PT99155A - Processo para a preparacao de antibiotico a base de eteres policiclicos acidico - Google Patents

Description

Antecedentes da Invenção

A presente invenção diz respeito a um antibiótico do éter policíclico acídico tendo a seguinte fórmula:

-· apresentado a estereoquímica relativa como representada; os seus sais catiónicos farmaceuticamente aceitáveis; as composições alimentares nutritivas incluindo o referido antibiótico para as aves, para o gado ou para os suínos; o seu uso como um agente anti-coccídico nas aves, no tratamento ou na prevenção da disenteria dos suínos, ou como um promotor do crescimento no gado ou nos suínos; um método de fermentação para a sua preparação; e o micro-organismo Actinomadura sp. o qual produz o referido antibiótico no do referido meio de fermentação. 0 composto (I) é um novo membro do grupo de antibióticos do éter policíclico acídico. Esta família inclui agentes tão bem conhecidos como a monensina (The Merck Index, llth Ed., Merck and Co., Inc., Rahway, N.J., 1989, monografia ns. 6157), a nigericina f loc. cit.. monografia ns 6457)r a; naràsina (loc. cit.. monografia ne 6339), o lasalocido A doe, cit.. monografia n2 5243), e a salinomicina (loc. cit.r monografia ns 8305). 0 assunto foi revisto por Westley, "Polyether Antibiotics", Adv. Appl. Microbiol., vol.22, pp.177-223 (1977). Estes compostos são geralmente conhecidos como coccidiostatos, sob a forma de aditivos promotores do crescimento, e ou como agentes úteis contra a disenteria dos suínos.

Sumário da Invenção

Uma cultura de Actinomadura sp., ATCC 55080, quando é posta a fermentar sob condições aeróbias num meio aquoso, produz um novo antibiótico do éter policíclico acídico, um composto tendo a fórmula (I), tal como é especificado atrás. A presente invenção diz respeito ao referido composto com a fórmula (I), incluindo os seus sais catiónicos farmacêuticamente aceitáveis, e a um processo para a sua preparação o qual inclui a fermentação da referida Actinomadura sp., ATCC 55080 num meio nutritivo aquoso qual inclui uma fonte de carbono e azoto assimilável até se formar uma quantidade recuperável do referido composto de fórmula (I), preferentemente sob condições aeróbias submersas. Para o uso como agente anti-coccídico, na prevenção ou no tratamento da disenteria dos suínos, e ou como um promotor de crescimento, o composto (I) pode ser separado a partir da fermentação e pode ser isolado numa forma substancialmente pura. No entanto, é usado alternativamente quer em bruto, por exemplo, na forma precipitada misturado com micélio (recuperado através de filtração do meio de fermentação), ou em sólidos obtidos por secagem através de pulverização ou através de congelamento de todo o meio de fermentação.

Os referidos sais catiónicos farmacêutiçamente aceitáveis incluem, embora não sejam a eles limitados, sais de sódio, potássio, cálcio, amoníaco, N-Ν'-dibenziletilenodiamina, N-metil-glucamina (meglumina) e dietanolamina. Os sais catiónicos preferidos são os de potássio e os de sódio. A presente invenção diz também respeito ãs composições alimentares nutrientes, uma para o gado ou para os suínos as quais incluem o composto de fórmula (I) numa quantidade eficaz para promover e ou aumentar a utilização da alimentação do referido gado ou dos referidos suínos, ou para prevenir ou tratar a disenteria nos suínos; e outra para as aves a qual inclui o composto de fórmula (I) numa quantidade eficaz para o controle das infecções anti-coccídicas nas referidas aves. A presente invenção é além disso dirigida a um método para a promoção do crescimento e ou aumentar a eficiência da utilização dos alimentos nos suínos ou no gado o qual inclui administrar ao referido gado ou aos suínos um promotor de crescimento ou uma quantidade do composto de fórmula (I) promotora da eficiência da utilização da alimentação, particularmente sob a fórmula de uma composição alimentar nutritiva; a um método para prevenir ou para tratar disenteria nos suínos o qual compreende administrar aos referidos suínos um composto de fórmula (I) numa quantidade eficaz para prevenir ou para tratar a referida disenteria nos referidos suínos, e a um método para controlar as infecções coccídicas nas aves o qual compreende administrar ás referidas aves uma quantidade anticoccídica eficaz do composto de fórmula (I), particularmente sob a forma de uma composição alimentar nutritiva.

Finalmente, a presente invenção diz respeito a uma cultura biologicamente pura de Actinomadura sp., ATCC 55080, sendo a referida cultura capaz de produzir um composto de fórmula (I) numa quntidade recuperável após a fermentação num meio aquoso incluindo fontes assimiláveis de carbono e de azoto; incluindo a referida cultura numa forma de secagem por congelamento.

Descrição Detalhada da Invenção A cultura capaz de produzir o presente antibiótico do éter policiclico de fórmula (I) ê designada por Actinomadura sp., e foi depositada no Tratado de Budapeste na The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland como o tipo de cultura sob o número de acesso ATCC 55080. A permanência do depósito desta cultura na The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland e o fácil acesso á mesma pelo público são conferidas através da validade efectiva da patente.

