PT99418A

PT99418A - Processo para a preparacao do antibiotico antitumor dinemicina c e de composicoes farmaceuticas que o contem

Info

Publication number: PT99418A
Application number: PT99418A
Authority: PT
Inventors: Takeo Miyaki; Kyoichiro Saitoh; Haruaki Yamamoto; Nahomi Oda
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1990-11-05
Filing date: 1991-11-04
Publication date: 1992-09-30
Also published as: EP0484856A3; IE913847A1; ZA918217B; KR920009986A; AU8695191A; AU648122B2; FI915182A; FI915182A0; US5162330A; JPH04368388A; CA2054659A1; EP0484856A2

Description

BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DO ANTIBIÕTICO ANTITUMOR DINEMICINA C E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE O CONTÊM"

1. CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um novo antibiótico designado por dinemicina C e ao seu derivado triacetato. Ambos os compostos possuem actividades antibacteriana, antifúngica e anti-tumoral.

2. DESCRIÇÃO DA TÉCNICA ANTERIOR A determinação da estrutura da dinemicina C revelou que esta contém um radical di-ino conjugado. Esta função pouco habitual foi descoberta nas esperamicinas [J. Am. Chem. Soc., 109, (1987) 3462-3464] e caliquemicinas [J. Am. Chem. Soc., 109, (1987) 3464-3466 e ibid, 109, (1987) 3466-3468], antibióticos antitumorais extraordinariamente potentes produzidos por uma estirpe de Actinomadura (ver patente de invenção norte-americana N2 4 675 187) e uma estirpe de Micromonospora (Program and -2-

Abstracts of 26 th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Abstract 227, Setembro de 1986), respec tivamente.

Considera-se que as esperamicinas A-^ e k^ são idênticas, respectivamente, a CL-1577A e B cuja descrição se encontra na patente de invenção norte-americana NQ 4 530 835. As esperamicinas estão também relacionadas estruturalmente com os antibióticos WS-6049A e B cuja descrição se encontra na patente de invenção norte-americana N2 4 578 271. Na patente de invenção norte-americana N° 4 661 353 descreve-se um fragmento de CL-1577A ou B designado por CL-1577-Β^, estando os fragmentos das esperamicinas A·^ ou A2, designados por BBM-1675C e D, descritos no pedido de patente de invenção britânica publicada NQ 2 179 649A.

No pedido de patente de invenção norte-americana série N9 323 648, depositado a 15 de Março de 1989 encontra-se a descrição de um componente de esperamicina designado por BMY-41339 apresentando a formula » 4 « -3-

Os antibióticos antitumorais designados por BU-3420T e triacetil-BU-3420T com um radical di-ino conjugado estão descritos na patente de invenção norte-americana N2 4 916 065. Estes antibióticos, também designados por dinemicina A e triace-til-dinemicina A, estão também descritos em J. Antibiotics, 42 (9) (1989) 1449-1452. A dinemicina A (BU-3420T) obtém-se por fermentação do caldo de Micromonospora chersina da estirpe M956-1 (ATCC-53710). SUMÃRIO da invenção A presente invenção proporciona o antibiótico dinemicina C e o seu derivado tri-O-acetílico que exibem actividade -4- sobre uma grande variedade de fungos e bactérias gram-positivas e gram-negativas. Adicionalmente, os compostos exibem actividade antitumoral in vitro e in vivo.

Obtém-se a dinemicina C por cultura de uma estirpe mutante de Micromonospora chersina, estirpe M956-1. A estirpe mutante designada por mutante F1085 foi obtida pelo tratamento de uma suspensão de esporos de Micromonospera chersina estirpe M956-1 com N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina. Cultiva-se a estirpe mutante FIO85 num meio nutriente aquoso contendo fontes assimiláveis de carbono e de azoto, sob condições de submersão aerôbicas até se produzir uma quantidade substancial de dinemicina C, pelo referido organismo no referido meio de cultura. Em seguida, recupera-se a dinemicina C do meio de cultura por procedimentos convencionais. 0 derivado triacetato da dinemicina C pode preparar-se por acetilação da dinemicina C, por exemplo, com anidrido acético.

