PT99049A

PT99049A - Processo para melhorar o rendimento e a meia-vida de proteinas heterologas produzidas pela streptomyces lividans e de preparacao de meios complexos

Info

Publication number: PT99049A
Application number: PT99049A
Authority: PT
Inventors: Mary Ellen Brawner; Edward J Arcuri; Mary Jo Donovan; Robert G Gerber; John A Keller
Original assignee: Smithkline Beecham Corp
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-25
Publication date: 1992-08-31
Also published as: IE913347A1; CA2090965A1; US5223418A; JPH06501390A; AU8715891A; EP0550626A4; WO1992006175A1; NZ239898A; MX9101259A; EP0550626A1; AU653178B2; ZA917558B

Description

73 140 SBC 14538 -2-

MEMORIA DESCRITIVA

Campo do invento O presente invento refere-se a um processo de melhoramento de rendimento e a vim processo de melhoramento da meia-vida de uma proteína heteróloga produzida por Streptomvces Lividans e de um meio complexo*.

Antecedentes do invento

Mostrou-se que a Streptomyces Lividans possui vim potencial como sistema microbiano útil para a expressão eficaz de proteínas heterólogas. S. Chang e S. Chang, "Secretion of Heterologous Pro-teins in Streptomvces lividans". Biology of Actinomycites, 1988, Y. Okamia, T.‘ Bepper, e Ogawara, Eds. (Japan Scientific Societies Press, Tokyo, 1988). No entanto, a expressão de proteínas heterólogas é limitada em alguns sistemas microbianos, tais como s. lividans. devido à instabilidade das proteínas.

Num esfórço para aumentar os rendimentos de proteínas expressas e segregadas por bactérias, têm-se explorado variações no conteúdo do meio de fermentação. Exploraram-se os efeitos de várias variações do meio, quimicamente definidas,, sobre a produção de actividade proteolítica extracelular para S. aureofa-ciens não recombinante. C. LaLuce e R. Molinari, "Selection of A Chemically Defined Médium For Submerged Cultivation of Streptomvces aureòfaciens with High Extracellular Caseinolytic Activi-ty", Biotechnology and Bioengineering, Vol. XIX, 1863-1884 (1977). Em LaLuca et al., utilizaram-se vários aminoácidos como fontes de azoto, alguns aumentando a produção de proteases, en- * quanto que outros diminuíram a produção de proteases.

Os rendimentos de proteínas heterólogas expressas por estirpes recombinántes tais como a S. lividans TK 24, são por vezes reduzidos pela acção de proteases. Werner Aretz, Klaus P. Koller e Gunther Riess, "Proteolytic Enzymes from Recombinant Streptomyces lividans TK24" FEMS Microbiology Letters, 65:31-36 (1989). Aretz et al. descrevem a adição de iões metálicos ao meio de cultura pára inibir certas proteases aumentando assim o rendi-

73 140 SBC 14538 [ -3- mento de proteínas heterólogas.

Foram descritas outras tentativas para definir os efeitos do meio sobre a expressão de um gene heterólogo por Philippe Dehot-tay et al.f "Cloning And Amplified Expression In Streptomyces li-vidans of A Gtene Encoding Extracellular j8-lactamase from Streptomyces albus. G", Gene, 42:31-36 (1986). Têm-se utilizado casaminoácidos para suplementar meios mi-crobiológicos. Mostrou-se que os casaminoácidos funcionam como promotores do crescimento em leveduras não recombinantes quando adicionados a um meio isento de casaminoácidos. J. R. Ludwig II, S. G. 01iver*e C. S. McLaughlin, "The Effect of Amino Acids on Growth and Phosphate Metabolism in a Prototrophic Yeast Strain", Biochemical ahd Biophysical Research Communications, Vol. 79, No. 1, 16-23 (1977).

Mostrou-se que havia um efeito repressivo dos casaminoácidos sobre a produção de exoproteases nas primeiras fases da fermentação de Pseudomonas aeruaenosa. Michael A. Whooley, John A. 0/Callaghan e Aiden J. McLoughlin, "Effect of Substrate on The Regulation of Exoprotease Production by Pseudomonas aeruaenosa ATCC 10145", Journal of General Microbiology, 129(4) 981-988 (1983).

Em comparação, E. Strydom et al., em "Detection and Charac-terization of Extracellular Proteases in Butyrivibrio fibrisol-vens H17C", Appl* Microbiol. Biotechnol, 24:214-217 (1986) mostrou que a produção de proteases era máxima num meio com casaminoácidos. Similarmente, mostrou-se que um digerido tríptico de caseína aumenta a actividade proteolítica na E. chrvsanteoni. C. Wandersman, T. Andro e Y. Bertheau, "Extracellular Proteases in Erwinia çhrysantemi", Journal of General Microbiology, 132:899-906 (1986). Adicionalmente, os casaminoácidos adicionados a um meio completo aumentaram a produção de proteases de Vibrio gazoaenes. C. Ratcliffe et al. "Amylase and Protease Secretion by The Marine Bacterium Vibrio gazogenes", A. J. Biol. Sei., 35:457--67 (1982).

