JPH11178591A

JPH11178591A - Ｂ型肝炎ワクチン

Info

Publication number: JPH11178591A
Application number: JP10269188A
Authority: JP
Inventors: Thomas Howard Christopher; ハワードクリストファートーマス; Carman William Frederick; ウィリアムフレデリックカーマン
Original assignee: Imperial College of Science Technology and Medicine
Current assignee: Imperial College of Science Technology and Medicine
Priority date: 1990-03-29
Filing date: 1998-09-24
Publication date: 1999-07-06
Anticipated expiration: 2015-06-05
Also published as: IE911022A1; EP0522030B1; US6099840A; JP2876091B2; WO1991014703A1; JPH05505805A; AU642729B2; DE69111801D1; JP3049018B2; EP0522030A1; IE67877B1; GB9007024D0; DE69111801T2; PT97159A; KR100208129B1; DK0522030T3; CA2078694A1; ES2075440T3; NZ237611A; ATE125821T1

Abstract

(57)【要約】【課題】 “エスケープ突然変異体(escape mutant) ”
の出現による問題を解決するために使用されるＤＮＡ組
成物、発現ベクター、診断検出用キット及び抗体調製物
を提供する。【解決手段】変異型Ｂ型肝炎表面抗原（ｖＨＢｓＡ
ｇ）タンパク質またはその断片はＳ（ＨＢｓ）タンパク
質の１４５番目のアミノ酸がアルギニンであるＨＢｓタ
ンパク質の修飾される“ａ”決定基からなり、該ｖＨＢ
ｓＡｇは野生型のＳ（ＨＢｓＡｇ）タンパク質の抗原性
とは異なる抗原性を発揮し、さらに、ＤＮＡは適当な担
体または希釈剤との混合物の形態を有する、変異型Ｂ型
肝炎表面抗原（ｖＨＢｓＡｇ）タンパク質またはその断
片をコード化するＤＮＡ配列からなる組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス
の抗原の特異性を有するポリペプチドをコード化する組
換えＤＮＡ配列からなるＤＮＡ組成物、および当該ＤＮ
Ａ配列からなる発現ベクターに関するものである。

【０００２】さらに詳しく述べると、本発明は、このよ
うなポリペプチドからなるＢ型肝炎ウィルスの変異体に
対する抗体のｉｎｖｉｔｒｏでの診断検出用のキッ
ト、および当該抗体からなるヒトのＢ型肝炎の感染の予
防または治療に使用される抗体調製物に関するものであ
る。

【０００３】

【従来の技術】Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）による感染
は重篤であり、世界中の問題であるが、集団免疫に使用
できるワクチン、例えば、遺伝子操作技術によって得ら
れる製品「エンゲリックス−Ｂ(Engerix-B) 」（スミス
クラインビーカムピーエルシー(SmithKline Beecha
m p.l.c.) ）が現在利用されている。

【０００４】様々な血清型のＢ型肝炎のビリオンのゲノ
ムのクローニングは、当該分野において良く知られてい
る；ミラー(Miller)ら、ヘパトロジー(Hepatology)、９
巻（１９８９年）、ページ３２２および上記文献中の引
用文を参照。Ｂ型肝炎のビリオンであり、感染した患者
より単離できるデーン粒子は、約４２ｎｍの直径を有す
る。それぞれは、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）から
なるエンベロープ、カプシド（ＨＢｃＡｇ）、内因性の
ポリメラーゼおよびＤＮＡゲノムから構成される。第三
のポリペプチド、“ｅ”抗原（ＨＢｅＡｇ）は、Ｂ型肝
炎ウィルスによって作製され、血清中で可溶化した状態
で発見される。

【０００５】ＨＢＶに対する市販のワクチンは、天然の
または組換え体のいずれかの形態のＢ型肝炎ウィルス表
面抗原（ＨＢｓＡｇ）からなる。本来のＢ型肝炎ウィル
スの表面抗原はＰ２４及びその配糖化された誘導体であ
るＧＰ２８として知られている２つのタンパク質から構
成される約２２ｎｍの粒子として感染した人の血漿から
回収でき、これら２つのタンパク質は両方ともＳタンパ
ク質コーディング配列又はＨＢＶＳ−遺伝子として知
られているＨＢＶゲノム上の２２６アミノ酸のコーディ
ング配列によってコード化される；チオライス(Tiollai
s)ら、ネイチャー(Nature)、３１７巻（１９８５年）、
ページ４８９およびこの文献中の引用文を参照。ＨＢｓ
Ａｇの完全なアミノ酸配列、およびＨＢｓＡｇをコード
化するヌクレオチド配列は、ヴァレンチュエラ(Valenzu
ela)ら、ネイチャー(Nature)、２８０巻（１９７９
年）、ページ８１５に記載されている。ヌクレオチドお
よびアミノ酸の位置を定義するためにチオライス(Tioll
ais)ら（上記引用文(loc. cit.)）によって使用されて
いる数のつけ方を本明細書中で使用する。

【０００６】ワクチンを製造するためにサッカロミセス
セレビジエ(S. cerevisiae) においてＨＢｓＡｇを発
現できる発現ベクター上への酵母のプロモーターの制御
下におけるＨＢＶＳ遺伝子のコーディング配列の挿入
は、例えば、ハーフォード(Harford) ら、デベロップ
バイオロスタンダード(Develop. Biol. Standard.)、
５４巻における：ページ１２５（１９８３年）、ヴァ
レンチュエラ(Valenzuela)ら、ネイチャー(Nature)、２
９８巻、ページ３４７（１９８２年）およびビター(Bit
ter)ら、ジェーメドヴィロル(J. Med. Virol.)、２
５巻、ページ１２３（１９８８年）によって記載されて
いる。また、ピチアパストリス(Pichia pastoris) に
おける発現もまた、グレッグ(Gregg) ら、バイオテクノ
ロジー(Biotechnology) 、５巻（１９８７年）、ページ
４７９（また、欧州特許出願公開番号０２２６８４６号
を参照）によって記載されており、ハンセンヌラポリ
モルファ(Hansenula polymorpha)における発現もある
（ＥＰ−Ａ−０２９９１０８号参照）。

【０００７】また、ワクチンが、欧州特許出願公開番号
０２７８９４０号に記載されているように、ＨＢｓＡｇ
タンパク質からなるハイブリッド免疫抗原性粒子から調
製される。

【０００８】このような粒子は、例えば、本明細書中で
はプレＳコーディング配列(Pre S coding sequence) と
称される、ＨＢＶゲノム上のＨＢＶ−Ｓ遺伝子のすぐ前
にあるコーディング配列によってコード化されるＨＢｓ
Ａｇ前駆体タンパク質の全部または一部を有することが
できる。プレＳコーディング配列(Pre S coding sequen
ce) は、通常、（ａｙＨＢＶサブタイプ(ay HBV sub
type) の場合では）１６３アミノ酸をコードしており、
プレＳ１コーディング配列(Pre S1 coding sequence)お
よびプレＳ２コーディング配列(Pre S2 coding sequenc
e)からなる。後者は５５アミノ酸をコードしており、Ｓ
タンパク質コーディング配列のすぐ前にある（さらなる
詳細についてはＥＰ−Ａ−０２７８９４０号を参照）。

【０００９】ＨＢＶの抗原性サブタイプ(subtype) は、
血清学的に定義されており、ＨＢｓＡｇをコード化する
ゲノム領域において１塩基変化することによるものであ
ることが示されている（オカモト(Okamoto) ら、ジェー
ヴィロル(J. Virol.) 、１９８７年、７４巻、ページ
５４６３〜５４６７）。しかしながら、すべての既知の
抗原性サブタイプ(subtype) は、ＨＢｓＡｇの１２４か
ら１４７番目のアミノ酸からなる“ａ”決定基を有して
いる。“ａ”決定基に対する抗体は、すべてのサブタイ
プ(subtype) に対する保護を与える。１４７番目のシス
テインおよび１４２番目のプロリンが“ａ”決定基の抗
原性を十分発揮するのに重要であることが、ｉｎｖｉ
ｔｒｏの突然変異誘発によって示された（アシュトン(A
shton)ら、ジェーメドヴィロル(J. Med. Virol.)、
１９８９年、２９巻、ページ１９６）。

【００１０】最近の１０年間で、Ｂ型肝炎ウィルス（Ｈ
ＢＶ）の様々な推定された変異体が記載されてきた。

【００１１】マックマホーン(Mac Mahon) らは、ＨＢ
ｓＡｇのドメインに結合する推定されたモノクローナル
抗体におけるグリシンからアルギニンへの置換が、抗Ｈ
ＢｓＡｇモノクローナル抗体で処置された肝臓移植患者
において見つかった（ＤＮＡ配列分析によって推論され
た）ことを報告した（コールドスプリングハーバー
シンポジウムオンザモレキュラーバイオロジ
ーオブヘパティティスビーウィルセス(Cold Sp
ring Harbor Symposium on the Molecular Biology of
Hepatitis B viruses)、１９８９年９月）。しかしなが
ら、この結果は、変異型ＨＢｓＡｇアミノ酸配列を合成
するまたはこれに基づいたワクチン組成物を開発する誘
因にはならない。

【００１２】他の報告では、２つの認可されたＢ型肝炎
ワクチンのうちの１つで免疫処置した後特異的な抗体
（抗ＨＢｓ）が存在するにもかかわらず、ウィルスの複
製を示す、Ｂ型肝炎表面抗原が循環している子供および
大人が見つかった（ザネッティ(Zanetti) ら、ランセッ
ト(Lancet)、１９８８年１１月、ページ１１３２）。モ
ノクローナル抗体によるＨＢｓＡｇの分析によって、循
環している抗原は“ａ”決定基を有していないまたはこ
の決定基はマスクされていることが分かった。感染が風
土病である地域において免疫処置に関連した疫学的圧力
によって恐らくＢ型肝炎ウィルスの変異体の出現が検出
されることが結論付けられた。しかしながら、変異体の
特性はさらに明らかにされなかった。

