PT96123B

PT96123B - Metodo de preparacao de um medicamento para tratamento da infeccao do pneumocystis carinii

Info

Publication number: PT96123B
Application number: PT96123A
Authority: PT
Inventors: Daniel V Santi; Charles K Marlowe
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 1989-12-07
Filing date: 1990-12-07
Publication date: 1998-08-31
Also published as: DE69029814T2; DK0504290T3; WO1991008668A1; CA2069941A1; IE904432A1; WO1991008667A1; DE69029814D1; EP0504290A4; EP0504290B1; PT96123A; ATE147938T1; JPH06504258A; GR3023144T3; ES2098346T3; EP0504290A1

Description

modalidades terapêuticas, trimetoprim/sulfametoxazol e pentamidina, foram desenvolvidas usando a teoria de antiprotozoário.

Trimetoprim e pirimetamina, e outros inibidores da Redutase do diidrofolato (DHFR) (tais como o metotrexato), são conhecidos como sendo anti-neoplásicos eficazes, antibactericidas, e agentes antiprotozoários devido ao papel central desempenhado pela DHFR sintese de novo dos precursores do ácido núcleico. Apesar das suas óbvias eficácias, guando usado em conjunção com a sulfonamida, o trimetoprim e a pirimetamina são, por si mesmos, inibidores pobres da DHFR do P. Carinii [o Índice de concentração inibitório a 50% (IC50) de 39.600 e 2400 nM, comparado respectivamente de 8 e 2.500 nM para a DHFR da E. Coli em concentração de substractos similares]. Outros antifolatos têm sido mostrados como sendo mais eficazes inibidores da DHFR do P. Carinii, mas requerem administração concomitante de leucovorina para prevenir a toxicidade no hospedeiro.

Precedente à epidemia da SIDA, estes tipos de agentes eram suficientes para o tratamento dos casos raros da pneumonia por P. Carinii. No entanto, nos pacientes HlV-positivos, a terapia e profilaxia com os agentes padrão anti-P. Carinii era complicada pelos frequentes efeitos secundários tóxicos e alérgicos. Novos compostos que ultrapassam a eficácia dos conhecidos antifolatos no tratamento da pneumonia pneumocistica são desejáveis, especialmente inibidores com grande selectividade para a DHFR do P. Carinii em relação à DHFR do hospedeiro (especialmente humano), que aqueles que existem para os inibidores conhecidos tais como o trimetoprim.

Literatura Relevante

Um número de compostos de 1-aril-s-triazina e os seus usos no tratamento da malária são discutidos na Patente dos E. U.

5 no 3.074.947. 0 composto anti-malárico N -p-clorofenil-N isopropilbiguanida, também conhecidos como proguanil, que é convertido em cicloguanil, in vivo, é descrito juntamente com um método para a sua produção na Patente dos E. U. no 2.529.992. A relação quantitativa estrutura-actividade da triazina-antifolato, inibição da redutase do diidrofolato da Leishmania e do crescimento da célula, juntamente com as técnicas de sintese para alguns dos compostos usados, são discutidos no Booth et al., J. Med. Chem. (1978) 30:1218-1224.

SUMARIO DO INVENTO

E um objectivo do presente invento fornecer um método de tratamento ou prevenção da pneumonia por P. Carinii usando um inibidor da redutase do diidrofolato que é mais selectivo para a DHFR do P. Carinii, em relação à DHFR do hospedeiro, espeeialmente a DHFR humana, ou tem uma mais alta afinidade para a DHFR do P. Carinii que os inibidores da DHFR correntemente conhecidos, tais como o trimetoprim.

