PT99127B

PT99127B - Processo para a preparacao de antibiotico a base de eteres policiclicos acidico promotor de crescimento e anti-coccidicos

Info

Publication number: PT99127B
Application number: PT99127A
Authority: PT
Inventors: Hiroshi Maeda; John Philip Dirlam; Junsuke Tone
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1990-10-01
Filing date: 1991-09-30
Publication date: 1999-03-31
Also published as: ES2097818T3; EP0553106A1; GR3022837T3; EP0553106B1; IE913430A1; WO1992006091A1; DE69124390D1; CA2092402A1; DE69124390T2; ATE148117T1; DK0553106T3; US5350764A; BR9106937A; PT99127A; JPH0786104B2; CA2092402C; JPH05507282A

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ANTIBIÓTICO À BASE DE ÉTERES POLICICLICOS ACÍDICOS PROMOTOR DE CRESCIMENTO E ANTI-COCCIDÍCOS

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito a um processo para a preparação de um composto de fórmula

no qual Me representa CH₃ e Et representa CH₂CH₃· É caracterizado pelo facto de a Actinomadura sp. ATCC 55027, ou um seu mutante ou uma sua forma recombinada, ser fermentada sob condições aeróbicas submersas num meio nutriente aquoso que compreende uma fonte ί

assimilável de carbono e azoto, até se formar uma quantidade recuperável do referido composto.

Este novo antibiótico é útil como anti-coccidíco nas aves, na prevenção e no tratmento da desinteria dos suínos e como promotor do crescimento do gado e dos suínos.

V

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a um antibiótico do éter policíclico acídico tendo a seguinte fórmula:

Apresentado a estereoquimicidade relativa que é revelada; os seus sais catiónicos farmacêuticamente aceitáveis; as composições alimentares nutrientes incluindo o referido antibiótico para as aves, para o gado ou para os suínos; o seu uso como um agente anti-coccídico nas aves, no tratamento ou na prevenção da desinteria dos suínos, ou como um promotor do crescimento no gado ou nos suínos; um método de fermentação para a sua preparação; e o micro-organismo Streptomvces sp. o qual produz o referido antibiótico através do referido meio de fermentação.

composto (I) é um novo membro do grupo do éter policíclico acídico de antibióticos. Esta família inclui agentes bem conhecidos como a monensina (The Merck Index, llth Ed., Merck and Co., Inc., Rahway, N.J., 1989, monografia ns. 6157), a nigericina f loc. cit.. monografia ns 6457), a narasina (loc.

cit.. monografia ns 6339), e os lasalocidos A-E (Westley et al.,

-4J. Antibiotics, vol.27. p.744, 1974), com o Tasalocido B posuíndo uma estrutura particularmente fechada em relação á do composto (I). 0 assunto foi revisto por Westeley, Polyether.

Uma cultura de Streptomvces sp., ATCC 55027, quando é posta a fermentar sob condições aeróbias num meio aquoso, produz um novo novo antibiótico do éter policíclico acídico, um composto tendo a fórmula (I), tal como é especificado atrás.

A presente invenção diz respeito ao referido composto com a fórmula (I), incluindo os seus sais catiónicos farmacêuticamente aceitáveis, e a um processo para a sua preparação ao qual inclui a fermentação do referido Streptomvces sp., ATCC 55027 num meio nutritivo aquoso qual inclui uma fonte de carbono e azoto assimilável até se formar uma quantidade recuperável do referido composto de fórmula (I), preferentemente sob condições aeróbias submersas. Para o uso como agentes anti-coccícos, na prevenção ou no tratamento da desinteria dos suínos, e ou como um promotor de crescimento, o composto (I) pode ser separado a partir da fermentação e pode ser isolado numa forma substancialmente pura. No entanto, é usado alternativamente na forma quer em bruto, quer na forma precipitada misturado com micélio (recuperado através de filtração do meio de fermentação) , ou em sólidos obtidos por secagem através de pulverização e através de congelamento de todo o meio de fermentação.

Os referidos sais catiónicos farmacêuticamente aceitáveis incluem, embora não sejam a eles limitados, sais de sódio, potássio cálcio, amoníaco, N-N'-dibenziletilenodiamina, N-Metilglucamina (meglumina) e dietanolamina. Os sais catiónicos preferidos são os de potássio e os de sódio.