Esta cultura nova derivou de uma amostra de solo colhida em Ohno, Gifu Prefecture, Japão; e identificada na colecção de culturas da Pfizer Inc. como a N 854-24 e como F.D. 28800. A sua descrição e classificação foram fornecidas pelo Dr. L. H. Huang. Esta cultura foi procurada para produzir dimensões reduzidas da hifa típica da actinomicetos, um micélio aéreo , e um substracto de micélio fragmentado. Os resultados das análises da célula completa indicam além disso que pertence ao género Actinomadura.

Uma cultura em plano inclinado do micro-organismo no meio ATCC 172 foi inoculada no caldo ATCC 172 e cresceu durante quatro dias a 28°C, num agitador. Foi então centrifugada durante 20 minutos, lavada três vezes com água destilada esterilizada, e plantada num meio normalmente usado para a identificação dos membros da Actinomicetas. ί

As culturas foram incubadas a 28^0 'g"''os resultados foram lidos a tempos variados, mas mais frequentemente aos catorze dias. As cores foram descritas na terminologia comum, mas as cores exactas foram determinadas através da comparação com padrões de cores do The Color Harmonv Manual, quarta edição. Os métodos de análise do amino ácido e do açúcar da célula completa encontram-se descritos no Backer et al., Appl. Microbiol., vol. 12, pp. 421-423 (1964), e no Lechevalier, J. Lab. Clin. Med., Vol. 71, pp. 934-944 (1968), respectivamente. A cultura foi identificada como se segue:

Agar de Extracto de Levedura- Extracto de Malte (meio IPS #2, Difco) - crescimento bom; branco, creme, cinzento claro, castanho a castanho escuro (2 ca, 3 ne, 3 pg, 3 pi); em relevo, enrugada; aparecendo como clónias confluentes ou isoladas; micélios aéreos brancos a cinzentos claros (perto de cinzento séries 3 eb); reverso amarelado, castanho amarelado, castanho a castanho escuro (2 ia, 3 nc, 3 ng, 3 pi); pigmentos não solúveis.

Aqar de Farinha de Aveia (meio IPS #3, Difco) crescimento moderado, amarelo esverdeado (1 1/2 lc, 1 1/2 ne); levemente elevada, suave, sem micélios aéreos; reverso verde amarelado a amarelo esverdeado (1 lc, 1 1/2 lc); pigmentos solúveis cremes (2 ca).

Acrar de Amido - Sais inorgânicos (meio IPS #4, Difco) -crescimento pobre a moderado; sem cor a creme (2 ca); delgado, suave, sem micélios aéreos; reverso igual á face; pigmento não solúvel.

Aoar de Aspargina-Glicerol (meio IPS #5, Difco) crescimento pobre a moderado; creme a laranja rosado pálido (2 i x

V

ca, 4 ca); levemente elevada, suave, colónias Confluentes ou isoladas, sem micélios aéreos; reverso igual ã face; pigmento não solúvel.

Aaar Sucrose - Czapek (Waksman, "The Actinomycetes", v. 2, meio #1, p. 328, 1961) - crescimento pobre a moderado; creme (2 ca); delgada, suave, colónias confluentes ou isoladas; sem micélios aéreos; reverso creme (2 ca); pigmento não solúvel.

Aaar de Asoargina-Glucose (ibid., meio #2) - crescimen-^ to moderado; verde claro, verde amarelado a verde (1 ca, 1 1/2 ^ ne, 1 1/2 pe, 1 lc); levemente elevada, suave, aparecendo sob a forma de riscas confluentes ou de colónias isoladas; sem micélios aéreos; reverso amarelo esverdeado a verde pálido (1 ca, 2 lc, 1 1/2 ne); pigmento não solúvel.

Aaar de Tirosina de Gordon e Smith (Gordon e Smith, J. Bacteriol., 69:147-150, 1955) - crescimento pobre a moderado; castanho a castanho escuro (3 le, 3 Ig, 3 ni); leve a moderadamente elevada, suave a granulada,aparecendo sob a formade colónias isoladas com poucos pontos de micélios aéreos cinzento pálido (3 dc); reverso castanho amarelado a castanho escuro (3 ne, 3 ni, 3 el); pigmento solúvel amarelado (2 ic). i

Aaar de Malato de Cálcio (Waksman, Bacteriol. Rev., 21, 1-29, 1957) - crescimento reduzido; sem cor a creme (2 ca); delgada, suave, aparecendo sob a forma de colónias isoladas; sem micélios aéreos; reverso sem cor, creme a amarelada (2 ca, 2 ga); pigmento não solúvel.

Aaar de Caseína (Gordon e Smith, ibid.) - crescimento moderado a bom; amarelado escuro (2 ic); moderadamente elevada, enrugada, sem micélios aéreos; reverso igual; â face; pigmento solúvel amarelado (2 lc).

Aqar de Bennett (Waksman, loc. cit..) - meio #30, p. 331) - crescimento bom; branco, creme, amarelado, castanho amarelado, castanho a castanho escuro (2 ca, 2 ic, 3 lc, 3 le, 3 ni); elevada, enrugada; micélios aéreos brancos; reverso amarelado, castanho amarelado, castanho a castanho escuro (2 ga, 3 ne, 3 ng, 3 ni); pigmento solúvel amarelado pálido (2 ga).