Estes e outros objectivos do invento têm sido realizados pelo fornecimento de um método de inibição selectiva da redutase do diidrofolato do P. Carinii, na presença da redutase do diidrofolato de um mamifero pela administração da 1fenil-s-triazina, a um hospedeiro infectado com P. Carinii. As 1fenil-s-triazinas são compostos conhecidos que são eficazes contra a malária mas que não foram anteriormente usadas no ί

tratamento da pneumonia por P, Carinii. Particularmente preferidas são as triazinas da fórmula:

J em que:

X, Y e Z são independentemente seleccionados do grupo constituido por hidrogénio, hidroxi, halogénio, arilo alquilo inferior, alquilo inferior, tioalquilo inferior, oxialquilo inferior e trifluormetilo;

Rq é um alquilo inferior; e

P.2 ^é hidrogénio ou metilo;

e compostos que sao amidas ou sais de adiçao do ácido formados pela reacção de um ácido orgânico ou inorgânico com uma triazina da dita fórmula. 0 tratamento com um precursor da 1fenil-s-triazina, tal como proguanil, que é conhecido como sendo convertido in vivo em cicloguanil, uma conhecida 1-fenil-striazina antimalárica, é equivalente ao tratamento com a própria

1-fenil-s-triazina.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura é um gráfico mostrando os efeitos de uma série de triazinas substituídas diferentemente, na actividade da DHFR do P. Carinii.

DESCRIÇÃO DAS CONFIGURAÇÕES ESPECIFICAS presente invento fornece um método para inibição do crescimento do Pneumocystis Carinii, num hospedeiro mamifero, pela administração ao hospedeiro de uma quantidade de uma 1fenil-s-triazina, eficaz para inibir o crescimento do Pneumocystis Carinii. As 1-fenil-s-triazinas são compostos conhecidos por serem eficazes como agentes antimalária. No entanto, elas não têm sido usadas no tratamento da pneumonia por P. Carinii, antes do presente invento.

Experiências no laboratório do inventor têm demonstrado que um número de diferentes compostos de 1-fenil-s-triazinas são selectivos na sua capacidade para inibir a redutase do diidrofolato do P. Carinii em relação à DHFR do mamifero. Por exemplo, o composto cicloguanil, que é uma 4,6-diamino-l-(pclorofenil)-l,2-diidro-2,2-dimetil-s-triazina, mostra um Kj_ de 70 nM para a DHFR do P. Carinii, enquanto o seu Kj para a DHFR do humano é de 3000 nM. Assim, o cicloguanil liga algumas 400ligações mais fortemente à DHFR do P. Carinii do que à DHFR do humano.

Em contraste, o dimetoprim, o antifolato mais amplamente usado para tratar as infecções por P. Carinii, é um inibidor pobre da enzima do P. Carinii, e mostra pequena especificidade sobre a DHFR humana. 0 Trimetoprim tem um Ki de 2 μΜ para a DHFR do P. Carinii, e um Ki de 2 μΜ para a DHFR humana. Por isso, não mostra selectividade para a DHFR dos organismos infecciosos.

Por consequência, o cicloguanil e as 1-fenil-striazinas relacionadas e os seus precursores, tanto só ou em combinação com outros agentes, serão mais eficazes que o trimetoprim no tratamento das infecções de mamíferos pelo Pneumocystis Carinii, devida à sua capacidade para inibir selectivamente a DHFR do P. Carinii na presença da DHFR do mamifero, especialmente humana.

Os compostos usados no método do invento sao as 1fenil-s-triazinas e são particularmente preferidas as 4,6diamino-1,2-diidro-l-fenil-s-triazinas, bem como as amidas e sais formados pela reacção de um ácido orgânico ou inorgânico com um grupo amino da triazina. Tais compostos têm tipicamente a fórmula:

em que:

X, Y e Z são independentemente seleccionados do grupo constituído por hidrogénio, hidroxi, halogénio, arilo alquilo inferior, alquilo inferior, tioalquilo inferior, oxialquilo inferior e trifluormetilo;

Rx é um alquilo inferior; e

R2 é hidrogénio ou metilo.

