) Aust. J. Plant Physiol. 21:807-
827); フォンテーンら(Fontaine et al.(1993) J. Biol. Chem. 268:16223-1623
0)〕。キーリングらの方法が代表的である。発生中のトウモロコシ穀粒からの内
胚乳を切り取り、凍結乾燥し、液体窒素中で磨砕する。抽出液は、磨砕組織１０
０ｍｇを緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１
ｍＭ ＤＴＴ）２ｍｌ中に懸濁させて調製され、そして機械的ホモジナイザーを
用いてホモジナイズされる。ホモジネートを３０，０００ｘｇで遠心分離し、上
清を可溶性デンプン合成酵素活性について検定する。簡単には、可溶性合成酵素
活性は、１．５ｍＬ試験管中で、ウサギ肝グリコーゲン２５ｍＬ（２ｍｇ）およ
び緩衝液（２００ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ、９ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＫＣｌお
よび２０ｍＭ還元グルタチオン、ｐＨ８．３）１００ｍＬを用いて検定される。
可溶性抽出液５０ｍＬを加え、２分間予備インキュベーションする。検定は、８
．０ｍＭ ＡＤＰ−グルコース（14Ｃ、４４４ｄｐｍ ｎｍｏｌ-1）２５ｍＬを
加えて開始し、そして１０分間進行させ、次いで０．２５Ｍ ＮａＯＨ１００ｍ
Ｌを加える。グルカンがメタノール１．０ｍＬの添加により沈降し、５分間氷上
で冷却し、次いで遠心分離する。グルカンを０．１Ｍ ＮａＯＨ中に再溶解させ
、メタノールを用いて二回目の沈降を行う。沈降物を次いで加熱してゼラチン化
させ、次いでシンチレエーションカクテルを加え、シンチレーションカウンター
で放射能を測定する。
【００４３】 トウモロコシ内のデンプン微細構造を改変するために、デンプン合成酵素をコ
ードする遺伝子の発現が、１）所望の植物組織内、２）最大の所望の効果を与え
る発生の段階、および３）発現がデンプン微細構造内に測定可能で顕著な変化を
起こすようにデンプン合成酵素機能の改変をもたらす遺伝子発現レベルにおいて
、遺伝子の発現に適する調節要素の制御下にあるようにキメラ遺伝子を構築する
。外来遺伝子の植物内での発現は、よく確立されている〔クラインら(Klein et
al.(1987) Nature(London), 327:70-73); およびデブレルら(DeBlaere et al.,(
1987) Meth. Enzymol. 143:277-291) 〕。トウモロコシ内のセンスまたはアンチ
センス合成酵素遺伝子の発現の適当なレベルは、種々の調節要素を用いる種々の
キメラ遺伝子の使用を要してもよい。さらに、コ−サプレッションまたはアンチ
センスサプレッションによる外因性デンプン合成酵素遺伝子発現の有効な調整は
、デンプン合成酵素のセンスまたはアンチセンス配列の種々の領域を含んでなる
キメラ遺伝子の構築を要してもよい。コ−サプレッションまたはアンチセンス法
のよく知られている変動性から、種々の遺伝子構築物を使用しても、所望の表現
型を有するものを同定するためには複数の植物をスクリーニングしなければなら
ないことが明らかである。
【００４４】 トランスジェニック植物中の遺伝子発現を駆動(drive) するために使用される
プロモーターは、多数の供給源から導入できるが、それは選定されたプロモータ
ーが、翻訳可能なｍＲＮＡ、コ−サプレッションに適するｍＲＮＡ、または所望
の宿主組織内のアンチセンスＲＮＡを発現することにより本発明を達成するため
に十分な転写活性を有する限りにおいて該当する。例えば、植物器官の広い範囲
内での発現のためのプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス中で１９Ｓ
および３５Ｓ転写物を支配するもの〔オデルら(Odell et al.(1985) Nature 313
:810-812);ハルら(Hull et al.,(1987) Virology 86:482-493)〕、リブロース１
，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ中の小さいサブユニット〔モレリら(Morelli
et al.(1985) Nature 315:200-204);ブロリーら(Bloglie et al.(1984) Scienc
e 224:838-843); ヘレラ−エストレラら(Hererra-Estrella et al.,(1984) Natu
re 310:115-120);コルッチら(Coruzzi et al.(1984) EMBO J. 3:1671-1679); フ
ァチオッティら(Faciotti et al.(1985) Bio/Technology 3:241)〕およびクロロ
フィルａ／ｂ結合タンパク質〔ランパら(Lamppa et al. (1986) Nature 316:750
-752) 〕を含む。
【００４５】 用途に応じて、植物の１種またはそれ以上の器官内での発現に特異性であるプ
ロモーターを選択することが望ましいであろう。その例には、光合成器官内で発
現が望まれる場合にはリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小さい
サブユニットの光誘導性プロモーター、または種子内で特異的に活性のプロモー
ターが含まれる。
【００４６】 好ましいプロモーターは、種子内で特異的に発現をさせるものである。種子は
長期のデンプン蓄積の一次場所なので、これは特に有用であろう。さらに、種子
特異性発現は、デンプン合成酵素調整が非種子器官を持つような起こる得る不利
な効果を避けることができる。種子特異性プロモーターの例には、これには限定
されないが、種子貯蔵タンパク質のプロモーターが含まれる。種子貯蔵タンパク
質の発現は、植物内では厳格に調節され、高度に器官特異性かつ段階特異性の様
式で種子内でほとんど独占的に発現される〔ヒギンスら(Higgins et al.(1984)
Ann. Rev. Plant Physiol. 35:191-221); ゴールドベルグら(Goldberg et al.(1
989) Cell 56:149-160);トムソンら(Thompson et al. (1989) Bio Essays 10:10
8-113)〕。さらに、種々の種子貯蔵タンパク質が、種子発生の種々の段階で発現
されてもよい。現在、トランスジェニック植物内の種子貯蔵タンパク質遺伝子の
種子特異性発現の多数の例がある。これらには、単子葉植物、例えばオオムギβ
−ホルデイン(hordein) 〔マリスら(Marris et al.(1988) Plant Mol. Biol. 10
: 359-366)〕およびコムギグルテニン〔コローら(colot et al. (1987) EMBO J.
6:3559-3564) 〕からの遺伝子が含まれる。さらに、キメラ遺伝子構築物中で非
相同コーディング配列に操作可能に連結されている種子特異性遺伝子のプロモー
ターも、またトランスジェニック植物中でその時間的および空間的な発現パター
ンを維持している〔ゴールドベルグら(Goldberg et al.(1989) Cell 56:149-160
) 〕。このような例には、ファゼオリンまたはシロイロナズナ(Arabidopsis) ２
Ｓアルブミンプロモーターのブラジルナット２Ｓアルブミンコーディング配列の
連結およびタバコ、シロイロナズナ、またはブラシカ・ナプス(Brassica napus)
内でのこの組み合わせの発現〔アルテンバッハら(Altenbach et al.(1989) Plan
t Mol. Biol. 13:513-522); アルテンバッハら(Altenbach et al.(1992) Plant
Mol. Biol. 18:235-245); デクラークら(DeClercq et al. (1990) Plant Physio
l. 94:970-979)〕、ルシフェラーゼを発現するためのエンドウレクチンおよびエ
ンドウｂ−ファゼオリンプロモーターの使用〔リッグズら(Riggs et al. (1989)
Plant Sci. 63: 47-57)〕、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ発現のためのコムギグルテニンプロモーター〔コローら(Colot et al. (1
987) EMBO J. 6:3559-3564) 〕が含まれる。
【００４７】 本発明の核酸断片の発現における特別な用途は、数種の広範に特性が研究され
ているトウモロコシ種子貯蔵タンパク質遺伝子からのプロモーター、例えば１０
ｋＤゼイン遺伝子〔キリハラら(Kirihara et al.(1988) Gene 71:359-370) 〕、
１５ｋＤゼイン遺伝子〔ホフマンら(Hoffman et al.(1987) EMBO J. 6:3213-322
1); シャーンターナーら(Schernthaner et al. (1988) EMBO J. 7:1249-1253)；
ウイリアソンら(Williamson et al. (1988) Plant Physiol. 88:1002-1007)〕、
２７ｋＤゼイン遺伝子〔プラトら(Prat et al.(1987) Gene 52:51-49); ガラー
ドら(Gallardo et al. (1988) Plant Sci. 54:211-281)〕および１９ｋＤゼイン
遺伝子〔マークスら(Marks et al.(1985) J. Biol. Chem. 260:16451-16459) 〕
からの内胚乳−特異性プロモーターであろう。トウモロコシ内でのこれらのプロ
モーターの相対転写活性が報告されており〔コルドルジックら(Kordrzyck et al
. (1989) Plant Cell 1:105-114)〕、トウモロコシのためのキメラ遺伝子構築物
中に使用するのためのプロモーターを選択するための基礎を提供している。さら
に、デンプン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を駆動するプロモ
ーターは、本発明の実施に使用してもよい。これらには、これに限定はされない
が、スクロース合成酵素の５’−調節配列〔ヤング、Ｎ．Ｓ．およびラッセル、
Ｄ．(Young, N.S., Russel, D. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-4
148)〕、ワキシーまたは粒結合デンプン合成酵素Ｉ〔ウンガーら(Unger et al.
