PT97159B - Processo para a preparacao de uma proteina do antigenio de superficie da hepatite b ou de um seu fragmento e processo para a preparacao de uma vacina - Google Patents
Processo para a preparacao de uma proteina do antigenio de superficie da hepatite b ou de um seu fragmento e processo para a preparacao de uma vacina Download PDFInfo
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Description
IMPERIAL C0LLE6E OF SCIENCE,TECHNOLOGY AND MEDICINE
PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA PROTEÍNA DO ANTIGÉNIO DE SUPERFÍCIE DA HEPATITE B OU DE UM SEU FRAGMENTO E PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA VACINA”
MEMÓRIA DESCRITIVA
O presente invento diz respeito a um processo para a preparação de uma proteína variante de KBsAg ou ssu fragmento apresentando a antigenicida.de do antigénio de superfície do vírus da Hepatite Bs em que a proteína variante ou seu fragmento CvHBsAçp compreende um determinante a modificado em que existe um aminoácido diferente de glicina na posição 145 da sequência de KBsfio =.· 0 referido processo consiste nos passos de culturs de um hospedeiro transformado coe u® vector ds expressão compreendendo uma sequência de? DNA codificadora da referida vHBsAg5 num meio de cultura adequado e a purificação da vHBsAg produzida até ao qrau de pureza desejado.
Q invento dis igualmente respeito a um processo p5íra a preparação de uma vacina compreendendo o vHBsAg,; assim como a um equipamento (kit) para diagnóstico por detecção? in vitro de anticorpos anfi-vHBsftg e a um processe para a obtenção de uma preparação de anticorpos compreendendo anticorpos anti-vHBeAg»
Esta invento está relacionado com moléculas de DNA recombinante que codificam polipsptídeos com a especificidade de us; antigénio virai da hepatite B,
Mais particularmente sets invsnto está relacionado com uma composição ds vacina para a estimulação da produção de anticorpos sm humanos contra uma variante do vírus da hepatite B,
A infecção com o vírus da hepatite B íHBV?» é um problema grave a nível mundial mas existem açora vacinas que podem ser usadas em imunização passiva5 por exemplo o produto “Engerix-S” CSmithKlins Bescham p«l«c.) que é obtido por técnicas de engenharia genética,
A clonagem de genomas ds viriSes da Hepatite B dos diferentes serotipos & conhecida^ ver Miller et al.« Heoatoloqv, 9 C19S9) página 322 e referâncias ali presentes» As partículas de Dane que são viriSes da hepatite B s que podem ser isoladas a partir de doentes infectados tâm um diâmetro de cerca de 12 nm» Cada uma consiste num invólucro compreendendo o antigénio ds superfície da hepatite B CHBsAg)P uma cápside CHBeAg), uma polimerase endógena e um genoma tíe DNA» Um terceiro polipeptídso, antigénio ”eH CHBeAg) é feito pelo vírus da hepatite B e encontra-se no soro numa forma solúvel»
As vacinas que podem ser adquiridas comercialmente contra HBV compreendem antigénio de superfície do vírus da hepatite B CHBsAg) na forma nativa ou na forma recombinante» 0 autêntico antigénio de superfície do vírus da Hepatite B pode ser reosovido do plasma de indíviduos infectados como uma partícula de aproximadamente 22nm contendo duas proteínas conhecidas como P24 e o seu derivado glicosilado SPSS» ambos são codificados pela sequência codificadora de 226 aminoácidos presente no qenoma de
HBV conhecida como a sequência codificadora da proteína S ou gene S de HBV| ver Tiollais st al., Nature,, 317 (1985), página 489 e referências ali presentes. A sequência completa tíe aminoácidos e correspondente sequência de nucleótidos codificadora de HBsAg estão descritas em Vslenzusla et al, » Nature, 2S@ (1979), página 815= 0 sistema de numeração usado por Tiollais et al = = (loc cif,) para definir posiçSes de nucleótidos s aminoácidos é também aqui usado=
A inserção das sequências codificadoras do gene 3 de HBV sob α controle da promotores ds levedura em vectores tíe expressão para permitir a expressão de HBsAg aa S»____cerevisiae para a produção de vacinas foi descrita por exempla pcsr Karford et ah em Develop. Biol. Standard, 54s página 125 (1983), Valensusls et al,, , Nature 298, página 347 (1932) a Bitter et al,, „ 3 = fted= Virol== 25 = página 123 <Í9BB>= A expressão em Pichia pastoris também foi. descrita por Srsgg et al = = Biotechnoloqy, 5 (1987), página 479 (ver também Pedido de Patente Europeia Publicação N2 © 226 846) assim como expressão em Hanssnula polymorpha (ver EP-A- @299 í@8).
As vacinas podem também ssr preparadas a partir partículas imunogénicas híbridas compreendendo proteína HBsAg como descrito no Pedido da Patente Europasia Publicação NS © 278 94© =
Tais partículas podem conter por exemplo toda, parte ou partes da proteína precursora ds HBsAg codificada pela sequência codificadora que precede imediatamente o gene S da HBV no genoma do HBV, aqui, referido como a sequência codificadora ds Pre 3= A sequência codificadora de Pre S codifica normalmente 163 aminoácidos (no caso do subtxpo ay do HBV) e compreende uma sequência codificadora Pre SI e uma sequência codificadora Pre 82, Esta última codifica 55 aminoácidos e precede imediatamente a sequência codificadora da proteína tí Cvsr EP-A-0 278 94ô para mais detalhes),,
Os subtipos sntigênícos ds HBv são definidos serologicamente e demonstrou-se serem devidos a alterações tíe bases isoladas na região do genoma codificadora ds HBsAg COkamoto st al. g J.____Virol, „ 1987, 74, 5463-5467). No entanto,, todos os
Ϊ5 t< jw. ;.·. γ--. ,... ή subtipos antigénicos conhecidos contêm o determinante tindo nos aminoâcidos 124 a 147 do HBsAq„ Anticorpos contra o determinante 5ia!í confere protecção contra todos os subtipos. Demonstrou—se por mutagénese in vitro que na cístsina ns posição 147 e na prolina na posição 142 são importantes para apresentação ds antigenicidade total do determinante !Sa?; CAshtor» et sL, 3, Med,, Virol,,,, 1989, 29, página 196) .