Num outro aspecto, proporcionou-se composições farmacêuticas utilizáveis para o tratamento de infecções bacterianas e fúngicas num animal hospedeiro ou para a inibição de tumores em hospedeiros mamíferos, que contêm uma quantidade eficaz, inibi dora de bactérias, inibidora de fungos ou inibidora de tumores, de dinemicina C ou do seu derivado triacetato conjuntamente com um veículo farmacêutico ou um dissolvente. -5-

Num outro aspecto da presente invenção proporciona-se um método para o tratamento de infecções bacterianas ou fúngicas num animal hospedeiro mediante a administração a esse hospedeiro de uma quantidade eficaz antifúngica ou antibacteriana de dinemi-cina C ou do seu derivado triacetato ou de uma sua composição farmacêutica.

Finalmente, a presente invenção proporciona um método para inibir o desenvolvimento de tumores num hospedeiro mamífero mediante a administração a esse hospedeiro de uma quantidade, inibidora de tumor, de dinemicina C ou do seu derivado triacetato ou de uma sua composição farmacêutica.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: representa o espectro de absorção no infravermelho da dinemicina C (em brometo de potássio).

Figura 2: representa o espectro de absorção no infravermelho de triacetil-dinemicina C (em brometo de potássio).

Figura 3: representa o espectro de ressonância magnética protó- nica de dinemicina C em dimetilsulfõxido-dg (a 400 MHz). -6-

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA 0 antibiótico dinemicina C, da presente invenção, e produzido pela fermentação de uma estirpe mutante de Micromonos-pora chersina designada por F1085 ou de uma sua mutante produtora de dinemicina C. A estirpe F1Q85 foi obtida pelo tratamento de uma suspensão de esporos de Micromonospora chersina da estirpe M956-1 (ATCC-53710) com N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina.

ESTODOS TAXONOMICOS DO ORGANISMO PRODUTOR A estirpe mutante F1085 forma esporos simples num micelio vegetativo não fragmentado, desenvolvendo-se num meio de agar descritivo. A superfície dos esporos tem uns filamentos cortados curtos. Não se formam micelio aéreo, esporos móveis e vasos especiais.

Tal como se mostra no Quadro 1, a seguir, a coloração do micelio vegetativo e de incolor a alaranjada, tornando-se castanha a negra após a esporulação. A temperatura de desenvolvimento está compreendida entre 18° C e 49° C. 0 nitrato não é reduzido a nitrito. A tolerância ao cloreto de sódio é observada a 2 l mas não a 3 7o. 0 perfil de utilização de açúcar está repre- -Ι Ο desenvolvimento e a esporulação da estirpe mutante F1085 são um pouco mais lentos do que para a estirpe original no meio descritivo. Contudo, com base na caracterização taxonomica da mutante, referida anteriormente, não se observam diferenças evidentes entre a estirpe mutante, F1085, e a estirpe progenitora, M956-1. • # « -8-

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Depositou-se tona cultura biologicamente pura da estirpe mutante F1085 na America Type Culture Collection (ATGC), Washington, D. C., a qual foi adicionada à sua colecção permanente de microrganismos sob a designação ATCC-55077. A cultura da mutante F1085 de Micromonospora chersina M956-1 não produziu dinemicina A.

Deve entender-se que a presente invenção não se limita ao uso da estirpe mutante particular descrita anteriormente. São especialmente incluídas no seu âmbito outras estirpes mutantes, produtoras de dinemicina C, do referido organismo que podem ser produzidas por meios convencionais, tais como a radiação X, a radiação ultravioleta, o tratamento com mostardas azotadas, exposição a fagos e outros.

PREPARAÇÃO DE DINEMICINA C A dinemicina C é produzida mediante cultura da mutante F1085 de Micromonospora chersina M956-1, ou de uma sua estirpe mutante produtora de dinemicina C, sob condições aerõbicas submersas num meio nutriente aquoso. Desenvolve-se o organismo produtor em um meio nutriente contendo uma fonte de carbono assimilável, por exemplo L-arabinose, D-xilose, sacarose, meli-biose, rafinose ou amido solúvel. 0 meio nutriente deve também -11- conter uma fonte de azoto assimilável, tal como a farinha de peixe, peptona, farinha de soja, farinha de amendoim, farinha de semente de algodão ou macerado de milho líquido. Podem também ser incorporados no meio sais inorgânicos nutrientes. Estes sais podem abranger qualquer sal utilizável capaz de proporcionar sódio, potássio, amónio, cálcio, fosfato, sulfato, cloreto, brometo, nitrato, carbonato ou outros iões. A produção de dinemicina C pode efectuar-se a qualquer temperatura que proporcione um desenvolvimento satisfatório do organismo produtor, por exemplo, entre 18° C e 49° C e, de forma conveniente, a uma temperatura de cerca de 28° C. A fermentação pode realizar-se em frascos cu em fermenta-dores de laboratório ou industriais de capacidades variáveis. Quando se utiliza um tanque de fermentação, é conveniente produzir um inoculo vegetativo num caldo nutriente por inoculação de um pequeno volume do meio de cultura com uma cultura inclinada ou cultura de solo ou uma cultura liofilizada do organismo. Após a obtenção de um inoculo activo, deste modo, este é transferido sob condições assépticas para o meio contido no tanque de fermentação para produção em grande escala de dinemicina C. 0 meio em que o inoculo vegetativo se produz pode ser o mesmo, ou diferente do que se utiliza no tanque, desde que proporcione um bom desenvolvimento do organismo produtor. -12-