Aqar de Emerson (ibid, meio # 28, p. 331) - crescimento moderado a bom; branco, creme, cinzento a cinzento escuro, (2 ca, 2 ea, próximo do 2 fe, 2 ih, 2 ml) ; altamente elevada, enrugada; aparecendo sob a forma de colónias isoladas; micélios aéreos brancos a cinzentos (próximo de 2 fe) ; reverso amarelado, cinzento a cinzento escuro (2ga, próximo 2 fe, 2 ih, 2 ml); sem pigmento solúvel.

Aqar Nutritivo (ibid, meio # 14, p. 330) - crescimento moderado; branco; ligeiramente elevada, suave, com micélios aéreos brancos; reverso creme (2 ca); pigmento insolúvel.

Aqar de Gelatina (Gordon e Mihm, J. Bacteriol., 73, 15-27, 1957) - crescimento pobre a moderado; castanho a castanho escuro (3 le, 3 ni, 3 pn); moderadamente elevada a elevada, suave a enrugada, aparecendo sob a forma de colónias isoladas, com micélios aéreos esparsos brancos; reverso castanho a castanho escuro (3 ne, 3 ng, 3 pl); pigmento insolúvel amarelado (2 ic).

Aqar de Amido (ibid.) - crescimento moderado; castanho a castanho escuro (3 ng, 3 pl) ; leve a moderadamente elevada, suave a granular com pontos cizento pálido (próximo de 3 cb) de micélios aéreos brancos ; reverso castanho a castanho escuro(3 lg, 3 pl); pigmento solúvel amarelado (2 lc).

Agar de Batata e Cenoura (Lechevalier, Lab. Clin. Med., 71, 934 - 944, 1968, mas usam-se só 30 g de batatas, 2,5 g de cenouras e 20 g de agar) - crescimento pobre a moderado; verde amarelado a amarelo esverdeado (1 1/2 ca, 1 1/2 le, l 1/2 ng); levemente elevado, suave a granular, aparecendo sob a forma de colónias isoladas; com micélios aéreos esparsos brancos; reverso igual ã face; sem pigmentos solúveis.

Agar de Água da Torneira (2%) - crescimento pobre; sem cor a creme (2 ca); delgada, suave; com colónias confluentes ou aparecendo sob a forma de colónias isoladas; sem micélios aéreos; reverso sem cor a creme; pigmento insolúvel.

Meio l Mineral de Gauze (Gauze et al. Problems in the Classification of Antagonistic Actnoraycetes, Engl. ed., 1957, p. 13) - crescimento moderado, verde amarelado (1 ic) com algums pontos amarelo acinzentados (1 1/2 le), delgada, suave a granular; micélios aéreos de nenhuns a esparsos, sem afectar a aparência da colónia; reverso verde amarelado (1 ic); pigmentos solúveis cremes (1 1/2 ca). «

Meio 2 Orgânico de Gauze (ibid.) - crescimento moderado a bom; verde escuro, verde amarelado a cor de rosa pálido (1 ic, 1 lg, 1 ni, 4 ea, 4 ga), moderadamente elevada; suave, enrugada a granular; micélios aéreos de nenhuns a esparsos, sem afectar a aparência da colónia; reverso igual ã superfície; pigmentos solúveis amarelados (2 ic).

Propriedades Morfológicas - as propriedades morfológicas foram observadas após 16 dias de incubação em agar de extracto de malte e extracto de levedura: micêlios aéreos brancos, micélios vegetativos castanho amarelado a castanho; Hifas ramificadas, 0,4 a 1,0 μιη diam. ; não foram produzidos esporos, mesmo após seis semanas de incubação neste e noutros meios.

Propriedades Bioquímicas - ausência de produção de melanina; ausência de produção de sulfureto de hidrogénio; gelatina liquefeita excluindo hipurato e amido não hidrolizados; nitrato orgânico mas não nitrato dextrose reduzido a nitrito; sem crescimento e sem decomposição em quer em caldo de celulose de Jansen ou em caldo de celulose de Levine e Schoelein; peptoni-zação e coagulação de leite, digestão da caseina positiva; digestão da adenina, hipoxantina, xantina, ureia, tirosina e malato de cálcio negativa; resistência à lisozima positiva.

Utilização de carbohidratos: glucose e ramnose utilizadas; amido e trehalose duvidosamente utilizados; arabinose, fructose, inositol, manitol, rafinose, sucrose, xilose, adonitol, celobiose, dulcitol, eritritol, galactose, maltose, manose, melezitose, melibiose, α-metil-D-glucosida, ribose, salicina, sorbitol e sorbose não utilizadas.

Utilização de ácidos orgânicos: acetato, lactato, propionato, e piruvato utilizados; benzoato, citrato, dextrina, malato, mucato, oxalato, fenol, e succinato não utilizados.

