RO109447B1

RO109447B1 - Procedeu pentru prepararea clorhidratului de ester metilic al a-Laspartil-L-fenilalaninei

Info

Publication number: RO109447B1
Application number: RO14571990A
Authority: RO
Inventors: John B Hill; Yefim Gelman; Hugh L Dryden Jr; Robert A Erickson; Kuang Hsu; Mark R Johnson
Original assignee: Nutrasweet Co
Priority date: 1990-08-08
Filing date: 1990-08-08
Publication date: 1995-02-28

Abstract

Invenția se referă la un procedeu pentru prepararea clorhidratului de ester metilic al a-L-fenilalaninei, intermediar pentru obținerea esterului corespunzător, folosit ca agent de îndulcire, prin reacția dintre acidul L-aspartic, acidul formic, anhidridă acetică și L-fenilalanină, într-un vas, într-o singură zonă de reacție, cuprinzând etapele de : formilarea acidului Laspartic pentru obținerea anhidridei N-formil-Laspartice, cuplarea acesteia cu L-fenilalanină, deformilarea izomerilor alfa, beta obținuți, esterificarea izomerilor cu metanol, în prezență de acid clorhidric și izolarea clorhidratului obținut.

Description

Prezenta invenție se referă la un procedeu pentru prepararea clorhidratului de ester metilic al «-L-aspartil-Lfenilalaninei, care se folosește pentru obținerea esterului metilic al a-L-fenilalaninei (a-APM), un agent de îndulcire care este de circa 200 ori mai dulce decât zaharoza. Puterea de îndulcire a acestui compus, o dipeptidă, face posibila îndulcirea alimentelor și a băuturilor prin folosirea unei cantități mult mai mici decât zahărul. Acestui compus îi lipsește gustul ulterior neplăcut asociat cu alți agenți de îndulcire ca zaharina și ciclamatul.

a-APM este un compus cunoscut (Brevet US 3492131) și sunt cunoscute diferite procedee de preparare a acestuia. Procedeele cunoscute cuprind, însă, faze de izolare și de recuperare dificile.

Esterul metilic al a-L-aspartil-L-fenilalaninei este o dipeptidă compusă esențial din 2 aminoacizi, acid L-aspartic și L-fenilalanină. S-a considerat câtva timp că proprietatea de îndulcire a dipeptidei depinde de stereochimia acestor aminoacizi individuali. Fiecare dintre acești aminoacizi poate să existe, fie sub formă de D sau formă de L și s-a determinat că esterii de L-aspartil-L-fenilalanină sunt dulci, în timp ce izomerii corespunzători D-D, D-L și L-D nu sunt dulci. Combinațiile izomerilor care conțin dipeptidă L-L. DL-aspartil-L-fenilalanina, L-aspartil-DL-fenilalanina și DLaspartil-DL-fenilalanina sunt dulci, dar au numai jumătate din puterea de îndulIzomer a

CO2CH3

I

CONH-C-H

I I

H2N - C - H CH2 0 l

CH2

I

CO2H cire, întrucât racematul conține 1/2 din jumătatea L-L.

Dipeptidă se produce printr-o reacție de cuplare, în care acidul aspartic este legat cu L-fenilalanină sau esterul său metilic. Reacția de cuplare necesită o grupă amino protectoare atașată la jumătatea de acid aspartic ca: formil, acetil, acetoacetil, benzii, caibobenzoxi substituit sau nesubstituit, terț- butoxicarbonil și halogenhidratul. Grupa amino protectoare sau N- protectoare este Nformil, considerată ca agent de blocare. Anhidrida aspartică formulată și procedeul său de preparare sunt cunoscute (Brevet US 4173562).

Reacția de cuplare se execută într-un solvent și este o fază cunoscută în diferite procedee pentru producerea de ester a-L-aspartil-L-fenilalaninmetilic «a-APM) (Brevete US 3962207, 4173562, EP 127411).

în timpul reacției de cuplare a celor doi aminoacizi, se produc doi izomeri ca intermediari și stereochimia lor determină până la urmă puterea de îndulcire a moleculei speciale. Izomerul alfa este produsul dorit, în sensul că fracțiuni izolate de α//α-ΑΡΜ pură prezintă o putere de îndulcire de circa 200 ori mai mare decât cea a zahărului. Fracțiunea de izomer beta însă nu prezintă această putere de îndulcire.

Izomerii alfa și beta prezintă formulele de mai jos:

Izomer β

CO2H

I

H2N - C - H CO2GH3 I I

CH2CONH-C-H

I

CH20

S-a determinat ca formarea izomerilor alfa și beta și raporturile lor respective din reac{ia de cuplare, depind de felul solventului folosit pentru executarea reacției, de temperatura la care are loc reacția și de cantitatea de solvenți folosită. Daca se folosește acid acetic ca solvent în reacția de cuplare, la 50°C, raportul de izomer alfa/beta este de 75:25 (Brevet US 4173562). Raportul molar de acid acetic la fenilalamnă trebuie să fie de cel puțin 10:1. Raportul de izomeri alfa/beta scade considerabil la 69/31 dacă raportul molar acid acetic fată de L-fenilalanină este redus la 6:1.

O problemă care apare în folosirea solven^lor, constă în faptul că după 0,5...3 h de reacție, amestecul de reacție se solidifică și devine realmente imposibil să se agite sau să se îndepărteze din reactor. Este necesară astfel, o agitare care asigură o amestecare a reactanților pentru realizarea unei reacții complete, în al doilea rând, solventul trebuie să fie îndepărtat mai târziu prin distilare.

O altă problemă constă în faptul, că în anumite cazuri 25% sau mai mult din #//α-ΑΡΜ se pierd deoarece rămân în soluția de reacție originală. în plus, anhidrida formil - L - aspartica într-un amestec de reacție din acid aspartic, dă un mare exces de acid formic și anhidridă acetică. Cantitatea în exces de acid formic trebuie îndepărtată într-un anumit moment prin distilare și separare de acid acetic.

Este cunoscut un procedeu similar în care clorhidratul de anhidridă L-aspartică este cuplat cu ester L-fenilalaninmetilic (Brevet US 4173562). O problemă care se ridică în acest procedeu constă înfăptui că este necesară o mare cantitate de ester metilic al L-fenilalanineL în al doilea rând, ca rezultat, se formează cantități importante de tripeptide care trebuie îndepărtate și necesită alte metode de separare.