(1991) Plant Physiol. 96:124) 〕遺伝子、ｓｈ２〔ベーヴら(Bhave et al.(19
90) Plant Cell 2:581-588) 〕およびｂｔ２〔ベーら(Bae et al.(1990) Maydic
a 35: 317-322)〕遺伝子が含まれ、これらの生産物は、酵素ＡＤＰ−グルコース
ピロホスホリラーゼを構成する。熟練者は、これらの初期の例に、いまでは最近
のゲノム科学技術を用いて単離された多数のデンプン生合成およびその他の種子
特異性遺伝子を追加することができ、これらは本発明の実施の目的に使用できる
種子特異性プロモーターの殆ど無限の供給源を提供することを認めるであろう。
必要な場合には、ｃＤＮＡクローンは、関係する調節配列を含むゲノムクローン
を単離するために使用できる。これらのプロモーターのいずれかからの発現は、
イントロン配列中に見いだされるものを含め、エンハンサー配列の使用により増
加できた〔例えばカリスら(Callis et al. (1987) Genes Dev. 1:1183-1200);マ
ースら(Maas et al. (1991) Plant Nol. Biol. 16:199-207); リュルセン、Ｋ．
Ｒ．およびワルボット、Ｖ．(Luehrsen, K.R., Walbot, V. (1991) Mol. Gen. G
enet. 225:81-93); オールドら(Oard et al. (1989) Plant Cell Rep. 8:156-16
0)参照〕。
【００４８】 ポリアデニル化シグナルを提供できるいかなる３’−非コーディング領域およ
び適切な発現に必要なその他の調節配列も、本発明を達成するために使用できる
。これには、いずれかの貯蔵タンパク質からの３’末端、例えば１０ｋＤ、１５
ｋＤ、２７ｋＤおよびアルファゼイン遺伝子の３’末端、エンドウファゼオリン
遺伝子の３’末端、ダイズβ−コングリシニン遺伝子の３’末端、ウイルス遺伝
子の３’末端、例えば３５Ｓまたは１９Ｓカリフラワーモザイクウイルス転写物
の３’末端、オパイン合成遺伝子からの３’末端、リブロース１，５−ビスリン
酸カルボキシラーゼまたはクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質をコードする遺伝
子の３’末端、または使用した配列がその核酸配列内で必要な調節情報を提供し
、操作可能に連結されているプロモーター／コーディング領域組合わせの適切な
発現をもたらすようなあらゆる遺伝子からの配列の３’末端が含まれる。種々の
３’非−コーディング領域の有用性を教示する当該技術分野における多数の例が
ある〔例えばインゲルブレヒトら(Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:67
1-680)参照〕。高等植物の真核細胞中にＤＮＡ配列を導入する（すなわち形質転
換する）種々の方法が、当該技術分野の専門家には利用できる（ＥＰＯ出版物02
95959A2 および0138340A1 参照）。このような方法には、核酸構築物を被覆した
金属粒子を用いる高速弾道ボンバードメント(ballistic bombardment) 〔クライ
ンら(Klein et al.(1987) Nature(London), 327:70-73)、および米国特許（ＵＳ
）第4,945,050 号参照〕、ならびにアグロバクテリウム種のＴｉおよびＲｉプラ
スミドに基づく形質転換ベクター、特にはこれらのベクターのバイナリー形に基
づくものが含まれる。Ｔｉ−由来ベクターは、双子葉植物、例えばダイズ、綿お
よびナタネを含む広く各種の高等植物を形質転換する〔パッチオッティら(Pacci
otti et al., (1985) Bio/Technology 3:241）; バーンら(Byrne et al. (1987)
Plant Cell, Tissue and Organ Culture 8:3); スカピンダら(Sukhapinda et a
l.(1987) Plant Mol. Biol. 8:209-216); ローツら(Lorz et al. (1985) Mol. G
en. Genet. 199:178-182);ポトリクスら(Potrykus et al.(1985) Mol. Gen. Gen
et. 199:183-188); チューＲ．ら(Qu, R. et al. (1996) Dev. Bio.-Plant 32:2
33-240）; バジル Ｖ．ら(Vasil, V. et al. (1993) Bio/Technology 11:1553-
1558) 〕およびさらに最近には、単子葉植物、例えばコメおよびトウモロコシ〔
ヒエイ、Ｙ．ら(Hiei, Y et al. (1994) Plant J. 6:271-282) 〕。
【００４９】 その他の形質転換方法の当該技術分野の専門家は利用でき、例えば外来ＤＮＡ
構築物の直接取り込み（ＥＰＯ出版物0295959A2 ）、およびエレクトロポレーシ
ョンの技術〔フロムら(Fromm et al. (1986) Nature(London) 319:791-793)〕が
ある。一旦形質転換されると、細胞は、当該技術分野の専門家により成熟植物に
再生できる。すなわち、商業的に重要な穀物、例えばナタネ〔デブロックら(DeB
lock et al. (1989) Plant Physiol. 91:694-701) 〕、ヒマワリ〔エヴェレット
ら(Everett et al. (1987) Bio/Technology 5:1201-1204)〕、ダイズ〔マッケー
ブら(MeCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926);ヒンチーら(Hinchee e
t al. (1988) Bio/Technology 6:915-922); チーら(Chee et al. (1989) Plant
Physiol. 91:1212-1218); クリストウら(Christou et al. (1989) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86:7500-7504); ＥＰＯ出版物0301749A2)〕、コメ〔チュ，Ｒ．
ら(Qu R. et al. (1996) Dev. Bio-Plant 32:233-240);ヒエ Ｙ．ら(Hie Y. et
al. (1994) Plant J. 6:271-282) 〕、コムギ〔ヴァーゼル，Ｖ．ら(Vasel,V.
et al. (1993) Bio/Technology 11:1553-1558)〕、およびトウモロコシ〔ゴード
ン−カムら(Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618); フロムら(Fro
mm et al. (1990) Bio/Technology 8:833-839)〕内に核酸断片を導入する数種の
最近報告された方法も関連がある。
【００５０】 当該技術分野の専門家は、原形質体内へのＤＮＡの導入および該原形質体から
植物の再生〔オミルレら(Omirulleh et al. (1993) Plant Mol. Biol. 21:415-4
23) 〕、不変組織のエレクトロポレーション〔ダルインら(D'Halluin et al. (1
992) Plant Cell 4:1495-1505); ロールセンら(Laursen et al. (1994) Plant M
ol. Biol. 24:51-61) 〕、炭化珪素媒介のメイズ細胞の繊維形質転換〔ケップラ
ーら(Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566);フレームら(F
rame et al. (1994) Plant J. 6:941-948)〕を含むトランスジェニックメイズ植
物の生産のためのさらに他の方法にも精通している。上記のメイズカルス細胞の
粒子ボンバードメントの方法に加えて、当該技術分野の専門家は、メイズ胚盤ま
たは懸濁液カルチャーの粒子ボンバードメントを用いて受粉したトランスジェニ
ック植物を得ることにも精通している〔コジールら(Koziel et al. (1993) Bio/
Technology 11:194-200); ウオルターズら(Walters et al. (1992) Plant Mol.
Biol. 18: 189-200)〕。
【００５１】 当該技術分野の専門家は、空間の考慮が、特定の遺伝子の発現を低下させるた
めに、アンチセンスまたはコ−サプレッション技術の使用と関連していることを
知っているであろう。米国特許（ＵＳ）第５，１９０，９３１号、第５，１０７
，０６５号および第５，２８３，３２３号は、これら技術の実現性を開示してい
る。一旦上記の方法の一つを用いてトランスジェニック植物が得られると、所望
の表現型を最も効率的に示しているものを個別のトランスジェニック体からスク
リーニングすることが必要となる。当該技術分野の専門家には、同じ構築物を有
する個別のトランスジェニック植物でも発現レベルが異なることはよく知られて
いる。この現象は共通的に「位置効果」と呼ばれている。例えば、問題の構築物
が関係する遺伝子の高いレベルでの発現のために設計される場合に、個別の植物
は、産生するタンパク質の量、従って酵素活性が変動する。これは他方では表現
型に影響する。従って、これらの技術の使用の場合に、個別の植物中でのこれら
の効率は予測不可能であるが、しかし多数のトランスジェニック集団を与えると
、抑制された遺伝子を有する個体が得られるであろう。いずれの場合でも、時間
を節約するために、当該技術分野の専門家は、抑制しようとする遺伝子の１箇所
またはそれ以上の箇所を含む複数の遺伝子構築物を調製するであろうが、それは
当該技術が、特定の遺伝子に対してどれが最も有効であるかを予測する方法を教
示しないからである。さらに、最も効率的な構築物でも、単離された個別のトラ
ンスジェニック株の一部分のみに効率的な抑制表現型を与えるだけであろう。例
えば、ＷＯ９３／１１２４５およびＷＯ９４／１１５１６は、カノーラ中で脂肪
酸デサチュラーゼ遺伝子の発現を抑制しようと試みた場合に、実際の抑制は、試
験した株の１％以下で得られたことを公開している。他の種では、その百分率は
いくらか高いが、しかしどの場合でも百分率は１００％には達していない。これ
は、本発明の限界ではなく、反対に、当該技術分野の専門家により評価および予
測される実際的な事項と考えられるべきである。従って、熟練者は、多数の形質
転換体をスクリーニングするための方法を開発するであろう。これらのスクリー
ニングの性質は、一般に実際的な基礎に立って選択され、本発明の固有の部分で
はない。例えば、この場合に、デンプン表現型における変化をクロマトグラフィ
ーを用いて観察し、アミロースとアミロペクチンとの相対比率、アミロペクチン
分枝鎖分布、重合度、ラピッド・ヴィスコ分析(Rapid Visco Analysis)、食品ヒ
ドロコロイド、特にはデンプンの機能性を測定するための標準の工業的方法（実
施例で行っているもの）、またはその他の手段により決定することによりスクリ
ーニングできる。同様に抑制されている遺伝子によりコードされるタンパク質に
対して特異性の抗体を用いることも、または特異的に酵素活性を測定する検定法
を確立することができるであろう。好ましい方法は、多数の試料が迅速に処理で
きるものであり、それというのも試料の大部分は陰性であると予測されるからで
ある。
【００５２】 穀物中に改変されたデンプン微細構造を有すると同定された植物は、従来の穀
類作物株および既知のデンプン変異体に対して優位を示す独特の遺伝子材料とな
る。ＳＳイソ型の阻害された発現を有する本発明の株の穀類作物栽培における使
用は、栽培プロセスを簡単化および迅速化できる優性基質を提供する。既知のデ
ンプン変異体を使用できるが、しかしこれらはしばしば劣性であり、さらに複雑
となる。さらに、コムギのような穀類作物に対しては、限定された数の変異体が
知られているだけである。さらに、ＳＳイソ型を阻害するアンチセンスまたはコ
−サプレッションの使用は、染色体の位置効果のために阻害のレベルの変動が起
きる。もたらされたＳＳ活性の変動するレベルは、従来の変異体を用いてでは不
可能な広範囲の表現型に導き、これは穀類作物内胚乳の変異対立因子の限定され
た一連の供給物をもたらすことができる。追加的な独特で価値があると考えられ
るデンプン微細構造は、改変されたＳＳ活性を有する新規に開発されたトウモロ
コシ株相互におよび／または既知のデンプン変異体、例えばｗｘまたはａｅとの
交配からもたらされる。
【００５３】 実施例 本発明を、以下の実施例によりさらに説明する。実施例は説明のためのみに提
出するものであり、本発明は実施例中の記載の用途制限されるものではないと理
解される。温度の値は摂氏度で示され、百分率の値は特に断らないかぎり体積に
対する重量である。本発明は、その改変されたデンプンの性質が、例えば、これ
らには限定されないが、食料品、紙、プラスチック、接着剤、または塗料に有用
ないかなる目的にも使用できるトランスジェニック穀類作物を生成するために使
用できる。上記の考察および以下の実施例から、当該技術分野の専門家は、本発
明の思想および範囲から外れることなく、種々の用途および条件に適合させるよ
うに本発明の種々の変化および改質を行うことができることを認めることができ
る。すべてのこのような改質は、本請求範囲内に入るとを意図している。
【００５４】 実施例１ トウモロコシデンプン合成酵素Ｉのアンチセンス構築物を発現するトランスジェ ニックトウモロコシの調製 トウモロコシデンプン合成酵素Ｉクローンの単離 コメからの可溶性デンプン合成酵素のｃＤＮＡ配列〔ババ、Ｔ．ら(Baba, T.
