PT95904B - Processo para a preparacao de compostos de ferro biodisponivel-albumina e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Processo para a preparacao de compostos de ferro biodisponivel-albumina e de composicoes farmaceuticas que os contem Download PDF

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Description

O presente invente refere-se resíduos de ácido dicarboxí1ico, que b i od i sponí ve 1»
A utilização de complexos de ferro com proteínas para a terapia marcial oral é conhecidas ver, por exemplo, a Patente Italiana N2 1 15© 213, que revelei um adutor de ferro que compreende proteínas succiniladas, que έ obtido pela reacção de sais férricos com proteínas de suporte de origem animal, tais como proteínas provenientes do leite, órgãos ou soro, ou de origem vegetal»
Contudo, uma vez que as referidas proteínas têm uma composição variável, os compostos de composição constante são de difícil obtenção»
Além disso, mesmo apesar de poderem ser obtidos complexos de elevado conteúdo de ferro Café 20 %), a elevada quantidade de ferro nestes derivados também envolve um aumento da viscosidade da solução»
De facto, o derivado succinilado de proteína de ferro, (obtido de acordo com a Patente Italiana NS 1 15© 213) que é utilizado para a formulação farmacêutica apropriada e está hoje em dia disponível comercialmente, contém 5 % de ferro numa base ponderai» A possibilidade de se obterem derivados que dê'm soluções de baixa viscosidade, mesmo quando quantidades bem mais elevadas do que 5 % de ferro numa base ponderai são suportadas por proteínas succiniladas, representaria um melhoramento notável na preparação de derivados para utilização medicinal»
Contudo, o aspecto mais importante a ser melhorado para esta classe de agentes terapêuticos consiste indubitavelmente na κ
redução ou completa remoção dos efeitos gastrolesivos e diarreicos relacionados com o principio terapêutico»
Foi agora verificado? e é o objectivo do presente invento? que utilizando albumina como a proteína para a obtenção dos referidos compostos acilados? se obtêm compostos de ferro biodisponíveis que são altamente solúveis, mesmo quando contêm elevadas quantidades de ferro? que estão substancialmente isentas de toxicidade e que mostram efeitos laterais gastrolesivos e caractecom uma precipihidroxi diarreicos reduzidos» As vantagens referidas? que são rísticas destes medicamentos, podem ser relacionadas solubilidade pobre dos derivados de ferro? ou com com a tação ao nível do intestino, ou com a criação de radicais que derivam da libertação do ferro na forma iónica»
Podem ser utilizadas diferentes albuminas na preparação dos compostos do presente invento? sendo particularmente preferidas a albumina do soro bovino e a lactalbumina altamente puras»
De acordo com o presente invento, as albuminas são aciladas com resíduos de ácido dicarboxilico tais como? por exemplo? as que derivam dos ácidos succínico? glutárico? maleico? málico? malónico? aspártico? glutâmico e semelhantes» é particularmente preferido o resíduo de ácido succínico? que prova ser o mais adequado para o melhoramento de algumas características da proteína? tais como a solubilidade e a degradabilidade por proteases»
Mais particuiarmente? o presente invento refere-se a compostos que compreendem ferro e albumina de soro bovino succinilado? que comportam quantidades de ferro desde 3 até 1© *» numa base ponderai? assim como compostos qus compreendem ferro e lactalbumina succinilada? que comportam quantidades de ferro até
Ξ® % numa base ponderai, sendo ambos estes compostos altamente solúveis»
Os referidos compostos podem ser obtidos em meio aquoso pela reacção das albuminas succiniladas ou aciladas anteriormente mencionadas com iSes ferro, a um pH que se situa numa gama desde 2 até 12, preferivelmente desde 3 até 7» presente invento será descrito com maior detalhe nos seguintes exemplos não limitantes»
Os compostos descritos nos exemplos serão denominados da maneira que se segues
Compostos dos Exemplos í-3s Compostos dos Exemplos 4-5s Compostos do Exemplo 6s Compostos do Exemplo 7s Compostos do Exemplo 8s