Durante a última década foram descritas várias variantes putativas do vírus da hepatite B (HBV)=
Mc Mahon at al„ descreveram que a substituição de arginina por glicina no domínio putativo ds ligação ao anticorpo monoclonal do HbsAg foi encontrado (conforme deduzido pela análise da sequência tíe DNA) num doente com transplante de fígado tratada com anticorpo monoclonal anti-HBsAg íCold Spring Harbor Symposium on the Molecular Biology of Hepatitis B viruses, September, 1989)B No entanto este resultado não sugere qualquer incentivo para sintetizar uma sequência de aminoâcidos variante do HBsAg ou desenvolver uma composição de vacina baseada nsla„
Numa outra publicação, encontraram-se crianças e adultos com antigénio de superfície da hepatite B circulante,, indicando rsplicação virai, apesar da presença de anticorpos específicos Canti-HBs) após imunização com uma ds duas vacinas da hepatite B autorizadas (Zsnetti et al„ Lancet, November Í988, página 1132),, A análise do HBsAg com anticorpos monoclonais revelou que o antigénio circulante não è·portador do determinante !ía ou que este determinante foi mascarado. Concluiu-se que foi detectada o aparecimento ds uma variante do vírus da hepatite B:, possivelmente devido a pressão epidemiológica associada a imunização nuas área endémica ds infecção. Na entanto,; a variante nso foi mais caracterizada=
A partir do trabalho ds Zanetti st. al ,= è claro que uma potencial desvantagem com as vacinas da hepatite B presentemente disponíveis é que podem,, pelo menos num hospedeiro com uma predisposição imunogenética, causar o aparecimento de um “mutante fugitivo’1 ? i.e. ua vírus infeccioso que sofreu uaa mutação que lhe permite fugir ã imunidade neutralisante. Tal vírus variante tem claramente capacidade para causar doenças e pode-se assumir como sendo transmissível. 0 virus variante pode portanto dar origem a um problema rfs imunização grave uma vez que não ê sficasmsnte neutralizado por anticorpos produzidos por vacinas baseadas em HBsAg normal.
presente invento ultrapassa,, ou pelo menos minimiza as desvantagens referidas associadas a vacinas de HSV conhecidas.
De acorda com a presente invento, é proporcionada uma proteína HBsAg ou um seu fragmento apresentando a antigenicidade do antigénio de superfície de HBV3 caracterizado por a proteína ou seu fragmento compreender um determinante a” modificado em que na posição 145 da sequência de HBsAg só exista glicina.
Deve-se entender que o HBsftg variante pode também incluir sequências Pre S caso se pretenda,,
A proteína variante HBsAg ou seu fragmento de acorda com o invento é daqui em diante abreviado para vHBsfiq.
Será avaliado que o vHBsAy não está numa “forma natural” ®ss s material sintético ou altamente purificado, sem produtos sanguíneos«
De preferência o vBBsAy do invento corresponde a HBsAg ds tamanho completo e & idêntico ao HBsAg normal excepto no gue respeita ao resíduo de aminoácido alterado na posição 145.
Preferencialmente o vHBsAg está nuina forma altamenis purifiçada5 por exemplo num estado ds pursza superior a 75%, mais preferencialmente superior a 90% e mais preferencialmente ê 95-100% puro.
Num outro aspecto do presente invento ê proporcionada uma composição de vacina compreendendo uma quantidade imunoprotec tora ds? vHBsAg juntamente com um veículo adequado.
Outros aspectos do invento são descritos abaixo» vHBsAg e vacina do invento podem ser usados para ultrapassar os problemas suscitados pelo aparecimento ds um ”mutanto fugitivo” como definido atrás em que o determinante a do HBsAg virai sofreu modificação,, Em particular a vacina do invento tem a vantagem de poder ser usado para proteger e evitar o aparecimento ou transmissão ds um HBV variante que ê definido aqui como tendo um determinante !1a” modificado na sequência de aminoácidos ds HBsAg em que existe apenas o aminoácido glicina na posição 145=
Assim é igulamente proporcionado um método para a protecção de um humano contra sintomas de doença associadas á infecção com o referida HBV variante, método esse que se caracteriza psia administração a um humano ds uma quantidade segura s eficaz da vacina ds acorde cora o invento.
Num outro aspecto o presente invento proporciona vHBsfig para usar e® terapia, espeeialmente prcfiláxia da infecção.
Quando usado para imunizar humanos contra um vírus HBV variante existente será apreciado que a sequência ds vHBsftg na vacina condiz ou s antigenicaments equivalente & sequência ds vHBsftg no vírus HBV variante.
Ds preferência o aminoãcído na posição 145 no vKBsAq do invento é tal que pode ser derivado por uma mutação pontuai no cotíao SSA codificador da glicina na posição 145 no HBsAg norísal.
