CZ283058B6 - Jednonádobový způsob přípravy hydrochloridu methylesteru alfa-L asparagyl-L-fenylalaninu - Google Patents

Abstract

Jednonádobový způsob přípravy hydrochloridu methylesteru a -L-asparagyl-L-fenylalaninu, který je meziproduktem pro přípravu aspartamu.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu jednonádobové přípravy hydrochloridu methylesteru a-L-asparagyl-Lfenylalaninu, α-APM/HCl, kterého se používá k přípravě methylesteru a-L-asparagyl-L-fenylalaninu, α-APM, což je sladidlo přibližně 200 krát sladší než cukr. Charakteristiky tohoto dipeptidu umožňují sladit potraviny a nápoje za použití mnohem menšího množství sladidla, než v případě cukru. Tento dipeptid tedy usnadňuje milionům spotřebitelů snížit příjem kalorií, aniž by se museli zříci sladkých pokrmů. Toto sladidlo také nemá nepříjemné doznívání chuti, které je spojeno se sacharinem a s cyklamáty. Vynález se týká také zvýšení poměru hydrochloridu methylesteru a-L-asparagyl-L-fenylalaninu, α-APM/HCl a způsobu výroby konečné směsi α,βAPM/HC1, která má viskozitu vhodnou k lití.

Dosavadní stav techniky α-APM není nový a je popsán v americkém patentovém spise číslo 3 492131 (Schlatter, 1970). Rovněž byly uděleny četné další patenty, týkající se různých způsobů jeho výroby a výroby příbuzných sloučenin a existuje četná literatura o dipeptidech a jejich využití v průmyslu nízkokalorických sladidel. Až dosud však způsoby přípravy zahrnovaly nákladné procesy izolace a získání produktu, což je samozřejmě na účet spotřebitelů. Vynález se naproti tomu týká způsobu výroby, který má srovnatelný výtěžek konečného žádaného produktu, nevyžaduje však izolaci meziproduktů, což bylo až dosud podle známého stavu techniky nutné.

α-L-asparagyl-L-fenylalaninmethylester je dipeptid, složený v podstatě ze dvou aminokyselin, z kyseliny L-asparagové a z L-fenylalaninu. Již určitou dobu je známo, že sladící charakteristiky dipeptidu jsou závislé na stereochemii jednotlivých aminokyselin. Každá z uvedených aminokyselin může být buď vD formě nebo vL formě a zjistilo se, že estery L-asparagyl-L-fenylalaninu jsou sladké, zatímco odpovídající D-D, D-L aL-D isomery nejsou sladké. Směsi isomerů, které obsahují L-L dipeptid, DL-asparagyl-L-fenylalanin, L-asparagyí-DL-fenylalanin a DL-asparagyl-DL-fenylalanin jsou sladké, avšak jen polovičně sladké, jelikož racemát obsahuje 1/2 L-L podílu.

Dipeptid se připravuje kopulační reakcí, při které kyselina L-asparagová se spojuje s Lfenylalaninem nebo sjeho methylesterem. Při této kopulační reakci je třeba chránit aminoskupinu, vázanou na podíl kyseliny asparagové; takovými chránícími skupinami je skupina formylová, acetylová, acetoacetylová, benzylová, substituovaná nebo nesubstituovaná karbobenzoxyskupina, t-butoxykarbonylová skupina a hydrohalogenidová sůl. Skupina, chránící aminoskupinu, se často v oboru označuje jako N-chránicí skupina a pro účely tohoto vynálezu se bude označovat jako N-formylová skupina, jelikož se formylového podílu používá podle vynálezu jako blokovacího činidla. Anhydrid N-formylasparagové kyseliny je široce používanou výchozí látkou a způsob jeho výroby je dostatečně popsán. Viz například americký patentový spis číslo 4 173562.

Kopulační reakce se provádí v rozpouštědle a je běžným stupněm četných patentově chráněných postupů výroby methylesteru a-L-asparagyl-L-fenylalaninu (α-APM); viz americký patentový spis číslo 3 962207 (Uchiyama), číslo 4 173562 (Bachman) a evropský patentový spis číslo 127411 (Yaichi a kol). V průběhu kopulační reakce dvou aminokyselin se vytvářejí dva isomery jakožto meziprodukty a jejich stereochemie konečně určuje sladkost příslušné molekuly. Isomer a je žádaným produktem, jelikož izolované frakce čistého α-APM mají sladkost přibližně 130 až

- 1 CZ 283058 B6

200 krát větší než cukr. Isomer β nemá však žádnou sladkost.

Vynález se týká zlepšeného způsobu přípravy α-APM, kteiý vede ke snížení nákladů výrobních za současného zvýšení výtěžků isomerů a, který je žádaným konečným produktem.

Isomery a a β APM mají následující vzorce:

Isomer a

CO₂H

Isomer β

CO₂H

I

H₂N—C—H CO₂CH₃

Zjistilo se, že vytváření isomerů a a β ajejich poměry závisejí na kopulační reakci, na rozpouštědle, používaném při reakci, na teplotě, za které reakce probíhá, a na množství použitého rozpouštědla. Podle amerického patentového spisu číslo 4 173562 (Bachman) poměr a a β 75 : 25 je dosažitelný, jestliže se použije jako rozpouštědla kyseliny octové při kopulační reakci, prováděné při teplotě 50 °C. Molámí poměr kyseliny octové k fenylalaninu musí být alespoň 10:1. Poměr isomerů a a β klesá závažně k 69:31, jestliže se molámí poměr kyseliny octové k Lfenylalaninu sníží na 6 : 1. Způsob podle vynálezu dokládá, že poměr a a β se může zvýšit přibližně na 80 : 20, jestliže se kyselina octová, používaná jako rozpouštědlo při kopulační reakci, nahradí částečně alkylesterem, bráněným alkoholem nebo jejich směsí. Bráněným alkoholem se zde míní sekundární nebo terciární alkohol.

Problémem, který zůstává při použití těchto rozpouštědel, je skutečnost, že po 0,5 až 3 hodinové reakční době reakční směs tuhne a stává se obtížně míchatelnou, koncentrovatelnou a deformylovatelnou, nebo prostě odstranitelnou z reaktoru. Míchatelnost systému je nutná alespoň ze dvou důvodů. Především míchání zajišťuje promísitelnost reakčních složek k dosažení dokonalého zreagování. Kromě toho se rozpouštědlo musí odstraňovat později destilací.