A presente invenção diz também respeito às composições alimentares nutrientes, uma para o gado ou para os suínos as quais incluem o composto de fórmula (I) numa quantidade eficaz para promover e ou aumentar a utilização na alimentação do referido gado ou dos referidos suínos, ou para prevenir ou tratar a desinteria nos suínos; e outra para as aves a qual inclui o composto de fórmula (I) numa quantidade eficaz para o controle das infecções anti-coccídicas nas referidas aves.

A presente invenção é além disso dirigida a um método para a promoção do crescimento e ou aumentar a eficiência da utilização dos alimentos nos suínos ou no gado o qual inclui administrar ao referido gado ou aos suínos um promotor de crescimento ou uma quantidade do composto de fórmula (I) promotora da eficiência da utilização da alimentação, particularmente sob a fórmula de uma composição alimentar nutritiva; a um método para prevenir ou para tratar desinteria nos suínos o qual compreende administrar aos referidos suínos um composto de fórmula (I) numa quantidade eficaz para prevenir ou para tratar a referida desinteria nos referidos suínos, e a um método para controlar as infecções coccídicas nas aves o qual compreende administrar às referidas aves uma quantidade anticoccídica eficaz do composto de fórmula (I), partioularmente sob a forma de uma composição alimentar nutritiva.

Finalmente, a presente invenção diz respeito a uma cultura biologicamente pura de Streptomvces sp., ATCC 55027, sendo a referida cultura capaz de produzir um composto de fórmula (I) numa quantidade recuperãvel através da fermentação num meio aquoso incluindo fontes assimiláveis de carbono e de azoto incluindo a referida cultura numa forma de secagem por congelamento .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A cultura capaz de produzir o presente antibiótico do éter policíclico de fórmula (I) é designada por Streptomvces sp., e foi depositada no Tratado de Budapeste na The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland como o tipo de cultura sob o número de acesso ATCC 55027. A permanência do depósito desta cultura na The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland e o fácil acesso â mesma pelo público são conferidas ao longo da vida efectiva da patente.

Esta cultura nova derivou de uma amostra de solo colhida em Tsukuba Town, Ibargi Prefecture, Japan; e identificada na colecção de culturas da Pfizer Inc. como a N768-28 e como F.D. 28706. A sua descrição e classificação foram fornecidas pelo Dr. L.H.Huang. Esta cultura foi procurada para produzir dimensões reduzidas da hifa típica da Actionomycetales, um micélio aéreo sobre o qual as cadeias de esporos se produzem, e um substracto de micélio fragmentado. Os resultados das análises da célula inteira indicam além disso que pertence ao género Streptomvces.

Uma cultura em plano inclinado do micro-organismo no meio ATCC 172 foi inoculado no caldo ATCC172 e cresceu durante quatro dias a 28 °C, num misturador. Foi centrifugada durante 20 minutos, lavada três vezes com água destilada esterilizada, e plantada num meio normalmente usado para a identificação dos membros da Actnomycetales.

As culturas foram incubadas a 28°C e os resultados foram lidos a tempos variados, mas mais frequentemente aos catorze dias. As cores foram descritas na terminologia comum, mas as cores exactas foram determinadas através da comparação com padrões de cores do The Color Harmonv Manual, quarta edição. Os métodos de análise do amino ácido e do açúcar da célula inteira encontram-se descritos no Backer et al., Appl. Microbiol., vol.

12, pp. 421-423 (1964), e no Lechevalier, J. Lab. Clin. Med.,

Vol. 71, pp.934-944 (1968), respectivamente.

A cultura foi identificada como se segue:

Agar de Extracto de levedura-extracto de Malte (meio IPS #2, Difco) - crescimento bom; creme (2 ca); em relevo, enrugada; micélios aéreos esparsos, brancos; reverso amarelado pálido (2 ga, 2 ic); pigmentos não solúveis.

Agar de Farinha de Aveia (meio IPS #3, crescimento moderado; branco a creme (1 a 1/2 ca); elevada, suave, com micélios aéreos brancos; reverso pálido (2 ca, 2 ea); pigmentos solúveis cremes (2 ca).

Difco) levemente amarelado

Agar de Amido-Sais Inorgânicos (meio IPS #4, Difco) crescimento pobre a moderado; branco a creme (2 ca); levemente elevada, suave, colónias confluentes ou isoladas, com micélios aéreos brancos; reverso amarelado pálido (2 ea, 2 ca); pigmento não solúvel.

Agar de Aspargina-Glicerol (meio IPS #5, Difco) crescimento pobre a moderado; branco a creme (2 ca); levemente elevada, suave, colónias confluentes ou isoladas, com micélios aéreos brancos; reverso sem cor a creme (1 1/2 ca); pigmento não solúvel.

