PT98787A

PT98787A - Processo para a preparacao de derivados de taxol soluvel em agua

Info

Publication number: PT98787A
Application number: PT98787A
Authority: PT
Inventors: David G I Kingston; Zhi-Yang Zhao
Original assignee: Virginia Tech Intell Prop
Priority date: 1990-08-28
Filing date: 1991-08-27
Publication date: 1992-07-31
Also published as: AU8274591A; RU2059630C1; US5059699A; PL291546A1; RU2043346C1; KR0132157B1; CA2049160A1; MX9205895A; PL166213B1; IL99183A0; NO913007D0; PL166224B1; KR920004370A; PL295890A1; JPH04230676A; US5352805A; PL295892A1; CA2049160C; ZA916450B; PL295891A1

Description

ir LAWRENCE/VIRGINIA TECH REF.: 1920 ASM 85.366 "PROCESSOS PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DE TAXOL SOLÚVEIS EM AGUA”

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a derivados de taxol solúveis em água com actividade anti-neoplásica e, mais particularmente, a derivados 2'-acriloiltaxol sulfonados, derivados do ácido 2'-sulfoalquilamino-O-acílico de taxol e derivados do ácido 2'-etileno-glicol-O-acílico de taxol.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 taxol é um diterpenóide de ocorrência natural que apresenta grande potencial como fármaco anti-carcerígeno e que tem exibido actividade em diversos sistemas tumorais. 0 taxol foi primeiro isolado e a sua estrutura referida por Wani et al., em "Plant Anti-tumor Agents. VI. The Isolation And Structure Of Taxol, A Novel Anti-Leukemic And Anti-Tumor Agent From Taxus brevifolia," J. Am. Chem. Soc., 93, (1971), 2325. 0 taxol encontra-se na casca do caule do teixo ocidental, Taxus brevifolia assim como em T. baccata e T. cuspidata. A actividade biológica do taxol está relacionada 1

com o seu efeito sobre a divisão celular. 0 taxol promove a formação de micro-túbulos que formam o fuso mitótico durante a divisão celular. Contudo, o taxol impede a despolimerização da tubulina que forma os micro-túbulos do fuso mitótico que é essencial para que se realize a divisão celular. Assim, o taxol provoca a suspensão da divisão da célula. 0 mecanismo do taxol é único, uma vez que promove a formação de polímeros de tubulina, enquanto outros fármacos anti-carcerígenos, como a vinblastina e colchicina, impedem a formação dos micro-túbulos. 0 estudo exaustivo do taxol não foi realizado porque existe em muita pequena quantidade e ainda não foi sintetizado com sucesso. Estudos preliminares demonstraram que o taxol pode apresentar actividade marginal na leucemia aguda e no melanoma, tendo sido notada alguma actividade noutros tumores. Além disso, os estudos de McGuire et al. mostraram que o taxol é um agente activo contra o cancro do ovário refractário a fármacos. Ver "Taxol : A Unique Antineoplastic Agent With Sígnificant Activity In Advanced Ovarian Epithelial Neoplasms," Ann. Int. Med., 111, (1989), 273-279, aqui incorporado como referência. Contudo, devido à baixa solubilidade do taxol, em água, as doses têm que ser administradas sob a forma de perfusões diluídas em soluções aquosas de dextrose.

Deve notar-se que nos ensaios clínicos de fase 1, o taxol não mostrou por si mesmo efeitos tóxicos excessivos, mas foram causadas reacções alérgicas graves pelos agentes 2 emulsionantes administrados conjuntamente com o taxol para compensar a baixa solubilidade do taxol na água. De facto, pelo menos um doente morreu devido a uma reacção alérgica induzida pelos agentes emulsionantes. Deste modo, os investigadores têm tentado criar derivados do taxol solúveis na água que retenham a sua actividade anti-neoplásica e anti-cancro.

Como referência à Figura 1, a estrutura do taxol está representada através do espectro de ressonância magnética 1 nuclear protónica (RMN H) de uma amostra de taxol. Os sinais de RMN estão bem separados e cobrem a região de 1,0 a 8,2 ppm. Para simplificar, o espectro está dividido em três regiões: uma primeira região entre 1,0 e 2,5 ppm formada por sinais de 3 protões fortes dos grupos metilo e acetato, assim como multipletos complexos provenientes de certos grupos metileno; uma segunda região entre 2,5 e 7,0 ppm representa os sinais observados emitidos pela maioria dos protões da cadeia principal do taxano e da cadeia lateral; uma terceira região entre 7,0 e 8,2 ppm é formada por sinais provenientes de protões aromáticos do grupo benzoato na posição C-2, do grupo fenilo na posição C--3' e do grupo benzamida na posição C-3'. Os picos do espectro de RMN da Figura 1 estão marcados de acordo com o número do carbono da estrutura de taxol ao qual os protões indutores de sinais estão ligados.

Magri e Kingston referem a actividade biológica de taxóis substituídos nas posições C-2' e C-7' a fim de os tornar 1 mais solúveis em água. Ver "Modified Taxols, 4. Synthesis And Biological Activity of Taxols Modified In The Side Chain", Journal of Natural Products, 5_1 (2) (Março-Abril 1988), aqui incorporado como referência. Foi sintetizado o 2'-(t-butildimeti 1 si 1i1)-taxol que se verificou ser essencialmente inactivo. Isto foi considerado como uma indicação da necessidade de um grupo hidróxilo livre na posição 2' da cadeia lateral do taxol para haver actividade biológica. Além disso, os substituintes acilo da posição 2' em 2 '-aceti 1 taxol e 2 ' , 7--diacetiltaxol foram facilmente hidrolisados sob condições in vivo e ambos exibiram actividade num bioensaio com cultura de células. A labilidade dos substituintes acilo na posição 2' sugeriu que os 2 '-aceti1taxóis poderão servir como formas pró--fármacos de taxol. (De um modo geral, um pró-fármaco é um composto que exibe actividade farmacológica após biotransformação).

Magri e Kingston referem dois taxóis que prepararam apresentando maior solubilidade na água, 2'-(β-alanil)taxol:

4

'J

e 2'-succini1taxol

0 2'-(β-alani1)taxol mostrou ser activo m vivo e in vitro mas instável. 0 2'-succiniltaxol preparado por tratamento de taxol com anidrido succínico tinha uma actividade in vivo P-388 muito diminuída quando comparado com o taxol. Assim, os esforços de investigação foram concentrados em outros derivados do taxol que não apresentassem instabilidade ou inactividade in vivo ou in vitro.

Deutsch et al., em "Synthesis Of Congeners And

Prodrugs. Antitumor i 3. Water-Soluble Prodrugs Of Taxol With Potent Activity", J. Med. Chem., 32, (1989), 788-792, aqui incorporado como referência, referem que os sais de 2'-succiniltaxol e 2 '-glutariltaxol tem actividdes anti-tumorais melhoradas quando se comparam com os ácidos livres. Uma vez que estes investigadores acreditam que os sais preparados com 5 -r diferentes iões contrários frequentemente têm propriedades substancialmente diferentes, foram sintetizados e estudados uma variedade de sais de taxol 2'-substituídos. Os sais de trietalnolamina e de N-metilglucamina de derivados de taxol 2'--substituídos exibiram solubilidade na água muito maior e maior actividade do que os sais de sódio. Além disso, verificou-se que uma série de sais de 2'-glutariltaxol tinham maior actividade que os seus análogos de 2'-succiniltaxol. Em particular, o sal de taxol resultante do acoplamento de 2'-glutariltaxol com 3--(dimetilamino)-l-propilamina utilizando N,N'-carbonildiimidazol mostrou boas solubilidade e bioactividade.

