PT975427E - Dispositivo que permite um ensaio utilizacao de uma mebrana para fabricar o referido dispositivo e metodo para a deteccao de um analito utilizando tal dispositivo - Google Patents

Dispositivo que permite um ensaio utilizacao de uma mebrana para fabricar o referido dispositivo e metodo para a deteccao de um analito utilizando tal dispositivo Download PDF

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PT975427E
PT975427E PT98940253T PT98940253T PT975427E PT 975427 E PT975427 E PT 975427E PT 98940253 T PT98940253 T PT 98940253T PT 98940253 T PT98940253 T PT 98940253T PT 975427 E PT975427 E PT 975427E
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binding substance
substrate
analyte
binding
channels
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PT98940253T
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Hendrik Sibolt Van Damme
Hermanus Johannes Mari Kreuwel
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Pamgene Bv
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Description

Descrição “Dispositivo que permite efectuar um ensaio, utilização de uma membrana para fabricar o referido dispositivo e método para a detecção de um analito utilizando tal dispositivo” [0001] A presente invenção diz respeito a um dispositivo para a realização de um ensaio, sendo esse dispositivo constituído por um substrato onde estão previstos canais de atravessamento, abrindo-se esses canais sobre uma superfície para aplicação de uma amostra e estando esses canais, pelo menos numa zona da superfície para a aplicação da amostra, dotados de uma primeira substância de ligação capaz de se ligar a um analito.
[0002] No documento W095/11755 está descrito um dispositivo deste tipo para aplicações de “sequenciação por hibridação”. O dispositivo compreende um substrato dotado de canais, estando esses canais dispostos praticamente segundo uma direcção perpendicular à superfície do substrato. São descritos três tipos de substrato. O primeiro tipo é constituído por uma multitude de fibras de vidro ocas. Este tipo é fabricado amontoando fibras de vidro que possuem um núcleo sensível ao ataque químico (corrosível), dotando o amontoado de extremidades planas, polindo essas extremidades e atacando quimicamente os núcleos, normalmente com um ácido. O segundo tipo de substrato é produzido por ataque corrosivo electroquímico a uma pastilha de silício cristalino. Em primeiro lugar, a posição dos canais e as suas dimensões são definidas utilizando métodos convencionais fotolitográficos. A seguir, os canais orientados são formados por via electroquímica. O terceiro tipo de substrato é produzido por ataque corrosivo por bombardeamento nuclear de um substrato inorgânico. Este método, que compreende os passos que consistem em expor o substrato a um ataque corrosivo por acção de humidade e de partículas pesadas com carga eléctrica, dá origem a um substrato com canais dispersos aleatoriamente sobre a superfície do substrato. Com maiores densidades em número de poros e maior porosidade há uma maior probabilidade de fusão dos canais que assim revelam uma menor resistência a fluxos, comparativamente com outros canais não fundidos.
[0003] Todos estes três tipos de substratos são bastante dispendiosos por implicarem processos de fabrico que requerem muita mão-de-obra e/ou materiais iniciais dispendiosos e operações custosas, tais como serragem e polimento, e/ou equipamento dispendioso. Além disso, os substratos caracterizam-se por uma porosidade relativamente fraca da ordem de 30% e superior. De forma mais vantajosa, afirma-se que é possível conseguir porosidades até cerca de 80%, mas apenas com densidades em canais relativamente diminutas, com a desvantagem de a superfície eficaz dos canais de uma zona particular do substrato ser menor comparativamente com um substrato que tenha uma porosidade comparável mas com maiores densidades em canais (e consequentemente canais mais estreitos). Um outro inconveniente dos substratos à base de silício, conforme descrito no documento WO 95/11755, é o facto de não serem transparentes à luz. Por tal motivo esses substratos não permitem a utilização vantajosa de sistemas marcadores ópticos para a marcação do analito ligado ao substrato. Os sistemas marcadores ópticos vulgares baseiam-se, por exemplo, em reacções colorigénicas induzidas por via enzimática, na bioluminescência ou na quimioluminescência ou ainda na fotoluminescência. Neste último caso, é necessário que tanto a luz de excitação como a luz emitida por luminescência passem através do material do substrato.