Agar Sucrose-Czapek (Waksman, The Actinomycetes, v. 2, meio #1, p. 328, 1961) - crescimento moderado; branca; levemente elevada, suave, com micélios aéreos brancos; reverso sem cor; pigmento não solúvel.

Agar de Aspargina-Glucose (ibid. . meio #2) - crescimento moderado a bom; creme com tuna margem branca; delgada a levemente elevada, suave a levemente enrugada; micélios aéreos brancos; reverso creme a amarelo pálido (2 ca, 2 ea); pigmento não solúvel.

Agar de Tirosina de Gordon e Smith (Gordon e Smith, J. Bacteriol., 69:147-150, 1955) - crescimento moderado; branco a creme (2 ca); delgada a levemente elevada, suave, com micélios aéreos brancos; reverso creme a amarelo pálido (2 ca, 2 ea); pigmento não solúvel.

Agar de Malato de Cálcio (Waksman, Bacteriol. Rev., 21, 1-29, 1957) - crescimento moderado; branca; delgada a levemente elevada, suave, com micélios aéreos brancos; reverso sem cor a creme (2 ca); pigmento não solúvel.

Agar de Caseína (Gordon e Smith, ibid.) - crescimento moderado; creme (2 ca); levemente elevada, suave mas enrugada em direcção ao final da risca, sem micélios aéreos; reverso amarelo pálido (2 ea); pigmento solúvel amarelado (2 ia).

Agar de Bennett (Waksman, loc. cit..1 - meio #30, p. 331) - crescimento bom; branco a creme (2 ca); levemente elevada, enrugada; micélios aéreos brancos; reverso amarelo pálido (2 ea, 2 ga); pigmento solúvel amarelo pálido (2 ea).

Agar de Emerson (ibid, meio #28, p. 331) - crescimento bom; creme escuro (2 gc); elevada, enrugada; sem micélios aéreos; reverso igual ã face; pigmento solúvel amarelado (2 lc).

Agar Nutritivo (ibid, meio # 28, p. 330) - crescimento bom; creme (2 ca, 2 ea); delgada a levemente elevada, suave, sem micélios aéreos a dispersos brancos; reverso' sem cor a creme (2 ca); pigmento insolúvel amarelado (2 lc).

Agar de Gelatina (Gordon e Mihm, J. Bacteriol., 73, 15-23, 1957) - crescimento moderado a bom; branco; moderadamente elevada, suave, com micélios aéreos; reverso creme (2 ca) ; pigmento insolúvel.

Agar de Amido (ibid.) - crescimento moderado a bom; branco; moderadamente elevada, suave, com micélios aéreos brancos ; reverso creme a amarelo pálido (2 ca, 2 ea) ; pigmento insolúvel.

Agar de Batata e Cenoura (Lechevalier, Lab. Clin. Med., 71, 934 - 944, 1968, mas usam-se só 30 g de batatas, 2,5 g de cenouras e 20 g de agar) - sem crescimento.

Agar de Água da Torneira (2%) - crescimento moderado; branco; moderadamente elevada, suave; com micélios aéreos brancos ; reverso sem cor; pigmento insolúvel.

Propriedades Morfológicas - as propriedades morfológicas foram observadas após 16 dias de incubação em agar de farinha de aveia: massa de esporos em séries de cor branca; cadeias de esporos em secções rectas e flexíveis, rectilínea, curvada ou irregularmente flexuosa; 10 a 50 ou mais do que 50 esporos por cadeia de esporos; esporóforos ramificados monopodicamente; esporos em forma de bastão, por vezes ovais a elípticos, 1-2 x 0,6-1,0 μιη ou maiores; suaves, tal como é revelado através da detecção por microscopia de electrões.

Propriedades Bioguímxcas - ausência de produção de melanina; ausência de produção de sulfito de hidrogénio; gelatina

liquefeita; amido hidrolizado; nitrato não reduzido a nitrito; sem crescimento e sem decomposição em caldo de celulose de Jansen ou em caldo de celulose de Levine e Schoelein; peptonização e coagulação de leite, digestão da caseína positiva; digestão da tirosina negativa; digestão do malato de cálcio negativa. Utilização de carbohidratos: utilização de glucose, sacarose, fructose, manitol, rafinose, e xilose; não utilização de arabinose, inositol e ramnose.