【００１３】ザネッティ(Zanetti) らの研究から、現在
使用されているＢ型肝炎ワクチンの潜在的な欠点は、こ
れらのワクチンが、少なくとも免疫遺伝学的体質を前か
ら有する宿主においては、“エスケープ突然変異体(esc
ape mutant) ”、つまり、免疫性を中和しないように突
然変異された複製感染ウィルスを出現させる原因になる
ことであることが明らかにされた。このような変異型ウ
ィルスは明らかに疾患を引き起こす能力を有し、感染性
があると考えられる。したがって、この変異型ウィルス
は、正常なＨＢｓＡｇを基礎としたワクチンによって産
生される抗体によって効果的に中和されないため、重大
な免疫性の問題が生じる可能性がある。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、既知のＨＢＶワクチンに関連した上記の欠点を解決
するまたは少なくとも軽減する組成物、発現ベクター、
診断検出用キット、および抗体調製物を提供することを
目的とするものである。

【００１５】また、本発明は、ウィルスのＨＢｓＡｇの
“ａ”決定基が修飾を受けた上記した“エスケープ突然
変異体(escape mutant) ”の出現による問題を解決する
ために使用される組成物、発現ベクター、診断検出用キ
ット、および抗体調製物を提供することをも目的とする
ものである。

【００１６】さらに、本発明は、１４５番目がグリシン
以外のアミノ酸であるＨＢｓＡｇアミノ酸配列において
修飾された“ａ”決定基を有するように本明細書中で規
定された変異型ＨＢＶに対して保護する、および上記変
異型ＨＢＶの出現または伝達を防ぐために使用できる組
成物、発現ベクター、診断検出用キット、および抗体調
製物を提供することをも目的とするものである。

【００１７】さらにまた、本発明は、Ｂ型肝炎の感染の
予防または治療に使用される組成物、発現ベクター、お
よび抗体調製物を提供することをも目的とするものであ
る。

【００１８】

【課題を解決するための手段】上記諸目的は、以下の
（１）〜（２８）によって達成される。

【００１９】（１）変異型Ｂ型肝炎表面抗原（ｖＨＢ
ｓＡｇ）タンパク質またはその断片はＳ（ＨＢｓ）タン
パク質の１４５番目のアミノ酸がアルギニンであるＨＢ
ｓタンパク質の修飾される“ａ”決定基からなり、該ｖ
ＨＢｓＡｇは野生型のＳ（ＨＢｓＡｇ）タンパク質の抗
原性とは異なる抗原性を発揮し、さらに、ＤＮＡは適当
な担体または希釈剤との混合物の形態を有する、変異型
Ｂ型肝炎表面抗原（ｖＨＢｓＡｇ）タンパク質またはそ
の断片をコード化するＤＮＡ配列からなる組成物。

【００２０】（２）前記ｖＨＢｓＡｇタンパク質また
はその断片は１４５番目のアミノ酸が変更された以外は
野生型のＨＢｓＡｇと同じである、前記（１）に記載の
組成物。

【００２１】（３）前記１４５番目のアミノ酸は１４
５番目の点突然変異コドンがアルギニンをコードするよ
うな野生型のＨＢｓＡｇにおける１４５番目のグリシン
をコードするＧＧＡコドンにおける点突然変異によって
誘導でき、かつ該点突然変異コドンはＡＧＡ、ＣＧＡ、
ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ及びＡＧＧからなる群より選ば
れる、前記（１）または（２）に記載の組成物。

【００２２】（４）前記ｖＨＢｓＡｇタンパク質また
はその断片は野生型のＨＢｓＡｇ配列の１４５番目以外
の位置の少なくとも一のアミノ酸残基の変更または付加
を起こす点突然変異または挿入が存在するｖＨＢｓＡｇ
の配列を有する、前記（１）から（３）のいずれかに記
載の組成物。

【００２３】（５）前記ｖＨＢｓＡｇはプレＳコーデ
ィング配列を含む、前記（１）から（４）のいずれかに
記載の組成物。

【００２４】（６）前記プレＳコーディング配列はプ
レＳ１コーディング配列である、前記（５）に記載の組
成物。

【００２５】（７）前記プレＳコーディング配列はプ
レＳ２コーディング配列である、前記（５）に記載の組
成物。

【００２６】（８）変異型Ｂ型肝炎表面抗原（ｖＨＢ
ｓＡｇ）タンパク質またはその断片はＳ（ＨＢｓ）タン
パク質の１４５番目のアミノ酸がアルギニンであるＨＢ
ｓタンパク質の修飾される“ａ”決定基からなり、該ｖ
ＨＢｓＡｇは野生型のＳ（ＨＢｓＡｇ）タンパク質の抗
原性とは異なる抗原性を発揮する、変異型Ｂ型肝炎表面
抗原（ｖＨＢｓＡｇ）タンパク質またはその断片をコー
ド化するＤＮＡ配列からなる発現ベクター。

【００２７】（９）前記ｖＨＢｓＡｇタンパク質また
はその断片は１４５番目のアミノ酸が変更された以外は
野生型のＨＢｓＡｇと同じである、請求項８に記載の発
現ベクター。ｖＨＢｓＡｇタンパク質またはその断片は
１４５番目のアミノ酸が変更された以外は野生型のＨＢ
ｓＡｇと同じである、前記（８）に記載の発現ベクタ
ー。

【００２８】（１０）前記１４５番目のアミノ酸は１
４５番目の点突然変異コドンがアルギニンをコードする
ような野生型のＨＢｓＡｇにおける１４５番目のグリシ
ンをコードするＧＧＡコドンにおける点突然変異によっ
て誘導でき、かつ該点突然変異コドンはＡＧＡ、ＣＧ
Ａ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ及びＡＧＧからなる群より
選ばれる、前記（８）または（９）に記載の発現ベクタ
ー。

【００２９】（１１）前記ｖＨＢｓＡｇタンパク質ま
たはその断片は野生型のＨＢｓＡｇ配列の１４５番目以
外の位置の少なくとも一のアミノ酸残基の変更または付
加を起こす点突然変異または挿入が存在するｖＨＢｓＡ
ｇの配列を有する、前記（８）から（１０）のいずれか
に記載の発現ベクター。

【００３０】（１２）前記ｖＨＢｓＡｇはプレＳコー
ディング配列を含む、前記（８）から（１１）のいずれ
かに記載の発現ベクター。

【００３１】（１３）前記プレＳコーディング配列は
プレＳ１コーディング配列である、前記（１２）に記載
の発現ベクター。

【００３２】（１４）前記プレＳコーディング配列は
プレＳ２コーディング配列である、前記（１２）に記載
の発現ベクター。

【００３３】（１５）以下からなる、生物培養液にお
ける変異型Ｂ型肝炎表面抗原（ｖＨＢｓＡｇ）タンパク
質またはその断片に対する抗体のｉｎｖｉｔｒｏでの
診断検出用のキット：（ａ）変異型Ｂ型肝炎表面抗原（ｖＨＢｓＡｇ）タン
パク質またはその断片はＳ（ＨＢｓ）タンパク質の１４
５番目のアミノ酸がアルギニンであるＨＢｓタンパク質
の修飾される“ａ”決定基からなり、該ｖＨＢｓＡｇは
野生型のＳ（ＨＢｓＡｇ）タンパク質の抗原性とは異な
る抗原性を発揮する、変異型Ｂ型肝炎表面抗原（ｖＨＢ
ｓＡｇ）タンパク質またはその断片の配列を有する血液
産物を含まない実質的に純粋なタンパク質；および
（ｂ）抗原抗体反応を検出する手段。

【００３４】（１６）前記ｖＨＢｓＡｇタンパク質ま
たはその断片は１４５番目のアミノ酸が変更された以外
は野生型のＨＢｓＡｇと同じである、前記（１５）に記
載のキット。

【００３５】（１７）前記１４５番目のアミノ酸は１
４５番目の点突然変異コドンがアルギニンをコードする
ような野生型のＨＢｓＡｇにおける１４５番目のグリシ
ンをコードするＧＧＡコドンにおける点突然変異によっ
て誘導でき、かつ該点突然変異コドンはＡＧＡ、ＣＧ
Ａ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ及びＡＧＧからなる群より
選ばれる、前記（１５）または（１６）に記載のキッ
ト。

【００３６】（１８）前記ｖＨＢｓＡｇタンパク質ま
たはその断片は野生型のＨＢｓＡｇ配列の１４５番目以
外の位置の少なくとも一のアミノ酸残基の変更または付
加を起こす点突然変異または挿入が存在するｖＨＢｓＡ
ｇの配列を有する、前記（１５）から（１７）のいずれ
かに記載のキット。

【００３７】（１９）前記ｖＨＢｓＡｇはプレＳコー
ディング配列を含む、前記（１５）から（１８）のいず
れかに記載のキット。

【００３８】（２０）前記プレＳコーディング配列は
プレＳ１コーディング配列である、前記（１９）に記載
のキット。

【００３９】（２１）前記プレＳコーディング配列は
プレＳ２コーディング配列である、前記（１９）に記載
のキット。

【００４０】（２２）変異型Ｂ型肝炎表面抗原（ｖＨ
ＢｓＡｇ）タンパク質またはその断片はＳ（ＨＢｓ）タ
ンパク質の１４５番目のアミノ酸がアルギニンであるＨ
Ｂｓタンパク質の修飾される“ａ”決定基からなり、該
ｖＨＢｓＡｇは野生型のＳ（ＨＢｓＡｇ）タンパク質の
抗原性とは異なる抗原性を発揮する、変異型Ｂ型肝炎表
面抗原（ｖＨＢｓＡｇ）タンパク質またはその断片に対
して生じるまたはを検出する抗体からなるヒトのＢ型肝
炎の感染の診断、予防または治療に使用される抗体調製
物。