[0004] A presente invenção tem por objecto resolver os inconvenientes anteriores e proporcionar um substrato que tenha simultaneamente uma densidade elevada de canais e uma porosidade elevada, permitindo que haja fileiras de densidade ainda mais elevada que
contenham diferentes primeiras substâncias de ligação por unidade da superfície para aplicação da amostra. Além disso, o substrato é muitíssimo transparente à luz visível. Mais particularmente, a presente invenção tem por objecto proporcionar um dispositivo constituído por um substrato relativamente barato para o qual não é necessário recorrer a nenhuma tecnologia típica de microfabrico e que permite uma melhor regulação da distribuição de líquidos sobre a superfície do substrato.
[0005] Os objectivos enumerados antes são conseguidos com um dispositivo em que o substrato poroso é uma membrana de um óxido metálico, produzida electroquimicamente.
[0006] As membranas de óxidos metálicos que nelas possuem canais de atravessamento orientados podem ser fabricadas por um processo pouco dispendioso que consiste no ataque corrosivo electroquímico a uma folha metálica. Entre os metais em consideração refere-se o tântalo o titânio e o alumínio e ainda as ligas de dois ou vários metais e também os metais e ligas tratados com impurezas. As membranas de óxidos metálicos são transparentes, especialmente quando estão húmidas, o que permite efectuar ensaios utilizando diversas técnicas ópticas. Tais membranas possuem canais orientados com diâmetros perfeitamente controlados e vantajosas propriedades superficiais químicas.
[0007] Assim sendo, a invenção proporciona um dispositivo para efectuar um ensaio, em que o referido dispositivo é constituído por um substrato onde há canais de, atravessamento orientados, abrindo-se esses canais sobre uma superfície para a aplicação de uma amostra, estando os canais dotados, pelo menos numa zona da superfície para a aplicação da amostra, de uma primeira substância de ligação capaz de se ligar a um analito, em que o substrato é uma membrana de um óxido metálico fabricada por via electroquimica.
[0008] De acordo com uma variante preferida, a primeira substância de ligação é escolhida entre o conjunto constituído por uma sonda hibridante de ácido nucleico, um anticorpo, um antigénio, um receptor, um hapteno e um ligando para um receptor.
[0009] Os ensaios em que é possível utilizar o dispositivo de acordo com a presente invenção compreendem as sequenciações por hibridação, os imunoensaios, os ensaios de tipo receptor/ligando e não só.
[0010] Se o dispositivo for utilizado como uma ferramenta para se obter informação sobre a sequência do ADN, estabelece-se um grande conjunto ordenado de zonas, compreendendo cada zona uma primeira substância de ligação que é uma sonda hibridante oligonucleotídica com um sequência diferente de pares de bases. Se uma amostra contendo fragmentos de ADN ou de ARN com uma sequência conhecida (parcialmente) estabelecer contacto com o substrato, pode ocorrer um padrão específico de hibridação, podendo ser obtida informação sobre a sequência do ADN/ARN a partir desse padrão. Tais métodos de “sequenciação por hibridação” são bem conhecidos na especialidade (ver v.g. Fodor, S.P.A et cã. (1992) , Science 251,767-773 e Southern, E.M. et cã. (1994), Nucleic Acids Res. 22, 1368-1373). O dispositivo de acordo com a presente invenção também pode ser utilizado para se pesquisar uma amostra biológica, por exemplo, o sangue, à procura de um grande número de elementos (analitos). O conjunto ordenado pode ser constituído por zonas que compreendam sondas hibridantes nucleotídicas específicas, por exemplo, paraE coli, S. aureus, S. pneumomae, etc.. É possível preparar uma amostra biológica conforme descrito no documento EP 0 389 063. Se esta amostra estabelecer contacto com o substrato, é possível ler o padrão de hibridação resultante, v.g. utilizando uma câmara de DAC (em inglês CCD) em combinação com um marcador óptico adequado.
