PT97077A - Processo para a preparacao de 2,8-dioxabiciclo{3.2.1}octanos uteis como anti-hipercolesterolemicos - Google Patents

Description

FUNDAMENTOS DQ IMvEMITQ ή sabido que a hiparcalesteralémia constitui um dos principais factores de risco em relação à doença cardiovascular isquémica„ tal como a arteriosclerose.-. Foram usados sequestrantes do ácido biliar para o tratamento desta situação? parecem ser moderadaments eficazes mas devam ser consumidos em grandes quantidades., isto é vários gramas de uma só vez, e não têm muito bom sabor,.

R 0 HEvfíCOFr <lovastatin>f agora comercialmente disponível, é um de entre um grupo de agentes antihipercolesterolémicos que funcionam limitando a biossintsse do colesterol ao inibirem o enz ima, HMG-CoA reductase= A sintetase do esqualsno è o enzima envolvido no primeiro passo realizado da via biossintética do novo colesterol, Este enzima catalisa a dimerizaçSo redutora de duas moléculas de pirafosfafco de farnssilo para formar esqualeno, A inibição da realização deste passo para a formação de colesterol deve desimpedir as vias biossintéticas para a ubiquinona, dolicol e isopen-tenilo t-RNA„

Esforços anteriores para a inibição da sintetase do esqualeno utilizaram compostos contendo pirofosfato ou análogo de pirofosfato tais como os descritos em P, Orfciz de Monteilano et al, J„ Med» Ghem» 2Θ, 243 (1977) s E« J. Corey and R» Volante, J, Am» Chem= Sdc . , 98., 1291 (1976) = S. Bi 1 ler (Patente dos E»U = A, Mo.-. 4a871.721 > descreve < fosf iniimetil) fosfonatos de isoprenoide como inibidores da sintetase do esqualeno, 4 4 a a 0 presente inventa proporciona inibidores io esqualeno contenda camoostos sem fósforo»

DESCRIϋΆΌ DETALHADA DO INVENTO

em que

gp "hl1"2? cada. um deles independentemente seleccionados de ai H íí b) C^_c? alquilo5

c) C. „ X “·** ._J alquilo substituído- com um membro do grupo consisti: ndo em i) fenilo i i) fenilo substituído com meti lo, mstoxi« halogé— nia (Cl, Br, I, F) OU hí. drO>; X S OU υ.ιϊι sal farmacêuticamente scsitávsl de um composto da fórmula ( esi que pelo menos um da entre Σ, „ Z_, e é hidrogénio»

Numa. apresentação do presente invento existem compostas da fórmula Cl) em que a confiesuracMo estersoquimics do anel 2?8-~dioxabicicloC3»2= lloctano è tal coma indicada a sequir;

O

Cl)

Ao 1 onqo desta, especificação e reivindicações onde se dsscrev e a estersoquimi ca. em reiação ao as s«l diOM oc tano a. c on f i q u r ac ão i .mplicita é rela f* i \t* 0¾ Pode conf igu .raçãcs real ou a do seu. enantióme: ro«

Pode ser indicada 11 ustraiR ainda, esta apresentação fórmula esir utural ! £ I) em que a configuração W θ3~· -.I5 sj £> 3 7 ê tal como indicada a. seguirs ds compostos da elativa nas posi-

ο

Nuraa classe desta tos da estrutura. I) esn que á tal coma indicada a sequi; pressn tação encontram— . conf iouração relativa e qí

4

J

ο

Slo exemplos desta classa o composta sm que =, Z_, e Z_, são cada um deles hidrogénio ou um seu sal farmacãutieamente aceitável ., 0 composto em que Z, Z,., e são cada um deles I * .li. C* hidrogénio ê aqui a seguir referido como composto A*

Ilustram ainda esta classe os compostos em que um ou mais de entre Z., , Z^ ou Z„ é XI- alquilo ou C, alquilo suhsti-tuido com fenilo ou. fenilo substituido com meti lo, me to x .1, halogênia <C15 Be, I, F) ou hidroxi,, Numa ilustração específica,, Zj, Z.-5 e Z·^ são cada um deles:· meti lo. Este composto é aqui a seguir referido como composto B»

Qs compostos da fórmula (I) slo preparados nuns processo de fermentação aeróbica utilizando uma nova cultura,, MF5453, observada como uns micélio estéril* Os mutantes de MF5453 slo também capazes de produzir compostos deste invento e são incluídos n es te 1 n ven to

A cultura MF5453 é a de um funga isolada ds uma amostra de água obtida a partir do rio Jalon, Zsragoza, Espanha» Esta cultura foi depositada na American Type Culture Colleciion em 12301 Farklai^n Drive, Rockviile, MD 2®852 como ATCC 20986. 0 microorganismo Í1F5453 apresenta as seguintes carscls-risticas morfulógicasi )

J

Colónias com 22-24 de diâmetro com 2 semanas em sgar de bataia-dextrose c Difca ? a 25 -'C em luz fluorescente contínua, cam 40-45 mm de diâmetro em duas semanas em agar de s-v;tracio de eKcremento de veado (flycolQqy SuidePOQk.; meio M~ll, p. 66Θ) a 25°C» Colónias em agar de batata-deKirose consistindo em micélio moderadamente espesso, macio no centro, apresentando um aspecto de feltro ou veludo em direcçlo às margens, formando estrias concêntricas escuras, ocasionalmen ta farinando sectores com diferentes tonturas e cores miceliais, com margem inteira, sem uma franja de bifas principais submersas» Côr das colónias primeiro branca ou algumas bifas aérias brancas, tornando-se rápidamente de côr creme. Cor Creme, Amarelado Cartucho, (nomes de cores capitalizadas a partir de Eidquay, R. Color Standards and Nome-nc 1 aturs. Washington, D»C» 1912), finalmente cinzento claro a cinzento. Cinzento Azeitona Claro, Cinzento, Cinzento Neutro Pálido, Cinzento Neutra, Cinzento Saivota. Cinzento Gaivota Escuro» Reverso das colónias castanho acinzentado a castanha amarelado ou creme. Castanho Claro—Canela, Canela, AmareIsdo-Ocre, Amarelo Antiménio, Amarelado Intenso, Amarelado Cartucho» Sem cheiros e SKSudados.,

Hifas ascomicetas com morfologia não diferenciada, septadas, ramificadas com 1,5-3,5 μη de diâmetro, hialinas em água e KDH» Sem formação de estruturas reprodutoras em quaisquer condições de cultura vigiadas, incluindo incubação em luz

continua ou ara ciclos de 12/12 horas de luz a escuridão em agar de farinha de milho, agar de extracto de feno, agar de farinha de aveia, agar ds extracto de excrementos, s agar ds extracto de malte. )

Os compostos deste inventa podem ser obtidos por cultura do microorganismo indicado anfceriormente num meio nutritivo aquoso contendo fontes de carbono e de azoto assimiláveis, de preferência em condições aeróbicas» Qs meios nutritivos podem também conter sais minerais e agentes contra a formação de espuma.