Além de aumentar a solubilidade e bioactividade do taxol, é desejável que os derivados taxol formados tenham estabilidade acrescida para prolongar o seu tempo de vida. Considera-se que os sais de ésteres de taxol são muito susceptíveis à hidrólise básica e os grupos solubilizantes na água, tais como os sais carboxilatos ou os sais de aminas, tendem a ser básicos. Portanto, é desejável que sejam sintetizados derivados de taxol solúveis na água, neutros, que também apresentem actividade melhorada ou equivalente à do taxol. Os sais sulfonatos orgânicos tendem a ser neutros ou apenas ligeiramente básicos e, portanto, os sais sulfonato de ésteres de taxol devem apresentar melhor estabilidade. Além disso, devido às dificuldades apresentadas pela síntese de sais carboxílicos e amínicos de ésteres de taxol, é desejável encontrar derivados de taxol solúveis na água menos dispendiosos 6 e processos para a sua preparação.

SUMARIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à produção de derivados de taxoi solúveis na água e a sais sulfonatos solúveis na água derivados de taxoi. Num aspecto preferido, prepara-se o sal de sódio de 2'-[(3-sulfo-1-oxopropil)-oxi-taxol mediante a \ reacção de taxoi com ácido acrílico para formar 2'--acriloiltaxol; em seguida, submete-se o 2'-acriloiltaxoi a uma reacção de Michael com bissulfito de sódio para obter o sal do éster 2'-sulfoetílico de taxoi. Em outro aspecto preferido, submetem-se cs derivados ácidos 2'-O-ací1icos de taxoi, como por exemplo 2'-succinitaxoi e 2'-glutariltaxoi, a uma nova reacção com o sal de tetrabutílamónio de taurina para formarem sais de sulfoalquilamina dos derivados ácidos 2'-O-acílicos de taxoi. Outro aspecto preferido envolve a reacção de sais de ácido amino-sulfónico com anidrido succínico ou anidrido ^ glutárico e a reacção do produto com taxoi para formar derivados de sulfoalquilamino de derivados ácidos 2'-O-acílicos de taxoi. Num outro aspecto, formaram-se derivados de etilenoglicol dos derivados ácidos 2'-O-acílicos de taxoi. Estes compostos exibiram grande solubilidade na água e demonstraram actividade anti-leucémica, anti-neoplásica e/ou anti-cancerígena.

Assim, é um objectivo principal da presente invenção preparar derivados do taxoi solúveis na água, com 7

n V

grande bioactividade e estabilidade. É ainda um objectivo da presente invenção proporcionar um processo simples e pouco dispendioso para a preparação de 2'-acriloiltaxóis e seus derivados sais sulfonatos. É ainda um objectivo da presente invenção preparar •tf} taxóis ácidos 2'-O-acílicos e seus sais de sulfoalquilamina. É ainda um objectivo da presente invenção preparar derivados de sulfoalquilamina de taxóis ácidos 2’-O-acílicos através de processos simples e de baixo custo.

Constitui ainda um objectivo da presente invenção preparar derivados de hidroxialcoxi de taxol ácido 2'-0--acílico.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 representa a estrutura do taxol e o seu espectro de ressonância magnética nuclear com os picos marcados de acordo com a parte de estrutura de taxol a que correspondem. A Figura 2 representa o espectro de RMN de 2'-0--cinamoiltaxol (2'-cinamoiltaxol). 8

A Figura 3 representa o espectro de RMN de 2'-0--crotoniltaxol (21-cronotiltaxol).

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Obteve-se taxol no National Câncer Institute. Os espectros de ressonância magnética nuclear protónica e de Λ 13 ressonância magnética nuclear C foram obtidos com um espectrómetro Bruker 270SY 270 MHz; os espectros de ressonância magnética nuclear 2D foram obtidos com um espectrómetro Bruker WP200,200 MHz. Os deslocamentos quimicos estáo registados em partes por milhão (ppm) abaixo do campo de TMS no espectro de ressonância magnética nuclear protónica e os deslocamentos quimicos de ressonância magnética nuclear C baseiam-se no deslocamento de clorofórmio a 77,0 ppm ou no deslocamento do IMS a 0 ppm. As amostras foram, em geral, registadas em CDC13 ou em CD^OD ã temperatura ambiente. Os espectros de massa foram obtidos num espectrómetro de massa/cromatõgrafo de fase gasosa Finnegan-MAT 112 e num espectrómetro de massa VG 7070 HF equipado com sistema de dados, fonte de FAB e fonte EI/CI. A espectroscopia de massa e de ressonância magnética nuclear apresentaram dados muito mais úteis para o estudo do taxol e dos seus derivados do que outros métodos, tais como os espectros no infra-vermelho e no ultravioleta, proporcionando informação e confiramção adicional da estrtura.

Outros instrumentos analiticos utilizados incluem 9

um espectrómetro Perkin-Elmer 710B de infra-vermelho e um espectrómetro Perkin-Elmer 330 UV-visível e ainda um polarímetro Perkin-Elmer. A HPLC foi realizada num aparelho constituído por uma bomba Waters M6000, uma válvula de injecção Rheodyne, uma coluna Waters Radial-Pak RLM-100 RP-8 e um detector Waters 440 uv.

2'-ACRILOILTAXOIS »

Preparou-se o sal de sódio de 2'-[(3-sulfo-l--oxoprcpil)-oxi]-taxol por acoplamento de taxol com ácido acrílico seguido por uma adição de Michael do ião bissulfito. Fez-se reagir o taxol com ácido acrílico utilizando cloroformato de isobutilo como agente de acoplamento. Obteve-se 2'--acriloiltaxol com um rendimento de 94% após purificação através de cromatografia rápida em gel de sílica, utilizando como eluente diclorometano/acetato de etilo a 1/1. Com o auxílio de cromatografia em camada fina, verificou-se que o acoplamento do ácido acrílico ao taxol se encontrava completo em 90% após 15 horas à temperatura de 60°C. Não se formou produto dissubstituído em C-2’, C-7 após tempos de reacção prolongados. O espectro de ressonância magnética nuclear protónica de 2'--acriloiltaxol mostrou que o sinal para o protão em C-2' se deslocou abaixo do campo para 5,46 ppm (d, j=3), desde o deslocamento de 4,73 ppm para o protão C-2' no taxol insubstituído. O deslocamento abaixo do campo é consistente com a acilação do grupo hidroxilo em C-2'. Uma vez que o sinal para 10

;V

ο protão C-7 a 4,43 ppm ficou essencíalmente inalterado quando comparado com o sinal do protão C-7 de taxol insubstituído a 4,38 ppm, concluíu-se que não houvera qualquer reacção na posição C-7. A espectroscopia de massa indicou um peso molecular de 907 com picos a m/z 930 (MNa+) e 908 (MH+).

Em seguida, fez-se reagir 2'-acriloiltaxol com bissulfito de sódio, numa reacção de adição de Michael. Utilizou-se o bissulfito de sódio porque é um bom nucleófilo e porque proporciona condições de pH adequadas à reacção. Comparou-se o espectro de RMN protónica do produto da reacção de adição de Michael com o espectro de 2'-acriloiltaxol. Os sinais do espectro de RMN de 2'-acriloiltaxol que eram devidos à presença de protões vinílicos não estavam presentes no espectro do produto de adição de Michael. Contudo, dois tripletos a 3,14 ppm e 2,93 ppm indicavam a presença dos dois novos grupos metileno no produto de adição de Michael. A espectroscopia de massa do produto de reacção de Michael indicou um peso molecular de 1011 com picos que se apresentavam a m/z 1034 (MNa+) e 1012 (MH+) . A formação do sal de sódio de 2'-[(3-sulfo-l--oxopropil)-oxi]-taxol foi tentada através de uma reacção em um passo, fazendo reagir taxol com ácido 3-hidroxi-3-oxopropil--sulfónico, na presença de piridina e de diciclo--hexilcarbodiimida, mas não se obteve qualquer produto. Este facto foi possivelmente devido a um ataque inter-molecular pelo 11 grupo sulfonilo no composto intermédio da reacção.