Para além de permitir pesquisar bactérias, o dispositivo é adequado para a detecção de vírus e também para a classificação de diferentes subtipos de VIH e CVH (em inglês HTV e HCV), etc.. A classificação dos viras pode ser essencial para se determinar a potencial resistência aos fáimacos. De um modo geral, é necessária a capacidade para a detecção de mutações pontuais únicas no ARN do vírus. O dispositivo também é apropriado para a realização de imunoensaios em sanduíche. Nesse caso, é preferível utilizar um segundo anticorpo para ligação ao analito ligado, sendo esse segundo anticorpo para cada analito reconhecido por um terceiro anticorpo marcado. Isto pode ser conseguido se o segundo e o terceiro anticorpos forem provenientes de espécies diferentes e se o terceiro anticorpo tiver sido criado contra anticorpos das outras espécies. Assim, evita-se a marcação do segundo anticorpo para cada analito particular. O dispositivo também é adequado para pesquisar péptidos (‘pespep’, o mesmo que ‘pepscans’) conforme descrito por Geysen et al. em Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3998-4002 (1984). Nesse caso, as primeiras substâncias de ligação que estão ligadas a zonas diferentes do substrato constituem sequências diferentes de aminoácidos. Se o substrato estabelecer contacto com um líquido que contenha um analito particular, pode ocorrer eventualmente um padrão de reacção que represente a afinidade específica do analito para as diferentes sequências de aminoácidos.
[0011] É preferível que a primeira substância de ligação esteja ligada de forma covalente ao substrato.
Isto minimiza as perdas da primeira substância de ligação a partir do substrato. A ligação covalente de um composto orgânico a um óxido metálico é bem conhecida na especialidade, por exemplo, utilizando o método descrito por Chu, C.W. et al. (J. Adliesion Sei. Technol., 7, 7<# págs. 417-433, 1993) e Fadda, M.B. et al. (Biotechnology and Applied Biochemistry, 16, págs. 221-227, 1992).
[0012] De acordo com uma variante preferida, a membrana do óxido metálico é feita de óxido de alumínio.
[0013] É visível que uma membrana de óxido de alumínio possui canais de atravessamento que são hidrofílicos em comparação com a superfície da membrana. Assim, de forma vantajosa, um líquido hidrofílico penetra preferencialmente nos canais em vez de se espalhar pela superfície da membrana. Posto isto, é possível dispor nas membranas de óxido de alumínio densidades elevadas de zonas que compreendam diferentes primeiras substâncias de ligação. As membranas de óxido de alumínio que possuem canais de atravessamento orientados foram descritas por Rigby, W.R. et al. (Trans. Inst. Metal Finish., 68(3), pág. 95, 1990) e são comercializadas por Anotec Separations Ltd, Oxon, RU. Estas membranas têm sido utilizadas para purificar vírus e para guardar enzimas para fins de detecção, mas não há nenhuma sugestão no que diz respeito à sua conveniência como substratos para a execução de ensaios que tenham por base sondas hibridantes.
[0014] De acordo com um modo preferido, a primeira substância de ligação é sintetizada in situ.
[0015] Por exemplo, utilizando apenas um número limitado de reagentes, com um dispositivo que disponha de um oligonucleótido como primeira substância de ligação, normalmente quatro compostos nucleotídicos (dA, dT, dC e dG para o ADN, A, U, C e G para o ARN) e outros reagentes, tais como os reagentes de bloqueio e os agentes de protecção, é possível utilizar as técnicas clássicas de síntese em fase sólida para se dotar um substrato com uma zona ou com um conjunto ordenado de zonas com sondas oligonucleotídicas.
