CS71991A2 - New squalene synthetase inhibitors - Google Patents

Description

1 ‘

Dosavadní stav techniky

Hypercholesterolemie je známá jako jeden z hlavníchrizikových faktorů pro ischemickou kardiovaskulární chorobu,jako je arteriosklerosa. Aby se tato choroba vyléčila, použí-valy se maskovací činidla kyseliny žlučové. Ty jsou, zdá se,mírně účinné, ais musí se užívat vs velkých množstvích, t.j,v jednotlivé dávce několik gramu a nejsou příliš chutné. MEVACOR(lovastatin), nyní komerčně dostupný, je jed-ním ze skupiny velmi aktivních hypercholesterolemických Čini-del, jejichž funkce spočívá v omezení biosyntézy cholesteroluinhibici enzymu HMG - CoA reduktasy.

Skvalen syntetasa je enzym, působící v prvním kroku nověprobíhající biosyntatické dráhy cholesterolu. Tento enzym ka-talyzuje reduktivní dimerizaci dvou molekul farnesyjL·^-fos-fátu za vzniku skvalenu, Inhibice tohoto kroku směrem k cholesterolu by měla opustit nebráněné biosvntetické dráhysměřující k ubicninonu, dolicholu a ísopentenyl .t-RNA. V předešlých pokusech o inhibici skvalen syntetazy sevyužívalo difosforečnanu nebo analogu diřcsforečnanu, kterýobsahoval sloučeniny jako jsou ty, popsané v P, Ortiz doMonteliano a další, 3, Med Ghem. 20, 243 (1977) a Ξ.3, Coreya R. Volante, 3. Am. Cf^ern. Soc., 93, 1291 (1976). S. Siller(U.S. Patent 4, 871 721) popisuje isoprenoidní fosfinyl-methyl) fosforitany jako inhibitory skvalen syntstasy.

Tento vynález poskytuje inhibitory skvalen syntetasy neobsahující fosfor.

Podstata vynálezu i I' ' / ;>>' I >\ 1

i· „A

Tento vynález je zaměřen na nové sloučeniny strukturní-ho vzorce I, které jsou inhibitory skvalen syntetasy

cn kde Z^, a Z^ jsou nezávisle na sobě vybrány ze skupinyzahrnující a) vodík b) alkylskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku c) alkylskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku substituovanoučlenem skupiny, která se skládá z i) fenylu ii) fenylu, který jé subtituovaný methylem, methoxyskupinou, haloge-nem (Cl, Br, I, F) nebo hydroxyskupi-nou; nebo farmaceuticky vhodné soli sloučenin obecného vzorce I,v nichž alespoň jeden ze symbolů Z^, Z£ a Z^ představuje vo-dík.

Jednou částí tohoto vynálezu jsou sloučeniny vzorce I,v nichž je relativní stereochemická konfigurace 2,8-dioxabi-cyklo / 3.2.1 / oktanového kruhu taková, jak je ukázáno níže

V tomto popisu a nárocích, kde je stereochemiě popsaná prodioxabicyklo /3.2.1 / -oktanový kruh, se samozřejmě vždyjedná o konfiguraci relativní. Skutečná konfigurace může býttaková, jako je ukázáno, nebo může jít o její enantiomer.

Další ilustrací této části vynálezu jsou sloučeninystrukturního vzorce I, v nichž relativní konfigurace na mís-tech 3,6 a 7 je taková, jak je ukázáno níže

(I)

Do jedné třídy této části vynálezu spadají sloučeniny vzorce I,v nichž relativní konfigurace v místě 4 je taková, jako je uká-záno níže

Příkladem této třídy je sloučenina, ve které symbolyZlz Z2 a Z3 Představují vodík nebo farmaceuticky vhodná sůltéto sloučeniny. Sloučenina, v níž symboly Z^, Z2 a předsta-vují vodík je dále v textu označována jako sloučenina A.

Dalším' příkladem z této třídy jsou sloučeniny, ve kte-rých jeden nebo více symbolů Z^, Z2 nebo Z^ jsou G^_5 alky-ly nebo C1_5alkyly, substituované fenylem, nebo fenylem substi-tuovaným methylskupinou|metoxyskupinou, halogenem (Cl, Br, I, F),nebo hydroxyskupinou. Specifickým příkladem je případ, kdy Z., , Z2 a Z^ představují methyly. Tato sloučenina je dále v textuoznačována jako sloučenina B.

Sloučeniny strukturního vzorce I se připravují aerobnímfermentačním postupem s použitím nové kultury MF 5453, o kterébylo zjištěno, že je čistá.. Mutanty MF 5453 jsou také schopnéprodukovat sloučeniny podle tohoto vynálezu a spadají do rozsa-hu tohoto vynálezu.

Kultura MF 5453 je houba, izolovaná ze vzorku vody zřeky Jalon v Zaragoze ve Španělsku. Tato kultura byla uloženav Americké sbírce typů kultur American Type Culture’ Collectionv 12301.Parkláwn'Drive, Rockville, MD*"2Ó852 pod číslem-ATCC20986. - ' J ý'”’ ''

Mikroorganismus MF 5453 má následující mórfologické znaky.

Kolonie, vyrostlé za 2 týdny na bramborodextrosovémagaru (potato-dextrose agar, Difco) při 25 °C v nepřetržitémzářivkovém světle, mají 22-24 mm v průměru. Kolnie, vyrostléza 2 týdny při 25 °C na agaru s extraktem jeleního trusu (My-cology Guidebook, medium M-ll, str. 660) mají 40-45 mm v prů-měru. Kolonie na bramboro-dextrosovém a^garu jsou mírně tlusté,1-2 mm hluboké. Jejich mycelium je ve středu kolonie načechranéa směrem k okraji kolonie se mění na plstovité až aksamitové;tvoří soustředné tmavé hřebeny. Někdy se tvoří sektory mycelia

IfiSS

•.VX‘?X w. s odlišnou texturou a barvou. OKraj kolonií je neporušenýbez třásní, způsobených submerzními hlavními hyfami. Barvakolonie je nejprve bílá, nebo některé vzdušné hyfy jsou bílé.Brzy se barva mění na smetanovou (Cream Color)Cartridge Buff(názvy barev velkými písmeny, Ridgway, R.Color Standars andNomenclature, (Barevné standardy:a názvosloví), (Washington,D.C. 1912) a dále na světle šedou až šedou,Light Olive-Gray,Gray, Pallid Neutrál Gray, Neutrál Gray, Gull Gray, DeepGull Gray. Ze zpodu jsou kolonie šedavě hnědé až žluto-hnědénebo smetanové, Cinnamon-Drab, Cinnamon, Ochraceous-Buff,Antimony Yellow, Warm Buff, Cartridge Buff. Zápach ani exu-dát kolonie netvoří.

Hyfy jsou po morfologické stránce podobné askomycetám,jsou nediferencované, septované, větvené. Jejich velikostčiní 1,5-3,5 //um v průměru. Ve vodě a v roztoku KOH je patrnýhyalin. Reprodukční struktury se netvoří za žádných vyzkouše-ných kultivačních podmínek, byla zkoušena inkubace při ne-přetržitém světle a inkubace se střídáním světlých a tmavýchcyklů (po 12 h) při použití obilného agaru (cornmeal), agarus výtažkem sena (hay extract), ovesného agaru (oatmeal), aga-ru s výtažkem trusu (dung extract) a sladinového agaru (maltextract).