73 140 SBC 14538 Várias formulações de meios complexos, algumas incluindo casaminoácidQs, melhoraram a produção dos produtos de leveduras recombinantes. S. J. Copella e Prasad Dhurjati, "a-Factor Direc-ted Expression of The Human Epidermal Grouth Factor in Saccha-romvces cerevisiae". Biotechnology and Bioengineering, 33:976-83 (1989). A adição da combinação, glucose e casaminoácidos, a um meio totalmepte definido onde a E. coli deve sintetizar, entre outros, aminoácidos, vitaminas e nucleótidos, aumentou o nível de produção de uma proteína heteróloga. G. K. Whitney, B. R. Glick e C. W. Robinsòn, "Induction of T4 DNA Ligase In A Recombinant Strain of E. Coli". Biotechnology and Bioengineering 33:991-998 (1989). Durante a fase terminal da cultura, mostrou-se que a adição de uma mistura de álcool e/ou aminoácido, solúvel em água, melhora o rendimento de uma proteína heteróloga tal como iFN-alfa, IFN-beta e IL-2, produzida por bactérias recombinantes. Patente dos E.U. 4 656 132.

Mostrou-se também que os casaminoácidos diminuem o rendimento de um proteína recombinante numa estirpe de Streptomvces. T. Erpicum et a-1., "Enzyme Production by Genetically Engineered Streptomvces Strains: influence of Culture Conditions", Biotechnology and Bioengineering, 35:719-726 (1990).

Sumário do invento 0 presente invento refere-se a um processo de melhoramento do rendimento] de proteínas heterólogas produzidas por culturas de Streptomyces lividans recombinante num meio nutriente líquido compreendendo, a adição de uma quantidade eficaz de casaminoácidos ao meio. 0 presente invento refere-se ainda a um meio complexo compreendendo glucose, peptona de soja, extracto de levedura, CaC03 e CoCla. Preferivelmente, os meios podem ser suplementados com uma quantidade eficaz de casaminoácidos. 0 presente invento refere-se ainda a um processo de melhoramento da meia-vida de proteínas heterólogas num sobrenadante de uma cultura substancialmente isento de células,

73 140 SBC 14538 sendo as referidas proteínas heterólogas produzidas por cultura de Streptomyces lividans recombinante, compreendendo a adição de uma quantidade eficaz de casaminoácidos ao sobrenadante.

Breve descrição das ficruras A fig. 1 é uma fotografia de um gel que mostra os níveis extracelulares aumentados de SCD4 num meio EI com carbonato de cálcio (1) e num meio EI sem carbonato de cálcio (2) versus TSB. O gel representa 11 a 69 horas de fermentação.

As figuras 2(a) e (b) são fotografias de geles que mostram a acumulação extracelular de sCD4 em EI sozinhos e em EI + CAA a 5%, em MBSM + CAA a 1% e em MBSM + CAA a 5%. As horas de fermentação estão mostradas no topo dos geles. A fig. 3 é uma fotografia de um gel que descreve a quebra de acumulação extracelular de V1J4 em MBSM sozinho e de acumulação extracelular de V1J4 quando se adicionaram 1% e 5% de CAA ao MBSM. 0 gel representa 21 a 89 horas de fermentação. A fig. 4 é uma fotografia de um gel que descreve uma acumulação extracelular de VIJ4 em EI + CAA a 5% (C) maior do que em TBS (A) ou em EI sozinho (B). O gel representa 16 a 65 horas de fermentação. A fig. 5 é um gráfico do tempo versus concentração de V1V2 em TSB sozinho, em ME1 + CAA a 5% e em ME1 + CAA isento de sais a 5%.

Descricão detalhada do invento 0 termo "heterólogo", quando utilizado no presente invento, refere-se a polipéptidos não produzidos por bactérias S. lividans do tipo selvagem. Os péptidos heterólogos sCD4 e os derivados de sCD4 são preferidos no presente invento.

Foi descrita uma sequência de ADNc do receptor CD-4 humano (Maddon, et al., Cell 43:93 (1985). A sequência da pré-proteína CD-4 completa possui 458 aminoácidos de comprimento compreendendo

73 140 SBC 14538 os domínios de comando de secreção de 23 aminoácidos putativos, de superfície de 372 aminoácidos (V-l-V^, transmembranar de 23 aminoácidos e citoplasmático de 40 aminoácidos. A sCD4 é um derivado solúvel da CD-4 a que falta os domínios transmembranar e citoplasmático da CD-4. 0 termo "derivado de sCD4", quando utilizado no presente invento, refere-se a derivados como os definidos no pedido de patente dos E.U. na. de série 160 463 comummente reconhecido, depositado em 24 ,de Fevereiro de 1988, o qual se incorpora como referência, como se estivesse completamente descrito no presente invento. Ver também Arthos et al., "Identification of the Residues in Human CD4 Criticai for the Binding of HIV", Cell, 57:469-81 (1989). Geralmente, estes derivados compreendem adições, delècções ou substituições, alterações estas que não afectam adversamente, de modo significativo, a secreção da proteína para o meio condicionado e a afinidade da proteína para a proteína env de HIV, i.e., gp 120. Por exemplo podem ser adicionados um ou alguns aminoácidos, ou podem sofrer delecção da extremidade N ou C. Ou pode-se inserir, submeter a delecção ou substituir um ou alguns aminoácidos, preferivelmente não mais do que quatro ajninoácidos, por aminoácidos internos. Alternativamente, pode-se construir uma proteína híbrida, i.e., uma fusão de tradução, entre a sCD4 e uma proteína transportadora, outro antigénio ou outras moléculas de sCD4 para preparar uma molécula de poli-sCD4. Ainda noutra alternativa, pode-se conjugar sinteticamente a sCD4 com uma molécula transportadora.