Os reagentes podem ser aplicados convenientemente aos canais de atravessamento de uma zona particular, utilizando a tecnologia do jacto de tinta. A tecnologia do jacto de tinta permite a deposição rigorosa de volumes definidos de líquido. A síntese in situ de sondas oligo-nucleotídicas sobre um substrato plano e não poroso é bem conhecida na especialidade (ver v.g. T.P. Theriault: DNA diagnostic Systems based on novel Chem-Jct technologics, IBC Conference on Biochip Array Technologies, Washington DC, 10 de Maio de 1995).
[0016] De acordo com uma variante preferida, os compostos nucleotídicos são aplicados recorrendo à atraeção electrostática. A atraeção electrostática diminui o risco de haver salpicos.
[0017] De acordo com um método alternativo de fabrico de um dispositivo que possua canais de atravessamento de acordo com a presente invenção, aplica-se a primeira substância de ligação aos canais de atravessamento de uma zona particular utilizando a tecnologia do jacto de tinta. Isto permite a purificação da primeira substância de ligação e permite, por exemplo, no caso de uma sonda oligonucleotídica, a verificação da sua sequência antes da aplicação ao substrato.
[0018] Pelas razões anteriormente mencionadas, mais uma vez é preferível que a primeira substância de ligação seja aplicada recorrendo à atraeção electrostática.
[0019] A presente invenção também diz respeito a utilização de uma membrana de um óxido metálico, produzida por via electroquímica, de preferência umamembrana de óxido de • r, alumínio, para a produção de qualquer dos dispositivos descritos antes.
[0020] De acordo com uma variante preferida, ajusta-se a diferença de temperaturas entre os diferentes locais sobre a membrana durante a execução da experiência para assim se criar diferentes condições de hibridação em locais diferentes da membrana.
[0021] A utilização prática é vantajosamente um ensaio de hibridação de ácido nucleico ou um ensaio imunológico. Em tais experiências, utiliza-se uma amostra que contenha um
analito, a qual irá ser colocada em contacto com um dispositivo de acordo com a invenção. Depois espera-se que o analito se ligue à primeira substância de ligação que se encontra ligada ao substrato. Tal ligação é bastante facilitada permitindo que o analito migre através do substrato poroso. A detecção da ligação pode ser feita adicionando uma segunda substância de ligação ligada a um marcador, permitindo que essa segunda substância de ligação se ligue ao complexo da primeira substância de ligação e do analito e determinando se o marcador se encontra presente na posição onde a primeira substância de ligação foi imobilizada. Em alternativa, o analito pode estar já dotado de um marcador, caso em que a ligação à primeira substância de ligação pode ser detectada directamente, sem a adição de uma segunda substância de ligação. A presente invenção também diz respeito a um estojo que compreende qualquer dos dispositivos supramencionados, contendo também esses estojo um sistema de detecção para se determinar se a ligação ocorreu entre a primeira substância de ligação e o analito. De preferência, tal sistema de detecção pode ser uma segunda substância de ligação dotada de um marcador. De preferência, o marcador é capaz de induzir uma reacçãó colorogénica ou é capaz de produzir bioluminescência ou quimioluminescênciã ou fotoluminescência. A presente invenção também diz respeito a um método para a detecção de um analito numa amostra, compreendendo esse método os passos seguintes: . « * ,, / a) fazer contactar a amostra com um qualquer dos dispositivos anterioimente descritos, b) permitir que tenha lugar a ligação entre a primeira substância de ligação e o analito, c) detectar se ocorreu a ligação entre a primeira substância de ligação e o analito.
Neste método, o analito pode ser uma sonda de ácido nucleico, um anticorpo, um antigénio, um receptor, um hapteno e um ligando para um receptor.
[0022]
Seguidamente ilustrar-se-á a presente invenção por meio dos exemplos adiante descritos.