【００４１】（２３）前記ｖＨＢｓＡｇタンパク質ま
たはその断片は１４５番目のアミノ酸が変更された以外
は野生型のＨＢｓＡｇと同じである、前記（２２）に記
載の抗体調製物。

【００４２】（２４）前記１４５番目のアミノ酸は１
４５番目の点突然変異コドンがアルギニンをコードする
ような野生型のＨＢｓＡｇにおける１４５番目のグリシ
ンをコードするＧＧＡコドンにおける点突然変異によっ
て誘導でき、かつ該点突然変異コドンはＡＧＡ、ＣＧ
Ａ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ及びＡＧＧからなる群より
選ばれる、前記（２２）または（２３）に記載の抗体調
製物。

【００４３】（２５）前記ｖＨＢｓＡｇタンパク質ま
たはその断片は野生型のＨＢｓＡｇ配列の１４５番目以
外の位置の少なくとも一のアミノ酸残基の変更または付
加を起こす点突然変異または挿入が存在するｖＨＢｓＡ
ｇの配列を有する、前記（２２）から（２４）のいずれ
かに記載の抗体調製物。

【００４４】（２６）前記ｖＨＢｓＡｇはプレＳコー
ディング配列を含む、前記（２２）から（２５）のいず
れかに記載の抗体調製物。

【００４５】（２７）前記プレＳコーディング配列は
プレＳ１コーディング配列である、前記（２６）に記載
の抗体調製物。

【００４６】（２８）前記プレＳコーディング配列は
プレＳ２コーディング配列である、前記（２６）に記載
の抗体調製物。

【００４７】本発明のさらなる概念においては、免疫を
保護する量のｖＨＢｓＡｇおよび適当な担体からなるワ
クチン組成物を提供するものである。

【００４８】また、本発明の他の概念を、以下に記載す
る。

【００４９】本発明のｖＨＢｓＡｇおよびワクチンは、
ウィルスのＨＢｓＡｇの“ａ”決定基が修飾を受けた上
記した“エスケープ突然変異体(escape mutant) ”の出
現による問題を解決するために使用できる。特に、本発
明のワクチンは、１４５番目がグリシン以外のアミノ酸
であるＨＢｓＡｇアミノ酸配列において修飾された
“ａ”決定基を有するように本明細書中で規定された変
異型ＨＢＶに対して保護する、および上記変異型ＨＢＶ
の出現または伝達を防ぐために使用できるという長所を
有する。

【００５０】したがって、無毒で効果的な量の本発明に
よるワクチンをヒトに投与することからなる、上記ＨＢ
Ｖ変異体の感染に関する病状からヒトを保護する方法を
も提供するものである。

【００５１】他の概念によると、本発明は、治療、特に
予防において使用するためのｖＨＢｓＡｇを提供するも
のである。

【００５２】本発明は、また、上記変異型ＨＢＶの感染
に関連する病状に対してヒトを保護するワクチン組成物
の製造におけるｖＨＢｓＡｇの使用を提供するものであ
る。

【００５３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００５４】本発明による変異型ＨＢｓＡｇタンパク質
またはその断片は、本明細書において、「ｖＨＢｓＡ
ｇ」とも略される。

【００５５】ｖＨＢｓＡｇは「自然発生した」形態では
ないが、血液産物を含まない合成のまたは非常に精製さ
れた材料であると考えられる。

【００５６】好ましくは、本発明のｖＨＢｓＡｇは、Ｈ
ＢｓＡｇの全長に相当し、１４５番目のアミノ酸残基が
変更された以外は正常なＨＢｓＡｇと同じである。

【００５７】好ましくは、ｖＨＢｓＡｇは、非常に精製
された形態であり、例えば、７５％以上、さらに好まし
くは９０％以上精製度の状態であり、さらに最も好まし
くは９５〜１００％精製されている。

【００５８】存在する変異型ＨＢＶウィルスに対してヒ
トを免疫化するのに使用される場合には、ワクチンにお
けるｖＨＢｓＡｇ配列は、通常、その変異型ＨＢＶウィ
ルスのｖＨＢｓＡｇ配列に一致する、またはこれと抗原
性が等価であると考えられるであろう。

【００５９】好ましくは、本発明のｖＨＢｓＡｇにおけ
る１４５番目のアミノ酸が、正常なＨＢｓＡｇにおける
１４５番目のグリシンをコードしているＧＧＡコドンに
おける点変異由来である。

【００６０】本発明の好ましい実施態様においては、正
常なＨＢｓＡｇの１４５番目のグリシン残基が、これに
よりさらに抗原性が促進されるのでより親水性のアミノ
酸に置換される。

【００６１】本発明の特に好ましい実施態様において
は、ＨＢｓＡｇの“ａ”決定基における１４５番目の修
飾は、以下に記載されるように、この修飾は臨床上で単
離されたＨＢＶ変異体で起こることが既に示されている
ので、グリシンからアルギニンへの置換である。

【００６２】本発明のさらなる概念によると、ｖＨＢｓ
Ａｇの調製方法および上記方法によって得られるワクチ
ン組成物を提供するものである。

【００６３】好ましくは、ｖＨＢｓＡｇは、ペプチド合
成またはさらに好ましくは組換えＤＮＡ技術のどちらか
によって、合成により得られる。

【００６４】組換えＤＮＡ分子および配列の構築、操作
および確認方法は、当該分野においてよく知られてい
る。本発明のｖＨＢｓＡｇを得るためにＨＢｓＡｇの正
常なＨＢＶＳタンパク質の１４５番目のグリシン（図
１を参照）を異なるアミノ酸に変化させるためには、Ｓ
遺伝子のヌクレオチド配列の４３３から４３５番目の位
置のＧＧＡコドンを目的とするアミノ酸をコード化する
異なるコドンに変える必要がある。

【００６５】特に好ましい実施態様においては、ＧＧＡ
コドンを最も好ましくはＡＧＡまたは前記ほど好ましく
はないが、すべてがアルギニンをコード化する３塩基連
鎖（トリプレット）である、ＣＧＡ又はＣＧＣ又はＣＧ
Ｇ又はＣＧＴ又はＡＧＧに変更することが好ましい。

【００６６】様々な方法が適切に配列を変更するために
使用できる。適当な方法の一つとしては、ウィルスのま
たは酵母のコドン頻度を用いて目的とするコーディング
配列の、ホスファイトまたはホスホルアミダイト化学に
よる完全な新規合成（ｄｅｎｏｖｏ合成）が挙げられ
る。

【００６７】ＤＮＡの合成は、様々な会社から市販され
ている。このような遺伝子合成の例としては、ハイデン
(Hayden)およびマンデッキ(Mandecki)によるＤＮＡ、７
巻：ページ５７１（１９８８年）およびこの中の引用文
に記載されている。

【００６８】第二の方法は、ボットスタイン(Botstein)
およびショートル(Shortle) によるサイエンス(Scienc
e) 、２２９巻、ページ（１９８２年）に記載されてい
るように、すでにＨＢＶゲノムを有するベクターの適当
な制限断片を１本鎖のベクター上にクローニングし、そ
の後、ｉｎｖｉｔｒｏの部位特異的突然変異誘発を行
うことである。ｐＢＲ３２２上にクローニングされたａ
ｙサブタイプのＨＢＶゲノムからなる組換えプラスミド
ｐＲＩＴ１０６０１を含む大腸菌(E. coli) Ｋ１２株Ｃ
６００の培養物は、ブダペスト条約に従って、受託番号
ＡＴＣＣ３９１３２で１９８２年６月２日にアメリカン
タイプカルチャーコレクション(AmericanType Culture
Collection)に寄託された。２２６アミノ酸のＨＢｓＡ
ｇタンパク質を表示する(specify) Ｓ遺伝子をコードす
る配列またはプレＳポリペプチド(Pre S polypeptides)
をコードするより長い配列は、一般的な組換えＤＮＡ技
術によって上記のクローンから切断できる。

【００６９】適当な制限断片の一つとしては、ｐＲＩＴ
１０６０１のＳ遺伝子コーディング配列内の５７５ｂｐ
のＸｂａＩ−ＡｃｃＩ断片がある。ｉｎｖｉｔｒｏの
突然変異誘発に用いられるベクターシステムは市販され
ている。このようにして得られた突然変異された遺伝子
断片をＳ遺伝子に再挿入する。

【００７０】第三の方法は、ホ(Ho)ら、ジーン(Gene)、
７７巻、：ページ５１（１９８９年）に記載されている
ポリメラーゼ連鎖反応(plymerase chain reaction)（Ｐ
ＣＲ）技術を用いて目的とする突然変異変化を行うこと
である。

【００７１】それぞれの場合、ｖＨＢｓＡｇのコーディ
ング配列は、適当な宿主において適当なプロモーターの
制御下で発現される。

【００７２】ｖＨＢｓＡｇをコード化するＤＮＡ配列を
有する発現ベクターは新規であり、本発明のさらなる概
念を形成する。上記発現ベクターを形質転換された宿主
は、本発明の他の概念を形成するものである。