DERIVADOS ÁCIDOS 2'-O-AClLICOS DE TAXOL 0 sal de sódio de 2'[4-((2-fulfoetil)amino)-1,4--dioxobutil]-oxij-taxol e o sal de sódio de 2'-| [4-((3--sulfopropil)amino-1,4-dioxobutil]-oxiJ-taxol foram preparados com grande rendimento por acoplamento de 2'-succiniltaxol com sais de tetrabutilamónio de taurina (ácido 2-aminoetil--sulfõnico) e de ácido 3-aminopropil-sulfõnico, respectivamente. De notar que podem ser utilizados outros sais de amónio quaternário para preparar ácidos aminoalquil-sulfónicos solúveis em dissolventes orgânicos. Preparou-se 21-succiniltaxol por reacção de anidrido succinico com taxol durante 2 horas á temperatura ambiente no seio de piridina ou de dimetilpiridina . Em comparação com o espectro RMN de taxol, o espectro de RMN de 2'-succiniltaxol exibiu um deslocamento abaixo do campo no sinal do potrão em C-2' para 5,51 ppm e os multipletos causados por protão de succinilo centraram-se cerca de 2,6 ppm.

Em seguida, fez-se reagir 2'-succiniltaxol com o sal de tetrabutilamónio de taurina utilizando cloroformato de isobutilo como agente de acoplamento. Obteve-se o sal de tetrabutilamónio de 2'[4-((2-sulfoetil)amino)-1,4- -dioxobutil]-oxi^-taxol com um rendimento de 100% apôs isolamento através de cromatografia rápida sobre gel de sílica utilizando como eluente diclorometano/metanol a 7/1. A reacção foi 12 "V. completada apenas em 80% em 2 horas de acordo com o controlo realizado por cromatografia em camada fina; para obter um rendimento de 100% foram necessários maiores tempos de reacção. O espectro de RMN do derivado de sulfoalquilamina de 2'--succiniltaxol apresentou novos picos a 3,6 ppm e 2,94 ppm para os dois grupos metileno. Obteve-se o sal de sódio de 2'-{[4-((2--sulfoetil)amino)-1,4-dioxobutil]-oxi}taxol fazendo passar através de uma coluna de permuta iónica Dowex 50 (na forma Na+) o sal de tetrabutilamónio de 2'-{[4-((2-sulfoetil)amino)-1,4--dioxobutil]-oxi}taxol. O espectro de ressonância magnética nuclear do sal de sódio mostrou a ausência de sinais para o grupo tetrabutilo. A espectroscopia de massa de sal de sódio indicou um peso molecular 1082 devido à presença de picos a m/z 1105 (MNa+) e 1083 (MH+).

Preparou-se o sal de sódio de 2' — {[4—( (3 — -sulfopropil)amino)-1,4-dioxobutil]-oxi}taxol pelo mesmo método utilizado para o sal de sódio de sulfoetilaminotaxol; contudo, substituiu-se a taurina pelo sal de tetrabutilamónio do ácido 3--amino-l-sulfopropiónico. O espectro de RMN confirmou a síntese do derivado de 3-sulfopropilamino; apresentaram-se novos picos a 3,28, 1,98 e 2,87 ppm, o que representa três grupos metileno adicionais formando o grupo propilo. A forma de sal de sódio do derivado sulfopropilamino-succiniltaxol foi obtida por passagem do sal de tetrabutilamónio através de uma coluna de permuta iónica Dowex 50 (sob a forma Na+). A espectroscopia de massa de sal de sódio do derivado de sulfopropilamino-succiniltaxol 13 indicou um peso molecular de 1096 através da presença de picos a m/z 1119 (MNa+) e 1097 (MH+).

Também foi contemplada a ligação amina que se podia formar entre um ácido amino-sulfõnico e um anidrido ou diãcido apropriados e que podia fazer-se reagir o produto com taxol para formar os derivados de taxol de ácido 2'-0-acilico solúveis. De preferência o ácido amino-sulfõnico ê um sal solúvel num dissolvente orgânico.

Tentativas para a formação do sal de sódio de 2'--|[4- ( (2-sulfoetil)amino)-1,4-dioxobutil} oxi]taxol directamente a partir de 2'-succiniltaxol, através de uma reacçâo em um sõ passo, foram mal sucedidas. Combinou-se 21-succiniltaxol com trietanolamina, cloroformato de isobutilo, tetra-hidrofurano, taurina, dimetilformamida e água. Contudo, a água necessária para a solubilizaçáo da taurina hidrolisou o anidrido misto intermédio para formar novamente o composto inicial. Quando se tentaram condições não aquosas, a reacçâo foi ainda mal sucedida devido à taurina não se dissolver nos dissolventes orgânicos.

Preparou-se 2'[4-((2-etanotiol)amino)-1,4- -dioxobutil]-oxijtaxol, com baixo rendimento, fazendo reagir 2'--succiniltaxol com trietilamina, cloroformato de isobutilo , tetra-hidrofurano, 2-tioetilamina e diclorometano. As tentativas de oxidação do tiol para o ácido sulfõnico pretendido com o ãcido raeta-cloroperbenzõico, MCPBA, e diclorometano, não 14 / originaram quantidades apreciáveis do derivado sulfoalquilaminico de succiniltaxol.

DERIVADOS DE ETILENOGLICOL DE SUCCINILTAXOL

Preparou-se 2'-|[4-((hidroxiletil)oxi)-1,4-

-dioxobutil]-oxi}taxol por acoplamento de succiniltaxol com etilenoglicol. 0 derivado hidroxietiloxi-succiniltaxol formou-se com um rendimento de 83% após um tempo de reacção de 20 horas à temperatura ambiente. O derivado hidroxietiloxi-succiniltaxol foi preparado a fim de se converter o grupo hidroxilo secundário na posição 2' do taxol num grupo hidroxilo primário; pôs-se a hipótese de o grupo hidroxilo do produto ser mais reactivo do que o grupo hidroxilo do taxol e que isto tornaria possivel preparar outros derivados de taxol, sob condições moderadas. O espectro de RMN do derivado de etilenoglicol mostrou a presença de novos picos a 3,7 ppm e 4,1 ppm que se atribuiram a dois novos grupos metileno do derivado hidroxietiloxi. A espectroscopia de massa indicou um peso molecular de 997 através da presença de picos a m/z 1020 (MNa+) e 998 (MH+).

FORMATO DE 2'- ^f-AMINOBUTIRILTAXOL por

Sintetizou-se o acoplamento de taxol com formato de 2 ' - ^"-aminobutiriltaxol ácido N-carbobenziloxi (CBZ)-^- 15 -aminobutírico seguido de desprotecçáo da amina. Fez-se reagir o taxol cora ácido N-CBZ- )£"-aminobutlrico utilizando diciclo- -hexilcarbodiiraida como agente de acoplamento. 0 2'-NCBZ - )f--aminobutiril-taxol resultante foi produzido com o rendimento de 75% após purificação por cromatografia em camada fina preparativa com gel de sílica e hexano/acetato de etilo a 3/2. A diciclo-hexilcarbodiimida decompõe a diciclo-hexilureia com a adição de água, pelo que o excesso de reagentes utilizado para forçar a reacçao náo apresenta problema; a maior parte da diciclo-hexilureia e do ácido N-CBZ- Jf-aminobutirico foi retirada por filtração. A desprotecçáo do 2'-N-CBZ- - aminobutiriltaxol efectuou-se com o auxilio de um catalisador de paládio a 5% sobre carvão e de ácido fõrmico como fonte de hidrogénio. 0 ácido fõrmico proporciona uma forma activa de mê hidrogénio para a remoção de grupos protectores CBZ e a reacçao origina o derivado 2' - 'X"-aminobutiriltaxol, sob a forma de formato, que ê mais solúvel na água do que a forma neutra. 0 espectro de ressonância magnética nuclear confirmou a síntese do formato de 2'- )f"-aminobutiriltaxol. Contudo, o composto era instável numa solução metanõlica e decompunha-se com formação de taxol apôs algumas horas. Esta instabilidade impediu que se considerasse o formato de 2'jf-aminobutiriltaxol como pró- -fármaco do taxol.