Exemplo 1
Ferrossuccinilalbumina» Ferrossuccin i1-1ac talbumina Ferroaspartilalbumina» Ferromalei 1-al bumina»
Ferrog lutari 1 a 1 bumina,,
Preparação de Ferrossuccinilalbumina. com 6 S de conteúdo de Fe numa base ponderai
São dissolvidos 2© g de albumina de soro bovino em 4©0 ml de água» Q pH è ajustado até 8,0 pela adição da NaOH, y São adicionados sm pequenas porçSes, sob agitação, 24 g de anidrido succínico, mantendo—se o pH desde 7,5 até 8 pela adição de NaOH 2 N e mantendo-se uma temperatura constante abaixo dos 25 *C,, preferivelmente a 2® °C» Deixa~se reagir a mistura durante uma hora e, em seguida, baixa—se o pH para 3 ± ®,5 por meia de HCl 2 N» Foriea-se um precipitada branca que é recolhida por centrifugação» excesso de ácido succínico formado é removido por dissolução do precipitado em 4®0 ml ds água a pH - 8, ajustando-se o pH da solução para 3 ± 0,5 por meio de HCl 2 IM» Forma-se um precipitado branco que é recuperado por centrifugação» Este processo é repetido até o ácido succínico ser completamente removido» 0 precipitado final obtido é dissolvido em 400 ml de água, com adição de NaOH 2 N até pH = 8» São rapidamente adicionados sob agitação 7,20 g de FeCl-»«6H^0, equivalente a 1,48 g de Fe. Forma-se instantaneamente um precipitado vermelho acastanhado que é lavado com HCl 0,001 M, recuperado por filtração (ou centrifugação) e seco sob vácuo»
Obtêm-se um pó vermelho acastanhado (19 g) que ê insolúvel em água e se torna solúvel ajustando piara um pH neutro, por adição de NaOH 2 IM» 0 composto .mostra á análise um conteúdo de ferro de 6,1-6,2 % numa base ponderai» Por electroforese sobre acetato de celulose (como se encontra descrito no item 4 abaixo) o composto move-se como uma mancha unitária, na qual se pode determinar o ferro»
Exemplo 2
Preparação de Ferrossuccinilalbumina com 5,8-4,1 % de conteúdo de Fe numa base ponderai composto é preparado como se descreveu no Exemplo 1, mas adicionando 4,8 g de FeCl-»»6H._.Q (equivalente a ©,922 q de composto, movendo-se sob o campo electroforético como uma mancha unitária na qual o ferro pode ser determinado, mostra um conteúdo de ferro de 3,8-4,1 ’Z numa base ponderai»
Exemplo 3
Preparação de Ferrossuccinilalbumina com 9,5—10 Ií de conteúdo de Fe numa base ponderai
São colocados num reactor 2& 1 de água desmineralizada e 1 kg de albumina de soro bovino, obtendo-se uma solução de pH ~
6,7-6,8. Uma solução de NaOH 5 N é aí lentamente gotejada até pH - 7,5 e, em seguida, é adicionado 1,2 kg de anidrido succínico em pequenas porções, mantendo o pH desde 7,2 até 7,5 por adição de NaOH 5 N. No termo da adição, o pH é mantido a 7,5 durante 3€t min e, em seguida, a solução é acidificada até pH ~ 3 com HCl 6 N, sob agitação. 0 precipitado que se obtêm é centrifugado., eompletamente lavado com água desmineralizada e redissolvido em 20 ml de água desmineralizada com NaOH 5 N até pH = 7,5, para se obter uma solução límpida em 30 min» O processo de precipitação a pH ácido e o processo de dissolução a pH básico são repetidos duas vezes»
Em seguida, é lentamente adicionada á solução anterior uma solução de 578,5 g de FeCl^.ôH^O em 10 1 de água desmineralizada mantendo-se o pH desde 6,5 até 6,8 por adição de NaOH 5 N. Em seguida, a mistura é agitada a pH = 6,6-6,8 durante 30 min, acidificada até pH = 3 com HCl 6 N e deixada sob agitação durante 30 min» 0 precipitada é centrifugado e eompletamente lavado com água desmineralizada ajustando-se o pH para 8,5 com NaOH 5 N, Depois de ter sido mantida a pH de 8,5 durante cerca de uma hora, a solução obtida é filtrada através de Celite <300 g)« processa de precipitação a pH ácido e o processo de dissolução a pH básico são repetidos por uma vez. A solução é filtrada sobre Celita C200 g), o produto é precipitado a pH = 3 com HCl 6 M, agita-se durante 3® min e;i em seguida, é centrifugada e completamente lavada com água desmineralizada» 0 sólido castanho escuro é= passado por um crivo e seco sob vácuo a 30 *C, para se obter 1 kg de ferrossuccinilalbumina» composto mencionado em título está preparado.