As fontes preferidas da carbono no meio nutritivo são hidratas de carbono tais coma glucose, glicerina, amido, dextrina, etc. Outras fontes que podem ser incluidas são mal tose, manose, sucrose, etc» Além disso, fontes nutritivas complexas tais como farinha de aveia, farinha de milho, milho miúdo, milho, etc», podem fornecer crabono utilizável» A quantidade exacta de fonte de carbono que é utilizada no meio depende, em parte dos outros ingredientes do meio, mas encontra-se habitualmente numa quantidade variando entre ©,5 e 5 por cento em peso» Estas fontes de carbono podem ser usadas individualmente num determinado meio ou. podem ser usadas diversas fontes em combinação no mesmo meio»

As fontes preferidas de azoto são os amino ácidos tais como glicina, metionina, prolina, treonina, etc», assim com fontes complexas tais como extractos de levedura (hidrolisados, autolisados), levedura seca» pasta de tomate, farinha ds soja, peptona, licor de milho, produtos de destilação solúveis, extractos de malte, etc» Podem também ser usadas fontes de azoto inorgânicas tais como sais de amónio ípor exemplo nitrato de amónio, sulfato de amónio, fosfato ds amónio, etc»). As várias fontes de azoto podem ser usadas isoladamente ou em combinações em quantidades, variando entre @s2 e 9® por cento em peso do meio.

As fontes de carbono e de azoto são geralmente utilizadas em combinação , mas não precisam de se apresentar sob uma forma pura. Podem também ser usados- materiais menos puros que cont?m vestígios de fsetores do crescimento, vitaminas, e agentes nutritivos minerais. Sais minerais podem também ser adicionadas ao meio tais como (mas não se limitando a) carbonato de cálcio, fosfata de sódio e potássio, cloreto de sódio ou potássio, sais de magnésio, sais de cobre, sal de cobalto, etc. São também incluidos- vestígios da metais- tal como de manganésio, ferro, molibdeno, zinco, etc. Além disso, se necessário, pode-se adicionar um agente contra a formação de espuma tal como polietileno glicol ou silicone, especialmente se o meio de cultura apresentar uma formação de espuma importante» 0 processo preferido para a produção de compostos deste invento consiste na inoculação de esporos ou de micélios do organismo produtor num meio apropriado e cultivando em seguida em cond içSes- aeréhicas. 0 processo de fermentação consiste geralmente em inocular em primeiro lugar uma fonte preservada de cultura num meio de sementeira nutritivo a fim de se obter, por vezes por meio de um processo em dois passos, a crescimento dos organismos que servem como sementeiras na produção dos compostos activos. Após inoculação, os frascos são incubadas com agitação a temperaturas variando entre 2® e 3®°C, de preferlncia entre 25 e 28°C» A agitação pode variar entre 46® rpm, de preferência entre 2Φ& e 22® rpm» Os frascos de sementeira são incubados durante um perlado de 2 a 1® dias, de preferência de 2 a 4 dias» Quando o crescimento é pleno, usualmente após 2 a 4 dias, a cultura pode

ser usada para. inocular frascos com meio de produção* Pode ser utilizado um segundo estádio de crescimento da sementeira, particularmente quando se utilizam recipientes .maiores* No fim deste processo utiliza-se uma porção do meio de cultura para inocular um segundo frasco incubado em condições semelhantes mas usando um período de tempo mais curto*

Após a inoculação, o meio de produção de fermentação é incubado durante 3 a 3Θ dias, da preferência de 4 a 14 dias, com ou sem agitação (dependendo do facto de se utilizarem meios de fermentação líquidos ou sólidos)* A fermentação é realizada aeróhicamente a temperaturas variando entre 2Φ e 4$°C. Se usada, a agitação pode ser realizada a. uma tana de 2©« a 4ββ rpm. Para se obterem resultados óptimos, as temperaturas variam entre 22 e 28*0, com maior preferencia entre 24 e 26°C.= 0 pH do meio nutritivo apropriado para a produção dos compostos activos varia entre 3,55 s 8,5, com maior preferencia entre 5,Θ e 7,5* Depois do período apropriado para a produção do composto desejado, os frascos de fermentação são recolhidos e o composto activo é isolado*

0 pH da fermentação micslia! aquosa é ajustada entre 1 e 9 (de preferência entre 3 e 5) de preferência misturando com um solvente miscível com a água tal como metanol a 5ô% sendo os micélios fi!trados. 0 composto activo pode então ser isolado a partir do filtrado aquoso por vários métodos incluindos í* ExtracçSo líquido-líquido do filtrado aquoso para um solvente não miscível com a água tal como metil etil cetona, acetato de etilo, éter dietílico, ou diclorometano de preferência após -ajustamento do pH para entre 3 e 5*

2= Extracção sólido-líquido do filtrado aquosa para uma matriz orgânica tal como BP207 ou HP-2® e eluição com um salventa orgânica (aquoso ou não aquosa) tal como metanol/água 90/íã ou acetona/égua 9®/10«

I 3» AdsorçSo do composto activo a partir do filtrado aquoso para uma resina permutadara de iõoes tal como Doue;·; í (01 } 2-j-

ou Dowsx 50 (Ca ) e eluição com um solvente orgânico/aquoso com elevada potência iónica tal como metanol/NH^Cl aquoso a 30% 90/1©» Foi então possível dsssalinizar este material utilizando o método 1 ou 2 anteriormente referidos»

Cada um destes três métodos pode também ser usado na posterior purificação do composto activo» A fracção contendo composto activo dos métodos anteri-ormente referidos pode então ser seca in vácuo dando origem ao composto activo crú. 0 composto activo crú á então geralmente submetido a vários passos de separação tais como adsorção e separação por cromatografia, s precipitação» Para cada passo de separação, as fracçSes são recolhidas e combinadas; tendo como base os resultados de um ensaio e/ou ds uma análise por HPLC,

As separações cromatográficas podem ser realizadas utilizando cromatografia ds coluna convencional com adsorvente iónico ou nlo iónico» Quando o gel de sílica é o adsorvente, é útil como um eluente uma mistura alcool/clorohidrocarboneto/ácido orgânico. Para a cromatografia de fase reversa, a adsorvente preferido é um gel de sílica de fase ligada a C8» 0 eluente preferido para a cromatografia de fase reversa é uma mistura de acetonitrilo e água tamponada para um pH baixo, tal como com ácido fosfórico a 0, 1 %, ou ácido trifluoroacétxco. 0 composto activo pode ser separado por precipitação a partir de um solvente

não polar sob -a forma de sal quinino. 0 solvente preferido para a precipitação é éter dietilico. 0 presente invento é também dirigido para um método de inibição da hiossíntese do colesterol o qual compreende a administração a um indivíduo necessitada desse tratamento de uma quantidade terapê'uticamente eficaz não tÓKica de um composto representado pela fórmula estrutural <I) e seus sais farmaCêOti-camente aceitáveis. Específicamente os compostos deste invento são úteis como agentes antihipsrcolesteralémicos para o tratamento da -arteriosclerose familiar e tíe doenças -afins nos seres humanos» Podem ser administrados oralmente ou parentéricament© sob a forma de uma cápsula, um comprimido, uma preparação injec— tâvel, é usua 1 sTisnte desejável usar a vis oral» He doses iodem variar , dependendo da idade, da qravi d-ade, do peso corpo ‘ de outras ; condições dos doentes humanos mas as doses diár :ars adultos variam entre cerca de 2;0 mq e 2»®0® mg (de prefer :ia entre 2·® írj 1 *c---£-: U114 1 que poaem ser adm inistradas- em duas quatro doses divididas» Doses mais elevadas podem ser utilizadas favorávelmente tal como seja requerido»