Numa realização preferida do invento o resíduo glicina na posição 145 do HBsAg normal s substituida par um amino-ácido mais hidrofílico uma vez que isto resulta numa maior antigenicidads „
Numa rsslizaçffe particularmente preferida do invento a modificação na posição 145 no determinante na“ do KBsAg è a substituição de glicina por arginina, uma vez qus como aqui descrita demanstrou~se que esta modificação surge numa variante ds HBV isolada c Unicamente»
Para descrever o invento mais claramente» ê feita referência as figuras que se seguem, em ques
Figura 1 mostra ura desenha esquemática de uma parte da sequência ds aminoácidos normal de HBsfiq indicando as duas ansas do determinsnts nail e o resíduo glicina na posição 145s
Figura 5 mostra um desenho esquemático da sequência de nucleótidos ds um HBsAg variante isolado clinicamentef indicando sities ds ligação de iniciadores usados na ssqusnciação e o codão AGA encontrado nas posições 587-589 resultando numa mutação pontual ds Θ para A na posição 587 na sequência normais
Figura 5 mostra uma representação esquemática do gene S no plasmídeo pRITiDóOl ou pRXT 13438 indicando sítios da ligação a oligonucleótitíos para a reacção em cadeia com poliserssss CPCR);
| FigUTg -4 pRITÍ3438g | mostra | uma | representação | esquemática | do | plasmídeo |
| rloura 5 mostra pMNSdsltaEco RI ρ s | uma | representação | esquemática | do | plasmídeo | |
| Figura 6 | mostra | uma | representação | esquemática | do | plasmídeo |
| pRIT12773= | D poli- | -ligador i em | é como se | segue sugl Π» |
Cia L, Hirsd III„ Bam ΗΣ» Ava I .·, Sma I» Ava i« Xho I. Sal L
Num outro aspecto do invento é proporcionado um processo para a preparação de vHBsAg s da composição de vacina contendo- o ·.,
Prefersncialments, o vHBsAg foi obtido sinteticamente,, por sintese peptídica ou mais preferencialmente por técnicas ds DNA rec as b ϊ n a n t e,
São bem conhecidos métodos para a construção, manipulação s verificação de moléculas de DNA recombinante e sequências são bem conhecidos» A alteração de glicina para um aminoácido diferente na posição 145 da proteina 8 normal do KBV Cver Figura 1) para obter o vHBsAg do invento ê necessário para alterar o codão GGA nas posições- 433-433 da sequência tís nucleótidos do gene S para um podão diferente codificador do aminoácido necessário»
Numa realização particular é preferido alterar o codão GGA mais prefersncialmente para AGA ou menos preíerencialfnsnte para CSft ou CSC ou CSS ou CST ou AGG» todos eles tripletos cotíificadores de arginina»
Existem vários métodos para efectuar a alteração adequada da sequência» Um método adequado & a síntese completa de novo., por química de fosfitos ou ds fosforamidstos da sequência codificadora pretendida usando frequências de codões virais ou de leveduras»
A síntese de DNA pode ser conseguida em várias empresas numa base comercial» Um exemplo de tal síntese de genes está descrito por Hayden e Msndecki» DMA 7s p571 CivSS) e referências ali presentes»
Um segundo método consiste em clcnsr num vector de cadeia simples um fragmento de restrição adequado derivado de um vector que já continha o genoma de HBv e depois efectuar mutacénese in vitro específica de sítio como descrito por Botstein s -Sbortle, Science, 229, p. 1193 (1982). Uma cultura de E. coli K12 estirpe C6@® contendo o plasmideo recombinante pRITWôGl compeendendo um genoats de HBv do subtipo ay clonado s® pBR322 foi depositada ds acordo com o Tratado de Budapeste na American Type Culture Collection ea 2 de D unho de 1982 com o Número de Acesso ATCC 39132» A sequência codificadora do gsns S especificando a proteína HBsftg de 226 aminoâcidos ou sequências maiores codificadoras de polipeptídeos Pre S podem ser retiradas de tais clones por técnicas de DNA recombinante convencionais.
Um fragmento de restriçSo adequado é o fragmento Xbal-Accl de 575 pb dentro da região codificadora do gene S do pRíTí060í» Sistemas vectores úteis para a mutsgénsss in____vitro podem ser adquiridos comercia Intente» 0 -fragmento de gene mutage~ nizado assim obtido foi rs-inserido no gene S»
U<n terceiro método á raalissr a alteraçao mutacional pretendida usando tecnologia ds reacção sm cadeia com polimerase (PCR) como descrito por Ho et al», gene, 77= p51 (1989),,
Em cada um dos casos a sequência codificadora ds vHBsAg pode ser expressa sob o controle ds um promotor adequado sm qualquer hospedeiro adequado»
Vsctores de expressão compreendendo a sequência de DNA codificadora ds vHBsfig são novos s constituem um outro aspecto do presente invento» Os hospedeiros transformados com os referidos vsctores de expressão formam ainda um -outro aspecto do invento»
Num aspecto preferido 5» cerevlsiae» Pichia pastoris ou Hansenula polymorpha podem ser usados como hospedeiros e a expressão fas-se sob o controle de um promotor ds levedura, como seja o promotor TDH3 de levedura (gene da gliceraldeído-3-fosfato desidrogsnase» ver Valenzuela et al1982; Sitter et al „1985, supra) ou PH05 (Miyanohara et al. , Proc» Natl. Acad» Sei» USA δ®,, p» 1» 1933)» MOX» FMDH Cver EP~fi-0 299 10S) e ÃOX (ver EP-A-0 226 846)» hospedeiro transformado pode ser cultivado ou fermentado por meios; convencionais s o vHBsAg extraído e purificado» A purificação do HSsAg a partir das células ds levedura ê bem conhecida e pode ser feita segundo qualquer uma das US 4,649,192,
US 4,683,294, US 4,694,074 qu US 4,738,926, A purificação do vHBsftg do invento foi realizada de forma análoga.