Os deriyados de sCD4 incluem, mas não estão limitados a, V1V2 e V1J4. A VIJ4 possui os aminoácidos (-)2-104 (N-glutamina--glicina-lisina- até alanina-asparagina-serina-C) fundidos aos aminoácidos 351-369 (-glicina-glutamina-valina- até -treonina--prolina-valina-C). A V1V2 possui os aminoácidos 1-183 (N-lisina--lisina-valina- até -lisina-alanina-serina-C). O pedido copendente de patente dos E.U. nB. de série 160 463, depositado em 24 de Fevereiro de 1988, descreve um processo para a expressão de proteínas sCD4 pela Streptomvces lividans. Geralmente, estas fusões utilizam as sequências de sinal LTI (ver a EP-A-264 175 -7- 73 140 SBC 14538 publicada em 20 de Abril de 1988) e de Bgal (Eckhardt, et al., J. Bacteriol, 169:4249-4256 (1987)) e Brawner, et al., (Patente dos E.U.A. 4 717 666) para dirigir a secreção de sCD4 para o sobrenadante da cultura. A sequência de codificação da sCD4 é fundida a um local dentro da região de codificação do LTI madura ou da proteíjia Bgal para conservar o local de clivagem da sequência de sinal que se espera que assegure um processamento e uma secreção das proteínas de fusão sCD4 precisos. Espera-se que qualquer processo pelo qual sejam expressos a sCD4 e os seus derivados pela S. lividans. seja útil neste invento. A bactéria recombinante. Streptomvces lividans, utilizada neste invento, pode-se preparar por técnicas de ADN recombinante conhecidas. Estas técnicas envolvem, tipicamente, (1) clonar um gene estrutural sintético ou um gene estrutural de origem genómica que codifica o polipéptido heterólogo num vector de expressão virai ou plasmídico apropriado, num local que permita a sua expressãof (2) introduzir o vector em bactérias competentes, e (3) seleccionar as células recombinantes (também chamadas "transformantes") por uma função marcadora do plasmídeo ou pela sua capacidade para produzirem o polipéptido heterólogo.

Uma sequência de codificação de ADN e a sequência de aminoácidos da sCD4 estão ilustradas abaixo. 10 30 50