Ds sais f s. rmao 's’u t i c amen te •3CBÍ V£?á. S· d ο deste inventa inc 11 lem os formados a pí irtir de cat ι Se· sódio, potássio, alumínio, cálcio, lítio, magnésio, zinco, e ; partir de bases tais como amónia, etilenediamina, N-metil-gluca·· mina, Usina, arqinina, ornitina, colina, N,N*—dibenziletilenedi-mina, dietilamina, piperazina, trisChidroKimetillaminometano, e hidróxido de tetrameti 1 -amónio« Este inventa inclui sais de um, dois ou tres grupos carfeoKilo da fórmula (I)» trad

Os compus to- uom polimeros deste invento podem também ser coadminis-catiónicos não tóKicos farmacãuticamente

•aceitáveis capaces de ligar os ácidos biliares numa forma não rsahsorvível no tracto castro-intestinal» Exemplos desses polímeros incluem colestiramina, colestipol e poliCdihaleto de meti 1--(3-trimeti1aminopropi1)imino-trimetileno3= As quantidades relativas dos compostos deste invento e destes polímeros situam--se entre ΙϊΙΘΘ e Ιϊ15„®0®„ A actividade ínífoidora intrínseca da sintetase do esqualeno deste invento foi medida pelo protocolo padrão in vitro descrito rnais abaiKD!

Preparação de Microsomas;

Ratos Charles River CD,, machos,, <120 a 15® g) foram alimentados com um regime alimentar contendo 0,1% de lovaststin durante 4 dias» Os fígados destes ratos foram homogenisadas em 5 volumes íml/g) de HEPES 50 mM arrefecido pelo gelo (ácido 4-C2---hidroxietilJ-l-piperasine-etanessulfénico), EDTft (ácido etilene-diaminetetraacético) 5 mM pH 7,5 com um aparelho para trituração de tecidos do tipo Potter-Elvehjem» 0 produto da homogenisação foi centrifugado duas vezes a 20.000 x g durante 15 minutos a 4°C, eliminando a pílula de cada vss„ 0 produto flutuante foi então centrifugado a 1®®.®Θ® x g durante 1 hora a 4°C. A pílula microsoíssl resultante foi rsssuspense num volume do tampão de homogenização anteriormente referido igual a um quinto ao volume do produto de homogenisação original» Esta preparação microsomal tem uma concentração proteica de cerca de 7 mg/ml. As suspensões microsomais foram armazenadas em porções aliquotas a -70°C„ A actividade da sintetase do esqualeno nestas porções aliquotas á estável durante pelo menos vários meses»

Purificação Parcial da Prenil Transferase A prenil transferase foi purificada para utilização na zimática do pirofosfato de fs.rnesilo marc •âdo COífí ráoiOn ransfera se foi ensaiada pelo método de Ri llinq (Methods OQV 110, 125-129 (1985)) e uma unidade de ac t i v i d a d e é definida coroo a quantidade de enzima que vai produzir 1 proole de pirofosfsto de fsrnssilo por minuto a 3®°C no ensaio pac!rãc. 0Q 0 0 que VA de 10 v 5 ratos machos coro quarenta dias de que se tinha administrado oralmente 5% de colestiraroina e "? Λ / coro KDH 3N e foi retirada uma f racção d?? a. to de i í.roòn 10» A pílula a / Λ*/ .C _ · ...__j: __ _ õ -:> /« 1 iJ j- i 60 Li Λ. »*»· 01vida em

ero 1 litro de mercaptoetanol 10 m-M, EEfTA 2 roM, 25 μΜ de leupepti— nar, 0,005% de fluoreto de fenilroet.il sulfonilo pH 7»Θ contendo Θ,ί unidades de inihidor da tripsina de aprotinina/ml. 0 produto homogenizado foi centrifugadc a 2Θ„ΘΘΘ >; g durante 20 minutos» 0 produto flutuante foi ajustado para pH 5,5 coro HOftc ésM e centri— fugado a ΙΘΘχΘΦΘ >; g durante í hora» Este produto flutuante foi ajustado para dH 60 rol c'e fosfato de potáss-io 1Θ rofi» mercaptoetanol 10 roM, EDTA 1 mH pH 7,0 (Tampão A) a dialisada coro duas mudas de 1 litro de Tampão A» Esta fracção dialisada foi aplicada a uma coluna 12,5 κ lavada coro 70@ rol de Tampão A e coro 1 gradiente de 1 litro de Tampão A para fosfato de potássio 100 mH, mercaptoetanol 10 mH, EDTA 1 roM pH 7 „Θ» As fraccSes contendo uma activida.de especifica superior a 0,20 umdades/rog foram corooinede.s, adicionando s*e lhes sulfato de amónio sói ido para dar origem a uma saturacã' D de 60% e formação de pílulas» A pílula foi dissolvida em Θ ml d e Tris 10 roM, B”mercaptoetanol 1Θ- mM pH 7 - 0 {Taropão B í. A pí1u1a redissol- vida foi levada saturação de 60% com sulfata de amónio a uma - 16 adicionando 1.5 volumes de sulfato de amónia saturado em tampão B. Esta suspenslo de sulfate» de amónio continha 3,5 unidades/ml com uma actividads específica de @=23 unidades/mg e apresentava·" se livre de acfivida.de da isomera.se de pirofosfato de isopente- nilo. Esta suspensão de sulfato de amónio foi usada para a 14 síntese de E4- ~ C3farnesil-pirafostato e a sua actividads manteve-se estável quando armazenada a 4°C durante pelo menos 6 meses» 14

SjntesEnzimàtica, de £4- Clfarnesil-pirofosfatQ

J 0 solvente (etanol s NH»OH S,i5 isl) foi removido de _ 14' 5'o μCx de pxrotosfato de C4- Ciisopentenilo (47,9 p.Ci/pmole) por

evaporação rotativa» Foram adicionadas seiscentos microlitros de Tris Í0& mM, MgCl0 1Θ míl, ditiotreitol 4 mM pH 7,5, e a solução foi transferida para um tubo de centrifugação de Eppendorf de 1,5 ml» Geranil-pirofosfato, 25Θ μΐ de uma solução 20 mM, e 5β μΐ de suspensa·::» de sulfato de amónio de fenil tra.nsfera.se foram adicionados a fim de iniciar a reacção» Esta incubação continha 5 pmoles de pirofosfato de geranilo, 1,15 pmoles de pirofosfato de isopentenilo, á pmoles de MqCl ,_= e 0,19 unidades de fenil transferase num volume de 9&Θ μΐ, A incubação foi realizada a 37 *(3,.· Durante a incubação, a mistura tornou—se branca turva à medida que α complexo de magnésio rec-sntemente formado do pirofosfato de farnesilo se separava da. solução por precipitação» 0 pirofosfato de LO-1*Cjfarnesilo foi recolhido por centrifugação durante 3 minutos a 14.Θ0Θ rpm num tubo de centrifugação de Eppendorf, sendo o produto flutuante removido, e sendo a pílula dissolvida em 1,0 ml de HEPES 50 mM, EDTft 5 mM, pH 7,5» 0 rendimento foi de 50,7 μΟχ (92%) de pirofosfato de C4-^Cjfarnesilo»