Relação de Temperaturas 21°C 28°C 37°C 45°C

Bom Bom Sem Sem

Crescimento Crescimento Crescimento Crescimento

Análise das Paredes das Células - O hidrolisado da célula total continha ácido LL-diaminopimélico, e não revelou açúcares de diagnósticos.

A presente cultura é caracterizada pelos esporos brancos em massa, a reacção negativa de melanina, as cadeias de esporos rectas a flexuosas, e os esporos suaves. 0 hidrolisado da célula toda indica a presença de ácido LL-diaminopimélico e a ausência de açúcares de diagonóstico. Foram utilizados glucose , fructose, manitol, rafinose, sacorose, e xilose. Além disso, a cultura pertence ao género Streptomices.

Quando comparada com as espécies conhecidas de Streptomices . a cultura em questão assemelha-se a S. albosporeus (Krainsky) Waksman e Henrici subsp. labilomyceticus Okami, Suzuki e Umezawa (J. Antibiotic Series A 16:152-154, 1963) nas propriedades de cultura, morfológicas e bioquímicas.

No entanto, difere desta última no crescimento vegetativo de cor creme em vez do castanho claro ao cor de rosa claro em alguns meios, e na utilização positiva da fructose.

Com base nos dados apresentados atrás, a cultura N768-28 em questão é considerada como sendo uma nova estirpe do género Streptomices e é designada por Streptomices sp. Foi depositada na The American Type Culture Collection sob o número de entrada ATCC 55027.

composto antibiótico (I) da presente invenção é rapidamente produzido pelo presente Streptomices sp. através do crescimento a partir de cerca de 20 graus a cerca de 35 graus C. em condições de submersão com agitamento e arejamento no meio consistindo em fontes de carbohidratos tais como açúcares, amidos, glicerol; substâncias contendo azoto orgânico tais como farinha de soja, casamino-ácidos, extractos de levedura; as substâncias de crescimento tais como grãos solúveis, farinha de peixe, farinha de sementes de algodão; os sais minerais contendo vestígios de elememntos tais como ferro, cobalto, cobre, zinco, etc,; e carbonatos de cálcio ou fosfatos como agentes de tamponagem. Após o crescimento ter sido completado, o antibiótico é prontamente recuperado através da extracção da totalidade do caldo com um solvente orgânico tal como o N-butanol, metilisobutilo cetona, ou o clorofórmio com uma gama de pH desde 4,0 a 8,0; por separação através da filtração do micélio, o qual contém o antibiótico precipitado, sendo descartado o filtrado; ou através de simplesmente secagem por pulverização ou de congelamento da totalidade do caldo. Alternativamente, o micélio ou a totalidade do caldo seco é extraído com um dos solventes orgânicos referidos. O composto antibiótico purificado, se tal for desejado, é isolado do extracto orgânico através dos métodos usuais de concentração, formação de sais ou de ácidos livres,

-12cromatografia, precipitação e ou cristalização, tal como é exemplificado abaixo.

Na forma usual de levar a cabo a fermentação, é em primeiro lugar preparado um inoculo através de raspagem das células vegetativas, crescendo num meio adequado, em garrafas de Roux ou em planos inclinados os quais foram inoculados com Streptomices sp. ATCC 55027. As células vegetativas resultantes são por sua vez usadas para inocular balões de agitação ou recipientes de inoculação, contendo igualmente um meio de crescimento adequado. Alternativamente, os recipientes para inoculo são inoculados a partir dos frascos de agitação. Passado um período de crescimento adequado (geralmente 120 a 144 horas em frascos de agitação e 168 a 196 horas em recipientes para inoculo), um fermentador, contendo igualmente um meio de crescimento adequado, é inoculado sob condições assépticas num caldo vegetativo dos frascos ou dos tanques de inoóculo. Após o crescimento ter sido completado (geralmente cerca de 120 a 196 horas), o composto antibiótico é recuperado na sua forma em bruto, como desejado, através de qualquer um dos métodos atrás descritos de um modo geral, ou através de métodos específicos os quais são exemplificados a seguir.