Em geral, a produção óptima de dinemicina C consegue-se após períodos de incubação de cerca de 3 a 4 dias. A produção de antibiótico pode ser controlada pela difusão em discos de papel com agar, num ensaio que utiliza Bacillus subtilis como organismo de teste.

ISOLAMENTO E PURIFICAÇ&O

Pode isolar-se a dinemicina C do caldo de fermentação por procedimentos de isolamento e purificação convencionais, por exemplo, extracção por dissolventes e cromatografia. 0 Exemplo 2, que se segue, esclarece uma técnica preferida de isolamento e purificação da dinemicina C obtida sob uma forma substancialmente pura. 0 Exemplo 3 ilustra a preparação do derivado triaceti-lico da dinemicina C. Este derivado pode obter-se fazendo reagir a dinemicina C com um agente de acetilação como, por exemplo, o anidrido acético no seio de um dissolvente orgânico inerte.

PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE DINEMICINA G E TRIACETATO DE DINEMICINA C

Obteve-se dinemicina C sob a forma de um pó amorfo, de cor púrpura intensa. É solúvel em dimetilsulfóxido, 1,4-dioxano, -13- dimetilformamida e acetonitrilo, ligeiramente solúvel em metanol e acetato de etilo e praticamente insolúvel em água e n-hexano.

As propriedades físico-químicas de dinemicina C estão resumidas no Quadro 3. Distingue-se a dinemicina C da dinemicina A por análise de cromatografia de alta resolução (HPLC) ou em camada fina (TLC)· 0 espectro de ultravioleta deste componente exibiu os máximos cerca de 239, 290, 568 e 598 nm atribuíveis ao mesmo cromoforo, l,4,6-tri-hidroxi-8,9-antraquinona dissubstituída, como dinemicina A. A formula molecular de dinemicina C foi estabelecida como C^gH-j^NOg com base no espectro de massa FAB (negativo), [m/z 521 (M)~J e no espectro de ressonância magnética nuclear protónica (Figura 3). 0 espectro de massa da dinemicina C difere do da dinemicina A (FAB-MS (negativo), m/z 537 (M)-] em 16 unidades de massa. Tal como se mostra no Quadro 4, o sinal (protão carboxílico) a b : 12,30 ppm para dinemicina C desapareceu, observando-se um novo sinal atribuível a um protão de aldeído a b : 10,03 ppm, com a dinemicina C. 0 espectro também exibiu duas bandas protõnicas duplas cis ( b : 6,11, 2H) do sistema l,5-diin-3-eno observado no espectro de ressonância magnética nuclear protónica da dinemicina A.

As propriedades físico-químicas de triacetil-dinemicina C estão resumidas no Quadro 5. 0 espectro de infravermelho do derivado acetílico (Figura 2) exibe uma banda de carbonilo acen- -14- tuada a 1765 cm""^ além das bandas que se observam no espectro da dinemicina C. Um protão de metilo (k: 1,18), tris de acetil--metilo (2,35, 2,36 e 2,44), um grupo metoxi (4,01); três de metino (3,53, 5,05 e 5,08); dois olefínicos (6,09 x 2), três protões aromáticos (7,62 x 2 e 8,08) e um protão de aldeído (10,02) foram observados no espectro de ressonância magnética nuclear protõnica, (Quadro 6). Sinais de carbono correspondentes foram também observados no espectro de EMN C. Entre os carbonos quaternários, apareceram quatro carbonos ab 89,6, 89,7, 97,5 e 97,6, sugerindo de forma acentuada um sistema diino conjugado quando se compara o espectro com o da esperamicina. Cada sinal de carbono também exibiu uma correlação relativamente boa com o carbono correspondente de triacetil-dinemicina A excepto no sinal do carbono de aldeído. 0 carbono carboxílico de triacetil-dinemicina Ateve ressonância a ^)167,3 (s), enquanto o sinal do carbo- nilo de aldeído da triacetil-dinemicina C se observou a b 188,0 13 (d) no espectro de RMN C (Quadro 7). Consequentemente, concluiu-se que as estruturas da dinemicina C e da triacetil--dinemicina C contêm um grupo aldeído em vez do grupo carboxilo no carbono 5 da dinemicina A, isto é: -15- -15- 25