Produção de ácidos a partir dos carbohidratos: ácidos produzidos a partir da glucose, arabinose, fructose, inositol, manitol, rafinose, sucrose, xilose, adonitol, celobiose, dulcitol, eritritol, galactose, glicerol, lactose, maltose, melezitose, melibiose, α-metil-D-glucosida, ribose, salicina, sorbitol, sorbose, e tre-halose: ácidos não produzidos a partir da manose e do amido.

Relação de Temperaturas -

21°C 28 °C 37 °C 45°C

Crescimento Crescimento Crescimento Crescimento Pobre a Bom Sem Sem

Moderado

Análise das Paredes das Células - 0 hidrolisado da célula total continha ácido meso-diaminopimélico, galactose, glucose, madurose e ribose. A presente cultura é caracterizada pelos micélios aéreos brancos, cinzento pálido a cinzento; o micélio substrato amarelo-verde a verde amarelo; e as colónias isoladas como resultado de um crescimento lento. Os esporos e as cadeias de esporos não foram observadas em meios diferentes mesmo depois de um período prolongado de incubação de seis semanas.

Os seguintes testes bioquímicos foram positivos: liquefacção da gelatina; reducção do nitrato orgânico a nitrito; decomposição da caseína, coagulação e peptonização no leite; resistência ao lisoma; utilização de glucose, ramnose, acetato, lactato, propionato, e piruvato. 0 hidrolisado da célula toda continha ácido meso-diaminopimélico e madurose. Além disso, esta cultura pertence ao género Actinomadura. A presente cultura assemelha-se a Actinomadura macra (Huang, L. H., Int. J. Syst. Bacteriol. 30: 565-568, (1980) na cor dos micélios aéreos e na maior parte das propriedades bioquímicas. No entanto, em agar de farinha de aveia e em meio #1 de Gauze o substrato do micélio do anterior é amarelo esverdeado mas o do último é creme a cor de rosa pálido e esbranquiçado a cinzento claro, respectivamente. Além disso, A. macra produz sulfureto de hidrogénio, decompõe a tirosina mas não a caseína e utiliza a sucrose mas não a ramnose.

Comparada com a presente cultura, a Actinomadura pulveracea (Iwami, M. et al. J. Antibiot. 38: 835-839, 1985) difere na utilização positiva a sucrose e da xilose e a hidrólise positiva do amido. Os micélios aéreos da A. pulveracea são cinzentos a azuis em vez de brancos a cinzento claro a cinzento. No agar de glucose aspargina o micélio substrato da A. pulveracea são cor de rosa mas os da presente cultura são verde amarelado a verde claro. A presente cultura é relacionada com a Actinomadura atramentaria (Miyadoh, S. et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 37: 342-346, 1987) na maior parte das propriedades bioquímicas mas difere na produção de melanina, na liquefacção negativa de gelatina, e na utilização negativa de ramnose.

Com base nos dados apresentados atrás, a cultura N 854-24 em questão é considerada como sendo uma nova estirpe do género Actinomadura e é designada por Actinomadura sp. Foi depositada na The American Type Culture Collection sob o número de entrada ATCC 55080. 0 composto antibiótico (I) da presente invenção é rapidamente produzido pelo presente Actinomadura sp. através do crescimento a partir de cerca de 24 graus a cerca de 36 graus C. em condições de submersão com agitamento e arejamento no meio consistindo em fontes de carbohidratos tais como açúcares, amidos, glicerol; substâncias contendo azoto orgânico tais como farinha de soja, casamino-ãcidos, extractos de levedura; as ι

substâncias de crescimento tais como grãos solúveis, farinha de peixe, farinha de sementes de algodão; os sais minerais contendo vestígios de elememntos tais como ferro, cobalto, cobre, zinco, etc,; e carbonatos de cálcio ou fosfatos como agentes de tampona-gem. Apôs o crescimento ter sido completado, o antibiótico é prontamente recuperado através da extracção da totalidade do caldo com um solvente orgânico tal como o N-butanol, metilisobu-tilo cetona, ou o clorofórmio com uma gama de pH desde 4,0 a 8,0; por separação através da filtração do micélio, o qual contém o antibiótico precipitado, sendo descartado o filtrado; ou através de simplesmente secagem por pulverização ou de congelamento da totalidade do caldo· Alternativamente, o micélio ou a totalidade do caldo seco é extraído com um dos solventes orgânicos referidos. 0 composto antibiótico purificado, se tal for desejado, é isolado do extracto orgânico através dos métodos usuais de concentração, formação de sais ou de ácidos livres, cromatogra-fia, precipitação e ou cristalização, tal como é exemplificado abaixo.

