PT97877A - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas contendo peptidos homeocaixas (semelhante a caixa) - Google Patents
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Description
CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (C.N.R.S.) PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO PÉPTIDOS HOMEOCAIXAS (SEMELHANTES A CAIXAS) A presente invenção diz respeito â utilização de péptidos homeocaixas (semelhantes a caixas), ou de péptidos derivados deste últimos, para a preparação de medicamentos.
Sob o nome de péptidos homeocaixas designa-se uma família de sequências peptldicas aparentadas, cue se encontra em diferentes espécies animais nos produtos de genes implicados na embrigénese.
Conhece-se, com efeito, genes que se exprimem em diferentes estádios do desenvolvimento embrionário e cuja expressão controla os fenómenos de migração e de diferenciação celulares implicados na morfogénese do organismo.
Estes genes são chamados genes homeotípicos e os seus produtos de tradução são chamados homeoproteínas.
Um destes genes que foi particularmente estudado, é o gene Antennapedia da Drosophile; a análise deste gene permitiu demonstrar uma sequência de ADN de cerca de 180 pb, baptizada sequência homeocaixa. -2-
Esta sequência homeocaixa apresenta a particularidade de ser claramente conservada em numerosos genes homeotipicos e isto, não somente na Drosophile, mas igualmente durante a evolução, nas diferentes espécies animais. Sequências homeocaixa homólogas da de Drosophile foram também encontradas em todos os vertebrados, incluindo os mamíferos [ACAMPORA e colab., "NUCLEIC ACID RES.", 17, 10385 , (1989)] . A sequência homeocaixa codifica para uma sequência polipé-ptídica de 60 aminoácidos, que corresponde a uma região estrutu-ralmente e funcionalmente conservada presente em todas as homeo-proteínas, o homeodomínio. A sequência do homeodomínio que é codificada pela sequência homeocaixa do gene Antennapedia é indicada a seguir, como exemplo. (I) NH2Arg Lys Arg Gly Arg Gin Thr Tyr Thr Arg Tyr Gin Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe His Phe Asn Arg Tyr Leu Thr
Arg Arg Arg Arg Ile Glu Ile Ala His Ala Leu Sys Leu Thr
Glu Arg Gin Ile Lys Ile Trp Phe Gin Asn Arg Arg Met Lys
Trp Lys Lys Glu AsnCOOH. 0 papel e o mecanismo de acção da sequência homeodomínio foram objecto de diversas pesquisas. Sabe-se, assim, actualmente, que esta sequência permite a fixação das homeoproteínas ao ADN, ao nível de sequências consenso incluindo o motivo ATTA, presentes nos promotores ou as sequências de amplificação de diferentes genes, compreendendo os próprios genes homeocaixa. MULLER e colab. [EMBO J., ]_, 4299, (1988)] clonaram a sequência homeocaixa da Antennapedia e purificaram o polipéptido correspondente, ou péptido homeocaixa (pAntp). Na presença de um agente redutor, obtiveram o polipéptido sob a forma de um monómero, de coeficiente de sedimentação de cerca de 1 S, e de peso molecular aparente 9040 Da (Peso molecular teórico, depois da sequência peptídica = 8545 Da).
Na ausência de agente redutor, a preparação do polipéptido contém uma importante proporção de dímeros, correspondente à dos homeodomínios ligados entre eles por pontes dissulfureto.
Estes mesmos autores demonstraram igualmente que o polipéptido purificado sob a forma monomérica se ligava ao ADN, ao nível de uma sequência ANNNNCATTA, contendo, portanto, a sequência consenso ATTA.
Dado o grau muito elevado de conservação das sequências homeocaixa de uma espécie para a outra, considera-se que as propriedades do péptido pAntp podem ser generalizadas aos outros péptidos homeocaixa, podendo diferir na sua sequência por alguns aminoácidos, mas dotados de propriedades funcionais quase iguais; -4- na memória descritiva que se segue, a expressão "péptido homeo-caixa" designará indiferentemente quer o péptido pAntp como qualquer outro membro da dita família, ou de uma família próxima, por exemplo a família "engrailed" (denteada).