SOLUBILIDADE NA AGUA

Determinou-se a solubilidade na água para todos os 16

compostos através do coeficiente de distribuição entre 1-octanol e água. Utilizaram-se octanol saturado com água destilada e água destilada saturada com octanol para determinação das solubilidades. Os resultados de experiências de partilha demonstraram que o sal de sódio de 2'-[(3-sulfo-l-oxo— propil)oxi]-taxol é 210 vezes mais solúvel na água do que o taxol. E que o sal de sódio é 2'-{[4-((2-sulfoetil)amino)-1,4-—dioxobutil]—oxi}taxol é 191 vezes mais solúvel do que o taxol e ainda que o sal de sódio de 2'-{(4-((3-sulfopropil)amino)-1,4--dioxobutil]-oxi}taxol é 118 vezes mais solúvel na água do que o taxol.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes não limitativos proporcionam métodos de síntese específicos para a preparação dos derivados de taxol solúveis na água de acordo com a presente invenção. Todos os termos técnicos e científicos utilizados têm o significado considerado correntemente na técnica. Outros métodos e produtos similares ou equivalentes aos descritos aqui podem ser os utilizados na realização prática ou no ensaio da presente invenção. EXEMPLO 1

Dissolveram-se 50 μΐ de trietilamina e 30 μΐ de 17 ácido acrilico em 5 ml de tetra-hidrofurano num balão de fundo redondo de 25 ml sob atmosfera de argon. Após arrefecimento da solução até ã temperatura de 0°C, com um banho de gelo, adicionaram-se 50 jxl de cloroformato de isobutilo e deixou-se a mistura reaccional retomar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Adicionaram-se 100 mg de taxol â mistura reaccional e agitou-se a solução à temperatura de 60°C durante 15 horas controlando-se por cromatografia em camada fina, com diclorometano/acetato de etilo a 2/1. Durante a reacção precipitou o cloridrato de trietilamina que se retirou por filtração. Em seguida , eliminou-se o dissolvente sob vazio e purificou-se o produto através de cromatografia rápida utilizando gel de silica e diclorometano/acetato de etilo a 1/1. Obtiveram-se 100 mg (rendimento de 94%) de 2'-acriloiltaxol:

C3 18

I

0 grupo acriloilo no 2'-acriloiltaxol é um bom aceitador de Michael devido ao átomo de carbono alceno 3 electrófilo que é submetido a um ataque nucleófilo. Assim, a reacção de 2'-acriΙοί1taxol com nucleófilos apropriados originará uma adição de Michael na posição 2'. Dissolveram-se 85 mg de 2 '-acnloil taxol em cerca de 3 ml de isopropanol destilado e 84 mg de metabissulfito de sódio, em cerca de 1 ml de água destilada. Misturaram-se as duas soluções e agitou-se a mistura reaccional à temperatura de 60"C durante cerca de 15 horas. Utilizou-se cromatografia em camada fina com diclorometano/metanol a 10/1 para seguir a reacção. Em seguida, eliminaram-se os dissolventes sob vazio e a água por azeotropia com acetonitrilo. Tara a purificação do produto aplicou-se cromatografia rápida com diclorometano/isopropanol a 2/1. Obtiveram-se 83,5 mg (rendimento de 83,5%) de sal de sódio de 2'-[(3-sulfo-l-oxopropil)oxi]taxol: 4

H,C f C = lcs^ λΛ

S020Na 19

Realizaram-se RMN, EM, UV e IV (KBr) sobre amostras do produto e determinaram-se a rotaçao õptica e o ponto de fusão, de acordo com os resultados de caracterização e de RMN que se apresentam nos Quadros 1 e 2 seguintes. QUADRO 1

Caracterização do Sal de Sódio de 2'-[(3-sulfo-l-oxopropil)oxi]taxol P. F. 175°-176°C [06]20D -30°(0,0012, MeOH) IV (KBr): 3500, 2950, 1760, 1730, 1660, 1380, 1250, 1190, 1100, 800 cm-1 UV J^Me0H raax: 279 nm (6 579), 270 nm (&869), 228 nm ( 6/15072) EM (FAB): 1034 (MNa+), 1012 (MH+) 20 QUADRO 2

Dados De RMN Para

Sal de Sódio de 2'-[(3-sulfo-l-oxopropil)oxi]taxol

Posição Deslocamento "''H (ppm de TMS) Emparelhamento (hertz) 13 Deslocamento C (ppm de TMS) C-l * C-2 6,2 (d,7) 75 C-3 3,82 (d,7) 45,8 C-4 80,5 C-5 5,0 (d,9) 84 C-6 2,48 m 35,2 C-7 4,35 m 76 C-8 57,9 C-9 203,8 C-10 6,45 s 70,8 C-ll 131 C-12 141 C-l 3 6,09 (t, 8 ) 75,4 C-l 4 2,48 m 35,8 C-l 5 43 C-16 1,15 s 25,9 C-l 7 1,17 s 19,8 C-18 1,95 s 13,8 C-l 9 1,67 s 9,4 C-20 4,21 s 70,8 C-l' 171 C-2' 5,45 (d,3) 74 C-3' 5,84 (d,7) 53,1 N-H 7,26 (t, 9) CH (OAc) 2 , Z s 21 CH,(OAc) 2,4 s 21,9 Bzò 7,4- 8,1 m 126,8-138,1 CO(OAc) 168,4 CO(OAc) 169,9 CO(OBz) 166,2 CO(NBz) 168,2 C-l" 170,2 C-2" 2,93 (t 8) 29,2 C-3" 1,14 (t 8) 63,2 * sinal sob CHCl^

Deve notar-se que foi previsto que se pode utilizar ácido acrílico ou substituir por outros membros da família do ácido acrílico que também sejam bons aceitadores de Michael e que o grupo formador de sal pode ser outro metal alcalino ou um grupo amónio, tal como um grupo tetrabutilamõnio. Também se previu que o grupo formador de sal podia ser substituído por um átomo de hidrogénio. As provas biológicas com o sal de sódio de 2'-[(3-sulfo-l-oxopropil)oxi]-taxol demonstraram que o composto é bioactivo além de apresentar melhor solubilidade na água. EXEMPLC 2

Combinaram-se 206 mg de taxol com 2,9 mg de 4--dimetilaminopiridina e 49 mg de anidrido succinico num balào de 25 ml equipado com um agitador magnético. Adicionaram-se 2,0 ml de piridina anidra e agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 2,5 horas. Em seguida, adicionaram-se vários ml de água para se obter um precipitado branco numa suspensão opaca. Adicionaram-se depois diversos ml de diclorometano para extracção dos produtos. A adição de 1 ml de ácido clorídrico concentrado provocou o desaparecimento da suspensão aquosa. Utilizou-se sulfato de sódio para secar a fase de diclorometano que, em seguida, se filtrou e evaporou. A cromatografia em camada fina com cloreto de metileno/metanol a 7/1 indicou apenas a permanência de vestígios de piridina. Retirou-se a piridina remanescente por adição cíclica de heptano seguida de evaporação. Obtiveram-se 218 mg de succiniltaxol representando 22