Na forma usual de levar a cabo a fermentação, é em primeiro lugar preparado um inoculo através de raspagem das células vegetativas, crescendo num meio adequado, em garrafas de Roux ou em planos inclinados os quais foram inoculados com Actinomadura sp. ATCC 55080. As células vegetativas resultantes são por sua vez usadas para inocular balões de agitação ou recipientes de inoculação, contendo igualmente um meio de crescimento adequado. Alternativamente, os recipientes para inoculo são inoculados a partir dos frascos de agitação. Passado um período de crescimento adequado (geralmente 120 a 144 horas em frascos de agitação e 168 a 196 horas em recipientes para inoculo), um fermentador, contendo igualmente um meio de crescimento adequado, é inoculado sob condições assépticas num caldo vegetativo dos frascos ou dos recipientes de inoculo. Após o crescimento ter sido completado (geralmente cerca de 120 a 196 horas), o composto antibiótico é recuperado na sua forma em bruto, como desejado, através de qualquer um dos métodos atrás descritos de um modo geral, ou através de métodos específicos os quais são exemplificados a seguir. 0 composto de fórmula (I) é testado in vitro através dos métodos padrão para determinar a actividade antibacteriana nos quais são medidas as concentrações de mínimos inibitórios (MIC'S) em mcg/ml contra um ou mais microorganismos. Tal procedimento é o recomendado pelo International Collaborative Study on Antibiotic Sensitivity Testing (Ericson and Sherris, Acta. Patholoqica et Microbioloqia Scandinav Supp. 217, secção B: 64-68 [1971]), e emprega agar de infusão de cérebro-coração (BHI) e um dispositivo de replicação de inóculos. São diluídos 100 vezes tubos de crescimento de uma dia para o outro para serem usados como o inoculo padrão (20.000 - 100.000 células em aproximadamen-te 0,002 ml. São postas na superfície de agar; 20 ml. de BHI agar /prato). Doze diluições de 2 vezes do composto teste são empregues, sendo a concentração inicial da droga teste de 200 mcg/ml. As colónias simples não são tomadas em consideração quando se faz a leitura dos pratos passadas 18 horas a 37 graus C. A suscepti-bilidade (MIC) do organismo teste é aceite como a concentração mínima do composto capaz de produzir a inibição completa do crescimento quando apreciada a olho nu. Tal como outros antibióticos do éter policíclico, o presente composto de fórmula (I) revela tipicamente actividade antibacteriana Gram positiva, bem como actividade contra a Treponema hvodvsenteriae (o agente causador da disenteria dos suínos). A eficácia dos dados para o composto de fórmula (I) e os seus sais contra as infecções coccídicas nas galinhas é obtida através do método seguinte. Grupos de 3 a 5 frangos leghorn brancos com dez dias de idade sem doença são alimentados com uma dieta de farelo com água contendo o composto (I) ou o seu sal de sódio e ou de potássio uniformemente aí disperso. Após estarem com esta racção durante 24 horas cada frango é inoculado per os com oócistos da espécie de Eimeria a ser testada em particular. Outros grupos de 3 a 5 galinhas de dez dias de idade são alimentadas com uma dieta de farelo com água semelhante sem o composto (I) ou os seus sais. São igualmente infectadas após 24 horas e servem de controles infectados. Ainda outro grupo de 3 a 5 frangos de dez dias de idade são alimentados com a mesma dieta de farelo com água sem antibiótico e não são infectados com coccí-dios. Estas servem de controles normais. Os resultados do tratamento são avaliados após cinco dias no caso da E. acervulina. e seis dias para as outras ensaios. 0 critério usado para medir a actividade anticoccídica consiste nos resultados de lesão de 0 a 4 para a E. tenella segundo J. E. Lynch., "A New Method of the Primary Evaluation of Anticoccidial Activity", AM. J. Vet. Res., 22, 324-326, 1961; e 0 a 3 para as outra espécies baseado nas modificações do sistema de resultados descoberto por J. Johnson e W. H. Reid, "Anticoccidial Drugs. Lesion Scoring Techniques in Battery and Floor Pen Experiments in Chicks", Exp. Parasit.. 28. 30-36, 1970. A actividade é medida dividindo o valor do resultado da lesão de cada grupo tratado pelo valor do resultado da lesão do controle infectado. Neste teste, por exemplo, o composto (I) e os seus sais catiónicos exibem actividade contra as infecções Eimeria tenella. E. acervulina, E. maxima e E. necatrix das aves quando incorporada na dieta de farelo com água de frangos com níveis de cerca de 30 a 60 ppm. O presente composto de fórmula (I) é também geralmente útil em combinação com outros agentes anticoccídicos conhecidos, tais como a nicarbazina, a 4,4/-dinitrocarbanilida ou -17- a naftalenamina, tal como é definido por Hamill et al., na patente U.S. 4.582.822.

Para a prevenção e o controle da coccidiose nas aves, o composto desta invenção é administrado oralmente às aves num veículo adequado. Convencionalmente, a medicação é simplesmente administrada na água de beber ou na alimentação das aves, de modo a que a dosagem terapêutica do agente seja ingerida com a água ou com a racção para aves diária. 0 agente pode ser directamente introduzido na água bebível, preferentemente sob a forma de um líquido concentrado; ou junto directamente á alimentação como tal, ou, mais comumente, acrescentado á alimentação sob a forma de uma pré mistura ou de um concentrado do agente terapêutico num veículo sólido. O agente terapêutico pode estar numa forma substancialmente pura (por exemplo, o ácido livre, ou um seu sal farmacêuticamente aceitável), ou numa forma em bruto de teste tal como o micélio molhado ou seco ou o caldo todo seco. Os veículos adequados são sólidos ou líquidos, se assim for desejado, tais como a água, várias farinhas (por exemplo), farinha de óleo de soja, farinha de óleo de linhaça, farinha de espiga de milho) e misturas minerais tais como as que são comumente empregues na alimentação das aves. Um veículo particularmente eficaz é a alimentação das aves em si mesma; Isto é, uma pequena porção de alimento para aves. 0 veículo facilita a distribuição dos materiais efectivos na alimentação final com a qual a pré mistura é misturada. Isto é importante porque apenas pequenas porções do presente agente potente são requeridas. É importante que o composto seja completamente misturado na pré mistura e, subsequentemente, no alimento. A este respeito, o agente pode ser dispersado ou dissolvido num veículo oleoso adequado tal como óleo de soja, óleo de milho, óleo de semente de algodão, e outros semelhantes, ou num solvente orgânico volátil e de seguida misturado com o veículo. Deverá ser tomado em consideração que as