Outros trabalhos [OTTING e colab., "EMBO J.n, 4305, (1988) estabeleceram que o homeodomínio possui uma estrutura particular (hélice/volta p/hélice), que estará implicada na ligação ao ADN. A ligação péptido homeocaixa/ADN será a resultante : - q _iπμ de uma ligaçao de alta afinidade (K^ = 10-10 ), implicando a sequência consenso ATTA, e de uma ligação de fraca afinidade (KD = 10~6-10~^M), implicando o sulco largo da dupla hélice do ADN. Uma publicação de KISSINGER e colab. ["Cell", 6_3, 579-590, (1990)] descreve um estudo feito mediante cristalografia sobre um complexo "homeodomínio engrailed/ADN". Este estudo demonstra que a parte C terminal do homeodomínio, compreendendo em particular, a estrutura denominada hélice 3 (aminoácidos 42-58 do homeodomínio "engrailed"-denteado), se fixa ao nível do sulco largo do ADN. A ligação é essencialmente assegurada por interacções hidrófilas; esta ligação será independente da presença da sequência consenso.
Apesar de se dispor agora de numerosos dados, obtidos "in vitro" e em sistema acelular, sobre a ligação péptido homeo- caixa/ADN, ignora-se até ao presente quais serão as consequências sobre as funções celulares. Ignora-se mesmo se os péptidos homeo-caixa serão susceptíveis de possuir uma actividade própria, ou se o seu papel se limitará simplesmente a permitir a ligação homeo-proteína/ADN.
Ora, estudando a acção de péptidos homeocaixa sintéticos sobre as culturas celulares, os Inventores descobriram propriedades surpreendentes dos ditos péptidos, propriedades que nunca foram conjecturados até então.
Verificaram, com efeito, que os péptidos homeocaixas sintéticos, quando adicionados a células nervosas em cultura, penetram em todas as células da cultura e que a entrada dos péptidos nos neurónios é seguida de uma acumulação no núcleo. Esta acumulação é não só bloqueada mediante pré-incubação com um oligonucleotido contendo a sequência consenso ATTA, mas igualmente mediante pré--incubação com fragmentos de ADN de dupla cadeia não específico (quer dizer não contendo a sequência consenso).
Os Inventores, analisando este processo de penetração, demonstraram a importância neste da região correspondente à hélice 3+4 (27 últimos aminoácidos do péptido homeocaixa).
Observaram, igualmente, a penetração de polipéptidos comportando este péptido homeocaixa.
Observaram igualmente este fenómeno, ainda que em menor grau em outros tipos de culturas de células sem ser as células nervosas
Os Inventores demonstraram, além disso, que a acumulação de péptidos homeocaixas no núcleo é acompanhada de um crescimento e de uma diferenciação celular intensa.
Estas propriedades dos péptidos homeocaixas, demonstradas pelos Inventores, permitem a sua utilização para a obtenção de novos medicamentos, assim como a sua utilização "in vitro" como agente activo sobre culturas celulares.
Com efeito, deduz-se dos trabalhos dos Inventores que os péptidos homeocaixas ou fragmentos destes, são da mesma forma capazes de fornecer novos factores de crescimento, em particular neurotrópicos, e/ou novos vectores de transporte transmembranares e intracelulares de moléculas activas sobre as funções celulares, em particular péptidos de oligonucleótidos.
Ora, qualquer uma destas aplicações responde às necessidades actuais. Foram objecto de diferentes trabalhos de que se faz uma breve referência adiante. 0 interesse dos vectores de transporte intracelulares de péptidos ou de oligonocleótidos, aparece consecutivamente na demonstração que alguns péptidos e oligonucleótidos, fixando-se -7- especificamente sobre certas regiões do ADN, sao susceptiveis de agir sobre as funções celulares (por exemplo, proteínas que activam ou reprimem a expressão de um gene, oligonucleótidos anti-sentido, etc.).
Contudo, uma exploração efectiva, em particular com um objectivo terapêutico, das propriedades destas moléculas, implica fazê-las chegar à base de construção mediante passagem de numerosas barreiras que separam o meio extracelular do ADN e em particular a membrana citoplasmática. Ora, muito frequentemente, estas moléculas, pela sua carga, e sua elevada massa molecular, não podem, elas próprias, transpor esta barreira. Foram propostas diferentes soluções para este problema; algumas de entre elas, relativas a sequências oligonucleotídicas são por exemplo citadas como introdução na publicação de LEMAITRE e colab. ["Proc. Natl. Acad. Sei. USA" 8A_, 648-652 (1987)]. Estes autores propõem uma aproximação consistindo em ligar de modo covalente uma sequência oligonocleotídica complementar de uma sequência do ARN do vírus da estomatite visicular (VSV), a um polímero de (L-lisina). 0 conjugado obtido penetra nas células e inibe especifica-mente a síntese das proteínas do VSV nas células infectadas.