-__ 7 um rendimento de 96,6%. A ressonância magnética nuclear protónica do produto apresentou os valores citados na bibliografia. A estrutura também se confirmou utilizando espectroscopia de correlação homonuclear 2D-RMN HOMO COSY. A taurina, H2NCH2CH2SO3H é um composto de grande polaridade que é essencialmente insolúvel em dissolventes orgânicos, tais como o clorofórmio. Têm-se obtido derivados de taurina com ácidos orgânicos mediante tratamento do cloreto de ácido com taurina sob condições de Schotten—Baumann (isto é, solução aquosa básica ou aquosa-etanólica. Este método é inaceitável para o taxol porque este é facilmente hidrolisável em base e, portanto, decompõe-se sob as condições de reacção. A fim de impedir este problema, desenvolveu-se um novo método que envolve a adição de taurina a hidróxido de tetrabutilamónio seguida de remoção dos compostos que não reagiram e evaporação. Este processo permite a obtenção de sal de tetrabutilamónio de taurina em vez do sal de sódio utilizado pela técnica anterior. 0 sal de tetrabutilamónio da taurina é solúvel nos dissolventes orgânicos, tais como o diclorometano. Assim, pode fazer-se reagir 2'-succiniltaxol em tetra-hidrofurano e trietilamina com cloroformato de isobutilo e sal de tetrabutilamónio de taurina para se formar o sal de tetrabutilamónio de taxol derivado da taurina. Notar que o composto intermédio é um anidrido misto que se hidrolisa formando novamente o composto inicial na presença de água. 23

Utilizou-se um volume mínimo de água destilada para dissolver 250 mg de taurina num balão e adicionou-se à solução 1 ml de hidróxido aquoso de tetrabutilamônio. Agitou-se a solução ã temperatura ambiente durante 1 hora e, em seguida, evaporou-se até ã secura. Dissolveu-se o produto seco em tetra-hidrofurano anidro (cerca de 15 ml), filtrou-se e evaporou-se o filtrado até à secura. 0 produto seco foi depois redissolvido em 2 ml de tetra-hidrofurano anidro.

PREPARAÇAO DO SAL DE TETRABUTILAMÔNIO DE 2 1 -1 [ 4- ( (2-SULFOETIL) -AMINO)-1,4-DIOXOBUTIL) OX jl'AXOL

Arrefeceu-se uma solução de 2'-succiniltaxol, preparada por dissolução de 122 mg de 2'-succiniltaxol em cerca de 4 ml de tetra-hidrofurano anidro e 50 ^il de tetraetilamina, até uma temperatura próxima de 0°C. Em seguida, juntou-se a solu çao a 50 p.1 de cloroformato de isobutilo e aqueceu-se a mistura reaccional até ã temperatura ambiente durante 15 minutos adicionando-se 0,5 ml do sal de taurina de tetrabutilamônio em solução em tetra-hidrofurano (equivalente a 91 mg de sal de tetrabutilamônio de taurina). Apôs a adição do sal de tetrabutilamônio de taurina agitou-se a mistura reaccional ã temperatura ambiente durante 5 horas e seguiu-se a reacção por cromatografia em camada fina utilizando acetato de etilo/metanol a 2/1. Em seguida, filtrou-se a mistura reaccional e evaporaram--se os dissolventes. A purificação por cromatografia rápida utilizando gel de sílica (num leito de 300 x 15 mm com cloreto 24

deu 168 mg (rendimento de 100%) de 2 1 - í [4 - ( (2-sulfoetil ) -amino) -1,4- de metileno/metanol a 7/1) sal de tetrabutilamõnio de -dioxobutil]oxiv taxol.

Converteu-se o sal de tetrabutilamõnio no sal de sõdio por introdução de 160 mg do sal de tetrabutilamõnio num copo contendo resina de permuta iõnica Dowex 50 sob a forma de Na+ (cerca de 3 ml de resina em 3 ml de água desionizada). Após a agitação da mistura à temperatura ambiente durante 90 minutos, fez-se passar a mistura através duma pequena coluna de resina contendo 2 ml de resina sob a forma Na+, utilizando como dissolvente água desionizada. A solução foi submetida a azeotropina com acetonitrilo para obter 122 mg (rendimento de 91,7%) do sal de sõdio 2' —j [4-( (2-sulfoetil) amino) -1,4-dioxobutil] oxij·-taxol:

0=C 25

Os valores para a caracterização estáo indicados no Quadro 3 e os valores dos deslocamentos químicos da ressonância magnética nuclear estáo indicados no Quadro 4, em seguida. QUADRO 3

Valores para Caracterização do Sal de Sódio de 2 '-{[4-((2- -sulfoetil)amino)-1,4-dioxobutil]oxijtaxol P. F. 174°-175° [ou 20d -29,8° (0,0055, MeOH) IV (KBr): 3450, 3000, 1760, 1730, 1660, 1560, 1400, 1260, 1190, 1050 cm-1 _ UvX Me0H max: 279 nm (£,649), 271 nm (&8920), 228 nm (612824) EM (FAB): 1105 (MNa+), 1083 (MH+) 26

QUADRO 4

Dados De RMN Para

Sal de Sódio de 2'-{[4-((2-sulfoetil)amino)-1,4--dioxobutil]oxi}taxol ~ 1 13

Posição Deslocamento H (ppm de TMS) Deslocamento C

Emparelhamento (hertz) (ppm de TMS) C-l 79 C-2 5,66 (d,7) 76, 6 C-3 3,8 (d,7) 47,2 C-4 81,6 C-5 5,02 (d,9) 85,4 C-6 2,52 m 36 C-7 4,35 m 77, 3 C-8 58,8 C-9 204,8 C-10 6,43 s 72,8 C-ll 132,6 C-12 142,2 C-l 3 6,05 (t,8) 75, 9 C-14 2,14 m 36, 2 C-l 5 44, 1 C-l 6 1, 18 s 26,8 27

QUADRO 4 (cont.)

Dados De RMN Para

Sal de Sódio de 2'-{[4-((2-sulfoetil)amino)-1,4--dioxobutil]oxi}taxol

Posição Deslocamento *H (ppm de TMS) Emparelhamento (hertz) 13 Deslocamento C (ppm de TMS) C-17 1,18 s 21 018 1,94 s 14, 9 019 1,67 s 10,2 C-20 4,23 72 C — 1 ' 173,4 02 ' 5,46 (d,7) 75,8 03 ' 5,8 (dd, 7,7) 55 N-H 7,27 (t,7) CH3(OAc) 2,2 s 22, 2 CH3(OAc) 2,4 s 23, 3 Bz 7,4-8,1 m 126,8-138,1 CO(OAc) 170,2 CO(OAc) 170,2 CO(OBz) 167, 2 CO(NBz) 171,2 C-l" 173, 1 C-2 " 2,72 m 30 C-3 " 2,52 m 30 C-4" 173, 1 C-l" ' 3,58 m 47 C-2" ' 2,96 m 51 N-H 3,58 (t,7) 28

Notar que o sal de tetrabutilamõnio da taurina pode facilmente reagir com outros taxõis ãcidos 2'-O-acíclicos como , por exemplo, 2'-glutariltaxol. Pode formar-se facilmente 2'--glutariltaxol por substituição do anidrido succínico por anidrido glutãrico. Considera-se que outros membros da série do ácido oxãlico e outros anidridos podem reagir com o taxol de forma mais ou menos equivalente a dos compostos especificamente descritos. Notar que, em alguns casos, pode ser preferível a utilização de 2'-glutariltaxol em vez de taxõis ãcidos 2'-0--acllicos. Além disso, considera-se que o grupo que forma sal pode ser substituído por um ãtomo de hidrogénio ou por outro metal alcalino ou alcalino-terroso. EXEMPLO 3

Preparou-se uma solução de 280 mg de ãcido3-amino--1-sulfopropiõnico em água destilada e adicionou-se-lhe 1 ml de hidróxido de tetrabutilamõnio. Agitou-se a solução à temperatura de 60°C durante 1 hora e, em seguida, evaporou-se até á secura. Dissolveram-se os produtos em cerca de 15 ml de tetra--hidrofurano e retirou-se por filtração o excesso do ácido 3--amino-l-sulfopropiõnico. Evaporou-se o filtrado e redissolveu--se em 2 ml de tetra-hidrofurano anidro para subsequente reacção. Preparou-se uma solução de 130 mg de 2'-succiniltaxol e 50 ^il de trietilamina em 4 ml de tetra-hidrofurano anidro e arrefeceu-se esta solução até à temperatura de 0°C. Adicionou-se uma aliquota de 50 ul de cloroformato de isobutilo ã mistura 29

reaccional e deixou-se a solução retomar a temperatura ambiente durante cerca de 15 minutos. Em seguida, adicionou-se 0,6 ml de sal de tetrabutilamónio do ácido 3-amino-l-sulfopropiónico em solução de tetra-hidrofurano (equivalente a 108 mg de ácido 3-amino-l-sulfopropiónico sob a forma de sal de tetrabutilamónio). Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 3 horas e seguiu-se o progresso da reacção por cromatografia em camada fina com acetato de etilo/metanol a 4/1. Em seguida, filtrou-se e evaporou-se a solução reaccional, purificando-se o produto por cromatografia rápida utilizando gel de sílica (um leito de 300 mm x 15 mm, com diclorometano/metanol a 10/1 como eluente). Obtiveram-se 128 mg (rendimento de 71,2%) do sal de tetrabutilamónio de taxol, homogéneo.

