PL167459B1 - Sposób wytwarzania mieszaniny a/^-N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalanlny - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzaniamieszaniny α/β -N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny nadrodze sprzęgania bezwodnika N-formylo-L-asparaginowego z L-fenyloalaniną w obecności kwasu octowego, znamienny tym, że reakcję sprzęgania prowadzi się w obecności estru alkilowego lub alkoholu z zawadą przestrzenną lub ich mieszaniny. 5. Sposób wytwarzaniamieszaninyα/β -N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny, na drodze reakcji bezwodnika N-formylo-L-asparaginowego z L-fenyloalaniną, w obecności kwasu octowego, znamienny tym, że mieszaninę reakcyjną miesza się w ciągu pierwszej godziny mieszadłem mechanicznym z prędkością 200-300 obrotów na minutę, po czym prędkość mieszadłaobniża się do poniżej 40 obrotów na minutę.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania mieszaniny α/β -N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny.

Związek ten jest stosowany do wytwarzania chlorowodorku estru metylowego α -L-aspartylo-L-fenyloalaniny, zwanego α-APM/HCl, który z kolei jest stosowany do wytwarzania estru metylowego α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny (α-APM) - środka słodzącego, który jest około 200 razy słodszy niż sacharoza. Siła słodząca tego dipeptydu umożliwia słodzenie produktów żywnościowych i napojów mniejszą jego ilością niż w przypadku słodzenia cukrem. W konsekwencji, umożliwia to milionom konsumentów zmniejszenie ilości pobranych kalorii bez zaprzestania spożywania słodyczy. Ponadto środek ten jest pozbawiony nieprzyjemnego posmaku, który mają inne środki słodzące, takie jak sacharyna i cyklaminian.

167 459

Sposób według wynalazku umożliwia zwiększenie stosunku izomerów α/β w końcowej mieszaninie i uzyskanie końcowej mieszaniny o lepkości umożliwiającej przelewanie.

α-APM nie jest nowym związkiem i znany jest z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 492 131. Od tego czasu zostały opublikowane liczne opisy patentowe dotyczące różnych sposobów tego wytwarzania i związków pokrewnych oraz obszerna literatura na temat wpływu, jaki wywarł ten dipeptyd na przemysł niskokalorycznych środków słodzących. Jednak do chwili obecnej sposoby wytwarzania obejmowały kosztowne procesy wydzielania i odzyskiwania, które w konsekwencji obarczały konsumenta.

Ester metylowy α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny jest dipeptydem złożonym zasadniczo z 2-aminokwasów, kwasu L-asparaginowego i L-fenyloalaniny. Wiadomo, że słodzące własności dipeptydu należą do stereochemii tych pojedynczych aminokwasów. Każdy z tych aminokwasów może występować w postaci D lub L i stwierdzono, że estry L-aspartylo-L-fenyloalaniny są słodkie, podczas gdy odpowiednie izomery D-D, D-L i L-D nie wykazują tej cechy. Kombinacje izomerów, które zawierają dipeptyd L-L, DL-aspartylo-L-fenyloalaninę, L-aspartylo-DL-fenyloalaninę i DL-aspartylo-DL-fenyloalaninę są słodkie, ale tylko w połowie tak słodkie jak izomer L-L, ponieważ racemat zawiera 1^ grup L-L. Dipeptyd wytwarza się przez reakcję sprzęgania, w której kwas L-asparaginowy łączy się z L-fenyloalaniną lub jej estrem metylowym. Taka reakcja sprzęgania wymaga obecności grup zabezpieczających grupy aminowe w kwasie asparaginowym, takich jak grupy formylowa, acetylowa, acetyloacetylowa, benzylowa, podstawiona i niepodstawiona karbobenzoksy, tert-butoksykarbonylowa i grupa soli halogenowodorkowej. Grupy zabezpieczające grupy aminowe często określa się w literaturze jako grupy N-zabezpieczające, a w sposobie według wynalazku środkiem blokującym jest grupa formylowa, stąd określa się ją jako N-formylową. Bezwodnik N-formylo-asparaginowy jest szeroko stosowanym związkiem wyjściowym np. w procesie opisanym w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 173 562.

Reakcję sprzęgania prowadzi się w rozpuszczalniku i zwykle stanowi to etap w kilku opatentowanych sposobach wytwarzania estru metylowego α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny (α -APM); opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 3 962 207, 4 173 662 i opis patentowy EPO nr 127 411. Podczas reakcji sprzęgania dwóch aminokwasów powstają dwa izomery jako związki przejściowe o stechiometrii, która ostatecznie determinuje własności słodzące danej cząsteczki. Pożądanym produktemjest izomer a, który w wydzielonych frakcjach czystego α-APM ma 130-200 razy większą siłę słodzącą niż cukier. Frakcja izomeru β jednak nie wykazuje takiej właściwości.

