JPS62179381A - 高分泌プロテア−ゼ活性の機能を有する微生物の製造方法 - Google Patents
高分泌プロテア−ゼ活性の機能を有する微生物の製造方法Info
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- JPS62179381A JPS62179381A JP1970086A JP1970086A JPS62179381A JP S62179381 A JPS62179381 A JP S62179381A JP 1970086 A JP1970086 A JP 1970086A JP 1970086 A JP1970086 A JP 1970086A JP S62179381 A JPS62179381 A JP S62179381A
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は高分泌プロテアーゼ活性の機能を有する微生物
の製造方法に関するものである。
の製造方法に関するものである。
（発明の背４ｙ、）
一般に、枯草菌は菌体外に分泌するプロテアーゼ量が高
いと言われている。このプロテアーゼの需要量に対して
生産量が不足気味であるととれに、プロテアーゼの／１
：ｆＦコストが高い。
いと言われている。このプロテアーゼの需要量に対して
生産量が不足気味であるととれに、プロテアーゼの／１
：ｆＦコストが高い。
この様な点を解決するために、種々研究が各機関でなさ
れており、特に主流となっているのは、遺伝子操作を用
い、分泌ベクターを作成しくプロテアーゼ分泌能を高め
るための遺伝子）、それを宿主細胞に入れ、分泌能を高
めようとするものである。
れており、特に主流となっているのは、遺伝子操作を用
い、分泌ベクターを作成しくプロテアーゼ分泌能を高め
るための遺伝子）、それを宿主細胞に入れ、分泌能を高
めようとするものである。
（発明が解決しようとする間Ｚ点）
上記のように、プロテアーゼの需要量に応じた生産量を
上げるために、遺伝子繰作を用いた方法が各機関で行な
われようとしているが、機能的に非常に複雑で実現には
至っていない。
上げるために、遺伝子繰作を用いた方法が各機関で行な
われようとしているが、機能的に非常に複雑で実現には
至っていない。
この発明はかかる問題点を解決すべくなされたものであ
り、簡単に？Ｒ要量に応じた生ｆｆｉ量を低コストで生
産することがで汚る高分泌プロテアーゼ活性の機能を有
する微生物の製造方法を得ることをＩＩ的とする。
り、簡単に？Ｒ要量に応じた生ｆｆｉ量を低コストで生
産することがで汚る高分泌プロテアーゼ活性の機能を有
する微生物の製造方法を得ることをＩＩ的とする。
（問題、αを解決するための手段）
この発明に係る高分泌プロテアーゼ活性の機能を有する
微生物の製造方法は、微生物Ｂ−６−４Ｊ株を、無機塩
培地で、グルコース、酵１号エキス、カザミノ酸、Ｃａ
Ｃｌ□、２〜５％無調整豆乳からなる培地で、２４時間
ないし３５時間の間、・［５“Ｃで振とう培ごしたもの
である。
微生物の製造方法は、微生物Ｂ−６−４Ｊ株を、無機塩
培地で、グルコース、酵１号エキス、カザミノ酸、Ｃａ
Ｃｌ□、２〜５％無調整豆乳からなる培地で、２４時間
ないし３５時間の間、・［５“Ｃで振とう培ごしたもの
である。
（作用）
この発明にかかる高分泌プロテアーゼ活性の（戊能を有
する微生物の製造方法によれば、微生物［１−６−４Ｊ
株を２〜５％無調整豆乳を加えた培地で、振とう培養す
ることにより、プロテアーゼ分泌能の高い丙を安価に生
産することができる。
する微生物の製造方法によれば、微生物［１−６−４Ｊ
株を２〜５％無調整豆乳を加えた培地で、振とう培養す
ることにより、プロテアーゼ分泌能の高い丙を安価に生
産することができる。
（実施例）
この発明にがかる一実施例について説明する。
最初に、大豆乳を凝固させる凝固酵素の分泌を行なう直
のスクリーニングを行なう。各種植物の葉あるいは茎を
簡単に水洗し、これを細切して無調整豆乳に入れ、４５
℃で２４時間振とう培養を行なう、その後、数度の集積
培養を打ない、微生物を純化させＳ培地（表１）を用い
て微生物の培養を行なう。
のスクリーニングを行なう。各種植物の葉あるいは茎を
簡単に水洗し、これを細切して無調整豆乳に入れ、４５
℃で２４時間振とう培養を行なう、その後、数度の集積
培養を打ない、微生物を純化させＳ培地（表１）を用い
て微生物の培養を行なう。
表Ｉ Ｓ培地組成
この中には、まだ数種の菌が入っており、その中から豆
乳のカード形成が最もよい菌を単離してきた（この菌を
８−６−４Ｊとする）。この菌は、工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託番号、微工研菌寄Ｆ？ｔｚｇ号とし
て寄託されている。
乳のカード形成が最もよい菌を単離してきた（この菌を