proporções do material activo no concentrado: . são capazes de grandes variações desde que a quantidade de agente na alimentação final possa ser ajustada através da mistura da proporção apropriada de pré mistura com o alimento para obter um nível desejado de agente terapêutico.

Concentrados altamente potentes são misturados pelo fabricante do alimento com um veículo proteico tal como óleo de soja e outros alimentos, tal como foi descrito atrás, para produzir suplementos concentrados os quais são adequados para a serem adinistrados directamente na alimentação das aves. Nestas circunstâncias, as aves podem consumir a dieta usual. Alternativamente, estes suplementos concentrados são acrescentados directamente á alimentação das aves para produzir uma alimentação nutricional equilibrada, e acabada contendo um nível terapêuticamente eficaz do composto desta invenção. As misturas são completamente misturadas através dos procedimentos usuais, tais como numa misturadora de duplo revestimento, para assegurar a homogeneidade. Para o uso em aves, os níveis de uso do composto aqui descrito variarão sob diferentes circunstâncias. Medicação continuada de baixo nível, durante o período de crescimento; Quer dizer, durante as primeiras 5 a 12 semanas para os frangos, constitui uma medida profilática eficaz. No tratamento das infecções estabelecidas, os níveis mais elevados podem ser necessários para ultrapassar a infecção. 0 nível usual do composto (I) na alimentação será geralmente na gama de cerca de 10 a 100 ppm. Quando administrado na água bebível, o nível será o que fornecer a mesma dose diária de medicação tendo como factor a relação do peso da média diária de consumo de alimento á média diária de consumo de água. A actividade do composto de fórmula (I) e dos seus sais na promoção e no crescimento ou aumento de eficiência da utilização dos alimentos nos suínos ou no gado. pode ser medido directamente através dos grupos de animais submetidos ao teste de alimentação com vários níveis do composto (I) ou um sal na alimentação. Alternativamente, as especificações da patente Britânica ns 1.197.826 descrevem em pormenor um método do rumen in vitro para a avaliação dos antibióticos nos alimentos.

Para o uso na prevenção ou no tratamento da disenteria dos suínos, ou na promoção do crescimento e ou aumento de eficiência da utilização dos alimentos em gado ou suínos o composto de fórmula (I) ou de um seu sal é preferentemente administrado sob a forma de um aditivo alimentar. Os alimentos preparados de acordo com os métodos inteiramente análogos àqueles descritos atrás para a preparação de alimentos para as aves, com a mesma preocupação para produzir alimentos nos quais o agente terapêutico é uniformemente dispersado. 0 nível usual do composto (I) na alimentação do gado ou dos suínos estará geralmente na gama de cerca de 1 a 100 ppm. Nos ruminantes o composto de fórmula (I) pode também ser administrado oralmente sob a forma de uma pílula grande (bolus) a qual é retida no saco rumenoreticular, libertando o agente terapêutico numa gama substancialmente constante num período de tempo prolongado, por exemplo, 4 a 8 semanas, fornecendo uma dose equivalente àquela da dose diária atrás referida na alimentação, i. e.: dose diária média = 10 a 100 x alimentação diária média em miligramas ppm consumo em Kg. A presente invenção é ilustrada através dos seguintes exemplos. No entanto, deverá ser entendido que a invenção não está limitada aos detalhes específicos destes exemplos. EXEMPLO 1

Fermentação da Actinomadura sp. ATCC 55080

Isolamento do Antibiótico de Fórmula (I) sob a forma de um Sal de Sódio A espécie Actinomadura era inicialmente desenvolvida em meios sólidos de inoculação em planos inclinados ou em frascos de Roux inoculados com uma cultura de ATCC 55080 usando o meio de cultura N2 172, e tendo a composição que se segue.