Ensaio da Sintetase do Esqualeno A r*5— -SCwáo fui rsâ lis ad a em tu bc;-· de teste com tampas de enroscar» Foi preparado um lote da mistura QD ensaio a partir da solução que se segues

J volume para ul por ensaio 5Θ ensaios

1. Hepes 25€* mM pH 7,5 2Θ 1000 2, NaF 11Θ mM 10 50Θ 3« MqCl_, 55 mM i 10 500 4. Ditiotreitol 3€* m!i 1Θ 500 5» NADPH 1Φ mM (produzido recantemente) 10 500 &. 1 4 C4— Clfarnesil—pirofosfato 47,9 pCi/pmole, ε 3.,0 150 05Θ25 μ0χ/3 μΐ 7. Η^,Ο 24 1200

Esta mi irrigada com N0.= foram preparadas d i. 1 uiçlo de í s 12¾ nizagSo original: tura de oluçSes :uer em ensaxu foi oesqasexrxcads sob de inibidores da sintetase do DMSO quer em MeDH e foi reali vácuo s esqualeno zada uma da protsina microsomal com α tampão de homoge— Para cada reacção? 87 μΐ da mistura do ensaio

-- ia foram misturados com 3 μΐ de uma solução inibidora (DM80 ou Με-?OH nos controlos), aquecidos até 3®°C num banho de água sendo em seguida a reacção iniciada pela adição de 1© μΐ da diluição 1:12© da proteína microsomal C©,p protexn ina total no ensaio). As n n QSS fora ffi in ter rom pid a.s após 2Í0 minuto s pe la adiç 1 o de 100 P-l de uma mis tura x Sí 1 de 4Θ KDH r-ru*·· Ocr. iusOUt .·*_> »/ f-l.ss /tf U u? EtOH. Λ f-í mistura in t ΘΓ romp ida foi 3Π! ? — -t — gr x da a 05=¾ du.r ante 30 ininu tosar refecida? sen do adi C i Qfi ados ml de H eptan o & sondo a m w. tura su pz metida a < 0- ti ce» Fora Ui tão atí XC1 on ados s gramas do a1umina activada? a m 15 tura T O X d e no vo Sub me tida cl vórtice,. dei KDU-55 a a1umina

J asserstar e foram removidos 5 ml da camada de heptano. Foram adicionados dez ml ds fluido de cintilação â solução de heptano e a radioactividade foi determinada, por contagem da cintilação liquida„ A inibição percentual é calculada pela fórmulas CAmostra - hm Branco] κ 1ΘΘ CControlo- Em Branco]

Foram determinados registando o loq da

Os concentr ação do com o-os to do toste versu -.JÚ concentração do inxbzdor que d X U Í«!;cSU é determinado a pa r *l· K· rj .3 stes

Representativos das actividades inibidoras intrínsecas :e invsnfn da sintetase do esqualsno dos compostos dados da 10=-¾ indicados a sequirs

Composto

Sintetase do Esqualeno

K -*50 < 5 μΜ < 5 μΜ

Composto A Composto B

Os presentes compostos também demonstraram uma ac ti vi-·· dads antifúngica de ampla espectro tal como foi determinado pelos métodos de diluição em caldo ou agar. Os compostos são partícula emente activos em relação aos fungos e leveduras filamentosos incluindo Candida albicans e Crypt neoformans. A sensibilidade tíos fungos e leveduras filamentosos·· foi determinada usando ensaios de diluição inibidora em formato de microtitulação, Os compostos foram dissolvidos em DM50 a 2 mq/ml e diluídos seriada— mente em tampão fosfato Θ5 í M, pH 7,Θ em placa de microtitulação de 1ΘΘ a θ,,ΦΦώ ug/ml» Uma suspensão de esporos normalizada para testar os fungos filamentosos foi preparada inoculando Meia Antibiótico #3 contendo 1,5% de agar com esporos de modo a 1,5 κ 10- unidades· formando colónias serem -adicionadas por recipiente· Introduziu—se nos recipientes de microtitulação 50 μΐ da composto contendo tampão e 5*3 μΐ de meio inoculado. A sensibilidade das leveduras foi determinada inoculando base de azoto da levedura contendo 1% de desirose íYNB/G) com porções aliquotas de cultura de levedura durante a noite feita crescer em meio de morfologia da levedura CYM) a 35 °C e diluindo em YBN/G para proporcionar uma concentração final de 1,5—7,-5 x 1Θ'~’ unidades formando colónias/— e meio i nocs lílado par ade da Is5 vedura ? o 10 por csn to a. *~i G? f q ,Jí3 em YNB/G de 128 para recipiente.Foram adicionados cinquenta μΐ recipiente. A fim de testar a sensibi! composto foi solubilizado em DMSO aquoso mg/ml· 0 composto foi diluido seriadamente em YNB/G ds &$&ò pg/ml. Introduziu—se nos recipientes 15Θ μΐ do meia contendo é definida oimeri to vis ·* y ízt 1 a pós uma i fung· os fil amento sos e 24 ração fu nqi cída ® íníma w tVi mais DS X xa da d ί oga que g cç, pe rmi tiu ο c res ci- droga, A concentração inibidora mínima (MIC) é definida coíbo concentração mais baixa que evita o a incubação durante 42 horas, 28 ®C para horas, 28°C para as leveduras. A conc? pg/ml έ definida como a concsntraçl? evitou totalmente o crescimento ou quí mento de não ma is que t.r@s colónias, Representativos da activida— de anti fúngica são os dados de concentração inibidora mínima s de concentração fungicida mínima indicados mais abaixo:

Concen t raçlo Inibidora Mí n i ma C mcg/m1)

Organismo Composto A Composto B

Fungos Fi1amentosos A. fumioatus HF4839 A. Flavus MF383 A, niger HF442 Fus, oxvsoQrum HF4ے14 Fen- italicum MF2819 Coch. ffiiyabeanus HF4626 J

128 128 T. lientagrophvtes HF4864 1 00 6,2 1,6 4 128

Levedura Composto A Composto B C. albicans ΜΥ1Θ55 8 >128 C. tropicalis MYI0Í2 4 >128 C. oaraosilosis 8 >128 Crvpt. neoformans IÍYÍB5Í 1 >128

Concen tração l-ungicida Mínima ípg/ml) Composto A Composto B Levedura C^ albicans MYI055 4 >128 Cj tropicalis ΜΥ1Θ12 2 >128 C^ parapsilosis MYi<&l€í 2 >128 Pr.yet neoformans ΜΥ1Θ51 0,5 >128

J

Assim o presente invento é também dirigido a um método de tratamento de infecçSes por fungos que compreende a administração a um organismo necessitada desse tratamento de uma quantidade teraptuticamente eficas não tóxica de um composto representado pela fórmula estrutural (I) e seus sais farmacêuticamente aceitáveis» Tendo como base os dados MIC e MFC anteriormente referidos é determinado que geralmente devem ser ut.iliçados de 2 a 5 mg/kg como unidade de dosagem num tratamento antifungico.