Celem wynalazku jest ulepszenie sposobu sprzęgania, które prowadzi do niższych kosztów produkcji i zwiększa wydajność izomeru α, pożądanego produktu końcowego.

Izomery α i β APM są przedstawione, odpowiednio, wzorami 1 i 2.

Stwierdzono, że tworzenie się w reakcji sprzęgania izomerów α i β i ich stosunek zależą od rodzaju stosowanego do reakcji sprzęgania rozpuszczalnika, temperatury reakcji i jakości rozpuszczalników. Według opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 173 562 uzyskuje się stosunek izomerów α/β 75:25, gdy jako rozpuszczalnik stosuje się kwas octowy, a reakcję sprzęgania prowadzi się w 50°C. Stosunek molowy kwasu octowego do fenyloalaniny musi wynosić co najmniej 10:1. Gdy stosunek molowy kwasu octowego do L-fenyloalaniny zmniejsza się do 6:1, stosunek izomerów a/p znacznie spada do 69/31.

Sposobem według wynalazku można zwiększyć stosunek α/β do około 80/20, jeżeli stosowany jako rozpuszczalnik w reakcji sprzęgania kwas octowy częściowo zastąpi się estrem alkilowym, alkoholem z zawadą przestrzenną lub ich mieszaniną. Przez alkohol z zawadą przestrzenną należy rozumieć alkohol drugorzędowy lub trzeciorzędowy.

Problem związany ze stosowaniem tych rozpuszczalników polega na tym, że po 0,5-3 godzinach reakcji mieszanina reakcyjna zestala się i zasadniczo niemożliwe jest jej mieszanie lub usunięcie z reaktora. Z dwóch powodów niezbędny jest układ reakcyjny, który nadawałby się do mieszania. Po pierwsze mieszanie zapewnia skontaktowanie reagentów, dzięki czemu zachodzi całkowita reakcja. Po wtóre, rozpuszczalnik musi być później usunięty przez destylację.

167 459

Inny problem, który występuje w znanych sposobach polega na tym, że traci się 25% lub więcej α-APM, który pozostaje w roztworze reakcyjnym (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 173 562). Dalszy problem polega na tym, że w sposobie według tego opisu patentowego z mieszaniny reakcyjnej zawierającej kwas asparaginowy, duży nadmiar kwasu mrówkowego i bezwodnik octowy powstaje bezwodnik N-formylo-L-asparaginowy.

W pewnym momencie nadmiar kwasu mrówkowego musi być usunięty przez destylację i oddzielony od kwasu octowego, co podnosi koszt produktu końcowego.

Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 962 207 znany jest podobny proces, w którym chlorowodorek bezwodnika L-asparaginowego sprzęga się z estrem metylowym L-fenyloalaniny. W tym sposobie wymagana jest duża ilość estru metylowego L-fenyloalaniny, co podnosi koszt końcowego produktu. Po drugie, tworzy się znaczna ilość tripeptydów, które muszą być usunięte, a w związku z tym występuje konieczność zastosowania kosztownych i skomplikowanych technik rozdzielania. Niedogodności tych pozbawiony jest sposób według wynalazku.

Sposób według wynalazku wytwarzania mieszaniny α /β -N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny polega na sprzęganiu bezwodnika N-formylo-L-asparaginowego z L-fenyloalaniną w obecności kwasu octowego, przy czym nowość jego polega na tym, że reakcję sprzęgania prowadzi się w obecności estru alkilowego lub alkoholu z zawadą przestrzenną lub ich mieszaniny w celu zwiększenia stosunku α /β.

Jako ester alkilowy stosuje się korzystnie octan metylu, etylu lub ich mieszaniny, a jako alkohol z zawadą przestrzenną - izopropanol.

Najkorzystniej reakcję sprzęgania prowadzi się w obecności octanu metylu.

Ponadto korzystnie w środowisku reakcji znajduje się od około 1,2 do około 4,7 równoważników molowych octanu metylu na mol L-fenyloalaniny.