Gramas/litro

Glucose 10

Amido Solúvel 20

Extracto de Levedura 5

Hidrolizado Enzimático de Caseína 5

Carbonato de Cálcio 1 Água Destilada a 1000 ml; pH a 7,0 com KOH; Agar acrescent. 20

Entretanto, foram preparados frascos de 300 ml em agitação usando em cada frasco 100 ml de um ou de outro dos seguintes meios : -21- i

C'

Gramas/litro JDYTT Gramas/litro

Cerelose 10 Cerelose 10 Farinha de Soja 10 Amido de milho 5 Sólidos de Fermentação do Milho 5 Licor de milho em infusão 5 Amido de Milho 10 Hidrolizado 5 Enzimãtico de Caseína Cloreto de Sódio 5 Cloreto de Cobalto 0 Cloreto de Cobalto 0,002 Carbonato de Cálcio 3 Carbonato de Cálcio 1

Os frasco de agitação contendo o meio foram seguidamente esterilizados a 120°C. e a 15 p.s.i. durante 30 minutos. Após arrefecimento, o meio foi inoculado com uma suspensão de células vegetativas raspada da cultura em plano inclinado de Actinomadura sp. atrás referida. Os frascos foram agitados a 28°C. numa batedeira tendo um deslocamento de 1,5 a 2,5 polegadas de 150 a 200 ciclos por minuto (CPM), durante quatro ou cinco dias.

Entretanto, frascos de fermentação de 5 litros foram preparados contendo 3 litros de um dos C' atrás referidos ou um dos meios JDYTT ou o seguinte meio: UK1-2

Gramas/litro

Cerelose 45

Farinha de Soja 10

Licor de milho em infusão 10

Cloreto de Cobalto 0,002

Sulfato de Magnésio 0,10

Carbonato de Cálcio 3

Sulfato de Manganês 0,10

Um agente anti espuma (polipropilenoglicol, P 2000, contendo 10% de óxido de etileno por peso, 1 ml) foi acrescentado, e os frascos foram selados e esterilizados a 120°C. e 15 p.s.i. durante 1 hora. Os vasos foram então inoculados com um frasco de agitar (o conteúdo de um frasco de agitar) (ca 3% de inoculo), e postos a fermentar durante 120 a 168 horas a 30°C., agitados a 1700 rotações por minuto (RPM) com uma gama de ar de um volume de ar por volume do líquido por minuto.

Quando a fermentação ficou completa (com base num disco teste de antibiótico contra B. subtilis ATCC 6633) os fermentos foram parados e filtrados a um pH neutro com a ajuda de terra diatomãcea. 0 bolo do filtro foi misturado em metanol, concentrado in vacuo. diluído com 2 a 3 volumes de água e de seguida extraído 2 x com 1/3 a 1%2 do volume quer da metil-isobutilo cetona ou do n-butanol. A camada solvente foi separada a partir da fase aquosa através de aspiração ou de centrifugação, borbulhada e concentrada in vacuo. para dar origem ao antibiótico de fórmula (I) em bruto sob a forma de um óleo viscoso. A bio-actividade do caldo e as correntes de recolha subsequentes podem ser seguidos usando uma estirpe sensível de

Bacillus subtilis ATCC 6633 ou Staphvlococcus aureus ATCC 6538. Os componentes no caldo e as correntes de recolha podem ser visualizados através cromatografia de camadas finas (tlc) usando gel de sílica Analtech empregando os pratos GF acetato de etilo como eluente. Os pratos desenvolvidos são pulverizados com reagente de vanilina (3 g de vanilina em 75 ml de etanol e 25 ml de ácido fosfórico a 85 %) e aquecidos a 80°C. 0 produto antibiótico de fórmula (I) aparece como uma mancha de cor vermelha. 0 prato tlc desenvolvido pode também ser coberto com agar semeado quer com S. aureus quer com B. subtilis ao qual foi acrescentado cloreto monohidrato de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio e incubado a 37°C. durante 16 horas para vizualizar o antibiótico (manchas brancas num fundo cor de rosa).

Aumentos graduais, foram levados a cabo em recipientes grandes de fermentação através da preparação em frascos de agitação contendo 0,7 litros de meio C' ou de meio JDYTT. 0 inóculo dos frascos de agitação foi posto a fermentar durante 5 a 7 dias a 28°C., e foi usado para inocular um vaso de fermentação de 200 litros contendo 100 litros de meio JDYTT, respectivamente. A fermentação após ter ocorrido durante 7 a 10 dias, foi colhida. A totalidade do caldo foi extraída com 33 litros de metil isobutil cetona com pH neutro. 0 extracto orgânico foi separado num separador alfa DeLavale e foi concentrado sob vácuo para dar origem ao antibiótico no estado bruto de fórmula I sob a forma de um óleo. O óleo foi cromatografado em gel de sílica e eluído primeiro em hexano, depois com CH2C12, e finalmente com acetato de etil. Fracções contendo o produto foram combinadas e recroma-tografadas usando CHC13/acetona como eluente e removidas para dar origem ao antibiótico de fórmula (I) no estado bruto. 0 antibiótico no estado bruto foi retirado com clóroformio, extraído com ácido fosfórico diluído e de seguida com um fosfato tampão de pH 9,0. A fase orgânica foi seca (Na2S04), retirada, e o -24- 1

resíduo foi cristalizado a partir do éter diétilico/hexano e seco sob alto vácuo para render 350 mg do antibiótico de fórmula (I) na forma do seu sal de sódio; ponto de fusão 160-162°C; [alfa]25D = +16,3° (c = 1, CH3 OH).

Análise Calculada para C^QH850 _Na:C, 62,58; H, 9,04.