Exemplo 4
Preparação de Ferrossuccinil-ct-lactalfaufflina com
11-11,45 X de conteúdo de Fe numa base ponderai é colocado num reactor 1 kg de albumina dissolvido em 20 ml de água desmineralizada» A solução que se obtém tem um pH entre 6,7 e 6,8« A proteína é succinilada e purificada a partir do ácido succínico como se descreveu no exemplo precedente» A solução da proteína succinilada ê adicionado í,2 kg de FeCl^.óH^O em 1® 1 de água, mantendo o pH desde 6,5 atê 6,9 por adição de NaOH 5 N« A reacção è levada a cabo como se descreveu no exemplo anterior para se obter, no fim da reacção, 1 kg do composto mencionado em título»
Exemplo 5
Preparação de Ferrossuccinil-a-lactalbumina com
18,3-18,55 λ de conteúdo de Fe numa base ponderai é colocado num reactor 1 kg de α-lactalbumina dissolvido em '2£j ml de água desmineralizada, para se obter uma solução com um pH entre 6,7 e 6,8» A proteína é succinilada e purificada como se descreveu, no Exemplo 3» ã solução da proteína succinilada é adicionado 2,4 kg ds FeCl^.óH^O em 1© 1 de água, •«2* 2-.
mantendo α pH desde 6,5 até 6,9 por adição de NaOH 5 N. A reacção ê levada a cabo como se descreveu no Exemplo 3, para se obter 1 kg da composta mencionado em título.
Exemplo ó
Preparação de Ferroaspartilalbumina com 7,5 '/ de conteúdo de Fe numa base ponderai
São dissolvidos í© g de albumina de soro bovino em 2©© ml de água e α pH é ajustado para 7,2 por adição da NaOH. São adicionados em pequenas porções, sob agitação, í© g de anidrido acetilaspártico, mantendo-se o pH desde 7,2 até 7,3 pela adição de NaOH 2 Μ» A solução é ultrafiltrada, mantendo-se o volume constante por adição contínua e operando-se com uma membrana de ultrafiltração com í© ©©© dalton de separação, durante 3 horas, de maneira a removei-—se o ácido aspártico que passa através da membrana» A solução que contém a albumina aspartilada é recuperada do ultrafiltrc. São adicionados 7,© g de FeCl-^-áH^O: forma-se um precipitado vermelho acastanhado que é lavado cora água a pH = 3, redissolvido ajustando—se o pH para 7,1 e seco por congelação»
Obtêm-se 9,5 g do composto mencionado em título»
Exemplo 7
Preparação de Ferromaleilalbumina com 6,5 7. de conteúdo de Fe numa base ponderai composto de ferro è preparado como se descreveu no Exemplo 6, mas utilizando-se anidrido maleico como agente de acetilação» composto mencionado em título está preparado
Exemplo 8
Preparação de Ferrotnq lutar ilalbumina com 7,0 X de conteúdo de Fe numa base ponderai composto de ferro é preparado como se descreveu no Exemplo 6, mas utilizando—se anidrido glutárico como agente de acetilação» composto mencionado em título está preparado»
Os complexos de proteína preparados nos Exemplos anteriores foram analisados de acordo com as metodologias analíticas descritas a seguir»
1) Determinação do conteúdo de ferro