Como é usado na anterior definição, halogénio designa um átomo de fluor, cloro, bromo ou iodo. Alquilo inferior, aqui e em qualquer outra parte, preferivelmente significa um grupo alquilo linear ou ramificado contendo de 1 a 5 átomos de carbono. Os grupos arilo são preferivelmente sistemas carbociclicos ou heterocíclicos contendo um ou dois anéis aromáticos (quando dois anéis, preferivelmente fundidos). Exemplos de anéis arilo convenientes incluem o benzeno, furano, tiofeno, pirol, pirrazol, triazol, isoxazol, oxazol, tiazol, isotiazol, pirano, pirona, dioxima, piridina, piridizina, purimidina, pirazina, triazina, indeno, benzofurano, isobenzofurano, benzotiofurano, indol, naftaleno, cumarina, quinolina, e isoquinolina. Os grupos arilo simples, tais como fenilo, naftilo, e anéis simples heterocíclicos são preferidos. 0 fenilo é particularmente preferido. Os grupos arilo alquilo inferior preferidos são aqueles em que os substitutos arilo e o alquilo inferior têm os significados definidos previamente. 0 benzilo é um grupo arilo alquilo inferior particularmente preferido. Em todos os casos, os substitutos normais encontrados nos anéis aromáticos, tais como halogénio, amino, hidróxido, e grupos amido podem estar presentes e são incluidos dentro do significado de arilo. No entanto, os grupos arilo substituídos só com hidrogénios são preferidos.

Particularmente preferidos são os compostos em que o Y é hidrogénio, halogénio, metilo ou trifluormetilo. Também preferidos são os compostos em que, pelo menos, um dos X, Y ou Z é hidrogénio? especialmente preferidos são os compostos em que X e Z são ambos hidrogénio, particularmente quando Y é cloro,

trifluormetilo, metilo, metoxi ou hidroxi. Os grupos preferidos para o Rp são o metilo e o etilo, e sendo o Ri e R2 ambos metilo é o caso particularmente preferido. Os compostos preferidos específicos incluem cicloguanil e os compostos relacionados, em que o cloro no anel fenilo do cicloguanil é substituido por um trifluormetilo, metilo, metoxi ou grupo hidroxi.

As 4,6- diamino-1,2- diidro-2- alquilo inferior-1arilo-s-triazinas e os seus sais solúveis, usados na prática do invento, podem ser preparados de várias maneiras. Elas podem ser obtidas pela reacção da 1-aril-biguanida de fórmula;

com um aldeideo alifático inferior ou cetona de fórmula:

II na presença de um ácido forte, onde ο X, Y, Z, Rj ou R2 são como os definidos antes. As 1-arilbiguanidas podem ser obtidas pela reacção de um derivado da anilina de fórmula:

com dicianodiamida na presença de um ácido forte; onde X, Y e Z são como os definidos antes. Alternativamente, os derivados da anilina, o aldeideo ou cetona, e dicianodiamida são reactivos na presença de ácidos fortes e o derivado da triazina desejado é obtido directamente. Este método é preferido naqueles casos em que o Rj e o R2 são ambos grupos alquilo inferiores. 0 derivado da triazina desejado é obtido directamente da mistura de reacção como um sal de adição ao ácido ou como uma base livre, a seguir à basificaçâo.

Além das triazinas livres descritas em cima, sais e amidas, formados pela reacção de um ácido inorgânico ou orgânico com um dos grupos amino livres, podem ser usados na prática da invenção. Exemplos de ácidos inorgânicos incluem o clorídrico, bromidrico e os ácidos sulfúricos. Exemplos de ácidos orgânicos incluem qualquer um dos números de ácidos carboxilicos, tais como o ácido acético e vários ácidos gordos. Os sais do ácido pamóico são particularmente preferidos tal como os sais que têm mostrado ser eficazes em proporcionar formas de acção prolongada de triazinas no tratamento de outras doenças. Ver, por exemplo, a Patente dos E. U. no 3.074.947.