Encontrado: C, 62,16; H, 9,25 l3C NMR CDC13 ppm (ns de H ligados entre parênteses): 180, 60 (0), 106 ,70 (0) , 99 ',53 (0), 98 ,47 (0), 96,61 (1), 94,74 (1), 88,74 (1), 84,59 (1), 84,09 (0), 83,85 (D , 83,20 (0), 80,77 (1), 80,46 (D, 80,25 (0), 80,25 (D, 79,64 (1) , 74,33 (1), 73,72 (D, 67,48 (D, 61,70 (3), 61,47 (D , 60,30 (3) , 59,88 (3), 58,96 (3), 56,81 (3), 46,26 (1), 45,97 (1), 45,35 (D , 40,74 (D, 39,34 (1), 33,85 (D, 32,66 (2), 31,89 (2), 31,14 (2) , 29,94 (2), 28,95 (2), 28,25 (3), 27,69 (2), 26,69 (3), 25,75 (2) , 24,36 (2), 22,52 (3) / 18,52 (3) / 13,24 (3), 12,59 (3), 12.03 (3) , 11,55 (3), 11,49 (3) e 10,02 (3) . IV (KBr) cm 1: 1610 (C02 ) EXEMPLO 2

Composto (I) sob a Forma de um Ácido Livre A forma de ácido livre do antibiótico de fórmula (I) foi preparada agitando-se vigorosamente uma solução de clorofórmio do sal de sódio com um volume igual de ácido clorídrico com o pH 3 num funil separador. As fases foram separadas, e a camada de clorofórmio foi lavada com água e de seguida foi evaporada sob vácuo para originar o ácido livre; ponto de fusão 109-111°C; [alfa]25D = +19,3° (c = 1, CH3 OH); IR (KBr)cm"1 :1700 (C02H).. EXEMPLO 3

Composto (I) sob a Forma de um Sal de Rubídio _para a Cristoloqrafia de Raios X A forma de ácido livre do Exemplo precedente (70 mg) foi dissolvido em 100 ml de CHCl^. Foi acrescentado carbonato de rubídio (150 mg em água) e a mistura resultante foi vigorosamente agitada num funil separador. A fase orgânica foi separada, lavada com água, e evaporada para dar origem ao produto em título sob a forma de ura sólido branco. Este foi recristalizado através de evaporação lenta a partir do éter /hexano (3:1). Uma análise de raios X de um único cristal feita pelo Dr. J. Border indicou que o antibiótico da presente invenção era de estéreoquimicidade relativa de fórmula (I) tal como foi descrito atrás.

Claims (2)

1. Reivindicações lâ_ -processo para a preparação de um composto com a fórmula OU·

   no qual Me representa CH3, caracterizado pelo facto de a Actinomadura sp. ATCC 55080, ou um seu mutante ou uma sua forma recombinada, ser posta a fermentar sob condições aeróbicas submersas num meio nutriente aquoso incluindo uma fonte assimilável de carbono e de azoto, até se formar uma quantidade recuperá-vel do referido composto. 2â - processo de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado por incluir adicionalmente o passo de separação do referido composto do meio de fermentação. 3 a - Processo de acordo com a Reivindicação 2 caracterizado por o referido passo de separação compreender a filtração referido do meio de fermentação e a recuperação da' mistura do composto e micélio. 4â - Processo de acordo com a Reivindicação 2 caracte-rizado por o referido passo de separação compreender a secagem por pulverização ou a secagem por congelamento do referido meio de fermentação e a recolha do composto referido no estado bruto. 5a - Processo de acordo com as Reivindicações la 4 caracterizado por compreender a fermentação da Actinomadura sp. ATCC 55027. 6 - - Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 5 caracterizado por compreender adicionalmente o passo de conversão do composto referido num seu sal catiónico farmacêuticamente aceitável. 7â - Processo de acordo com a Reivindicação 6 caracterizado por o sal catiónico referido ser um sal de sódio ou de potássio. 8 â - Método para promover o crescimento ou o aumento da eficiência da utilização da alimentação nos suínos ou no gado caracterizado por se administrar aos suínos ou ao gado um promotor de crescimento ou uma quantidade que aumenta a eficiência da utilização da alimentação do composto com a fórmula -28-OW.

   no qual Me representa CH^, ou um seu sal catiónico farmacêuticamente aceitável. 9§ - Método para prevenir ou para tratar a desinteria nos suínos caracterizado por se administrar aos suínos um composto com a fórmula t

   ou·

   no qual Me representa CH„ , , . - . - Λ . . ^ ^ 3, ou um seu sal cationico farmaceutica- mente aceitável, numa quantidade eficaz para prevenir ou para tratar a desinteria nos referidos suínos.
2. 103 - Método para prevenir ou para controlar as infec-ções coccídícas nas aves caracterizado por se administrar às aves uma quantidade eficaz de um anticoccidica de um composto com a fórmula i • 1 r • 1 r

   no qual Me representa CH^, ou um seu sal catiónico farmacêuticamente aceitável. llã _ Método de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8 a 10 no qual o referido composto se encontrar na forma do seu sal de sódio ou de potássio. ^ Lisboa, 3 de Outubro de 1991

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