15l II I11

OR Ο OR

R = H

Dinemicina C R = C0CH3

Triacetil-dinemicina C 4 6«

-16- QUADRO 3: Propriedades físico-químicas da dinemicina C

Aspecto : Pó amorfo purpura acentuada P.F. : ^ 230° C (decomposição) FAB-MS (negativo) m/z : 521 (M)" Fórmula molecular : C30H19NO8 UvXmáx. nm (£) em Me OH : 286sh (6,800)5 570(8,200); 600(7,800) I.V. (KBr) cm"1 : 3430, 2930, 1730, 1665, 1630, 1580, 1475, 1460, 1400, 1300, 1190 CCE, Si02 Rf : 0,86 (N-103, xileno-metiletilcetona-metanol = 5:5:1, (v/v) cf. dinemi cina A: 0,30, L:0,15, M: 0,63, N:0,08 HPLC Rt (minuto) : 9,62 (ODS, CH3GN-MeOH-0,15 l KH2PC>4, PH 3,50 = 3:3:2, v/v) cf. dinemi cina A: 6,13, L:4,72, M: 4,42, N: 3,80 FAB-MS:

Espectro de massa de bombardeamento atómico rápido. -17- -17- QUADRO 4:

Espectro de RMN de dinemicina C e dinemicina A (400 MHz)

Dinemicina C ( £> ppm em DMSO-dg)

Dinemicina A ppm em DMSO-d^) * * 13,12 (1H, s) Λ 13,10 (1H, br) 12,72 (1H, s) Λ 12,70 (1H, br) Λ 12,30 (1H, br) Λ 12,15 (1H, br) 12,41 (1H, s) 10,03 (1H, s) 9,86 (1H, d, J=4,3 4\ 9,86 (1H, d, J=4,3) 8,12 (1H, s) 8,03 (1H, s) 7,42 (1H, d, J=9,4) 7,38 (1H, d, J=8,9) 7,36 (1H, d, J=9,4) 7,33 (1H, d, J=8,9) 6,11 (2H, semelhante a s) 6,09 (1H, dd, J=9,8, 6,06 (1H, dd, J=9,8, 5,18 (1H, s) 4,89 (1H, s) 5,10 (1H, d, J=4,3) 5,08 (1H, d, J=4,3) 4,03 (3H, s) 3,82 (3H, s) 3,55 (1H, q» J=7,3) 3,57 (1Π, q, J=7,3) 1,21 (3H, d, J=7,3) 1,30 (3H, d, J=7,3)

desaparecimento com a adição de D2O -18-

QUADRO 5: Propriedades físico-químicas de triacetildinemicina C

Aspecto : Pó amorfo laranja P.F. : 230° C (decomposição) FAB-MS (negativo) m/z : 647 (M)‘ Fórmula molecular : C36H25NOn UV .X, mãx. nm (6) em MeOH : 247(20,700); 480(3,800) I.V. (KBr) cm"1 : 2930, 1765, 1665, 1640, 1600, 1490, 1460, 1375, 1190 HPLC Rt (mínimo) : 2.77 (ODS, CH3CN-MeOH-0,15 % KE^PO^, pH 3,50 = 3:3:2, v/v) cf. dinemi- cina A: 6,11, triacetil dinemicina A: 2,84, dinemicina C: 9,36 -19- -19- QUADRO 6:

Espectro de RMN de triacetil-dinemicina C (400 MHz em DMSO-dg)

Triacetil-dinemicina G 1,18 (3H, d, J=7,3 Hz) 2,35 (3H, S) ; , 2,36 (3H, 2,44 (3H, s) 3,53 (1H, m) 4,01 (3H, s) 5,08 (1H, s) 5,05 (1H, d, J=4,3 Hz) 6,09 (2H, s) 7,62 (2H, s) 8,08 (1H, s) 9,42 (1H, d, J=4,3 Hz) 10,02 (1H, s) NQ de protões 4-CH3 ii-ococh3, 15-ococh3, 18-OCOCH3