【００７３】好ましい概念においては、サッカロミセス
セレビジエ(S. cerevisiae) 、ピチアパストリス(P
ichia pastoris) またはハンセンヌラポリモルファ(H
ansenula polymorpha)が宿主として使用され、酵母のＴ
ＤＨ３プロモーター（グリセルアルデヒド−３−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ遺伝子(glyceraldehyde-3-
phosphate dehydrogenase gene) 、ヴァレンチュエラ(V
alenzuela)ら、１９８２年；ビター(Bitter)ら、１９８
８年、上記参照）またはＰＨ０５（ミヤノハラ(Miyanoh
ara)ら、プロシナショルアカデサイユーエスエ
ー(Proc. Natl.Acad. Sci. USA)、ページ１、１９８３
年）、ＭＯＸ、ＦＭＤＨ（ＥＰ−Ａ−０２９９１０８号
参照）およびＡＯＸ（ＥＰ−Ａ−０２２６８４６号参
照）等の酵母のプロモーターの制御下で発現する。

【００７４】形質転換された宿主は既知の手段で培養ま
たは発酵でき、ｖＨＢｓＡｇを抽出および精製できる。
酵母細胞からのＨＢｓＡｇの精製は、当該分野において
よく知られており、米国特許４，６４９，１９２号、米
国特許４，６８３，２９４号、米国特許４，６９４，０
７４号または米国特許４，７３８，９２６号のいずれか
にしたがって行うことができる。本発明のｖＨＢｓＡｇ
の精製は類似の方法で行うことができる。

【００７５】ｖＨＢｓＡｇを含むワクチンは既知の技術
によって調製され、好ましくは緩衝化生理食塩水中で免
疫保護量のｖＨＢｓＡｇを含み、水酸化アルミニウムお
よびリン酸アルミニウム等の様々な既知のアジュバント
のいずれかと混合または上記アジュバントに吸収され
る。「免疫保護」とは、重篤な副作用を伴わずに感染物
質に対して保護するのに十分な保護抗体または細胞が介
在した免疫反応を誘発するのに充分なｖＨＢｓＡｇが投
与されることを意味する。ｖＨＢｓＡｇの投与量は、ワ
クチンがアジュバント処理されているかによって変わる
が、通常、１から１，０００μｇのタンパク質、例え
ば、１から２００μｇのタンパク質、さらに好ましくは
５から４０μｇのタンパク質を含む。投与量および投与
回数は、抗体力価および患者の他の反応を観察しながら
標準的な投与範囲内で決定される。

【００７６】ｖＨＢｓＡｇは、また、ワクチンの配合を
目的として、プレＳ１(PreS1) 又はプレＳ２(PreS2) ポ
リペプチドのすべてまたは一部または複数の部分を含む
正常なＨＢｓＡｇまたは均質なまたは複合のＨＢｓＡｇ
粒子等の他のＨＢｓＡｇと混合されてもよい。また、ｖ
ＨＢｓＡｇは、他の生物体のタンパク質由来のエピトー
プを有するハイブリッドＨＢｓＡｇ粒子とさらには他の
免疫抗原と混合して２価または多価ワクチンを形成して
もよい。ワクチンの調製は、通常、ボラー(Voller)らに
よる著、ユニバーシティパークプレス、バルティモ
ア、エムディ(University Park Press, Baltimore, M
D)、米国、１９７８年の「ワクチン」において記載され
る。

【００７７】ｖＨＢｓＡｇは、変異型ＨＢＶウィルスの
感染等に関する検出キットの免疫試薬として使用でき
る。また、ｖＨＢｓＡｇは、既知の方法によってポリク
ローナル抗体及びモノクローナル抗体を生じさせるため
にも使用でき、モノクローナル抗体のうちには変異型の
抗原に対して特異的であり、正常なＨＢｓＡｇを認識し
ないものもある。

【００７８】したがって、本発明の他の概念において
は、以下からなる、生物培養液における変異型Ｂ型肝炎
表面抗原（ｖＨＢｓＡｇ）タンパク質またはその断片に
対する抗体のｉｎｖｉｔｒｏでの診断検出用のキット
が提供される：（ａ）変異型Ｂ型肝炎表面抗原（ｖＨＢｓＡｇ）タン
パク質またはその断片はＳ（ＨＢｓ）タンパク質の１４
５番目のアミノ酸がアルギニンであるＨＢｓタンパク質
の修飾される“ａ”決定基からなり、該ｖＨＢｓＡｇは
野生型のＳ（ＨＢｓＡｇ）タンパク質の抗原性とは異な
る抗原性を発揮する、変異型Ｂ型肝炎表面抗原（ｖＨＢ
ｓＡｇ）タンパク質またはその断片の配列を有する血液
産物を含まない実質的に純粋なタンパク質；および
（ｂ）抗原抗体反応を検出する手段。

【００７９】また、以下よりなることを特徴とする、生
物培養液における抗ｖＨＢｓＡｇ抗体、特にワクチン接
種後の中和抗体のｉｎｖｉｔｒｏの診断検出用のキッ
トもまた提供される：ａ）本明細書中で規定されたｖＨＢｓＡｇ；およびｂ）抗原抗体反応を検出するための手段。

【００８０】さらなる概念において、本発明は、変異型
Ｂ型肝炎表面抗原（ｖＨＢｓＡｇ）タンパク質またはそ
の断片はＳ（ＨＢｓ）タンパク質の１４５番目のアミノ
酸がアルギニンであるＨＢｓタンパク質の修飾される
“ａ”決定基からなり、該ｖＨＢｓＡｇは野生型のＳ
（ＨＢｓＡｇ）タンパク質の抗原性とは異なる抗原性を
発揮する、変異型Ｂ型肝炎表面抗原（ｖＨＢｓＡｇ）タ
ンパク質またはその断片に対して生じるまたはを検出す
る抗体からなるヒトのＢ型肝炎の感染の予防または治療
に使用される抗体調製物を提供するものである。

【００８１】また、本発明は、ヒトにおけるＢ型肝炎の
感染の予防または治療に使用するための抗ｖＨＢｓＡｇ
抗体からなる抗体調製物をも提供するものである。ま
た、Ｂ型肝炎の感染を予防または治療するのに効果的な
量の上記抗ｖＨＢｓＡｇ抗体を人に処理する方法をも提
供するものである。

【００８２】

【実施例】本発明を以下の実施例によって詳細に説明す
る。

【００８３】実施例１変異型Ｂ型肝炎ウィルス（「エスケープミュータント
(escape mutant) 」）の同定（ａ）方法（ｉ）ＨＢＶワクチンによる免疫処置ＨＢＶワクチンが１９８２年イタリアにおいて数多く試
行され始めた。様々な機関が行い、そのうちの一つであ
る、ナポリにあるホスピタリディ．コチュノ(Hospita
l.D Cotugno)のザフォースディビジョンオブイ
ンフェクシャウスディジーゼス(the Fourth Division
of Infectious Diseases)が１５９０人の人で調査し
た。ほとんどの患者の出身地である、キャンパニア(Cam
pania)は、５％以上のＨＢｓＡｇの罹患率を有する。患
者はほとんど南イタリアの２つの地域出身のＨＢｓＡｇ
が陽性のキャリアの乳児であり、両方とも血漿由来のワ
クチンであるＨＢ−ＶＡＸ（メルクシャープアンド
ドーム(Merk Sharp and Dohme)）またはＨＥＶＡＣ−
Ｂ（パスチュール(Pasteur) ）によるワクチン接種を受
けた。前者は大人で２０μｇ（乳児で１０μｇ）の投与
量を０、１および６か月で受け、または後者は５μｇの
投与量を０、１、２および１４か月で受けていた。ま
た、新生児は、誕生時及び１か月時に、コーンのエタノ
ール分画法(Chonethanol fractionation procedure)に
よって調製された０．５ｍｌのＢ型肝炎ハイパーイムン
グロブリン(hyperimmuneglobulin) （ビアギニ(Biagin
i) 社製）を接種されていた。大人も子供も両方とも、
多くの家庭内接触のキャリアにもワクチン接種された。

【００８４】（ｉｉ）肝炎のマーカー血液サンプルを、市販のキット（アボットラボラトリ
ーズ(Abbott Laboratories) 社製）を用いてＨＢｓＡ
ｇ、ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢｅ、抗ＨＢｓおよび抗ＨＢｃに
ついて試験した。抗ＨＢｓは、定量パネル（アボット
ラボラトリーズ(Abbott Laboratories) 社製）によって
生じる標準曲線と比較することによって評価した。ＨＢ
ｓＡｇ陽性は、再試験によっておよびＨＢｓＡｇコンフ
ァーマトリーアッセイ(HBsAg Confirmatory Assay)（ア
ボットラボラトリーズ(Abbott Laboratories) 社製）
を用いた中和によって確認した。ＨＢｓＡｇの中和は、
ほとんど抗ａのみを含む血清を用いて行った。ウィルス
の複製のマーカーを有する患者の血清をも、アラニンア
ミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）量レベルについて試
験した。

【００８５】（ｉｉｉ）ＨＢｓＡｇおよび抗ＨＢｓのサ
ブタイピング(subtyping) ＨＢｓＡｇのサブタイピングを、５人の感染した新生児
および５人の感染した子供のキャリア接触感染者(carri
er contact) で行った。８人のうち６人が感染した大人
およびＡＳ、ＡＡ及びＡＥの患者の家庭内接触感染者(f
amily contact)であり、２人が大人の患者のものであっ
た。サブタイピングのために、抗ａ、抗ｄ、または抗ｙ
（ソリンバイオメディカ(Sorin Biomedica) 社製）で
被覆したビーズを室温で血清と共に一晩インキュベート
した。蒸留水で洗浄した後、１３．２μＣｉの¹²⁵Ｉの
ヒツジの抗ＨＢｓを加え、４５℃で１時間放置し、洗浄
し、シンチレーションカウンターで定量した。固相上の
抗ａまたは抗ｙのどちらかを用いて得られたカウントが
（７人の健常なＨＢＶ陰性の人の）ネガティブコントロ
ールの平均値の２．１倍を越え、抗ｄのビーズで得られ
た値がカットオフ値より低いと、サンプルはａｙと考え
られた。カウントが固相上の抗ｙに加えた際にカットオ
フ値より高いが、抗ａまたは抗ｄの固相上に加えられる
際にはカットオフ値より低い場合には、サンプルはｙ反
応性のみを有すると考えられた。