Sloučeniny podle tohoto vynálezu se mohou získatkultivací výše zmíněných mikroorganismů ve vodném živnémmediu, které obsahuje zdroje asimilovatelného uhlíku a dusíku.Nejlépe je kultivaci provádět za aerobních podmínek. Živnámedia mohou také obsahovat minerální soli a odpěňovací činid-la .

Nej lepšími zdroji uhlíku v živném mediu jsou sacharidy, jako např. glukosa, glycerol, škrob, dextrin a podobně. Jiný- mi použitelnými zdroji jsou maltosa, manosa, sacharosa a po- dobně. Kromě toho může být využitelný uhlík dodán v komplex- ních živných zdrojích jako je ovesná mouka, pšeničné vločky, s •K1 o' proso, kukuřice a podobně. Přesné množství zdroje uhlíku, kte-ré se použije v mediu, závisí částečně na ostatních složkáchmedia. Ale obvykle se toto množství pohybyuje v rozmezí od 0,5do 5 hmotnostních procent. Tyto zdroje uhlíku se mohou používatv daném mediu samostatně, nebo se může používat kombinace ně-kolika zdrojů v jednom mediu. '

Nej lepšími zdroji dusíku jsou aminokyseliny, jako jeglycin, methionin, prolin, threonin a podobně, stejně jakokomplexní zdroje např. kvasničné extrakty (hydrolyzáty, auto-lyzáty), sušené kvasinky, rajský protlak, sojová mouka, pepton,corn steep liquor, lihovarské výpalky, sladinové extrakty apodobně. Anogranické zdroje dusíku jako např. amonné soli (např.dusičnan amonný, síran amonný, fosforečnan amonný atd.) se mo-hou také používat. Různé zdroje dusíku se mohou používat samot-né nebo v kombinaci s jinými v množstvích, která se pohybujív rozmezí 0,2 až 90 procent hmotnostních v mediu.

Zdroje uhlíku a dusíku se obvykle používají v kombina-ci, ale nemusí být čisté. Mohou se použít méně čisté materiá-ly, které obsahují stopy růstových faktorů, vitaminů a mine-rálních živin. Do media se také mohou přidat anorganickésoli jako jsou uhličitan vápenatý, fosforečnan sodný nebodraselný, chlorid sodný nebo draselný, soli hořčíku, mědi,kobaltu a podobně. Na použití těchto solí se vynález neomezu-je. Také se mohou použít stopové kovy jako např. mangan , že-lezo, molybden, zinek a podobně. Kromě toho se, jestliže je tonutné, mohou přidat odpěňovací činidla, jako polyethylenglykolnebo silikon, zejména když kultivační medium silně pěni.

Nej lepším způsobem přípravy sloučenin podle tohoto vy-nálezu je zaočkování spor nebo mycelia produkčního organismudo vhodného media a potom kultivace za aerobních podmínek.

Fermentační proces se obecně skládá za prvé z inokulace konzervovaného zdroje kultury do živného zákvasného media a získání, někdy pomocí dvoustupňového procesu, rostoucích

'íá>í' I -.«."Λ! - 7 - organismů, které se použijí jako zákvasy při přípravě účin-ných sloučenin. Po naočkování se baňky inkubují za třepánípři teplotě v rozmezí od 20 do 30 °C, nejlépe při teplotěod 25 do 28 °C. Intenzita třepání může dosáhnout až 400 min x,nejlepší je však intenzita třepání od 200 do 220 min . Zákvasnébaňky se inkubují po.dobu.2,až 10 dní, nejlépe 2 až 4 dny. Kdyžje v médiu mnoho rostoucích buněk, obvykle za 2 až 4 dny, můžese kultura použít pro inokulaci baněk s produkčním médiem. Mů-že se vytvořit i druhý stupeň zákvasu, zejména při převodu dovětších nádob. K tomuto účelu se část rostoucí kultury použi-je pro naočkování druhé zákvasné baňky a ta se inkubuje za stej-ných podmínek, ale kratší dobu.

Po naočkování se produkční fermentační medium inkubuje3 až 30 dní, nejlépe 4 až 14 dní za třepání nebo bez třepá-ní (v závislosti na tom, zda se provádí fermentace v kapalnémnebo tuhém mediu). Fermentace se provádí aerobně při teplotáchv rozmezí od 20 do 40 °C. Je-li to potřeba, intenzita třepánímůže být 200 až 400 min . Pro získání optimálních výsledků ležíteploty v rozmezí od 22 do 28 °C, nejlépe od 24 do 26 °C, pHživného media, vhodné pro produkci účinných sloučenin, se pohybu-je v rozmezí od 3,5 do 8,5, nejlépe však od 5,0 do 7,5. Po vhod-·né době produkce žádané sloučeniny se fermentační baňky sklidía účinná sloučenina se izoluje. pH vodného media s myceliem se po fermentaci upraví nahodnotu mezi 1 a 9 (přednostně na hodnotu mezi 3 a 5), dále sesmísí nejlépe s rozpouštědlem mísitelným s vodou jako je 50 %methanol a mycelium se odfiltruje. Účinná sloučenina se potommůže izolovat z vodného filtrátu několika způsoby včetně: 1) Extrakce kapalina-kapalina vodného filtrátu do roz- pouštědla němísitelného s vodou jako je methylethy lJ^Éon, ethyl- acetát, diethylether, nebo,dichlormethan, přednostně po upra- vení pH na hodnotu mezi 3 a 5. wa·’·;.''/ ) ,J ,t V \ < ) z \ í í, 4 C\ ?// 1 /fy fí&amp; Λ í< ^,1¾ 1 >, í“ t 2) Extrakce tuhá látka -kapalina vodného filtrátu naorganickou matrici jako je SP 207 nebo HP-20 a eluce organic-kým rozpouštědlem (vodným nebo nevodným) jako je směs methanol/voda (90:10) nebo aceton/voda (90:10). 3) Adorbce účinné sloučeniny z vodného filtrátu na iontoměničovou pryskyřici jako je Dowex 1 (Cl ) nebo Dowex2 + 50 (Ca ) a eluce směsí organického a vodného rozpouštědlao vysoké iontové síle jako je např. směs methanol 30%-ní vodnýroztok NH^Cl (90:10). Takto získaná látka může být potomodsolena při využití výše uvedeného způsobu bud 1 nebo 2.

Každý z těchto tří způsobů se může také použít při dalšímčištění účinné sloučeniny.