Procedeul de preparare a clorhidratului de «//«-APM prin reacția dintre acidul Lraspartic, aridul formic, anhidridă acetică și L-fenilalanină, conform invenției, înlătură dezavantajele procedeelor cunoscute, prin aceea că, într-o singură zonă de reacție cuprinde:

a) , formilarea aridului L-aspartic într-un amestec de reacție de 1,2 până la 1,35 echivalenți molari de acid formic per mol de arid aspartic, 2,2 până la 2,9 moli anhidridă acetică per mol de acid aspartic și cel puțin 0,3 echivalenți molari față de cantitatea totală de arid formic adăugată dintr-un alcool secundar pentru a se obține anhidridă N-formil-L-aspartică, iar anhidrida L-acetică poate fi adăugată fie toată deodată într-o cantitate de 2,3 până la 2,9 moli per mol de acid L-aspartic, fie în două trepte, prima de cel puțin 2,0 mol per mol de arid Laspartic și cea următoare de circa 0,2 mol per mol de acid L- aspartic;

b) . cuplarea anhidridei N-formilasparticinsitu cuL- fenilalanină în prezența a cel puțin 7 echivalenți molari de acid acetic, față de L-fenilalanină și eventual în prezența unui alchilester și/sau a unui alcool împiedicat, la o temperatură de 5 până la 60°C, pentru a se obține izomeri dea,/2-N-fonnil-L-aspartil-L~fenilalanină cu sau fără agitare;

c) . deformilare izomerilor prin adăugarea a circa 1,2 mol acid clorhidric per mol de arid L-aspartic;

d) . îndepărtarea acidului acetic rezidual și a aridului formic din amestecul de reacție;

e) . esterificarea izomerilor deformilați prin adăugarea a 1 până la 10% în greutate metanol, 32 până la 50% în greutate apă și 9 până la 18% în greutate acid clorhidric la amestecul de reacție pentru a obține dorhidrat de a și /3-APM în care precipita clorhidratul de ațfaAPM și

f) . izolarea clorhidratului de alfaAPM.

Procedeul, conform invenției, prezintă următoarele avantaje:

- mărirea raportului de alfa/beta de APM (HC1) la circa 80/20, dacă aridul acetic folosit ca solvent în reacția de cuplare, este parțial înlocuit cu un ester alchilic, alcool împiedicat, sau amestec al lor;

- randament mărit al izomerului alfa care este produsul final dorit;

- subprodusele de reacție rezultate în timpul formării de anhidridă L-aspartică formilată servesc, de asemenea, ca solvent pentru reacția de cuplare, într-un mod care evită multe din problemele de separare.

La prepararea anhidridei N-formilL-aspartice se folosește o cantitate minimă de acid formic (1,2... 1,35 echivalenți molari per mol acid aspartic) și se convertește excesul la formiat de izopropii prin adăgare de anhidridă acetică și alcool izopropilic.

Anhidrida aspartică formilată se poate apoi cupla in situ, prin adăugare de L-fenilalanină (L-Phe). în reacția de cuplare se adaugă eventual, un ester alchilic sau alcool împiedicat și acesta îmbunătățește în mod surprinzător raportul alfa/beta. în timp ce un ester se prepară în mod normal prin reacționarea unui alcool cu o anhidridă, este neașteptat că alcoolul împiedicat nu atacă anhidrida formil-aspartică în timpul desfășurării reacției.

Această reacție de cuplare se poate executa cu o agitare slabă, sau chiar deloc, menținându-se o viscozitate a amestecului de reacție redusă, având ca rezultat un amestec de reacție final fluid.

Apoi, dipeptida rezultată se deformilează cu acid clorhidric și se esterifică prin potrivirea concentrațiilor de metanol, apă și acid clorhidric, la cantități eficace, producându-se alfa- APM (HCl) cu randament mare. /l#a-APM (HCl) precipită din amestecul de reacție și se izolează și se neutralizează cu o bază, fonnându-«e α#α-ΑΡΜ.

Procedeul într-o singură fază de reacție, începe prin amestecarea de add L-aspartic cu o cantitate minimă de add formic (cel puțin, 1,2 echivalenți molari fațade add aspartic) și anhidridă acetică (cel puțin circa 2,0 echivalenți molari față de acidul acetic), în prezența unui catalizator, ca oxid de magneziu rezultând anhidridă N-formil-L-aspartică. Catalizatorii corespunzători sunt cunoscuți și cuprind oxizi, hidroxizi și săruri de metale (Brevete US 4508912; 4550180). Această reacție se execută la temperaturi până la circa 52°C. Amestecul se agită, de preferință, la drca 50°C, cel puțin circa

2,5 h. După drca 2,5 h se adaugă suplimentar anhidridă acetică (drca 0,2 mol) pentru a converti excesul de acid formic neintrat în reacție la anhidrida mixtă formil-acetică. După alte 2,5 h se adaugă un exces de alcool izopropilic (cel puțin drca 0,3 echivalenți molari pe bază de total acid formic adăugat) pentru transformarea anhidridei formil-acetice în formiat de izopropii. Cantitatea de add formic folosită este, de preferință, de la 1,31a 1,35 echivalenți molari față de add aspartic.

în mod alternativ, anhidrida acetică se poate adăuga la amestecul de reacție toată odată (2,3...2,9 mol per mol de acid aspartic) la începutul reacției și alcoolul secundar se poate adăuga după aceea pentru consumarea excesului de acid formic prin reacționare cu anhidrida mixtă, având ca rezultat formarea esterului corespunzător. De asemenea, se poate adăuga o parte minora de anhidridă acetică cu alcool secundar într-o singură fază. De preferință, însă, acidul formic, o cantitate mai mare de anhidridă acetică și un catalizator se amestecă timp de drca 2~3 h, după care urmează adăugarea unei porțiuni mai mici din anhidrida acetică. Amestecul de reacție se menține în amestecare timp de alte 2...3 h, după care se adaugă alcoolul secundar (izopropanol). Acest amestec de reacție final se amestecă apoi, de preferință, la drca 50°C timp de încă 2~3 h pentru definitivare.

Produsul, anhidridă N-formil-L-aspartică, se lasă apoi să reacționeze cu L-fenilalanină in sfiu, fără să se aplice metode de separare costisitoare și consumatoare de timp. Subprodusele de reacție servesc ca cosoivenți pentru procedeul de cuplare.