【００８６】反応の特異性は、モノクローナル抗体（ソ
リンバイオメディカ(Sorin Biomedica) 社製）による
中和によって確認した。ＨＢｓＡｇ陽性の血清を、サブ
タイピング前に単一特異性抗ａ、抗ｄまたは抗ｙ抗体と
混合した。参考のＨＢｓＡｇ含有血清をコントロールと
して用いた。

【００８７】固相上の一つのサブタイプの組換えＨＢｓ
Ａｇ（ｒＨＢｓＡｇ）およびプローブとして異なるサブ
タイプの放射性ヨウ素化されたものを用いるサンドウィ
ッチＲＩＡを用いて、ＡＳ、ＡＡの患者及び２人の大人
の患者で、抗ＨＢｓのサブタイピングを行った。ポリス
チレンビーズをａｄまたはａｙのｒＨＢｓＡｇのどちら
かで被覆した。抗ａを検出するために、０．２ｍｌの血
清をビーズと共に室温で一晩培養した。洗浄後、ビーズ
を放射性ヨウ素化ｒＨＢｓＡｇと共に４０℃で２時間イ
ンキュベートした。洗浄後、これらのビーズの放射能を
計測した。ａｄサブタイプアッセイを目的として、ａｄ
で被覆したビーズを標識されたａｄのｒＨＢｓＡｇを用
いて検査し、同様にしてａｙアッセイを行った。ネガテ
ィブコントロールの平均値の４倍を超える検体が陽性で
あった。力価を標準パネルと比較してｍＩＵ／ｍｌで表
わした。抗ａを抗ａｄまたは抗ａｙで割り、それに１０
０掛けることによって、血清中の抗ａの割合（％）を測
定した。

【００８８】（ｉｖ）配列決定研究を目的とする患者１０５のＡＬＴを有するＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよび
抗ＨＢｃが陽性のキャリア（患者ＩＥ）が、１９８３年
３月５日に男の乳児（ＡＳ）を出産した。父親は抗ＨＢ
ｃおよび抗ＨＢｓが陽性であった。誕生時及び１か月
後、乳児に１．５ｍｌのＨＢＩｇを与え、３か月、４か
月及び９か月後にＨＢ−ＶＡＸ（メルクシャープアン
ドドーム(Merk Sharp and Dohme)）をワクチン接種し
た。配列決定研究を目的として、出産時に母から、１１
か月後（ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよび抗ＨＢｃが陽
性；抗ＨＢｓ４２０ｍＩＵ／ｍｌ；ＡＬＴ１２０）
および５年後（ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇが陽性；抗
ＨＢｓが陰性；ＡＬＴ３６）の子供から血清を採取し
た。研究に含まれていないイタリアのＨＢｅＡｇが陽性
のキャリアから無差別に選んだ４人および３人の英国の
ＨＢｓＡｇが陽性の患者からの血清もまた配列を調べ
た。

【００８９】（ｖ）ＰＣＲおよび直接配列決定５０μｌの血清を３７℃で一晩２００μｌの容積で２５
ｍＭの酢酸ナトリウム、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５
％のＳＤＳおよび１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（ベ
ーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim) 社製）中
で消化した。２回フェノール／クロロホルムおよび２回
クロロホルムで抽出した後、ＤＮＡをエタノールで沈殿
させ、ペレットを７０％エタノールで洗浄した。沈殿物
を２０μｌの水に再懸濁した。カーマン(Carman)ら、ラ
ンセット(Lancet)、１９８９年、ｉｉ、ページ５８８〜
５９１の方法を用いて、３００ｐｍｏｌのそれぞれのプ
ライマーＢＣＳ２およびＢＣＳ４を用いて１０μｌのＤ
ＮＡで、ＰＣＲを行った。標的配列の詳細、プライマー
の結合部位及びプライマーの配列は図２に示す。

【００９０】増幅されたＤＮＡの存在を確認するために
１０μｌの反応物をアガロースゲル電気泳動した後、残
りをＧ−５０セファデックスカラム（ファルマシア(Pha
rmacia) 社製）にかけ、エタノールで沈殿させた。３回
７０％エタノールで洗浄した後、ペレットを２０μｌの
水に再懸濁した。その間に、最終容積が２０μｌになる
ようにして、１０Ｕのポリヌクレオチドキナーゼ（ベー
リンガーマンハイム(Boehringer Mannheim) 社製）を用
いて１０μＣｉのガンマ³²Ｐ−ＡＴＰを含む標準バッフ
ァー中で１０ｐｍｏｌの配列決定用プライマーＢＣＳ３
を末端標識した。配列決定用プライマーは標識後カラム
精製しなかった。

【００９１】４μｌのＤＮＡを２μｌの５×バッファー
の存在下で４μｌの標識ＢＣＳ３に加え、シークエナー
ゼキット(Sequenase kit) （ユーナイテッドステイ
ツバイオケミカルズ(United States Biochemicals)社
製）中に供給し、９５℃まで加熱し、徐々に５０℃まで
冷却した。標識過程を除き、最終の混合物を等量の水で
希釈する以外は製造社の推薦する通りに行った。反応物
を５％のセクアゲル(Sequagel)（ナショナルダイアグノ
スティックス(National Diagnostics)社製）のポリアク
リスアミド−ウレアゲルで電気泳動した。

【００９２】（ｖｉ）疎水性プロット正常なおよび変異型ＨＢｓＡｇ由来の“ａ”決定基の１
３９から１４７番目のアミノ酸をプロシス(Prosis)（フ
ァルマシア(Pharmacia) 社製）のソフトウェアーを用い
て分析した。

【００９３】（ｂ）結果（ｉ）サブタイピングの研究１５９０人のワクチン接種者のうち、４４人（２．８
％）がＨＢｓＡｇを発現し、これらのうち１２人が弱い
反応性を示したが、他のＨＢＶマーカーは示さなかっ
た。これらの患者のうち以下の１８人について詳細は以
下のとおりであった：キャリアの母親から生まれた５人
の乳児、５人の子供の家庭内接触感染者および８人の大
人の家庭内接触感染者。

【００９４】感染した乳児及び子供のすべての接触感染
者および大人の患者の接触感染者８人（被験者すべて）
のうちの６人において、ＨＢＶのサブタイプがａｙであ
ると決定された。ＡＳ症例の母親は、２ケースでａｙと
分かり、初めは出産後２か月であった。ＡＳの患者は、
１２及び１８か月でサブタイプｙでわずかに陽性であ
り、抗ＨＢｓが検出不能になってから６ヶ月後の、４６
か月でａｙ陽性であった。ワクチン接種開始後２年たっ
たＡＡの患者、ワクチン接種開始後９か月たったＡＥの
患者および両方の大人の患者（免疫処理後２６及び２８
か月）はｙのみ陽性であった。

【００９５】これらの結果は単クローン試薬を用いて確
認された。ｙ含有血清を有する患者はすべて抗ｙで中和
できたが、抗ａではできなかった。

【００９６】抗ＨＢｓのサブタイピングによって、５０
から７０％の抗体が抗ａであることが分かった。ＡＳの
患者では、６か月以降、約９０％が“ａ”決定基に対す
るものであった。

【００９７】（ｉｉ）“ａ”決定基の配列決定ＡＳの患者は５８７番目（ＨＢＶゲノムの唯一のＥｃｏ
ＲＩ部位から数えた）のグアノシンをアデノシンに１塩
基変異(single mutation) （ＧからＡ）しており、これ
によってＨＢｓＡｇの１４５番目のアミノ酸がグリシン
からアルギニンにアミノ酸置換していることが配列決定
によって分かった。この変化は、１１か月及び５年の両
方で存在していることから、安定であることが示され
た。母親、ＩＥおよびコントロールの患者は、今日まで
公表されたすべての配列と同様に、エピトープ内のこの
部位にグリシンを有していた。その他の点では、“ａ”
決定基の配列はＡＳ及びＩＥの患者において同様であ
り、さらに、これまでに公表されているものと同様であ
った。

【００９８】（ｉｉｉ）疎水性のプロット正常なＨＢｓＡｇの“ａ”決定基の第二のループおよび
ＡＳの患者の第二のループの相対的な疎水性を測定し
た。カイト(Kyte)およびドゥリトル(Doolittle)、ジェ
ーモルバイオロ(J. Mol. Biol.) 、１９８２年、１
５７巻、ページ１０５〜１３２の方法を用いることによ
って、第二のループの平均の疎水性指数は、−１．３か
ら−１．９を変化しており、ホップ(Hopp)およびウッズ
(Woods) の方法（プロシナショルアカデサイユ
ーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) 、１９８
１年、７８巻、ページ３８２４〜３８２８）を用いた場
合は−０．５から−０．９を変化していることが分かっ
た。

【００９９】実施例２１４５番目のアミノ酸をグリシンからアルギニンに置換
したａｙ血清型の変異型Ｓ遺伝子コーディング配列の構
築以下に示す配列を有する４つのオリゴヌクレオチドのプ
ライマー、ＢＣ１７、ＢＣ１４４、ＢＣ１４５およびＢ
Ｃ１４６を、製造社の指示にしたがってバイオサーチ(B
iosearch) ８６００のＤＮＡ合成器で既知のホスホルア
ミダイト化学によって合成した。