CAAGCCCAGAGCCCTGCCATTTCTGTGGGCTCAGGTCCCTACTGCTCAGCCCCTTCCTCC 70 90 110

CTCGGCAAGGCCACAATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAA

MetAsnArgGlyValProPheArgHisLeuLeuLeuValLeuGln 130 150 170 CTGGCGCTCCTCCCAGCAGCCACTCAGGGAAAGAAAGTGGTGCtGGGCAAAAAAGGGGAT LeuAlaLeuLeuProAlaAlaThrGlnGlyLysLysValValLeuGlyLysLysGlyAsp -9 -1 +1 190 210 230 ACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGGAAAAAC ThrValGluLeuThrCysThrAlaSerGlnLysLysSerlleGlnPheHisTrpLysAsn 250 270 290 TCCAACCAGATAAAGATTCTGGGAAATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAG SerAsnGlnlleLysIleLeuGlyAsnGlnGlySerPheLeuThrLysGlyProSerLys -8- 73 140 SBC 14538 310 330 350 CTGAATGATCGCGCTGACTCAAGAAGAAGCCTTTGGGACCAAGGAAACTTCCCCCTGATC LeuAsnAspArgAlaAspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsnPheProLeuIle 370 390 410 ATCAAGAATCITAAGATAGAAGACTCAGATACTTACATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAG IleLysAsnLeuLysIleGluAspSerAspThrTyrlleCysGluValGluAspGlnLys 430 450 470 GAGGAGGTGCAATTGCTAGTGTTCGGATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTCAG GluGluValGlnLeuLeuValPheGlyLeuThrAlaAsnSerAspThrHisLeuLeuGln 104 490 510 530 GGGCAGAGCCTGACCCTGACCTTGGAGAGCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGT GlyGlnSerLeuThrLeuThrLeuGluSerProProGlySerSerProSerValGlnCys 550 570 590 AGGAGTCCAAGGGGTAAAAACATACAGGGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAG ArgSerProArgGlyLysAsnlleGlnGlyGlyLysThrLeuSerValSerGlnLeuGlu 610 630 650 CTCCAGGATAGTGGCACCTGGACATGCACTGTCTTGCAGAACCAGAAGAAGGTGGAGTTC LeuGlnAspserGlyThrTrpThrCysThrValLeuGlnAsnGlnLysLysValGluPhe 151 670 690 710 AAAaTAGACATCGTGGTGCTAGCTTTCCAGAAGGCCTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAG LysIleAspIleValValLeuAlaPheGlyLysAlaSerSerlleValTyrLysLysGlu 183 730 750 770 GGGGAACAGGTGGAGTTCTCCTTCCCACTCGCCTTTACAGTTGAAAAGCTGACGGGCAGT GlyGluGlnValGluPheSerPheProLeuAlaPheThrValGluLysLeuThrGlySer 790 810 830 GGCGAGCTGTGGTGGCAGGCGGAGAGGGCTTCCTCCTCCAAGTCTTGGATCACCTTTGAC GlyGluLeuTrpTrpGlnAlaGluArgAlaSerSerSerLysSerTrpIleThrPheAsp 850 870 890 CTGAAGAACAAGGAAGTGTCTGTAAAACGGGTTACCCAGGACCCTAAGCTCCAGATGGGC LeuLysAsnLysGluValSerValLysArgValThrGlnAspProLysLeuGlnMetGly 910 930 950 AAGAAGCTCCCGCTCCACCTCACCCTGCCCCAGGCCTTGCCTCAGTATGCTGGCTCTGGA LysLysLeuPrbLeuHisLeuThrLeuProGlnAlaLeuProGlnTyrAlaGlySerGly 970 990 1010 AACCTCACCCTGGCCCTTGAAGCGAAAACAGGAAAGTTGCATCAGGAAGTGAaCCTGGTG AsnLeuThrLeUAlaLeuGlyAlaLysThrGlyLysLeuHisGlnGluValAsnLeuVal 1030 1050 1070 GTGATGAGAGCCACTCAGCTCCAGAAAAATTTGACCTGTGAGGTGTGGGGACCCACCTCC ValMetArgAIaThrGlnLeuGlnLysAsnLeuThrCysGluValTrpGlyProThrSer 1090 1110 1130 CCTAAGCTGATGCTGAGCTTGAAACTGGAGAACAAGGAGGCAAAGGTCTCGAAGCGGGAG ProLysLeuMetLeuSerLeuLysLeuGluAsnLysGluAlaLysValSerLysArgGlu

73 140 SBC 14538 1150 1170 1190 AAGGCGGTGTGGGTGCTGAACCCTGAGGCGGGGATGTGGCAGTGTCTGCTGAgTGACTCG LysAlaValTrpValLeuAsnProGluAlaGlyMetTrpGlnCysLeuLeuSerAspSer 1210 1230 1250 GGACAGGTCCTGCTGGAATCCAACATCAAGGTTCTGCCCACATGGTCCACCCCGGtgtaa GlyGlnValLeuLeuGluSerAsnlleLysValLeuProThrTrpSerThrProValFim 351 369 1270 tggcgcctctaga

Faz-se então a cultura das Streptomvces lividans que produzem proteínas heterólogas num meio nutriente líquido. O meio nutriente líquido é geralmente compreendido por um excesso de materiais nutrientes convencionais que preenchem as necessidades do ·* crescimento celular da Streptomvces lividans. Os materiais incluem fontes de carbono e de azoto para a síntese de componentes celulares e energia, e minerais (iões), os exemplos incluem enxofre, fósforo, magnésio, potássio e ferro. Podem-se adicionar um ou mais aminoácidos ao meio. O meio nutriente líquido pode ser um meio definido ou complexo.

Os meios nutrientes líquidos preferidos utilizados no presente invento são os meios complexos. Ê particularmente preferido para o melhoramento do rendimento ou da meia-vida de proteínas heterólogas um meio complexo de fórmula: (a) de cerca de 20 a cerca de 30 gramas por litro de glucose; (b) de çerca de 20 a cerca de 50 gramas por litro de peptona de soja; (c) cerca de 1 grama por litro de extracto de levedura; (d) de cerca de 0 a cerca de 1 grama por litro de caC03; e (e) cerca de 1 mg por litro de CoCl2. 0 termo "casaminoácidos11 (CAA), quando utilizado no presente invento refere-se ao hidrolisado ácido de caseína. Uma quantidade eficaz de CAA adicionada ao meio para melhorar o rendimento ou a meia-vida de proteínas heterólogas está na gama de cerca de 1% a cerca de 5% (p/v). Adicionalmente, o CAA pode estar isento de

73 140 SBC 14538 sais (CAA SF J.. O limite superior de CAA é governado por razões económicas e por uma inibição indesejável do crescimento celular. 0 CD4 solúvel e os derivados de sCD4 são segregados pela Streptomyces lividans para o sobrenadante da cultura. Como um primeiro passo no processo de recuperação da proteína prepara-se um sobrenadante da cultura clarificado por centrifugação. Podem-se então purificar o sCD4 e derivados por uma combinação de cromatografiá de afinidade, filtração em gel ou outros processos de purificação de proteínas. É ainda proporcionado pelo presente invento um processo de melhoramento da meia-vida de proteínas heterólogas num sobrenadante de uma cultura substancialmente isento de células, sendo as referidas proteínas heterólogas produzidas por uma cultura de S. lividans recoínbinante, compreendendo a adição de entre cerca de 1 e cerca de 5% (p/v) de casaminoácidos ao sobrenadante. As proteínas heterólogas preferidas são o sCD4 e os derivados de sCD4, como se descreve em detalhe no presente invento.