L-fenilalanina se cuplează cu anhidrida N-formil-L-asparti că în cantități echimolare, eventual în prezența unui ester alchilic sau a unui alcool împiedicat sau un amestec al acestora. S-a constatat că esterul alchilic și/sau alcoolul împiedicat mărește raportul alfa/beta dacă se adaugă în cantitate echivalentă cu cel puțin circa 1,2 mol per mol L-fenilalanină. Raportul alfafbeta crește cu creșterea cantităților de ester sau alcool până la un punct când cantitatea molară de ester, alcool sau amestecuri ale lor este de circa 4,7 ori mai mare decât cea de L-fenilalanină. în acest moment se atinge un nivel de saturare, când raportul izomeric rămâne constant indiferent de cât de mult ester sau alcool se mai adaugă.

De preferință, esterul alchilic folosit in reacția de cuplare se alege dintre: acetat de metil, acetat de etil, acetat de izoporopil, acetat de n-butil și formiat de izopropil. Un ester alchilic preferat este acetatul de metil (MeOAc). Alcooli împiedicați care se pot folosi cuprind alcool izopropilic și alcool butilic secundar sau terțiar. Alcoolul izopropilic este un alcool împiedicat preferat

Reacția de cuplare se execută apoi, prin agitarea amestecului sus-menționat timp de circa 4...6 h, la o temperatură cuprinsă între circa 5 și 60°C, de preferință între 15 și 30°C, adică temperatura camerei. O problemă care apare în timpul reacției de cuplare este reacția care are loc cu formarea de N- formilL-aspartil-L-fenilalanină, amestecul sau suspensia începe să se solidifice, adică viscozitate mare, până în momentul când agitarea devine extrem de dificilă dacă nu, chiar imposibilă. Viscozitatea mare până la acest nivel face filtrarea foarte dificilă și inhibează transferul de căldură care previne distilarea de add acetic, de esteri și/sau de alcool împiedicat descrisă mai jos. S-a constatat că prin adăugarea de add acetic la reacția de cuplare, această solidificare este inhibată, adică apare o scădere a viscozității. Aceasta este important în sensul că amestecarea asigură definitivare reacției. De asemenea, acidul și esterii trebuie să fie îndepărtați din amestec prin distilare înaintea deformilării și pentru aceasta amestecul de reacție trebuie să fie agitabil.

Cantitatea de add acetic adăugată depinde de cât de multă anhidridă Nformilaspartică s-a sintetizat întrucât reacția de cuplare se execută in situ, în subprodusele de reacție se va găsi deja ceva add acetic din reacția inițială dintre add L- aspartic și anhidridă acetică. Cantitatea totală de add acetic în sistem va fi de circa 7 ori mai mare decât cea de L- fenilalanină, în mol/moL De aceea, nu va fi necesar să se adauge add acetic în cantitate de 7 ori mai mare decât cea de L- fenilalanină care s-a adăugat O cantitate mai mică, în care cantitatea molară totală de add acetic prezentă în sistem este de circa 7 ori mai mare decât cea de L-fenilalanină, este suficientă.

în timp ce reacția de cuplare se poate executa la temperatura ambiantă, de preferință, se folosesc temperaturi ridicate care contribuie, de asemenea, la scăderea viscozității amestecului de reacție. în mod avantajos, se folosesc temperaturi între 25 și 40°C, iar temperatura preferată este de circa 30°C.

Conform invenției, este importantă scăderea viscozității amestecului de reacție de cuplare prin controlarea agitării amestecului de reacție de cuplare. S-a constatat că oprirea sau reducerea vitezei agitatorului în timpul reacției de cuplare provoacă în mod dramatic o scădere a viscozității amestecului de reacție de cuplare. Intr-un reactor mare (10 ft diametru de reactor prevăzut cu agitator mecanic cu palete lungi de 5 ft) o agitare foarte slabă ca 5—40 tur/min și agitare ocazională ca acționarea scurtă a agitatorului la fiecare 5-15 min, se reduce drastic viscozitatea amestecului de cuplare în comparație cu reacții executate cu o viteză de agitare de circa 60 tur/min sau mai mult în reactori la scară de laborator (flacon cu fund rotund de 10,24 cm cu palete de 12,7 an), 200...300 tur/min provoacă nu amestec de reacție foarte gros, în timp ce o agitare de 5... 15 tur/min produce un amestec de reacție cn viscozitate redusă, foarte curgător. De asemenea, oprirea agitatorului după circa o oră, după ce s-a adăugat L-Phe la amestecul de reacție și reporuirea sa după reacție, adică după circa 6 h, produce un amestec de reacție cu o viscozitate mică. Dar într-o operație, la scară industrială, când agitatorul se oprește perioade de timp mai mari de 1 h, poate fi foarte greu să se repornească agitatorul din cauza depunerii și aglomerării precipitatului De aceea, se prefera agitare slabă și agitare periodică.

în folosirea termenilor curgător sau viscozitate mică, atunci când se referă la amestecuri de reacție de cuplare, aceasta înseamnă un lichid care va curge dintr-un vas de sticlă sau un reactor. Aceste lichide vor avea în general o viscozitate de sub circa 15000 cP, în mod avantajos între 1000 și 10000 cP, de preferință între 150 și 500 cP.

Mijloacele de agitare nu sunt critice, în cadrul procedeului conform invenției. Se pot folosi orice fel de mijloace de agitare standard, adică injecție de gaz inert, scuturare, rotirea reactorului, agitatoare mecanice etc. Se preferă agitatoare mecanice. De asemenea, nu este critică configurația exactă a agitatorului. Cu agitatoare cu palete sau cu lame, viteza de agitare este în mod avantajos de la circa 5 la circa 40 tur/min și, de preferință, de circa 20 tur/min. O viteză a agitatorului sub circa 40 tur/min este acceptabilă pentru reducerea viscozității amestecului de reacție. Se observa însă că, în aparatură la scară de laborator (flacon de 10,2 cm) o viteză de agitare titre 40 și 150 tur/min va produce un amestec de reacție fluid.

Izomerii alfa și beta de N-formilα^ι-L-aspartil-L-fenilalanină, (alfalbeta F-AP) obținu]), conform invenției, se pot analiza prin cromatografie lichidă de io înaltă performanță (HPLC) și aceasta va arăta că aceste procedee dau un raport alfalbeta neobișnuit de mare, de circa 79,5:20,5.