８−６−４Ｊとする）。この菌は、工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託番号、微工研菌寄Ｆ？ｔｚｇ号とし
て寄託されている。
この時点で、豆乳のカード形成の活性及びプロテアーゼ
活性を測定したところ、プロテアーゼ活性が非常に高い
ことが判明した。
活性を測定したところ、プロテアーゼ活性が非常に高い
ことが判明した。
なお、プロテアーゼ活性はハイパウダー（シグマ）を使
用して測定した。
用して測定した。
Ｈ，ＲＩＮＤＥＲＫＮＥＣＨＴ、Ｍ、Ｃ０ＧＥＯＫＡＳ
、Ｐ、Ｓ Ｉ ＬＶＥＲＭＡＮ ａｎｄＢ、 Ｊ、
ＨＡＶＥＲＢＡＣＫ、Ｃｌ１ｎ、 Ｃｂｉｍ。
、Ｐ、Ｓ Ｉ ＬＶＥＲＭＡＮ ａｎｄＢ、 Ｊ、
ＨＡＶＥＲＢＡＣＫ、Ｃｌ１ｎ、 Ｃｂｉｍ。
Ａｃｔａ＋２１
小試験管ｌニハイドパウダ一３０ｍｇを測り取りリン酸
緩衝液を一定量入れて予め５５°ｃＩ：設定しておく。
緩衝液を一定量入れて予め５５°ｃＩ：設定しておく。
およそ３０分後に、培液液を遠心（８０００ｒ、 ＋３
６ｍｙＯ“ｃ、１０分）して（：Ｌられた上清液を一定
量加えて反応させる。３０分間反応させる間に５分おき
に投袢する。
６ｍｙＯ“ｃ、１０分）して（：Ｌられた上清液を一定
量加えて反応させる。３０分間反応させる間に５分おき
に投袢する。
３（）分径に氷水に入れて反応を停止させろ過して上清
液を入れる。
液を入れる。
得られた上清液の５９５ｎｍにおける吸光度を測定する
（１吸光度は０．１〜１．５の間になるように加える培
養液の量を調節する） アクＩ＋−’／／＋−１−ＩＩ４ｎ、）Ｊ−＋Ｊ−ｒｌ
ＱＩＩｋｌＪｂＳ培地により２４時間から３５時間、４
５℃で振とう培養することにより、最もプロテアーゼ分
泌活性が高い。
（１吸光度は０．１〜１．５の間になるように加える培
養液の量を調節する） アクＩ＋−’／／＋−１−ＩＩ４ｎ、）Ｊ−＋Ｊ−ｒｌ
ＱＩＩｋｌＪｂＳ培地により２４時間から３５時間、４
５℃で振とう培養することにより、最もプロテアーゼ分
泌活性が高い。
培養時間は２４時間以下でも３５時間以上でもプロテア
ーゼ分泌活性は減少する（第１図参照）。培養温度は４
５℃以下（３７℃）ではプロテアーゼ分泌活性は減少し
、逆に温度が高い場合には、菌の生をに問題が生じる（
表２）。
ーゼ分泌活性は減少する（第１図参照）。培養温度は４
５℃以下（３７℃）ではプロテアーゼ分泌活性は減少し
、逆に温度が高い場合には、菌の生をに問題が生じる（
表２）。
表２ 培養温度の違いによる５ ９５ ｎ ＩＩｌの
吸収Ｓ培地において添加する豆乳の量は２〜５％が最も
プロテアーゼ分泌活性が高く、それ以下でもそれ以上で
もプロテアーゼ分泌活性は減少しな（第２図参照）。
吸収Ｓ培地において添加する豆乳の量は２〜５％が最も
プロテアーゼ分泌活性が高く、それ以下でもそれ以上で
もプロテアーゼ分泌活性は減少しな（第２図参照）。
上記培養条件で培養後、上清液を得て熱射性および反応
至適温度を検討した結果、５５℃以上で１０分間の熱処
理を行なうとプロテアーゼ分泌活性は減少していく。し
かし、５分間とぃう短時間の反応では６０℃〜７０゛ｃ
で最もプロテアーゼ活性が高く、７５℃以上では極端に
落ちた（第３図参照）。つまり長時間の反応（３０分）
では至適温度が５５℃で短時間（５分）の反応では至適
温度６０〜７０℃である。次に至適ｐＨは８〜１０で、
Ｉ）Ｈ７，０以下の酸性側ではプロテアーゼ活性が下が
る（第４図参照）。
至適温度を検討した結果、５５℃以上で１０分間の熱処
理を行なうとプロテアーゼ分泌活性は減少していく。し
かし、５分間とぃう短時間の反応では６０℃〜７０゛ｃ
で最もプロテアーゼ活性が高く、７５℃以上では極端に
落ちた（第３図参照）。つまり長時間の反応（３０分）
では至適温度が５５℃で短時間（５分）の反応では至適
温度６０〜７０℃である。次に至適ｐＨは８〜１０で、
Ｉ）Ｈ７，０以下の酸性側ではプロテアーゼ活性が下が
る（第４図参照）。
野生株の枯草菌Ｎ Ｉ Ｇ １１２１をＳ培地がら無調
整豆７Ｌを抜いた培地で３７℃１２４時間の振とう培養
を行ない、遠心分離をして上清液を得る。これと、［１
−６−４ＪをＳ培地を用いて４５°ｃ１２４時間の振と
う培養を行ない、その遠心上清液とのプロテアーゼ分泌
活性を比較した。その結果、Ｂ−６−４Ｊ株の培養遠心
上清液は野生株枯す菌の培養遠心上清液よりもそのプロ
テアーゼ分泌活性がおよそ１００倍高い（表３参照）。
整豆７Ｌを抜いた培地で３７℃１２４時間の振とう培養
を行ない、遠心分離をして上清液を得る。これと、［１
−６−４ＪをＳ培地を用いて４５°ｃ１２４時間の振と
う培養を行ない、その遠心上清液とのプロテアーゼ分泌
活性を比較した。その結果、Ｂ−６−４Ｊ株の培養遠心
上清液は野生株枯す菌の培養遠心上清液よりもそのプロ
テアーゼ分泌活性がおよそ１００倍高い（表３参照）。
表３
上記のように、Ｂ−６−４Ｊ株をＳ培地で２４時間、４