O composto de fórmula (I) é testado in vitro através dos métodos padrão para determinar a actividade antibacteriana nos quais as concentrações de mínimos inibitórios (MIC^ZS) em mcg/ml contra um ou mais microorganismos é medida. Tal procedimento é o recomendado pelo International Collaborative Study on Antibiotic Sensitivity Testing (Ericson and Sherris, Acta. Pathologica et Microbiologia Scandinav Supp. 217, secção B: 64-68 [1971]), e emprega agar de infusão de cérebro e coração (BHI) e um dispositivo de replicação de inõculos. São diluídos 100 vezes tubos de crescimento de uma dia para o outro para serem usados

como o inoculo padrão (20.000 - 100.000 células em aproximadamente 0,002 ml. são postas na superfície de agar; 20 ml. de BHI agar /prato). Doze diluições de 2 vezes do composto teste são empregues, sendo a concentração inicial da droga teste de 200 mcg/ml. As colónias simples não são tomadas em consideração guando se faz a leitura dos pratos passadas 18 horas a 37 graus C. A susceptibilidade (MIC) do organismo teste é aceite como a concentração mínima do composto capaz de produzir a inibição completa do crescimento quando apreciada a olho nu. Tal como outros antibióticos do éter policíclico, o presente composto de fórmula (I) revela tipicamente actividade antibacteriana Gram positiva, bem como actividade contra a Treponema hyodysenteriae (o agente causador da desinteria dos suínos).

A eficácia dos dados para o composto de fórmula (I) e os seus sais contra as infecções coccideais nas galinhas é obtida através do método seguinte. Grupos de 3 a 5 frangos leghorn brancos com dez dias de idade sem doença são alimentados com uma dieta de farelo com água contendo o composto (I) ou o seu sal de sódio e ou de potássio uniformemente aí disperso. Após serem postos em reacção durante 24 horas cada frango é inoculado per os com oócistos da espécie de Eimeria a ser testada em particular. Outros grupos de 3 a 5 frangos de dez dias de idade são alimentadas com uma dieta de farelo com água semelhante sem o composto (I) ou os seus sais. São igualmente infectadas após 24 horas e servem de controlos infectados. Ainda outro grupo de 3 a 5 frangos de dez dias de idade são alimentados com a mesma dieta de farelo com água sem antibiótico e não são infectados com coccídios. Estas servem de controlos normais. Os resultados do tratamento são avaliados após cinco dias no caso da od. E. acervulina. e seis dias para as outras ensaios.

critério usado para medir a actividade anticoccídica consiste nos resultados de lesão de 0 a 4 para a E. tenella após J.E. Lynch., A New Method of the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity”, AM.J. Vet. Res.. 22, 324-326, 1961; e 0 a 3 para as outra espécies baseado nas modificações do sistema de resultados descoberto por J. Johnson e W. H. Reid, Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks, Exp. Parasit.. 28, 30-36, 1970. A actividade é medida dividindo o valor do resultado da lesão de cada grupo tratado pelo valor do resultado da lesão do controlo infectado. Neste teste, por exemplo, o composto (I) e os seus sais catiónicos exibem actividade contra a Eimeria tenella. infecções nas aves quando incorporada na dieta de farelo com água de frangos com níveis de cerca de 30 a 60 ppm. O presente composto de fórmula (I) é também geralmente útil em combinação com outros agentes anticoccídicos conhecidos, tais como a nicarbazina, a 4,4'-dinitrocarbanilida ou a naftalenamina, tal como é definido por Hamill et al., na patente U.S. 4.582.8122.

Para a prevenção e o controlo da coccidiose nas aves, o composto desta invenção é administrado oralmente ás aves num veículo adequado. Convencionalmente, a medicação é simplesmente administrada na água de beber ou na alimentação das aves, sendo assim a dosagem terapêutica do agente ingerida com a ração diária de água ou de alimento. O agente pode ser directamente introduzido na água bebível, preferentemente sob a forma de um líquido concentrado; ou junto directamente à alimentação como tal, ou, mais comumente, acrescentado â alimentação sob a forma de uma pré mistura ou de um concentrado do agente terapêutico num veículo sólido. 0 agente terapêutico pode estar numa forma substancialmente pura (por exemplo, o ácido livre, ou um seu sal farmacêuticamente aceitável), ou numa forma em bruto de teste tal como o micélio molhado ou seco ou o caldo todo seco. Os veículos

adequados são sólidos ou líquidos, se assim for desejado, tais como a água, várias farinhas (por exemplo), farinha de óleo de soja, farinha de óleo de linhaça, farinha de espiga de milho) e misturas minerais tais como as que são comumente empregues na alimentação das aves. Um veículo particularmente eficaz é a alimentação das aves em si mesma; Isto é, uma pequena porção de alimento para aves. 0 veículo facilita a distribuição dos materiais efectivos na alimentação final com a qual a pré mistura é misturada. Isto é importante não só porque pequenas porções do presente agente potente são requeridas. É importante que o composto seja completamente misturado na prémistura e, subsequentemente, no alimento. A este respeito, o agente pode ser dispersado ou dissolvido num veículo oleoso adequado tal como óleo de soja, óleo de milho, óleo de semente de algodão, e outros semelhantes, ou num solvente orgânico volátil e de seguida misturado com o veículo. Deverá ser tomado em consideração que as proporções do material activo no concentrado são capazes de grandes variações desde que a quantidade de agente na alimentação final possa ser ajustada através da mistura da proporção apropriada da prémistura com o alimento para obter um nível desejado de agente terapêutico.