Estes resultados demonstram o interesse da associação entre uma macromolécula activa e um vector de transporte da dita macro-molécula. É por conseguinte, desejável pesquisar novos vectores.
No que diz respeito aos factores de crescimento activos sobre a sobrevivência e a diferenciação dos neurónios, apenas se conhece actualmente um pequeno número; o primeiro a ser demonstrado foi o Nerve Growth Factor (NGF). A acção do NGF exerce-se essencialmente sobre os neurónios sensoriais e os neurónios do sistema nervoso simpático; foi igualmente demonstrada uma acção sobre certas células do sistema nervoso central e do sistema imunitário. A actividade neurotrópica do NGF é transportada por uma sub-uni-dade (sub-unidade J5) de 118 aminoácidos.
Outras substâncias com acção neurotrópica foram igualmente descritas: são por exemplo, o Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) [LIN e colab., SCIENCE, 246, 1023-1026, (1989); STOCKLI e colab. NATURE, 342, 920-923, (1989)], o Brain Derived Neurotropic Factor (BDNF) [LEIBROCK e colab., NATURE, 341, 149-152, (1989)], o Glial Derived Nexin (GDN), componente da matriz extracelular [GLOOR e colab., CELL, 47, 687-693, (1986)].
Factores de crescimento mais ubiquitários como o Fibroblast Growth Factor (FGF) [PARK e HOLLENBERG, DEV. BIOL., 134, 201-205, (1989)] ou o Epidermial Growth Factor (EGF) [MORRISON e colab., "SCIENCE, 238 72-74, (1987)] têm igualmenteuma acção neurotrópica. 0 mecanismo de acção destes factores é actualmente mal conhecido. Demonstrou-se que o NGF penetra nos neurónios por intermédio de um receptor específico, que é uma glicoproteina fosforilada [CHAO e colab. "Science, 232, 518 (1986)]. No interior da célula nervosa, o NGF estimula a síntese do ARN, por intermédio de um segundo mensageiro.
Numerosas experiências demonstram o interesse terapêutico potencial dos factores de crescimento neurotrópicos. A utilização do NGF foi por exemplo sugerida na doença de Alzheimer. Foi, com efeito, demonstrado, que o NGF permite aumentar a actividade colina-acetiltransferase dos neurónios colinérgicos e prevenir a sua degenerescência [MOBLEY e colab., "Science", 229, 284 (1984)], [KROMER, "Science, 235, 214, (1987)]. Ora, sabe-se que a doença de Alzheimer está associada a uma degenerescência dos neurónios colinérgicos e a uma diminuição da actividade colina-acetiltransferase.
Experiências realizadas sobre ratos adultos em que havia colinérgica que liga o hipocampo e o cepto foi previamente destruída (o que leva a uma degenerescência dos neurónios ceptais), demonstraram que a injecção intra-ventricular de NGF permite a sobrevivência dos neurónios ceptais assim como a restauração de uma actividade normal colina-acetiltransferase (WILL e HEFTI, "Behav, Brain. Res.", 17,17 (1985)]. A utilização dos factores de crescimento neurotrópicos foi igualmente encarada no caso da doença de Parkinson, ligada a uma degenerescência dos neurónios dopaminérgicos. -10-
Uma outra tentativa do tratamento das doenças associadas a uma degenerescência neuronal foi recentemente proposta e parece prometer, num futuro próximo, um desenvolvimento importante: trata-se de enxertos intracerebrais de células que possam substituir as funções neuronais deficientes; a utilização de neurónios fetais [Lindvall e colab., SCIENCE, 24 7, 574-577, (1990)] ou de linhas celulares transformadas [HORELLOU e colab., "EUR. J. NEUROSCI"., 2, 116-119, (1990)] foi igualmente sugerida.