Jiným problémem, známým ze stavu techniky, je, že při některých způsobech se 25 % nebo i více procent α-APM ztrácí, jelikož zůstává v původním reakčním roztoku; viz americký patentový spis číslo 4 173562. Dalším problémem podle amerického patentového spisu číslo 4 173562 je, že se anhydrid N-formyl-L-asparagové kyseliny připravuje reakcí směsi asparagové kyseliny, velkého nadbytku kyseliny mravenčí a acetanhydridu. Nadbytek kyseliny mravenčí se musí v určité chvíli odstranit destilací a musí se oddělit od kyseliny octové, čímž se náklady na konečný produkt zvyšují.

Americký patentový spis číslo 3 962207 popisuje podobný způsob, při kterém se anhydrid chloridu kyseliny L-asparagové kopuluje s L-fenylalaninmethylesterem. Problémem při tomto procesu je potřeba velkého množství L-fenylalaninmethylesteru, který zvyšuje výrobní náklady. Kromě toho vede k vytváření významných množství tripeptidů, které se musí odstraňovat, což vyžaduje nákladné a pracné separační způsoby. Tento nedostatek při způsobu podle vynálezu odpadá.

-2CZ 283058 B6

Vynález je zaměřen na způsob výroby methylesterhydrochloridu a-L-asparagyl-L-fenylalaninu (α-APM (HC1)) jednonádobovým způsobem, přičemž reakční vedlejší produkty, vytvářené v průběhu přípravy anhydridu N-formylované L-asparagové kyseliny, se používají jakožto rozpouštědlo při kopulační reakci způsobem, který řeší mnohé separační problémy, čímž se snižují výrobní náklady. Zřeďováním kopulační reakční směsi esterem nebo bráněným alkoholem se zlepšuje výtěžek hydrochloridu methylesteru a-L-asparagyl-L-fenylalaninu.

Anhydrid N-formyl-L-asparagové kyseliny se připravuje nejdříve uváděním do styku kyseliny asparagové s acetanhydridem a s kyselinou mravenčí v podobném reakční procesu, jaký je znám ze stavu techniky; viz americké patentové spisy číslo 3 933781, 3 962207 a 4 1 73562. Při způsobu podle vynálezu se však používá minimálního množství kyseliny mravenčí (1,33 až 1,35 molámích ekvivalentů na mol asparagové kyseliny) a její nadbytek se převádí na isopropylformiát přísadou acetanhydridu a isopropylalkoholu.

Formylovaný anhydrid kyseliny asparagové se pak může kopulovat in šitu přidáním Lfenylalaninu (L-Phe). Do kopulační reakce se popřípadě přidává alkylester nebo bráněný alkohol, čímž se překvapivě zlepšuje poměr a a β. Zatímco se ester zpravidla připravuje reakcí alkoholu s anhydridem, nebylo možno očekávat, že bráněný alkohol nebude napadat anhydrid N-formylasparagové kyseliny v průběhu reakce. Kyselina octová se rovněž přidává jakožto reakční rozpouštědlo. Tato kopulační reakce se může provádět za mírného míchání nebo bez míchání k udržení nízké viskozity reakční směsi, což vede ke konečné reakční směsi, kterou je možno lít.

Získaný dipeptid se pak koncentruje destilací a deformyluje se chlorovodíkovou kyselinou a esterifikuje se nastavením koncentrace methanolu, vody a chlorovodíkové kyseliny na efektivní množství pro výrobu a-APM(HCl) ve vysokém výtěžku. a-APM(HCl) se z reakční směsi vysráží, izoluje se a neutralizuje se zásadou za vzniku a-APM.

a-APM(HCl) se tedy podle vynálezu připravuje zlepšeným způsobem. Jednonádobový způsob podle vynálezu začíná mícháním kyseliny L-asparagové s minimálním množstvím kyseliny mravenčí (alespoň 1,2 molámí ekvivalenty, vztaženo na kyselinu asparagovou) a s acetanhydridem (alespoň přibližně 2,0 molámí ekvivalenty, vztaženo na kyselinu asparagovou) v přítomnosti katalyzátoru, jako je oxid hořečnatý; získá se anhydrid N-formylasparagové kyseliny. Jakožto vhodné katalyzátory se dále uvádějí oxidy, hydroxidy a soli kovů, uvedené v amerických patentových spisech číslo 4 508912 a 4 550180. Reakce se provádí při teplotě až do přibližně 52 °C. Směs se s výhodou míchá při teplotě přibližně 50 °C po dobu alespoň 2,5 hodin. Další kyselina octová (přibližně 0,2 mol) se přidává po přibližně 2,5 hodinách k převedení jakéhokoliv nadbytku nezreagované kyseliny mravenčí na mravenčanooctový anhydrid, to je na směsný anhydrid. Po dalších 2,5 hodinách se přidá nadbytek isopropylalkoholu (alespoň 0,3 molámích ekvivalentů, vztaženo na celkové množství přidané kyseliny mravenčí) k převedení směsného anhydridu kyseliny mravenčí a kyseliny octové na isopropylformiát. Množství použité kyseliny mravenčí je s výhodou 1,3 až 1,35 molámích ekvivalentů, vztaženo na kyselinu asparagovou.

Nebo se acetanhydrid může přidávat najednou do reakční směsi (2,3 až 2,9 mol na mol kyseliny asparagové) na začátku reakce a pak se přidá sekundární alkohol ke spotřebování nadbytku kyseliny mravenčí reakcí se směsným anhydridem, čímž se vytvoří odpovídající ester. Může se také přidávat menší množství acetanhydridu se sekundárním alkoholem v jediném stupni. S výhodou se však kyselina mravenčí, menší množství acetanhydridu a katalyzátor mísí po dobu 2 až 3 hodin, načež se přidá menší množství acetanhydridu. Reakční směs se pak dále míchá po dobu dalších 2 až 3 hodin, načež se do reakční směsi přidá sekundární alkohol (isopropanol). Konečná reakční směs se pak míchá, s výhodou při teplotě přibližně 50 °C, po další 2 až 3 hodiny k ukončení reakce.