Vacinas contendo o vHBsftg foram preparadas por técnicas convencionais e conterão usa quantidade imunoprotectora do vHBsftg preferencialmente cm soro fisiológico tamponado e misturado ou adsorvido co® qualquer ua dos vários adjuvantes conhecidos incluindo hidróxido da alumínio a fosfato de alumínio. Por imunoprotector··' pretends-ss significar que 6 administrada uma Quantidade de vHBsftg suficiente para induzir um anticorpo protector ou resposta imune celular para conferir protecção contra o agente infeccioso sem efeitos secundários graves, A quantidade de vHBsftg a ser administrada dependerá da presença ds adjuvante e será de uma forma geral entre 1 e pg ds proteína, por exemplo 1 s 20® pg de proteína, mais prefarencíalmente 5 s 40 yy de proteína, A quantidade a RÚssra de doses a serem administradas pode ser determinada em estudos convencionais de gamas de doses envolvendo a observação ds títulos de anticorpos e outras respostas em indívitíuos., vHBsftg pode também ser misturado com outro HBsftg como seja HBsAg normal ou partículas de HBsAg homogéneas ou compostas contendo toda ou parte ou partes dos polipeptídeos PreSl ou PreS2 para a formulação ds vacinas. Ele pode também ser misturado com partículas de HBsAg híbrido portadoras de epítopos de proteínas ds outros organismos s com outros imanogènios para formar vacinas foivaientes ou muitivalentes. A preparação de vacinas está descrita em ”vaccines!!, editado por vol ler st al», University Park Press, Baltimore, HD, U.S.ft., 1978, vhnísAg s útil para a inclusão como um reagente imunológico sm kits de detecção de infecções por variantes do vírus HBV e similares. Ele pode também ser usado para induzir anticorpos policlonais s monoclonais por métodos conhscidos, alguns destes anticorpos monoclonais podem ser específicos para o antigénio variante s não reconhecem HBsAg normal.
Assim num outro aspecto do invento é proporcionado um kit para o diagnóstico por detecção in vitro de anticorpos anti-vKBsftg num meio biológico e em particular anticorpos neutralicantes após vacinação, caracterizado pors
a) vHBsAq como aqui definido? s ta) meios adaptados para detectar a reacção antigénio-anticorpo.
Num outro aspecto o invento proporciona uma preparação de anticorpo compreendendo anticorpos anti-vHBsAg para usar na prevenção ou tratamento de infecção por hepatite B em humanos. é também proporcionado um método de tratamento de humanos com uma quantidade eficaz de tal anticorpo anti-vHBsAg para evitar ou tratar a infecção pelo vírus da hepatite B, invento será agora ilustrado pelos exemplos que se
Exemplo 1
Identificação de vírus da Hepatite B variante (te utente fugitiYfiLl (a) Métodos <i> ifflynisa£^_£aOLvaçÍQaJãBV
Foi iniciada uma série ensaios da vacina HBV sm Itália em 1982« Tomaram parte vários centras, um dos quais, a Quarta Divisão ds Doenças Infecciosas no Hospital D. Cotugno em Nápoles, seguiu 159® pessoas. A região de onde veia a maior parte destes doentes, Campania, tem uma prevalência d® HBsAg superior a 5%. Os doentes foram essencialmente crianças portadoras positivas ds HBsfig, de duas regiões do Sul de Itália, que foram vacinadas com HB-VAX (Merck Sharp and Dohme) ou HEVAC--B (Pasteur) , ambas as vacinas derivadas do plasma. Foram administradas doses de 2ú μα da primeira para adultas Cl® pg para crianças) nos aess <?, 1 e 6 ou 5pg da última nos meses ®, 1, 2 s 14. Aos bébês foi também dado ®55 ml de hiperimunoglabulina B (HBIg) (Biagini), preparado pelo processo de fraccionação com etanol de Chon, ao nascimento e com i mês da idade. Foram também vacinados uma série de famílias qus contacta com os portadores, adultos e crianças.
íiií Marcadores da hepatite
Amostras de sangue foram testadas para HBsAg, HBsAg, anti-HBe, anti-HBs ε anti-HBc usando kits comerciais (Abbott Laboratories) Anti-HBs foi calculado por comparação com uma curva padrão gerada ccm um painel ds quantificação (Abbott Laboratories)» A positividade para HBsAg foi confirmada por novo teste e por neutralização usando o HBsAg Confirmatory Assay CAbbot Laboratories)„ As neutralizações de HBsAg foram realizadas usando uss soro contendo quass exclusivamente anti-a, Os soros ds doentes com marcas de replicação virai foram também testados rslativsmente aos níveis de alanína-aminotransferase (ALT)«
ÍIIi> Subtipagem ds HBsAg e anti-HBs
A subtipagem de HBaAq foi realizada nos contactos coo 5 béhés infectados portadores s 5 crianças infectadas» 6 de 3 dos contactes familiares de adultos infectados e casos AS;i AA e AE assim como 2 dos casos adultos» rara subtipagem5 esferas revestidas com anti-as snti-d ou anti-y (Sorin Biomedica) foram incubados durante a noite a temperatura ambiente com soro» Após lavagem com água destilada., adicionou-se Í3?2 pCi de anti-HBs de carneiro marcado com ‘'“í s deixou-se i hora a 45°C» lavou-ss e quantificou-se num contador de cintilação. Uma amostra foi considerada ay quando as contagens obtidas usando anti-a ou anti-y na fase sólida excedeu 23í vezes o valor médio do controle negativo (ds 7 pessoas saudáveis HBV negativas? e o obtido com as esferas anti-d foi inferior ao valor do controla negativa. As amostras foram consideradas como tendo apenas reactividade y se as contagens foram superiores ás do controle negativo quando adicionado a anti-y na fase sólida5 mas inferior ao valor do controle negativo quando adicionado a anti~a ou anti-d nas fases sólidas»
A especificidad® da rssctividade foi confirmada por neutralização com anticorpos monoclonais (Sorin Biomsdics), Os soros positivos para HBsAg foram misturados com anticorpo roonoespecífico anti-a, anti-d ou anti-y antes da subtipagem. uchro testemunha usou-ss um soro contendo um HBsAg referência» fi subtipsgem anti-HBs foi realizada nos casos AS, Afi e 2 dos casos adultos, usando uma RIA de sanduíche que emprega um HBsAg recombinante CrHBsAg) ds um suhtipo na fase sólida s um marcado com iodo radioactivo de um subtipo diferente como sonda» As esferas de polistireno foram revestidas com rHBsAg ad ou ay» Para detectar anti-a, ®,2 ml ds soro foi incubado durante a noite ã temperatura ambiente com esferas» Após lavagem» as esferas foram incubadas com rHBsAg marcado com iodo radioactivo durante 2 horas ã 4®°C = Após lavagem» a radioactividade das esferas foi contada» Para o ensaia do subtipo ad, as esferas revestidas com ad foram despistadas com rHBsAg ad marcado e do mesmo modo ay» As amostras con< contagens 4 vezes acima da média do controle negativo foram positivos» Gs títulos foram expressos como mIU/ml comparado com um painel padrãoa a percentagem de anti-s num soro foi determinada calculando a anti-a relativamente a anti-ad ou anti-ay vezes i©®» <iv> Doentes para estudos ds sequenciação
I
Um portador positivo para HBsAg» HBsAg e snti-HBc (doente IE) com um ALT de 105 deu â luz uma criança do sexo masculino CAS) eoi 5 de Março, 1983» 0 pai era snti-HBc e anti-HBs | positivo» Na altura do nascimento e 1 mês mais tarde foi administrado ao bebé 1,5 ml de HBIg e ele foi vacinado com HB-VAX (MerckSharp and Dohme) aos 3 meses, 4 meses © 9 meses tíe itíatíe» Para estudos ds sequenciação, escolheram-se soros da mãe na altura tío nascimento» da criança aos 11 meses tíe idade (HBsAg, HBsAg e anti-HBc positivos; anti-HBs 42® mlU/mls ALT 12®) e 5 anos mais tarde (HBsAg e HBsAg positivos^ anti-KBs negativo? ALT 36)= Foram também sequenciadcs os soros de 4 portadores italianos HBeAq positivos escolhidos ao acaso não evolvidos no estudo e de 3 doentes HBsAg positivos ingleses.