4-H 6- 0CH3

7- H 2-H

2-5 & 26-H 16 & 17-H 10-H 1-NH 5-CH0 13 -20- QUADRO 7:

Espectro de RMN

C de triacetil-dinemicina C

Triacetil-dinemicina C ( ^ ppm em DMSO-dg)

Triacetil-dinemicina ppm em DMSO-d^)

A 17,2 (q) 18,9 (q) 20,7 (qx2) 20,6 (qx2) 21,0 <q) 20,9 (q) 30,2 (d) 31,4 (d) 31,6 (d) 35,6 (d) 43,9 (d) 43,8 (d) 57,7 (q) 57,7 (q) 62,8 (S) 63,0 (s) 71,5 (s) 71,3 (s) 89,6 (s) 88,8 (s) 89,7 (s) 89,6 (s) 97,5 (s) 97,3 (s) 97,6 (s) 99,4 (S) 115,0 (sx2) 114,7 (S) 114,8 (S) 123,8 (d) 124,0 (d) 124,7 (s) 124,5 (s) 125,1 (d) 124,4 (d) 126,0 (s) 125,9 (s) 126,1 (s) 126,1 (s) 130,1 (d) 130,0 (d) 129,9 (s) 130,1 (s) 130,7 (d) 130,6 (d) 131,1 (d) 131,0 (d) 139,5 (s) 139,5 (s) 143,9 (s) 143,8 (s) 146,5 (s) 146,4 (s) 147,0 (s) 146,9 (s) 159,4 (s) 153,2 (s) 167,3 (s) 169,0 (s) 168,9 (s) 169,3 (sx2) 169,1 (sx2) 180,7 (s) 180,6 (s) 182,8 (s) 182,7 (s) 188,0 (d) -21-

AGTIVIDADE BIOLÓGICA DE DINEMICINA C E DO SEU DERIVADO TRIACETATO

ACTIVIDADES ANTIBACTERIANA E ANTIFÚNGICA IN VITRO

Determinou-se a concentração inibidora minima (CIM) por um método de diluição de duas vezes em série de tubos utilizando agar nutriente (pH 7, Difco contendo 10° ufc/ml). Após incubação â temperatura de 32° C durante 18 horas, determinou-se a concentração inibidora mínima. A dinemicina C e o seu derivado triacetato apresentaram grande actividade contra os organismos gram-positivos. Ambos os compostos demonstraram muito melhor actividade sobre estes organismos do que a amicacina. Sobre os organismos gram-negativos, incluindo certas estirpes de Pseudomonas e duas estirpes de Xanthomonas, o triacetato de dinemicina C exibiu uma actividade com valores de CIM variando entre 0,05 e 0,8mcg/ml. Embora a dinemicina C não exibisse qualquer actividade contra espécies de Pseudomonas aeruginosa, ela revelou melhor actividade do que a amicacina sobre outros organismos gram-negativos com excepção de Enterobacter cloacae IPM-12 e Serratia marcescens IPM.16. -22- QUADRO 8: Espectro antlbacteriano de dinemicinas

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As concentrações inibidoras mínimas antifúngicas de dinemicina C e do seu derivado triacetato foram determinadas por um método de diluição de agar em agar de morfologia de levedura com o pH ajustado para 7,0 com 1/tampão de fosfato 15 M. Inoculou-se tuna alíquota de 5 uX de suspensão fúngica contendo 10 células/ml na superfície das placas de agar contendo o antibiótico, por meio de um multi-inoculador. Após a incubação à temperatura de 28° C durante 40 horas, determinou-se a menor concentração de antibiótico que provoca a inibição praticamente completa do desenvolvimento fúngico (CIM). A dinemicina C e o triacetato de dinemicina C exibiram actividade contra estirpes resistentes à anfotericina de Candida albicans ATCC 38247 de CIM 0,8 mcg/ml e 0,4 mcg/ml, respectiva-mente, sendo aquelas actividades mais acentuadas do que a actividade do cetoconazol. Sobre Cryptococcus neoformans D49 e C. neo-formans IAM4514, a dinemicina C apresentou muito mais actividade do que a anfotericina B e o cetoconazol, mas o triacetato de dinemicina C foi inactivo para aquelas duas estirpes. -25o N cdsoao +jcu u cd fí Ή U •H V4 O) 4-1 O >w

cn H r-l « A « "«O O O cs -<r o o om QUADRO 9; Espectro antifúngico de dinemicinas