et al. (1993) Plant Physiol. 103:565-573) 〕を、トウモロコシ中の相同性デ
ンプン合成酵素配列の検出のためのＤＮＡプローブを生成するために使用した。
オリゴヌクレオチドＢＥ６２（配列番号１）およびＢＥ６１（配列番号２）をベ
ックマン・オリゴ(Beckman Oligo) １０００TMオリゴヌクレオチド・シンセサイ
ザーを用いて合成した。これらのプライマーは、公開されたコメ配列のそれぞれ
ヌクレオチド（ｎｔ）１６００−１６１９および１８２６−１８０８を包含して
いる。
【００５５】
【表１】
【００５６】 ジーンアンプ(GeneAmp)(R)ＰＣＲキット（パーキン・エルマー(Perkin Elmer)
）に指定された標準ＰＣＲ条件を用いて、コメゲノムＤＮＡから４２９ｂｐＤＮ
Ａ断片を増幅するために、このプライマーの対を使用した。増幅は、１分間９４
℃、２分間５５℃および３分間７２℃からなる３０サイクル、最終サイクルに続
いて最後に７２℃を７分間延長して行った。ヌクレオチド配列解析から、増幅し
た断片（ＳＳＩ）が、予想したｃＤＮＡ配列ならびに公開された配列のｎｔ１６
７８の後に１２４ｂｐイントロンおよびｎｔ１７８８の後に８１ｂｐイントロン
を含んでいた。ＤＮＡ断片は、ニックトランスレーション法により標識し、発生
中のトウモロコシ穀粒から全ＲＮＡのノーザンブロットをプローブするために使
用した。２．６ｋｂメイズ転写物が検出され、これは受粉１０日後（ＤＡＰ）に
は存在し、２２ＤＡＰで最大レベルに達した。コメＳＳ１断片は、植物および細
菌デンプンまたはグリコーゲン合成酵素に共有されていることがわかっている相
同配列の２領域を含むように設計された〔ババ、Ｔ．(Baba, T. et al. (1993)
Plant Physiol. 103:565-573) 〕。アミノ酸保存のこれらの領域が欠失している
第二の可溶性合成酵素断片（ＳＳ２）は、ｃＤＮＡのｎｔ１０８３−１１０３（
ＳＳ７；配列番号３）およびｎｔ１４４０−１４５９（ＳＳ８；配列番号４）を
包含するプライマー対を用いてコメＤＮＡのＰＣＲ増幅により得られた。
【００５７】
【表２】
【００５８】 明らか１個または数個のイントロンを含む９００ｂｐＤＮＡ断片が得られた。
全トウモロコシＲＮＡのブロット上のハイブリダイゼーションプローブとして使
用された場合に、この断片は同じ大きさの転写物（２．７ｋｂ）を検出し、その
発現プロフィールは、ＳＳＩプローブを用いて観察されたものと一致した。次い
で、ＳＳ２断片を、１９ＤＡＰトウモロコシ内胚乳ｃＤＮＡライブラリーから、
コメ可溶性デンプン合成酵素のそれに相同配列をスクリーニングするために使用
した。
【００５９】 メイズｃＤＮＡライブラリーを、１９ＤＡＰに収穫した内胚乳組織からのポリ
Ａ＋ＲＮＡを用いてクロンテック(Clontech)により構築した。ｃＤＮＡを、ベク
ターラムダ−ＺＡＰＩＩ（ストラタジーン(Stratagene)）内のＥｃｏＲＩ−Ｘｈ
ｏＩ挿入物としてクローニングした。非増幅ライブラリーの約１２０，０００プ
ラーク形成単位をＮＸＹアガープレート上にプレートし、ニトロセルロース膜上
に２箇所に移行させた〔サンブルックら「分子クローニング」(Sambrook, J., F
ritsch, E.F., Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, New York); 以後「マニアチス」と呼ぶ〕。不動化したＤＮ
Ａを、１６時間、５１℃で、６ＸＳＳＰＥ、５Ｘデンハート(Denhardt)の０．５
％ＳＤＳ、改質サケ精子ＤＮＡ１００ｍｇ／ｍｌ中のニックトランスレーション
したＳＳ２（２ｘ１０5 ｄｐｍ／ｍｌ）にハイブリダイズした（マニアチス）。
フィルターを２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２回、室温で各回３０分間、１Ｘ
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回、５０℃で１５分間洗浄した（マニアチス）。
全体で３８個の推定陽性プラークをこの最初のスクリーニングで同定した。これ
らから、２４個を精製し、さらに制限酵素消化および部分ヌクレオチド配列解析
による特性決定を行った。ｐＳＳ２３およびｐＳＳ３１と名付けられたクローン
２種は、最も長いｃＤＮＡ挿入物を含み、さらに詳細な特性決定を行うために選
択した。プラスミドｐＳＳ３１は２．２ｋｂのｃＤＮＡ挿入物を有することが分
かり、これは５’非翻訳ＤＮＡの１４４ｂｐ、読み取り枠１９２３ｂｐ、および
３’非翻訳ＤＮＡの１６８ｂｐを含んでなっている。従って、プラスミドｐＳＳ
３１は、トウモロコシデンプン合成酵素ポリペプチドの完全なコピーをコードし
ている。推論されたアミノ酸配列とコメ可溶性デンプン合成酵素のアミノ酸配列
との比較から、両方のタンパク質がその全長にわたって８０％が同一であること
が分かる。ｐＳＳ２３は１９５４ｂｐの挿入物を有し、その最初の１７１５ヌク
レオチドの配列はｐＳＳ３１のｎｔ５２１〜２２３５と一致する。しかし、ｐＳ
Ｓ２３のｃＤＮＡ挿入物は、ｐＳＳ３１の３’末端を越えて２３９ｂｐ伸びてい
る。従って、ｐＳＳ２３は、デンプン合成酵素ポリペプチドの不完全なコピーを
含み、アミノ末端で１２６アミノ酸が欠失している。ＳＳＩ ｃＤＮＡ共通配列
は、ｐＳＳ２３とｐＳＳ３１の配列の比較から得られ、配列番号５に記載してあ
る。ｐＳＳ２３とｐＳＳ３１との両方とも、トウモロコシ植物中のこのデンプン
合成酵素の発現の改質のためのＤＮＡ構築物の生成に使用した。 トウモロコシＳＳＩのアンチセンス転写物をコードする発現ベクターの調製 デンプン合成酵素クローンｐＳＳ２３をトウモロコシ中のＳＳＩ発現の抑制の
ためのアンチセンス構築物を生成するために使用した。ｐＳＳ２３を最初に制限
酵素ＰｖｕＩを用いて消化し、次いで５’陥凹末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼと
の反応により平滑化した。ＰｖｕＩ消化ｐＳＳ２３（４０ｍＬ中１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ
ＤＴＴ）１０ｍｇに、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ２０単位およびデオキシヌクレ
チオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）を加え、最終濃度０．１ｍＭとした。反
応混合物を１５分間、１２℃、１０分間、７５℃でインキュベーションし、ＤＮ
Ａをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を用
いて抽出し、次いでエタノール沈降により精製した。修復したプラスミドＤＮＡ
を次いで制限酵素ＸｈｏＩと一緒に、上記の緩衝液中でインキュベーションした
。消化に続いて、ｄＮＴＰを最終濃度５０μＭとなるまで加え、ＸｈｏＩ末端を
、大腸菌(E. coli) ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（１０単位）およびｄ
ＮＴＰと１５分間、室温で反応させて充填(fill in) した。この酵素を７５℃、
１０分間インキュベーションして不活性化し、４０ｍＭトリスアセタート、ｐＨ
８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ中の０．７％低融点アガロースゲル上の電気泳動によ
り平滑末端ＤＮＡを分別した。１．５５ｋｂバンド（挿入）をゲルから切り取り
、プラスミドｐＭＬ１０３（ＡＴＣＣ９７３６６）からの４．９ｋｂ断片と組み
合わせた。プラスミドｐＭＬ１０３は、メイズ２７ｋＤゼイン遺伝子の１．０５
ｋｂ ＳａｌＩ−ＮｃｏＩプロモーター断片およびメイズ１０ｋＤ遺伝子の０．
９６ｋｂ ＳｍａＩ−ＳａｌＩ ３’断片をｐＧｅｍ９Ｚｆベクター（プロメガ
(Promega) ）中に含んでいる。プラスミドｐＭＬ１０３をＮｃｏＩおよびＳｍａ
Ｉと一緒に消化し、消化したＤＮＡをクレノウおよびｄＮＴＰを用いて処理して
酵素により残ったオーバーハングを充填し、所望の４．９ｋｂベクター断片を電
気泳動し、上記のようにして単離した。組み合わせた挿入物およびベクター断片
を本質的に記載（マニアチス）のようにして６８℃で融解し、一晩結合させた。
結合したＤＮＡを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（エピキュリアン・コライ(Epicu
rean Coli)ＸＬ−１ ＢｌｕｅTM；ストラタジーン）を形質転換するために使用
した。細菌形質転換体を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化して挿入ＤＮＡの
存在および配向に関してスクリーニングした。プラスミドｐＳＳ４２をこの分析
から同定した。ｐＳＳ４２はｐＳＳ２３の１．５５ｋｂ断片（配列番号６）を、
２７ｋＤゼインプロモーター断片および１０ｋＤゼイン３’末端に関してアンチ
センス配向に含んでいた。植物形質転換のための構築物を生成するために、ｐＳ
Ｓ４２のキメラ遺伝子をＢａｍＨＩを用いる消化により解放し、３．６ｋｂ断片
をベクターｐＫＳ１７のＢａｍＨＩ部位内にクローニングした。プラスミドｐＫ
Ｓ１７は、抗生物質ハイグロマイシンに耐性を与えるハイグロマイシンＢホスホ
トランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子を含んでいる。植物形質転換のための構築
物を生成するために、ｐＳＳ４２のキメラ遺伝子をベクターｐＫＳ１７中にクロ
ーニングした。ベクターｐＳＰ７２（プロメガ）の誘導体、ｐＫＳ１７は、抗生
物質ハイグロマイシンに耐性を与えるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ
ーゼ（ＨＰＴ）遺伝子を含んでいる。Ｔ７プロモーター−ＨＴＰ−Ｔ７ターミネ
ーター遺伝子をβ−ラクタマーゼ遺伝子を欠失している改質ｐＳＰ７２プラスミ
ドに付加してｐＫＳ１７を構築した。ｐＳＳ４２のキメラ遺伝子をＢａｍＨＩを
用いる消化により解放し、３．６ｋｂ断片をベクターｐＫＳ１７のＢａｍＨＩ部