A administração de um composto que actua como precursor de uma das triazinas descritas atrás é considerado como sendo equivalente à administração da própria triazina. Por exemplo, o composto proguanil, que é l-p-clorofenil-5-isopropilbiguanida, tem mostrado ser convertido lentamente em cicloguanil (ver atrás), na administração a hospedeiros mamíferos. A maior parte dos precursores são biguanidas de fórmula:

MH - C MH em que X, Υ, Z, e R2 têm o significado definido atrás. Biguanidas podem ser preparadas pelas reacções gerais descritas atrás. Ver, por exemplo, Kurd e outros, J. Chem. Soc. 1946 i 729 e Kurd et al., Ibid 1948; 1630.

O método do invento contempla a utilização de compostos como os descritos atrás, tanto sózinhos ou em combinação com um segundo (ou mais) compostos, para proporcionar um aumento da eficácia contra o P. Carinii. O segundo composto utilizado é tipicamente um que é conhecido (1) para potenciar a actividade do inibidor da redutase do diidrofolato no Pneumocystis Carinii, ou (2) para contrariar ou evitar a acção do inibidor da redutase do diidrofolato no hospedeiro mamifero. Por exemplo, uma sulfonamida ou depsona pode ser usada para potenciar o efeito do inibidor da. DHFR. Estas combinações são conhecidas no tratamento de outros organismos parasiticos, tal como na malária. Por exemplo, a combinação do trimetoprim e uma sulfonamida, tal como o sulfametoxazole, tem sido usada no tratamento de bactérias gram negativas tais como a E. Coli sob os nomes comerciais de Septa e Bactrim, e combinações de uma triazina e uma sulfonamida serão igualmente úteis no caso presente. Alternativamente, o factor citrovorum (CF; também conhecido como Leucovorina; ácido 5formil-5,6,7,8-tetraidrofólico) é conhecido no reverter do efeito inibidor da DHFR, pelo fornecimento de uma fonte directa dos folatos reduzidos. 0 CF tem sido frequentemente usado para reverter os efeitos do metotrexato no tratamento de certos tipos de cancro. No entanto, o CF não entra nas células de Pneumocystis Carinii, logo ele pode salvar as células do hospedeiro, dos efeitos de um inibidor da DHFR do P. Carinii, sem salvamento das próprias células de P. Carinii. Este principio foi previamente aplicado no tratamento da pneumonia por P. Carinii, com antifolatos não específicos, tais como o trimetrexato e piritrexim, que inibe fortemente a DHFR humana. A coadministraçâo do factor citrovorum com uma triazina, tal como o cicloguanil, permitirá doses mais elevadas ou de mais longa duração para serem usadas sem toxicidade causada pela inibição da DHFR humana, que serão possíveis na ausência da fonte de folato reduzido. Outras fontes de tetraidrofolatos podem ser usadas no lugar do CF. 0 5metil-THF é um exemplo de uma fonte diferente de folato reduzido.

As composições, segundo o invento, podem ser administradas per os ou parenteralmente, numa quantidade suficiente para inibir o crescimento do organismo. A morte dos organismos não é requerida, mas é preferida. A dose é ajustada, tal como requerido, para evitar a desnecessária toxicidade para o hospedeiro. 0 tratamento inicial começará usualmente com doses da ordem de 0,1 até 30 mg/Kg de peso corporal, especialmente de 1 até 3 mg/Kg. Como os medicamentos contra a pneumonia, as formas de dosagem unitárias, tais como drageias ou cápsulas para administração oral ou âmpolas para injectar, contendo cada uma de 50 a 200 mg de uma, ou uma mistura de substâncias activas, são preferidas. Tais dosagens unitárias são geralmente administradas de uma a três vezes, eventualmente cinco vezes, diariamente, dependendo da situação do paciente.