Recentemente, células transformadas produzindo um NGF recom-binante foram implantadas no cérebro de ratos, ao mesmo tempo que neurónios colinérgicos de origem fetal. Verificou-se que, nestas condições, a sobrevivência dos neurónios enxertados, assim como a neugénese de fibras nervosas eram consideravelmente aumentadas [ERNFORS e colab., "Proc. Natl. Acad. Sei. USA", 86, 4756, (1989)].
Estes trabalhos demonstram, por conseguinte, que os factores de crescimento neurotrópicos podem encontrar aplicações particularmente interessantes no tratamento dos distúrbios resultantes de lesões ou de degenerescência neuronal.
Uma restrição à utilização dos factores de crescimento neurotrópicos é contudo, constituída pelo pequeno número de factores de crescimento actualmente conhecidos, assim como pela sua especificidade de acção relativamente estreita, limitada a certos tipos de neurónios. Além disso, a maior parte destes 11- f factores de crescimento nao podem, actualmente, ser obtidos em quantidade suficiente para uma utilização terapêutica.
Será por conseguinte, particularmente desejável poder dispor-se de factores de crescimento neurotrópicos que não apresentem os inconvenientes acabados de mencionar. A presente invenção, pela demonstração das propriedades inesperadas dos péptidos homeocaixas, propõe uma resposta nova aos dois problemas que acabam de ser expostos. A presente invenção tem por objectivo um polipéptido escolhido no grupo constituído pelos péptidos homeocaixas e os fragmentos destes, para a utilização como medicamento.
No sentido da presente invenção, entende-se por péptido homeocaixa, qualquer péptido pertencente ãs famílias anteriormente definidas e, em particular, qualquer sequência de aminoácidos que apresente com o péptido pAntp da Drosophile, uma homologia que permita a fixação deste péptido a uma dupla hélice do ADN.
De acordo com um modo de realização preferido da presente invenção, o dito polipéptido compreende a sequência correspondente à hélice 3 de um péptido homeocaixa.
De acordo com um modo de realização preferido da presente invenção, o péptido homeocaixa é o péptido pAntp.
De acordo com um modo de realização preferido da presente invenção, o péptido homeocaixa ou o seu fragmento, como definidos antes, são ligados a uma outra sequência peptídica.
De acordo com um outro modo de realização preferido da presente invenção, o péptido ou o seu fragmento, são ligados a uma sequência nucleotídica.
Os péptidos homeocaixas, ou fragmentos destes, assim como os seus produtos de fusão com uma outra sequência polipeptídica podem ser facilmente obtidos de acordo com processos já conhecidos, por exemplo mediante síntese peptídica, ou então mediante engenharia genética. Os produtos de fusão de um péptido homeocaixa- e de uma sequência oligonucleotídica podem ser obtidos por exemplo de acordo com a técnica descrita por LEMAITRE e colab. ["Proc. Natl. Acad. Sei. USA", 84, 648-652 (1987)].
As propriedades de penetração intracelular dos péptidos homeocaixas e dos seus fragmentos permitem a sua utilização para introduzir nas células de moléculas activas sobre as funções celulares, em particular outros péptidos, ou sequências nucleo-tídicas dotadas de propriedades farmacológicas. 13- /
Pode-se utilizar um péptido homeocaixa ou um fragmento de péptido homeocaixa contendo a hélice 3, que reconhece independentemente da sequência, a estrutura da molécula de ADN (sulco largo); sendo a ligação a uma sequência específica de ADN ou de ARN assegurada então pelo péptido ou o oligonucleotido ligado ao péptido homeocaixa ou ao fragmento de péptido homeocaixa.
De acordo com a presente invenção, os polipéptidos comportando um péptido homeocaixa ou um fragmento deste são igualmente utilizáveis como factores de crescimento, em particular neuro-trópicos, tanto "in vivo" como "in vitro".
Contrariamente aos factores de crescimento neurotrópicos conhecidos na técnica anterior, os péptidos homeocaixas são activos sobre um grande número de tipos de neurónios. Os inventores observaram, em particular, a actividade do pAntp sobre células nervosas preparadas a partir de diversas regiões do sistema nervoso central embrionário, em particular a medula espinal, o rombencéfalo, o mesencéfalo ventral, o tecto e o cortéx. A actividade sobre as células corticais é particularmente surpreendente, visto que até hoje nenhuma expressão de homeoproteínas foi revelada nesta região do cérebro. 0 largo espectro de acção dos péptidos homeocaixa, torna-os agentes farmacológicos de um grande interesse, particularmente no tratamento de lesões ou degenerescências neuronais. Podem igual- -14- ''Λ. mente ser utilizados no domínio dos enxertos intracerebrais de neurónios, que são chamados a desenvolver-se e para os quais é indispensável assegurar a sobrevivência assim como o desenvolvimento mais rápido e o mais extenso em volume do enxerto celular.