EXEMPLOS

Materiais e processos Estirpes bacterianas e plasmídeos

Utilizou-se Streptomyces lividans 1326 (Bibb, et al., Mol Gen Genet 184*:230 (1981)) em todos os exemplos descritos abaixo. Os plasmídeos utilizados para expressar a sCD4 e os derivados de sCD4 continham um minigene de sCD4 (pedido de patente dos E.U.A. na. de série T.60 463, depositado em 24 de Fevereiro de 1988) operativamente ligado ao promotor do inibidor de tripsina da Strep-tomvces lonqisporus (LTI) e à sequência de sinal (EP-A-264 175, publicada em 20 de Abril de 1988), assim como às funções de replicação dè plasmídeos da Streptomyces. como se verificou nos plasmídeos pIJ350 e pIJ351 (Kaiser, et al., Mol Gen Genet 185:223 (1982)). Utilizou-se o plasmídeo pLTI:sT4/7 (USSN 160 463, depositada em 24 de Fevereiro de 1988) para a expressão da sCD4. A expressão da VIJ4 foi dirigida pelo plasmídeo pLTI/VlJ4 o qual foi preparado substancialmente como se descreveu para o -11- 73 140 SBC 14538 pLTI:ST4/7. O plasmídeo progenitor usado para o V1V2 foi ο 12B1 e foi construído como se segue: deslocou-se o local de clivagem Bbvl dentro da sequência de codificação para o péptido de sinal de CD4 (entre os nuoleótidos 148 e 149 da sequência de ADN de CD4; Ma-ddon, et al.J Cell 42.:93-104 (1985)) por mutagénese dirigida a local (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492) de modo que o local de clivagem Bbvl ficasse colocado entre os nucleótidos 150 e 151. inseriu-se esta mutação (#1478) num minigene de sCD4 que continha a sequência de codificação para os resíduos de aminoácido 1-129. Transferiu-se um fragmento EcoRI + + HindIII contendo a mutação 1478 do M13mpl8 para o pUC18 para gerar o pUCVlpV2 (1478). Seguidamente à digestão com Bbvl do pUCVlpV2 (1478), este tratou-se com o fragmento Klenow da ADN-polimerase I para completar a sequência de cadeia simples em 5', e depois digeriu-se com HindIII. Clonou-se o fragmento de HindIII de extremidade romba resultante destas manipulações no pLTI450 (USSN 160 463, depositado em 24 de Fevereiro de 1988) o qual tinha sido digerido com Accl, tratado com o fragmento Klenow da ADN-polimerase I e digerido com HindIII. O plasmídeo resultante 12B1/1477, contém um minigene de sCD4 (resíduos de aminoácido 1-129) fundido com a sequência de codificação da sequência de sinal de LTI tal que a proteína V1V2 expressa conterá, na sua extremidade amino, o pró-péptido LTI de 6 aminoácidos mais os resíduos 1 e 2 da proteína LTI madura. Clonam-se um replição de Streptomvces e um marcador seleccionável no 12B1/1477 inserindo o pIJ351 (Kieser, et al., Mol. Gen, Genet. 185:223-238 (1982)) utilizando o único local PstI dentro dos dois plasmídeos. Para criar um minigene de V1V2 completo (resíduos de aminoácido 1-183) dentro do contexto de 12B1/1477, inseriu-se um fragmento Afim + Xbal do DHFR V1V2 183#7 num 12B1/1477 que tenha sido digerido com AflIII e Xbal. O plasmídeo resultante foi ο 12B1.

Transformaram-se os plasmídeos anteriores em Streptomvces lividans usando procedimentos comuns (ver Hopwood, et al., Ge-netic Manipulation of Streptomyces - A laboratory Manual, F. Cro-we & Sons, Ltd., Norwich, England (1985)). Seleccionaram-se os

73 140 SBC 14538 -12- transformantes cobrindo as placas de transformação com ágar a 0,4% contendo 100 μg/ml de tioestreptona.

Quantificação da sCD4 por imunotransferência Separaram-se os sobrenadantes isentos de células e o sCD4 purificado em geles de poliacrilamida a 10% ou 12,5% (acrilamida:bis 30:0,8)dodecilsulfato de sódio (Laemmli, Nature 227:680-685 (1970)), então transferiram-se para nitrocelulose (Towbin, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:4350-4354 (1979)). Processou-se o filtro de nitrocelulose para detectar o sCD4 (Brawner, et al., Gene 40:191-201 (1985)) utilizando antissoro de coelho preparado contra o sCD4. Detectou-se o anticorpo ligado com 125I-proteína A. Quantificou-se a 125I-proteína A ligada (que é proporcional à quantidade de sCD4 presente no filtro de nitrocelulose) utilizando um sistema de imagem radioanalítico Ambis. Determinou-se a concentração de sCD4 para as amostras experimentais incluindo concentrações conhecidas de sCD4 em cada imunotransferência.