Wariant sposobu według wynalazku wytwarzania mieszaniny α/β -N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny, na drodze reakcji bezwodnika N-formylo-L-asparaginowego z L-fenyloalaniną, w obecności kwasu octowego polega na tym, że mieszaninę reakcyjną miesza się w ciągu pierwszej godziny mieszadłem mechanicznym z prędkością 2000-300 obrotów na minutę, po czym prędkość mieszadła obniża się do poniżej 40 obrotów na minutę.

W tym wariancie korzystnie reakcję prowadzi się w mieszaninie reakcyjnej, zawierającej dodatkowo ester alkilowy, alkohol z zawadą przestrzenną lub ich mieszaniny, które skutecznie zwiększają stosunek izomerów α/β, a najkorzystniej zawierają octan metylu.

Korzystnie reakcję prowadzi się tak, że po upływie pierwszej godziny reakcji prędkość mieszania obniża się do 0 obrotów na minutę.

Korzystnie stosuje się prędkość mieszadła około 20 obrotów na minutę.

Korzystnie, mieszadło uruchamia się okresowo z prędkością poniżej 40 obrotów na minutę. Ponadto, korzystną reakcję prowadzi się w temperaturze do około 60°C, a zwłaszcza w temperaturze około 30°C.

Nieoczekiwanym efektem w sposobie według wynalazku jest fakt, że podczas gdy zwykle w reakcji alkoholu z bezwodnikiem powstaje ester, to tu alkohol z zawadą przestrzenną nie reaguje z bezwodnikiem N-formylo-asparaginowym podczas przebiegu reakcji. Reakcję sprzęgania można prowadzić przy wyżej określonych warunkach bez mieszania, tak aby utrzymać niską lepkość mieszaniny reakcyjnej, co daje w rezultacie nadającą się do przelewania końcową mieszaninę reakcyjną.

L-fenyloalaninę sprzęga się z bezwodnikiem N-formylo-L-asparaginowym w równomol lowych ilościach, w obecności estru alkilowego lub alkoholu z zawadą przestrzenną lub ich odpowiednich mieszanin. Stwierdzono, że ester alkilowy i/lub alkohol z zawadą przestrzenną zwiększa stosunek α/β, gdy dodaje się je w ilości odpowiadającej co najmniej około 1,2 mola na mol L-fenyloalaniny. Stosunek α/β wzrasta ze wzrastającą ilością estru lub alkoholu do momentu, w którym molowa ilość estru, alkoholu lub ich kombinacji jest w przybliżeniu 4,7 razy większa niż ilość L-fenyloalaniny. W tym momencie osiąga się poziom nasycenia, w którym stosunek izomerów pozostaje stały, niezależnie od ilości dodawanego estru lub alkoholu.

Korzystnie ester alkilowy, stosowany w reakcji sprzęgania, jest wybrany z grupy obejmującej octan metylu, etylu, izopropylu, n-butylu i mrówczan izopropylu. Korzystny jest octan

167 459 metylu (meOAc). Alkohole z zawadą przestrzenną, które można stosować, obejmują alkohol izopropylowy i drugo lub trzeciorzędowy alkohol butylowy. Korzystny jest alkohol izopropylowy. Wymienione związki są korzystnymi środkami w sposobie według wynalazku i nie ograniczają możliwości stosowania innych estrów alkilowych lub alkoholi ani nie ograniczają zakresu wynalazku.

Reakcję sprzęgania prowadzi się przez mieszanie wyżej określonej mieszaniny w ciągu około 4-6 godzin w temperaturze pomiędzy około 5-60°C, korzystnie pomiędzy 15-30°C, tj. w temperaturze pokojowej. Problem, który powstaje podczas reakcji sprzęgania, polega na tym, że gdy zachodzi reakcja z wytworzeniem N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny, mieszanina lub zawiesina zaczyna zestalać się, tj. wzrasta jej lepkość do punktu, w którym mieszanie staje się wyjątkowo trudne, a nawet niemożliwe. Tak wysoka lepkość bardzo utrudnia sączenie i hamuje przeznaczenie ciepła, co powstrzymuje destylację kwasu octowego, estrów i/lub alkoholu z zawadą przestrzenną, opisanych poniżej. Obecność kwasu octowego do reakcji sprzęgania hamuje zestalanie tj. uzyskuje się obniżenie lepkości. Jest to istotne, ponieważ mieszanie zapewnia przebieg reakcji do końca, przy czym kwas i estry muszą być usunięte z mieszaniny przez destylację. Mieszanina musi nadawać się do mieszania, aby można było to przeprowadzić.