-3 CZ 283058 B6

Produkt, anhydrid N-formyl-L-asparagové kyseliny, se pak nechává reagovat s L-fenylalaninem in šitu, čímž odpadají nákladné a časově náročné separační postupy. Reakční vedlejší produkty slouží při kopulační reakci jakožto korozpouštědla.

L-fenylalanin se kopuluje s anhydridem N-formyl-asparagové kyseliny v ekvimolámích množstvích, popřípadě v přítomnosti alkylesteru nebo bráněného alkoholu, nebo v přítomnosti jejich vhodné směsi. Zjistilo se, že alkylester a/nebo bráněný alkohol zvyšují poměr a a β, pokud jsou přidány v množství ekvivalentním alespoň přibližně 1,2 mol na mol L-fenylalaninu. Poměr a a β se zvyšuje se zvyšujícím se množstvím esteru nebo alkoholu až k bodu, kdy molámí množství esteru, alkoholu nebo jejich směsi je přibližně 4,7 násobkem L-fenylalaninu. V tomto bodě se dosahuje hranice nasycení, přičemž poměr isomerů již zůstává konstantní bez zřetele na to, o kolik více esteru nebo alkoholu se přidá.

S výhodou se alkylester, používaný při kopulační reakci, volí ze souboru, zahrnujícího methylacetát, ethylacetát, isopropylacetát, n-butylacetát a isopropylformiát. Výhodným alkylesterem je methylacetát (MeOAc). Jakožto vhodné bráněné alkoholy, kterých se může použít, se uvádějí isopropylalkohol a sekundární nebo terciární butylalkohol. Výhodným bráněným alkoholem je isopropylalkohol. Výhodná provedení způsobu vynálezu nejsou však nijak míněna jakožto omezení vynálezu a může se přirozeně používat i jiných alkylesterů nebo bráněných alkoholů.

Kopulační reakce se provádí mícháním shora uvedené směsi po dobu přibližně 4 až 6 hodin při teplotě přibližně 5 až 60 °C a s výhodou při teplotě 15 až 30 °C, to je při teplotě místnosti. Problémem při provádění reakce je skutečnost, že s vytvářením N-formyl-L-asparagyl-L-fenylalaninu směs nebo suspenze začíná tuhnout, to znamená, že se její viskozita zvyšuje až do bodu, kdy se míchání stává mimořádně obtížným, pokud je ještě vůbec možné. Vysoká viskozita způsobuje, že je míchání nesmírně obtížné a brání se přestupu tepla a tedy od destilovávání kyseliny octové, esteru a/nebo bráněného alkoholu, jak bude dále uvedeno. Zjistilo se, že přidání kyseliny octové do kopulační reakční směsi brání tomuto tuhnutí, to znamená, že se viskozita směsi snižuje. To je důležité, jelikož míchání zaručuje proběhnutí reakce až do konce. Kromě toho se kyselina a estery musí odstranit ze směsi destilací před deformylací. Reakční směs musí být míchatelná k podpoře dokonalého proběhnutí reakce.

Množství přidané kyseliny octové závisí na tom, jak mnoho anhydridu N-formyl-L-asparagové kyseliny se syntetizuje. Jelikož se kopulační reakce provádí in šitu ve vedlejších reakčních produktech, může být již obsaženo nějaké množství kyseliny octové v reakční směsi z počáteční reakce kyseliny L-asparagové a acetanhydridu. Celkové množství kyseliny octové v systému má být přibližně 7 násobkem množství L-fenylalaninu na bázi mol/mol. Nemusí být proto nutné přidávat kyselinu octovou v sedminásobném množství se zřetelem na množství při dávaného Lfenylalaninu. Je dostatečné i přidání menšího množství kyseliny octové, přičemž celkové molámí množství kyseliny octové v systému je sedminásobkem celkového množství L-fenylalaninu.

Jakkoliv se kopulační reakce může provádět za teploty okolí, používá se s výhodou teploty zvýšené, což také přispívá ke snížení viskozity reakční směsi. S výhodou se kopulace provádí při teplotě 25 až 40 °C, přičemž se jako výhodná uvádí teplota 30 °C.

Další jedinečnou předností způsobu podle vynálezu je skutečnost, že se snižuje viskozita kopulační směsi řízeným mícháním kopulační reakční směsi. Zjistilo se, že zastavení míchání nebo snížení rychlosti míchání v průběhu kopulační reakce způsobuje dramatické snížení viskozity kopulační reakční směsi. Ve velkém reaktoru (průměr 3 m), opatřeném mechanickým míchadlem s lopatkami o délce 1,5 m, při velmi pomalém míchání, například za počtu otáček 5 až 40/min, a za občasného míchání jakožto krátkodobého běhu míchadla každých 5 až 15 minut, se viskozita drasticky snižuje ve srovnání s viskozitou kopulační směsi reakční, kdy se reakce

-4CZ 283058 B6 provádí za použití míchadla o rychlosti, dané počtem otáček přibližně 60/min nebo větším. V laboratorním reaktoru (baňka s kulatým dnem 100 mm s míchadly 75 mm) vede počet otáček 200 až 300/min k velmi husté reakční směsi, přičemž míchání za počtu otáček 5 až 15/min vede k dobře míchatelné reakční směsi, která má nízkou viskozitu. Také vypnutí míchadla přibližně jednu hodinu po přidání L-fenylalaninu do reakční směsi a jeho opětné zapnutí po ukončení reakce, tedy přibližně po 6 hodinách, vede k reakční směsi s nízkou viskozitou; avšak v provozním měřítku, když se míchadlo vypne po jedné hodině, může být opravdu obtížné ho zase posléze zapnout, jelikož dochází k usazování sraženiny a k vytváření koláče.

Proto je výhodné pomalé a periodické míchání reakčního systému.

Pokud se zde používá výrazu licí nebo o nízké viskozitě v souvislosti s kopulační reakční směsí, míní se, že jde o kapalinu, kterou je možno vlít do baňky nebo do reakční nádoby. Takové kapaliny mají obecně viskozitu 15 000 mPa.s, s výhodou 1 000 až 10 000 mPa.s a především 150 až 500 mPa.s.