Meios

Concentração fg/1 de volume do lote) 17 3 5 2.5 2.5 m TSB Ingrediente

Digerido panoreático de caseína (CAA)

Digerido de papaína de farinha de soja NaCl k2hpo4 Dextrose

Fonte de H20: (desionizada) Dl -13- 73 140 SBC 14538

(2) MBSM

Ingrediente L-Asparagina MgCl2*6H20 CaCl2*2H20 NaCl k2hpo4 kh2po4 FeCl2*6H20 (nh4)2so4

Concentração fg/1 de volume do lote) 2 0,50,01 1 3 0,5 1 mg/1 30

Fonte de H20: Dl Ajustamento do pH: 7,0-7,2

Aditivos: glucose adicionada na concentração final de 3% após a esterilização.

(3) EI

Ingrediente

Glucose

Peptona de soja Extracto de levedura CaCOg CoCl3

Fonte de H20: Dl m ME1

Ingrediente

Glucose

Peptona de soja Extracto de levedura CaCC>3 C°C12

Fonte de H20: Dl Ajustamento de pH: nenhum

Concentração fg/1 de volume do lote) 20 20 1 1 1 mg/1

Concentração fg/1 de volume do lote) 30 50 1 1 1 mg/1

-14- 73 140 SBC 14538

Exemolo 1

Efeito de casaminoácidos sobre a meia-vida da sCD4

Prepararam-se culturas de sementeira para a estirpe de Streptomvces lividans que produz a sCD4, por inoculação de 50 ml de TSB contendo 5 jug/ml de tioestreptona com 5 mg (peso de células secas ou DCW) de micelos congelados. Deixou-se desenvolver ás culturas de sementeira a 28°C durante 30-34 horas utilizando uma placa de agitação Variomag Electronicruhrer de multipontos HP. Colheram-se os micelos através de uma centrifugação de 5 minutos numa centrifugadora Beckman TJ-6 e depois utilizaram-se como inoculo para as fermentações em TSB ou em TSB + 5% de casaminoácidos. Inocularam-se estas fermentações em balão agitado com uma biomassa inicial de 1 grama de células (DCW) por litro de cultura, com um volume final de 200 ml num balão Erlenmeyer de 2 1. Adicionou-se tioestreptona a cada um dos balões de fermentação até uma concentração final de 5 μg/τc^l. Agitaram-se as culturas (300 rpm) a 28°C num agitador giratório New Brunswick Scientific G10.

Em tempos específicos durante o período de crescimento, prepararam-se sóbrenadantes isentos de células por centrifugação como se descreveu anteriormente. Transferiu-se cem ml de sobrena-dante isento de células para um balão Erlenmeyer de 2 1 e agitou-se a 28°C. Tomou-se uma amostra em cada hora durante 4 horas, começando a t=0 horas. Quantificou-se a concentração de sCD4 presente em cada ponto temporal por imunotransferência como se descreveu anteriormente. A velocidade de desaparecimento de sCD4 é igual ao declive da relação de log[sCD4] versus tempo. Calculou-se a meia-vida da sCD4 utilizando as equações seguintes. (1) ln(X/Xo)=rt onde r=velocidade de desaparecimento (2) ln(0,5Xo/Xo)=rt (3) t1//2=-° ,693/r

Resultados; sumarizaram-se na tabela 1 os resultados das experiências da meia-vida da sCD4. No primeiro ponto no tempo ensaiado (6 horas), a estabilidade da sCD4 reflectida nos valores de meia-vida foi aproximadamente a mesma para ambos os meios de

73 140 SBC 14538 fermentação testados (TSB ou TSB + 5% de CAA). No entanto, esta tendência não se notou nos pontos no tempo subsequentes. Em todos os outros pontos no tempo, a meia-vida da sCD4 foi significativamente diminuída nas fermentações em TSB quando comparada com o valor da meia-vida notado para a fermentação em TSB + 5% de CAA comparável apfenas no último ponto no tempo (36 horas), o valor da meia-vida para a fermentação em TSB + 5% de CAA (4,6 horas) apro-ximou-se do ^alor notado na fermentação em TSB comparável (2,9 horas).

Conclusão: os resultados dos estudos indicam que a estabilidade da sCD4 é especificamente aumentada pela inclusão de casaminoácidos no meio de crescimento.

Tabela 1

Meia-vida do sCD4 em fermentações em TSB +/-dos*^· 5% de casaminoáci- Tempo de fermentação TSB TSB + 5% de CAA 6 h 5,1 h 5,7 h 9 h 6,2 h 14,7 h 12 h 4,5 h 19,8 h 24 h 4,1 h 13,1 h 36 h 2,9 h 4,6 h 1 Tomaram-se amostras experimentais em cada hora durante quatro horas.