Exemplo 1 [0023] Detecção simultânea de dois tipos diferentes de fragmentos amplificados de V-1IH (em inglês HTV-1), um ARN de tipo natural TN (em inglês Wild Type RNA (WT)) e ARN calibrador Qa (em inglês Calibrator RNA (Qa)), utilizando uma membrana de óxido de alumínio numa célula de passagem de efluente.
Analitos: [0024] Os fragmentos de ARN-TN e de ARN-Qa representam uma parte da região GAG do genoma do V-1IH. Estes fragmentos têm comprimentos iguais (145 nt) e sequências idênticas, para além de uma região com um comprimento de 21 nt na parte central do fragmento. As sequências dos fragmentos são as seguintes: ARN-TN: 5’ cccugcuaugucacuuccccuuffuucucucaucuggccuggug caauaggcccugcaugcacuggaugcacucuaucccauucugcag cuuccucauugauggucucuuuuaacauuugcauggcugcuugau guccccccacu 3’(SEQ IDNO:Í) ARN-Qa: 5’ cccugcuaugucacuuccccuuggiiucucucaucuggccuggug cauaggcccugcaugcgacugucaucuaucuacacugucugcag cuuccucauugauggucucuuuuaacauuugcauggcugcuuga uguccccccacu 3’ (SEQ ID NO:2).
[0025] A sequência das partes específicas de TN e Qa estão sublinhadas.
[0026] Neste exemplo foram utilizadas duas soluções tamponados: um tampão fosfato a pH 7,4 contendo NaCl na concentração de 8 g/L (“tampão de incubação”); [0027] um tampão fosfato a pH 7,4 contendo NaCl na concentração de 8 g/L e 0,05% de polissorbato (Tween 20), doravante designado por “tampão de lavagem”.
Substrato [0028] Membrana de óxido de alumínio com uma espessura de 60 pm e um diâmetro de 24 mm. Os canais têm um diâmetro de 0,2 pm e a densidade é de cerca de 18 canais/pm (“Anodisc 25”, Whatman). A superfície da membrana é recoberta com estreptavidina mergulhando a membrana no tampão de incubação que continha estreptavidina na concentração de 2 g/L, durante 60 minutos. A seguir efectua-se a lavagem das membranas com o tampão de lavagem e faz-se a sua secagem ao ar à temperatura ambiente.
Imobilização da primeira substância de ligação [0029] São aplicadas duas sondas oligonucleotídicas, parcialmente complementares . - v para os fragmentos TN e Qa
Sonda TN: 5’ GAATGGGATAGAGTGCATCCAGTG 3’ (SEQID NO:3)
Sonda Qa: 5’ GACAGTGTAGATAGATGACAGTCG 3’ (SEQ TD NO:4) ambas com uma molécula de biotina acoplada à extremidade 5’.
[0030] Utilizando um bico poroso (alimentador de ‘nylon’) são aplicados pontos com um diâmetro específico, do tipo obtido com uma caneta vulgar de “ponta fina” (Hauser schreibtechnik
GmbH, Gosheim, Alemanha). Enquanto o bico do alimentador aplica os pontos à membrana, a sua outra extremidade fica em contacto com o fluído de um reservatório que contém a solução de sonda hibridante (tampão de incubação, concentração da sonda hibridante igual a 25 μτηοΙ/L). A transferência da solução de sonda hibridante para a membrana é perfeitamente regulada pela interaeção capilar da membrana e do alimentador: a solução de soda hibridante enche de forma autónoma os canais que estão em contacto físico com o bico do alimentador. Neste exemplo foram utilizadas 2 linhas com 3 pontos de 0,5 mm de diâmetro (3 pontos para cada tipo de sonda hibridante). A distância entre cada 2 pontos consecutivos foi de 1 mm. Após a aplicação dos pontos (pingos) e a seguir a uma fase de incubação de 10 minutos à temperatura ambiente, removeu-se por lavagem o material da sonda hibridante não ligado, utilizando para tal o tampão de lavagem.