Em todos os compostos preparados de acorda com as Exemplos Í~B o conteúdo de ferro foi determinado por extracção do ferro da amostra com HC1 2 N; a determinação quantitativa foi levada a cabo de acordo com o método descrito em Standard MethodSj 14ã ed»5 1975, pág» 2©8, ftPHA, ftWWft, WPCF (reacção com o-fenantrolina),
No composto refsrido¥ o ferro está presente no estado trivalente, como ficou evidenciado visto que nenhuns ÍSes Fe podem ser determinados quando a reacção da o-fenantrolina é levada a cabo na ausência de agentes de redução»
2) Solubilidade como função do pH
Todos os compostos preparados de acordo com os Exemplos anteriores são insolúveis em pH ácido e solúveis em pH básico.
perfil de solubilidade da ferrossuccinilalbumina, preparada de acordo com o método descrito no Exemplo 3, é relatado a título de exemplo» □ perfil de solubilidade é conseguido a partir de medidas espectrofotométricas da diferença de absorvência a 500 nm e 28€) nm de soluções obtidas pelo tratamento de 20 mg de ferrossuccinilalfaumina com 50 ml de água, num pH que se situa numa gama desde 2S© até 7,0» São diluídos 5 ml da amostra até í© ml com água, centrifugados a 300© rpm e o sobrenadante é lido no espec·-t r o f o tóme t ro»
A ferrossuccinilalbumina è completamente solúvel a valores de pH iguais ou superiores a 6,5, ao passo que é insolúvel a pH abaixo de 6» A curva de precipitação invertida, que se obtém por acidificação da solução de ferrossuccinilalbumina C20 mg do composto em água a pH - 7), mostra que a precipitação se inicia a pH = 4,5»
3) Determinação do conteúdo de proteína
A quantidade de proteína nas amostras, preparadas de acordo com os Exemplo í-8, foi determinada por titulação do azoto da proteina (utilizando o método descrito em Ifcalian Official Fharmacopoeia, IX ed«, vol» I, pág» 191-192).
Os valores encontrados situam-se numa gama desde um máximo de 85 X Cno composta do Exemplo 3) até um mínimo de 65 X (no composto do Exemplo 5).
4) Electroforese sobre acetato de celulose
A electroforese foi levada a cabo durante 20 min a 4© V/cm, utilizando tampão de Tris-tricina 0,05 M, pH = 8,6, que detecta bandas è mesmas distância electroforêtica para os compostos do invento e para as respectivas proteínas aciladas. Não puderam ser evidenciadas nenhumas bandas que pudessem ser atribuídas às albuminas de partida. A presença de ferro nas bandas dos compostos do invento pode ser detectada por meio da o~fenan~ trolina.
A título de exemplo, no caso ds determinações levadas a cabo nos compostos dos Exemplos 1-3, a distância da mancha desde & origem é 37 mm.
Análise espectroscópica UV—VIS (Shimadzu UV—160 espectro UV-VIS na gama 200-600 nm, registado em soluçSes aquosas a pH = 7 que contêm i mg/1 dos compostos do invento evidencia um aumento de absorvência desde 60® até 34© nm.
6) Espectro de emissão de fluorescência (Aparelhos espectrofluor6met.ro Kontron SFM25)
Ds espectros de emissão de fluorescência em 400 nm e 2®© nm (excitação em 236 nm) mostram uma emissão pobre, igual a cerca de 1/1© da da proteína de partida.