Concentrados altamente potenciados são misturados no pelo fabricante do alimento com um veículo proteico tal como óleo de soja e outros alimentos, tal como foi descrito atrás, para produzir suplementos concentrados os quais são adequados para a serem adinistrados directamente na alimentação das aves. Nestas circunstâncias, as aves podem consumir a dieta usual. Alternativamente, estes suplementos concentrados são acrescentados directamente á alimentação das aves para produzir uma alimentação nutricional balanceada, e acabada contendo um nível terapêuticamente eficaz do composto desta invenção. As misturas são completamente misturadas através dos procedimentos usuais, tais como

-16numa misturadora de duplo revestimento, para assegurar a homogeneidade. Para as aves, os níveis em uso do composto aqui descrito variarão sob diferentes circunstâncias. Medicação continuada de baixo nível, durante o período de crescimento; quer dizer, durante as primeiras 5 a 12 semanas para os frangos, constitui uma medida profilática eficaz. No tratamento das infecções estabelecidas, os níveis mais elevados podem ser necessários para ultrapassar a infecção. 0 nível usual do composto de fórmula (I) na alimentação será geralmente na gama de cerca de 10 a 100 ppm. Quando administrado na ãgua bebível, o nível será o que fornecer a mesma dose diária de medicação tendo como factor a relação do peso da média diária de consumo de alimento à média diária de consumo de água.

A actividade do composto de fórmula (I) e dos seus sais na promoção e no crescimento ou aumento de eficiência da utilização dos alimentos nos suínos ou no gado pode ser medido directamente através dos grupos de animais submetidos ao teste de alimentação com vãrios níveis do composto (I) ou um sal na alimentação. Alternativamente, as especificações da patente Britânica ns 1.197.826 descrevem em pormenor um método do rumen in vitro para a avaliação dos antibióticos nos alimentos.

Para o uso na prevenção ou no tratamento da desinteria dos suínos, ou na promoção do crescimento e ou aumento de eficiência da utilização dos alimentos em gado ou suínos o composto de fórmula (I) ou de um seu sal é preferentemente administrado sob a forma de um aditivo alimentar. Os alimentos preparados de acordo com os métodos inteiramente análogos àqueles descritos atrás para a preparação de alimentos para as aves, com a mesma preocupação para produzir alimentos nos quais o agente terapêutico é uniformemente dispersado. 0 nível usual do composto (I) na alimentação do gado ou dos suínos estará geralmente na gama de

-17cerca de 10 a 100 ppm. Nos ruminantes o composto de fórmula (I) pode também ser administrado oralmente sob a forma de uma pílula grande (bolus) a qual é retida no saco rumeno-reticular, libertando o agente terapêutico numa gama substancialmente constante num período de tempo prolongado, por exemplo, 4 a 8 semanas, fornecendo uma dose equivalente aquela da dose diária atrás referida na alimentação, i. e.:

dose diária média = 10 a 100 x alimentação diária média em miligramas ppm consumo em Kg.

A presente invenção é ilustrada através dos seguintes exemplos. No entanto, deverá ser entendido que a invenção não está limitada aos detalhes específicos destes exemplos.

EXEMPLO 1

Fermentação Isolamento sob a de Streptomices sp. ATCC 55027 do Antibiótico de Fórmula (I) forma de um Sal de Sódio , A espécie Streptomices era inicialmente desenvolvida em planos inclinados inoculados com uma cultura de ATCC 55027. Uma porção do plano inclinado era usada para inocular 150 ml. do meio seguinte:

I

Glucose 1 Dextrina 24 Polipeptona 5 Extracto de levedura 5 Extracto de carnede vaca 3 CaCo₃ 4 num frasco de 500 ml. em agitação (minijarro). Isto era posto a fermentar a 28 graus C durante 3,5 dias a 200 rpm e por seu turno era usado para semear 3 litros de um dos meios seguintes:

MECO

JA

Composição	(g/D	Composição	(g/1)
Glucose		10	Glucose	10
Dextrina		5	Amido de milho	20
Licor de milho	em	infusão 5	NZ Amina tipo-A	5
Farinha de sangue	5	Extracto de levedura	5
CaCo₃		3	Rebentos de trigo	5
			CoC1₂6H₂0	0,001
			CaCo₃	4
	C-4		IT-2

Composição	(g/D	Composição	(g/D
Glucose	20	Glucose	10
Glicerol	10	Dextrina	20
Farinha de soja	10	Glúten de trigo	10
Licor de milho em	infusãolO	Licor de milho em	infusão 5
Na₂ ^s°₄	0,5	Polipeptona	1
CoCl₂6H₂0	0,001	(^nh4)₂ ^s°₄	1
CaCo₃	4	CoC1₂6H₂0	0,001
		CaCo₃	4

Em frascos de fermentação esterilizados de 6 litros. Estas fermentações principais foram levadas a cabo a 28 graus C. durante 4 dias a 1700 rpm e arejadas com um volume de ar por volume de líquido por minuto. As fermentações completas foram

clarifiçadas pela filtração sobre terra diatomácea e o antibiótico foi isolado a partir do filtrado tal como foi detalhado atrás.

Foram extraídos 80 litros de caldo de acordo com o parágrafo precedente com metilisobutil cetona com pH natural. O extracto orgânico foi concentrado sob vácuo para dar origem a um resíduo oleoso. O resíduo foi cromatografado usando 300 g de gel de sílica para colunas graduadas, 32-63 microns, empregando um gradiente de 80 para 20 a 50 para 50 hexano : acetato de etilo. Os eluatos foram examinados através da cromatografia de camadas finas (tlc) em placas de gel de sílica desenvolvidas com o clorofórmio : isopropanol (95 para 5), seguidamente foram pulverizadas com 3,3% de vanilina dissolvida em etanol : ácido fosfórico (2 : 1), e aquecido até 80 graus C. Fracções com componentes comuns foram combinadas e testadas em relação á actividade antibacteriana contra a Staphvlococcus aureus 01A110. Foram combinadas fracções activas, e foram posteriormente purificadas através da cromatografia de flash” usando uma coluna de 100 g de gel de sílica gelatinizando um gradiente de 90 para 10 hexano : etil acetato para 100% de etil acetato. De novo, os eluatos foram examinados através de tlc. Após pulverização com o indicador de vanilina e ser aquecido a 80 graus C, o componente activo apareceu sob a forma de uma mancha amarela Rf 0,32. Todas as fracções contendo este componente foram combinadas e cromatografadas usando o método de cromatografia de flash de colunas (100 g de gel de sílica; 80 para 20 clorofórmio:acetato de etilo) e 387 mg de sal de sódio do composto de fórmula (I) foram obtidos após a 25 remoção do solvente sob vácuo: mp 160-162 graus C, [alfa]_D = -44,3 graus (c = 1, CH₃OH).

A estrutura do composto de fórmula (I) foi atribuída com base na RMN de e (incluindo ^³C DEPT, HECTOR e as

1 experiências de acouplamento C - H de gama longa) e dados de

-21espectro de massa. A estereoquimicidade relativa foi determinada através da análise de raios x dos sais Cs de I. No entanto, os dados dos raios x foram inconclusivos relativamente ao comprimento da cadeia de carbono na 4 posição do anel aromático (i. é., metilo ou etilo), e a atribuição do 4-etilo foi feita com base nos dados NMR. Os dados espectroscópicos e a análise dos elementos foram consistentes com C^H^OgNa para o sal de sódio de I. Por exemplo, na EM-BAR, foram detectadas no composto (I) moléculas de diagonóstico cationizadas m/z 641 (m + Na) e 663 (M + 2Na - H)⁺ bem como o sal de sódio.

Análise Calculada para C_^H^^O-NaH-C: C, 65,60; H, 8,99 Encontrado: C,64,92; H, 8,68. ^JC NMR [deslocamento químico (ppm) em CDClg com o número de hidrogénios entre parênteses]: 216,18 (0), 176,16 (0), 158,73 (0), 149,97 (0), 129,87 (1), 128,26 (0),

118,	30 (0),	115,	39 (1)	, 86	,77 (0), 82	,72	(1),	76,	04	(1),	71,01
(0) ,	69,78	(D,	55,83	(D,	48,46	(1),	44,60	(2)	, 38	,00	(2) ,	34,35
(1),	31,46	(2),	31,02	(1),	30,55	(1),	29,68	(2)	, 29	,56	(2),	23,18
(2),	18,98	(2),	18,66	(3),	15,46	(2),	15,36	(3)	, 14	,01	(3),	14,01
(3),	13,27	(3),	13,27	(3),	12,41	(3),	12,41	(3)	z 9,	21	(3) e	6,41

(3).