Exemplos 2-6

Os exemplos 2-6 mostram o desenvolvimento dos meios melhorados para a produção de moléculas relacionadas com a sCD4 na S. lividans. Estes exemplos mostram os resultados de produção para a sCD4 e dois derivados em diferentes meios, em fermentações de 10 1. Os exemplos 2-6 demonstram a superioridade do EI e do ME1, os novos meios descritos no presente invento, sobre o TSB, para melhorar o rendimento da sCD4. Estes exemplos demonstram também que a adição de CAA a ambos os meios, definido ou complexo, resulta num aumento nos níveis de rendimento máximo de

73 140 SBC 14538 -16 várias proteínas relacionadas com a sCD4.

Preparação da cultura de sementeira

Todas as fermentações de 10 1 para estes exemplos foram inoculadas a partir de balões de sementeiras com agitação crescidas em l 1 de cardo de soja tripticase (TSB) ou mbsm (com 5 jug/ml de tioestreptona) em balões Fernbach de 2,8 1 agitados a 170 rpm a 28°C durante de 24 a 48 horas.

Protocolo nara os exemplos realizados à escala de 10 1

Todos os estudos à escala de 10 1 foram realizados em fer-mentadores B^olafitte de 15 1 contendo aproximadamente 10 1 de meio. A temperatura, a pressão posterior e a velocidade de arejamento foram controladas a 28°C, 48,3 kPa (7 PSIG) e 5 litros padrão por minuto (SLPM), respectivamente. O pH foi controlado a 7,0 utilizando NaOH e ácido fosfórico excepto onde estiver indicado em contrário. A velocidade de agitação foi, inicialmente, de 300 RPM. Após a inoculação, permitiu-se que o oxigénio dissolvido (DO) descesse para 20% da saturação? controlou-se então o DO automaticamente a 20% através de um algoritmo de derivada integral proporcional (PID) que acoplou a agitação à concentração de DO. Adicionou-se tioestreptona até uma concentração final de 5 /xg/ml.

Fonte de casaminoácidos

Utilizaram-se casaminoácidos Difco em todas as experiências, excepto onde estiver indicado.

Exemplo 2 Pôs-se em evidência a acumulação de sCD4 em culturas de Streptomyces lividans desenvolvidas em El, EI sem carbonato de cálcio e em TSB.

Protocolo: conduziu-se um controlo experimental à escala de 10 1, como se descreveu anteriormente, em TSB, El com carbonato de cálcio (1), e El sem carbonato de cálcio (2).

Resultados: os níveis extracelulares de sCD4 foram superiores no -17- 73 140 SBC 14538 meio EI aos do melo TSB. (Nota: ambos os meios, TSB e El, são considerados complexos). Além disto, os níveis de sCD4 no TSB declinaram rapidamente após a produção máxima para 17 horas de fermentação, enquanto que os níveis de produção no El permaneceram relativamente constantes durante um período de 30 horas (fig. 1).

Exemplo 3

Efeito dos casaminoácidos sobre a acumulação extracelular de sCD4 em meios complexos e definidos.

Protocolo: nesta experiência a 10 1, monitorizou-se a acumulação extracelular de sCD4 em meios complexo (El) e definido (MBSM) com e sem a adição de CAA. Utilizaram-se cinco meios: (1= El; (2) El + 5% de CAA; (3) MBSM; (4) MBSM + 1% de CAA; e (5) MBSM + 5% de CAA.

Resultados da análise por transferência da Western: no meio complexo (El), a adição de CAA resultou num aumento da acumulação de sCD4 sobre o observado no meio El sem CAA. No meio MBSM, não se observou àcumulação extracelular de sCD4 a não ser quando se adicionou CAA. Também a acumulação extracelular de sCD4 foi superior no meio MBSM + 5% de CAA do que no meio MBSM + 1% de CAA. (Figs. 2(a) e (b)).

Exemplo 4

Acumulação extracelular de V1J4 pela S. lividans desenvolvida no meio definido (MBSM) com 0, 1 ou 5% de CAA.

Resultados da análise por transferência de Western: não se observou acumulação extracelular de V1J4 no meio MBSM simples. A acumulação extracelular de V1J4 em MBSM + 1% de CAA foi mais elevada na amostra tomada 21 horas após a inoculação, e depois diminuiu. Em MBSM + 5% de CAA, como se definiu anteriormente, obser-vou-se um máximo de acumulação de VIJ4 entre 44 e 89 horas após a inoculação e pareceu permanecer razoavelmente constante durante este período (fig. 3).

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Exemplo 5

Acumulação de V1J4 em culturas de s. lividans desenvolvidas em caldo de soja tripticase (TSB), Elf e EI + 5% de CAA.

Resultados da análise por transferência de Western: em TSB (A na fig. 4 )^, como se definiu previamente, observou-se o máximo da acumulação extracelular de VIJ4, 16 horas após a inoculação, e depois diminuiu rapidamente. Em EI (B na fig. 4), como se descreveu previamente, a acumulação extracelular de VIJ4 foi muito inferior à observada em TSB; como em TSB, o máximo de acumulação foi observado] 16 horas após a inoculação, com um rápido declínio nos títulos de V1J4 após este ponto. Em EI + 5% de CAA (C na fig. 4), a acumulação extracelular de V1J4 foi muito superior às observadas tanto em TSB como ei EI (fig. 4).