7) Espectroscopia ESR
Os espectros foram registados não só à temperatura ambiente mas também a -16£s ’~'C com um espectrómetro Varian E1D, e eles são caracterizados por um único pico de largura 1200 B entre a inclinação sinais podem complexos Fe máxima ε mínima, com om valor ds g = 2,00= Estes ser atribuídos a complexos polinucleares (neste caso i4 ) caracterizados por fortes interacções de permuta»
Não puderam ser evidenciados nenhuns outros sinais que pudessem ser atribuídos à presença de ferro na forma mononuclear»
8) Electroforese sobre sulfato de dodecilo e sódio (SDS)
A electroforese foi levada a cabo sobre gel de poliacrilamida a 7,5 % que continha 1 7» numa base ponderai de SDS»
As bandas electroforêticas foram evidenciadas com Comassie Brilliant Blue. Foram utilizadas as seguintes produtos como padrões de peso molecular? miosina (200 kd), {S-galactosidase íííó kd), fosforilase b (97 kd), albumina bovina (6S kd), albumina do ovo (42 kd)» Em determinações representativas, a ferrossuccinilalbumina mostrou uma banda isolada que corresponde ao peso molecular de 100 kd» Um comportamento electroforético semelhante foi mostrado pela ferrossuccinil-a-lactalbumina, mas o seu peso molecular é de 20 kd»
9) Determinação do grau de acilação e localização da acilação grau de acilação foi determinado não só espectrofotometricamente, de acordo com a reacção dos grupos amino livres da proteína com ninidrina, mas também por reacção fluorométrica com o-ftalaldeído (G. Soodno et al». Anal» Biochem», 115, 203, 1981)» Ambos estes métodos foram utilizados para avaliar a localização da acilação na fracção da proteína que constitui os compostos preparados»
Os resultados obtidas provam que os grupos a-amino terminais e os grupos «-amino lisina são acilados- em mais de 95 7..
Foram determinados os parâmetros adicionais seguintes para a ferrossuccinilalbumina, preparada como se descreveu no Exemplo 3.
10) Conteúdo de ácido succínico έ de 7-13 %s foi determinado por SLC CPerkin Elmer 3B, coluna de 3 m x 2 mm GP 1® % SP 1200 Κ,ΡΟ. sobre Chromasorb®> o 4 após hidrólise de uma quantidade conhecida de uma amostra com NaOH 2,5 N, a 100 *C, durante 5 horas, e subsequente acidificação até pH 2-3 com HC1 ό N, 0 ácido succínico libertado é quantitativamente transformado no succinato de metilo correspondente com BF^/CH^OH.
succinato de metilo é determinado sob as seguintes candiçSes, utilizando glutarato de metilo como padrão internos
Azotos Ar s
Hidrogénios Tempe ratu ra;
3® ml/min 3 atm 1,5 atm injec uor 255 coluna
14® *C
I rd ecçSes í detector F«I,D. 275 °C 5 y 1
11) Dicroísmo circular (aparelho JASCO 5000
Os resu1tados.