Converteu-se o sal de tetrabutilamónio em sal de sódio colocando 120 mg do sal de tetrabutilamónio de 2'-{[4--((3-sulfopropil)amino)-1,4-dioxobutil]oxi}taxol num copo contendo uma resina de permuta iónica Dowex 50 sob a forma Na+ (aproximadamente 3 ml de resina por 3 ml de água desionizada). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 90 minutos e, em seguida, fez-se passar através de uma coluna de resina contendo 2 ml de resina sob a forma de Na+ utilizando como dissolvente água desionizada. A solução foi submetida a azeotropia com acetonitrilo dando 84 mg (rendimento de 79,3%) de sal de sódio de 2'-{[4-((3-sulfopropil)amino)-1,4- -dioxobutil]oxi}taxol: 30 .___-f' o

«=*z>z o=c

I

Os dados para a apresentam- se no Quadro 5 e ressonância magnética nuclear seguida. caracterização deste composto os deslocamentos químicos da apresentam-se no Quadro 6, em 31 QUADRO 5

Valores para Caracterizaçao do Sal de Sódio de 2 ' -<[4- ((3-sulfopropil)amino)-1,4-dioxobutil]oxiítaxol P. F. 168°-169° C í*l) 20d -29° (0,001, MeOH) IV (KBr): 3480, 3000, 1760, 1740, 1660, 1550, 1400, 1260, 1050 cm_1

UvA/ Me°H maX: 279 nm ( & 974) , 271 nm ( & 1240), 228 nm ( 6 12719) EM (FAB): 1119 (MNa+), 1097 (MH+) 32

( * QUADRO 6

Dados De RMN Para

Sal de Sódio de 2'-{[4-((3-sulfopropil)amino)-1,4--dioxobutil]oxi}taxol ~ 1 13

Posição Deslocamento H (ppm de TMS) Deslocamento C

Emparelhamento (hertz) (ppm de TMS) C-l ★ C-2 5,63 (d,7) 74, 8 C-3 3,8 (d,7) 46 C-4 80, 8 C-5 4,99 (d,9) 84, 2 C-6 2,5 m 34,7 C-l 4,34 m 75, 9 C-8 57, 5 C-9 204, 2 C-10 6,44 s 71,3 C-ll 131,6 C-12 141,2 C-l 3 6,05 (t,8) 75,2 C-l 4 2,14 ni 35, 7 C-15 42,8 C-16 1,16 s 25,6 33 £ QUADRO 6 (cont.)

Dados De RMN Para

Sal de Sódio de 2'-{[4-((3-sulfopropil)amino)-1,4--dioxobutil]oxi}taxol ~ 1 13

Posição Deslocamento H (ppm de TMS) Deslocamento C

Emparelhamento (hertz) (ppm de TMS) C-l 7 1,16 s 19,4 C-18 1,93 s 13,6 C-19 1,67 s 8,9 C-20 4,21 s 70,8 C-l ' 172 C-2 ' 5,44 (d,7) 74,2 C-3 ' 5,79 (dd,7,7) 53,6 N-H 7,25 (t,7) CH3(OAC) 2,2 s 20,9 CH3(OAc) 2,4 s 21,6 Bz 7,4-8,1 m 126,8-1 CO(OAc) 169 CO(OAc) 170,2 CO(OBz) 166,4 CO(NBz) 170,2 C-l" 171,9 C-2" 2,75 (t,7) 29 34

QUADRO 6 (cont.)

Dados De RMN Para

Sal de Sódio de 2'-{[4-{(3-sulfopropil)amino)-1,4--dioxobutil]oxi}taxol ~ 1 13

Posição Deslocamento H (ppm de TMS) Deslocamento C

Emparelhamento (hertz) (ppm de TMS)

n 1 2,54 (t,7) 29, 8 C-4 " 171,9 C-l" ' 3,25 m 37,9 C-2" ' 1,98 m 28, 3 C-3" ' 2,85 (t,7) * * * sinal sob CHCI3 ** Sinal sob MeOH pode ser formador um metal

Notar que se considerou que o sódio substituído por um átomo de hidrogénio ou outro grupo de sal, tal como um átomo de um metal alcalino ou de alcalino-terroso ou grupos amónio. 35 EXEMPLO 4 4

Preparou-se uma solução de 26 mg de 2'-succiniltaxol e 20 Jil de trietilamina em 2 ml de tetra-hidrofurano anidro, sob atmosfera de argon, e arrefeceu-se ate a temperatura de 1°C. Adicionaram--se 10 ^il de cloroformato de isobutilo a esta solução e deixou--se a mistura retomar a temperatura ambiente durante cerca de 15 minutos. Após o passo de aquecimento, adicionaram-se 5 jxl de etilenoglicol e agitou-se a mistura reaccional ã temperatura ambiente durante 15 horas, seguindo-se o avanço da reacção por cromatografia em camada fina, com diclorometano/acetato de etilo a 1/1. Interrompeu-se a reacção por filtração do precipitado e evaporação do dissolvente. Purificaram-se os produtos por cromatografia em camada fina (utilizando diclorometano/acetato de etilo a 1:3) obtendo-se 25 mg (rendimento de 83,3%) de 2'--£[4- ((2-hidroxi) -1,4-dioxobutil] oxijtaxol:

0(0¾) 2oh o=c 36 QUADRO 7

Dados de Caracterizaçao para 2 ' [4- ( (2-hidroxietil) oxi) -1,4-dioxobutil] oxij;taxol

P. F. 164°-165°C

[<V.]2°D -32,5° (0,002, MeOH) IV (KBr): 3500, 2950, 1760, 1740, 1660, 1390, 1260, 1160, 1080, 1040 cm"1 UV X/ Me0H raax; 279 nm (£ 609), 272 nm (£,831), 228 nm (£ 14404) EM (FAB): 1020 (MNa+), 998 (MH+) 37 / QUADRO 8

Dados De RMN Para 2'—{[4—((2-hidroxietil)oxi)-1,4-dioxobutil]oxi}taxol

~ 1 11 Posição Deslocamento H (ppm de TMS) Deslocamento C

Emparelhamento (hertz) (ppm de TMS) C-l 79, 1 C-2 5,7 (d,7) 75, 8 C-3 3,8 (d,7) 45,8 C-4 81 C-5 4,95 (d,9) 84,3 C-6 2,56 m 35,6 C-7 4,43 m 75,8 C-8 58, 2 C-9 204 C-10 6, 29 s 72, 1 C-ll 132 C-12 142,3 C-l 3 6,23 (t,8) 75,8 C-l 4 2,42 m 35,6 C-15 43, 2 C-16 1,23 s 26,8 38

QUADRO 8 (cont.)