Os- compostos deste inven a ρ1i c aç Ses d as composiçS compus cOs· ρ {j Ό iTr ssr mas tarados c inerte, gera!mente com o aunílio d acfcivo, cuja natureza irá variar utilizados para o controlo de a em várias marní feros5 J___ C Ltó X s loíííd o homem, uu p r Cífi τ' rolo de fungos na agriculcura de p i. Sfl ÍT.cÍO r. ou para o controlo de ta são adaptáveis a utilizações es antifúngicas. Nesse caso, os oiTi um veicula biologicamente e lutí aqente de dispersão tensio dependendo dos compostos serem gentes patogénicos infectando ássaros, ou repteis, ou para o tal como no solo ou em partes fungos em ohjectos inanimados.

Em composições para aplicações médicas, os compostos podem ser misturados com um veiculo farmac@uti.camente aceitável, cuja natureza irá variar dependendo da composição ser para aplicação tópica, parentérica ou oral„

Se a referida -aplicação for tópica, a droga pode ser formulada em cremes e unguentos convencionais tais como petróleo branco, lanolina anidra, álcool cetílico. base para cremes de oe ϊ s z. a 3 monustearato de glxcerii. o, água de rosas, e tc, ra r a. a p 1 x c a c õí formulados em soluções ΙΛ O'”. parentéricas, os compostos podem ser parsntérxcas convenc xon ais tais como cloreto de sódio a Θ,85 por cento ou dentrose a 5 por cento em águas ou outras composições farmacêutxcamente aceitáveis. fts composições para administração oral podem ser preparadas misturando intimamente as drogas componentes com qualquer um dos meios farmacêuticos usuais, incluindo, para preparações liquidas, veículos líquidos, caulino, etil celulose, aqentes de dispersão tensio activos, geralmente com lubrificantes tais como estearato de cálcio, juntamente com agentes de ligação, aqentes- de desintegração, etc „

Estas composições são então administradas em quantidades suficientes para se obter o desejado efeito arstifungico* Para aplicação médica, o método compreende a. administração a uns indivíduo necessitado desse tratamento de uma quantidade antifun— gica terapãutieamente eficaz dé um composto da Fórmula I„ As doses apropriadas irão variar dependendo da idade, gravidade, peso corporal e outras condições» Para aplicação tópica as composições são aplicadas directamente ã superfície onde se deseja realizar o contraio» Para administração interna, a composição pode ser aplicada por injecção ou pode ser administrada oralmente»

Para aplicação não médica, o produto do presente invento, quer isoladamente quer em mistura, pode ser utilizado em composições num veículo inerte que inclui diluentes secos ou líquidos finamente divididos, agentes de extensão, agentes de enchimento, condicionadores e excipientes, incluindo várias argilas, terra díatomáesa, talco, etc», ou água e vários líquidos orgânicos tais como alcanois inferiores, por exemplo etanol e isopropanol» ou querosene, benzeno, tolueno e outras fraeções da destilação do petróleo ou suas misturas»

Estas composições podem ser utilizadas por aplicação a superfície ou por incorporação no meio a ser protegido» Para o controlo do míldio do arroz, míldio tardio do tomate» míldio precoce do tomate, ferrugem da folha do trigo, míldio pulverulento da faveira e Fusarium do tomate, as composições podem ser aplicadas directamente á planta em aplicação tópica ou. administradas ao solo para aplicação sistémica» 0 método compreende a administração á planta, solo ou meio afsetados a serem protegidos de uma quantidade antifungicamente eficaz do composto da Fórmula I, que Sfôc;usfVi ilustram a pre paraçãa a su.a ,'incorporaçãD Bffl compos das

Os exemplos devam ser considerados limitativos IvindicaçBss que lhe estão apensas, to A é a do Exemplo 2. compostos da fórmula (I) e farmaeiuticas e como tal não do invento apresentado nas re A via preferida para o Conrpos A composição ou meios utilizados nos Exemplos que se sequem são indicados a sequir

HE10 DE SEMENTEIRA KF por litro

Licor de Milho cr g Pasta de Tomate 40 g Farinha de Aveia 10 g Glucose 10 g Mistura Elementos Vestigiais 1Θ ml pH ajustado para 6,3 (préestéril) 50 mis/balão Erlenmeyer de 25© mis sem separador autoclave 2Θ minutos Í12Í°C, 15 psi)

Mistura Elementos Vestiqiais

g/L FeS04-7H^0 1,0 MnS04*4H^0 lf0 CuC 1 ^«2K-,0 0,025 CaClí?*2H„0 0,1 0,056 •w* ÍNH4)6Mo7024-4H2Q ©,019 ZnSQ4-7H^0 0,2 dissolvido em 1L HC1 0,6 N

Meio de Produção MBH

g/L

Extracto de Malte CDifco) 5 ,Φ Glucose 15?€í Peptona lf0 KH2Pu4 1,0 MgSQ4 ©,5 H^G destilada l.í 50©,0 ml

J (sem ajustamento do pH) 45 rels/balão frasco Erlenreeyer de 5® mis sem separador autoslave 15 minutos í121°C, 15 psi) EXEMPLO 1

Preparação do Composto A A.

Cultura MF5453

J A cultura MF5453 foi inoculada em meio de sementeira KF usando uma pá funda de vidro do solo original em tubo. 0 frasco de sementeira de KF foi íncv.h&do durante 73 horas a 25 °C, 22Θ rpms 85% de humidade. No final desta incubação., porções aliquota.s de 2,,Θ mis foram transferidas assepticamente para cada um dos 75 •frascos core meio de produção MBM» Estes frascos de produção foram então incubados a 25°C,, 22Θ rpms S5% de humidade, core ure ciclo de fermentação de 14 dias. Os frascos foram colhidos como se segues o crescimento micelial foi homogenisado durante 2® segundos a alta velocidade usando ure reisturador/Biohoreocienizador (Biospec

Products Inc, Bartlesville, Ok)? adicionando-se então 45 mis de metanol a cada frasco Ca concentração final de metanol foi de aproMimadamente 5Θ%) « Os frascos regressaram então ao -agitador e goram agitados a 220 rpm durante 30 minutos,, Subsequentemente,* os conteúdos dos frascos foram reunidos»

B, Isolamento do Composto A

Um extracto de fungos com 6 litros homogenicado com metanol a 5®% apresentando um pH de 4?5 foi utilisado no processo de isolamento que se segue» Os micélios foram filtrados através de ceiits e os micélios recuperados foram extraídos de novo por agitação durante a noite com 3 L de metanol a 50% filtrando-se de novo,.