【０１００】ＢＣ１７５’ ＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧ
ＧＡＣＴ３’ ＢＣ１４４５’ ＴＴＧＧＡＡＴＴＣＧＴＴＡＡＡＴ
ＧＴＡＴＡ３’ ＢＣ１４５５’ ＣＴＴＣＧＧＡＣＡＧＡＡＡＴＴＧ
ＣＡＣＣＴ３’ ＢＣ１４６５’ ＡＧＧＴＧＣＡＡＴＴＴＣＴＧＴＣ
ＣＧＡＡＧ３’ これらのオリゴヌクレオチドは、図３に示されるように
ｐＲＩＴ１０６０１上のａｙＳ遺伝子配列と相同性を
有しており、ａｙＳ遺伝子を鋳型として用いたＴａｑ
ポリメラーゼによるヌクレオチドの伸長用のプライマー
として使用される。ＢＣ１４５およびＢＣ１４６の下線
を引いたＡＧＡおよびＴＣＴのトリプレットは、目的と
する１４５番目のアルギニンによる（ａｒｇ１４５）置
換をコード化するものである。さらに、ＢＣ１４４のＧ
ＡＡＴＴＣＧの配列によって、Ｓ遺伝子のコーディング
配列のＴＡＡ終結コドンより１ｂｐ末端にＥｃｏＲＩの
制限部位を導入することができる。ｐＲＩＴ１０６０１
または図４に示されるプラスミドｐＲＩＴ１３４３８の
どちらかを鋳型として用いて製造社（パーキンエルマ
ーセタス(Perkin Elmer Cetus)）によって指示された
ようにして、ＰＣＲ反応を行う。ｐＲＩＴ１３４３８
は、ｐＲＩＴ１０６０１由来の完全なａｙＳ遺伝子の
コーディング配列を有し、ｉｎｖｉｔｒｏの操作によ
って導入されたＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩの制限部位
に隣接する既知の大腸菌のベクターである。約１から１
０ｎｇの鋳型ＤＮＡを、最終容積が１００μｌとなるよ
うにして、５０ｍＭの塩化カリウム、１０ｍＭのトリス
塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、
０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、それぞれ２００μＭの
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、それぞ
れ１μＭの目的とするプライマーおよび２．５ユニット
のＴａｑポリメラーゼと混合する。２つの異なる反応物
を構築し、一方はＢＣ１７及びＢＣ１４６を鋳型と共に
含むもので、他方はＢＣ１４４及びＢＣ１４５を鋳型と
共に含むものである。

【０１０１】これら２つの混合物を、２５回、変性（９
４℃、２分）、アニーリング（４８℃、２分）および伸
長（７２℃、２分）を行い、さらに、１回、ＤＮＡサー
マルサイクラー(DNA Thermal Cycler)（パーキンエル
マーセタス(Perkin ElmerCetus)社製、ファンデル
ハイデン、ブリュッセルズ(Van der Heyden, Brussel
s)、ベルギーより得られる）を用いて７２℃で１５分間
伸長した。それぞれの混合物における目的とする増幅さ
れた断片の存在を既知のアガロースゲル電気泳動によっ
て確認し、断片をセントリコン１００カラム(Centr
icon 100 columns) （アミコンディビジョン(Amicon
Division) 、ダブルアールグレイスアンドコーポレ
ーション(W.R. Grace and Co) 製、ファンデルハイ
デン、ブリュッセルズ(Van der Heyden, Brussels)、ベ
ルギーより得られる）に通すことによって精製する。約
１から１０ｎｇのそれぞれの増幅された断片を、１反応
でプライマーＢＣ１７及びＢＣ１４４と混合し、アニー
リング反応を６０℃で行うこと以外は上記とまったく同
様にして増幅する。

【０１０２】さらに、以下に示す配列を有するオリゴヌ
クレオチドのプライマーＢＣ９０及びＢＣ１５３を、Ｂ
Ｃ１７及びＢＣ１４４の代わりに使用してもよい。

【０１０３】ＢＣ９０５’ ＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＡＴ
ＣＡＧＣＡＴＴＣＣＴＡＧＧＡ３’ ＢＣ１５３５’ ＴＴＧＧＡＡＴＴＣＧＴＴＡＡＡＴ
ＧＴＡＴＡＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡＡＡ３’ ＢＣ９０は、開始コドンで始まるａｙＳ遺伝子配列の
５’末端と相同性を有する。ＢＣ１５３はＢＣ１４４と
オーバーラップする。

【０１０４】２つのＰＣＲ反応混合物を構築し、一方に
はＢＣ９０及びＢＣ１４６を鋳型としてのｐＲＩＴ１３
４３８のＤＮＡ及び上記した他の成分と共に含み、他方
にはＢＣ１４５及びＢＣ１５３を鋳型としてのｐＲＩＴ
１３４３８及び上記した他の成分と共に含む。次に、こ
れら２つの混合物を、２５回、変性（９４℃、２分）、
アニーリング（４８℃、２分）および伸長（７２℃、２
分）を行い、増幅した。ＢＣ９０／ＢＣ１４６の増幅に
よる目的とする４４５ｂｐの断片およびＢＣ１４５／Ｂ
Ｃ１５３の増幅による２６７ｂｐの断片をポリアクリル
アミドゲル電気泳動および電気溶出によって精製した。

【０１０５】次に、約１０ｎｇのそれぞれの断片を混合
し、上記したのと同様の反応条件で、オリゴヌクレオチ
ドＢＣ９０およびＢＣ１５３の存在下で２５回ＰＣＲ増
幅を行った。このようにして得られた約６９０ｂｐの増
幅された断片を回収したところ、この断片はＸｂａＩお
よびＥｃｏＲＩのエンドヌクレアーゼに関して単一の認
識部位を有している。

【０１０６】これらの特異的なオリゴヌクレオチドのプ
ライマー、ａｙＳ遺伝子の鋳型を用い、ＰＣＲ反応を行
うことによって、１４５番目をアルギニン（ａｒｇ１４
５）に置換し、５’にＸｂａＩ、３’にＥｃｏＲＩが伸
長した５９０ｂｐのＳ−ａｙ断片の変異体が製造され
る。この目的とする断片は、セントリコン１００カ
ラム(Centricon 100 columns) に通すことによって、プ
ライマーおよびＰＣＲ反応の他の生成物より精製される
ことが好ましい。次に、この断片を、既知のクローニン
グ技術によって、好ましくは酵母のプロモーターに融合
する正常なウィルスのコーディング配列の相当するＸｂ
ａＩ−ＥｃｏＲＩに代えて用いる。この目的に適するベ
クターは、ａｄ血清型Ｓコーディング配列が予め酵母の
ＴＤＨ３プロモーターに融合された図５に示されるｐＮ
Ｎ２ｄｅｌｔａＥｃｏＲＩであり、発現カセットを形成
する酵母ＡＲＧ３の転写ターミネーターの上流にある。
上記の発現カセットの構築及び使用はＥＰ−Ａ−０２７
８９４０号に示唆される。このタイプの適当なベクター
が宿主として選ばれた酵母株における発現を制御するよ
うに選択されたプロモーターおよび転写ターミネーター
断片によって使用できることは、当業者によって理解さ
れるであろう。さらに、他の制限部位をＢＣ１４４以外
のプライマーを用いて変異断片の３’末端に導入しても
よい。さらに、ＰＣＲによって得られるＸｂａＩ−Ｅｃ
ｏＲＩの変異断片をｐＮＮ２ｄｅｌｔａＥｃｏＲＩ上に
置換することによってａｙｗのコーディング配列が生成
できるように、ａｄｗ及びａｙｗの血清型の既知のＨＢ
Ｖ分離株間のアミノ酸の変化を生じさせるすべてのヌク
レオチドの相違はＸｂａＩ部位の下流に存在すると解さ
れるであろう。

【０１０７】上記したＢＣ９０、ＢＣ１５３、ＢＣ１４
５およびＢＣ１４６を用いたＰＣＲ反応より生じた約
１．５μｇの６９０ｂｐの断片を、ＸｂａＩ及びＥｃｏ
ＲＩのエンドヌクレアーゼで消化し、約０．１５μｇの
消化された断片を、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩのエンドヌ
クレアーゼで予め消化し、脱リン酸化された約５０ｎｇ
のベクターｐＲＩＴ１２６４２と混合、連結した。ｐＲ
ＩＴ１２６４２は、図５に示されるｐＮＮ２ｄｅｌｔａ
ＥｃｏＲＩベクターとまったく同様である。連結混合物
より、プラスミドを回収したところ、このプラスミド
は、変異型のａｙコーディング配列がＴＤＨ３プロモー
ターの３’側に位置し、かつこのプロモーターでコント
ロールされる発現カセットを形成できるように、ｐＲＩ
Ｔ１２６４２ベクターのＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩ部位の
間に挿入された修飾されたＳコーディング配列を有する
ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を含むｐＲＩＴ１３５５５で
あるとして同定された。