registados numa gama desde 30® até
-·
206 nm em soluções de ferrossuccinilalbumina a pH = 7, em comparação com a albumina de partida., evidenciam que a reaeção de succinilaçSo envolve a estrutura desordenada da proteína» A Figura 1 mostra o espectro de dicroísmo da albumina do soro bovino do composto acilado correspondente e do composto do Exemplo 3«
12a) Espectro de RH!M-~H (566 mHz; D„Q; aparelho Varian
JASCO 5000
D espectro mostra bandas largas e um sinal fraco em 2,4 ppm, sinal esse que está também presente no espectro da albumina succinilada correspondente, mas com uma mais nítida e definida configuração» 0 espectro é mostrado na Figura 2«
12b) Espectro de RMN-^C (aparelho Varian XL.506 espectro mostra sinais em Í5-70 ppm CCH alifâtico), 110-14© ppm (aromático) e ISO ppm (carboxílico)» A pobre resolução e intensidade dos sinais em 29-32 ppm (resíduo hemissuccinil) devido â presença do ferro, sugere uma possível implicação dos grupos succinilo na ligação com ferro» 0 espectro é mostrado na Figura 3»
13) Espectro de raios X (aparelho; Difractómetro Siemens 566D) espectro no intervalo angular 2 desde 9- até 51° não evidencia picos que possam ser atribuídos à presença de centras cristalinos, indicando por conseguinte a natureza amorfa do composta»
14) Determinações do peso molecular p
Por meio de filtração gel sobre colunas fauperose 6R ' obtém-se um perfil não gaussiano de peso molecular com um pico
z. 4 principal > 10 dalton e um patamar muito largo até 10 dalton.
Mo de Luz Laser com de sáida de 25 mW, ,5 Mill$12.
Utilizando a técnica de Dispers fonte de He-Na de 6328 angstrom, potência determinado um peso molecular de 17,5 ± 2 tf uma foi
15) Análise de aminoácido
A análise foi levada a cabo após a descomplexaçMo do ferro que pode interferir na análise, sujeitando uma amostra a hidrólise ácida total com HCl 6 N a 105 °C durante 24 horas e determinando a composição de aminoácido com um analisador automática CLiquimat + ΣΙΙ kantron) utilizando tampões de Na como eluentes.
perfil de aminoácido é mostrado no Quadro 1
Ιό
BUftDRQ 1
Composição em aminoácido (¾ de amlnpáçido por mede)
Ácido aspãrtico 9, í Va1zna és, S
Treonina 5,4 Hetionina 0,6
Serina 4,3 Isoleucina 2,4
Ácido glutâmico 13,9 Leucina Í0,5
Prolina Ó,© Tirosiria 3,1
Glicina Fenilalanina 4,3
Alanina 7,9 Lisina 9,3
1/2 Cisteína 5,0 Histidina 2,8
Argirsina 4,2
16) Protegiise
A hidrólise da enzima foi levada a cabo tratando 25 mg dissolvidos em 5 ml ds tampão Tris-HCl 0:,05 M, pH - 7,6, com quimotripsina (5® pg) e tripsina <5® pg). É drenado da mistura de reacção 1 ml, a intervalas de tempa definidos? são adicionados 2 ml de ácido tricloroacético CTCA). A mistura ê centrifugada a 3000 rpm durante íí© min e o sobrenadante é lido espectrofotometricamente em 280 nm contra um branco de TCA.
A troca de absorvência coma uma função do tempo representa a taxa de hidrólise, que mostra ser comparável à da albumina correspondente utilizada na preparação do composto, para evidenciar que o ferro presente no composto não deve inibir a acção das enzimas proteollticas.
17) Imobilização do ferro
A imobilização do ferro é testada pela, reacção com desferrioxamina, que é controlada como função do tempo medindo o aumento de absorvência, em 4B7 nm» de uma. solução que contém 7,0 μΐ de desferrioxamina» 500 gg ds ferrossuccinilalbumina previamente neutralizada a. pH = 7»4 em tampão Tris-HCl 20 mH» aumenta de absorvência em 487 nm ao longo do tempo confirma que o ferro pode ser mobilizado a partir da ferrossuccinilalbumina, A taxa de libertação é de 2,2 A para 5 min»
IS) Imobilização do ferro
Dissolve-se ferrossuccinilalbumina em ãgua a pH = 7»2 em concentrações de ©»1» 1,2» 4,B e 10 ”4 numa base ponderai, As viscosidades das soluções obtidas são analisadas com um viscosímetro capilar ou um viscosímetro Brookfield, As soluções preparadas com ferroproteinossuccinilato (uma amostra a 5 7 obtida como se encontra descrito na Patente Italiana N2 1 150 213) são analisadas por comparação e ás mesmas concentrações.