Ilość dodawanego kwasu octowego zależy od ilości zsyntetyzowanego bezwodnika N-formylo-L-asparaginowego. Ponieważ reakcję sprzęgania przeprowadza się in situ w produktach ubocznych, w środowisku znajduje się już pewna ilość kwasu octowego z początkowej reakcji pomiędzy kwasem L-asparaginowym i bezwodnikiem octowym. Całkowita ilość kwasu octowego w układzie powinna być około 7 razy większa od ilości L-fenyloalaniny w przeliczeniu mol/mol. A zatem ilość dodawanego kwasu octowego nie musi być 7-krotną ilością L-fenyloalaniny. Wystarczająca jest mniejsza ilość, byleby całkowita ilość kwasu octowego w układzie była około 7-krotnie większą od ilości L-fenyloalaniny.

Aczkolwiek reakcję sprzęgania można prowadzić w temperaturze otoczenia, korzystna jednak jest podwyższona temperatura, która także przyczynia się do obniżenia lepkości mieszaniny reakcyjnej. Dogodnie stosuje się temperatury pomiędzy 25°C-40°C, korzystnie około 30°C.

Nieoczekiwany efekt uzyskiwany w drugim wariancie sposobu według wynalazku polega na obniżeniu lepkości mieszaniny reakcyjnej podczas reakcji sprzęgania przez kontrolowane mieszanie mieszaniny. Stwierdzono, że zatrzymanie mieszadła lub zmniejszenie jego prędkości podczas reakcji sprzęgania istotnie obniża lepkość mieszaniny reakcyjnej. W dużym reaktorze (reaktor o średnicy 3 m zaopatrzony w mieszadło mechaniczne o długości łopatek 1,5 m) bardzo powolne mieszanie, takie jak 5-40 obrotów na minutę i okresowe mieszanie, takie jak krótko pracujące mieszadło co 5-15 minut, drastycznie zmniejsza lepkość mieszaniny reakcyjnej w porównaniu z reakcją prowadzoną przy szybkości mieszanin około 60 obrotów na minutę lub większej. W reaktorach w skali laboratoryjnej (kolba okrągłodenna o średnicy 10 cm z łopatkami o długości 7,6 cm) mieszanie z szybkością 200-300 obrotów na minutę powoduje duże zagęszczenie mieszaniny reakcyjnej, podczas gdy przy 5-15 obrotach na minutę uzyskuje się mieszaninę reakcyjną o niskiej lepkości i bardzo łatwo przelewalną. Także wyłączenie mieszadła po około 1 godzinie po dodaniu do mieszaniny reakcyjnej L-Pha i ponowne włączenie po reakcji, tj. po około 6 godzinach, prowadzi do mieszaniny reakcyjnej o niskiej lepkości. Jednakże, podczas procesu w skali handlowej, gdy mieszadło zatrzyma się na ponad 1 godzinę, ponowne jego uruchomienie może być bardzo trudne z powodu zestalania się i zbrylenia wytrąconego osadu. Zatem powolne mieszanie i okresowe mieszanie są korzystne.

Stosowane określenie nadająca się do przelewania lub o niskiej lepkości w odniesieniu do mieszaniny reakcyjnej oznacza ciecz, którą można przelać do szklanej kolby lub reaktora. Takie ciecze zwykle mają lepkość do około 15 000 korzystnie pomiędzy 1000-10000, a szczególnie pomiędzy 150-500 m Pa-s.

Sposób mieszania w sposobie według wynalazku nie jest krytyczny. Można stosować standardowe środki do mieszania, tj. wstrzykiwanie gazu obojętnego, wytrząsanie, reaktor w postaci bębna, mieszadła mechaniczne itd. Korzystne są mieszadła mechaniczne. Dokładna konfiguracja mieszadła także nie jest krytyczna. Dla mieszadeł łopatkowych szybkość mieszania korzystnie ustala się od około 5 do około 40 obrotów na minutę, a zwłaszcza około 20 obrotów na minutę. Ponieważ szybkość końca łopatki w m/sek. zmienia się przy ustalonej liczbie obrotów

167 459 na minutę w zależności od długości łopatki, stwierdzono, że bardziej dokładnie określa się tę szybkość podając liczbę obrotów na minutę. W celu zmniejszenia lepkości mieszaniny reakcyjnej dopuszcza się dowolną szybkość mieszadła do około 40 obrotów na minutę. Jednak należy zauważyć, że w urządzeniu w skali laboratoryjnej (kolba o średnicy 10 cm) mieszaninę o dobrej przelewalności uzyskuje się przy szybkości mieszania pomiędzy 40-150 obrotów na minutę.