Míchací prostředky nemají pro způsob podle vynálezu rozhodující význam. Může se použít jakýchkoliv běžných míchacích prostředků, například zavádění inertního plynu, třepání, otáčení reaktorem, použití míchadel. Výhodná jsou mechanická míchadla. Rovněž nemá rozhodující význam konstrukce použitého míchadla. Za použití lopatkových nebo listových míchadel je výhodným počet otáček přibližně 5 až 40/min a především přibližně 20/min. Jakkoliv se obvodová rychlost v m/s značně liší při daném počtu otáček za minutu v závislosti na délce lopatky, zjistilo se, že charakterizace míchání počtem otáček za minutu je pro způsob podle vynálezu nejpřesnější. Je přijatelná jakákoliv rychlost míchání pod počet otáček 40/min se zřetelem na snížení viskozity reakční směsi. Připomíná se však, že v případě laboratorních zařízení /baňka 100 mm/ produkuje míchadlo s počtem otáček 50 až 150/min dobře míchatelnou reakční směs.

Isomery a a β N-formyl-L-asparagyl-L-fenylalaninu /αβ F-AP/, produkované způsobem podle vynálezu, se mohou analyzovat vysoce přesnou chromatografií (HPLC); analýza dokládá, že se při způsobu podle vynálezu získá nezvykle vysoký poměr a a β, přibližně 79,5 : 20,5.

Kyselina octová a veškeré estery (methylacetát, isopropylformiát a pod.) nebo bráněný alkohol se odstraňují popřípadě z reakční směsi před deformylací, dále popsanou. S výhodou se kyselina octová a estery oddestilovávají ve vakuu 51 až 98 kPa. Vakuová destilace se provádí před přidáním chlorovodíkové kyseliny, používané k deformylací αβ F-AP. Získá se kyselina octová, estery a/nebo alkohol a vracejí se do následující kopulační reakce.

Isomery a a β N-formyl-L-asparagyl-L-fenylalaninu se pak deformylují. K tomuto účelu se přidává chlorovodíková kyselina a popřípadě methanol do směsi isomerů k deformylací αβ F-AP za vzniku αβ AP. Nadbytek methanolu také reaguje s jakýmkoliv zbytkem kyseliny octové a kyseliny mravenčí v reakční směsi, čímž se získá methylacetát a methylformiát, které mají mnohem nižší teplotu varu než kyselina octová a kyselina mravenčí a mohou se tak odstraňovat ze systému destilací při nižší teplotě.

Získaná směs αβ-ΑΡ a její různé methylestery se pak esterifikují k nastavení koncentrace chlorovodíkové kyseliny, methanolu a vody na dostatečné množství pro dosažení vysokého výtěžku a-APM(HCI). Množství methanolu má být hmotnostně přibližně 1 až přibližně 10 % a s výhodou přibližně 3 až přibližně 5 %. Množství chlorovodíku má být přibližně 9 až přibližně 18 % a s výhodou přibližně 12,5 až 14,5 %. Množství vody má být hmotnostně přibližně 32 až přibližně 50 % a s výhodou přibližně 37 až přibližně 42 %. Po příslušné úpravě koncentrace vody, chlorovodíku a methanolu se reakční směs mírně míchá při teplotě přibližně pod 35 °C a s výhodou při teplotě místnosti (20 až 30 °C). Esterifikace je dokonalá za přibližně 4 až přibližně

-5 CZ 283058 B6 dní a zpravidla za přibližně 6 dní.

Vzniklá hydrochloridová sůl methylesteru α-L-asparagyl-L-fenylalaninu (a-APM(HCl)) se pak snadno oddělí od isomerů β, jelikož a-APM.HCl.2H2O má nižší rozpustnost ve vodných roztocích než β-ΑΡΜ(ΗΟ); viz americký patentový spis číslo 3 798207 (Ariyoshi). Isomer a se vysráží z roztoku a oddělí se filtrací, odstředěním, dekantací nebo jiným běžným způsobem.

a-APM(HCl) se pak neutralizuje zásadou za vzniku APM, který se pak získá o sobě dobře známou krystalizaci.

Následující příklady způsob podle vynálezu toliko blíže objasňují, nijak jej však neomezují, přičemž, jak je ostatně pracovníkům v oboru známo, jsou možné různé obměny a varianty způsobu podle vynálezu.

Příklad 1

Rozpustí se 0,12 g (0,003 mol oxidu hořečnatého, jakožto katalyzátoru, v 16 ml (0,405 mol) 95% kyseliny mravenčí. Pak se přidá 60,2 ml anhydridu kyseliny octové do uvedeného roztoku, který se udržuje po dobu 10 až 15 minut na teplotě 35 až 40 °C. Pak se přidá 39,93 g (0,3 mol) kyseliny L-asparagové a tato směs se míchá po dobu 2,5 hodin při teplotě 50 ± 2 °C. V tomto bodě se přidá dalších 8,6 ml anhydridu kyseliny octové a reakce se nechá probíhat po dobu dalších 2,5 hodin při teplotě 50 ± 2 °C. Následně se přidá 9,2 ml (0,120 mol) isopropylalkoholu do reakční směsi a v zahřívání se pokračuje po dobu dalších dvou hodin. Vytvoří se anhydrid Nformylasparagové kyseliny, jak je možno doložit vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

Směs anhydridu N-formylasparagové kyseliny se pak ochladí na teplotu místnosti, 20 až 25 °C a do směsi se přidá 150 ml (1,89 mol) methylacetátu, načež se přidá 44,6 g (0,27 mol) L-fenylalaninu. Směs se míchá po dobu tří hodin při teplotě místnosti (20 až 30 °C). Po tříhodinovém míchání se směs nechá stát přes noc (18 až 24 hodin) při teplotě místnosti a ke ztuhnutí.

Ztuhlý produkt se rozpustí v roztoku methanolu a vody (9 : 1). Vzniklá směs a a β isomerů Nformyl-L-asparagyl-L-fenylalaninu se analyzuje HPLC; zjištěn poměr a a β isomerů 79,2 : 20,8.