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ACTIVIDADE ANTITUMORAL A dinemicina C e o seu derivado triacetato foram ensaiados in vitro para determinação da citotoxicidade sobre linhas de células de tumores humanos e murinos. A dinemicina A e o seu derivado triacetato foram utilizados como compostos de referencia. As células B16-F10 (melanoma murino) foram desenvolvidas até à fase logarítmica em meio essencialmente mínimo de Eagle (MEM) suplementado com soro de vitela fetal (FCS, 10 %) e canamicina (60 mcg/ml e células HCT-116 (carcinoma de colon humano) em meio 5A de Maccoy suplementado com 10 % de soro de vitela fetal, 100jAlml de penicilina e 100 mcg/ml de estreptomicina e foram recolhidas e inoculadas em cavidades de placas de cultura de tecidos de 96 ou 24 cavidades com materiais de teste, a concentração de 1,5 x 104, 1,3 x 104, 1,3 x 104, 2,5 x 104 e 3,0 x 104 células/ml, respectivamente. Incubaram-se à temperatura de 37° C em atmosfera humidificada de 5 I de dióxido de carbono e 95 1 de ar, durante 72 horas. Determinaram-se as actividades citotoxicas por colorimetria a 540 nm após a coloração das células viáveis com uma solução de vermelho neutro a 0,006 %. Os resultados estão resumidos no Quadro 10, expressos em termos de CI^q. A dinemicina C exibiu uma actividade quase igual à da dinemicina A, embora os acetatos destes compostos exibissem maior actividade contra melanoma B16. -27- QUADRO 10

Actividade Citotóxica de Dinemicinas

Composto

Dinemicina C

Dinemicina A

Acetato de dinemicina C

Acetato de dinemicina A B16-F10: melanoma murino B16-HCT-116: carcinoma de cólon humano HCT-116 CI50 ( /tg/ml) B16-F10 . HCT-116 0,0028 0,0086 0,0052 0,0032 0,00074 0,0028 0,0007 não testado

Tal como se demonstrou anteriormente, a dinemicina C e o seu derivado triacetílico possuem actividade antibacteriana e antifúngica potente e são, portanto, utilizáveis no tratamento de mamíferos e de outros animais com doenças provocadas por aqueles organismos.

Além disso, os compostos podem ser utilizados para outras aplicações convencionais dos agentes antimicrobianos, tais como na desinfecção em equipamento de medicina e de odontologia. -28- A dinemicina C e ο seu derivado triacetílico são também úteis para a terapêutica inibidora do desenvolvimento de tumores malignos em hospedeiros mamíferos.

Deste modo, a presente invenção proporciona um método para a terapêutica de um animal hospedeiro portador de uma infecção bacteriana ou fúngica, que consiste em administrar a esse hospedeiro uma quantidade eficaz antibacteriana ou anti--fúngica de dinemicina C ou de triacetato de dinemicina C ou de uma sua composição farmacêutica.

Também se proporciona trai método para inibir o desenvolvimento de tumores malignos em mamíferos que conssite em administrar a esses hospedeiros mamíferos uma dose eficaz, inibidora de tumor, de dinemicina C ou de triacetato de dinemicina C ou de uma sua composição farmacêutica.

Num outro aspecto da presente invenção, proporciona-se composições farmacêuticas que contêm uma quantidade eficaz anti--fúngica ou antibacteriana de dinemicina C ou de triacetato de dinemicina C em associação com um veículo ou um dissolvente aceitável em farmácia.

Além disso, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas contendo uma quantidade eficaz, inibidora de tumores, de dinemicina C ou de triacetato da dinemicina C em -29- associação com um veículo ou um dissolvente aceitável em farmácia.

As composições farmacêuticas podem conter outros agentes antimicrobianos ou antitumorais e podem ser preparados sob qualquer forma farmacêutica apropriada para a via de adminis tração escolhida. Os exemplos destas composições incluem as compo sições sólidas para administração oral, tais como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós ou grânulos, composições líquidas para administração oral, tais como soluções, suspensões, xaropes ou elixires, e preparações para administração parentérica, tais como as soluções, suspensões ou emulsões estéreis. Podem ainda ser preparadas sob a forma de composições sólidas estéreis, as quais podem ser dissolvidas com água estéril, solução fisiológica de cloreto de sódio ou outro meio injectável estéril apropriado, imediatamente antes da sua aplicação.