Izomery α i β N-formylo-a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny (α/β F-AP) wytworzone powyższym sposobem według wynalazku można analizować metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), która wykazuje, że uzyskuje się niezwykle wysoki stosunek α/β, w przeliczeniu 79,5:20,5.

Kwas octowy i estry (octan metylu, mrówczan izopropylu itd.) lub alkohol z zawadą przestrzenną ewentualnie usuwa się z mieszaniny reakcyjnej. Korzystnie kwas octowy i estry oddestylowuje się pod próżnią przy ciśnieniu od około 381 mm Hg do około 635 mm Hg (507,95· 10²Pa - 846,59· 10²Pa) Hg. Destylację próżniową prowadzi się przed dodaniem HCl stosowanego do odformylowania α/β F-AP. Kwas octowy, estry i/lub alkohol usuwa się i zawraca do stosowania w następnych reakcjach sprzęgania.

Następujące przykłady ilustrują sposób według wynalazku, nie ograniczając jego zakresu.

Przykład I. 0,12g (0,003 mola) tlenku magnezu, stanowiącego katalizator, rozpuszczono w 16 ml (0,405 mola) 95% kwasu mrówkowego. Następnie do wytworzonego roztworu, który ogrzewano do 35^O- 40°C pzzez 10-15 minut 60,2 m 1 bezwodnika octowego, po czym dodano 39,93g (0,3 mola) kwasu L-asparaginowego i mieszano przez 2,5 godziny w 50 ± 2°C. W tym momencie dodano jeszcze 8,6 ml bezwodnika octowego i reakcję prowadzono przez dalsze 2,5 godziny w 50 ± 2°C. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano 9,2 ml (0,120 mola) alkoholu izopropylowego i ogrzewano przez dalsze 2 godziny. Wysokosprawna analiza chromatograficzna (HPLC) wykazała utworzenie się bezwodnika N-formyloasparaginowego.

Mieszaninę z bezwodnikiem N-formyloasparaginowym następnie oziębiono do temperatury pokojowej, 20-25°C i dodano 150 ml (1,89 mola) octanu metylu, a następnie 44,6g (0,27 mola) L-fenyloalaniny. Mieszaninę mieszano przez 3 godziny w pokojowej temperaturze (20-30°C). Po 3 godzinach mieszania pozostawiono mieszaninę do odstania na noc (18-24 godziny) w pokojowej temperaturze i zestalenia się.

Zestalony produkt rozpuszczono w roztworze metanolu i wody (9:1). Wytworzoną mieszaninę izomerów α i β N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny poddano analizie HPLC i stwierdzono, że stosunek izomerów α/β wynosi 79,2:20,8.

Przykład II. Porównywano stosunki α/β N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny wytworzonej w reakcji sprzęgania in situ, uzyskanej przy stosowaniu różnych estrów/alkoholi jako korozpuszczalników.

0,121 g (0,003 mola) tlenku magnezu rozpuszczono w 16,4 ml (0,406 mola) 93,4% kwasu mrówkowego, w atmosferze azotu. Następnie podczas mieszania dodano 62,5 ml (0,655 mola) bezwodnika octowego powodując utworzenie się białego osadu. W ciągu dalszych 30 minut temperatura mieszaniny wzrosła do 37-38°C. Dodano 39,93g (0,30 mola) kwasu L-asparaginowego i ogrzewano mieszaninę do 48-50°C przez 2,5 godziny. Następnie dodano dodatkowo 8,6 ml (0,09 mola) bezwodnika octowego i ogrzewano przez dalsze 2,5 godziny, po czym dodano

9,2 ml (0,120 mola) alkoholu izopropylowego i ogrzewano w 50 ± 2°C przez następne 2 godziny. Następnie mieszaninę reakcyjną oziębiono do temperatury pokojowej (22-27°C).

Wytwarzanie bezwodnika N-formylo-L-asparaginowego powtórzono kilka razy w celu przygotowania kilku pierwszych mieszanin areakcyjnych. Do każdej z tych pierwszych mieszanin dodano 100 ml jednego z estrów alkilowych lub alkoholi z zawadą przestrzenną, zestawionych w tabeli 1, a następnie dodano 44,6g (0,27 mola) L-fenyloalaniny. Wytworzone zawiesiny utrzymywano w temperaturze pokojowej przez 5 godzin do zakończenia procesu sprzęgania in situ. W każdej reakcji, w miarę jej postępu, zawiesina coraz bardziej zestalała się i dodawano pewną ilość roztworu metanolu i wody (10:1) w celu rozpuszczenia całej substancji stałej. 2,0g próbki każdej mieszaniny reakcyjnej poddawano analizie HPLC. Stosunki α/β N-formylo-Laspartylo-L-fenyloalaniny uzyskane w każdej reakcji przedstawione są w tabeli 1.