[0031] Neste exemplo foram produzidos 4 substratos idênticos desta forma. Hibrídação [0032] A seguir introduz-se as membranas numa célula de passagem de efluente e faz-se com que fiquem em contacto com o tampão de incubação que contém os fragmentos de ARN doVM.
[0033] Foram aplicados 4 conjuntos de condições de hibrídação em 4 experiências diferentes: 1 volume de 25 pL contendo 1,5 x 1012 moléculas de ARN de Qa, sem fluxo, 2 volume de 25 pL contendo 1,5 x 1012 moléculas de ARN de TN, sem fluxo, 3 volume de 25 pL contendo 1,5 x 1012 moléculas de ARN de Qa, fluxo contínuo, 4 volume de 25 pL contendo 1,5 x 1012 moléculas de ARN de TN, fluxo contínuo.
[0034] Nas experiências 1 e 2 não houve transporte de tampão através da membrana.
[0035] Nas experiências 3 e 4 o volume de 25 pL de solução de ARN flui continuamente através da membrana em dois sentidos (para trás e para a frente) com uma velocidade de cerca de 25 pL/minuto.
[0036] Para se regular este fluxo utilizou-se um distribuidor automático de modelo ‘Hamilton’.
[0037] Em todas as experiências a hibridação teve lugar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Lavagem [0038] Após a hibridação efectuou-se a lavagem das membranas utilizando 5 pL de tampão de lavagem.
Marcação e detecção [0039] Para a detecção esperou-se que uma sonda que é genérica para o ARN do VIH (SEQ DD NO:5) interactuasse com as membranas. Esta sonda está contida no tampão de incubação (40 nmol/L). Em cada experiência utilizou-se um volume de 75 pL, sem fluxo. As sondas são marcadas com a enzima peroxidase de Armoracia rusticana (PAR) numa proporção de 1:1, utilizando interligadores heterobifuncionais contendo maleimida (Hashida, S. et al. (1984) J. Applied Biochem. 56, 56-63). Antes do acoplamento à PAR as sondas foram tioladas (Carlsson, J. et al. 81978) Biochem. J. 173, 723-737).
[0040] Após a lavagem com 10 mL de tampão de lavagem fez-se contactar com as membranas (sem fluxo) uma solução que continha 3,3’,5,5’-tetrametil-benzidina e peróxido de hidrogénio, TMB (Organon Teknika, art.: 78510).
Resultados [0041] A interpretação dos resultados foi feita a olho nu. Nas experiências 3 e 4 apareceram pontos azuis quase imediatamente num local onde se esperava uma reacção específica (os pontos que continham as sondas de TN ficaram azuis utilizando o ARN de TN e os pontos que continham as sondas de Qa ficaram azuis utilizando o ARN de Qa). Com os pontos que continham as sondas hibridantes que não são complementares do ARN no tampão não foi observada coloração nenhuma, embora a zona da membrana que ficou entre os pontos tivesse revelado uma cor azulada ligeira ao fim de alguns minutos, provavelmente devido a uma lavagem insuficiente ou devido a alguma ligação não especifica Nas experiências 1 e 2 foram obtidos resultados idênticos; no entanto, foi necessário esperar cerca de 1 minuto até que ficassem visíveis os pontos azuis.
[0042] Para além da avahação visual dos pontos durante a reacção com PMB fez-se também a avaliação dos pontos sobre as membranas nas experiências 3 e 4, utilizando um densitómetro de imagens (Biorad GS700). Para este procedimento as membranas foram retiradas das células de passagem de efluente (quadro 1).
Quadro 1
Densidade de pontos, medida com um densitómetro Analitode ARN Pontos com sondas de TN Pontos com sondas de Qa Zona espontânea [unidades de DO] [unidades de DO] [unidades de DO] ARN-TN 38 20 20 ARN-Qa 25 35 25
Exemnlo 2 [0043] As sondas oligonucleotídicas foram acopladas de forma covalente a membranas de tipo ‘Anopore’ utilizando como bgador 3-aminopropil-trietoxi-silano (APS) entre a alumina e o oligonucleótido. Para as experiências foram utilizadas membranas de tipo ‘Anodisc 25’ com um diâmetro de 25 mm e uma superfície total de 0,3 m .