Eventual, acidul acetic și orice fel de esteri (acetat de metil, formiat de izopropil etc) sau alcool împiedicat se îndepărtează din amestecul de reacție înaintea fazei de deformilare descrisă mai jos. De preferință, acidul acetic și esterii se distila în vid între circa 38,1 și circa 63,5 mm Hg. Distilarea în vid se execută înaintea adăugării de acid clorhidric folosit pentru deformilarea de alfa/beta-F-AP. Acidul acetic, esterii și/ sau alcoolul se recuperează și se reciclează pentru folosire în reacții de cuplare ulterioare.

în continuare, izomerii alfa și beta de N-formil-L- aspartil-L-fenilalanină se deformilează. Se adaugă acid clorhidric și eventual metanol la amestecul de izomeri pentru deformilarea de alfalbeta F-AP, rezultând formarea de alfa/betaAP. De asemenea, excesul de metanol reacționează cu ceea ce a rămas din acidul acetic și acidul formic, prezență în amestecul de reacție, obținându-se acetat de metil și formiat de metil care au puncte de fierbere mult mai reduse decât acidul acetic sau acidul formic și astfel se pot îndepărta din sistem prin distilare la temperaturi mai joase. Amestecul rezultat de alfa/beta-AP și diferiții lor esteri metilici, se estenfică apoi prin potrivirea concentrației de acid clorhidric, metanol și apă, la cantități suficiente să producă un randament mare de o/fa-APM (HC1). Concentrația în metanol va fi de circa 1 la circa 10% în greutate și, de preferință, de circa 3 la circa 5% în greutate. Concentrația de acid clorhidric va fi de circa 9% la circa 18% în greutate și, de preferință, de circa 12,5% la circa 14,5% fii greutate. Concentrația de apă va fi de circa 32 la circa 50% bi greutate și, de preferință, de circa 37 la circa 42% bi greutate. După ce concentrațiile de apă, acid doihidric și metanol au foststabiliteîh mod corespunzător, ames109447 tecul de reacție se agită ușor la temperaturi sub circa 35°C gi, de preferință, la temperatura ambiantă (2O...3O°C). Esterificarea este completă în circa 4 la circa 8 zile gi de obicei în circa 6 zile.

Clorhidratul rezultat de ester aspartil-L- fenilalaninmetilic -o^â-APM (HC1)- se separă apoi cu ugurința de izomerul beta întrucât alfa- APM.HCL 2H2O are o solubilitate mai mică în soluții apoase decât beto-APM (HC1). Izomerul alfa precipită din soluție gi se separă prin filtrare, centrifugare, decantare sau una din multe alte metode obișnuite.

Apoi, α^α-ΑΡΜ (HC1) se neutralizează cu o bază formând APM care se recuperează apoi prin metode de cristalizare cunoscute.

Se dau, în continuare, exemple de realizare a procedeului, conform invenției, care nu sunt limitative.

Exemplul L Se dizolvă 0,12 g (0,003 mol) catalizator oxid de magneziu în 16 ml (0,405 mol) add formic soluție 95%. La soluția de mai sus se adaugă 60,2 ml anhidridă acetică și se încălzește la

35...40°C, timp de 10...15 min. Se adaugă apoi 39,93 g (0,3 mol) add L-aspartic gi acest amestec se agită timp de 2,5 h, la 50±2°C. în acest moment se adaugă 8,6 ml anhidridă acetică în plus gi reacția se continuă timp de încă 2,5 h la 50:fc2°C. Apoi la amestecul de reacție se adaugă

9,2 ml (0,120 mol) alcool izopropilic gi încălzirea se continuă încă timp de 2 h. în acest moment se formează anhidridă N-formil-L-aspartica aga cum reiese din cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC).

Apoi amestecul de reacție care conține anhidridă N-formil- aspartică se răcește la temperatura camerei, 2Q~ 25°C gi la acesta se adaugi 150 ml (1,89 mol) aeetat de metil urmat de 44,6 g (0,27 mol) L-fenilalanină. Amestecul se agită timp de 3 h, la temperatura camerei (20Î30°C).DujĂ3hde agitare, amestecul se lasă să stea peste noajpte (18...24 h) la temperatura camerei gi se solidifică.

Produsul solidificat se dizolvă într-o soluție de metanol gi apă (9:1). Amestecul rezultat de izomeri alfa gi beta de N-formil - L - aspartil - L - fenilalanină se analizează prin HPLC gi are raportul izomeric alfafbeta de 79,2:20,8.

Exemplul 2. Raportul alfafbeta de N-formil-L- aspartil-L-fenilalanină preparat prin reacția de cuplare in situ, se compara folosind diferiți cosolvenți de ester/alcooL Se dizolvă 0,121 g (0,003 mol) oxid de magneziu în 16 ml (0,406 mol) add formic de 93,4% sub azot Apoi la amestecul agitat se adaugă 62,5 ml (0,655 mol) anhidridă acetică și se formează un precipitat alb. Temperatura amestecului se ridică la 37...38°C în timpul următoarelor 30 min. Se adaugă 39,93g (0,30 mol) add acetic gi amestecul se încălzește la 48...50°C, timp de 2,5 h. Apoi se adaugă încă 8,6 ml (0,09 mol) anhidrida acetică cu încălzire timp de încă 2,5 h. La amestecul de reacție se adaugă 9,2 ml (0,120 mol) alcool izopropilic, încălzirea la 50±2°Ccontinuânduse încă timp de 2 h. Apoi amestecul de reacție se răcește la temperatura camerei (22...27°C).

Prepararea de anhidridă N-formil-Laspaitică se repetă de mai multe ori pentru a se produce mai multe prime amestecuri de reacție. La fiecare din aceste prime amestecuri de reacție se adaugp 100 ml din unul din esterul alchilic sau alcoolul împiedicat, ca solvenți, menționați în tabelai 1, după care urmează adăugarea de 44,6 g (0,27 mol) L-fenilalanină. Suspensiile rezultate se mențin la temperatura camerei timp de 5 h, pentru definitivarea procesului de cuplare in atu. Pe măsura ce reacția înaintează, suspensiile se solidifică din ce în ce mai mult în fiecare reacție gi pentru a dizolva întreaga cantitate de solide șe adaugă o cantitate de metanol gi apă ca soluție 10: L Se analizează 2,0 g alicote în fiecare amestec de reacție prin HPLC. Raporturile alfafbeta de N-formil- L-aspartil109447

14

Tabelul 1

Solvent	Raport alfa/beta
Acetat de metil	79:21
Acetat de etil	79:21
Acetat de izopropil	80:20
Acetat den - butii	78: 22
Fonniat de etil	75,5 : 24,5
Formiat de izopropil	78:22
Alcool izopropilic	78: 22
Alcool sec - butilic	76: 24
Alcool terț - butilic	78:22
Fără solvent	71:29

L-fenilalanină rezultate, formate în fiecare reacție, sunt date în tabelul 1.