167 459

Tabela 1

Rozpuszczalnik	Stosunek α/β
Octan metylu	79:21
Octan etylu	79:21
Octan izopropylu	80:20
Octan n-butylu	78:22
Mrówczan metylu	75,,5:24,5
Mrówczan izopropylu	78:22
Alkohol izopropylowy	78:22
Alkohol sek-butylowy	76:24
Alkohol tert-butylowy	78:22
Nie dodawano rozpuszczalnika	71 :229

Przykład III. Sposobem według przykładu I wytworzono znów bezwodnik N-formyloasparaginowy. W początkowej mieszaninie reakcyjnej, która ma być poddana reakcji sprzęgania in situ z fenyloalaniną, pozostał bezwodnik asparaginowy. Do mieszaniny reakcyjnej dodano 100 ml octanu metylu, 44,6 (0,27 mola) L-fenyloalaniny i 85 ml (1,47 mola) kwasu octowego. Całkowita ilość kwasu octowego w mieszaninie reakcyjnej wynosiła 166,4 ml (2,912 moli), ponieważ pewna ilość kwasu już znajdowała się w mieszaninie jako produkt uboczny reakcji wytwarzania bezwodnika N-formyloasparaginowego, gdy bezwodnik octowy reagował z kwasem L-asparaginowym.

Mieszaninę reakcyjną podczas sprzęgania mieszano w temperaturze pokojowej (20-25°C) przez około 6 godzin. Mieszanina ta nie zestaliła się po zakończeniu reakcji sprzęgania. Produkt poddano analizie HPLC, która wykazała stosunek izomerów a/p 79,5:20,5.

Przykład IV. Sposobem według przykładu I wytworzono bezwodnik N-formyloasparaginowy (F-Asp-O) i pozostawiono go w początkowej mieszaninie reakcyjnej. Następnie prowadzono reakcję sprzęgania in situ dodając 44,6g (0,27 mola) L-fenyloalaniny, 1O6,89g (1,26 mola) octanu metylu i taką ilość kwasu octowego, aby całkowita ilość kwasu w układzie wynosiła 2,91 mola (patrz przykład III).

Reakcję sprzęgania prowadzi się mieszając mieszaninę reakcyjną przez około 6 godzin w temperaturze pokojowej (20 - 55°C). Miesaaniaa nie eestaliła się oo aakońzeeniu reakcji sprzęgania. Uzyskano stosunek izomerów a/p 79,5:20,5.

W tabeli 2 przestawiono wyniki w zakresie stosunków α/β, jakie uzyskano stosując różne stężenia octanu metylu i kwasu octowego (HOAc) wprowadzane do reakcji sprzęgania. Ilości bezwodnika N-formyloasparaginowego i L-fenyloalaniny były stałe i wynosiły 0,27 mola każdego ze związków. Temperatury i czasy reakcji były także stałe. Odpowiednie stężenia octanu metylu i kwasu octowego w każdej reakcji podano w molach rozpuszczalnika na mol L-fenyloalaniny. Odpowiednie stosunki α/β uzyskane z każdej mieszaniny przedstawiono, aby potwierdzić, że sposobem według wynalazku zawsze uzyskuje się wysoki stosunek izomerów α/β.

Tabela 2.

Stosunki α/β uzyskane przy różnych stężeniach HOAc i MeOAc w reakcji sprzęgania L-Phe i F-Asp-O

Doświadczenie nr	Stężenie mole/mole L-Phe	Stosunek α/β
MeOAc	HOAc
1	2	3	4
1	4,65	0,00	80,0/20,0
2	4,65	5,34	78,6/21,4
3	7,00	5,34	79,2/20,8
4	4,60	10,79	79,5/20,5
5	3,49	10,79	79,2/20,8

167 459

Tabela 2 (ciąg dalszy)

1	2	3	4
6	2,33	10,79	77,9/22,1
7	1,17	10,79	77,1/22,9
8	2,94	9,00	77,4/22,6
9	3,50	9,00	78,0/22,0
10	2,28	7,00	77,15/22,85
11	1,17	8,58	76,3/23,7
12	2,61	7,67	77,8/22,2
13	0,00	5,34	69,0/31,0
14	0,00	10,50	74,0/26,0