Dados De RMN Para 2 ' -{[4-((2-hidroxietil)oxi)-1,4-dioxobutil]oxi}taxol ~ 1 1 "í

Posição Deslocamento H (ppm de TMS) Deslocamento C

Emparelhamento (hertz) (ppm de TMS) C-17 1,15 s 20, 5 C-18 1,94 s 14 , 3 C-19 1,70 s 9,8 C-20 4,19 (d, 8 ) 72 , 1 C-l ' 172 , 2 C-2 ' 5,48 (d,3) 74, 3 C-3 ' 5,97 (dd,3,9) 52,9 N-H 7,14 (d,9) CH3(OAc) 2, 25 s 22, 1 CH3(OAc) 2,45 s 22,8 Bz 7,4-8,1 m 126,8-1 CO(OAc) 168 CO(OAc) 169,9 CO(OBz) 167 CO(NBz) 167, 3 C-l" 171 C-2 " 2,65 m 29 C-3" 2,78 m 29 39 QUADRO 8 (cont.)

Dados De RMN Para 21[4-((2-hidroxietil)oxi)-1,4-dioxobutil]oxi|taxol Posição Deslocamento (ppm de TMS) 13 Deslocamento C Emparelhamento (hertz) (ppm de TMS) C-4 " 171 C-l" ' 3,7 (t,7) 66,2 C-2111 4,1 m 61 EXEMPLO 5

Num balão de 10 ml introduziram-se 20 mg de taxol, 40 mg de diciclo-hexilcarbodiimida e 20 mg de ácido N--carbobenzil-^"-aminobutlrico. Dissolveram-se os reagentes em 4 ml de acetonitrilo anidro (obtido por passagem do acetonitrilo através de alumina activada). Apôs a agitação da mistura reaccional ã temperatura ambiente durante 30 horas, filtrou-se a solução para remover o precipitado de diciclo-hexilureia. Em seguida, eliminou-se o dissolvente sob vazio e separaram-se os produtos impuros por cromatografia em camada fina com hexano/acetato de etilo a 45:55. Obtiveram-se deste modo 19,1 mg (rendimento de 75,9%) de 2-'-N-CBZ- ^-aminobutiriltaxol puro. 40

Sintetizou-se o formato de 2'- )f-aminobutiriltaxol por adição de 6 mg de 2'-N-CBZ- V-aminobutiriltaxol a 1,5 ml de metanol. Após a dissolução do derivado de CBZ-taxol, adicionou--se 1 ml de ácido fõrmico para obter uma solução de ácido fõrmico a 40%/metanol. Realizou-se a reacção mediante a adição de 5 mg de paládio a 5% sobre carvão ã solução e agitação ã temperatura ambiente durante 26 horas. Interrompeu-se a reacção por filtração do paládio sobre carvão e secagem do filtrado sob vácuo. Obteve-se o formato de 21 - {T-aminobutiriltaxol:

Após algumas horas, a RMN protònica e a cromatografia em camada fina com diclorometano/acetato de etilo/metanol a 2:1:0,02 mostraram que o formato de -2'-^*--aminobutiriltaxol se tinha decomposto para dar novamente o taxol. EXEMPLO 6

Determinou-se a solubilidade na água do taxol por dissolução de 1,6 mg de taxol em 10 ml de água destilada 41 saturada com 1-octanol numa ampola separadora de 60 ml e adicionaram-se em seguida 10 ml de 1-octanol saturado com ãgua destilada. Agitou-se a ampola e deixou-se repousar durante cerca de 30 minutos até se separarem as fases orgânica e aquosa. Determinou-se a absorção no ultra-violeta a 228 nm da fase aquosa e/ou de octanol, efectuando-se a diluição da fase de octanol 5 vezes antes dessa determinação.

Seguindo o procedimento descrito anteriormente, a partir de 0,8 mg de sal de sódio de 2'- [ (3-sulfo-l--oxopropil) oxi] taxol, 0,8 mg de sal de sódio de 2'-f[4«-((2--sulfoetil)amino)-1,4-dioxibutil]taxol e 0,7 mg de sal de sódio de 2'-|[4-((3-sulfopropil)amino)-1,4- -dioxibutil] oxij-taxol, determinaram-se as respectivas solubilidades na ãgua relativamente ã solubilidade do taxol. Os resultados apresentam-se no Quadro 9. 42 /\ I > QUADRO 9 SOLUBILIDADE NA AGUA DOS DERIVADOS DE TAXOL COMPARATIVAMENTE AO TAXOL Composto Solubilidade Relativa Taxol 1 Sal de sódio de 2'-[ ( 3-sulfo-l--oxopropil)oxi]taxol 210 Sal de sódio de 2 '-{[4-((2-sulfoetil) --amino)-1,4-dioxibutil]oxi}taxol 191 Sal de sódio de 2'-{(4-((3-sulfopropil)--araino)-1,4-dioxibuti1]oxi}taxol 118 O Quadro 9 indica que o derivado 2'-acriloiltaxol tem a maior solubilidade na água, sendo 210 vezes mais solúvel na água do que o taxol. Notar que o derivado 2'-succini1taxol da taurina tem muito maior solubilidade na água do que o derivado do ácido 3-amino-l-sulfopropiómco de 2'-succiniltaxol; contudo, ambos os 43

compostos apresentam solubilidades mais de 100 vezes superiores à do taxol. A menor solubilidade do derivado do ácido 3-amino-l--sulfopropiónico de 2 '-succiniltaxol é provavelmente devida ao aumento do comprimento da cadeia alquilica.

Deste modo, a presente invenção proporciona novos derivados de taxol com solubilidade acrescida na água comparativamente ao taxol tal e qual e que são estáveis durante períodos maiores do que certos derivados anteriores do taxol que tinham solubilidades na água acrescidas. Estes compostos são preparados por novos processos que resultam em rendimentos elevados de compostos essencialmente puros os dados de caracterização e os estudos de ressonância magnética nuclear confirmam a estrutura e as propriedades dos derivados de taxol da presente invenção. Além de terem elevada solubilidade na água e maior estabilidade, estes compostos mantêm a bioactividade e a aplicabilidade com pró-fármacos anti-neoplásicos, anti--leucémicos e anti-cancro.

Na presente invenção incluem-se equivalentes dos derivados de taxol solúveis na água da presente invenção, tais como derivados de 2'-acriloil e do ácido 2'-0-acílico de taxol, que têm uma ou mais cadeias laterais ou substituintes no núcleo constituídos por grupos que não interferem (por exemplo, um grupo substituinte que não altera acentuadamente as propriedades desejáveis nos derivados de taxol da presente invenção), tais como, mas não limitadas a, átomos de hidrogénio, grupos -OH, 44

grupos de fórmula geral -OR ou -NR, Ar ou =o ou outros grupos que não interfiram.

Dos ensinamentos descritos anteriormente, é evidente que se podem fazer muitas modificações e variações da presente invenção. Portanto, deve entender-se que esta invenção pode ser realizada de outro modo além das formas especificamente descritas. EXEMPLO 7

Embora a partir do Exemplo 1 seja evidente que outros membros da família do ácido acrílico, tais como, mas não limitado a, ácido acrílico substituído nas posições alfa e/ou beta com grupos alquilo, alceno, arilo e cíclicos, prepararam-se outros os derivados do taxol e do ácido acrílico para demonstrar de forma conclusiva que outros membros da família do ácido acrílico podem reagir com taxol de forma equivalente à do ácido acrílico. Trataram-se 22 mg de taxol, num balão seco, sob atmosfera de árgon, à temperatura de 0°C, com 1 ml de uma solução preparada a partir de 39,9 mg de diciclo-hexilcarbodiimida, 16,0 mg de ácido trans-cinâmico e aproximadamente 4,0 ml de acetonitrilo anidro. Adicionou-se uma quantidade catalítica de dimetilaminopiridina (DMAP) e seguiu-se a reacçao por cromatografia em camada fina. Após 15 minutos, adicionou-se uma segunda porção de 1 ml de solução reagente. Após decorrida cerca de 30 minutos, aqueceu-se a mistura até à temperatura de 25°C e deixou-se repousar durante 45