Příklad 2

Poměr αβ N-formyl-L-asparagyl-L-fenylalaninu, připraveného in šitu kopulační reakcí, se porovnává za použití různých ester/alkoholových korozpouštědel. Rozpustí se oxid hořečnatý (0,121 g, 0,003 mol) v 16,4 ml (0,406 mol) 93,4% kyseliny mravenčí v prostředí dusíku. Pak se přidá 62,5 ml (0,655 mol) anhydridu kyseliny octové do míchané směsi za vytvoření bílé sraženiny. Teplota směsi vzroste na 37 až 38 °C v průběhu nejbližších 30 minut. Pak se přidá kyselina L-asparagová (39,93 g, 0,30 mol) a směs se udržuje na teplotě 48 až 50 °C po dobu 2,5 hodin. Pak se přidá další anhydrid kyseliny octové (8,6 ml, 0,09 mol) a zahřívá se po dobu dalších 2,5 hodin. Do reakční směsi se přidá 9,2 ml (0,120 mol) isopropylalkoholu a v udržování na teplotě 50 ± 2 °C se pokračuje po dobu dalších 2,0 hodin. Reakční směs se pak ochladí na teplotu místnosti (22 až 27 °C).

Příprava anhydridu N-formyl-L-asparagové kyseliny se opakuje několikrát k přípravě několika prvních reakčních směsí. Do každé z těchto prvních reakčních směsí se přidá 100 ml jednoho z rozpouštědel, zahrnujících alkylester a bráněný alkohol, jak je uvedeno v tabulce I, načež se přidá 44,6 g (0,27 mol) L-fenylalaninu. Vzniklá suspenze se udržuje na teplotě místnosti po dobu

-6CZ 283058 B6 hodin k dokonalému proběhnutí kopulační reakce in šitu. Jak reakce postupuje, suspenze se stává stále tužší a tužší a přidá se roztok methanolu a vody (poměr 10 : 1) k rozpuštění všech pevných podílů. Analyzují se 2 g podíly každé reakční směsi HPLC chromatografií. Vzniklé poměry αβ N-formyl-L-asparagyl-L-fenylalaninu v jednotlivých reakčních směsích jsou následující:

Rozpouštědlo	Poměr
methylacetát	79:21
ethylacetát	79:21
isopropylacetát	80:20
n-butylacetát	78:22
methylformiát	75,5 : 24,5
isopropylformiát	78:22
isopropylalkohol	78 :22
sek.-butylalkohol	76:24
terc.-butylalkohol	78:22
bez přidání rozpouštědla	71 :29

Příklad 3

Opět se připraví anhydrid N-formylasparagové kyseliny způsobem podle příkladu 1. Anhydrid asparagové kyseliny se ponechá v původní reakční směsi ke kopulaci in šitu s L-fenylalaninem. Do reakční směsi in šitu se přidá 100 ml methylacetátu, 44,6 g (0,27 mol) L-fenylalaninu a 84 ml (1,47 mol) kyseliny octové. Celkové množství kyseliny octové, obsažené v reakční směsi, je 166,4 ml (2,912 mol), jelikož jí bylo již něco obsaženo jakožto vedlejší produkt při reakci vytváření anhydridu, když anhydrid kyseliny octové reaguje s kyselinou L-asparagovou.

Kopulační reakční směs se míchá při teplotě místnosti (20 až 25 °C) po dobu přibližně 6 hodin. Po ukončení kopulační reakce směs neztuhne. Vzniklý poměr a a β isomerů se analyticky zjišťuje HPLC; zjištěn poměr 79,5 : 20,5.

Příklad 4

Způsobem podle příkladu 1 se připraví anhydrid kyseliny N-formylasparagové (F-Asp=O) a ponechá se ve výchozí reakční směsi. Kopulační reakce se provádí in šitu, přičemž se přidá 44,6 g (0,27 mol) L-fenylalaninu, 106,89 g (1,26 mol) methylacetátu a dostatečné množství kyseliny octové pro dosažení celkového množství 2,91 mol /viz příklad 3/.

Kopulační reakce se provádí mícháním směsi po dobu přibližně šest hodin za teploty místnosti (20 až 25 °C). Směs neztuhne po ukončení kopulační reakce. Dosaženo poměru a a β isomerů 79,5 : 20,5.

V následující tabulce III jsou shrnuty výsledky se zřetelem na a a β poměry, dosažené za použití různých koncentrací methylacetátu a kyseliny octové (HOAc), zavedených do kopulační reakce. Množství anhydridu N-formylasparagové kyseliny a L-fenylalaninu se udržuje na konstantní hodnotě vždy 0,27 mol. Reakční teplota se rovněž udržuje na konstantní výši. Případné koncentrace methylacetátu a kyseliny octové při jednotlivých reakcích se uvádí v mol rozpouštědla na mol L-fenylalaninu. Poměry a a β, získané pro každou směs, se uvádějí pro potvrzení jejich vysoké hodnoty při způsobu podle vynálezu.

-7CZ 283058 B6

Tabulka III

Poměr a a β se zřetelem na koncentraci HOAc a MeOAc při kopulaci L-fenylalaninu a anhydridu kyseliny N-formylasparagové

Zkouška Koncentrace mol/mol L-fenylalaninu Poměr a a β

MeOAc HOAc

1	4,65	0,00	80,0/20,0
2	4,65	5,34	78,6/21,4
3	7,00	5,34	79,2/20,8
4	4,60	10,79	79,5/20,5
5	3,49	10,79	79,2/20,8
6	2,33	10,79	77,9/22,1
7	1,17	10,79	77,1/22,9
8	2,94	9,00	77,4/22,6
9	3,50	9,00	78,0/22,0
10	2,28	7,00	77,15/22,85
11	1,17	8,58	76,3/23,7
12	2,61	7,67	77,8/22,2
13	0,00	5,34	69,0/31,0
14	0,00	10,50	74,0/26,0

Příklad 5

Jakkoliv je vhodné, aby množství kyseliny octové v kopulační směsi bylo obecně osminásobkem množství L-fenylalaninu, ukázalo se, že jako katalyzátor působí i malé množství. Anhydrid Nformylasparagové kyseliny (31,0 g, 0,217 mol), připravený způsobem podle příkladu 2, se smíchá se 150 ml methylacetátu a s 25,8 ml (0,45 mol) kyseliny octové v prostředí dusíku. Pak se přidá 33,0 g (0,20 mol) L-fenylalaninu a směs se míchá při teplotě přibližně 25 °C. Po 3,5 hodinách se přidá dalších 100 ml methylacetátu k předcházení ztuhnutí směsi a to se opakuje po dalších 4,5 hodinách. Po celkem 6 hodinách se reakční suspenze rozpustí v dostatečném množství systému methanol a voda v poměru 10:1. Roztok se analyzuje HPLC a poměr isomerů a a β se stanoví jakožto 80 : 20.