位中にクローニングした。ｐＫＳ１７中に２７ｋＤゼインプロモーター−アンチ
センスＳＳＩ−１０ｋＤゼイン３’末端を含む得られたプラスミドをｐＳＳ４３
を名付ける（図１）。 ＳＳＩアンチセンス構築物を用いるトウモロコシの形質転換 未熟トウモロコシ内胚乳を、メイズ同系繁殖体Ａ１８８ｘＢ７３の２から選択
された「Ｈｉ−ＩＩ」メイズ生殖質の自己受粉に由来する発生中の穀果から切り
取った〔アームストロングら(Armstrong et al. (1991), Maize Genetics Coope
ration Newsletter 65:92-93) 〕。Ｈｉ−ＩＩ生殖質は、これが「タイプＩＩ」
カルスの形成の頻度が高いという特徴のために、形質転換に広く使用されている
。このカルスは、切り取った未熟接合性胚芽の胚盤からインビトロで誘導される
。タイプＩＩカルスは、これが壊れやすく、迅速に増殖し、高度に胚芽形成性で
あるために、特に形質転換が用意である。長さ１．０〜１．５ｍｍとなった受粉
１０〜１２後に胚芽を単離した。胚芽を軸側の面を下にして配置し、２，４−Ｄ
１ｍｇ／Ｌを補足したアガロース固化ＭＳ培地〔ムラシゲ、Ｔ．およびスクー
グ、Ｆ．(Murashige, T., Skoog, F. (1962) Physiol. Plant 15: 473)〕と接触
させた。胚芽を暗所で２７℃に保持した。胚柄構造上に支持された体性の前胚様
体および胚様体を有する細胞の未分化塊からなる壊れやすい胚形成性カルスは、
これらの未塾の胚芽の胚盤から増殖する。一次外植体から単離された胚形成性カ
ルスを，２，４−Ｄ １ｍｇ／ｍＬを補足したアガロース固化Ｎ６培地〔チュー
ら(Chu et al. (1975)、Sci. Sin .Peking 18:659-668)〕上で培養し、この培地
上に２〜３週間毎に継代培養した。
【００６０】 形質転換実験中で選択可能なマーカーを提供するために、プラスミドｐＭＬ１
０８のセグメントを使用した。このプラスミドは、ホスフィノトリシン(phosphi
nothricin)アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードするｂａｒ遺伝子〔
トムソンら(Thompson et al. (1987) EMBO J. 6:2519-2523)〕を含む。酵素ＰＡ
Ｔは、除草性グルタミン合成酵素阻害剤、例えばホスフィノトリシンへの耐性を
与える。ｐＭＬ１０８中のｂａｒ遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルスから
の３５Ｓプロモーターの制御下にあり〔オデルら(Odell et al.(1985) Nature 3
13:810-812) 〕、またアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium t
umefaciens) のＴＩプラスミドのＴ−ＤＮＡからのオクトパイン合成酵素遺伝子
の３’領域を含む。キメラ３５Ｓ−ｂａｒ−ＯＣＳ遺伝子を含む２１１６ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＭＬ１０８から単離し、植物形質転換実験の形質ＤＮＡ
に関連して使用した。
【００６１】 粒子ボンバードメント法〔クラインら(Klein et al.(1987) Nature(London),
327:70-73)〕をカルスカルチャー細胞に遺伝子を導入するために使用した。金粒
子（直径１μｍ）を下記の技術を用いてＤＮＡにより被覆した。プラスミドＤＮ
Ａ（ｐＭＬ１０８断片１μｇおよびｐＳＳ４３ １２μｇ）を、金粒子懸濁液（
ｍｌあたり６０ｍｇ）５０μｌに加えた。塩化カルシウム（２．５Ｍ溶液５０μ
ｌ）およびスペルミジン遊離塩基(spermidine free base 、１．０Ｍ溶液２０μ
ｌ）を粒子に加えた。この懸濁液を溶液添加の間および最後の溶液添加の５分後
までに渦攪拌した。さらに５分後、試験管を短時間遠心分離し（１５，０００ｒ
ｐｍで５秒間）、上清を取り除いた。粒子を純エタノール１４０μｌ中に再懸濁
し、再度遠心分離し、上清を取り除いた。再度エタノール洗浄し、粒子をエタノ
ールに最終体積５５μｌとなるように再懸濁した。ＤＮＡコートした金粒子のア
リコート（６μｌ）をカプトン(Kapton)TMフライングディスク〔バイオ−ラッド
・ラブズ(Bio-Rad Labs)〕の中心に配置した。バイオリスティック(Biolistic)
TMＰＤＳ−１０００／Ｈｅ〔バイオ−ラッド・インスツルメンツ(Bio-Rad Instr
uments、Hercules, CA) 〕を用い、ヘリウム圧力１１００ｐｓｉ、ギャップ距離
０．５ｃｍおよびフライング距離１．０ｃｍを用いてトウモロコシ組織中に粒子
を加速した。
【００６２】 ボンバードメントのために、２，４−Ｄ １ｍｇ／Ｌを補足したアガロース固
化Ｎ６培地上の濾紙上に胚芽形成性組織を配置した。組織を薄いローン(lawn)と
して配置し、直径約5cm の円形に覆った。組織を含むペトリ皿を、停止スクリー
ンから約８ｃｍにあるＰＤＳ−１０００／Ｈｅの室内に配置した。次いで、室内
の空気を水銀柱２８インチの真空まで減圧した。衝撃管内のＨｅ圧力が１１００
ｐｓｉに達した後に爆発する破裂膜を用いて、ヘリウム衝撃波を用いてマクロキ
ャリヤー(macrocarrier)を加速した。
【００６３】 ボンバードメントの４日後に、２，４−Ｄ １ｍｇ／Ｌに加えてバイアラフォ
ス(bialaphos) （リットルあたりに２〜１０ｍｇ）を補足したカゼインまたはプ
ロリを含まないＮ６培地（選択培地）に組織を移行させた。培地上でこの組織は
ゆっくりと生育を続けた。１週間後に、２，４−Ｄ １ｍｇ／Ｌおよびバイアラ
フォスを含む新しいＮ６選択培地に組織を再び移行させた。選択性培地上の６〜
８週間後に、バイアラフォス補足培地を含む一部のプレート上に、直径約１ｃｍ
の区域の活発に生育中のカルスが識別された。選択的培地上に継代培養すると、
これらのカルスは生育を続けた。選択的培地上で活発に生育を続けているカルス
を、ＰＣＲ分析のために、新鮮重量約２００〜５００ｍｇのカルス塊を冷凍して
試料採取した。
【００６４】 ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、７Ｍ尿素、０．３５Ｍ ＮａＣｌ、２
０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ｎ−ラウリルサルコシンからなる緩衝液中に冷凍して磨
砕した組織を懸濁し、３７℃で１５分間インキュベーションして採取した試料か
らＤＮＡを抽出した。この時間の後、フェノール−クロホルム−イソアミルアル
コールの混合物（２５：２４：１）を用いて試料を抽出し、イソプロパノールを
用いる沈降により濃縮した。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ（１００μｌ）中にＤＮＡを再懸濁し、プライマーＭＭ５０（配列番
号７）およびＢＥ５６（配列番号８）を用いるＰＣＲにおける鋳型として使用し
た。
【００６５】
【表３】
【００６６】 ジーンアンプ(R)ＰＣＲキット（パーキン−エルマー）から供給された標準混
合物中でプライマーＭＭ５０およびＢＥ５６ＮＯそれぞれ２０μＭを用いてＤＮ
Ａ（２μｌ）を組み合わせた。増幅は、１分間９５℃、２分間５５℃および３分
間７２℃の３０サイクルで行った。ＳＳＩ断片の３’部分および１０ｋＤゼイン
３’末端にわたる５４６ｂｐ標的バンドの存在について記録した。形質遺伝子-
陽性カルス試料を形質転換処理に送った。
【００６７】 最初に組織の導入クラスターをバイアロフォスも２，４−Ｄも含まない培地に
移行させ、暗所に配置して、トランスジェニック細胞から植物を再生した。２週
間後に、組織を明所で再生培地〔フロムら(Fromm et al. (1990) Bio/Technolog
y 8:833-839)〕に組織を移行させた。全体で３５のトウモロコシ植物が、ｐＳＳ
４３構築物を用いる一回の形質転換実験から再生された。
【００６８】 実施例２ トウモロコシデンプン合成酵素Ｉのセンス構築物を発現するトランスジェニック トウモロコシの調製 プラスミドｐＳＳ６４−Ｃ５およびｐＳＳ６５−Ｃ１１は、ＳＳＩ遺伝子のセ
ンス構築物をコードする。両方の構築物に対して、ＰＣＲによりＳＳＩｃＤＮＡ
の開始メチオニンにＮｓｏＩ部位を導入した。オリゴヌクレオチドＭＭ６２（配
列番号９）およびＭＭ６０（配列番号１０）を、鋳型ＤＮＡのＧＣ−リッチ領域
を介する増幅を容易にするために設計された改質ＰＣＲミックス〔アドヴァンテ
ージ(Advantage) −ＧＣTM、クローンテク(Clontech)〕中で、鋳型ＤＮＡｐＳＳ
３１を用いて組み合わせた。
【００６９】
【表４】
【００７０】 増幅は、１分間９５℃、１分間５３℃および１分間７２℃の３５サイクル、引
き続いて最後に７２℃で１０分間延長して行った。増幅された断片は、ＳＳＩｃ
ＤＮＡのヌクレオチド１３６−１００３を含んでいる。ＤＮＡを順番に制限酵素
ＫｐｎＩおよびＮｃｏＩを用いて消化、１％アガロースゲル上の電気泳動による
分別（マニアチス）を行い、次いで５３７ｂｐＮｃｏＩ−ＫｐｎＩ断片をゲルか
ら切り取り、ジェレース(Gelase)TM〔エピセンター・テクノロジーズ(Epicentre
Technologies)〕を用いる処理により精製した。プラスミドｐＥＴ−ＳＳＳＩ（
ＰｐｕＭＩ）は、平滑化されたｐＥＴ２４ｄ〔ノヴァジェン(Novagen) 〕のＮｃ
ｏＩ部位に挿入され、センス方向に配向し、Ｔ７プロモーターに関して枠内であ
るＳＳＩｃＤＮＡのヌクレオチド４１８−２２３５を包含する断片を含む。ＳＳ
Ｉ配列の５’末端におけるＮｃｏＩ部位は、ＳＳＩ断片の挿入の際に再創製され
た。ＰＥＴ−ＳＳＳＩ（ＰｐｕＭＩ）は、ＫｐｎＩ、次いＮｃｏＩと一緒にイン
キュベーションされ、消化物を１％アガロースゲル上で分別した。７．１ｂｐバ
ンドを切り取り、精製および上記の５３７ｂｐＮｃｏＩ−ＫｐｎＩＳＳＩ断片に
結合した。３’非翻訳ＤＮＡの１６８ｂｐに加えてＳＳＩの完全なコーディング
領域を含む得られたプラスミドは、ｐＥＴ−ＳＳＳＩ＠ＭＡＴと呼ぶ。このプラ
スミドをｐＳＳ６４−Ｃ５およびｐＳＳ６５−Ｃ１１の両者の構築に使用した。
ｐＳＳ６４−Ｃ５を生成するために、ｐＥＴ−ＳＳＳＩ＠ＭＡＴをＢｇｌＩＩを