0 sxtracto combinado <9 L) de 50% de metanol foi diluioo até 25% de metanol com água (volume total 18 L) e aplicado a uma coluna Mitsubishi HP-20 C75Θ ml) com uma taxa de fluxo de 80 ml/minuto» A coluna foi lavada com água íl L) e eluida com um gradiente em vários passos de metano), consistindo em meia-nol/H^O 50/50 (1 L), metanol/H^O 6Θ/4Θ (1 L), metanol/H^O 80/2Θ C2 L)5 metanol/H^O 90/10 <1 L>, metanol 100% <2 L)? e acetona 100% Cl L>« As fracçSes de metanol/H^D de 50/50 a 90/10 foram combinadas e díluidas com água até metanol/Η.-β 35/65 Cvolume total 10 !_>.

Os 1Θ L de metanol/Η^,Ο 35/65 foram acidificados- com HC1 1,0 N C20 ml) até pH 3,0 e extraídos para EtOAc (4 L). A camada de EtOAc foi separada e o solvente foi removido in. vácuo para proporcionar 260 mg de um óleo côr de laranja»

Uma porção <!©%> do óleo côr de laranja foi dissolvida em í ml de metanol e diluída com ©,8 ml de fosfato de potássio i© mM (pH 6,5) coffi uma certa precípitaçSo. A suspensão foi aplicada a uma coluna preparativa HPLC <Whatman Maqnum 2© 0„ _, 22 mm ID X i iZí ‘ > 25 cm, 8 ml/minuto* A fase móvel inicial foi metanol/IC^PO^ i© mM 60/40r pH 6,5, e após 2© minutos a fase móvel foi alterada para metanol/fosfato de potássio 10 mM 8©/2®, pH 6?5. FracçB>es de 8 ml cada foram recolhidas, e as fracçSes entre 31 e 33 minutos (2) foram combinadas, diluidas com égua até 35% de metanol, acidificadas com HC1 a 1©% até pH 3, e extraídas para EtOAc. 0 solvente foi removido i_n vácuo e obteve-se uns óleo 1 igeiramente amarelado transparente identificado como o composto do titulo, , EXEMPLO 5

Preparação do Composto A A. Cultura MF5455

e

Um f rasco Erlenmeyer de 25© ml contendo 54 ml do meio de sementeira <KFJ foi inoculado com MF5453 e incubado a 25°C e com 85% de humidade a 22© rpm durante 72 horas, Dez ml da cultura foram transferidos para cada um dos três frascos Erlenmeyer contendo 5©© ml do meio de sementeira !<F„ Estes frascos foram cultivados durante 44 horas a 25 °C, 85% ds humida.de a 22© rpm. Setecentos e cinquenta mm da cultura resultante foram usados para inocular cada um dos 2 fermentadores de 22 litros contendo 15 litros de meio de produção KBH, As condições de esterilização foram as seguintes; íΞΞ°C„ 15 p-si durante 25 minutos. 0 pH do meio após esterilização foi de 5,©. As condições de fermentação foram as seguintess 25°C, com uma taxa de agitação de 3©© rpm.

uma taxa. da fluxo de ar de 435 litros por minuto, ε uma pressão de fundo de 5 psi* Após 357 horas de cultura nestas condiçSes os lotes foram recolhidos,

B, Isolamento do Composto A

Foram utilizadas três fermentações independentes (3 L), (1® L), e (10 L) no processo de isolamento que se seque, A fermentação de 3 L foi cultivada seguindo o Exemplo IA e cada 1Θ L de fermentação foi cultivado seguindo o processo do Exemplo 2A» Cada fermentação foi filtrada através de celite e os micélios foram extraídos indivitíualmente durante a noite (2 X) com 1 Ls 3 L? e 3 L de metanol a 5®% respectivamente,

Os filtrados e extractos foram todas combinados e diluídos com água até 25% de metanol (volume total 45 L). Este foi aplicado a uma coluna Mitsubishi HP-20 <1,5 L) com uma taxa de fluxo de lã® ml/minuto, A coluna foi então lavada com água <4 L)p e 40% de metanol (á U, A coluna foi então eluida com metanol a 100% (é> L) «

O produto da eluição com metanol a 100% HP-20 foi diluído com HTFO^ 10 mM (è L5 volume total 12 L) e extraído para CH.-jCl^, (4 L) „ 0 solvente foi removido in vácuo para proporcionar 21 g de um óleo amarelo. 0 concentrado anterior foi dissolvido em metanol (5ΘΘ ml) e diluído com IC^PO^ 20 mMs pH 7.ã (500 ml>, Esta solução foi aplicada a uma coluna Dowex 1X2 (Cl ) C35® ml) a uma taxa de 25 ml/minuto, A coluna foi lavada com metanol/água 5©/50 (2 L>, metanol/solução NaCI a 3% 50/50 (1 L) 5 s o produto foi aluído com metanol/solução NH^CI aquosa a 3Φ% (2 L)» 0 produto eluido com metanolfoi diluído com H^PO^ 2Φ mM (2 L> e extraído com CH^C1? (2 L). 0 solvente foi removido in vacuo para proporcionar um óleo c8r do laranja espesso*

Uma porção do élso cSr de laranja <24 mg5 foi dissolvida em 1 ml de metanol e adicionou-se 0,4 ml de H^PO^ 1Θ mH com uma certa turvação. Esta suspensão foi aplicada a uma coluna oreparativa HPLC (isíhatman iiaqnum 2Θ C„„, 22 mm ID X 25c m, 8 1 «3 “ ml/minuto? fase mévsl metanol/B^PO^ 10 mM ΒΘ/2® pH 2,5)« As fracçSes eluindo entre 16 s 2& minutos foram combinadas, diluídas com Η-ΓΡΟ„ 5Θ mH í5tí ml) ? e extraídas com Ci-í-.C 1 _= <2 x 75 ml)= 0 -·-* *r ' sL έ. CH^Cl„ foi removido in. vacuo para proporcionar um óleo liqeira- i · 1 mente amarelado. Este material apresentou espectros ”H-RMN a UV itífnticos aos do Composto A isolado no Exemplo 1. EXEMPLO 5

Como uma apresentação específica de uma composição oral de um composto deste invento. 2Θ mg do composto do Exemplo í são formulados com suficiente lactose finamente dividida para proporcionar uma quantidade total de 58Θ a 59Θ mg para introdução numa cápsula de gelatina dura tamanho Θ. 7)

EXEMPLO 4

Preparação ds um Sal de Amónio

Uma amostra de 0,1 mmol do ácido 1ivre do Composto íI) é dissolvida em 10 ml de acetato de etx 1 o =. A solução resultante é pós o que o sal de amónio se separa saturada com aíirônia gasosa, por precipitação a partir d ) EXEMPLO 5