Příklad 6

Rozpustí se oxid hořečnatý (0,4 g, 0,01 mol) v 53,3 ml (1,35 mol) 95% kyseliny mravenčí ave 200 ml (2,10 mol) acetanhydridu. Při reakci se teplota zvýší na 40 °C (z 20 až 22 °C) v průběhu 15 minut. Do reakční směsi se přidá kyselina L-asparagová (133,1 g, 1,0 mol) a vzniklá suspenze se udržuje na teplotě 48 až 50 °C po dobu 2,5 hodin, načež se přidá 28,9 ml (0,303 mol) přídavného acetanhydridu. V zahřívaní se pokračuje po dobu dalších 2,5 hodin, načež se vmísí 30,7 ml (0,4 mol) isopropylalkoholu. Směs se míchá po dobu 1,5 hodin při teplotě 48 až 50 °C a pak se nechá ochladit na teplotu místnosti /25 ± 2 °C/. Vzniklá směs obsahuje anhydrid kyseliny N-formylasparagové.

Do této reakční směsi se přidá 187 ml methylacetátu a 148,68 g (0,9 mol) L-fenylalaninu, čímž se získá suspenze, která se míchá po dobu 1,5 hodin. Pak se přidá 120 ml kyseliny octové k usnadnění míchání směsi a směs se udržuje na teplotě 25 až 26 °C po dobu dalších 4,5 hodin. Směs se pak destiluje za vakua (70,5 kPa) tak dlouho, až reakční směs dosáhne teploty 65 °C.

-8CZ 283058 B6

Do suspenze se vmíchá methanol (220 ml) a 100 ml chlorovodíkové kyseliny (1,2 mol) a suspenze se udržuje na teplotě přibližně 60 °C po dobu jedné hodiny. Získá se čirý roztok, který se destiluje až do dosažení teploty hlavy 63 °C a teploty reakční směsi 73 °C. Přidá se další methanol (400 ml) a v destilaci se pokračuje až do dosažení teploty reakční směsi 85 °C. Získaný zbytek se ochladí na teplotu místnosti (přibližně 25 °C) podrobením reakční směsi vakuu (88 kPa) po dobu 45 minut. Do ochlazeného zbytku se pak přidá 120 ml 37% chlorovodíkové kyseliny, 19 ml methanolu a 94,8 ml vody. Směs se pak míchá při teplotě místnosti po dobu šesti dnů. Získaná suspenze se zfiltruje a promyje, čímž se získá pevná bílá látka (197,54 g) po vysušení při teplotě 50 °C v průběhu 10 hodin. Tento materiál se zkouší chromatografíí HPLC; zjištěno, že produkt obsahuje 61,5 % a-APM.

Příklad 7

Opakuje se způsob podle příkladu 6 s tou výjimkou, že se přidá 400 ml methanolu v dostatečné míře k udržení konstantního objemu. Výsledná pevná látka (197,85 g) se analyzuje, HPLC zjištěn obsah α APM 67,18 %.

Příklad 8

Opakuje se způsob podle příkladu 7 stou výjimkou, že se konečná destilace provádí plně za vakua při maximální teplotě nádoby 55 až 56 °C. Výtěžek hydrochloridové soli methylesteru Lasparagyl-L-fenylalaninu je 51 % teorie.

Příklad 9

Opakuje se způsob podle příkladu 7 s tou výjimkou, že se destilace po přidání methanolu provádí za vakua 67,7 kPa po dobu dvou hodin při teplotě 55 až 67 °C. Výtěžkem je dihydrát hydrochloridu methylesteru α-L-asparagyl-L-fenylalaninu v množství 186,15 g, který se izoluje a zkouškou zjištěno, že obsahuje 64,68 % methylesteru a-L-asparagyl-L-fenylalaninu.

Příklad 10

Kyselina mravenčí (95,7 %, 16 ml, 0,405 mol) se přidá po kapkách do 60,2 ml (0,631 mol) anhydridu kyseliny octové v průběhu 5 minut, přičemž při tomto přidávání teplota vzroste na 40 °C. Směs se míchá po dobu 55 minut a přidá se 0,43 g (0,003 mol) octanu hořečnatého a 39,93 g (0,3 mol) kyseliny L-asparagové. Získaná suspenze se udržuje na teplotě 47 až 48 °C po dobu 2,5 hodin. Přidá se anhydrid kyseliny octové (7,1 ml, 0,0744 mol) a v zahřívání se pokračuje po dobu 2,5 hodin. Přidá se isopropylalkohol (7,21 g, 0,120 mol) a v zahřívání se pokračuje po dobu dalších 1,5 hodin. Pokračuje se v zahřívání a přidá se 130 ml kyseliny octové a 44,6 g (0,270 mol) L-fenylalaninu. Směs se míchá při teplotě místnosti přes noc. Získaná suspenze se rozpustí v 750 ml vody a 1,05 litru methanolu a zváží se. Odejme se alikvotní podíl a stanoví se αβ-N-formyl-L-asparagyl-L-fenylalanin chromatografií HPLC. Výtěžek a isomeru stanoven jako 71,5 %.

Příklad 11

Kyselina mravenčí (16,0 ml, 0,405 mol) se přidá do 0,121 g (0,003 mol) oxidu hořečnatého v prostředí dusíku a míchá se až do rozpuštění všech pevných podílů. Přidá se anhydrid kyseliny