Frakce, obsahující účinnou sloučeninu, získaná výšeuvedenými způsoby, se potom může vysušit za vakua. Tím se zís-ká surová aktivní sloučenina a ta se potom obvykle podrobíněkolika separačním krokům, jako je adsorpční a rozdělovačichromatografie a precipitace. V každém separačním stupni sezískané frakce spojí podle výsledků stanovení a/nebo podleHPLC analýzy. . Chromatograf ické· separace se mohou provádět za použi-tí obvyklých způsobů kolonové chromatografie s iontovou neboneiontovou pryskyřicí. Je-li adsorbentem silikagel, je vhod-ným eluantem směs alkohol/chlorovaný uhlovodík/organická ky-selina jako směs methanol/chloroform/kyselina octová/voda.Pro chromatografii na reverzní fázi je přednostním adsorben-tem silikagel vázaný na C8 fázi. Přednostním eluentem prochromatografii na reverzní fázi je směs acetonitrilu a vody,která je udržována při nízkém pH například 0,1 %-ní kyseli-nou fosforečnou nebo kyselinou trifluoroctovou. Účinná slou-čenina se může vysrážet z nepolárního rozpouštědla jako jesůl chininia. Přednostním rozpouštědlem pro precipitaci jediethyléter.

> \ s>! t 1 »’ { t } \ t K > ť 1 3 -5 íyv .. \ i í, V j? '» <.

Sloučenin podle vynálezu je možno použít pro ihibicibiosyntézy cholesterolu. Netoxické therapeuticky účinné množst-ví sloučeniny strukturního vzorce I, nebo její farmaceutickyvhodné soli se může podávat pacientovi za účelem dosaženíléčebného účinku. Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou spe-cificky účinné jako antihypercholesterolemická činidla proléčení arteriosklerózy, hyperlipidemie, dědičné hypercholeste-rolemie a podobných humánních nemocí. Mohou se podávat orálněnebo parenterálně ve formě kapslí, tablet, injekčních přípravkůapod. Obvykle je vhodné orální 'WWW ''fV/ <' >' 5 Λ s > '\. óx V/ ·, v t I{ < ' A'Jt * ' r i podávání. Dávky mohou být různé, závisí na věku, vážnos-ti choroby, tělesné hmotnosti a jiných aspektech, lidskýchpacientů. Denní dávka pro dospělé je však v rozmezí od 20do 2 000 mg (nejlépe 20 až 100 mg) a může se podávat vedvou až čtyřech dílčích dávkách. Oe-li to zapotřebí, mohouse úspěšně použít i vyšší dávky.

Farmaceuticky vhodné soli sloučenin podle tohoto vy-nálezu jsou soli utvořené od kationtů sodíku, draslíku, hli-níku, vápníku, lithia, hořčíku, zinku a od bázi jako je amo-niak, ethylendiamin, N-methyl-glukamin, lysin, arginin,ornithin, cholin, NřN'- dibenzylethylen^diamin, chlorprokain,diethanolamin, prokain, N-benzylfenethylamin, diethylamin,piperazin, tris (hydroxymethyl)aminomsthan, a tetramethyl-amoniumhydroxid. Do tohoto výčtu spadají soli, v nichž jedna,dvě nebo všechny tři karboxylovó skupiny jsou převedeny nasůl.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu se mohou také podá-vat společně s farmaceuticky vhodnými netoxickými kationto-vými polymery, schopnými vázat žlučové kyseliny na formu,která není V gastrointestinálním traktu vstřebatelná. Příkla-dy takových polymerů jsou cholestyramin, kolestipol a poly-/methyl-(3-trimethylaminopropyl)iminotrimethylendihalogenic/.Vzájemný poměr sloučenin podle tohoto vynálezu a těchto po-lymerů leží mezi 1:100 a 1:15 000.

Skutečná inhibiční aktivita reprezentativních slouče-nin podle tohoto vynálezu vzhledem k skvalen syntetase bylaměřena standardním postupem, prováděným in vitro, jak je po-psáno níže. Příprava mikrosomů:

Krysí samci (Charles River CD) o hmotnosti 120 až 150 gbyli 4 dny krmeni stravou, která obsahovala 0,1 % lovasta-tinu. Oátra z těchto krys byla homogenizována v 5 objemech 10 (ml/g) ledově chladného pufru o složeni 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazin-ethansulfonovó kyseliny}, 5 mMEDTA (ethylendiamintet raoctové kyseliny), pH 7,5 pomocítkáňového mlýnku, typu Potter-Elvehjem. Homogenát byl dva-krát 15 min. centrifugován při 20 000 g, při teplotě 4 °C,při čemž pokaždé byla peleta odstraněna. Supernatant bylpotom centrifugován při 100 000 g, 1 hodinu, při 4 °C.Výsledná mikrosomálni peleta byla resuspundována v homoge-nizačnim pufru, jehož složení je uvedeno výše. Objem homo-genizačního pufru se rovná jedné pětině objemu původního ho-mogenátu. Koncentrace proteinu v tomto mikrosomálním prepa-rátu činí asi 7 mg/ml. Mikrosomálni suspenze byly skladová-ny v alikvotních podílech při -70 °C, Skvalen syntetásováaktivita v těchto alikvotních podílech je stabilní alespoňněkolik měsíců. Částečná purifikace prenyljtransferasy

Prenyl transferasa byla vyčištěna pro použiti v enzy-mové syntéze radiologicky značeného farnesyldifosfátu. Prenyltransferasa byla stanovena metodou podle Rillinga (Methodsin Enzymology 110, 125-129 £1985)). Jednotka aktivity prenyltransfesy je definována jako množství enzymu, které poskytne1 /Umol farnesyldifosfátu za minutu při 30 °C při standardnímstanoveni. Oátra z 23 krysích samců, 40 dnů starých, jejichž stravaobsahovala 5 % cholestyrarainu plus 0,1 % lovastatinu, bylahomogenizována v mixéru Waring v 1 litru pufru o složeni 10mM merkaptoethanolu, 2 mM EDTA, 25 ^uM leupeptinu, 0,005 %fenylmethylsulfonyl fluoridu pH 7,0, který také obsahoval0,1 jednotek, inhibujicich trypsin, aprotinu na ml. Homogenátbyl 20 min centrifugován při 20 000 g, pH supernatantu byloupraveno na 5,5 pomocí 6N kyselinyjactové (HOAc) a 1 hodinuodstfeáováno při 100 000 g< pH^Ůpernatantu bylo upraveno 3 NKOH na 7, O a byla odebrána frakce 35-60 % síranu amonného. 60 % pelet bylo znovu rozpuštěno v 60 ml pufru o složení

11 10 mM fosforečnanu draselného, 10 mM merkaptoethanolu, 1 mMED TA, pH 7,0 (pufr A) a dialyzováno proti dvakrát jednomulitru pufru A, Tato dialyzovaná frakce byla nanesena na kolonu (12,5 x 5 cm) DEAE-sepharosy 4B, která byla stabilizovánapufrera A. Kolona, byla promyta 700 ml pufru A a 1 litrem puf-ru s pH gradientem, který se měnil od pufru A k pufru o slo-žení 100 mM fosforečnanu draselného, 10 mM merkaptoethanolu,1 mM EDTA, pH 7,0. Frakce o specifické aktivitě větší než0,20 jednotek/mg byly spojeny a byl k nim přidán pevný sí-ran amonný tak, aby se dosáhlo 50 % nasyceni. Ve frakci seutvořila peleta. Peleta byla rozpuštěna v 8 ml pufru o slo-ženi 10 mM Tris, 10 mM /3 -merkaptoethanol, pH 7,0 (pufr B).Rozpuštěná peleta byla zkoncentrována na 50 % pomocí síra-nu amonného přídavkem 1,5 objemu nasyceného roztoku síranuamonného v pufru B. Tato suspenze síranu amonného obsahova-la 3,5 jednotky/ml se specifickou aktivitou 0,23 jednotky/ml a neměla aktivitu isopentenyldifosfát isomerasy. Tatosuspenze síranu amonného byla použita pro syntézu /4 - ^4C/farnesyldifosfátu a její aktivita byla stabilní alespoň 6měsíců při skladování při 4 °C.