Exemplul 3.Sepreparădinnouanhidridă N-formil-aspartică în condițiile prezentate în exemplul 1. Anhidrida aspar- 5 tică se lasă în amestecul de reacție original sa se cupleze in atu cu L-fenilalanină. La amestecul de reacție in âtu se adaugă 100 ml acetat de metil, 44,6 g (0,27 mol) L-fenilalanina și 84 ml (1,47 mol) acid 1θ acetic. Cantitatea totală de acid acetic prezenta în amestecul de reacție este de 166ț,4 ml (2,912 mol), întrucât există deja ceva ca subprodus în reacția de formare de anhidridă, atunci când anhidrida ace- 15 tică reacționează cu acid L-aspartic.

Amestecul de reacție de cuplare se agită la temperatura camerei (2O...25°C), timp de circa 6 h. Acest amestec nu se solidifică după ce reacția de cuplare a 20 luat sfârșit Raportul izomeric atfafbeta se analizează prin HPLC și este 79,5:

20,5.

Exemplul 4. Se prepară anhidrida N-formîlaspartică (F-Asp=0), în ace- 25 leași condiții ca în exemplul 1, și se lasă în amestecul de reacție original. Reacția de cuplare se execută apoi in atu, adăugându-se 44,6 g (0^27 mol) L-fenilalanină, 106,89 g (1,26 mol) acetat de 30 metil și suficient acid acetic pentru a se obține o cantitate totală de 2,91 mol (vezi exemplul 3).

Reacția de cuplare se executa prin agitarea amestecului timp de circa 6 h, la temperatura camerei (2O...25°C). La fel, acest amestec nu se solidifică după ce a luat sfârșit reacția de cuplare. Se obține un raport izomeric atfafbeta de 79,5:20,5.

în tabelul 2, se dau rezultatele în raporturi alfa/beta care s-au obținut la introducerea în amestecul de cuplare de diferite concentrații de acetat de metil și acid acetic (AcOH). Cantitățile de anhidridă N-formilaspartică și L-fenilalanină se mențin constante la 0,27 mol pentru fiecare. De asemenea, se mențin constante temperatura și timpurile de reacție Concentrațiile respective, de acetat de metil și acid acetic în fiecare reacție sunt date în mol solvent^>er mol pective, obținute la fiecare amestec, sunt prezentate fii dreapta tabelului pentru a verifica modul constant cu care se poate obține un raport mare, aplicând procedeul conform invenției.

Raport alfafbeta referitor la concentrația de AcOH și AcOMe la cuplarea de L-Phe și F-Asp=0

Tabelul 2

Nr. experienței	Concentrație moli/moli L-Phe	Raport alfafbeta
AcOMe	AcOH
1	4,65	0,00	80,0/20,0
2	4,65	534	78,6/21,4
3	7,00	5,34	79,2/20,8
4	4,60	10,79	79,5/20,5
5	3,49	10,79	79,2/20,8
6	2,33	10,79	77,9/22,1
7	1,17	10,79	77,1/22,9
8	2,94	9,00	77,4/22,6
9	3,50	9,00	78,0/22,0
10	2,28	7,00	77,15/22,85
11	1,17	8,58	76,3/23,7
12	2,61	7,67	77,8/22,2
13	0,00	5,34	69,0/31,0
14	0,00	10,50	74,0/26,0

Exemplul 5. Deși cantitatea de acid acetic în reacția de cuplare este in general de 7 ori mai mare decât cea de L-fenilalanină, s- a demonstrat că și o cantitate mică va acționa drept catalizator O _ cantitate de 31,0 g (0,217 mol) anhidrida ⁵N-formilaspartică preparată în condițiile exemplului 2, se amestecă cu 150 ml acetat de metil și 25,8 ml (0,45 mol) acid acetic sub azot Apoi se adaugă 33,0 g (0,20 mol) L-fenilalanină și amestecul se agită la circa 25°C După 3,5 h, pentru prevenirea solidificării se adaugă încă 100 ml acetat de metil și aceasta se repetă după 4,5 h. După un total de 6 h, _ suspensia de reacție se dizolvă într-o ¹⁵cantitate suficientă de metanol și apă 10:1. Soluția se analizează prin HPLC și raportul izomeric alfafbeta este 80:20.

Exemplul & Se dizolvă 0,4 g (0,01 „ mol) oxid de magneziu în 533 ml (1,35 ^Mmol) add formic de 95% și 200 ml (2,10 mol) anhidridă acetică. Reacția produce o creștere a temperaturii la 40°C (de la 20^22°Ο,ΐηύπφάε15ηϊΐη. La amestecul __ de reacție se adaugă 133,1 g (1,0 mol) ²⁵acid L-aspartic și suspenda rezultată se încălzește la 48...50°C, timp de 2,5 h, în care moment se adaugă 28,9 ud (0,303 mol) anhidridă acetică suplimentar, încălzirea se continuă timp de alte 2,5 h, după care se amestecă cu 30,7 ml (0,4 mol) alcool izopropilic. Acest amestec se agită timp de 1,5 h la 48^50°C și apoi se lasă să se răcească la temperatura camerei (25±2°C). Amestecul rezultat contine anhidridă N-formilaspartică.

La acest amestec de reacție se adaugă 187 ml acetat de metil și 148,68 g (0,9 mol) L-fenilalanină, dând o suspensie care se agită timp de l,5h. Se adaugă 120 ml acid acetic pentru facilitarea agitării și amestecul se menține la 25.~26°C, timp de încă 4,5 h. Amestecul se distilă apoi în vid (558,8 mm Hg) până ce amestecul de reacție ajunge la temperatura de 65°C.