[0044] As membranas foram activadas por imersão numa solução de ácido nítrico (0,4 mol/L) durante 1 hora. Após enxaguamento com água efectuou-se a secagem das membranas que foram depois imersas numa solução a 0,25% (v/v) de APS em água durante 2 horas. Removeu-se o excesso de APS por enxaguamento com água. As membranas foram guardadas após a secagem a 120°C sob pressão reduzida. A concentração de grupos amino devido ao acoplamento das moléculas de APS atingiu o valor típico de 2-3 pmol/m .
[0045] Antes do acoplamento, os oligonucleótidos terminados por grupos amino foram activados por reacção com suberato de dissuccinimidilo (SDS, ver v.g. PIERCE BV, Immuno-technology Catalog & Handbook, 1990). O grupo succinimidilo resultante na extremidade do oligonucleótido foi utilizado para acoplamento à membrana activada com APS. Recorreu-se à marcação com 32P para quantificar os resultados. O acoplamento com 500 pL de solução de oligonucleótidos numa membrana de tipo ‘Anodisc’ durante 60 minutos teve como consequência um rendimento de acoplamento de oligonucleótido igual a 1-10'10 mol/m2.
Exemplo 3 [0046] Definição de um padrão de um conjunto ordenado (matricial) sobre uma membrana de AI2O3 utilizando um dispositivo de jacto de tinta.
[004η Recorrendo à tecnologia convencional do jacto de tinta é possível gerar pequenas gotículas com um diâmetro de 20-80 pm e colocá-las sobre um substrato com um ritmo elevado e para uma resolução da ordem das pm. Utilizando uma impressora de jacto de tinta comercialmente disponível (HP 660C) em combinação com as membranas de AI2O3 foram obtidos conjuntos ordenados de muito alta resolução.
[0048] A inspecção visual com um microscópio (amplificação: 400X) revelou pontos perfeitamente redondos com um diâmetro aproximado de 60 pm com margens muito nítidas. Não havia sinais de salpicos, conforme se observa frequentemente quando são utilizadas superfícies não porosas. Atribui-se a elevada resolução do conjunto ordenado à elevada porosidade do material em combinação com a característica hidrofílica dos canais de atravessamento.
Exemnlo 4 [0049] Realização de um imunoensaio em sanduíche.
[0050] Detecção de gonadatrofina coriónica humana (GCh, em inglês hCG) com um imunoensaio enzimático utilizando como fase sólida uma membrana de óxido de alumínio.
Revestimento da membrana [0051] Recobriu-se pequenas zonas das membranas de óxido de alumínio (redondas, com um diâmetro de 20 mm) com uma solução tamponada (fosfato na concentração de 0,0127 mol/L e NaCl na concentração de 0,140 mol/L a pH 7,4) contendo um anticorpo monoclonal de murganho na concentração de 1 pg/mL (OT-GCh-4B) (em inglês OT-hCG-4B) dirigido contra a GCh. Aplicou-se a solução pipetando gotículas de 10 pL sobre a membrana ou por aplicação de pontos por contacto utilizando um alimentador de poliéstèr (Hauser). Após a incubação a 37°C durante 30 minutos as membranas ficaram prontas para utilização.
Incubação [0052] As amostras positivas foram misturadas com 50 pL de GCh com uma concentração de 200 Ul/L e 50 pL de anti-GCh de murganho (OT-GCh-3A) conjugado com 16 peroxidase de Armoracia rusticam (PAR) (1 pg/mL). Esta mistura foi pré-incubada durante 15 minutos. No caso da contraprova negativa misturou-sc 50 pL de tampão com 50 pL de solução do conjugado.