ív) PCR ^..„sequsnciaçãq...,direc ta
5® yl ds soro foi digerido em acetato de sódio 25 mli,
2,5 mM EDTA5 0,57 SD3 s 1 mg/ml de protsinass K CBoehringer Mannheim), nus volume de 2®0 yl durante a noite a 37°C. Após 2 extracções com fenol/clorofórmio e 2 com clorofórmio, o DMA foi precipitado com etanol e o sedimento lavado com etanol a 707 = D sedimento foi ressuspsnso em 2® μΐ ds água, PCR foi realizada em 1® yl do DNA com 3®0 pmoles- de cada um dos iniciadores BSC2 e BSC4 usando o método ds Carman et al =, Lancet, 1989» ii, 583-591= Na Figura 2 são apresentados a sequência alvo, sítios de ligação ao iniciador s sequências ds iniciador.
Após electroforese em gel de aqarose ds 10 yl da reacção para confirmar a presença ds DNA amplificado, o restante foi passado numa coluna de Sephadex B-5® (Pharmacia)e precipitado com etanol. Após 3 lavagens cos etanol a 7®7» o sedimento foi ressuspensc em 2® yl de àgua = Entretanto, í® pmolss do iniciador ds sequenciação BCS3 foi marcado nos extremos num tampão convenciansi com 1® yCi. ds gama—'''P—ATP usando 1® 0 ds polinucleótido— Cinas-e CBoehringer Mannhsim) num vclume final ds 2@ yl= 0 iniciador ds sequenciação não foi purificado em coluna após marcação, yl do DNA foi adicionado a 4 yl de BCS3 marcado na presença de 2yl de tampão 5x» conforme fornecido no Kit Sequena.se (United States Biocbsmicals), aquecida ate ?5‘:>C s arrefecida lentamente até 5®*C« As recomendações do fabricante foram seguidas exceptuancio as misturas de terminação que foram diluídas com um volume igual de água» As reacções foram sujeitas a electroforess num gel de 5'í Sequagsl (National Diaqnostics) poliacrilamida-ureis» ívi) Gráficos de Hidrofobicidade
Os aminoácidos 13? a 147 do determinante a do HBsAg normal s mutsnte foram analisados usando software Prosis (Pharmacia) » <b) Resultados íi) Estudos, ds subtipaqsm
Dos 159® vacinados, 44 (2,8%) desenvolvsrsm HBsAg, de entre estes 12 mostraram reactividads fraca s nenhuma outra marca de HBV» Obtiveram-se detalhes de 1B destes doentess 5 crlanças nasceram ds mães portadoras» 5 crianças familiares sm contacta s S adultos familiares em contacto.
subtipo ds HBV foi determinado cama sendo ay em todos os contactos dos bébés e crianças infectadas e em ó de S Ctodos eles testados) dos contactes de casos adultos» A encontrou-se que a mãe do caso AS era ay em duas ocasiões, a primeira vez dois meses após o parto» 0 doente AS mostrou-se fracamente positivo para o subtipo y aos 12 s 18 meses ds idade ay positivo aos 46 meses, 6 rneses após a anti-HBs tornou-se indetsctável= O caso AA aos 2 anos de idade após o começo da vacinação, caso AE 9 meses após s todos os casos de adultos C2ó e 28 meses após imunicação) foram y positivos apenas»
Os resultados foram confirmados usando reagentes monoclonaís» Todos os casos com soros contendo y foram neutralizados com snti-y mas não anti-a.
A subtipsgem ds anti-HBs revelou que 50-70% dos anticorpos eram anti-a» No doente AS, aos 6 meses de idade e posteriorments, csrca de 90% eram contra o determinante a= íii) Sgguenciacgo_do.^eteríHÍnante,..%¾.
doente AS, através de ssquenciação, mostrou-se ter uma única mutação ds guanosina para adenosina ÍS para A) na posição 587 (numerado desde o sitio único EcoRI do genoma ds HBV>9 resultando numa substituição da aminoácido de glicina para arginina no aminoácido 145 d© HBsftg. Esta alteração ê estável uma vss qus estava presente tanto na idads da 11 mases como na idade de 5 anos, A mâ'e3 IE s os doentes testemunha tinham glicina nesta altura no epitopo.. tal como em todas as sequências publicadas até à data, fi sequência do determinante a era igual nos doentes AS e IE s a mesma dos anteriormente publicados.