Enzymatická syntéza /4 - ^4C/ farnesyldisfátu14 V rotačním odpařováku se z 55 |jCí /4- 0/ isopentenyl- difosfátu (47,9 pCi/pmol^) odstraní rozpouštědlo (ethanol: 0,15 N NH^OH, 1:1). K odparku bylo přidáno 600 mikrolitrůroztoku o složení 100 mM Tris, 10 mM MgCl^, 4 mM dithiothreitol pH 7,5. Výsledný roztok byl převeden do 1,5 ml Eppendor-fovy centrifugačni zkumavky. Pro zahájeni reakce bylo při-dáno 250 /Ul geranyldif osf átu (koncentrace 20 mM) a 50 ,ulsuspenze síranu amonného s přenyijtransferasou. Tento inku-bovaný roztok obsahoval 5 yumol geranyldifosfátu, 1,15 ^umolisopentenyldifosfátu, 6 ^umol mgCl2 s 0,18 jednotkami pre-nyl^transferasy v objemu 900 ^ul. Inkubace se prováděla při37 °C. Během inkubace se směs bíle zakalila, jak nově vznik-lý komplex hořčíku s farnesyldifosfátem vypadával z roztoku./4 - ^4C/ farnesyldifosfát byl získán po 3 min odstřelovánipři 14 000 min"\v Eppendorfově centrif ugačni zkumavce.

- 12 -

Supernatant byl odstraněn a palota byla rozpuštěna v 1,0 tniroztoku o složeni 50 mM HEPES, 5 mM EDTA, pH 7,5. Výtěžekčinil 50,7 yUCi (92 %) /4-^0/ farnesyldifosfátu. /4 - ^4C/farnesyldifosfát byl skladován v alikvotních podílech při- 7.0 °C.

Stanovení skvalen syntetasy

Reakce se prováděly ve zkumavkách o rozměrech 16 x 125mra se šroubovým uzávěrem. Dávka směsi pro stanoveni byla při-pravena z následujících roztoků: objem pro pl na stanoveni 50 stanoveni (pl) 1. 250 mM Hepes pH 7,5 20 1000 2. NaF 110 mM 10 500 3. MgCl2 55 mM 10 500 > 4. Dithiothrsitol 30 mM 10 500 5. NADPH 10 mM (čerstvě připra- vený) 10 500 6. /4-^C/farnesyldifosfát r. / 47,9 pCi/pmol , a 3,0 150 £ 0,025 pCi/3,0 pl 7. H20 24 1200 Ě Tato směs pro stanovení se odplyni pomocí vakua a pro- ! ' plechováním dusíkem. Roztoky inhibitorů skvalen syntetasy £ se připraví bučí v DMSO nebo v MeOH. Mikrosomálni proteinse zředí 1 : 120 původním homogenizačnim pufrem. Pro kaž-dou reakcí se odebere 87 pl směsi pro stanovení a 3 plroztoku inhibitoru (DMSO nebo MeOH pro kontrolu). Roztokse na vodní lázni zahřeje na 30 °C. Potom se zahájí reakcepřídavkem 10 jjl mikrosomálniho proteinu zředěného 1 : 120(při stanovení se použije celkem 0,6 jug proteinu). Reakcese po 20 min zastaví přídavkem 100 pl směsi (1:1) 40 % KOH a 95 % EtOH. Směs se 30 min zahřívá na 65 °C a potom

.'.'.'Dač:; > v, - 13 - ochladí. Potom se přidá 10 ml heptanu a směs se zamíchá.Dále se přidají 2 g aktivovaného oxidu hlinitého a směsse opět zamíchá. Oxid hlinitý se nechá usadit a odstraníse 5 ml heptanovó vrstvy. K heptanovému roztoku se přidá10 ml scintilační kapaliny. Radioaktivita se stanoví spočí-táním scintilaci v kapalině.

Inhibice (%) se vypočítá podle vzorce: (zkoušený vzorek-slepý pokus)^θθ(kontrolní vzorek-slepý pokus)

Hodnoty IC^q se urči vynesenímzkoušené sloučeniny proti inhibicica inhibitoru, při níž dochází k 50odečte se shora uvedeného grafu. logaritmu koncentracev %. 1C5O j® koncentra % inhibici, která se

Data, IC50 uvedená níže, jsou reprezentativní pro inhibiční aktivity sloučenin podle tohoto vynálezu vůči skvalensyntetase:

Sloučenina skvalen syntetasa

IC 50

A 3

Sloučeniny podle vynálezu vykazuji také širokéspektrum antifungální aktivity, což bylo stanoveno zředo-vacími metodami v mediu a agaru. Tyto sloučeniny jsou zvláště účinně proti vláknitým houbám a kvasinkám včetně Candi-da albicans a Crypt. neoformans. Citlivost vláknitých huba kvasinek byla stanovena pomoci zředováni inhibitoru namikrotitrových plotnách. Sloučeniny podle tohoto vynálezu ΆΛϊ^?-.ί·;ίί:ΐ', - 14 byly rozpuštěny v OMSQ (2 mc/rnl) a na mikrctitrové plotnassricvě zředěny O,?. M fosfátovým pufren o pH 7,3 na kcr.csn -óraci od ICO do 3,CCS pg/mi. 3yla připravana .3 tancardni suspan·zs spor pro testováni vláknitých hub naočkováním artibioti-kového radia č , 3. Toto medium obsahuje 1,3 ;< sgaru a tako-vým množstvím spor, ža na jednu jamku připadá 1,3 x IC' jed-notek-'tvořících kolonie.· Mikrotítrov.é jamky se naplní 30 plpuíru, ktarý obsahuje zkousanou sloučeninu a 30 ul naočko-vaného media, Citlivost kvasinek ss stanoví naočkováním kva-sinkové dusíkaté baze, která obsahuje 1 % dextrcsy (YNB/G),slikyotními podíly 24 h staré kultury kvasinek, pastované v"Yaast Morphology" (YM) madlu a zředěné v YNB/G na koncentra-ci, která Odpovídá konečné koncentrací 1,3 - 7,5 x 10““ jed-notek tvořících kolonie na jamku, Ma jádru jamku ss dává150 pl naočkovaného media, Tro zkoušeni citlivosti kvasinekS3 zkoumaná sloučenina rozpustí v 10 %-ním vodném roztokuDMSO v množství 2,56 mg/ml. Zkoumaná sloučenina sa sériovězředí v YNB/G na koncentraci od 128 do 0,06 pg/ml. Oamky senaplní 150 ρ,Ί media, které obsahuje účinnou sloučeninu. Mi-nimální ínhibični koncentrace (MÍC) je definována jako nsj-nišší koncentrace, která zabráni růstu po 42 hodinové inku-bači, při 23 ,°C pro vláknitá houby a po inkubaci, trvající24 až 43 hodin, při 35 °C pro kvasinky. Minimální funcicidníkoncentrace v jjc/ml se definuje jako nejnižší koncentrace účinné sloučeniny, která úplně zabrání růstu nebo dovolírůst ne více nsž tří kolonií. Cako reprezentativní hodnotyentifunoální aktivity jo mcžno uvést následující minimálníínhibični koncentrace a minimální fungícidní končenirace,