Isto pode ser realizado, por exemplo, mediante pré-incubação dos neurónios e enxertar com um factor de crescimento de acordo com a presente invenção, ou então mediante realização de um enxerto conjunto de células embrionárias com células transformadas, capaz de sintetizar e de segregar péptidos homeocaixa, ou péptidos de fusão contendo uma sequência homeocaixa. A presente invenção tem igualmente por objectivo um processo para o tratamento "in vitro" de neurónios destinados ao enxerto, caracterizado pelo facto de se incubar os referidos neurónios na presença de pelo menos um péptido homeocaixa, eventualmente ligado a uma outra sequência peptídica ou oligonucleotídica. A presente invenção diz, além disso, respeito a uma composição celular utilizável em técnicas de enxerto de neurónios, caracterizado pelo facto de conter uma associação dos neurónios que se pretende enxertar e de células transformadas aptas para sintetizar e segregar um péptido homeocaixa.
Os Inventores estudaram, igualmente, a acção dos péptidos homeocaixas não somente em culturas celulares, mas igualmente -15- sobre organismos pluricelulares. Verificaram, também, que graças à rapidez de penetração dos péptidos homeocaixas, estes entram de modo localizado em células adjacentes ao ponto de injecção.
Esta propriedade oferece a vantagem no quadro de uma utilização sobre um organismo vivo, que permite aplicar, se se pretender, um tratamento muito exacto, localizado, a um grupo de células. A presente invenção será melhor compreendida com a ajuda do complemento da descrição que se segue, que se refere a exemplos que demonstram a actividade dos péptidos homeocaixas. É evidente, contudo, que estes exemplos são dados unicamente a titulo de ilustração do objectivo da presente invenção, não constituindo de modo algum uma limitação.
I) OBTENÇÃO DE FACTORES DE CRESCIMENTO DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO EXEMPLO 1: Obtenção de um péptido pAntp A sequência que codifica para o homeodominio do gene Anten-napedia da Drosophile foi sintetizada utilizando a técnica da PCR, a partir do plasmídeo p903G que contém, entre os seus sitios BamHl e PVUII, um fragmento de 600bp do Antp (GARBER e colab., -16- / (1983). Utilizam-se os dois iniciadores cuja sequência se indica a seguir: 0 primeiro iniciador: (5'GGGGGAATTCCATATGCGCAAACGCGCAAG 3') contém um sítio de restrição Ndel a montante do codão de iniciação, e o segundo iniciador: i (5'GGGGAAGCTTGGATCCTCAGTTCTCCTTCTTCCACTTCAT 3') contém um codão de terminação seguido de um sítio BamHl.
Um plasmídeo, denominado pAHl é formado por ligação do fragmento Ndel-BamHl de 220 bp obtido mediante PCR, ao plasmídeo pET3a (ROSENBERG e colab., 1987). 0 polipéptido é, em seguida, expresso em "E. Coli" BL 21 (Lys S). Cultivam-se as células transformadas a 37°C no meio LB na presença de ampicilina e de cloramfenicol (100jtg cada um), até uma densidade óptica DO^qq = 1,2. Depois de uma indução de 5 horas na presença de 1 mM de IPTG, recolhem-se as células mediante centrifugação (16000 gramas, 15 minutos), lavam-se três vezes com tampão de fosfato 50 mM, pH 7,5, NaCl 400 mM, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM, DTT 1 mM (tampão A) e submetem-se, depois, a uma sonicação (acção de ultra-sons).