Ciii) gráficos de hidrofobicidsde
Determinou-se a hidrofobicidads relativa da segunda ansa do determinante a do HBsftg normal e da do paciente AS, Usando o método de Kyts e Doolittles J. Mol, Biol» 1982, 157..
105-132, o índica médio de hidrofobicidads para a segunda ansa mudou da -1,3 para -1,9 s ds -®,5 para 0,9 usando o método de Hopp e Woods <Pro£^__NâlL·._____d£â£b_____Sc to____y„,S,ft,, 1981, 78»
3824-3828).
Exemplo
Construção de uma sequência codificadora do_gene S variante_do ssrotipo ay contendo substituição de_gl.i para arg.....na,posição_de
-aminoÃcido 145
Sintetizaram-se quatro oligonucleótidos iniciadores» BCí/j BCÍ44, BCÍ45 © BC146, tendo as sequências mostradas abaixo, par química de fosforamidetos convencional num sintetizador de DMA Biasearch 860® segundo as instruções do fabricante.
| BC17 | 55 | GTCTAGACTCGTGGTGGACT | 3? |
| BC 144 | 5? | TTGGAATTCSTTAAATGTATA | 3’ |
| BC 145 | s *' | CTTCGSACAGAAATTSCACCT | 3’ |
| BC 146 | 5* | ASGTGCAATTTCT6TCCGAAG | 3’ |
Estes oligonucleótidos têm homologia com a sequência ay do gene S em pRITl©6©l como se rnostra na Figura 3 e foram usados como iniciadores para extensão com nucleótidos pela polimerase Taq com o gene S ay como molde» Os tripletos sublinhados AGA e TCT em BC145 © BC146 codificam a substituição pretendida arg145« Axnfla a sequência GAATTCG em BCÍ44permite a introdução de um sitio ds restrição EcoRl num par ds bases distai relativamente so codão ds terminação da sequência codificadora do gene 3= A reacção PCR foi realizada como especificado pelo fabricante (Perkin Elrnsr Cetus? usando pRITi©ó©i ou o plasmideo pRIT1343S apresentada na Figura 4 como molde« pR!T1343S é ua vector E« coli convencional contendo uma sequência codificadora completa do gens S ay derivada do pRITi©6©l e flanqueada por sítios de restrição
EcoRI e Bcjl 11 introduzidos por manipulação in vitro= Cerca de 1 a 10 ng do DMA molde foi misturado com 5© mM KC1, 10 fflM Tris™HCl p-H 8 = 3 = í,5 mM MgCl^, 0,01*4 <p/v) de gelatina, dATP, dSTP, dCTP e dTTP 200 μΜ csds5 1 μΜ da cada um dos iniciadores pretendidos s
2,5 unidades da polimerass Taq num volume final de í®® microli™ tros= Foram estabelecidas duas reacções separadas, uma contendo BC17 e BCÍ46 com o molde, a outra contendo SCÍ44 e BC145 com o molde,:
As duas misturas foram sujeitas a 25 ciclos de desnaturação (2 min, 94*0, empar®lhamento C2 min, 48*0 e extensão (2 min, 72*0 seguido ds um ciclo com um tempo ds extensão ds 15 minutos a 72*C usando um DNA Thermal Cyclsr (Psrkin Elmer Cstus, adquirido à Van dsr Heyden, Brussels, Belgium). A presença do fragmento amplificado pretendido em cada uma das misturas foi verificado por electroforese convencional ee gel de agarose e os fragmentes foram purificados por passagem através de colunas Centricon i©0 íAmicon Division, W.R. Srace © Co« adquirido à Van dsr Heyden, Brussels, Belgium). Cerca de í a í© ng de cada fragmento amplificado foi misturado numa s-ά reacção com os iniciadores BC17 e BC144 s amplificado exactamente como descrito atrás excepto a reacção de smparslhamsnto ter lugar a 6©*C =
Os oligonucleótidos iniciadores BC9© e BCÍ53 tendo as sequências mostradas abaixo podem também ser usados em vez de BC17 e de BC144,,
BC90 5’ ATSSAGAACATCACATCASCATTCCTAGSA 3’ bcl53 5’ TTSSAATTCSTTAAATGTATACCCAAASACAAAA 3’
BC9© tem homologia com o extremo 5f da sequência do gen© S ay começando no codão de iniciação= BC153 sobrepõe-se a BC144,,
Estabeleceram—se misturas ds reacção PCR, contendo uma BC9B e BC14& juntaments ccm DNA de pRITí343B como molde e outros ingredientes como detalhado atrás s a outra BC145 s BC153 juntamente com pRITÍ3438 como molde e outros ingredientes como detalhado atrás. As duas (Bisturas forma então sujeitas a 25 ciclos de desnaturação (2 min, 94*0 emparelhamsnto <2 min,, 48*0 e extensão <2 min,, 72*0 para permitir a araplxficação, 0 fragmento pretendido de 445 pb da amplificação BC90/BC146 e o fragmento de 267 pb da amplificação BC145/BC153 foram purificados por eleciroforese em gel de poliacrilamida s electroeluição,
Cerca de í® ng de cada fragmento foram então misturados e sujeitos a 25 ciclos de amplificação PCR na presença dos oligonucleótidos BC9® e BCÍ53 nas mesmas condiçSes de reacção como descrito atrás, 0 fragmento amplificado resultante com cerca de ò9© pb foi recuperado s contem sítios de rsconhecimento únicos para as endonucleases Xbal e EcoRI» fundida com α terminador da fí utilização destes oligonucleótidos iniciadores específicos, molde qene S ay e reacção PCR resulta na produção de um fragmento variante de 59© pb S-ay tendo a substituição srqt45 e extensSes 55 Xbal e 3;i EcoRI, Q fragmento pretendido è purificado de preferência dos iniciadores e outros produtos da reacção PCR por passagem através de uma coluna Csntricon í©@, O fragmento foi então substituido por técnicas convencionais de clonaqem pelo correspondente fragmento Xbal-EcoRI ds unia sequência codificadora virai normal de preferência fundida com um promotor de levedura. Um vector adequado para este fim è pIMM2:deltaEcoRI mostrado na Figura 5 onde uma sequência codificadora de S ssrotipo ad foi promotor TDH3 de levedura e está a montante do transcrição ARS33 de levedura para formar uma cassete de expressão, A construção e utilização de tais cassetes de expressão estão descritas em EP-A-© 278 940, Será facilmenta avaliado paios familiarizados com a nsatêria que qualquer vector adequado dasts tipo podo ser empregue dependendo dos fragmentos promotor e terminador da transcrição seleccionados para controlar a expressão na espécie ds levedura escolhida como hospedeiro» Ainda, outros sítios de restriçãc? poderão ser introduzidos no extremo 33 do fragmento variante usando iniciadores diferentes de BCÍ44. Será ainda avaliado que todas as diferenças de nucleótidos resultando em alterações de aminoácidos entre isoldos de HBV conhecidos dos ssrofcipos adu e ayu residem a jusante do sitio Xhal ds tal forma que a substituição sa pNN2deltaEcoRI do fragmen to variante Xhal-EcoRI obtido por PCR resulta numa sequência codificador® de ay.