1 hora. A reacçao deu 10,4 mg de 2'-trans-cinamoiltaxol (rendimento aproximado de 65%). O espectro de ressonância magnética nuclear de 2'-trans-cinamoiltaxol apresenta-se na Figura 2. EXEMPLO 8

Num balão seco, lavado por uma corrente de argon, i introduziram-se 23 mg de taxol, e tratou-se ã temperatura de 0°C com 1 ml da solução preparada a partir de 40 mg de diciclo -hexilcarbodiimida, 10,0 mg de ácido crotónico e 4 ml de acetonitrilo anidro. Adicionou-se uma quantidade catalítica de dimetilaminopiridina (DMAP) e seguiu-se a reacçao por cromatografia em camada fina. Após 15 minutos, adicionou-se uma segunda porção de 1 ml da solução reagente e decorrida cerca de meia hora, aqueceu-se a mistura até â temperatura de 25°C e \ ^ deixou-se repousar durante 1 hora. A purificação e a análise confirmaram a síntese de 2' -trans-crotonil-taxol com um rendimento de 45%). Apresenta-se na Figura 3 um espectro de ressonância magnética nuclear de 21-trans-crotonil-taxol. 46

Claims

1

ι REIVINDICAÇÕES 1·- Processo para a preparação de compostos de fórmula geral C

CX=CHX (I) 2

na qual X representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo ou arilo, caracterizado pelo facto de se esterificar o taxol com um ácido da família do ácido acrílico.

2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual X represen ta um átomo de hidrogénio, caracterizado pelo facto de se utili zarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

3.- Processo para a preparação de compostos de fórmula geral

2 (II) na qual X representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo ou arilo? e M representa um átomo de hidrogénio, um grupo amónio ou um metal alcalino, 'v. 3

caracterizado pelo facto de se realizar uma reacção de Michael r*-\ no grupo vinilo em posição''" do ester 2’-acriloilico preparado pelo processo descrito na reivindicação 1 com um nucleófilo pa ra se obterem derivados de taxol solúveis em água, sendo o citado nucleófilo escolhido entre um grupo constituído por iões bissulfito ou sulfito e apresentando os derivados hidrossolú-veis resultantes a fórmula geral seguinte

(III) na qual R representa um grupo de fórmula geral -CHX-CHX-SC^O-M na qual X representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo ou arilo; e M representa um átomo de hidrogénio, um grupo amõ nio ou um metal alcalino.

4.- Processo de acordo com a reivindicação 3, para a preparação de compostos de fórmula geral II na qual X representa um átomo de hidrogénio e M representa o metal sódio, caracteriza 4

do pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondente mente substituídos.

5. - Processo de acordo com a reivindicação 3, carac-terizado pelo facto de se realizar a esterificação descrita na reivindicação 1 na presença de cloroformato de isobutilo como agente de acoplamento.

6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, carac-terizado pelo facto de se realizar a esterificação descrita na reivindicação 1 efectuando as fases seguintes; (al) dissolução da trietilamina e o ácido acrílico es colhido em tetra-hidrofurano sob atmosfera de árgon para se obter uma primeira solução; (a2) arrefecimento da solução obtida em (al) até uma temperatura próxima de 0°C; (a3) adição do cloroformato de isobutilo â primeira solução preparada em (al) para se obter uma segunda solução, e aquecimento dessa segunda solução até uma temperatura próxima da temperatura ambiente; (a4) adição de taxol ã segunda solução obtida em (a3) para se obter um derivado 2'-acriloílico do taxol; (a5) precipitação e secagem do derivado 2'-acriloílico do taxol; e de se realizar a reacção de Michael descrita na reivindicação 3 efectuando as fases seguintes: (bl) dissolução do derivado 2 '-acriloílico do taxol preparado na reivindicação 1 em isopropanol para se obter uma terceira solução; (b2) dissolução de meta-bissulfito de sódio em água destilada para se obter uma quarta solução; e (b3) junção da terceira e quarta soluções para se obterem derivados de taxol solúveis na água.

7.- Processo para a preparação de compostos de fórmula geral AnO OH

(III) na qual R representa um grupo de fórmula geral - (CH^)n-CO-NH-(CH2)z-S020-M ou - (CH ) n-C0-0- (C^) Z~0H em que M representa um átomo de hidrogénio, um grupo amónio ou um metal alcalino; n representa um número inteiro de 1 a 3; 6

y representa ο número inteiro 1 ou 2 com a condi ção de y não representar o número inteiro 1 quan do n representa esse número; e Z representa o número inteiro 2 ou 3, caracterizado pelo facto (a) para a preparação de compostos de fórmula geral III na qual R representa um grupo de fórmula geral - (CHy)n-CO-NH-(CH2)Z-SO2-O-M na qual M representa um grupo amónio, n representa um número inteiro de 1 a 3, Y representa o nú mero inteiro 1 ou 2 com a condição de y representar o número in teiro 2 quando n representa o número inteiro 1, e Z representa o número inteiro 2 ou 3, (1) de se fazer reagir um derivado ácido 2'-0-acíli-co do taxol com um sal do ácido aminossulfónico solúvel num dissolvente orgânico para se obter o derivado 2'-0-acílico do taxol pretendido, ou (2) de se fazer reagir taxol com um composto de fõr mula geral HOOC—(CHy)n-CO-NH-(CH2)z-S020-M na qual M representa um grupo amónio; n representa um número inteiro de 1 a 3; y representa o número inteiro 1 ou 2, com a condição de y representar o número inteiro 2 quando n representa o número inteiro 1; e 7 Z representa ο número inteiro 2 ou 3, para se obter o derivado de taxol pretendido.

8.- Processo de acordo com a reivindicação 7, para a preparação de compostos de fórmula geral III na qual y representa o número inteiro 2, n representa o número inteiro 2 e z representa o número inteiro 2, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

9. - Processo de acordo com a reivindicação 7, para a preparação de compostos de fórmula geral III na qual y representa o número inteiro 2, n representa o número inteiro 2 e z repre senta o número inteiro 3, caracterizado pelo facto de se utiliza rem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

10. - Processo de acordo com a reivindicação 7, para a preparação de compostos de fórmula geral III na qual M representa um grupo amónio quaternário, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos .

11.- Processo de acordo com a reivindicação 7, para a preparação de compostos de fórmula geral III na qual R repre- 9 8 I um grupo de fórmula geral -(CH ) -CO-OH na qual y represen . . ^ y n ^ i v _ ίο ou um metal úmero inteiro 1 ou 2 e n representa um número inteiro de 1 om a condição de y representar o número inteiro 2 quando n enta o número inteiro 1, caracterizado pelo facto de se ar o processo (1) da reivindicação 7 efectuando as fases tes: (al) adição de um composto de fórmula geral nh2-(ch2)z-so3h na qual Z representa o número inteiro 2 ou 3, solução aquosa de um derivado de amónio para se obterem e fórmula geral nh2-(ch2)z-so3m na qual Z tem os significados definidos antes; e M representa um derivado de amónio; e (a2) reacção de um derivado ácido 2'-0-acílico do com o sal preparado em (al).

12.- Processo de acordo com a reivindicação 11, ca-:izado pelo facto de se converter o grupo amónio em um áto hidrogénio ou um metal alcalino.

13.- Processo de acordo com a reivindicação 7, ca-:izado pelo facto de se converter o grupo amónio do deri-

BAD ORIGINAL /

t e (b) de se realizar uma reacção de Michael no grupo vinilo em posição 0?do composto obtido em (a) com um nucleófilo para se obterem derivados do taxol solúveis em água, sendo o citado nucleófilo escolhido entre um grupo constituído por iões bissulfito ou sulfito e apresentando os derivados hidros-solúveis resultantes a fórmula geral III citada antes. Estes compostos exibem acção antitumoral. m * **'

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