Preparação de Sal de Potássio

Uma LiCSQ GS 0 s em 1Θ ml de metanol é tratada com ca contendo : 0,3 mmo1 de hidróxid? solvente pr oporciona o sal de tri- e 0, o* mmo 1 de hidróxi do de potáss O Cl 'HH· S *S X '5 de mono ρ otéssio, di· c ompos ição depende da quantidade * do :ido livre do Composto (I) uma solução aquosa OU metani óli- de potássio» A εν pC rração do O O íl -ã '“·X Ο π H au X Ç -SC) _£ ... entre 0,1 o proporciona misturas análogas potássio s tri-potássio cuja. xacta de hidróxido de potásssio

adicionado»

De um modo semelhante, sódio s de látio do Composta í 1) =, podem ser formados os sais de

EXEMPLO 6

Preparação de um Sal de Cálcio

Uma solução de· @sí mmol tj o -é’·.’.-. ido 1 x v f e de um composta rmula (!) em 2Θ ml de snetan o1/ág ua 6 s 4 é τ. Γ 3. tada : com uma *50 -5C| LIOSH de 0,1 mmol de Hid r Ci H X d o d e c â 1 c io- Os solventes : ve. po r ed os para dar origem ao çorresoonden te 3 6i 1 η E—f cálcio» EXEMPLO 7

Preparação ds um Sal Etiienediamina

Uma ' da fórmula (I) e t i 1 en ed i. -a® i π a e 112 en e d i a m i n a olução em í@ de Φ, í «só 1 do ácido livra da u.m ml de metanol é tratada cq® 0,1 aporação do solvente proporciona

Lumposto {Timo 1 de o sal 0 processo pode ser também aplicado á preparação do sal N, N ” -d i ben z i 1 eti 1 ened iamina „

EXEMPLO 8

Preparação de um Sal TrisCbidroximetillaminometano ft uma se :;luç an de •0,1 mmol í d O a c x o o 1 x V Y“s ds da fórmula (1) em 10 ml de metanol adiciona-se de &31 um Compt a θ,3 to mmol

de trisíhidroximeti!)aminometancs dissolvido em 10 m1 de metanol, A evaporação do solvente dá origem è forma sal correspondente da composição enacta do Composto (15 que é determinada pela relação molar da amina adicionada * 0 método pode ser também aplicado a outras aminas tais como, mas não se limitando as dietanolamina s dietilamina» EXEMPLO 9 ) A preparação de um sal L-arginirta

Uma solução de &?í mmol da ácido livre de um composto da fórmula (1) em 1Θ ml de metanol/égua 6s4 é tratada ca® uma solução aquosa de 0,1--0,3 mmol de L—arginlna, A evaporação do solvente proporciona o sal do título, cuja exacta composição é determinada pela relação molar entre o amino ácido e o ácido livre do Composto (I). São preparados de um modo semelhante os sais de L-orni-tina, L-lisina, e N-metilglucamina»

J EXEMPLO 10

Preparação de Composto B (Método í)

Uma. solução de 9Θ mg de Composto A em 5 ml de acetato de stiio foi tratada com um ligeiro excesso de diasometano etéreo» Após 5 minutos o excesso de diazometano foi removido e o solvente foi. evaporado para dar origem ao Composto B.

EXEMPLO 11

Preparação da Composto B

Uma solução de 2 mg ds Composto A em Θ55 ml ds scetoni·· t.ri i o f o i -i. trat ada .(¾ i" em per a tu r a •SiTi sn te c ocn 10 equi va 1 en t es de DBL1 e equiv alentes -ds M SI = Ap ÓS 2 horas 8. Γ 0SCÇ 8.0 foi d i 1 u ida c otn 10 1 de d j r ] ΟΓΟΓίί et ano e 1 a vad a suces siva rnen te c Í-VEY« IO ml de éci do 5 s T CíT-IC. o ,im, Ί Λ i.*:? _ "3 -à ~~ ml de âg u.a 4 Λ » J. ti-1 ml de bic arb anato Sod io se. t urado 10 ml de 8QU8. = ft pó· s sec agem sobre su lf ato de SÓd ia «í camad B. D rgan xca f oi con c sn tf- a d a. e Ο Γ esíduo foi croma â, w gra f a d ° s obre q£i 1 d 0 sí 1 ice u san do mis tura .s de h S‘K-3 no e de acs t, ,G d e e t x lo para dar origem ao Π; ompos to B 0 má tod o d ο Εκ emplo 11 é tam bem apropri ado i para 8: pre par 'B.Ç du uS OU tros deri V eldOS de tai s como i) eti lo s outros ésteres de alquilo inferior e 2) henziio e ésteres benzi-1icos substituidos.

Dados Espectrais de Massa

J li£ãda= 0 u o CPFK) ou como pa drão .dos com uma

Os espectros de massa foram registados no modelo Firsnigan-MAT modelo MAT212 (impacto de slsct.rSess EI,, v€> eV) ? MAT 9® (Fast Atom Bombardmentj FAB) s TSQ70B Cespectrómetros de massa FABq EI >, As niediçoes exactas de massa foram realizadas com elevada separação CHR-EI) usando perfluoroqueroseno CPFK) ou óxido de perf1uoropo1ipropi1ene (Ultramark U1600F) como interno» Os derivados de trimetilsililo foram prepare mistura 1 ; i ds BSTFA—piridirsa -à temperatura ambiente.

C RUM

Dados de 13, CD-vOD a

0 t ?spe r· ·$* 1 1 ro de ~'ϋ RMN do I Co mpo s to n ri foi * £í l] j. stado om V». ic { 1ΘΦ MH 2 nu.ni (gg. pectróme *Η·“ Ci Var i an v L4©0,, Os desv: ÍOS são ind i.c ados ^{ϊ\ ppm em r*s 1 aç 5¾ tet .Γ ;r, meti 1S-J. 1 ano (TI 18) ‘P® t .ísafi Ho O L íic o da so Iv ΘΠ t. e .¾ .flQ 0 ppm com o padi -ão U evapec tr O uS 13 C RMN d o COfli pos t o B f oz rs gist ado a / :J MHz ·’ temperatura ambiente) num espec.trometro Varian XL30® em C,D, * ò ò usando o pico do solvente a 128ppm como padrão interno»

Espectros de H RMN

Os esoectros de Ή-Ι RMN foram registados a 4ΘΘ MHz em CD_,DD b CD, ·-* ò d num espectromeiro : XL400» Os desvios químicos são ΧΠ Q X rS w.d OS w£fTf ppm Bm rs laçSsu a TliS a zero ppm usando os picos de solvente a 3 ? 30 ppm (CD^OD) e 7,15 ppm C C,D,> como padr ij £j ões internos»

Propriedades Fisicas dos compostos da Estrutura I;

J

Composto A ~ o composto da. estrura íí) em pus Z. cada um deles hidroqíãnio* são

Sadss Espectrais de Massa; < EM+H3 ste composto tem srvado a m/z &9Í O p-BSD íFiO 1 te e com adi ão de 0 é}9‘0 por FAB-MS acetato de litio

CM«LiT+Li3' Cisto ê* o aducto iítio do sal de trilitio) a m/z 715),. A fórmula molecular 40., a fai determinada por medição HR-EI do derivado penta-trimetiisililo (calc. para 0^.^^0.^+-(SiC^Hp)^ 105Θ,= 48ό4., encontrados 1 @50» 4829)« Outros fragmentas iónicos críticos foram observados no espectro si li lo como se segues ΠΙ-AcOHj ! , calc,, para ^+(810^8^),- 99Θ.4597, encontrados 99®.4625g C.^-TH.7^01 f-+<SiC^Hg}^, calc. 749.3015, encontrados 749«3®22;i CM~<C0oH+SiC?Hq)3 + , calc para 0^,8^0..-,+-( 8 -i- L, -..ri O-' w' :: *V "V -—: CZ- ΌΙ'ϊΙ—ΟΙίϊΟ dd!J‘^ V--*ò K 445® h CièH23084-<SiC3Hs)4, calc 631.2974» encontrados 631.2944. > 1

Espectro H RUM (CD^OD, 4®C‘C) ϊ Ver figura 1.