用いて消化し、本質的に上記のようにして５’突出末端をクレノウおよびｄＮＴ
Ｐとの反応により充填した。ＤＮＡをＮｃｏＩを用いて消化し、解放された１．
４８５ｂｋ断片をｐＳＰＢ３８の４．５３ｋｂ ＮｃｏＩ−ＳｍａＩ断片内にク
ローニングした。このｐＳＰＢ３８セグメントは、上記のベクターｐＫＳ１７中
の２７ｋＤゼイン遺伝子の１．０５ｋｂＳａｌＩ−ＮｃｏＩプロモーター断片お
よび１０ｋＤゼイン遺伝子の３’末端からの０．９６ｋｂ ＳｍａＩ−ＰｖｕＩ
Ｉ断片を含む。ｐＳＳ６４−Ｃ５と呼ばれる得られたプラスミド（図２）は、こ
のように２７ｋＤゼインプロモーターに続いてＳＳ１コーディング領域のアミノ
酸１−４９４（配列番号１１）および１０ｋＤゼイン３’末端を含む。ｐＳＳ６
５−Ｃ１１を生成するために、プラスミドｐＥＴ−ＳＳＳＩ＠ＭＡＴをＢｓｒＧ
Ｉを用いて消化し、５’突出末端をクレノウおよびｄＮＴＰとの反応により充填
した。ＤＮＡをＮｃｏＩを用いて消化して２．０ｋｂ断片を解放し、これを次い
で上記の４．５３ｋｂ ｐＳＰＢ３８断片に結合させた。誘導されたプラスミド
ｐＳＳ６５−Ｃ１１（図３）は、２７ｋＤゼインプロモーターおよび０．９６ｋ
ｂ １０ｋＤゼイン３’末端断片に挟まれた完全なＳＳＩコーディング領域、引
き続いてＳＳＩ３’非翻訳ＤＮＡからの８４ｂｐ（配列番号１２）からなってい
る。ＤＮＡ構築物、ｐＳＳ６４−Ｃ５およびｐＳＳ６５−Ｃ１１を実施例１に記
載した方法を用いてトウモロコシ内に導入した。形質陽性カルス株がＰＣＲ分析
により同定され（実施例１）、トランスジェニック植物を再生するために処理を
続ける。
【００７１】 実施例３ ｐＳＳ４３アンチセンス構築物を含む形質転換トウモロコシ植物からのデンプン の分析 ｐＳＳ４３アンチセンス構築物を用いて形質転換させたトウモロコシ植物から
得た単一種子からデンプンを抽出した。酪酸１．０％およびメタ重亜硫酸ナトリ
ウム０．３％、ｐＨ３．８２を含む溶液中に種子を浸漬し、５２℃に２２〜２４
時間保持した。種子の水を切り、洗浄し、１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液８〜９ｍＬ
中で個別にホモジナイズした。トルエン５ｍＬをそれぞれの試験管に加え、試験
管を６分間、２回激しく振とうし、次いで３０分間沈降させた。１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ２ｍＬを溶液上に噴射し、これを３０分間沈降させ、次いでタンパク質／
トルエン層を吸引除去した。トルエン洗浄手順を反復した。水１２ｍＬを加え、
塗料シェーカー中で４５秒間振とうした。この溶液を１０分間、卓上型遠心分離
機で遠心分離し、水を除去した。水洗を反復し、次いでアセトン１２ｍＬを用い
て最終洗浄を行った。振とうおよび遠心分離手順の後、アセトンを排出し、そし
て１時間蒸発させた。残留しているアセトンを除去するために、デンプン抽出液
を一晩、４０℃のオーブン中でインキュベーションした。
【００７２】 抽出されたデンプンを酵素的に下記のようにして脱分枝した。各デンプン試料
７ｍｇをネジキャップ付きの試験管に水１．１ｍＬと一緒に加えた。試験管を１
２０℃に３０分間加熱し、次いで４５℃の水浴内に置いた。脱分枝溶液は、酢酸
ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ４．５）のｍＬあたりにイソアミラーゼ（５
ｘ１０6 単位／ｍＬ、シグマ(Sigma) ）５０μＬを希釈して作製した。脱分枝溶
液４０μＬを各デンプン試料に加え、３時間、４５℃デインキュベーションした
。１１０℃に５分間加熱して反応を停止させた。脱分枝したデンプン試料を凍結
乾燥し、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）分析のためにＤＭＳＯ中に再溶
解させた。脱分枝したデンプン１０μＬを注入し、３基の小孔(narrow-bore) カ
ラム〔ポリマー・ラブズ(Polymer Labs)、ミニミックス(Mini-Mix)Ｃ〕を直列に
１００℃で通し、流量０．３５ｍＬ／分のＤＭＳＯを用いて溶離した。試料採取
間隔は３０分であった。屈折率検出器〔ウオーターズ(Waters)〕を、ＧＰＣオプ
ション付きの計算機制御ウオーターズ・ミレニアム(Waters Millenium)クロマト
グラフィー・マネージャー・システム（バージョン２．１５．１、ウオーターズ
社）と、それぞれ検出、データ取得および分析に一緒に使用した。プルラン標準
（標準１：３８０ｋＤ、１００ｋＤ、２３．７ｋＤ、５．８ｋＤ、６６６および
１８０ｍｗ、標準２：８５３ｋＤ、１８６ｋＤ、４８ｋＤおよび２．２８ｋＤ）
の保持時間を線型補正の確立に使用し、そしてミレニアム(R) ソフトウエア内で
分子量分布を計算した。
【００７３】 当該技術分野の専門家には既知のように、アンチセンス現象は一般にあらゆる
個別のトランスジェニック株中に観察されるものではない。従って、複数の株か
らの個別の穀粒を試験し、予想のように、すべてではなく一部の株が、対照と比
較して改変されたデンプン表現型を示す穀粒を有していた。同様に当該技術分野
の専門家には既知のように、粒子ボンバードメントにより生産されたトランスジ
ェニックトウモロコシ植物は、標準的には導入された導入遺伝子に対してヘテロ
接合性であり、導入遺伝子は、推定できるメンデル法則に従って分離する。Ｒ０
（一次形質転換体）植物の自殖雌穂(selfed ear)上で、デンプン産生を担当する
組織である三倍体内胚乳は、導入された導入遺伝子の０、１、２および３コピー
に対してそれぞれ１：１：１：１で分離する。これらの導入遺伝子供与のいずれ
かを観察する合理的な可能性を有するために、株Ｓ０４８．６．１．１０からの
単独穀粒１０個（ＸＢＧ００９４４−１〜ＸＢＧ００９４４−１０と呼ぶ）から
デンプンを抽出し、各穀粒からのデンプンを脱分枝し、上記のようにして分離し
た。図６は、株Ｓ０４８．６．１．１０の２個の代表的な穀粒からの脱分枝デン
プンに対して得られた分子量分布を示している。ＸＢＧ００９４４−７は、正常
な分離個体に相当するパターンを示し、一方ＸＢＧ００９４４−１改変された分
離個体に相当するパターンを示している。
【００７４】 株Ｓ０４８．６．１．１０は、２種の非常に異なる分子量分布を有するデンプ
ンを産生する。種子９４４−３、９４４−４、９４４−５、および９４４−７か
らの脱分枝デンプンの分子量分布は、正常デントコーン(dent corn) デンプンに
観察される分子量分布の典型である。種子９４４−１、９４４−２、９４４−６
、９４４−８、９４４−９および９４４−１０からの脱分枝デンプンの分子量分
布は、脱分枝したデンプンの分子量分布における改変を示している。図６は、こ
れらのタイプの種子それぞれ一種の分子量分布を描いており、９４４−７は、正
常のデンプンの例を示し、また９４４−１は改変されたデンプンの例を示してい
る。図６から分かるように、高分子量物質（ｌｏｇＭＷ＞４）の量の増加および
低分子量物質の分布の減少がある。分離した雌穂上の改変および正常種子の出現
の比率を、カイ二乗（χ2 ）統計を用いて、種々の可能な推定遺伝モードに対し
て比較した。観察された６０％改変：４０％正常種子の頻度は、単純優性仮説（
導入遺伝子の１個またはそれ以上の供与が改変されたデンプン構造を産生するた
めに十分である）（χ2 ＝１．２）またはデンプン構造を改変すために導入遺伝
子の２個またはそれ以上の供与が必要との仮説（半優性、χ2 ＝０．４）のいず
れかに合理的に適合した。
【００７５】 実施例４ ＸＢＧ００９４４種子内のデンプン構造改変の定量分析 改変されたトランスジェニックデンプンの定量的比較のために、ＸＢＧ００９
４４−１デンプンを、最も極端なデンプン構造中の改変の代表として選択し（図
６参照）、デントコーンデンプン、ｄｕｌｌ変異体からのデンプンおよびｗａｘ
ｙ変異体からのデンプンとの比較に使用した。これら４種の株（デント、ｄｕ、
ｗｘ、９４４−１）からのデンプンを上記のようにして酵素的に脱分枝し、アミ
ロペクチン画分中の分枝鎖分布のより良い分解能を得るために少し変更したクロ
マトグラフィー法を用いて分離した。脱分枝したデンプン１０μＬを注入し、３
基の小孔カラム（ポリマー・ラブズ、ミニ−ミックスＣ、Ｄ、Ｅ、ミニ−ミック
スＣガードカラム付き）を直列に９０℃で通し、流量０．３５ｍＬ／分のＤＭＳ
Ｏを用いて溶離した。試料採取間隔は３５分であった。屈折率検出器（ウオータ
ーズ）を、ＧＰＣオプション付きの計算機制御ウオーターズ・ミレニアム・クロ
マトグラフィー・マネージャー・システム（バージョン２．１５．１、ウオータ
ーズ社）と、それぞれ検出、データ採取および分析に一緒に使用した。プルラン
標準（標準１：３８０ｋＤ、１００ｋＤ、２３．７ｋＤ、５．８ｋＤ、６６６お
よび１８０ｍｗ、標準２：８５３ｋＤ、１８６ｋＤ、４８ｋＤおよび１２．２ｋ
Ｄ）の保持時間を三次補正を確立するために使用し、そしてミレニアム(R) ソフ
トウエア内で分子量分布を計算した。比較する４種のデンプンそれぞれに対して
３回の反復分析を行った。
【００７６】 アミロース（Ａｍ）およびアミロペクチン（Ａｐ）含有量の測定のために、適
合するクロマトグラフィーピーク下の面積を比較した。ｗａｘｙ変異体（アミロ
ースを欠く）を比較のための適当な分子量範囲を確定するために使用した。表１
は、４種の株それぞれのアミロースおよびアミロペクチン含有量を示す。
【００７７】 表１ ｄｕ、デント、おおびｗｘデンプンと比較したＳＳＳＩアンチセンスデンプンの
アミロースおよびアミロペクチン含有量（平均（ｎ＝３）および平均の標準偏差
） ％アミロース 標準偏差 ％アミロペクチン 標準偏差 944-1 35.40 ％ 0.15％ 64.60 ％ 0.15％ du 31.99 ％ 0.05％ 68.01 ％ 0.05％ デント 25.65 ％ 0.14％ 74.35 ％ 0.14％ wx 0.00 ％ 0.00％ 100.00 ％ 0.00％ アミロース含有量は、正常デントデンプンおよびｄｕｌｌ変異体からのデンプ
ンと比較して有意に増加（Ｐ＜０．０１）している。アミロペクチン含有量は、
両方の株と比較して同様に有意に増加（Ｐ＜０．０１）している。このように、
デンプン合成酵素Ｉ発現の抑制は、これらの植物内のデンプン微細構造の改変、