-9CZ 283058 B6 octové (60,2 ml, 0,631 mol), čímž vznikne okamžitě sraženina a teplota vzroste v průběhu 15 minut na 40 °C. Přidá se kyselina L-asparagová (39,93 g, 0,3 mol) a suspenze se udržuje na teplotě 48 až 50 °C po dobu 2,5 hodin. Pak se přidá další anhydrid kyseliny octové (9,3 ml, 0,0974 mol) a v zahřívání se pokračuje po dobu dalších 2,5 hodin. Přidá se isopropylalkohol (11,9 ml, 0,155 mol) a směs se zahřívá 1,5 hodin. Teplota vzroste na 53 °C a přidá se 44,6 g (0,27 mol) L-fenylalaninu ve čtyřech dávkách v průběhu 15 minut. Teplota vzroste na 58 °C v průběhu 10 minut a vmíchání se pokračuje po dobu 50 minut. Reakční směs se pak nechá ochladit na teplotu okolí. Přidá se 30,1 ml 37% chlorovodíkové kyseliny a 70 ml vody. Suspenze se zahřeje na teplotu 60 °C a udržuje se na této teplotě po dobu jedné hodiny, přičemž se veškeré pevné podíly rozpustí. Rozpouštědlo se odstraní destilací ve vakuu při teplotě nádoby 55 ± 2 °C. Získá se zbytek v množství 119 g. Do tohoto zbytku se přidá 100 g vody a destilace se opakuje za získání zbytku v množství 107 g. Přidá se 50,5 ml kyseliny chlorovodíkové, 41,2 ml vody a 31,5 ml methanolu a suspenze se míchá při teplotě 20 až 30 °C po dobu 4 dní. Pevná hmota se odfiltruje a promyje se 50 ml nasycené solanky. Po sušení přes noc se získá 43,95 g bílého, krystalického dihydrátu hydrochloridu methylesteru a-L-asparagyl-L-fenylalaninu.

Příklad 12

Připraví se suspenze anhydridu N-formylasparagové kyseliny způsobem podle příkladu 1. Přidá se methylacetát (75 ml) a 84 ml kyseliny octové a pak se přidá L-fenylalanin (44,6 g) a vzniklá suspenze se míchá po dobu 6 hodin při teplotě 20 až 30 °C. Rozpouštědlo se odstraní destilací za vakua 169,3 kPa. Přidá se chlorovodíková kyselina (37%, 30 ml) a 66,7 ml methanolu a udržuje se na teplotě 60 až 62 °C po dobu jedné hodiny; přidá se další methanol (528 ml) a destiluje se při teplotě nádoby 85 °C. Použije se vakua 88 kPa a rozpouštědlo se oddestiluje při teplotě v nádobě 30 °C. Přidá se 36,4 ml chlorovodíkové kyseliny, 24,4 ml vody a 5,5 ml methanolu a vzniklá směs se míchá po dobu čtyř dnů. Vzniklá sraženina se odfiltruje, promyje se a vysuší se, čímž se získá 63,1 g bílé pevné látky. Chromatograflí HPLC doložen obsah 63 % a-APM.

Příklad 13

Připraví se způsobem podle příkladu 1 různé suspenze anhydridu N-formyl-L-asparagové kyseliny, které se vnesou do baňky s kulatým dnem o obsahu 500 ml, vybavené mechanickým míchadlem model Talboys 134-2. Do reakční směsi se přidá methylacetát (MeOAc), kyselina octová (HOAc) a L-fenylalanin (Phe) v množství takovém, že odpovídá molámím poměru

MeOAc/HOAc(celkem)/Phe/F-Asp = 0 = 2,73/10,64/1,0/1,0.

Tato reakční směs se míchá při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny při počtu otáček míchadla 200 až 300/min. Po jedné hodině vzroste teplota na 40 °C a počet otáček se sníží na 5 až 15/min. V podstatě dokonalá konverze L-fenylalaninu proběhne za 3 hodiny. Viskozita se měří viskozimetrem Brookfield LV za teploty místnosti po šesti hodinách reakce včetně 1,5 a 2,0 hodin reakce, končící při teplotě 50 až 55 °C. Výsledky jsou v následující tabulce, přičemž ve sloupci I je uveden počet otáček míchadla za minutu po první hodině, ve druhém sloupci teplota ve °C po první hodině a ve třetím sloupci je viskozita v mPa.s (za použití vřetene 2).

I II III

6* 12* 30* 60*

300-300/min	místnosti	2860	1587	819	483
kontrolní
5-15/min	25 °C	1225	937	490	301
5-15/min	40 °C	690	485	287	170

- 10CZ 283058 B6 * počet otáček vřetene za minutu

Příklad 14

Postupuje se způsobem podle příkladu 13 s tou výjimkou, že se reakční směs nemíchá vůbec po první hodině reakce. Po celkové době 6 hodin se reakční směs může míchat, k nastartování míchadla je však potřebná pomoc. Jakmile se reakční směs začne míchat, je velmi tekutá a licí aje mnohem méně viskóznější než reakční směs, míchaná 200 až 300 otáčkami za minutu po dobu celých šesti hodin. Analýzou reakční směsi potvrzena dokonalá konverze L-fenylalaninu.

Příklad 15

Postupuje se v podstatě způsobem podle příkladu 13 stou výjimkou, že se reakční směs míchá krátce, to je po dobu 12 sekund, nízkou rychlostí, každých 5 až 15 minut po 45 minutách reakce. Pro první hodinu se reakční směs míchá při počtu otáček 200 až 300/min. Na konci reakce je reakční směs tekutá, takže ji lze lít. Analýza reakční směsi potvrzuje dokonalé zreagování Lfenylalaninu.

Příklad 16

Způsobem podle příkladu 1 se připraví suspenze anhydridu N-formyl-L-asparagové kyseliny (FAsp=O) a vnese se do baňky a kulatým dnem o objemu 500 ml, vybavené mechanickým míchadlem model Talboys 134-2. Do reakční směsi se přidá methylacetát, kyselina octová aLfenylalanin v množství, odpovídajícím molovému poměru

MeOAc/HOAc (celkem)/Phe/F-Asp=O = 2,73/7,84/1,0/1,0.

Reakční směs se míchá při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny za počtu otáček 200 až 300/min. Na konci první hodiny se rychlost míchadla sníží na 5 až 15/min. Dokonalá konverze L-fenylalaninu proběhne za přibližně 5 hodin. Provedou se také dvě kontrolní zkoušky při rychlosti míchadla 200 až 300/min po dobu 6 hodin. Použije se viskozimetru Brookfield LV k měření viskozity při teplotě místnosti po 6 hodinách reakce včetně ukončování reakce po dobu 1,5 až 2 hodiny při teplotě 50 až 55 °C. Výsledky jsou uvedeny v tabulce:

Rychlost míchadla Viskozita v mPa.s (RPM vřeteno 4) po první hodině 1230⁺60⁺

200 - 300/min/kontrolní/	9 100	6 740	5	110
200 - 300/min/kontrolní/	12 000	8 000	6	000
5 - 15/min	6 850	3 740	2	410

+ RPM počet otáček vřetene za minutu

Příklad 17

V podstatě se postupuje způsobem podle příkladu 16 s tou výjimkou, že se teplota reakční směsi zvýší na 40 °C, když se rychlost míchání sníží na počet otáček 5 až 15/min. Vzniklá reakční směs je dobře licí a mnohem méně viskózní, než kontrolní směs, míchaná za počtu otáček 200 až 300/min. Analýza potvrzuje dokonalou konverzi L-fenylalaninu.