Após centrifugação (16000 gramas, 15 minutos) precipita-se o sobrenadante com sulfato de estreptomicina (20 mg/ml) mediante agitação suave durante 15 minutos â temperatura ambiente e centri-fuga-se depois (16000 gramas, 15 minutos). -17- -17-
Introduz-se directamente o sobrenadante em uma coluna S-SEPHAROSE Fast Flow (PHARMACIA), previamente equilibrada com o tampão A. Lava-se em seguida a coluna com uma grande quantidade de tampão de fosfato 50 mM pH 7,5, NaCl 0,5 M e elui-se o péptido pAntp mediante aplicação de um gradiente de NaCl (0,5 a 1 M). Submete-se em seguida o péptido eluido (3 mg/1 de cultura) a uma diálise durante 24 horas contra o tampão de fosfato 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM.
Determinou-se as sequências do segmento de ADN amplificado e do péptido (APPLIED BIOSYSTEM 477) e verificou-se que elas correspondem às do homeocaixa de Antennapedia. A análise do péptido mediante electroforese sobre gel na presença de SDS demonstrou a presença de uma única banda de peso mulecular correspondente â do homeopéptido de Antennapedia. A sequência do péptido obtido é a seguinte :
I NH2Arg Lys Arg Gly Arg Gin Thr Tyr Thr Arg Tyr Gin Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe His Phe Asn Arg Tyr Leu Thr
Arg Arg Arg Arg Ile Glu Ile Ala His Ala Leu Cys Leu Thr
Glu Arg Gin Ile Lys Ile Trp Phe Gin Asn Arg Arg Met Lys
Trp Lys Lys Glu AsnCOOH
Verificou-se, além disso, mediante retardamento sobre gel do péptido pré-incubado com um duplex oligonucleotídico correspondente ao sitio de ligação de uma proteína homeocaixa do tipo Antennapedia, e obtida a partir do promotor Hoxl.3 [Hoxl.3p, (ODENWALD,e colab., "GENES AND DEV.", 3, 158, 1989)]: 3’ CAGAGCACGTGATTACCCCCTCAACC 5' 5' GTCTCGTGCACTAATGGGGGAGTTGG 3' que o péptido reconhece "in vitro" a sequência consenso de fixação das proteínas do tipo Antennapedia.
II) DEMONSTRAÇÃO DA ACTIVIDADE DOS FACTORES DE CRESCIMENTO DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO EXEMPLO 2 : Demonstração do efeito biológico do péptido pAntp sobre neurónios em cultura
Os neurónios recolhidos em diferentes regiões do cérebro (mesencéfalo, corda espinal, cortéx) de embriões (E14 a E16) de rato são colocados em cultura em um meio definido (CHAMAK and PROCHIANTZ, DEVELOPMENT, 106, 483, 1989) que só permita a sobrevivência das células neuronais (meio CDM).
Submete-se o péptido pAntp a uma renaturação mediante incubação durante 10 minutos a 60°C na presença de ditiotreitol (0,1 mM) e de magnésio (10 mM) em um tampão de fosfato pH 7,2 isotónico contendo 33 mM de D-Glucose. Adiciona-se o péptido às -19-
Os efeitos observados depois da adição do péptido estão ilustrados na figura 1 (A e B). A figura IA mostra o aspecto de células testemunhas cultivadas durante 24 horas sem péptido. A figura 1B mostra o aspecto das células cultivadas durante 24 horas na presença do péptido. Verifica-se, após 24 horas depois da adição, um aumento considerável do crescimento neurítico nas células cultivadas na presença do péptido pAntp.
Os mesmos resultados sobre o crescimento celular foram, além disso, observados aquando de experiências em que as células eram pré-incubadas com péptido pAntp e depois colocadas em cultura durante 24 horas em meio CDM desprovido do péptido. Uma incubação de 30 minutos na presença de pAntp permite já observar os efeitos descritos antes; estes efeitos são máximos depois de uma incubação de 2 horas e não aumentam com um prolongamento do tempo de pré-incubação. A pré-incubação do péptido homeocaixa com a sequência consenso de fixação obtida a partir do promotor Hoxl.3, ou então com uma mistura de fragmentos (de sequência aleatória) de ADN em dupla hélice, bloqueia o seu efeito biológico.
Demonstra-se, além disso, mediante utilização de um péptido marcado com fluoresceína, que o péptido homeocaixa é rapidamente -20- (menos de 2 horas) capturado por todos os neurónios, transportado depois, no núcleo (figura 2A) e que este transporte é bloqueado após pré-incubação com o oligonucleótido consenso obtido a partir do promotor Hoxl.3 ou então com uma mistura de fragmentos (de sequência aleatória) de ADN em dupla hélica (figura 2B).