Desvios Químicos í ~iC RHM (CD,0D. 4®*C)s 11,5, 14,3. 19,4, 2®,6, 21,®, 26,7, 3®,8, 33,3, 35,2, 35,6, 37,9, 41,®, 44,5, 75,8, 76,8, 8®,4, 81,3, 82,7, 91,3, 106,9, 111,7, 12®,®, 127,®, 129,4 C2x>, 130.3 (2x>, 14í,7, 147,9, 157,6, 166,8, 168,7, 17®,3, 172,2, 172,7 ppm. UV(HeQH) Χιβκ 209 nm í€ = 30.Θ0Θ)

IV (como Acido livre; película sobre ZnSe)n 34ΘΘ--25®® br, 296®, 293®, 2875, 1745-17®®, 165®, 145®, 1375, 128®-1225, 1185, 1135, 1®2®, 985, 75®, e 7Θ® cm”1.

Composto B - o éster trimetilico do Composto A, isto é, o composto da estrutura (I) em que Z., , Σe Z -- são cada um deles meti lo. ο ο

Dados Espectrais de Massas

Este composto tem o peso molecular de 732 ; rar EI-MS e forma um derivado dl-(tri metilsililo)» fi fórmula molecular \_, ~~ .~,H j-. .-^0 j « foi determinada directamente por medição por HR—EI Ccalc 732« 3357, en c on t r a d os 732 E3329),

Espectro de 1H mn (C D 22*0: Ver figura 2, 13, C RMNDesvios Químicos <C, D,, 75 MHz): 11,3, 14,©, 18,9, 2©,2, O Q* * * ' * 2© ? 6 ? ’^ó <1 *-J 3 30, © 7*7 1 3 —* -- 3 »· »ϊ ·~·: "r 3 & q 74 7 "í,"/ i Λω *— sj a. 3 ^ V ·” 3 3 4-i S ·-> ? SI o w λ J .· J irr-~> «f rzrry u·.;* η, o tj jp* “j· *7 i: ·„* i2 / ·_/ r t. ~7í~i 3 ·* *-x ? 8« 82 5 β O·^1 O αα o 5 U t· j W 3 106 j.25 111 o q W ;; 1 1 S 8 1 ·“? /_ ·"> - W t| 5 1: r>o .4 ? o <2k )? i 29 i. f ♦ t ' 3 £> \ ; í / ? 1 7?i5% O a -rV 3 t i4é?é>3 157 5 2 s 166 í-i ? ? 166 j5?

J

Claims (2)

1. REIVINDICftÇSES 11* - Processo para a preparação de um composto de fármuis estrutural I; em pue £ - . entre O

   (I) e slo cada um deles indspendsntsmente ssleec de a > H 5 \ r 51 fu π i nt l—’ . r .| JJ· ut A .A. J. ί~' S i “~’3 substituído ífii membro do grupo μυ ?-.un Í. ) f 0p i 1 p

   h-5 1 CSCjè.n XO ii) fenilo substituído com instilo* íneto:>;i? \Cl, Br,= IF) ou hidroK.1 s ou ) 7sdo rei ti Vi 2s, — Processo de por se preparar de fórmula estrutur ãLOrQD lOOí c um compacto aI <I} és indicação 15 carac--· que a configuração de um sal farmac :eut icamente ace i t é. ve 1 de uns composto da fórmula Cl) pue pe I o men os um de entre 1χ9 !.-> s Z.T é hidrogénio; caraciaric ado por compreer ~c q o r a cultura i si w Fw—1 1 t 1 1 í_7·_? ΞΘ9Β6) ou de um seu mutante activo. £?£Γ- condições apropriadas para a forma··· çS?o do ΓΒf srido composto* e a r ec u pera ç ão do compostD.= Rg»; Biíi 0

   (I) 2 5 caractesão cada uí\ íiisn te ace i tave 1» . J. il U _i. O ;rí i_ elU . 7 _ í= 7_ 3~ e ” F'TulS55u d-S ãCDi du uOih a Fiei risado por se preparar mm composto em que 2 deles hidrogénio, ou. um seu sal farma.csutic 4ã.- : í* CfL.u. ϋΐΐ acordo com a r e x v x r idicação risedo por se preparar um composto em pUísí “ ^ 3 Z.-5 e Z-~ são cada um deles metilo»

   5â.- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade terapfuticamente eficaz não tóxica de um composto da Reivindicação 1 e um veículo farmacfuticamsnte aceitavel»
2. 65, - Método para o tratamento da hipercolesterolémia, caracterizado por compreender a administração a um indivíduo necessitado desse tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz não tóxica de um composto da Reivindicação 1, sendo a gama de dosagem de ingrediente activo de cerca, de 2Φ mg até cerca de 2ΰ#θ mg por dia» 7i, — Cultura de MF5453 íATCC 2Ô986) ou de um seu mutante activo, caracterizada por ser capas de produzir ucn composto da estruturas O

   em quantidades recuperáveis„ Sé» ~ Processo para a preparação de um composto de estrutura; ο

   COOH > caracterizado por conspreender de um seu mutants activo , em çã'o do referido composto, a a a cultura de MF5453 CATCÍ condiçSes apropriadas pari recuperação do composto» 20986) ou a forma- 9s„ - Método para a inibição do crescimento de fungos, caracterizado por compreender a aolica.ção à superfície onde o crescimento deve ser controlado ou ao desse tratamento, particularmente por sistémica de uma quantidade antifungic to de f òrrnu 1 a I s organismo vivo necessitando via oral, parentériea ou amente eficaz de um compos-

   ο

   Ci) Biii LjUe 7 3 e Z-j. s-So cada usb deles independentemente seleccionados de J. ·-'/ entre a Hs b) r '"1 alqi i *1 n c.) alquilo substituído com um membro do grupo consistindo em i) fenilo 5 ii) fenilo substituído com metilo, metoKi, halogénio ÍCl, Br, I, F) ou hidroxij ou oe um sal <I) em que a gama de farmaceuticamente aceitável de um composto da fórmula. pelo menos um de entre Z,f , Σ.-, e á hidrogénio, sendo dosagem de composto activo de 2 a 5 mg por quilograma

   Lisboa, 19 de Março de 1991

   J. pereira DA cruz Agente Oficial da Propriedade Industriei RUA VtCTOR CORDON, 10-A 3« 1200 LISBOA