Cerca de ls5 yg do fragmento de 690 pb resultante das reacçSes PCR com BC9®, BCÍS3» BC145 s BC146 descritas atrás foi digerido com as endonuclsases Xbal e EcoRI s cerca ds ®515 μρ do fragmento digerido foi misturado e ligado com cerca de 5® ng do vector pRIT12642 que foi previamente digerido com as endonuclea~ ses ds restrição XbaJ e EcoRI e desfosforilado. pRIT12642 ê exactamente idêntico ao vector pNM2deltaEcoRI mostrado na Figura 5= A partir da mistura de ligação, recuperou-se um plasmídeo e identificou-se como pRITÍ3555 que contem o fragmento Xbsí-EcoRI portador da sequência codificadora ds S modificada inserida entre os sitios XfoaX e EcoRI do vector pRIT12642, ds modo a formar uma cassete de expressão onde a sequência variante codificadora ds ay está situada 35 relativamente ao promotor TDK3 e sob o controle deste,
A cassete ds expressão vHBsAg resultante obtida como descrito atrás foi retirada do plasmídeo derivado pNN2dsltaEcoRI como uís fragmento de 2,89 Kb por digestão com as endonucleases Bql I s Sall e inserido em qualquer vector escolhido para introdução ®m levedura. Um vector de multicópias adequado para S, cerevisiae é pRITÍ2775 apresentada esquematicamente na Figura 6 o qual contem um poli-adaptador inserido entre os sítios EcoRI e SalI no replicão do pBR327 e que foi construído por técnicas convencionais ds amnipulaçSo de DNA usando fragmentos de DNA conhecidos, 0 fragmento cassete BgXIl-SslX ds 2,98 do pRIT13S55 foi obtido por digestão com endonucleases ds restrição e inserido entre os sítios BglII e Sall do plasmídeo pRITÍ'2775 por técnicas ds clonagem convencionais para formar o plasmídeo pRlTÍ3557« Caso se pretenda integrar a cassete no genoma de levedura é preferido um vector integrstivo como os descritos am Jacofos et al „, Sene, SP, página 279 CÍ9S9), Quando ss procede è inserção da cassete ds expressão vHBsftg em pRITi2775 as células de levedura de um mutante deficiente em leucina 2 são transformadas pelo método de Ito et al, d, Bactsriol, 153u pí63 (1983) com selecção de transformantes independentes de leucina. Uma estirpe recipiente adequada com uma dupla mutação leu2 é a estirpe DC5 depositada segundo o Tratado de Budapeste na American Type Culture Colláctico em 2 de Junho, 1982 com o número ds acesso ATCC 2OÓ30»
Uma outra estirpe adequada é um derivado cir' do DCS que foi depositada de acordo com o Tratado de Budapeste na American Type Culture Collaction em 18 de Agosto, 1986 com o número ds acesso ATCC 2®Θ2®, A estirpe DC5 cir’ foi transforasda com DNA ds pRIT13557 pelo método da íto et al, rsfsridís atrás com selecção de colónias independentes ds leucina. Uma colónia transformante foi repicada s subcultivsds para estabelecer a estirpe identififcada como Y1648,
Uma cassete de expressão portadora da sequência codificadora de vHBsftg pode também ser usada para transformar células hospedeiras ds S»__cerevisiae, H,__polymorqha ou P, pastoris as quais são portadoras de outras cassetes ds expressão ds modo a formar particulas de HbsAg compostas que contêm uaa mistura de duas ou maio espécies polipsptídicas»
Usaram—se técnicas de clonagem convencional para construir uma cassete ds expressão de 2 »98 Kb consistindo no promotor TDH3 de levedura, a sequência codificadora do gene S do subtipo ay derivada do pRITlOóOí s o fragmento tsrminador A6R3 de levedura» Esta cassete foi então inserida entre os sítios Bglll s Salí do pRITí2775 para formar pRlT13558„ pRJ.T1355B foi então introduzido por transformação» usando a técnica de Ito et al» referida atrás, da estirpe recipiente DC5 cir“ com selecçâo ds indepedência relativamente a leucina» Uma colónia transformante foi repicada e subcultivada para estabelecer a estirpe identificada como YÍ654»
A estirpe Y1Ó54 expressa HBsAg do subtipo ay que é útil corno controle quando se investiga as propriedades do vHSsAg do presente invento»
Subclonagem e expressão de partículas do subtipo 2y em levedura usando pRÃTlOôOi como material ds partida s o promotor ÃRB3 de levedura foi descrita por Ds Wiltís et al =, em Devei» Biol» Standard» 59, 99-107 <1983)=
Culturas de Y1648 e Y1654 foram cultivadas s cs HBsfig extraído s medido nos extratos celulares brutos por ratiioimunoen— saio ÃUSRIA (Abbott Laboratories» North Chicago, Illinois, U»S»A»)» Os resultados do ensaio das duas culturas YÍ648 s Y1Ó54 estão apresentados abaixo»
| r........... jESTIRPE | T I | i j HBsAg por I AUSRIA {(g/1 cultura) i .................. | Γ — ........i jHBsAg como j |percentagem j jde proteína j ..?...... ? | |
| INÚMERO Dft j CULTURA I I | PROTEÍNA (g/1 cultura· | |||
| {¥1648 | i ÍC1316 | 23.42 | 1.................. ........ .............. { 0,0115 | t —I } 0,049 j |
| j Cl 324 J............ | 27.3Ô | { 0,0131 ..........j ........................... | j 0,85 j ί I | |
| {¥1654 | l j Cl 332 | 2®,Í2 | !......... ....... ....................................... 1 0,127 | i ------ Ί í ®,63 j |
| I......... „ | JC1336 L | 26,09 L......... | j 0,136 J. | | 0,52 I I 5 |
A estirpe Y1648 produz cerca ds 1® vezes senos material reactivo aparente em AUSRífi comparado com a estirpe YÍ654. A transferência Western de extractos celulares brutos usando o anticorpo monoclonal HBSÍ CSmithKline Beecham Bioloqicals, Rixsnsart.; Belgium? , reconhecendo o polipeptídeo do antícénio ds superfície ds HBV reduzido, mc?strou que YÍ648 produziu aproximadamente a mesma quantidade de proteína reactiva com HBS1 tendo um peso molecular ds 24 K tal como Y1654.