特にはアミロースとアミロペクチンとの比率に著しい変化をもたらしている。
【００７８】 ミレニアム(R) ＧＰＣソフトウエアを、分析したデンプンのアミロースとアミ
ロペクチン成分の独立した分子量分布を得るため、および分子量平均Ｍn （数平
均分子量）、Ｍw （重量平均分子量）、Ｍz およびＭz+1 （ポリマーの沈降分子
量）、ピーク分子量（ＭＰ）および多分散度（Ｍw ／Ｍn ）をアミロースおよび
アミロペクチン成分に対して決定するために使用した。
【００７９】 表２は、９４４−１、デントおよびｄｕｌｌデンプンからのアミロースの分子
量分布の定量分析を示す。
【００８０】 表２ ９４４−１、デントおよびｄｕｌｌデンプンからのアミロース成分の分子量平均
（ドルトン） Ｍn ＭＰ Ｍw （数平均分子量） （ピーク分子量） （重量平均分子量） 944-1 91414 ±110 278047±0.00 357427± 278 du 82728 ±693 183963±13228 283207±2727 デント 90511 ±1106 172334±8444 304715±3480 Ｍz Ｍz+1 ＰＤ （沈降分子量z ） （沈降分子量z+1 ）（多分散度（Ｍw ／Ｍn ）） 944-1 1123204±12306 2258755±48432 3.9100±0.0074 du 894430±21341 1908812±91646 3.4236±0.0349 デント 968529±36715 2095380±176856 3.3667±0.0037 表２中のＭw の列の値を比較すると、９４４−１からのデンプン中の最大のア
ミロース分子は、ｄｕｌｌおよびデントデンプンに対して分子量が有意に増加し
ている（Ｐ＜０．０１）ことが分かる。これは、ＭＰ、Ｍz およびＭz+1 の有意
な増加に反映される。デントおよびｄｕｌｌデンプンの両者に対する９４４−１
アミロースの有意に増加した多分散性（Ｐ＜０．０１）は、このアミロースの分
子量の増加が、より短いアミロース分枝の犠牲によるのではなく、どちらかとい
うばアミロース成分の分布の拡大に由来することを示唆している。これは、表１
中に報告した増加した相対アミロース含有量の観察と一致し、そして９４４−１
株の増加したアミロース含有量は、デントまたはｄｕｌｌデンプンには存在しな
い高分子量アミロースの発生に帰することができる。従って、正味の効果は、デ
ンプン合成酵素Ｉ発現の改変は、アミロースとアミロペクチンとの比率に有意な
変化を起こすだけでなく、追加されるアミロースがサイズ的に大きいので、デン
プンのアミロース成分の分子量分布の改変によって、これらの植物の種子内のデ
ンプン微細構造の改変をもたらしている。
【００８１】 表３は、９４４−１、デントおよびｄｕｌｌデンプンからのアミロースの分子
量分布の定量分析を示している。
【００８２】 表３ ９４４−１、デントおよび対照デンプンのアミロペクチン成分から得られた分子
量平均（ドルトン） Ｍn ＭＰ Ｍw （数平均分子量） （ピーク分子量） （重量平均分子量） 944-1 2727 ± 4.5 2409 ± 8.3 3534 ± 5.8 du 2713 ± 6.7 2320 ± 8.0 3557 ±11.2 デント 2717 ± 2.3 2352 ±14.1 3739 ± 0.9 wx 2873 ±13.0 2460 ± 8.7 4144 ± 8.6 Ｍz Ｍz+1 ＰＤ （沈降分子量z ） （沈降分子量z+1 ）（多分散度（Ｍw ／Ｍn ）） 944-1 4803 ±13.9 6406 ± 26.9 1.296 ± 0.0019 du 4878 ±20.2 6529 ± 35.4 1.311 ± 0.0009 デント 5311 ± 7.1 7133 ± 18.3 1.376 ± 0.0012 wx 6196 ±20.3 8716 ± 65.8 1.442 ± 0.0043 ９４４−１アミロペクチンのＭw は、デントと比較すると有意に低下（Ｐ＜０
．０１）しており、Ｍz およびＭz+1 でも同様であり、アミロペクチン鎖長分布
がより短い鎖長に移動していることを示している。９４４−１アミロペクチンの
多分散度も、デントアミロペクチンと比較して有意に低下（Ｐ＜０．０１）して
おり、ｄｕｌｌでも同様であり、この場合にも、９４４−１デンプンのアミロペ
クチン画分が、デントアミロペクチンよりも鎖長においてより均質であるという
図６における目視観察を確認している。
【００８３】 このように、定量分析は、デントデンプンと比較した９４４−１デンプンのア
ミロース含有量の有意な増加およびアミロース成分の分子量の増加を確認する。
アミロース分子量において観察された増加は、アミロース連鎖の分子量分布の拡
大により達成される。観察された９４４−１デンプンのアミロペクチン含有量の
増加は、より短い連鎖に向けた分枝鎖分布の移行を伴っている。
【００８４】 要約すると、定量分析は、トウモロコシ種子内のデンプン合成酵素Ｉ発現の改
変は、これらの種子からのデンプンの微細構造に複数の変化をもたらし、これに
は、有意なアミロース含有量の増加、デンプンのアミロース成分の分子量の増加
、および低下したアミロペクチン成分中のより短い連鎖への移行が含まれること
を確認している。観察されたアミロース分子量の増加は、アミロース連鎖の分子
量分布の拡大により達成される。
【００８５】 実施例５ ３’アンチセンス構築物に対してホモ接合性の株からのデンプンの機能性分析 当該技術分野の専門家には既知のように、ホモ接合性株は、分離集団の十分な
数の穀粒を植え、これらの種子からもたらされた植物を自己受粉し、そして改変
されたデンプン形質を固定している雌穂を同定するために生産された単一後代を
スクリーニングすることにより、株Ｓ０４８．６．１．１０のようなヘテロ接合
性植物の分離した後代から誘導できる。このようなホモ接合性雌穂が同定される
と、デンプンのより大きい試料が、同定された株および正常のデントコーンデン
プンを生産する対照株の乾燥成熟穀粒から抽出できる。それぞれの株に対して、
穀粒１５ｇを秤量して５０ｍＬ三角フラスコ中に入れ、浸漬溶液（実施例３）５
０ｍＬ中に１８時間、５２℃で浸漬することができる。次いで穀粒の水を切り、
水を用いて洗浄する。穀粒を冷５０ｍＭＮａＣｌ溶液５０ｍＬ中の２０ｍｍポリ
トロン(Polytron)プローブ〔キネマチカ有限会社(Kinematica GmbH, Kreis-Luze
rn, Switzerland)〕を用いてホモジナイズする。ホモジネートを７２ミクロンメ
ッシュのふるいを用いて濾過する。５０ｍＭＮａＣｌを用いて濾液を全体積４０
０ｍＬとし、等量のトルエンを加える。次いで混合物をマグネティックスターラ
ー棒を用いて１時間、２相を乳化するために十分な速度で攪拌する。乳化液を一
晩、覆いをしたビーカー中で分離させる。上にあるトルエン層をビーカーから吸
引して廃棄する。ビーカーの底部に残ったデンプンスラリーを再懸濁し、２５０
ｍＬ遠心分離ビン中に注入し、１５分間、２５，０００ＲＣＦで遠心分離する。
上清を廃棄し、デンプンを水およびアセトンを順次に用いて、上記のように振と
うおよび遠心分離して洗浄する。アセトン洗浄および遠心分離の後、アセトンを
デカンテーションし、デンプンを一晩、排気フード中、室温で乾燥させる。高感
度オプションおよびサーモクライン(Thermocline) (R) ソフトウエアを有するラ
ピッド・ヴィスコ分析器〔ニューポート・サイエンティフィック(New Port Scie
ntific; Sydney, Australia)〕が、ペースト化曲線分析に使用できる。それぞれ
の株に対して、デンプン１．５０ｇを秤量して試料カップ内に入れ、１％ＮａＣ
ｌを含むリン酸／クエン酸緩衝液（ｐＨ６．５０）２５ｍＬを加える。ペースト
化曲線分析は、下記の温度プロフィールを用いて行う：アイドル(idle)温度５０
℃、５０℃に０．５分間保持し、９５℃まで直線的に２．５分間で加熱、５０℃
まで直線的に４分間で冷却、５０℃に４分間保持。
【００８６】 実施例６ トウモロコシデンプン合成酵素ＳＳｂのアンチセンスおよびセンス構築物を発現 するトランスジェニックトウモロコシの調製 メイズのヌクレオチド配列から、デンプン合成酵素（Ｔ１４６８４）、オリゴ
ヌクレオチドＳＳ９（配列番号１３）およびＳＳ１０（配列番号１４）と相同性
を有する発現配列タグ（ＥＳＴ）を設計し、ジーンアンプ(R) ＰＣＲキット（パ
ーキンエルマー）中に指定されている標準条件を用いるＰＣＲにより３５１ｂｐ
ＤＮＡ断片を増幅するために用いた。
【００８７】
【表５】
【００８８】 得られたＤＮＡ断片をラドプライム(RadPrime)ＤＮＡ標識システム〔ＢＲＬラ
イフテクノロジーズ(Life Technologies) 〕を用いて標識し、次いでラムダ−Ｚ
ＡＰＩＩ中の１９ＤＡＰトウモロコシ内胚乳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングするために使用した。約５００，０００プラーク形成単位をＮＺＹアガープ
レート上に配置し、ニトロセルロース膜に２箇所で移行させた（マニアチス）。
本質的にマニアチスの記載に準拠して、固定化したＤＮＡを標識断片にハイブリ
ダイズし、過剰のプローブをフィルターから除いた。全体で陽性プラーク１０個
が同定され、精製し、そしてＤＮＡ挿入物を引き続いて特性試験した。ＤＮＡ配
列分析から、クローン１０個のうちの９個が互いに関連しており、また最初にこ
れらの検出に使用したプローブ配列の５０ｂｐに関して８４％相同であった。残
りのクローンは、他のクローンとは異なり、Ｔ１４６８４に９５％の相同性を示
した。クローン９個の集合の中で、その一つのｐＳＰＢ３７は２００６ｂｐ挿入
物（配列番号１５）を含み、トウモロコシ内への導入のためのアンチセンス構築
物の生成に使用した。ｐＳＰＢ３７のＤＮＡ挿入の配列中の余分のＴの存在は、
他の単離されたＳＳｂクローン、ｐＳＢ２８の４３１ｂｐ ＮｃｏＩ断片を、ｐ
ＳＰＢ３７中の同じ領域の代わりに置換してｐＳＢ３９を得て最初に修正した。
１．７８ｋｂ ＳＳｂ断片が、ｐＳＢ３９をＢａｍＨＩおよびＢｓｒＧＩを用い
て消化して得られた。このＳＳｂ断片およびベクターｐＳＰＢ３８の４．５３ｋ
ｂ ＮｃｏＩ−ＳｍａＩ断片を、ＤＢＡポリメラーゼＩのクレノウ断片との反応
により平滑化し、標準プロトコールに従って互いに結合させた（マニアチス）。