５℃で振とう培養することにより、菌体外商分泌プロテ
アーゼを簡単に得ることができる。
５℃で振とう培養することにより、菌体外商分泌プロテ
アーゼを簡単に得ることができる。
（発明の効果）
以上説明したとおり、この発明によれば、微生物Ｂ−６
−４Ｊ株を、ｐ！、磯塩培地、グルコース、酵母エキス
、カザミ／Ｉ！！、（ａｃｌｚ、２〜５％無調整豆乳か
らなる培地で、２４時間ないし３５時間の間、４５℃で
振とう培養するという簡単な方法で、高分泌のプロテア
ーゼが得られるという高分泌プロテアーゼ活性のＲ能を
有する微生物の製造方法が得られるという効果を生ずる
。
−４Ｊ株を、ｐ！、磯塩培地、グルコース、酵母エキス
、カザミ／Ｉ！！、（ａｃｌｚ、２〜５％無調整豆乳か
らなる培地で、２４時間ないし３５時間の間、４５℃で
振とう培養するという簡単な方法で、高分泌のプロテア
ーゼが得られるという高分泌プロテアーゼ活性のＲ能を
有する微生物の製造方法が得られるという効果を生ずる
。
第１図は振とう培養と＃置培養とによる経時的プロテア
ーゼ活性の比較図、第２図はＳＰＩ培地に添加する豆乳
濃度量とプロテアーゼ活性の比較図、ｆ５３図は熱耐性
および各温度でのプロテアーゼ活性の比較図、第４図は
培養遠心上清液の至適Ｉ’１１を示す図である。 特許出願人 口？＋′！製菓株式会社（株）日清イ
ンターナショナル
ーゼ活性の比較図、第２図はＳＰＩ培地に添加する豆乳
濃度量とプロテアーゼ活性の比較図、ｆ５３図は熱耐性
および各温度でのプロテアーゼ活性の比較図、第４図は
培養遠心上清液の至適Ｉ’１１を示す図である。 特許出願人 口？＋′！製菓株式会社（株）日清イ
ンターナショナル
Claims (1)
- 微生物Ｂ−６−４Ｊ株を、無機塩培地、グルコース、酵
母エキス、カザミノ酸、ＣａＣｌ＿２、２〜５％無調整
豆乳からなる培地で、２４時間ないし３５時間の間、４
５℃で振とう培養したことを特徴とする高分泌プロテア
ーゼ活性の機能を有する微生物の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1970086A JPS62179381A (ja) | 1986-01-31 | 1986-01-31 | 高分泌プロテア−ゼ活性の機能を有する微生物の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1970086A JPS62179381A (ja) | 1986-01-31 | 1986-01-31 | 高分泌プロテア−ゼ活性の機能を有する微生物の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62179381A true JPS62179381A (ja) | 1987-08-06 |
| JPH0440984B2 JPH0440984B2 (ja) | 1992-07-06 |
Family
ID=12006542
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1970086A Granted JPS62179381A (ja) | 1986-01-31 | 1986-01-31 | 高分泌プロテア−ゼ活性の機能を有する微生物の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62179381A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0550626A1 (en) * | 1990-09-28 | 1993-07-14 | Smithkline Beecham Corporation | Method of improving the yield of heterologous proteins produced by streptomyces lividans |
-
1986
- 1986-01-31 JP JP1970086A patent/JPS62179381A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0550626A1 (en) * | 1990-09-28 | 1993-07-14 | Smithkline Beecham Corporation | Method of improving the yield of heterologous proteins produced by streptomyces lividans |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0440984B2 (ja) | 1992-07-06 |
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