Minimální ínhibični koncentrace (pg/ml)

Organismus vláknitá houby A. fumipatus MF4839A. riavus MF3S3A. niqer MF442 sloučenina sloučenina 3 6,2 > 123 6,2 > 123 25 < Λ

mí· íjt' - 15 -

Fus. oxysporum MF4O14

Pen. italicum MF2819Coch. miyabeanus MF4626T. Mentagrophytes MF4864 sloučenina A sloučenina B>100 6,2 1,6 4 >128 kvasinky

sloučenina A sloučenina B C. albicans MY1O55 · C. tropicalis MY1O12C. parapsilosis MY1010Crypt. neoformans MY1051 8 >128 4 >128 8 . >128 1 >128 kvasinky

Minxální fungicidní koncentrace //Ug/ml)

sloučenina A sloučenina B C, albicans MY1O55C^ tropicalis MY1012 parapsilosis MY1010Crypt. neoformans MY1051 4 >128 2 >128 2 >128 0,5 >128

Sloučeniny podle tohoto vynálezu je možno použít taképro léčení fungálních infekcí. Pacientovi se může za účelemdosažení léčebného účinku podávat netoxidké terapeuticky účin-né množství sloučeniny strukturního vzorce I nebo její farma-ceuticky vhodné soli. Na základě výše uvedených MIC a MFC úda-jů se zjistilo, že obvykle by mělo být užito při antifungálnímléčení v jedné dávce množství látky od 2 do 5 mg/kg. •Sloučeniny podle tohoto vynálezu se dají přizpůsobitpro použití v různých formách antifungálních přípravků. Přitakovém použití se sloučeniny podle tohoto vynálezu mohousmísit s biologicky inertním nosičem, obvykle s pomocí povrcho-vě aktivního disperzního činidla. Povaha tohoto činidla sebude měnit v závislosti na tom, zda se zmíněný přípravek mápoužít pro potlačení patogenů, způsobujících in - χι ‘XV&amp;MŽ// 'ΐΚίώ' Λ '; #/# - 16 - fekce u savců, například u člověka, nebo u ptáků nebo uplazů, anebo pro potlačeni hub v zemědělství například půd-ních nebo rostlinných mikroorganismů, nebo pro potlačeni hubv neživých objektech, V přípravcích pro lékařská ..použiti se mohou sloučeni-ny podle tohoto vynálezu smísit s farmaceuticky vhodným no-sičem, jehož povaha se bude měnit v závislosti na tom, zdaje přípravek určen k zevnímu použití nebo k parentálnimu ne-bo orálnímu podáváni, □estliže je přípravek určen k zevnímu použití, může seléčivo zpracovat do podoby obvyklého krému nebo masti, jakonapříklad za použiti bílé vazelíny, bezvodého lanolinu, ce-tylalkoholu, základu pro pístový krém, glycerylmonostearátu,růžové vody a podobně.

Pro parentální použití se sloučeniny podle tohoto vy»nálezu mohou zpracovávat na obvyklé parentální roztoky, jakonapříklad na roztoky v 0,85% roztoku chloridu sodného nsbo5% roztoku dextrosy ve vodě nebo v jiných farmecauticky vhod-ných nosičích. Přípravky pro orální podávání se mohou připravit doko-nalým smísením léčivých složek s jakýmkoliv obvyklým farma-ceutickým nosičem. Pro kapalné přípravky se používá kapalnýchnosičů, jako je například voda, glykoly, oleje, alkoholya podobně. Pro tuhé přípravky, jako jsou kapsle, tablety,se používá tuhých nosičů, jako jsou škroby, cukry, kaolin,ethylcelulosa, povrchově aktivní dispergačni činidla, obvyk-le s mazadlem, jako je stearát vápenatý, společně s pojivý,dezintegracnimi činidly a podobně.

Tyto přípravky se potom podávají v'množstvích, kterájsou dostatečná pro dosaženi žádaného antifungálního efektu.Při lékařském použiti se může pacientovi podat za účelemdosažení léčebného účinku terapeuticky antifungálne účinné Α-'ί’Υχ 1 ,Γ ÍC/rtl \ 1 "> J \ 1 s. U ϊJ ί &amp; C.\ř χ ίι 4 ί - 17 - množství sloučeniny vzorce I. Vhodné dávky se budou měnitv závislosti na věku, vážnosti choroby, tělesné hmotnostia jiných aspektech. Při zevním použití se přípravky apliku-ji přímo na místo léčení. Při vnitřním podávání se přípravekmůže podávat injekčně nebo orálně.

Pro nelékařskó použiti se produktu podle tohoto vyná-lezu může užívat bu3 samostatně nabo ve směsi ve formě pří-pravku obsahujícího také inertní nosič. Tento nosič můžezahrnovat jemně rozdělená pevná nebo kapalná ředidla, plni-va, nastavovadla, upravovači přísady a excipienty, jakojsou různé jilytrozsivková zemina, mastek a podobně, nebovoda a různé organické kapaliny, jako například alkanoly,například sthanol a isopropylalkohol nebo petrolej, benzen,toluen a jiné^destilační frakce ropy nebo jejich směsi.

Tyto přípravky se mohou použít nanesením na povrch ne-bo přidáním do prostředí, které má být chráněno. 'Pro potla-čení Pyricularia oryzae u rýže, septoridzy a jiných fungál-nich onemocnění rajčat, jako je fusarióza apod, rez pšenič-ných listů, padli ujfazoli se uvedené přípravky mohou apli-kovat přímo na rostlinu při zevním použití nebo se mohoupřidávat do půdy při systemické aplikaci. Sloučenin podlevynálezu se přitom používá v antifugálně účinném množství. Následující příklady ukazují přípravu sloučenin vzorceI a jejich zpracování do podoby farmaceutických přípravků.Tyto příklady se nemohou brát jako omezení patentových ná-roků, které jsou uvedeny dále. Přednostní cesta pro získá-ni sloučeniny A je popsána v příkladu 2.