Para administração oral, podem ser usados, nesse caso,

em particular, comprimidos, drageias, cápsulas, pós ou grânulos, que contêm a mistura das substâncias activas juntamente com os usuais excipientes e adjuvantes, tais como amido, pó de celulose, talco, estearato de magnésio, açúcar, gelatina, carbonato de cálcio, ácido salicilico, finamente dividido, carboximetilcelulose ou substâncias similares.

Para administração parentérica, em particular para injecções intra-musculares, podem ser usadas suspensões estéreis, por exemplo suspensões oleosas preparadas com a utilização de óleos gordos tais como o azeite, óleo de sésamo, óleo de amendoim, óleo de castor ou um triglicérido sintético, opcionalmente com a utilização simultânea de agentes surfactantes activos tais como o sorbitano, ésteres de ácidos gordos. Além disso, suspensões aquosas podem ser preparadas, por exemplo, com a utilização de ésteres de ácido gordo, sorbitano etoxilatado, opcionalmente com adição de espessantes, tais como o polietilenoglicol ou a carboximetilcelulose.

Para testar a eficácia das composições anti-pneumonia, de acordo com a invenção, as suspensões aquosas para o efeito são administradas a ratos infectados com P. Carinii usando uma sonda esofágica. Os ratos têm a mesma sequência de aminoácido da DHFR que a DHFR humana, de forma que tal administração se correlaciona rapidamente com a administração a seres humanos. Para esta finalidade, os ingredientes activos são dissolvidos em água ou em outros solventes adequados, ou suspensos numa suspensão aquosa a 2% de Tilose, pela adição de 100 mg da composição a ser testada a 1 ml da suspensão de Tilose. A concentração de substâncias activas a serem testadas é ajustada pela adição de água. Uma dose de 0,5 ml por rato, por 20 g de peso corporal, fornece uma dose inicial útil, que pode ser modificada segundo os efeitos que se alcançam. Antes da administração, as suspensOes são tratadas por ultra-sons, até se conseguir uma dispersão uniforme das substâncias aetivas.

As composições do invento podem ser usadas tanto para tratamentos crónicos como para agudos ou para profilaxia. Formas de acção prolongada das triazinas, tais como as biguanidas precursoras ou os sais de pamoato, descritos atrás, são particularmente preferidas para tratamento de infecções crónicas.

Os seguintes exemplos são oferecidos como meio de ilustração e não como meio de limitação.

EXEMPLO

Determinação do IC50 do substituto para das fenil triazinas para a DHFR do P. Carinii

Várias 4,6-diamino-l(p-substituto-fenil)-1,2-diidro2,2-dimetil-s-triazinas (referidas geralmente como substitutos para das fenil triazinas) foram ensaiadas para inibição da actividade da DHFR do P. Carinii. Os compostos foram dissolvidos a várias concentrações (12,25 mM até 50 mM) em água. Um autoverificador de amostras Gilson (Modelo 401/232) foi programado para realizar 8 diluições em séries de 5 de cada composto, nas células de um prato do microtitulador (o volume total de cada diluição era igual a 125 μΐ). Para controlo da actividade total da DHFR do P. Carinii, 125 μΐ de água foram depositados na célula. Os seguintes componentes foram adicionados manualmente à solução de 125 ml resultante: 25 μΐ de BSA a 10 mg/ml (em água),

12,5 μΐ de NADPH a 2 mM (em água), e 62,55 μΐ de DHF a 400 μΜ, 4 x atenuada (tes a 200 mM, BME a 300 mM, EDTA a 4 mM, pH 7,0). O prato do microtitulador foi bem agitado num agitador Titertek durante um minuto. Finalmente, 10 μΐ de DHFR do P. Carinii a 25 nM (em tes a 50 mM, DTT a 5 mM, EDTA a 1 mM, BSA a 1 mg/ml) foram adicionados, e o prato do microtitulador foi, de novo, bem agitado. As condições finais de ensaio eram 100 μΜ de NADPH, 100 μΜ de DHF, 1 nM de DHFR do P. Carinii, e 0,078 μΜ a 25 nM de substituto para da fenil triazina. A taxa de diminuição da absorvância a 340 nM foi medida num leitor do prato do microtitulador Thermo-max (Dispositivos Moleculares) a 25° C.