細菌形質転換体をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを用いる制限酵素消化によりＳＳｂ
挿入ＤＮＡの存在および配向についてスクリーニングした。この分析は、２７ｋ
Ｄゼインプロモーターおよび１０ｋＤゼイン３’末端に関してアンチセンス配向
にある１．８ｋｂ ＳＳＢ断片（配列番号１６）を含むｐＳＰＢ４０の同定に導
いた。精製したｐＳＰＢ４０（図４）ＤＮＡを、本質的に実施例１に記載と同様
にして、ボンバードメント毎にｐＳＰＢ４０ １．３３μｇおよびｐＭＬ１０８
のマーカー遺伝子断片０．３４μｇを用いてトウモロコシカルスカルチャー中に
導入した。カルス試料は、形質遺伝子ＤＮＡの存在に関してＰＣＲ分析により試
験し、そして形質遺伝子陽性試料を形質転換試験に送った。
【００８９】 全長のセンスＳＳｂ構築物も作製し、粒子ボンバードメント法によりトウモロ
コシカルス組織中に導入した。ＳＳｂ ｃＤＡＮの完全なコピーは、ｐＳＢ３９
を開始物質として使用して最初に得られた。発生中の内胚乳から抽出した全ＲＮ
Ａのノーザンブロット分析は、ＳＳｂ転写物が約３．０ｋｂであることを示した
。ＳＳｂ ｃＤＮＡの残った５’配列は、５’ＲＡＣＥシステムキット（ライフ
・テクノロジーズ）を生産者から提供された指示に従う一部変更を含めて用いて
、ｃＤＡＮ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）により得られた。第一ストランドｃＤＡ
Ｎの合成は、遺伝子特異性プライマーＯＳＰＢ１０４（配列番号１７）を用いて
５０℃において行った。
【００９０】
【表６】
【００９１】 ｄＩ−ｄＧテイル付きｃＤＮＡの増幅は、ＲＡＣＥキット中で提供されたＡＡ
Ｐプライマーおよび遺伝子特異性プライマーＯＳＰＢ１０５（配列番号１８）と
一緒に、アドヴァンテージ(Advantage) ＧＣ ＰＣＲキット（クロンテック）を
用いて行った。
【００９２】
【表７】
【００９３】 再増幅は、ＡＡＰプライマーおよびＯＳＰＢ１０６（配列番号１９）を用いて
同様の方法で行った。
【００９４】
【表８】
【００９５】 ＳＳｂ ｃＤＮＡの全長等価物、ｐＳＰＢ４５は、１４８５ｂｐ５’ＲＡＣＥ
生産物をＸｂａＩおよびＫｐｎＩを用いる消化から得られた１３４６断片を、Ｘ
ｂａＩを用いる消化およびＫｐｎＩを用いる部分消化によりｐＳＰＢ３９から得
られた１６０４ｂｐ３’ＳＳｂ領域に結合させて創成した。ＮｃｏＩ部位をｐＳ
ＰＢ４５のコーディング領域の開始コドンにＰＣＲにより導入してｐＳＰＢ４６
が得られた。ｐＳＰＢ４６をＢｓｒＧＩを用いて消化し、５’オーバーハングを
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片との末端充填反応により平滑化した（マニ
アチス）。ＮｃｏＩを用いる部分消化の後に、２２４８ｂｐＳＳｂ断片（配列番
号２０）が単離され、ｐＳＰＢ３８の４．５３ｋｂＮｃｏＩ−ＳｍａＩ断片中に
クローニングして、ｐＳＰＢ４７（図５）が得られた。プラスミドｐＳＰＢ４７
は、２７ｋＤゼインプロモーターおよび１０ｋＤゼイン３’末端に挟まれたセン
ス配向の全ＳＳｂ ｃＤＮＡを含む。精製したｐＳＰＢ４７ ＤＮＡを、本質的
に実施例１に記載のようにして、ボンバードメント毎にｐＳＰＢ４７ １．４３
μｇおよびｐＭＬ１０８のマーカー遺伝子断片０．３３μｇを用いてトウモロコ
シカルスカルチャー細胞内に導入した。カルス試料を、形質遺伝子ＤＮＡの存在
に関してＰＣＲ分析により試験し、陽性試料を形質転換試験に進めた。
【００９６】 実施例７ ＳＳＢアンチセンス構築物を含む形質転換トウモロコシ植物からのデンプンの分 析 以上に記載したＳＳＢアンチセンス構築物を用いて形質転換したトウモロコシ
植物から得た単一種子からデンプンを抽出した。抽出したデンプンを以上に記載
したようにして酵素的に脱分枝し、ゲル透過クロマトグラフィーにより分析した
。脱分枝したデンプン１０μＬを注入し、３基の小孔カラム（ポリマー・ラブズ
、ミニ−ミックスＣ、Ｄ、Ｅ、ミニ−ミックスＣガードカラム付き）を直列に９
０℃で通し、流量０．３５ｍＬ／分のＤＭＳＯを用いて溶離した。試料採取間隔
は３５分であった。屈折率検出器（ウオーターズ）を、ＧＰＣオプション付きの
計算機制御ウオーターズ・ミレニアム・クロマトグラフィー・マネージャー・シ
ステム（バージョン２．１５．１、ウオーターズ社）と、それぞれ検出、データ
採取および分析に一緒に使用した。プルラン標準（標準１：３８０ｋＤ、１００
ｋＤ、２３．７ｋＤ、５．８ｋＤ、６６６および１８０ｍｗ、標準２：８５３ｋ
Ｄ、１８６ｋＤ、４８ｋＤおよび１２．２ｋＤ）の保持時間を三次補正を確立す
るために使用し、そしてミレニアムソフトウエア内で分子量分布を計算した。
【００９７】 当該技術分野の専門家には既知のように、アンチセンス現象は一般にあらゆる
個別のトランスジェニック株中に観察されるものではない。従って、複数の株か
らの個別の穀粒を試験し、予想のように、すべてではなく一部の株が、改変され
たデンプン表現型を示す穀粒を有していた。同様に当該技術分野の専門家には既
知のように、粒子ボンバードメントにより生産したトランスジェニックトウモロ
コシ植物は、標準的には導入された導入遺伝子に対してヘテロ接合性であり、導
入遺伝子は、推定できるメンデル法則に従って分離する。Ｒ０植物の自殖雌穂上
で、デンプン産生を担当する組織である三倍体内胚乳は導入した導入遺伝子の０
、１、２および３コピーに対してそれぞれ１：１：１：１で分離する。これらの
導入遺伝子供与のいずれかを観察する合理的な確率を有するために、株Ｓ０６４
．１．２．１からの単独穀粒１０個（ＸＢＧ０１７１７−１〜ＸＢＧ０１７１７
−１０と呼ぶ）からデンプンを抽出し、各穀粒からのデンプンを脱分枝し、上記
のようにして分離した。Ｓ０６４．１．２．１は、異なるタイプの分子量分布を
有するデンプンを分離する種子を産出する。一部の種子デンプン（ＸＢＧ０１７
１７−１、２、３、４、５、６、および８）は、正常なデントコーンアミロペク
チンよりもさらにヘテロ接合性のアミロペクチン（ｌｏｇＭＷ３とｌｏｇＭＷ４
．２との間の領域）を産出し、一方正常のデントコーンは、典型的な２モード分
布を示す（ＸＢＧ０１７１７−７、９、および１０）。図７は、代表的な穀粒２
種、正常な分離個体ＸＢＧ０１７１７−９および改変された分離個体ＸＢＧ０１
７１７−２から得られた脱分枝デンプンについて得られた分子量分布を示してい
る。正常な分離個体の典型として、図７は、ＸＢＧ０１７１７−９が単一の主要
ピークをｌｏｇ３．５に有し、また単独の明瞭な肩をｌｏｇＭＷ３．９に有して
いることを示している。図７は、また異常な分離個体（ＸＢＧ０１７１７−２）
が、ｌｏｇ３．５における主要ピークに分裂を有し、またあまり明瞭でない肩を
ｌｏｇＭＷ３．９に有していることを示している。この改変されたアミロペクチ
ン構造を示す分離個体も、クロマトグラムのアミロース画分の存在度の増加も示
しているが（ｌｏｇＭＷ＞４．２）その増加は、一部の分離個体では他のものよ
りも大きい。分離した雌穂における改変および正常アミロペクチンを含む種子の
出現の比率を、カイ二乗（χ2 ）統計を用いて、種々の可能な推定遺伝モードに
対して比較した。観察された７０％改変：３０％正常の種子の頻度は、単純優性
仮説（導入遺伝子の１個またはそれ以上の供与が改変されたデンプン構造を生成
するために十分である）（χ2 ＝０．１３）またはデンプン構造を改変するため
に導入遺伝子の２個またはそれ以上の供与が必要との仮説（半優性、χ2 ＝１．
６）に合理的に適合した。 メイズＳＳｂアンチセンス分離個体の微細構造アミロペクチン分析 正常およびＳＳＢアンチセンスデンプンの構造比較を拡張するために、上記の
二種（正常対改変）のそれぞれから１種のデンプンを、発蛍光団タグ法(taging)
および電気泳動により比較した。上記のようにして脱分枝およびＤＭＳＯ中へ再
懸濁した単一メイズ穀粒からデンプンを調製した。希釈した試料４μＬを０．２
ｍＬ ＰＣＲ反応管内にピペットで入れ、発蛍光団（１５％酢酸中の０．２Ｍ ８−アミノ−１，３，６−ピレントリスルホン酸、三ナトリウム塩）および還元
剤（水中の１Ｍ シアノホウ酸ナトリウム）のそれぞれ２μＬを加えた。試験管
を密封し、２分間、４０００ｒｐｍで遠心分離し、続いて３７℃で１６〜１８時
間インキュベーションした。デンプン試料と同様にして、水中のマルトヘプタオ
ース(Maltoheptaose) ０．２ｍｇ／ｍＬを用いて標準を調製した。
【００９８】 ウエル−読み取り間隔(well-to-read distance) ３６ｃｍのガラス配列決定プ
レートの間に、６Ｍ尿素中の５％ポリアクリルアミド（１９：１アクリルアミド
：ビス）、１Ｘ ＴＢＥ、０．０５％過硫酸ナトリウムおよび０．０７％ＴＥＭ
ＥＤを０．２ｍｍスペーサーを用いてゲルを注入した。３〜４時間の重合の後に
、３６ウエル・シャークストウース・コム(sharkstooth comb)を挿入し、緩衝液
（１ｘＴＢＥ）を流してウエルをフラッシュした。発蛍光団タグした試料を負荷
緩衝液（８０％ホルムアミド中の５ｍＭ ＥＤＴＡ、可視ウエルマーカーとして
５ｍｇ／ｍＬブルーデキストランを加える）中で２００〜５００倍に希釈し、１
．５μＬを改変ウエルに負荷した。マルトヘプタオース標準をＤＰ７ピークの位
置探索に使用した。電気泳動は、パーキン−エルマーＡＢＩ３７７遺伝子シーケ
ンサーを用い、２時間、３０００ボルト、５１℃で行い、結果はＡＢＩジーンー
スキャンソフトウエアを用いて解析した。図８は、ＤＰ７とＤＰ３０との間の各
鎖の相対％としてＡＢＩ結果を描いたグラフである。
【００９９】 ＤＰ７とＤＰ３０との間の鎖を有する全モル数は、改変された分離個体のＸＢ
Ｇ０１７１７−２、および正常分離個体のＸＢＧ０１７１７−７に対して計算さ
れ、これらを合計した鎖の相対モル百分率を計算した。この分布を図８に描き、
これは、改変された分離個体ＸＢＧ０１７１７−２は、正常の分離個体ＸＢＧ０
１７１７−７と比較して、ＤＰ７とＤＰ１１との間の鎖でより高い相対モル％を
有し、正常な分離個体は、ＤＰ１２とＤＰ２６の間の鎖でより高い相対割合を有
することを示している。改変された分離個体の相対モル％は、ＤＰ７およびＤＰ
８において正常な分離個体中のものの２倍である。これらの結果は、改変された