Složení medií, kterých bylo použito v následujícíchpříkladech, jsou uvedena níže: 38«8Ββ - 18 - KF zákvasné MEDIUM roztok stopových prvků na litr 371 Corn Steep Liquor 5 g FeSO4.7H2O 1,0 rajčatový protlak 40 g MnSO4.4H2O 1,0 ovesná mouka 10 g CuC12.2H20 0,025 glukóza 10 g CaCl2.2K2O 0,1 roztok stopových h3bo3 0,056 prvků 10 ml (NH4)6MO7°24'4H2° 0,019 upraveno na 6,8 (před sterilizací) ZnS04.7H2O 0,2 50 ml media v 250 ml

Erlenmeyerově baňce bez míchacích narážek rozp ústěno v 1 -(/ 0,6 N sterilizováno v autoklávu20 minut (121°C, 103 kPa) MBM produkční medium g/1 sladinový extrakt(Difco) 5,0 glukosa 15,0 peptan 1,0 KH2PO4 1,0 MgSO4 0,5 destilovaná voda 1000,0 ml (pH neupravováno) 45 ml media v 250 ml Erleumeyerově baňce bez míchacích na-rážek sterilizováno v autoklávu 15 min (121 °C, 103 kPa) Příklady provedení vynálezu Příklad 1

Příprava sloučeniny A A. Kultivace MF 5453 tyl,ώ.'ί> iS-<- -CíS„.. k.>!. ...vf-,, 1¾. I»y. ...Z,,,. ΪΜ.,.^υ - 19 -

Kultura MF 5453, naočkovaná ze zkumavky s půdou jednoulžičkou půdy (použije se skleněné lžičky) se pěstuje v KFzakvasném mediu 73 hodin při 25 °C, při intenzitě třepání220 min-l ,při 85% vlhkosti. Na konci tohoto inkubačního obdo-bí se aseptičky převedou 2 ml alikvotního podílu do každé ze75 baněk sMBM produkčním mediem. Tyto produkční baňky se potominkubují při 25 °C, intenzitě třepání 220 min^, 85% vlhkosti.Fermentační cyklus trvá 14 dní. Baňky se sklidí následovně:mycelární hmota se 20 s homogenizuje při vysoké rychlosti vmixeru Biohomogenizer/mixer (Biospec. Products lne. BartlesvilleOK) a potom se do, každé baňky přidá 45 ml methanolu (výslednákoncentrace methanolu je asi 50%). Baňky se potom vrátí na tře-pačku a 30 min se třepou při rychlosti 220 min \ Potom se obsahy baněk spojí.

B. Izolace sloučeniny A 6 litrů homogenizovaného houbového extraktu v 50%-nímmethanolu o pH 4,5 se zpracuje následujícím izolačním postu-pem. Mycelium se přefiltruje přes celit. Získané mycelium seopět extrahuje přes noc mícháním ve 3 1 50% methanolu a směsse opět přefiltruje.

Spojený extrakt v 50%-ním methanolu /9 1/se zředí vodouna 25%-ní roztok methanolu (celkový objem 18 1) a nadávkujese do kolony Mitsubishi HP-20 /750 ml/ při průtokové rychlosti80 ml/min. Kolona se promyje vodou (1 1) a eluje se stupňovi-tým gradientem methanolu, který se vytvoří z roztoků methanol/voda (50:50) (1 1), methanol/voda (60:40) (1 1), methanol/voda (80:20) (2 1), methanol/voda (90:10) (1 1) ,100%-ní methanol (21) a 100 % -ní aceton (1 1). Frakce methanol/voda od. složení50:50 k 90:10 se spojí a zředí vodou na roztok methanol/voda(35:65) (celkový Objem 10 1). 10 1 roztoku methanol/voda (35:65) se okyselí, 1,0 N HC1 (20 ml) na pH 3,0 a extrahuje se do ethylacetátu (4 1). Ethyla- cetátová vrstva se oddělí a rozpouštědlo se za vakua odpaří, čímž se získá 260 mg oranžového oleje.

- 20 - Část oranžového oleje (10 %) se rozpustí v 1 ml metha-nolu a zředí se 0,8 ml roztoku 10 mM fosforečnanu draselného(pH 6,5) . Tím dojde k částečnému vysrážení. Suspenze se nanesena preparativní HPLC kolonu (Whatman Magnum 20 C-^g, 22 mmID X 25 cm, průtok 8 ml/min). Počáteční mobilní fází je roz-tok methanol /10 mM K^PO^ (pH 6,5) (60:40) a po 20 minutách se mobilní fáze změní na roztok methanol/10 mMpígPO^ (pH 6,5)(80:20). Sbírají se frakce po 8 ml. Frakce od 31. do 33. minu-ty (2) se spojí a zředí vodou tak, aby koncentrace methanolubyla 35%. Dále se tento roztok okyselí 10% HC1 na pH 3a extra-huje se do ethylacetátu. Rozpouštědlo se za vakua odpaří azíská se čirý světle žlutý olej, který je identifikován jakouvedená sloučenina. Příklad 2

Příprava sloučeniny A A. Kultivace MF5453 250 ml Erleumeyerova baňka, která obsahuje 54 ml zákvas-ného media (KF) se naočkuje kulturou MF 5453. Inkubuje se 72 h,.při 25 °C, 85% vlhkosti a intenzitě třepání 220 min-.10 ml kul-tury se potom převede do každé ze tří 2 1 Erlenmeyerových ba-něk s obsahem 500 ml KF zákvasného media. Tyto baňky se kulti-vují 44 h, při 25 °C, 85% vlhkosti a intenzitě třepání 220 min750 ml výsledné kultury se použije pro očkování každého ze dvou22 1 fermentorů s obsahem 15 1 MBM produkčního media. Podmínkysterilizace jsou následující: 122 °C, 103 kPa, 25 min. pH me-dia po sterilizaci je 5,0. Ferméntační podmínky jsou: 25 °C,rychlost míchání 300 min \ rychlost průtoku vzduchu 4,5 1/mina protitlak 35 kPa. Po 357 h kultivace za těchto podmínek sevsádkysklidí.

B. Izolace sloučeniny A V tomto izolačním postupu se používají tři nezávislé fermentace (3 1), (10 1) a (10 1) . Fermentace ve 3 1 se kulti- ή' γ5νh, Λ ' > ν/Ο* ί - 21 - vuje podle postupu z příkladu I A a obě fermentace v 10 1se kultivují podle postupu z příkladu 2A. Všechny fermentacese přefiltrují přes celit a mycelia se samostatně extrahují2x 24 hodin 50 % methanolem. Pro fermentaci ve 3 1 se použije1 1 methanolu, pro fermentace v 10 1 se použijí 3 1 methanolu. Všechny filtráty a extrakty se spojí a zředí se vodouna výslednou koncentraci methanolu 25% (celkový objem činí45 1). Tento roztok se nadávkuje na kolonu Mitsubishi HP-20(1,5 1) při průtokové rychlosti 100 ml/min. Potom se kolonapromyje vodou (41) a 40 % methanolem (6 1). Dále se kolonaeluuje 100 % methanolem (61).

Eluát HP-20 100 % methanolu se zředí roztokem 10 mMH3PO4 (6 1, celkový objem 12 1) a extrahuje se do CH2Cl2(4 1). Rozpouštědlo se za vakua odpaří, čímž se získá 21 gžlutého oleje.