A actividade de cada composto era expressa como uma percentagem da actividade total da DHFR do P, Carinii. Um gráfico da actividade percentual total, versus o logaritmo da concentração de substituto para da fenil triazina, foi traçado (ver Figura) e usado para determinar uma IC50 para cada composto e, juntamente com o Km do DHF (p.4 μΜ), foi usado para calcular os valores K^.

TABELA

Substituto para	IC50 (100 μΜ de DHF)	Kl
-Cl	20 μΜ	70 nM
-cf₃	25 μΜ	87,5 nM
-ch₃	30 μΜ	105 nM
-och₂	90 μΜ	315 nM
-OH	250 μΜ	875 nM
-conh₂	> 8333 μΜ	> 2900 nM
-no₂	> 8333 μΜ	> 2900 nM
Todas as	publicações e pedidos de	patentes citados
nesta especificação	são aqui incorporados para	referência, como
se cada publicação	individual ou pedido de patente fossem

especifica e individualmente indicados para ser incorporadas para referência.

Apesar do invento precedente ter sido descrito, com algum detalhe, através da ilustração e exemplo, com a finalidade de clarificar a sua compreensão, será rapidamente evidente para os especialistas no ramo , à luz dos preceitos deste invento, que certas alterações e modificações podem ser feitas no mesmo, sem que nos afastemos do espirito ou âmbito das reivindicaçOes anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Um método de preparação de um medicamento para o tratamento da infecção do Pneumocystis carinii, num mamífero hospedeiro, caracterizado pelo facto de compreender a mistura de uma 1-fenil-s-triazina, numa quantidade eficaz para tratar a referida infecção com um veiculo farmacêutico.
2. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a dita triazina ser uma 4,6-diamino1,2-dihidro-l-fenil-s-triazina.
3. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a dita triazina ter a seguinte fórmula:

em que:

X, ¥ e Z são independentemente seleccionados do grupo constituído por hidrogénio, hidroxilo, halogénio, alquilo inferior, alquilo de aril inferior, tioalquilo inferior, alquiloxido inferior e trifluorometil;

Rl é um alquilo inferior; e

R2 é hidrogénio ou metil;

ou a dita triazina é um amido ou um sal de adição do ácido, formado pela reacção de um ácido orgânico ou inorgânico com uma triazina da fórmula referida.
4. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o dito Y ser hidrogénio, halogénio, metil, metoxi, ou trifluorometil.
5. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de pelo menos um de entre X, Y e Z ser hidrogénio.
6. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterizado pelo facto de Y ser cloro, halogénio, metil, metoxi, ou trifluorometil.
7. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto de X e Z serem hidrogénio.
8. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto de Rl e R2 serem ambos metil.
9. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a dita trazina ser um sal da dita fórmula.
10. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o dito sal ser um sal pamóico de adição do ácido.
11. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a dita triazina ser cicloguanil, e sendo administrada como proguanil, estando o dito proguanil convertido em cicloguanil depois se ter sido administrado ao dito hospedeiro.
12. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o dito hospedeiro ser um ser humano.
13. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida quantidade ter entre cerca de 0,1 mg e cerca de 30 mg da dita triazina, por quilograma do dito hospedeiro.
14. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a dita triazina ser administrada simultâneamente com, pelo menos, um outro composto conhecido (1) para tornar possivel a actividade de um inibidor da redutase do dihidrofolato no Pneumocystis carinii, ou (2) para se opôr à acção do inibidor da redutase do dihidrofolato no dito hospedeiro mamifero.
15. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o dito outro composto ser uma sulfonamida.
16. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o dito outro composto ser uma fonte de folato reduzido.
17. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 16, caracterizado pelo facto de a dita fonte de folato reduzido ser factor citrovorum.