Se adaugă 220 ml metanol și 100 ml (13 md) acid dorhidric și se amesteca în suspensia ce se încălzește la drea 60°C, timp de 1 h. Se obține o soluție limpede care se distilă până ce se atinge o temperaturii de vârf de 63°C și o temperatură a amestecului de reacție de 73°C. Se adaugă 400 W metanol supli10 menlar si distilarea se continua pana ce temperatura amestecului de reacție ajunge ia 6? L. ixt-ziduni iczuiiai se răcește ia temperatura camerei ci<o circa 25°C. prin supunerea amestecului de 5 reacție la un vid de circa 6()1).4 mm iîg, timp de 45 min. I a reziduul răcit se adaugă apoi 120 ml acid clorhidric eduție de 17' <. 19 mi metanol și 94 «<> iiii Amestecul se mtită apoi la temperat'nra 0' camerei timp de 5 /iJe.

Suspensia rezultată se tiiirea/.ă si se spala. ohîinandu-se 1'%5-ί p soPp -pe după uscate la >0 C. timp de ’() n. Aeesi produs se analizează prin IIPI.L si 15 conține M.5', ρΖ/λ-.Λΐ’Μ.

Exemplul ι. Se lucrează în aceleași condiții. c;t in exemplul 6. cu excepția • aptului eă se adaugă 400 ml metanol cu o viteză suficientă ea să se obțină un 20 volum constant. Rezultă 197.85 g solid care se analizează prin IIPI.C, indicând un continui de ulfa-AP\i de 67.18%.

Exemplul 8. Se aplică aceleași condiții, ca în exemplul 6, cu excepția faptului 25 că distilarea finală se execută complet în vid. la o temperatură maximă în vas. de 55...56°C, Randamentul de ester metilical aspartil-L-fenilalaninei sun formă de clorhidrat este de 51% față de cel 30 teoretic.

Exemplul 9. Se aplică aceleași condiții. ca în exemplul 7. cu excepția faptului că distilarea după adăugare de metanol se execută în vid (508 mm Hg) timp de 35 2 h, la 55...67°C. Se izolează și se analizează un randament de 186,15 g clorhidrat de ester metilic al alfa-L-aspartil-L-fenilalaninei dihidrat, din care 64,68% este ester metilic al «Z/ă-L-aspar- 40 til-L- fenilalaninei.

Exemplul 10. Se adaugă în picături, ml (0,405 mol) acid formic soluție de 95,7% la 60,2 ml (0,631 mol) anhidridă acetică în timp de 5 min, în care timp 45 temperatura se ridică la 40°C. Amestecul se agită timp de 55 min și se adaugă 0,43 g (0,003 mol) acetat de magneziu și 39,93 g (0,3 mol) acid L-aspartic. Suspensia rezultată se încălzește la 50

4/...46 V. timp tie 2.5 n. Se adamui 7. i mi i4.6~44 mol) :,nfidridă acetică si iUCnlZii'va se νυύΐΐύιω tlllip UC__-> ii. Se adauea 7.21 $> u). I j) moi) alcool vnpropilic și încălzirea se con! im·.” timp de

i.s li. iiit.iiziren osie discontinua si se adaucă 136 mi acid acetic si 44.0 p (0.2⁷)) mol; 1 ,-fenilalanină. Acest ames’ec ce apiiă ia iemiK’ialura ambiantă peste noa|»\u<npn<id ^rc' j

^; ~^: i' *' % ^J · laicele. S»?

n > I i - a vă ^r î ίΗτπϊί dizoh’5 în . îllf‘Ϊ.1:% >v ό pane .ihcom aî se î e, f* . 7 . ’ț /7 _ X' _ ț AT’VÎ ι I _ !

-5 |ti · C11 z danielii ui de i/oinc Exemplu! 1 A Se mol) acid formic h, ττητ / ’ *5

Aii ------AsOi ιΐίίά c<te oe 1.5.

’6 O ml 9’ 9.05 < zi mp .... . î < țb.i.'de i.ioii oxid de mapneziu. sub azol si se apita până ce se dizolvă cp solidul. Se adaugă

60.2 ml (0.631 moli .inhiJiidă acetică obtinându-se. imediaT. un precipitat si temperatura crește la 40°C în timp de 15 min. Se adaugă 39.93 g (6.3 mol) acid L-aspartic si suspensia se încălzește la 48...50°C, timp de 2,5 h. Se adaugă încă9.3 ml (0,0974 mol) anhidridă acetică și încălzirea se continuă timp de 2.5 h. Se adaugă 11,9 ml (0,155 mol) alcool izopropilic și amestecul se încălzește timp de 1,5 h. Temperatura crește la 53^CC și se adaugă 44,6 g (0,27 mol) L-fenilalanină în 4 porțiuni. în timp de 15 min. Temperatura crește la 58°C. în timp de 10 min și agitarea se continuă încă timp de 50 min. Acest amestec de reacție se lasă apoi să se răcească la temperatura ambiantă. Se adaugă 30,1 ml acid clorhidric soluție 37% și 70 ml apă. Suspensia se încălzește la 60°C §i se menține timp de 1 h, în care timp se dizolvă tot solidul. Solventul se îndepărtează prin distilare în vid la temperatura de vas de 55±2°C. Reziduul cântărește 119 g. La reziduu se adaugă 100 g apă și distilarea se repetă, obținându-se un reziduu de 107 g. Se adaugă 50,5 ml acid clorhidric, 41,2 ml apă și 31,5 ml metanol și suspensia se agită la 20,..30°C, timp de 4 zile. Solidul se filtrează și se spală cu 50 ml soluție saturată de sare.

Di Iuti raiul clorhidrat de ester meliiie al 'D1 .-aspartil-E-ienilnlaninei cristalin, alb. cântărește 45.9? e după uscaie peste noapte.

Exemplul 12. O suspensie de anhidridă b-lormilaspartica. se prepara ca in exemplul 1. Înaintea adâimarii de 44.6 u F- fenilalanir.â se adaugă 5 in! accml iltvtli bl *V+ ÎHÎ iivlG «ivClK >1 SuSpViîSiii rezultata seaei’â timp de h. la 2O...3O'4

..4C i iivit.' j *<i i ί i Zn b»>î\CiIi pî'tît dib i H.tle iii vid de ?0 IU IU tiu, de adatlija ?u ml soluție acid ci or ța dac si 06'·' itil iiidiitiCi bx bC jLAi<tiiZvbi< i-i OJ... ·-.. .

ump de J h. >e «idaui.i mea mi metanol și se di-adâ la temperatura tas de 8 7’ f., Se aρlma an 11a ac îhiI îuîu Hg si solventul se distila ia lempernmra în var- de 30(’. Se adaugă apoi ?6.4 iul a<i<j < ι.' i 111 a ι j . _-i.-T ι ii i apa si .a..Ș m 1 metanol si amestecul rezultat se agită timp Jc 4 zile. Precipitatul rezultat >e iiilreazâ. se spală si >e usucă, obtinânduse 63.1 g solid alb. Prin analiză HPI 4 ' se obline un continui de rt/tn-APM de 63D.