Tento koncentrát se rozpustí v methanolu (500 ml) azředí se roztokem 20 mM K^PO^ o pH 7,0 (500 ml). Vzniklý roz-tok se nadávkuje na kolonu Dowex 1X1 (či ) (350 ml) při průtokové rychlosti 25 ml/min. Kolona.se promyje roztokemmethanol/voda (50:50, 2 1), methanol/ 3% roztok NaCl (50:50, 1 1), a produkt se eluuje 2 1 roztoku methanol/vodný 30 %roztok NH^Cl (90 : 10). Eluát methanol/NH^Cl se zředí 2 1roztoku 20 mM H^PO^ a extrahuje se 2 1 CH2C12- Rozpouštědlose za vakua odpaří a tím se získá hustý oranžový olej. Část tohoto oranžového oleje (24 mg) se rozpustí v 1 ml methanolu a přidá se 0,4 ml roztoku 10 mM H^PO^, čímž se roztok zakalí. Tato suspenze se nanese na preparativní HPLC kolonu (Whatman Magnum 20 C, o, 22 mm ID x25 cm, průtok

-L O 8 ml/min. mobilní fáze methanol/roztok 10. mM H^PO^ (pH 2,5)(80:20)). Frakce eluátu získané mezi 16. a 20. minutou sespojí, zředí se roztokem 50 mM H^PO^ (50 ml) a extrahujíse CH2C12 (2x 75 ml). CH2C12 se odstraní za vakua a získáse světle žlutý olej . Tato látka má totožné ^"H-NMR a UVspektrum se sloučeninou A, izolovanou v příkladu 1. y v yyMfcyb > V» . χ, - 22 - Příklad

Specifickým příkladem orálního přípravku sa sloučeni-nou podle tohoto vynálezu je tvrdá želatinová kapsle val: kosti 0.20 mg sloučeniny podle;příkladu i sa smísí s ta-kovým množstvím jemně rozemleté laktosy, aby se získalocelkem 530 až 590 mg směsi. Touto směsí sa naplní kapslez tvrdé želatiny velikosti 0, Příklad 4 Příprava amonné soli 0,1 mmol vzorkurozpustí v 10 mlplynným amoniakemsůl. se tl ná volné kyseliny sloučeniny vzorce Iethylacetátu. Výsledný roztok sa nasy-, při čemž se v roztoku vysráží amon- Přiklad 5 Příprava draselné soli

Na roztok 0,1 mmol volné kyseliny sloučeniny vzorce Σv 10 ml methanolu ss nechá působit vodný nebo methanolovýroztok, obsahující 0,3 mmol hydroxidu draselného. Odpaře-ním rozpouštědla vznikne tri-araselná sůl. Analogicky vznik-ne směs mono-drasalných, di-draselných a tri-draselnýcb so·»·li při přídavku 0,1 až 0,5 mmol hydroxidu přidaného hydro-xidu draselného. Podobně sa dají vytvořit sodné a lithnésoli. Příprava vápenaté soli Příklad *&amp;>&amp; t iCÍÍ tói 1 $&amp; V H t i ? / í5/V,V,M*$ ) ? ík í >t?

Ns roztok 0,1 mmol volné kyseliny sloučeniny vzorce I,ve 20 ml směsi methanol/voda /5:4/ se působí vodným roz-tokem 0,1 smol hydroxidu vápenatého, Rozpouštědla se od-oaří a tím sa získá vápenatá sůl. r *» lad Příprava soli ethylendiaminu

Na roztok 0,1 mmol volné kyseliny sloučeniny vzorce Ϊv 10 ml methanolu sa nechá působit 0,1 mmol ehtylendiaminu.Odpařením rozpouštědla se získá sůl ethylendiaminu. Tentopostup se může také použít při přípravě soli N,N" -dibenzylethylendiaminu. Příklad 8 Příprava soli tris(hydroxymethyl)aminomethanu i< roztoku 0,1 mmol volné kyseliny sloučeniny vzorce Iv 10 ml methanolu se přidá 0,1 až 0,3 mraol iris(hydroxy-methyl) aminomethanu rozpuštěného v 10 ml methanolu. Odpa-řením rozpouštědla se získá odpovídající solná forma, jerjíž přesné složení je určeno Polárním poměrem sloučeninyvzorce 1 a přidaného aminu.

Tento způsob se může použít i pro jiné aminy jakonapř. pro diethanolamin a disthylamin, ale není omezenjen na tyto dva příklady. Příklad 9 Příprava soli L-argininu

Na roztok O,?, mmol volné kyseliny sloučeniny vzorce Iv 10 ml směsi methanol/vcda (5:4) se působí vodným rozto-kem, který obsahuje 0,1 až 0,5 mmol L-argininu, Odpařením -Ά - 24 - přesné složenípoužité volnéL-ornithinu,., rozpouštědla se získá příslušná sůl, jejížje určeno molárním poměrem aminokyseliny akyseliny vzorce I. Podobně se připraví soli L-lysinu a N-mathylglukaminu. o li ' P Ί n 1 n

t i i K J. c3 -i. V Příprava sloučeniny 3 (způsob 1)

Na roztok 90 mg sloučeniny A v 5 ml ethyiacetátu sepůsobí mírným přebytkem diazomethanu v etheru. Po 5 min.se přebytek diazomethanu odstraní a rozpouštědlo se odpaří,aby se získala sloučenina 3. Přiklad 11 Příprava sloučeniny 3 (způsob 2)

Na roztok- 2 mg sloučeniny A v 0,5 ml acatonitrilu sepůsobí při laboratorní teplotě 10 ekvivalenty OSU a 10ekvivalenty Mel. Po 2 hodinách se reakčni směs zředí 10ml dichlormathanu a promývá se postupně 10 ml 0,1 M roz-toku kyseliny fosforečné, 10 ml vody, 10 ml nasycenéhoroztoku hydrogenuhličitanu sodného a 10 ml vody. Po vysušenísíranem sodným se organická vrstva zkoncentruje. Zbytek seohromatograficky dělí na silikagelu. Oako elučni činidlose použije směsi hexanu a ethyiacetátu. Tímto způsobem sezíská sloučenina 3.

Způsob podle příkladu 11 je taká vhodný přo přípravujiných esterových derivátů, jako 1) athylesterů a jinýchnižších alkylestarů 2} benzylasterů a substituovaných ben-zylasterů. údaje z hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektra se proměřují na hmotnostních spekt- rometrech Finnigan-MAT model MAT212 (ráz elektronů (elect- γΛ'·λ' ron impact) ΕΙ, 90 eV), ΜΑΤ 90 bombardování rychlými ato-my (rast Atom 3ombardment), FAB), a TS070B (FA3, ElJ. Přesná hmotnostní spektrometrická měření se provádí přivysokém rozlišení (high resolution) (HR-EI) s použitímperfluorovaného petroleje (FFK) nebo perfluorovaného pro-pylenoxidu (Ultramark U 1500 F) jako vnitřního standardu.Trimethylsilyl deriváty se připraví se směsí 3STFA-pyri~din (1:1) při laboratorní teplotě. JÚdaje z ^3C NMR: NMR spektrum sloučeniny se měří v CD-,00 při 100 MHz na Varian XL400 spektrometru*Chemické posuny se udávají v ppm. Oedná se o hodnoty re-lativní, vztažené k tetramethylsilanu (TMS). (TMS - O ppm).Pik rozpouštědla je při 49,0 ppm, rozpouštědlo je vnitřnímstandardem, °C NMR spektrum sloučeniny 3 se měří při 75. MHz (při okolní teplotě) na spektrometru Varian XL 300v CgDg. Pik rozpouštědla jo při 123,0 ppm, rozpouštědloje vnitřním standardem. •^H NMR Spektra NMR spektra se měří při 400 MHz v CD^OD a CRD^ naVarian XL400 spektrometru. Chemické posuny se udávají vppm, Oedná se o hodnoty relativní, vztažená k tetramethyl-silanu (TMS)· (TMS - Oppm). Píky rozpouštědel jsou při3,30 ppm pro CD^OO a při 7,15 ppm pro CgDg. Rozpouštědlajsou vnitřními standardy.