Efectuou-se, igualmente, uma comparação entre a entrada e a repartição intracelular do péptido pAntp e da poliornitina.
Incubou-se, as células durante 1 hora na presença de pAntp ou de poliornitina, marcadas com fluoresceína.
Os resultados estão ilustrados na figura 3 que mostra que o pAntp marcado (3A) se encontra principalmente no núcleoplasma, contrariamente à poliornitina presente na soma e nos nucléolos (3B) . EXEMPLO 3 : Penetração do péptido pAntp nos fibroblastos em cultura
Os fibroblastos são obtidos a partir da pele de embriões de ratos, dissociados mecanicamente e tripcinizados; sendo as células cultivadas em caixas de vidro recobertas com poli-DL--ornitina (SIGMA, PM 40.000, 15ycg/ml) , em meio de cultura DMEM-F12 (GIPCO-PRL), e na presença de 10% de soro de vaca fetal. Depois de 24 horas de cultura, incubam-se as células durante 1 -21- / hora na presença de péptido pAntp marcadas com fluoresceína. 0 péptido pAntp marcado penetra nos fibroblastos, mas está presente no núcleo em menor quantidade que nas células nervosas. EXEMPLO 4 : Penetração do péptido pAntp nas células embrionárias "in vivo"
Injecta-se 0,2pX de solução (1 jtfèldo péptido pAntp marcado com fluoresceína, no mesencéfalo de um embrião de codorniz com 2 dias. Após 4 horas de incubação "in-ovo", extrai-se o embrião do ovo e efectuam-se cortes do mesencéfalo. A observação destes cortes ao microscópio mostram que a marcação fluorescente está localizada no núcleo das células situadas na proximidade imediata do ponto de injecção.
Sobressai, assim, da descrição anterior, que a presente invenção não se limita unicamente a estes modos de utilização, de realização e de aplicação que acabam de ser descritos de modo mais pormenorizado; engloba, pelo contrário, todas as veriantes que possam vir ao espírito do especialista na matéria, sem se sair do quadro, nem do alcance, da presente invenção.
Claims (13)
- 22 c REIVINDICAÇÕES 1. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eíectiva compreendida entre 0,01 e 100% de um polipeptido como ingrediente activo escolhido no grupo constituído por péptidos homeocaixas e os fragmentos destes últimos, com agentes auxiliares de formulação apropriados.
- 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte- 23 rizado por c referido polipeptido compreender a sequência da hé lice 3 de um péptido homeocaixa.
- 3. _ Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, caraczerizado por o referido péptido homeocaixa ser o péptido pAntp.
- 4. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o referido polipeptido estar liga do a uma sequência polipeptídica.
- 5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o referido polipeptido estar liga do a uma sequência oligonucleotlcica.
- 6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de se obter um factor de crescimento celular, em particular neurotrópico.
- 7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de se obter um vector de transporte intracelular de moléculas activas sobre as funções celulares. 24
- 8. - Processo de cultura celular, caracuerizado pelo fac to de se promover a cultura das células na presença de um polipeptidc tal como definido nas reivindicações 1 a 5.
- 9. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracteri zado por o referido polipeptido ser utilizado como factor de crescimento.
- 10. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracte-rizado por o referido polipeptido ser utilizado como vector de transporte intracelular de moléculas activas sobre as funções celulares.
- 11. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindica ções 8 a 10, caracterizado por as células em cultura serem neu-rónios.
- 12. - Processo de tratamento in vitro de neurónios desti nados a enxerto, caracterizado por os referidos neurónios serem incubados na presença de uma quantidade compreendida entre 0,1 ug e 1 mg/ml de pelo menos um péptido homeocaixa, eventual- J mente ligaco a uma outra sequência peptldica.
- 13. - Processo para a preparação de uma composição celu lar utilizável nas técnicas de enxerto de neurónios, caracteri 25 / zado pelo facto de se cultivar simultaneamente os neurõnios que se pretende enxertar e células transformadas aptas a sintetizar e segregar um péptido hcmeocaixa ou um péptido de fusão que com preende uma sequência homeocaixa, Lisboa, Aqor 16 de Dezembro de 1991 o òf;cc! da Prcor. doceJ
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