Para a utilização como agente antimicrobiano, a dinemi-cina C ou o triacetato de dinemicina C ou uma sua composição farmacêutica são administrados de forma a que a concentração do ingrediente activo seja superior à concentração inibidora amínima para um dado organismo a tratar. Para o uso como um agente antitumoral, as dosagens óptimas e posologias da dinemicina C e triacetato de dinemicina C, para um dado hospedeiro mamífero, podem ser determinadas facilmente pelos especialistas na matéria. Evidentemente, terá que se considerar que a dose -30- actual do composto utilizado variará de acordo com a composição particular utilizada, o modo de aplicação, o sítio em causa, o hospedeiro e a doença a tratar. Muitos factores que modificam a acção dos fármacos devem ser considerados incluindo a idade, peso, sexo, dieta, tempo de administração, via de administração, taxa de excreção, situação do doente, associação de fármacos, sensibilidades reaccionais e a gravidade da doença.

Os exemplos seguintes têm como objectivo ilustrar e não limitar o âmbito da presente invenção. A menos que indicado de outro modo, todas as relações em volume são utilizadas como volume/volume. EXEMPLO 1

FERMENTAÇÃO DE DINEMICINA C

Utilizou-se uma cultura inclinada bem desenvolvida da estirpe F1085 para inocular cinco balões de Erlenmeyer de 500 ml contendo, cada um, 150 ml de meio de sementeira composto por lactose a 1 %, amino solúvel a 3 %, farinha de peixe a 1 %, sulfato de cálcio a 0,6 1 e carbonato de cálcio a 0,5 %, com pH 7,0. Os balões de sementeira foram incubados à temperatura de 32° C durante quatro dias e transferidos para um agitador rotativo (200 rpm) e foram transferidos 500 ml da cultura de -31- sementeira para um fermentador de agitação de 20 litros, contendo 12 litros de meio de produção constituído por amido de milho a 1 7 Pharmamedia a 0,5 %, carbonato de cálcio a 0,1 %, CuSO^S^O a 0,005 1 e iodeto de sõdio 0,00005 7o, sendo o pH ajustado para 7,0 após a esterilização. O fermentador operou ã temperatura de 30° C durante 90 horas sob agitação a 250 rpm com um caudal de arejamento de 12 litros por minuto. A produção do antibiótico no local de fermentação foi controlado por difusão em disco de papel com agar utilizando este ensaio Bacillus subtilis PCI 219 como organismo indicador. A cromatografia em camada fina e a cromato-grafia líquida de alta resolução foram também utilizadas para análise de cada componente. EXEMPLO 2

ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DA DINEMICINA C 0 caldo recolhido (52 litros) de acordo com o processo geral descrito no Exemplo 1 foi extraído com 28 litros de n-butanol. Separou-se a mistura em micélio compacto, fase aquosa e fase de n-butanol com o auxílio de uma centrifugadora de tipo "Sharples". Concentrou-se o extracto de dissolvente (25 litros), sob vazio até um pequeno volume e, em seguida, adicionou-se ao concentrado 1 litro de acetato de etilo para depositar um solido biologicamente inactivo. Após remoção das impurezas por filtração, -32- lavou-se o filtrado com 3,2 litros de água e secou-se para se obter um produto oleoso castanho escuro (33,6 gramas). Dissol-veu-se o produto não purificado em 360 ml de uma mistura de acetato de etilo-metanol-água (6:10:20) e absorveu-se em pérolas SP-800 (Mitsubishi Rasei, 100 ml) numa operação por lotes. Após a lavagem com 450 ml de água e 450 ml de cada uma das soluções aquosas de metanol (50 % e 80 %), eluiu-se a actividade com 920 ml de acetona aquosa a 80 1 e concentrou-se sob vazio para se obter uma substância oleosa verde escura (3,6 g). A substância oleosa contendo dinemicina C foi submetida a cromatografia em uma coluna· de Sephadex LH-20 (diâmetro: 2,5 x 40 cm) utilizando uma mistura de metanol-acetato de etilo (1:1) como dissolvente de desenvolvimento. Após o controlo por cromatografia em camada fina (SÍO2, xileno-metiletilcetona-metanol - 5:5:1, v/v), secaram-se as fracções apropriadas para se obterem 215 mg de um sólido higroscópico violeta escuro. Dissolveu-se este sólido em 2 ml de 1,4-dioxano e submeteu-se a uma cromatografia em gel de sílica de fase inversa (ODS, A60, 350/250 malhas, Yamamura Chemical Lab., diâmetro: 2,5 x 35 cm) previamente equilibrada com metanol aquoso a 80 L Desenvolveu-se a coluna com metanol aquoso a 80 % e acetona aquosa a 80 1 e controlou-se 0 eluído por HPLC [gel YMC (ODS), A301-3, D.I.: 4,6 mm x 100 mm, 3 JL·m, Yamamura Chemical Lab.; acetonitrilo-KE^PO^ a 0,15 %, pH 3,5 (75:25, v/v) como fase móvel com um caudal de 0,8 ml/minuto; para detecção utilizou-se absorção no ultravioleta a 595 nm. Recolheram-se as fracções activas e secaram-se para se obter 10,3 mg de dinemicina -33- C sólida, semi-puraC.Submeteu-se a amostra a uma cromatografia em coluna de Sephadex LH-20 (diâmetro: 4,2 x 30 cm) com acetoni-trilo para se obter dinemicina G sob a foma de um pó cor de púrpura intensa, homogéneo, (3 mg). EXEMPLO 3