Exemplul 13. Diferite ‘••uspensii ,ț_eanhidridă N-formiî-L-aspartică (F_se prț.pju;-. _c., ț_n exemplul i și se introduc într-un balon cu fund rotund de 500 nil. prevăzut cu un agitator mecanic, i .a aceste amestecuri de reacție . .... 4,j„ ... s \ !Λ\χ •Λ. < bJ. I ιΑκ t*i · Uk j»l, ,i! ·, , ki. ' _ i < . .0 1 U div( Μ i f bî » -icîiiiiHriοiιϊϋ îi'ncj

JO m imnΐίΐ.Ίΐ; π, . ' ' - · >:^Ύ 4 / \ L x / ,· k Z \ c ·< .» 1 J .· i « : e. , 1 · . i ·> j · -— >. > < > t \ -J V

2./3· lo.o4< 1.0-'1.0. Aceste amestecuri de cactie reacționează la temperatura ca.Îid,; iiiiip de 1 h. cil o viteza dc aprtare ie de .··... sop iui anin. Fa o ora. lempera'rm r-dtcă la f · v-’t' ci ','ț,a<ia :ii”i;țtorului se reduce între 5 si 15 tur,min. Conversia. îndeosebi, completă de P’ne are loc în ' h. Se folosește un viscozi—0 meii a r.v oiooivt lelo penii u masuiaiea viecozitătilor la temperatura camerei, după un timp de reacție de 6 h. incluzând

i.5.,.2.0 h timp de finalizare, ia 50...55 Că Rezultatele sunt date mai jos:

j ... . I I (ț Viteza agitatorului i lemperatura ι Viscozitate. cP

după prima eră	dună prima ora 1 j	<>	12^x	30'	60^x
200 - 300 tur/min	camerei ι	z860	1587	819	483
(control)	{
5-15 tur/min	25°C	1225	937	490	30i
5-15 tur,mm	4(V’^r' +U	690	48?		170

x) Viteza fusului :r. turații pc minut

Exemplul 14. Se folosesc aceleași condiții de reacție, ca în exemplul 13. cu CXCCpțlTl frîptvl’-i C3 cL·'' nu se agită după prima oră de reacție. După un total de 6 h. amestecul de reacție se va agita, însă va fi nevoie de ajutor pentru pornirea agitatorului. Odată pornit. amestecul de reacție este foarte fluid și curgător și este mai puțin viscos decât un amestec de reacție agitat cu

200...300 tur/min pentru toate cele 6 h. Analiza amestecului de reacție arată conversia completă de Phe.

Exemplul 15. Se execută în aceleași condiții, ca în exemplul 13, cu excepția faptului că amestecul de reacție se agilă scurt, adică timp de 12 s. cu viteză mică.

fiecare 5...15 min după 45 min de reacție. Pentru prima oară amestecul de reacție se agită cu 200...300 tur/min. Amestecul de reacție este un lichid curgător la sfârșitul reacției. Analiza amestecului de reacție arată conversia completă de Phe.

Exemplul 16. Se prepară o suspensie de N-formil-L-aspartică (F- Asp=0) în aceleași condiții, ca în exemplul 1, și se introduce într-un balon cu fund rotund de 500 ml, prevăzut cu un agitator mecanic.

Seadaugă ia amestecul de reaclie AcOMe. z\c(Jll și Phe în cantităti în care raportul molar de AcOMe/AcOI I( total)/PIie,I Asp=0 este de 2.73/7.84/1.0·· 1.0. Reacția se efectuează la temperatura camerei timp de 1 in cu o viteză de agitare de

200...300 tur/min. (’onversia completă de Phe are ioc în circa 5 h. La dărsi(uI primei ore. viivza agitatorului se reduce ia 5... 15 tur/min. Se tac. de asemenea. 2 controale cu viteză de agitator de ?ⁿ⁽’ ..300 tur/min. timp de G il. V Lsev^/., teiil iiC Ov măsoară cu viscozimeiru ia temneralura camerei, după o perioada de reacție care include finalizarea reacției de 1.5...2 h. ia 50...55^(7

Rezultatele sunt prezentate mai jos:

ifT.. . , . .

îl v neza ajyÎuujî uui aupa pruna ^μ ui a

Iț i R. . .......

jl 200-oGo (UI, Uliii leolltlol / ;Ș 200 - 3u0 iiiMinn (controi ι j 5-15 turmin

x) Turativmin a ie tusuiui

Viscozitatea. cP

. -X V j —	î	5d^x ;	60
' i UU V i	1	G ι ib Li	.· i x\7 vi
1 _.·>»<	1	8000 .	f.'lH.IO
''XSO	1	3740 ;	2411)

Exemplul 1/. Se folosesc aceleași 0) condiții de reacție, descrise în exempiui

16. cu excepția faptului că temperatura amestecului de reacție este mărită la 40^(3. când viteza agitaiorului esle redusa la 5...15 tur/min. zXmestecul de reacție o

rezultai este ioarte curgător si mult mai puțin vâscos când verificările se efectuează la 200...300 tur/min. Analiza indica o conversie totală a Phe.

în operații similare. φ-ΛΡ.Μ (HO) 20 se produce cu un randament bun, folosind diferiți esteri ale Iulie i. alcooli împiedicați, parametrii de agitare și metode de distilare descrise mat sus.