【０１０８】上記したようにして得られたｖＨＢｓＡｇ
発現カセットを、ＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩのエンドヌ
クレアーゼで消化することによって２．８９ｋｂの断片
としてｐＮＮ２ｄｅｌｔａＥｃｏＲＩの誘導プラスミド
より切り出し、酵母導入用に選ばれた適当なベクターに
挿入する。サッカロミセスセレビジエ(S. cerevisia
e) の適当なマルチコピーベクターは、ｐＢＲ３２７レ
プリコン上のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位の間に挿入
されたポリリンカーを有し、既知のＤＮＡ断片を用いた
既知のＤＮＡ操作技術によって構築された図６に概略が
示されているｐＲＩＴ１２７７５である。ｐＲＩＴ１３
５５５の２．９８ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩカセット
断片を、エンドヌクレアーゼ消化によって得、既知のク
ローニング技術によってｐＲＩＴ１２７７５のＢｇｌＩ
Ｉ及びＳａｌＩ部位の間に挿入し、プラスミドｐＲＩＴ
１３５５７を形成した。このカセットを酵母のゲノム中
に組み込むことが望ましい際には、ヤコブス(Jacobs)ら
によるジーン(Gene)、８０巻、ページ２７９（１９８９
年）に記載されたベクター等の組込みベクターが好まし
い。ｐＲＩＴ１２７７５上のｖＨＢｓＡｇの発現カセッ
トの挿入を行う場合、ロイシン２欠失変異体の酵母細胞
をイトー(Ito) ら、ジェーバクテリオル(J.Bacterio
l.) 、１５３巻：ページ１６３（１９８３年）の方法に
よって形質転換し、ロイシン非依存性形質転換株につい
て選択する。ダブルのｌｅｕ２変異体を有する適当な受
容株は、ブダペスト条約に従って、受託番号ＡＴＣＣ２
０６３０で１９８２年６月２日にアメリカンタイプカル
チャーコレクション(American Type Culture Collectio
n)に寄託されたＤＣ５株である。

【０１０９】さらに適当な株は、ブダペスト条約に従っ
て、受託番号ＡＴＣＣ２０８２０で１９８６年８月１８
日にアメリカンタイプカルチャーコレクション(America
n Type Culture Collection)に寄託されたＤＣ５株のｃ
ｉｒ゜誘導体である。ＤＣ５ｃｉｒ゜株に上記のイトー
(Ito) らの方法によってｐＲＩＴ１３５５７のＤＮＡを
形質転換し、ロイシン非依存性コロニーを選択する。形
質転換コロニーを保持し、継代培養し、Ｙ１６４８とし
て同定される株を確立した。

【０１１０】ｖＨＢｓＡｇコーディング配列を有する発
現カセットを、２またはそれ以上のポリペプチドの混合
物を含む複合ＨＢｓＡｇ粒子を形成できるように、他の
発現カセットを持つサッカロミセスセレビジエ(S. ce
revisiae) 、ハンセンヌラポリモルファ(H. polymorph
a) またはピチアパストリス(P. pastoris) の宿主細
胞に形質転換してもよい。

【０１１１】既知のクローニング技術を用いて、酵母Ｔ
ＤＨ３のプロモーター、ｐＲＩＴ１０６０１由来のａｙ
サブタイプのＳ遺伝子のコーディング配列および酵母Ａ
ＲＧのターミネーター断片からなる２．９８ｋｂの発現
カセットを構築した。次に、このカセットをｐＲＩＴ１
２７７５のＢｇｌＩＩ及びＳａｌＩ部位間に挿入し、ｐ
ＲＩＴ１３５５８を形成した。さらに、ｐＲＩＴ１３５
５８を、上記のイトー(Ito) らの技術を用いて受容株Ｄ
Ｃ５ｃｉｒ゜中に形質転換し、ロイシン非依存性につ
いて選択することによって、導入した。形質転換コロニ
ーを保持し、継代培養し、Ｙ１６５４として同定される
株を確立した。

【０１１２】Ｙ１６５４株は、本発明のｖＨＢｓＡｇの
性質を調査する際にコントロールとして使用できるａｙ
サブタイプのＨＢｓＡｇを発現する。

【０１１３】出発材料としてのｐＲＩＴ１０６０１及び
酵母ＡＲＧ３のプロモーターを用いた酵母におけるａｙ
サブタイプの粒子のサブクローニングおよび発現は、デ
ワイルデ(De Wilde)らによる、デベロバイオルス
タンダード(Devel. Biol. Standard.)、５９巻、ページ
９９〜１０７（１９８５年）に記載されている。

【０１１４】Ｙ１６４８及びＹ１６５４の培養物を生育
させ、ＨＢｓＡｇを抽出し、アウスリア（ＡＵＳＲＩ
Ａ）ラジオイムノアッセイ（アボットラボラトリーズ
(Abbott Laboratories) 社製、ノースシカゴ、イリノ
イ(North Chicago, Illiois)、米国）によって未精製細
胞抽出物中のＨＢｓＡｇを測定した。Ｙ１６４８及びＹ
１６５４のそれぞれの２つの培養物をアッセイした結果
を以下に示す。

【０１１５】

【表１】

【０１１６】Ｙ１６４８株は、Ｙ１６５４株と比較する
と約１０倍少ない見掛けのアウスリア（ＡＵＳＲＩＡ）
反応材料を生成する。変性、減少したＨＢＶの表面抗原
ポリペプチドを認識する、モノクローナル抗体ＨＢＳ１
（スミスクラインビーカムバイオロジカルズ(SmithKl
ine Beecham Biologicals)、リクセンサート(Rixensar
t) 、ベルギー）を用いた未精製の細胞抽出物のウェス
ターンブロッティングによって、Ｙ１６４８はＹ１６５
４のとほぼ同量の２４ｋの分子量を有するＨＢＳ１反応
タンパク質を生成することが示された。

【０１１７】酵母細胞の培養、ＨＢｓＡｇの抽出及びア
ッセイならびにウェスターンブロッティングの方法は、
両方とも参考で本明細書に導入されているＥＰ−Ａ−０
２７８９４０号およびＥＰ−Ａ−０４１４３７４号に記
載されている。

【０１１８】表面抗原材料は、上記した米国特許４，６
４９，１９２号および４，６８３，２９４号に従って既
知の方法によって、Ｙ１６４８およびＹ１６５４の両方
の細胞抽出物から精製した。

【０１１９】これらの調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ
び銀染色によって分析したところ、微量のダイマー及び
マルチマーと共に２４ｋでタンパク質の１本の主要なバ
ンドを示す、実質的に純粋なＨＢＶ表面抗原タンパク質
から構成された。

【０１２０】Ｙ１６５４株の酵母由来のＨＢｓＡｇの２
つの調製物のアウスリア(AUSRIA)／タンパク質の比率
は、１．６４および２．７９であったが、Ｙ１６４８株
の２つのｖＨＢｓＡｇ調製物のアウスリア(AUSRIA)／タ
ンパク質の比率は、０．１および０．１３に減少してい
た。

【０１２１】Ｙ１６４８株から精製されたｖＨＢｓＡｇ
を、酢酸ウラニル(uranyl acetate)による染色後、電子
顕微鏡検査によって調べた。この材料は、ＨＢＶ表面抗
原に特有の球状の粒子の存在を示した。

【０１２２】実施例３ワクチン組成物の調製１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリ
ウムにおける３％水酸化アルミニウムの滅菌緩衝化水溶
液（ｐＨ６．８）に、同様のバッファーにおける実施例
２のｖＨＢｓＡｇを、タンパク質の最終濃度が５から４
０μｇに、また、アルミニウム（Ａｌ³⁺）が１ｍｌ当た
り０．５ｍｇになるように、常時攪拌しながら加える。
さらに、チメロサール（ソディウムメルチオレイト(s
odium merthiolate)）を防腐剤として最終濃度が１／２
０，０００（ｗ／ｖ）になるように添加する。

【０１２３】このワクチンは、ヒトに非経口投与するの
に適している。

【０１２４】

【発明の効果】本発明のｖＨＢｓＡｇおよびワクチン
は、ウィルスのＨＢｓＡｇの“ａ”決定基が修飾を受け
た上記した“エスケープ突然変異体(escape mutant) ”
の出現による問題を解決するために使用できる。特に、
本発明のワクチンは、１４５番目がグリシン以外のアミ
ノ酸であるＨＢｓＡｇアミノ酸配列において修飾された
“ａ”決定基を有するように本明細書中で規定された変
異型ＨＢＶに対して保護する、および上記変異型ＨＢＶ
の出現または伝達を防ぐために使用できるという長所を
有する。

【０１２５】また、本発明のＤＮＡ組成物、発現ベクタ
ー、診断検出用キット及び抗体調製物は、１４５番目が
グリシン以外のアミノ酸であるＨＢｓＡｇアミノ酸配列
において修飾された“ａ”決定基を有する変異型ＨＢＶ
に対して保護する、および上記変異型ＨＢＶの出現また
は伝達を防ぐために使用できる。

【０１２６】さらに、本発明のＤＮＡ組成物、発現ベク
ター、診断検出用キット及び抗体調製物は、上記変異型
ＨＢＶの感染に関連する病状に対してヒトを保護するワ
クチン組成物の製造に使用でき、ゆえにＢ型肝炎の感染
の予防または治療に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 “ａ”決定基の２つのループおよび１４５番
目のグリシン残基を示す正常なＨＢｓＡｇのアミノ酸配
列の一部の概略図である。

【図２】臨床上単離された変異型ＨＢｓＡｇのヌクレ
オチド配列の概略図であり、ここでは、ＰＣＲ及び配列
決定に使用されるプライマー結合部位が示され、さらに
５８７〜５８９番目の位置に見られるＡＧＡコドンは正
常な配列における５８７番目の位置をＧからＡに点変異
することによって生じる。

【図３】ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain re
action) （ＰＣＲ）用のオリゴヌクレオチド結合部位を
示すプラスミドｐＲＩＴ１０６０１またはｐＲＩＴ１３
４３８上のＳ遺伝子を概略的に表わした図である。