Métodos para a cultura ds células de levedura, extrac™ ção e ensaio ds HBsAg e transferências Western podem ser encontrados em EP—A-® 278 94® e EP™A—® 414 374 ambos sendo aqui incorporados como referência.
material do antigénio de superfície foi purificado a partir ds extractos celulares de YÍ64S e Y1654 por métodos convencionais ds acordo com as Patentes US 4= 649, 192 e 4, 683, 294 referidas atrás.
As preparações consistiraíK em proteina substancialmente pura do antigénio de superfície ds HBV conforme analisado por 8D3--PA8E e coloração com prata que revelou bandas isoladas fortes da proteína 24K juntamente com vestígios de dímeros e multímsros»
Duas preparações ds HBsAg derivado de levedura da estirpe Y1654 deram razões AIJSR1 A/proteína de i?ó4 e 2S79 enquanto que duas preparações de vHBsAq da estirpe Y1648 deram razões AUSRIA/proteína de ©„! s ©,13, vHBsAg purificado da estirpe YÍ64S foi examinado por microscopia elsctrónica após coloração com acetato de uranilo, 0 material mostrou a presença de partículas esféricas típicas do antigénio de superfície ds HBV,
Exemplí
Preparação de uma.composição ds vacina
A uma scúução aquosa tamponatía estéril de 3% de hidróxido ds alumínio sm fosfato ds sódio 1© 15© mM NaCl, pH 658? adicionou—se o vHBsAg do Exemplo 2 num tampão semelhante com agitaçao constante para uma concentração finai de 5 a 40 pg de proteína e ©f5 mg por ml de alumínio (&!'“)„ Adicionou—se então Timsrosal ímsrtiolato de sódio) para uma concentração final de í em 2© ©O© Cp/v) como preservativo.
A vacina è adequada para administração parsntsral humanos,
Claims (11)
- REIVINDICAÇÕESIa. - Processo para a preparação de uma proteína do antigénio de superfície da hepatite B ou seu fragmento apresentando a antigenicidade do antigénio de superfície de HBV, em gue a referida proteína ou seu fragmento (vHBsAg) compreende um determinante a modificado em gue o resíduo de glicina na posição 145 da sequência de HBsAg, é substituído por um aminoácido mais hidrofílico, caracterizado por compreender os passos de cultura de um hospedeiro transformado com um vector de expressão compreendendo uma sequência de DNA codificadora da referida vHBsAg, num meio de cultura adequado e a purificação da vHBsAg produzida até ao grau de pureza desejado.
- 2a. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracte rizado por se preparar uma vHBsAg em que o aminoácido na posição 145 pode ser derivado por uma mutação pontual no codão GGA codificador da glicina na posição 145 no HHsAg normal.
- 3a. - Processo de acordo com a Reivindicação 1 ou com a Reivindicação 2, caracterizado por se preparar uma vHBsAg que é idêntica à proteína HBsAg S normal excepto no que respeita o resíduo de aminoácido alterado na posição 145.
- 4a. - Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 3, caracterizado por se preparar uma vHBsAg em que a modificação na posição 145 é a substituição de glicina por arginina.
- 5a. - Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 4, caracterizado por se preparar uma vHBsAg que está mais de 75% pura.
- 6a. - Vector de expressão, caracterizado por compreender uma sequência de DNA codificadora de uma vHBsAg de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 4.
- 7a. - Hospedeiro, caracterizado por ter sido transformado com o vector da Reivindicação 6.
- 8a. - Processo para a preparação de uma composição de vacina, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade eficaz de uma vHBsAg conforme preparada de acordo com a Reivindicação 5, misturada com um veículo ou adjuvante adequado.
- 9a. - Método para a protecção de humanos contra doenças associadas a HBV, caracterizado por compreender a administração de uma vHBsAg de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 5, sendo a gama de dosagem da proteína de la 1000 mcg, de preferência de 1 a 200 mcg.
- 10a. - Equipamento (”kitu) para o diagnóstico por detecção in vitro de anticorpos anti-vHBsAg num meio biológico, caracterizado por o referido equipamento compreender:(a) vHBsAg de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 5; e (b) meios adaptados à detecção da reacção de antigénio-anticorpo.
- 11*. - Processo para a obtenção de uma preparação de anticorpo, caracterizado por se incorporar na referida preparação anticorpos anti-vHBsAg para usar na prevenção ou tratamento da infecção por hepatite B em humanos.
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