分離個体が、非常に短いＡＰ鎖（ＤＰ７〜ＤＰ１０）内が増加し、より大きいＡ
Ｐ鎖（ＤＰ１４〜２３）では減少していることを示している。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドｐＳＳ４３の制限地図を示す。
【図２】 プラスミドｐＳＳ６４−Ｃ５の制限地図を示す。
【図３】 プラスミドｐＳＳ６５−Ｃ１１の制限地図を示す。
【図４】 プラスミドｐＳＰＢ４０の制限地図を示す。
【図５】 プラスミドｐＳＰＢ４７の制限地図を示す。
【図６】 改変された分離個体９４４−１および正常分離個体９４４−７のトウモロコシ
植物のＲ１穀粒からの脱分枝したデンプンの分子量分布を示す。
【図７】 株Ｓ０６４．１．２．１の改変された分離個体ＸＧＢ０１７１７−２および正
常分離個体ＸＧＢ０１７１７−９の単一穀粒からの脱分枝したデンプンの分子量
分布を示す。
【図８】 改変された分離個体穀粒に由来するデンプンおよび非改変分離個体に由来する
デンプンに対するＤＰ７とＤＰ３０との間の鎖長の相対モル百分率の分布を示す
。 配列番号１は、ＢＥ６２ ＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列を示す。 配列番号２は、ＢＥ６１ ＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列を示す。 配列番号３は、ＳＳ７ ＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列を示す。 配列番号４は、ＳＳ８ ＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列を示す。 配列番号５は、ＳＳ１複合遺伝子配列のヌクレオチド配列を示す。 配列番号６は、ｐＳＳ４３中に挿入されたＳＳ１ ＤＮＡ配列のヌクレオチド
配列を示す。 配列番号７は、ＭＭ５０ ＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列を示す。 配列番号８は、ＢＥ５６ ＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列を示す。 配列番号９は、ＭＭ６２ ＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列を示す。 配列番号１０は、ＭＭ６０ ＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列を示す。 配列番号１１は、ｐＳＳ６４−Ｃ５中に挿入されたＳＳ１ ＤＮＡ配列のヌク
レオチド配列を示す。 配列番号１２は、ｐＳＳ６５−ｃ１１中に挿入されたＳＳ１ ＤＮＡ配列のヌ
クレオチド配列を示す。 配列番号１３は、ＳＳ９ ＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列を示す。 配列番号１４は、ＳＳ１０ ＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列を示す。 配列番号１５は、ｐＳＰＢ３７のＳＳｂ 挿入配列のヌクレオチド配列を示す
。 配列番号１６は、ｐＳＰＢ４０中に挿入されたＳＳｂ ＤＮＡ配列のヌクレオ
チド配列を示す。 配列番号１７は、ＯＳＰＢ１０４ ＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列を示
す。 配列番号１８は、ＯＳＰＢ１０５ ＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列を示
す。 配列番号１９は、ＯＳＰＢ１０６ ＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列を示
す。 配列番号２０は、ｐＳＰＢ４７中に挿入されたＳＳｂ ＤＮＡ配列のヌクレオ
チド配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD07 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD13 CD17 CD21 4B024 AA08 BA79 CA04 DA01 FA02 HA03 4C090 AA01 BA13 BC10

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）非ＧＢＳＳＩデンプン合成酵素構造遺伝子をコードす
    る核酸断片またはその断片を含んでなり、上流側においてセンスまたはアンチセ
    ンスのいずれかの配向にて穀類作物組織内で遺伝子発現を支配するプロモーター
    をコードする核酸断片に操作可能に連結され、そして下流側において転写終止の
    ための適合する調節配列をコードする核酸断片に操作可能に連結されているキメ
    ラ遺伝子を調製し、 （ｂ）段階（ａ）のキメラ遺伝子を用いて穀類作物を形質転換する ことを含んでなる形質転換された穀類作物を生産する方法において、 該キメラ遺伝子の発現が、該キメラ遺伝子を有していない穀類作物に由来するデ
    ンプンの微細構造と比較して、該形質転換穀類作物の穀粒に由来するデンプンの
    微細構造の改変をもたらす方法。
  2. 【請求項２】 穀類作物がトウモロコシ品種である、請求項１に記載の方法
    。
  3. 【請求項３】 デンプン合成酵素構造遺伝子をコードする核酸断片またはそ
    の断片がトウモロコシに由来する、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 デンプン合成酵素構造遺伝子をコードする核酸断片またはそ
    の断片が、トウモロコシＳＳＩデンプン合成酵素のすべてまたは一部分をコード
    する、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 ＳＳＩデンプン合成酵素構造遺伝子をコードする核酸断片ま
    たはその断片が、配列番号５、配列番号６、配列番号１１および配列番号１２か
    らなる群から選択される構成員に記載の単離された核酸断片に本質的に類似して
    いる、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 デンプン微細構造の改変が、該デンプンのアミロース分子成
    分のアミロペクチン分子成分に対する比率の改変を含んでなる、請求項１に記載
    の方法。
  7. 【請求項７】 デンプン微細構造の改変が、該デンプンのアミロペクチン成
    分の分子量分布の改変を含んでなる、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 デンプン微細構造の改変が、該デンプンのアミロース成分の
    分子量分布の改変を含んでなる、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 デンプン合成酵素構造遺伝子をコードする核酸断片またはそ
    の断片が、上流側においてトウモロコシ内胚乳組織内の遺伝子発現を支配するプ
    ロモーターをコードする核酸断片に対して、および下流側において転写終止のた
    めの適合する調節配列をコードする核酸配列に対して、センスまたはアンチセン
    ス配向で操作可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１記載の方法により調製されたトウモロコシ品種ま
    たはそのあらゆる後代。
  11. 【請求項１１】 該トウモロコシ品種の穀粒から単離されたデンプンのアミ
    ロース分子成分が、穀粒非形質転換トウモロコシから単離されたデンプンのアミ
    ロース分子成分と比較して著しく増加している、請求項９に記載のトウモロコシ
    品種。
  12. 【請求項１２】 請求項１に記載の方法により調製されたトウモロコシ品種
    またはそのあらゆる後代の穀粒から単離されたデンプン。
  13. 【請求項１３】 請求項１に記載の方法により調製された穀類作物品種また
    はそのあらゆる後代から調製された穀粉。
  14. 【請求項１４】 食料品、水、および請求項１３に記載の穀粉に由来するデ
    ンプンの有効量を組合せ、そして濃縮された食料品を生産するために必要に応じ
    て得られた組成物を調理することを含んでなる濃厚化された食料品を調製する方
    法。
  15. 【請求項１５】 トウモロコシＳＳＩデンプン合成酵素構造遺伝子をコード
    する核酸断片またはその断片を含んでなり、上流側においてセンスまたはアンチ
    センスのいずれかの配向でトウモロコシ内胚乳組織内の遺伝子発現を支配するプ
    ロモーターをコードする核酸断片に操作可能に連結され、そして下流側において
    転写終止のための適合する調節配列をコードする核酸断片に操作可能に連結され
    ているキメラ遺伝子を用いて形質転換されたトウモロコシ品種またはそのあらゆ
    る後代。
  16. 【請求項１６】 デンプン合成酵素構造遺伝子をコードする核酸断片または
    その断片が、トウモロコシＳＳｂデンプン合成酵素のすべてまたは一部分をコー
    ドする、請求項３に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 ＳＳｂデンプン合成酵素構造遺伝子をコードする核酸断片
    またはその断片が、配列番号１５、配列番号１６および配列番号２０からなる群
    から選択されている構成員に記載の単離された核酸断片に本質的に類似している
    、請求項４に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 デンプン微細構造の該改変が、該デンプンのアミロペクチ
    ンＤＰ７〜ＤＰ１０成分の相対モル数を低下させることを含んでなる、請求項１
    に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 低下した老化性を有する、請求項１に記載の方法により生
    産されたデンプン。
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