【図４】プラスミドｐＲＩＴ１３４３８の概略図であ
る。

【図５】プラスミドｐＮＮ２ｄｅｌｔａＥｃｏＲＩの
概略図である。

【図６】プラスミドｐＲＩＴ１２７７５の概略図であ
る。なお、図６において、ポリリンカー１は以下の通り
である：０．０１／ＢｇｌＩＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｖａＩ、ＳｍａＩ、ＡｖａＩ、Ｘ
ｈｏＩ、ＳａｌＩ。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 16/08 Ｃ０７Ｋ 16/08 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (71)出願人 598134950 ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＬｏｎｄｏｎ，ＬｏｎｄｏｎＳＷ７２ＡＺ，Ｅｎｇｌａｎｄ (72)発明者トーマスハワードクリストファーイギリス国，ロンドンダブル２１ピージー，セントメリーズホスピタルメディカルスクール，クィーンエリザベスザクイーンマザーウィング，ザデパートメントオブメディシン（番地なし) (72)発明者カーマンウィリアムフレデリックイギリス国，グラスゴウジー11 ５ジェーアール，チャーチストリート，ザインスティテュートオブビロロジー（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】変異型Ｂ型肝炎表面抗原（ｖＨＢｓＡ
ｇ）タンパク質またはその断片はＳ（ＨＢｓ）タンパク
質の１４５番目のアミノ酸がアルギニンであるＨＢｓタ
ンパク質の修飾される“ａ”決定基からなり、該ｖＨＢ
ｓＡｇは野生型のＳ（ＨＢｓＡｇ）タンパク質の抗原性
とは異なる抗原性を発揮し、さらに、ＤＮＡは適当な担
体または希釈剤との混合物の形態を有する、変異型Ｂ型
肝炎表面抗原（ｖＨＢｓＡｇ）タンパク質またはその断
片をコード化するＤＮＡ配列からなる組成物。
【請求項２】該ｖＨＢｓＡｇタンパク質またはその断
片は１４５番目のアミノ酸が変更された以外は野生型の
ＨＢｓＡｇと同じである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】該１４５番目のアミノ酸は１４５番目の
点突然変異コドンがアルギニンをコードするような野生
型のＨＢｓＡｇにおける１４５番目のグリシンをコード
するＧＧＡコドンにおける点突然変異によって誘導で
き、かつ該点突然変異コドンはＡＧＡ、ＣＧＡ、ＣＧ
Ｃ、ＣＧＧ、ＣＧＴ及びＡＧＧからなる群より選ばれ
る、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】該ｖＨＢｓＡｇタンパク質またはその断
片は野生型のＨＢｓＡｇ配列の１４５番目以外の位置の
少なくとも一のアミノ酸残基の変更または付加を起こす
点突然変異または挿入が存在するｖＨＢｓＡｇの配列を
有する、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】該ｖＨＢｓＡｇはプレＳコーディング配
列を含む、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】該プレＳコーディング配列はプレＳ１コ
ーディング配列である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】該プレＳコーディング配列はプレＳ２コ
ーディング配列である、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】変異型Ｂ型肝炎表面抗原（ｖＨＢｓＡ
ｇ）タンパク質またはその断片はＳ（ＨＢｓ）タンパク
質の１４５番目のアミノ酸がアルギニンであるＨＢｓタ
ンパク質の修飾される“ａ”決定基からなり、該ｖＨＢ
ｓＡｇは野生型のＳ（ＨＢｓＡｇ）タンパク質の抗原性
とは異なる抗原性を発揮する、変異型Ｂ型肝炎表面抗原
（ｖＨＢｓＡｇ）タンパク質またはその断片をコード化
するＤＮＡ配列からなる発現ベクター。
【請求項９】該ｖＨＢｓＡｇタンパク質またはその断
片は１４５番目のアミノ酸が変更された以外は野生型の
ＨＢｓＡｇと同じである、請求項８に記載の発現ベクタ
ー。
【請求項１０】該１４５番目のアミノ酸は１４５番目
の点突然変異コドンがアルギニンをコードするような野
生型のＨＢｓＡｇにおける１４５番目のグリシンをコー
ドするＧＧＡコドンにおける点突然変異によって誘導で
き、かつ該点突然変異コドンはＡＧＡ、ＣＧＡ、ＣＧ
Ｃ、ＣＧＧ、ＣＧＴ及びＡＧＧからなる群より選ばれ
る、請求項８または９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】該ｖＨＢｓＡｇタンパク質またはその
断片は野生型のＨＢｓＡｇ配列の１４５番目以外の位置
の少なくとも一のアミノ酸残基の変更または付加を起こ
す点突然変異または挿入が存在するｖＨＢｓＡｇの配列
を有する、請求項８から１０のいずれかに記載の発現ベ
クター。
【請求項１２】該ｖＨＢｓＡｇはプレＳコーディング
配列を含む、請求項８から１１のいずれかに記載の発現
ベクター。
【請求項１３】該プレＳコーディング配列はプレＳ１
コーディング配列である、請求項１２に記載の発現ベク
ター。
【請求項１４】該プレＳコーディング配列はプレＳ２
コーディング配列である、請求項１２に記載の発現ベク
ター。
【請求項１５】以下からなる、生物培養液における変
異型Ｂ型肝炎表面抗原（ｖＨＢｓＡｇ）タンパク質また
はその断片に対する抗体のｉｎｖｉｔｒｏでの診断検
出用のキット：（ａ）変異型Ｂ型肝炎表面抗原（ｖＨＢｓＡｇ）タン
パク質またはその断片はＳ（ＨＢｓ）タンパク質の１４
５番目のアミノ酸がアルギニンであるＨＢｓタンパク質
の修飾される“ａ”決定基からなり、該ｖＨＢｓＡｇは
野生型のＳ（ＨＢｓＡｇ）タンパク質の抗原性とは異な
る抗原性を発揮する、変異型Ｂ型肝炎表面抗原（ｖＨＢ
ｓＡｇ）タンパク質またはその断片の配列を有する血液
産物を含まない実質的に純粋なタンパク質；および
（ｂ）抗原抗体反応を検出する手段。
【請求項１６】該ｖＨＢｓＡｇタンパク質またはその
断片は１４５番目のアミノ酸が変更された以外は野生型
のＨＢｓＡｇと同じである、請求項１５に記載のキッ
ト。
【請求項１７】該１４５番目のアミノ酸は１４５番目
の点突然変異コドンがアルギニンをコードするような野
生型のＨＢｓＡｇにおける１４５番目のグリシンをコー
ドするＧＧＡコドンにおける点突然変異によって誘導で
き、かつ該点突然変異コドンはＡＧＡ、ＣＧＡ、ＣＧ
Ｃ、ＣＧＧ、ＣＧＴ及びＡＧＧからなる群より選ばれ
る、請求項１５または１６に記載のキット。
【請求項１８】該ｖＨＢｓＡｇタンパク質またはその
断片は野生型のＨＢｓＡｇ配列の１４５番目以外の位置
の少なくとも一のアミノ酸残基の変更または付加を起こ
す点突然変異または挿入が存在するｖＨＢｓＡｇの配列
を有する、請求項１５から１７のいずれかに記載のキッ
ト。
【請求項１９】該ｖＨＢｓＡｇはプレＳコーディング
配列を含む、請求項１５から１８のいずれかに記載のキ
ット。
【請求項２０】該プレＳコーディング配列はプレＳ１
コーディング配列である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】該プレＳコーディング配列はプレＳ２
コーディング配列である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】変異型Ｂ型肝炎表面抗原（ｖＨＢｓＡ
ｇ）タンパク質またはその断片はＳ（ＨＢｓ）タンパク
質の１４５番目のアミノ酸がアルギニンであるＨＢｓタ
ンパク質の修飾される“ａ”決定基からなり、該ｖＨＢ
ｓＡｇは野生型のＳ（ＨＢｓＡｇ）タンパク質の抗原性
とは異なる抗原性を発揮する、変異型Ｂ型肝炎表面抗原
（ｖＨＢｓＡｇ）タンパク質またはその断片に対して生
じるまたはを検出する抗体からなるヒトのＢ型肝炎の感
染の診断、予防または治療に使用される抗体調製物。
【請求項２３】該ｖＨＢｓＡｇタンパク質またはその
断片は１４５番目のアミノ酸が変更された以外は野生型
のＨＢｓＡｇと同じである、請求項２２に記載の抗体調
製物。
【請求項２４】該１４５番目のアミノ酸は１４５番目
の点突然変異コドンがアルギニンをコードするような野
生型のＨＢｓＡｇにおける１４５番目のグリシンをコー
ドするＧＧＡコドンにおける点突然変異によって誘導で
き、かつ該点突然変異コドンはＡＧＡ、ＣＧＡ、ＣＧ
Ｃ、ＣＧＧ、ＣＧＴ及びＡＧＧからなる群より選ばれ
る、請求項２２または２３に記載の抗体調製物。
【請求項２５】該ｖＨＢｓＡｇタンパク質またはその
断片は野生型のＨＢｓＡｇ配列の１４５番目以外の位置
の少なくとも一のアミノ酸残基の変更または付加を起こ
す点突然変異または挿入が存在するｖＨＢｓＡｇの配列
を有する、請求項２２から２４のいずれかに記載の抗体
調製物。
【請求項２６】該ｖＨＢｓＡｇはプレＳコーディング
配列を含む、請求項２２から２５のいずれかに記載の抗
体調製物。
【請求項２７】該プレＳコーディング配列はプレＳ１
コーディング配列である、請求項２６に記載の抗体調製
物。
【請求項２８】該プレＳコーディング配列はプレＳ２
コーディング配列である、請求項２６に記載の抗体調製
物。