Exemplo 6

Acumulações extracelulares de V1V2 em TSB, ME1 + 5% de CAA Difco, e ME1 + 5% de HYCASE SF (casaminoácidos isentos de sais de Sheffield products).

Protocolo: quantificou-se a acumulação de V1V2 utilizando um analisador de radio-imagem AMBIS.

Resultados: a acumulação de V1V2 foi mais elevada em ME1 + +SF CAA (aproximadamente 50 mg/ml). Em TSB, os níveis de V1V2 foram máximos para cerca de 35 μg/ml, e em ME1 + CAA Difco, a acumulação májcima foi de 21 μg/ml (fig. 5).

Em sumário, os exemplos 2-6 mostraram que o meio EI é um meio superiof ao TSB para o melhoramento do rendimento de sCD4. No entanto, o meio EI + 5% de CAA (ou o meio estritamente relacionado ME1 + }>% de CAA) é superior tanto ao TSB como ao EI (ou ME1) para o melhoramento do rendimento tanto de sCD4 como de VI. Além disto, a adição de CAA ao meio definido MBSM melhorou signi-ficaticamenté o rendimento do derivado de sCD4. Assim, a adição de CAA teve um efeito positivo significativo sobre o rendimento de proteínas heterólogas produzidas pela S. lividans. 73 140 SBC 14538 -19-

Exemplo 7

Os casaminoácidos prolongam a meia-vida de sCD4 produzida pela S. lividans.

Protocolo: seguindo o procedimento da meia-vida da sCD4 descrito no exemplo 1, determinou-se a meia-vida da sCD4 quando se adicionaram CAA ao sobrenadante da cultura isento de células na altura da conclusão de três fermentações em TSB sem CAA. Colheram-se os sobrenadantes da cultura após 6, 12 e 24 horas de crescimento. Escolheram-se estes tempos porque são amostras representativas das proteínas extracelulares presentes durante a fase de crescimento activa (6 horas), a entrada na fase estacionária (12 horas) e a fase estacionária (24 horas). Removeram-se as células por centrifugação para preparar o sobrenadante isento de células para os estudos da meia-vida. Adicionou-se uma solução de casaminoácidos (concentração final de 5%) a metade do sobrenadante isento de células. Tomaram-se amostras do sobrenadante isento de células para a quantificação da sCD4 após 0, 30, 60, 90 e 120 minutos de incubação a 28°C. Quantificou-se a sCD4 a partir de uma imunotransfèrência utilizando um sistema de imagem radio-analítica Ambis.

Resultados; como está sumarizado na tabela II, a meia-vida da sCD4 após 12 e 24 horas de fermentação aumentou significativamente quando se adicionou uma solução de casaminoácidos ao sobrenadante isento de células. Em contraste, os casaminoácidos não tiveram qualqUer efeito detectável sobre a meia-vida da sCD4 após 6 horas de crescimento.

Tabela II

Tempo dentro do ciclo de crescimento (h) meia-vida da sCD4 fh) -casaminoácidos +casaminoácidos 6 12 20 3 3 2 4,3 >20 >20

Claims

-20- 73 140 SBC 14538 REIVINDICAÇÕES 1 - Processo para melhorar o rendimento proteínas heterólo-gas seleccionjadas de entre o grupo que consiste em sCD4 e derivados de sCD4, produzidas por cultura de Streptomvces lividans re- * combinante num meio nutriente líquido, caracterizado por compreender adicionar entre cerca de 1 e cerca de 5% (p/v) de casaminoácidos ao meio.
2 - Processo de acordo com a reivindicação l# caracterizado por o derivado ser VIJ4.
3 - Processo de acordo com a reivindicação l, caracterizado por o derivado ser V1V2.
4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o meio nutriente líquido ser um meio complexo.
5 - Processo de preparação de um meio complexo, caracterizado por se misturar: (a) cerca de 20 a cerca de 30 gramas por litro de glucose; com (b) cerca de 20 a cerca de 50 gramas por litro de peptona de soja; (c) cerca de 1 grama por litro de extrac- to de levedura; (d) cerca de 0 a cerca de 1 grama por litro de CaC03; (e) cerca de 1 mg por litro de CoCl2.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se misturar ainda: (f) cerca de 1 a cerca de 5% (p/v) de casaminoácido.
7 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o meio complexo ser o meio complexo preparado de acordo com a reivindicação 6.
8 - Processo para melhorar a meia-vida de proteínas heteró-logas num sobrenadante de cultura substancialmente isento de células, sendo as referidas proteínas heterólogas seleccionadas de entre o grupo que consiste em sCD4 e derivados de sCD4 produzidas por cultura de Streptomvces lividans recombinante, caracterizado -21- 73 140 SBC 14538 por compreender adicionar cerca de 1 a cerca de 5% (p/v) de casa-minoácidos ao sobrenadante.
9 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o derivado ser VIJ4.
10 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o derivado ser V1V2.
11 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o meio nutriente líquido ser um meio complexo. >
12 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o meio complexo ser um meio complexo de acordo com a reivindicação 6. Lisboa, 2$ SEI. 1991 Por SMITHKLINE BEECHAM CORPORATION =0 AGENTE OFICIAL= )