Fyzikální vlastnosti sloučenin strukturního vzorce I:

Sloučenina A je sloučenina strukturního vzorce I, kdo všech·ny symboly Z^, Z9 a Z- představují vodíková atomy. Údaje z hmotnostní spektrometrie

Tato sloučenina má molekulovou hmotnost 690, zjiště·nou pomocí FAB-MS /pozorováno /M+H/+ při m/z 691, a s 't M<\'<v’’'"-z’1'</''? i?* /·’ r\ l?'-\ VÍS.vWl^YÍVí'’- - éX) ořídavkem acetátu lithnóho /M.Li-, + Li/* (t.j. adukt lithia, * o tri-lithná sůl) při m/z 715)« Sumární vzorec C 35^45^4 sestanoví měřením penta-trimothylsilyi derivátu na HR-EI (vy-počteno pro C~5^45θ14*ί^ίΟ^Ηθ)^ 1050, 4864, nalazano 1050,4329. Jiné kritické fragmenty iontů sa - dají pozorovat vsilyl-spektru:/ M-AcOH /*, spočtano pro ^33^440^3+ (Sic3Hg)5990,4597 nalezeno 990,4625 ; 033^50^0+(SiC^Hg)^ spočteno749,3015, nelezeno 749,3022; / M-(COgH+SiC-Ηθ) /+, spočtenopro 0341^4^0^^ + (SiC-^Hg^, 933,4458, nalezeno 933,4450; Ο-^θΗ^Οθ·{·(SiC^Hg)4, spočteno 631,2974, nalezeno 631,2944. ~H NMR spektrum (CD-ODt/4Q°C): viz obr. 1. 13C NMR Chemická posuny, (OD^OD, 40°C)t 11,5, 14,3, 19,4, 20,6, 21,0, 26,7, 30,8, 33,3, 35,2, 35,6, 37,9, 41,0, 44,5, 75,8, 76,8, 30,4, 81,3, 82,7, 91,3, 106,9, 111,7, ±20,0, 127,0, 129,4 (2x), 130,3 (2x), 141,7, 147,9, 157,6, 166,8, 168,7, 170,3, 172,2, 172,7 ppm. UV (mathanol) maximální vlnová délka 209 nm (£. = 36,000IRfpro volnou kyselinu;film na ZnSe): 3400-2500 br, 2960,2930, 287-5, 1745-1700, 1650, 1450, 1375, 1280-1225, 1185,1135, 1020, 985, 750 a 700 cm“1.

Sloučenina 3 je trimethylaster sloučeniny A, t.j. sloučeni-na strukturního vzorce I, kde všechny symboly 2^, 2^ a 2gpředstavují methylskupiny. Údaje z hmotnostní spektrometrie

Tato sloučenina má molekulovou hmotnost 732 zjištěnoupomocí ΞΙ-MS a tvoří di-(trimethylsilyl) derivát. Sumárnívzorec ^33^52^14 SQ stanovl přímo měřením pomocí HR-EI (Spoč-teno 732,3357, nalezeno 732,3329). f η'·»7*? (/ /’ / ‘->. i.j>b i. i.» . IL.V; % ι'λίΛ-^A'ví ' >?'!&amp;“ -, U V*.*JřA .»&amp;/»·>V; ító í

' ;ί<?^ V ~H NMR Spektrum {CgOg, 22°c'): viz obr. 2. 13 C NMR Chemické posuny (C^B^> 75 MHz): 11.3, 14,0, 5,3, 30,0, 32,1, 34,5, 34,7, 37,1,2,1, 53,3, 75,3, 75,2, 78,8, 82,0, 18,9, 20,2, 20,6, 40,2, 43,3, 51,9, 32,8, 89,3, . 106,2 129,6 (2x), 140,9 169,5 i 1/0, 3 pp®.

Claims (8)

1. kde Z1, a Z jsou nezávislá na sobě vybrány ze skupiny ‘i zahrnující έ a) vodík, b) alkylskupínu s 1 až 5 atomy bliku, c) alkylskppinu s 1 až 5 atomy uhlíku substituova-nou členem skupiny, která se skládá z i) fenylu ii) fenylu, který je substitu-ovaný methylem, methoxyskupinou,halogenem (Cl, 3r, I, nebohydroxyskupinou} nebo farmaceuticky vhodné soli sloučenin obecného vzorce Z,v nichž alespoň jeden ze symbolů Z.-, a Z-, představujevodík.
2. 2, Sloučeniny podle nároku 1, v nichž relativní kon-figurace strukturního vzorce Z je O

   Μξ Me ¢1)

   II.
3. 3. Sloučeniny podle nároku 2, v nichž symboly Z^, Z? a Z- představují atomy vodíku nebo jejich farmaceuticky vhod-né soli.
4. 4. Sloučeninv podle nároku 2, v nichž symboly Z,, Z.-,a Z-, představují methylskupiny.
5. 5. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, žeobsahuje netoxické terapeuticky účinné množství sloučoninypodle nároku 1 a farmaceuticky vhodný nosič.
6. S. Kultura MF 5453 (ATCC 20SS6) nebo její aktivní mu-tant, schopný produkovat sloučeninu vzorce

   v izolovatelných množstvích.
7. 7. Způsob přípravy sloučeniny vzorce

   Ο»»» III. vyznačující se tím, že se kultura MF 5453 (ATCC 20986) nebojají aktivní mutant kultivuje za podmínek, vhodných pro tvorbuřečené sloučeniny, načež se získaná sloučenina izoluje*
8. 8« Způsob inhibice fungálního růstu, vyznačující se tím,ze na plochu, na které má být růst potlačen, se nanese anti-fungálně účinné množství sloučeniny vzorce I

   (I) kde Ζ^, Zg a Z- jsou nezávisle na sobě vybrány ze skupiny zahr-nující a) vodík, b) alkylskupinu s 1 až 5 atomyuhlíku substituovanoučlensm skupiny, která sa skládá z i) fenylu ii) fenylu, který j'e substituovaný methylem,mathoxyskupinou, halogenem (Cl, Br, I, F) nebo hydroxyskupinouj nebo farmaceuticky vhodné soli sloučenin obecného vzorce I,v nichž alespoň jeden ze symbolů Z^, Z? a Z-, představuje vodík. MP-313-91-HO