Przykład V. Aczkolwiek zaleca się, aby ilość kwasu octowego w reakcji sprzęgania stanowiła 7-krotną ilość L-fenyloalaniny, wykazano, że nawet mniejsza ilość działa jako katalizator. 31,0g (0,217 mola) bezwodnika N-formyloasparaginowego, wytworzonego sposobem według przykładu Π, zmieszano ze 180 ml octanu metylu i 25,8 ml (0,45 mola) kwasu octowego, w atmosferze azotu. Następnie dodano 33,Og (0,20 mola) L-fenyloalaniny i mieszaninę mieszano w około 25°C. Po 3,5 godzinach dodano jeszcze 100 ml octanu metylu aby zapobiec zestaleniu i powtórzono to po 4,5 godzinach. Po 6 godzinach zawiesinę reakcyjną rozpuszczono w wystarczającej ilości metanolu i wody (10:1). Roztwór poddano analizie HPLC i uzyskano stosunek izomerów α/β 80:20.

Przykład VI. Do 60,2 ml (0,631 mola) bezwodnika octowego w ciągu 5 minut wkraplano 16 ml (0,405 mola) 95,7% kwasu mrówkowego, w tym czasie temperatura wzrosła do 40°C. Mieszaninę mieszano przez 55 minut i dodano 0,43g (0,003 mola) octanu magnezu i 39,93g (0,3 mola) kwasu L-asparaginowego. Wytworzoną zawiesinę ogrzewano w 47-48°C przez 2,5 godziny. Dodano 7,1 ml (0,0744 mola) bezwodnika octowego i ogrzewano dalej przez

2.5 godziny). Dodano 7,2 lg (0,120 mola) alkoholu izopropylowego i ogrzewano przez dalsze

1.5 godziny. Przerwano ogrzewanie i dodano 130 ml kwasu octowego i 44,6g (0,270 mola) L-fenyloalaniny. Mieszaninę mieszano w temperaturze otoczenia przez całą noc. Wytworzoną zawiesinę rozpuszczono w 750 ml wody i 1,051 metanolu i zważono. Pobrano próbkę i poddano analizie HPLC na zawartość α/β -N-formyło-L-aspartylo-L-fenyloalaniny. Oznaczona wydajność izomeru α wynosiła 71,5%.

Przykład VII. Sposobem według przykładu I przygotowano różne zawiesiny bezwodnika N-formylo-L-asparaginowego (F-Asp=O) i umieszczono w 500 ml kolbach okrągłodennych wyposażonych w mieszadło mechaniczne Talboys model 134-2. Do mieszanin tych dodano octanu metylu (MeOAc), kwasu octowego (HOAc) i L-fenyloalaniny (Phe) w ilościach, przy których stosunek molowy MeOAc/HOAc/całkowity/ /Phe/F-Asp=O wynosił 2,73/10,64/1,0/1,0. Mieszaniny reakcyjne mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny z szybkością mieszadła 200-300 obrotów na minutę. Po 1 godzinie temperatura wzrosła do 40°C i obroty mieszadła zmniejszono do 5-15 na minutę. Zasadniczo całkowita konwersja Phe nastąpiła w ciągu 3 godzin. Za pomocą wiskozymetru Brookfielda LV zmierzono lepkość w temperaturze pokojowej po 6 godzinach reakcji, włączając w to 1,5-2,0 godzin reakcji kończącej się w temperaturze 50-55°C. Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 3

Szybkość mieszadła po 1-szej godz. /obr/min/	Temperatura po 1-szej godz.	Lepkość w cp /obr./min.-wrzeciono 2
6X	12*	30x	60x
200-300 /próba kontrolna/	pokojowa	2860	1587	819	483
5- 15	25°C	1225	937	490	301
5-15	40°C	690	485	287	170

* obr./min. wrzeciona

167 459

Przykład VIII. Postępowano zasadniczo sposobem według przykładu I, z tą różnicą, że po 1-szej godzinie reakcji w ogóle nie mieszano mieszaniny reakcyjnej. Po 6 godzinach mieszaninę można byłoby mieszać, jednak rozpoczęcie mieszanin wymagało pomocy. Gdy rozpoczęto mieszanie mieszanina reakcyjna była bardzo płynna i nadająca się do przelewania i o wiele mniej lepka niż mieszanina mieszana przez cale 6 godzin z prędkością 200-300 obrotów na minutę. Analiza mieszaniny reakcyjnej wykazała całkowitą konwersję Phe.