Claims

Revendicări

1. Procedeu pentru prepararea clorhidratului de ester metilic al a-L-aspartil-L-fenilalaninei, prin reacția dintre aci- 30 dul L-aspartic, acidul formic, anhidridă acetică și L- fenilalanină, caracterizat prin aceea că într-un vas, într-o singură zonă de reacție cuprinde:

(a), formilarea acidului L-aspartic 35 într-un amestec de reacție de 1,2 până la 1,35 echivalenți molari de acid formic per mol de acid aspartic, 2,2 până la 2,9 moli de anhidridă acetică per mol de acid aspartic și cel puțin 0,3 echivalenți molari fală de canlitatea tolală de acid formic adăugată, dintr-un alcool secundar pentru a obține anhidridă N-formil-L-aspartică. în care anhidrida acetică poate să fie adăugată, fie toată deodată într-o cantitate de 2.3 până la 2.9 moli per mol de acid 1 -aspartic, fie în două trepte, prima de cel puțin 2,0 moli per mol de acid Laspartic și cea următoare de 0,2 mol per mol de acid L-aspartic:

(b) . cuplarea anhidridei N-formilaspartice in situ cu L-fenilaianină în prezența a cel puțin 7 echivalenți molari de acid acetic, pe bază de L-fenilalanină și eventual în prezența unui ester alchilic și/sau a unui alcool împiedicat, la o temperatură de 5 până la 60°C pentru a obține izomeri dea./3-N-formil-L-aspartil-L-fenilalanină, cu sau fără agitare;

(c) . deformilarea izomerilor menționați. prin adăugarea a circa 1.2 moli per mol de acid L-aspartic, de acid clorhidric;

(</). îndepărtarea acidului acetic rezidual și a acidului formic din amestecul de reacție;

(e). esterificarea izomerilor deformilați prin adăugarea a 1 până la 10% în greutate metanol, 32 până la 50% în greutate apă și 9 până la 18% în greutate ucid eioriiidric la amestecul de reacție ικ-ntru a obține clorhidrat de ester meti 1 ic ai ci. ρ-L-aspai ril-L- fenilalaninei în care clorhidratul de estet inetiiic al partil-îfenilalaninei precipită, și

f). izolarea civi'iuuratuiui de osîci metilie al rz-î .-asnarîil-I .-fenilalaninei.
2. Procedeu, conform revendicării 1. caracterizat. prin aceea că aicooiul secundar din treapta (//) este alcool izonro3. Procedeu, conform revendicării 2. caracterizat prin aceea că. treapta de <Upn.iiC v?) CSÎ.C ÎCtiilZeîÎLî III plCZCIlțil unui ester aichtitc. a unui alcool împiedicat sau un amestec al acestora. într-o cantitate de 1.2 până la 4.7 moli per mol de P- feniiaianină.

4. Procedeu, conform revendicărilor

i. 2 sau 3. caracterizat prin aceea că treapta de deformilare leț mai cuprinde adăugarea unei cantități de metanol efi eiente pentru esterificarea oricărei cantități de acid formic și acid acetic prezent! în amestecul de reacție 5; treapta (J) cuprinde îndepărtarea acetatului de metil și formiatului de metil rezultați.

5. Procedeu, conform revendicării 4. caracterizat prin aceea că treapta de cuplare (b) mat cuprinde distilarea în vid a acidului acetic, a alcoolului împiedicai si a esterilor prezent! în amestecul de reacție, înainte de treapta de deformilare (c).

6. Procedeu, conform revendicării 5. caracterizat prin aceea că treapta de îndepărtare (d) este realizată prin distilare atmosferică.

7. Procedeu, conform revendicării 5. caracterizat prin aceea că treapta de îndepărtare (d) este realizată prin distilare în vid.

8. Procedeu, conform revendicării 5, caracterizat prin aceea că esterul alchilic este acetatul de metil, acetatul de etil, acetatul de izopropil, acetatul de n-butii, formiatul de izopropil sau amestecuri ale acestora.

9. Procedeu, conform revendicării 5, caracterizat prin aceea că alcoolul împie2-i dtcal este alcool izopropilic. alcool buntic secundar, alcool butilic terțiar sau amestecuri ale acestora.

i0. Procedeu, conlorm revendicării

5. caracterizai prin aceea că treapta de viipinic ie t este teaiizata in absența a ui tării.

1 1. Procedeu, conform revendicării 4 sau 5. caracterizat, prin aceea că treapta decuplare realizată sub agitare.

.— ?r>?iCuCt:. conlorm revendicării 1 1. caracterizat prin aceea ia agilarea este realizată cu ur agilator mecanic.

ie. Procedeu, conlorm revendicării

12. caracterizat prin aceea că agitatorul mecanic este acționat cu mai outin de

X circa 40 tur/min.

14. Procedeu, conform revendicării

12. caracterizat prin aceea ca agitatorul mecanic este acționat periodic în tot timpul reacției.

15. Procedeu, conform revendicării

11. caracterizat prin aceea că agitarea este realizată cu: (z?) agitare puternică cu circa 1/2 h după adăugarea L-fenilalaninei și (b) agitare lentă sau intermitentă după adăugarea L-fenilalaninei.

16. Procedeu, conform revendicării

15. caracterizat prin aceea că agitarea este realizată cu un agitator mecanic și: (a) agitarea puternică este realizată la o viteză de rotație de circa 60 tur/min. (b) agitarea lentă este realizată la o viteză de rotație a agitatorului de circa 20 tur/min si (c) agitarea intermitentă este realizată prin acționarea agitatorului cel puțin o dată la fiecare 15 min, timp de cei puțin 1 min.

17. Procedeu, conform revendicării
3, caracterizat prin aceea că treapta de cuplare (b) este realizată la o temperatură de circa 5 până la 40°C, pentru a obține izomerii a. jS-N-formil-L-aspartil-L-fenilalanină; treapta de deformilare (c) este realizată în prezență de metanol și treapta (d) este realizată prin distilarea în vid a excesului de acid acetic, acid formic, acetat de metil și formiat de metil din amestecul de reacție.

18. Procedeu, conform revendicării

17. caracterizat prin aceea ca metanolul este adăugat la reacție în timpul trepte: de distilare în vid (J),în cantități eficiente pentru a înlesni îndepărtarea acidului acetic și acidului formic prin formarea 5 esterilor de metil corespunzători.

19. Procedeu, conform revendicării

18. caracterizat prin aceea că treapta, de cuplare (/?) este realizată sub agitare, cu un agilator mecanic la viteze de rotație mai mici decât circa 30 tur/min.

20. Procedeu, conform revendicării 5. caracterizat prin aceea caclorhidratul de ester metilic al cr-! .-aspartil-ifenilaiamneieste neutralizat cu o bază pentru a se forma esîerul metilic al l.-asoartilL-fenilnlaninei.