[0053] A seguir pipetou-se a mistura (50 pL) sobre as membranas e efectuou-se a incubação durante 15 minutos à temperatura ambiente.
Lavagem e detccção
[0054] As membranas foram enxaguadas exaustivamente com um tampão de lavagem (NaCl na concentração de 0,131 mol/L, fosfato na concentração de 0,127 mol/L e polissorbato 20 na concentração de 0,5 mL/L) sobre um funil.
[0055] Finalmente colocou-se as membranas numa proveta que continha um substrato para a PAR, à base de 3,3’,5,5’-tetrametil-benzidina e peróxido de hidrogénio (Organon Teknika). Durante o período de incubação de 30 minutos os resultados foram observados visualmente e com uma câmara.
Resultados [0056] Ficaram visíveis pontos de cor azul clara ao fim de alguns minutos nos locais onde as membranas estavam recobertas com OT-GCh-4B, no caso das amostras positivas.
Nas outras partes das membranas e com a contraprova negativa apenas foi possível observar uma cor natural azul ténue ao fim de um período de incubação relativamente longo.
Lisboa, 25 de Maio

Claims (16)

  1. /
    Reivindicações 1. Dispositivo para executar um ensaio, sendo esse dispositivo constituído por um substrato que possui canais de atravessamento orientados, abrindo-se esses canais sobre uma superfície para aplicação dc amostras, estando os canais dotados, pelo menos numa zona da superfície para a aplicação de amostras, de uma primeira substância de ligação capaz de se ligar a um analito, caracterizado pelo facto de o substrato ser uma membrana de um óxido metálico, produzida por via electroquimica.
  2. 2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, em que a primeira substância de ligação é seleccionada entre o conjunto constituído por uma sonda de ácido nucleico, um anticorpo, um antigénio, um receptor, um hapteno e um ligando para um reccptor.
  3. 3. Dispositivo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, em que a primeira substância de ligação se liga de forma covalente ao substrato.
  4. 4. Dispositivo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, em que a membrana do óxido metálico é feita de óxido de alumínio.
  5. 5. Dispositivo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, em que a primeira substância de ligação é sintetizada in situ.
  6. 6. Dispositivo de acordo com a reivindicação 5, em que um composto para sintetizar a primeira substância de ligação é aplicado a uma zona particular utilizando a tecnologia do jacto de tinta.
  7. 7. 7.
    - Ο 2 Dispositivo de acordo com a reivindicação 6, em que se aplica o composto recorrendo à atracção electrostática.
  8. 8. Dispositivo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, em que a primeira substância de ligação é aplicada a uma zona particular utilizando a tecnologia do jacto de tinta.
  9. 9. Dispositivo de acordo com a reivindicação 8, em que a primeira substância de ligação é aplicada recorrendo à atracção electrostática.
  10. 10. Utilização de uma membrana de um óxido metálico, fabricada por via electroquímica, para a produção de um dispositivo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4.
  11. 11. Estojo que compreende um dispositivo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, contendo também esse estojo um sistema de detecção que serve para determinar se a ligação ocorreu entre a primeira substância de ligação e o analito.
  12. 12. Estojo de acordo com a reivindicação 11, em que o sistema de detecção compreende uma segunda substância de ligação dotada de um marcador.
  13. 13. Estojo de acordo com a reivindicação 12, em que o marcador é capaz de induzir uma reacção colorigénica e/ou é capaz de produzir bioluminescência ou quimioluminescência ou fotoluminescência.
    3
  14. 14. Método para a detecção de um analito numa amostra, compreendendo esse método os passos seguintes: a) fazer contactar a amostra com um dispositivo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, b) permitir que tenha lugar a ligação entre a primeira substância de ligação e o analito, c) detectar se ocorreu a ligação entre a primeira substância de ligação e o analito.
  15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o analito compreende ácido nucleico.
  16. 16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o ácido nucleico provém do vírus da imunodeficiência humana. Lisboa, 25 de Maio de 2001
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