Przykład IX. Postępowano zasadniczo sposobem według przykładu I, z tą różnicą, że mieszaninę reakcyjną krótko mieszano, tj. przez 12 sekund, z małą prędkością, co 5-15 minut po 45 minutach reakcji. Przez 1-szą godzinę mieszaninę reakcyjną mieszano z prędkością 200-300 obrotów na minutę. Pod koniec reakcji mieszanina była cieczą nadającą się do przelewania. Analiza mieszaniny reakcyjnej wykazała całkowitą konwersję Phe.

Przykład X. Sposobem według przykładu I wytworzono zawiesinę bezwodnika N-formylo-L-asparaginowego (F-Asp=O) i umieszczono w 500 ml okrągłodennej kolbie wyposażonej w mieszadło mechaniczne Talboya model 134-2. Do mieszaniny dodano MeOAc, HOAc i Phe w ilościach, przy których molowy stosunek MeOAc/HOAc/całkowity/ /Phe/F-Asp=O wynosił 2,73/7,84/1,0/1,0. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny z prędkością mieszadła 200-300 obrotów na minutę. Pod koniec 1 godziny prędkość mieszadła zmniejszono do 5-15 obrotów na minutę. Całkowita konwersja Phe zaszła w ciągu około 5 godzin. Przeprowadzono także 2 próby kontrolne, w których w ciągu 6 godzin mieszano z prędkością 200-300 obrotów na minutę. Za pomocą wiskozymetru Brookfielda LV zmierzono lepkość w temperaturze pokojowej po 6 godzinach reakcji wliczając w to 1,5-2,0 godzin reakcji kończącej się w temperaturze 50-55°C. Wyniki przedstawione są w tabeli 4.

Tabela 4

Szybkość mieszadła	Lepkość w cp /obr./min. wrzeciono 4/
12x	30x	60x
Po 1-szej godzinie 200-300 obr./min.
/próba kontrolna/	9,100	6,740	5,110
200-300 obr./min.
/próba kontrolna/	12,000	8,000	6,000
5-15 obr./min.	6,850	3,740	2,410

^xobr./min. wrzeciona

Przykład XI. Postępowano zasadniczo sposobem wedługprzykładul z tą różnicą, że temperaturę mieszaniny reakcyjnej podniesiono do 40°C, gdy zmniejszono szybkość mieszadła do 5-15 obrotów na minutę. Wytworzona mieszanina reakcyjna nadawała się do przelewania i była dużo mniej lepka niż w próbach kontrolnych, które były mieszane z prędkością 200-300 obrotów na minutę. Analiza wykazała całkowitą konwersję Phe.

CO2CH3

I

CCNH-C-H I I

H2N-C-H ch₂-o ch₂ co₂h

WZÓR 1

CO₂H

H₂N-C-H CO₂CH3 ch₂conh-c-h

I ch₂o

WZÓR 2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,50 zł

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania mieszaniny α/β -N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny na drodze sprzęgania bezwodnika N-formylo-L-asparaginowego z L-fenyloalaniną w obecności kwasu octowego, znamienny tym, że reakcję sprzęgania prowadzi się w obecności estru alkilowego lub alkoholu z zawadą przestrzenną lub ich mieszaniny.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako ester alkilowy stosuje się octan metylu, etylu lub ich mieszaniny, a jako alkohol z zawadą przestrzenną - izopropanol.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję sprzęgania prowadzi się w obecności octanu metylu.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w środowisku reakcji zawierającym od około 1,2 do około 4,7 równoważników molowych octanu metylu na mol L-fenyloalaniny.
5. 5. Sposób wytwarzania mieszaniny α/β -N-formylo-L-aspartylo-L-fenyloalaniny, na drodze reakcji bezwodnika N-formylo-L-asparaginowego z L-fenyloalaniną, w obecności kwasu octowego, znamienny tym, że mieszaninę reakcyjną miesza się w ciągu pierwszej godziny mieszadłem mechanicznym z prędkością 200-300 obrotów na minutę, po czym prędkość mieszadła obniża się do poniżej 40 obrotów na minutę.
6. 6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w mieszaninie reakcyjnej, zawierającej dodatkowo ester alkilowy lub alkohol z zawadą przestrzenną lub ich mieszaniny.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako ester alkilowy stosuje się octan metylu.
8. 8. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że po upływie pierwszej godziny reakcji prędkość mieszadła obniża się do 0 obrotów na minutę.
9. 9. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się prędkość mieszadła około 20 obrotów na minutę.
10. 10. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że mieszadło uruchamia się okresowo z prędkością poniżej 40 obrotów na minutę.
11. 11. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w temperaturze do około 60°C.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w temperaturze około 30°C.