IV (filme) cm”¹: 1700 (cetona) e 1585 (carboxilato). UV (metanol) : inflecção a 246 nm, máximo a 305 nm.

EXEMPLO 2

Composto (I) sob a Forma de um Ácido Livre

A forma de ácido livre do antibiótico de fórmula (I) foi preparado agitando vigorosamente uma solução de clorofórmio do sal de sódio com um volume igual de ácido clorídrico com o pH igual a 3 num funil separador. As fases foram separadas, e a

camada de clorofórmio foi lavada com água e de seguida foi evaporada sob vácuo para originar o ácido livre.

. -1

IV (filme) cm : 1700 (cetona) e 1645 (grupo carboxilo ligado a hidrogénio).

EXEMPLO 3

O Sal de Césio do Composto (I)

Para preparar o sal de césio do composto do composto de fórmula (I), o ácido livre (98 mg) foi dissolvido em 70 ml de clorofórmio. 0 carbonato de césio (130 mg em 100 ml de água) foi acrescentado e a mistura resultante foi agitada durante vários minutos e foi então posta num funil separador e foi vigorosamente agitada durante vários minutos. A fase orgânica foi separada e evaporada sob vácuo para dar origem a um sólido branco. O sal de césio foi recristalizado através de evaporação lenta a partir do cloreto de metileno : heptano (2 : 1) e os dados de raios X foram obtidos a partir dos cristais resultantes por Ms. G. Schulte.

Claims

ia. - Processo para a preparação de um composto com a fórmula

We no qual Me representa CHg e Et representa CHgCHg, caracterizado pelo facto de a Actinomadura sp. ATCC 55027, ou um seu mutante ou uma sua forma recombinada, ser fermentada sob condições aeróbicas submersas num meio nutriente aquoso que compreende uma fonte assimilável de carbono e azoto, até se formar uma quantidade recuperável do referido composto.

»
2a. - Processo de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado por incluir adicionalmente o passo de separação do referido composto do meio de fermentação.
3a. - Processo de acordo com a Reivindicação 2 caracterizado por o referido passo de separação compreender a filtração do meio de fermentação e a recuperação da mistura do referido composto e micêlio.
4a. - Processo de acordo com a Reivindicação 2 caracterizado por o referido passo de separação compreender a secagem por pulverização ou a secagem por congelamento do referido meio de fermentação e a recolha do referido composto no estado bruto.

53. - Processo de acordo com as Reivindicações la 4 caracterizado por compreender a fermentação da Actinomadura sp. ATCC 55027.

63. - Processo de acordo com qualquer umà das Reivindi_ cações 1 a 5 caracterizado por compreender adicionalmente o passo ™ de conversão do referido composto num seu sal catiónico farmacêuticamente aceitável.

73. - Processo de acordo com a Reivindicação 6 caracterizado por o referido sal catiónico ser um sal de sódio ou de potássio.

83. - Método para promover o crescimento ou o aumento da eficiência da utilização da alimentação no gado caracterizado por compreender a administração a esse mesmo gado de um composto com a fórmula

-» »

no qual Me representa CH₃ e Et representa CH₂CH₃, ou um seu sal catiónico farmaceuticamente aceitável, numa quantidade eficaz para produzir o crescimento ou o aumento da eficiência da alimentação no gado.
9a. - Método para prevenir ou para tratar a desinteria, promovendo o crescimento ou aumentando a eficiência da alimentação nos suínos caracterizado por se administrar aos referidos suínos um composto com a fórmula

H no qual Me representa CH₃ e ET representa CH₂CH₃, ou um seu sal catiónico farmaceuticamente aceitável, numa quantidade eficaz para prevenir ou para tratar a desinteria, promovendo o crescimento ou aumentando a eficiência da alimentação nos referidos suínos.
10a. - Método para prevenir ou para controlar as infecções coccídeais nas aves caracterizado por se administrar ãs referidas aves um composto com a fórmula »

no qual Me representa CH₃ e ET representa CH₂CH₃, ou um seu sal catiónico farmacêuticamente aceitável, numa quantidade eficaz para prevenir ou para controlar as infecções coccídeais nas aves.

lia. - Método de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8 a 10 caracterizado por o referido composto se encontrar na forma do seu sal de sódio ou de potássio.