- 11 CZ 283058 B6

Podobnými způsoby se připravuje a-APM(HCl) v dobrém výtěžku za použití různých alkylesterů, bráněných alkoholů, parametrů míchání a popsaných destilačních technik.

Claims (27)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob jednonádobové přípravy hydrochloridu methylesteru a-L-asparagyl-L-fenylalaninu, vyznačující se tím, že se

   a) formyluje kyselina L-asparagová v první reakční směsi kyseliny mravenčí, acetanhydridu a sekundárního alkoholu,

   b) získaný anhydrid N-formyl-L-asparagové kyseliny se kopuluje in šitu s L-fenylalaninem,

   c) získané α, β isomery N-formyl-L-asparagyl-L-fenylalaninu se deformylují přidáním kyseliny chlorovodíkové,

   d) zbytkové množství kyseliny octové a kyseliny mravenčí se z reakční směsi odstraní,

   e) deformylované isomery se esterifikují přidáním methanolu, vody a chlorovodíkové kyseliny,

   f) zvysrážené směsi hydrochloridu methylesteru α-, β-L-asparagyl-L-fenylalaninu se izoluje hydrochlorid methylesteru α-, β-L-asparagyl-L-fenylalaninu.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako sekundárního alkoholu ve stupni (a) používá isopropylalkoholu a kopulace se provádí v přítomnosti kyseliny octové.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se kopulace provádí v přítomnosti alkylesteru, bráněného alkoholu a jejich směsi.
4. 4. Způsob podle nároků 1,2a 3, vyznačující se tím, že kopulační stupeň podle stupně (b) zahrnuje dále vakuové oddestilovávání kyseliny octové, bráněného alkoholu a esterů z reakční směsi před prováděním deformylace podle stupně (c), deformylace podle stupně (c) zahrnuje dále přidávání methanolu k esterifikaci kyseliny mravenčí a kyseliny octové v reakční směsi a stupeň (d) zahrnuje dále odstraňování vzniklého methylacetátu a methylformiátu.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se vzniklý methylacetát a methylformiát podle stupně (d) oddestilovává za tlaku okolí.
6. 6. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se vzniklý methylacetát a methylformiát podle stupně (d) oddestilovává za vakua.
7. 7. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se neutralizuje izolovaný hydrochlorid methylesteru α-L-asparagyl-L-fenylalaninu zásadou za získání methylesteru Lasparagyl-L-fenylalaninu.
8. 8. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že celkové obsažené množství kyseliny octové je alespoň sedminásobkem obsaženého L-fenylalaninu.
9. 9. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se alkylester přidává podle stupně (b) v molámím množství alespoň 1,2 násobném se zřetelem na L-fenylalanin.
10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že se jako alkylester přidává methylacetát, ethylacetát, isopropylacetát, n-butylacetát, isopropylformiát nebo jejich směs.

    - 12 CZ 283058 B6
11. 11. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se bráněný alkohol přidává podle stupně (b) v molámím množství alespoň 1,2 násobném se zřetelem na L-fenylalanin.
12. 12. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se jako bráněný alkohol 5 přidává isopropylalkohol, sekundární butylalkohol, terciární butylalkohol nebo jejich směs.
13. 13. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se směs alkylesteru a bráněného alkoholu přidává podle stupně (b) v molámím množství alespoň 1,2 násobném se zřetelem na L-fenylalanin.

    io
14. 14. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se kopulace podle stupně (b) provádí bez míchání.
15. 15. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se kopulace podle stupně (b) 15 provádí za míchání mechanickým míchadlem s počtem otáček menším než 40/min.
16. 16. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se kopulační směs míchá mechanickým míchadlem periodicky v průběhu reakce.

    20
17. 17. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se kopulační směs míchá

    a) intenzivně po dobu půl hodiny po přidání L-fenylalaninu,

    b) pak mírně nebo přerušovaně.

    25
18. 18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že se kopulační směs míchá mechanickým míchadlem

    a) intenzivně za počtu otáček míchadla 60/min,

    b) mírně za počtu otáček míchadla 20/min, a

    30 c) přerušovaně zapínáním míchadla na dobu alespoň jedné minuty alespoň jednou za 15 minut.
19. 19. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se

    b) získaný anhydrid N-formyl-L-asparagové kyseliny kopuluje in šitu s L-fenylalaninem při 35 teplotě 5 až 40 °C,

    c) získané isomery se deformylují za přídavného přidání methanolu, a

    d) odstraní se vakuovou destilací.
20. 20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že 1) molámí poměr kyselina 40 octová: L-fenylalanin je alespoň 7 : 1 a 2) methanol se přidává do reakční směsi v průběhu vakuové destilace podle stupně d).
21. 21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že molámí poměr bráněného alkoholu, alkylesteru nebo jejich směsí k L-fenylalaninu je alespoň 1,2 : 1.
22. 22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že se jako alky lester přidává methylacetát, ethylacetát, isopropylacetát, n-butylacetát, isopropylformiát nebo jejich směs.
23. 23. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že se jako bráněný alkohol 50 přidává isopropylalkohol, sekundární butylalkohol, terciární butylalkohol nebo jejich směs.
24. 24. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že se kopulační reakce podle stupně b) provádí za míchání mechanickým míchadlem s počtem otáček menším než 40/min.

    - 13 CZ 283058 B6
25. 25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že se míchání provádí mechanickým míchadlem při otáčkách 30/min.
26. 26. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že se kopulační reakce podle 5 stupně b) provádí za míchání mechanickým míchadlem periodicky v průběhu reakce.
27. 27. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že se kopulační reakce podle stupně b) provádí za míchání ío a) intenzivně po dobu půl hodiny po přidání L-fenylalaninu,

    b) pak mírně nebo přerušovaně.