TRIACETIL-DINEMICINA C

Trataram-se 12 mg de dinemicina C com 0,5 ml de anidrido acético em 1,0 ml de piridina, durante 22 horas à temperatura ambiente. Concentrou-se a mistura reaccional sob vazio por adição de tolueno para se eliminarem os dissolventes. Dissolveu-se o resíduo em 0,5 ml de uma mistura de cloreto de metileno--metanol (1:1) e aplicou-se a solução a uma placa de gel de sílica (Merck, Kiesel gel 6OF254, 20 x 20 cm). Desenvolveu-se a placa com uma mistura de xileno-metiletilcetona (1:1) e retirou-se a parte pretendida (Rf 0,65-0,85) e eluiu-se com 60 ml de cloreto de metileno-metanol (5:1). Evaporou-se o eluído sob vazio para se obter 9,5 mg de triacetil-dinemicina C homogénea com maior solubilidade do que a dinemicina C.

Claims

-34- fl & REIVINDICAÇÕES 1.- Processo para a preparação de dinemicina C da fórmula

OH 0 OH -35- /

η ^ caracterizado pelo facto de se cultivar uma estirpe de Micromonospora chersina produtora de dinemicina C em um meio nutriente aquoso contendo fontes assimiláveis de carbono e de azoto em condições aerõbias submersas até à produção de uma quantidade substancial de dinemicina C pelo organismo citado antes no meio de cultura também citado antes e de se recolher depois a dinemicina C pretendida a partir do meio de cultura.
2.- Processo para a preparação de dinemicina C triacetilada de fórmula geral

na qual R representa um grupo -COCE3; caracterizado pelo facto de se fazer reagir dinemicina C de fórmula -36- /

\ Ρ· ί 1 ΟΗ no seio de um dissolvente orgânico inerte com um agente de acet_i lação capaz de introduzir grupos acetilo nas posições 11, 15 e 18 da dinemicina C.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de se utilizar como estirpe produtora da dinemicina C a Micromonospora chersina F 1085 (ATCC 55077) ou um seu mutante em uma cultura biologicamente pura capaz de produzir a dinemicina C em uma quantidade recuperãvel mediante cultura em um meio de cultura contendo fontes assimiláveis de carbono e de azoto sob condições aerõbias submersas.
4. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas com acção antibacteriana, antifúngica e antitumoral, ca-racterizado pelo facto de se misturar, como ingrediente activo, -37-

uma quantidade efica2 sob o ponto de vista terapêutico de dinemi-cina C de fórmula

preparada pelo processo de acordo com a reivindicação 1, com um veículo ou diluente aceitável-em farmácia.
5.- Processo para a preparação de composições far- t macêuticas com acção antibacteriana, antifúngica e antitumoral, caracterizado pelo facto de se misturar, como ingrediente acti-vo, uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico de dinemicina C triacetilada de fórmula geral -38-

na qual R representa um grupo -COCH^; preparada pelo processo de acordo com a reivindicação 2, com um veiculo ou diluente aceitável em farmácia. © Agente Oficiai da Propriedade Industriai