A viscosidade das amostras de ferrossuccinilalbumina» em todas as concentrações testadas» é notoriamente inferior à do ferroproteinossuccinilato»
19) Produção do radicai hidroxi
Foi investigada» de acordo com B» Halliwell» 3« Sutteridge, 0. Aruoma» Anal, Biochem»» 165» 215-219 <1937), a capacidade dos compostos de ferro do presente inventD de
produzirem radicais OH . São utilizados como controlos FeCl^ e FeSO^, que são conhecidos como capazes de gerar radicais OH.
São apresentados resultados representativos no Quadro
QUADRO 2
Degradação da desoxirrifaose a pH = 4,0
Fe
E 2© μπι 3
Ascorbato
E10© μΜ3 eni 5o2 nm
FeCl^ — Θ, i 56
f· eSO4 - 1,044
Ferrossuccini1a1bumina - ©, ©69
FeCl, T *f + ©, 625
F©so4 + 1,59
Ferrossucc in i1a1bumina s* 0,45
Na ausência de ascorbato, a formação de radicais livres é significativa com o FeSO^ ©, numa menor extensão, com o FeCl^..
A produção de radicais livres que derivam da ferrossuccinilalbumina, na presença de ascorbato, é significativamente inferior à do FeSG-„
2€j) Produção de radicais livres em fluidos biológicos
Foi utilizado o teste de bleomicina (Life Chesmistry
Report, 1987, vol. 4, pág. 113-142 - J. Gutteridge, B. Halliwell) para a determinação de radicais livres, devido à presença de ferro livre, em fluidos biológicas.
São tratados intraperitonealmente grupos de ratazanas cora ferrossuccinilalbumina e ferroproteinossuccinilato (preparado de acordo com a Patente Italiana 1 150 213) (em quantidades correspondentes a 10© mg de ferro/kg) e com sulfato ferroso (em quantidades correspondentes a 25 mg de ferro/kg)»
São recolhidas amostras ds plasma após 2, 8 e 15 horas e é determinada a presença ds ferro com o teste de bleomicina (ver Quadra
QUADRO 5
Determinação de ferro L livre no plasma
Produto Fe ΕμΜ3
2 h 8 h 1 5 h
-------------------------- — --------- — —
Sulfato de Fe++ 4,1 2,6 n »d,,
5,2 0,7 H
à O G? ij X* n.d. il
4 0,7 ii
Ferroproteinos-
succinilato 5,2 1,5 n »d»
4,8 Π κ Ú « 11
4,1 0,9 il
3,8 « .*4 15 β U h 11
Ferrossucc ini1-
-albumina Π » d » n „ d» n «d»
1} ss ii
:! u
tí ii £i
Controlos
n.d» n.d» n.d» η π h
A ferrossuccinilaibumina, ao contrário do sulfato ferroso e do ferroproteinossuccinilato, não induz ferro livre no plasmar, proporcionando por conseguinte a ausência dos efeitos nocivos induzidos pelos radicais livres que derivam do ferro»
ΞΙ
Estudo de toxicidade
Nos testes para a tolerância gastrointestinal, os animais foram tratados oralmente com ferrossuccinilalbumina (uma amostra preparada de acordo com o Exemplo 3, amostra essa que era significativa devido ao seu elevado conteúdo de ferro e, por conseguite, sendo potencialmente mais tóxica) ou com sulfato ferroso em níveis de dose de 2©© mg/kg» Qs animais foram mortos em instantes diferentes,, até às 24 horas» O exame do estômago e do intestino mostrou que as lesSes gástricas e intestinais eram significativamente menos marcadas após a administração da ferrossuccinilalbumina do que do sulfato ferroso»
A toxicidade aguda da amostra foi comparada com a do sulfato ferroso e os resultados são relatados no Quadro 4»
A ferrossuccinilalbumina prova ser muito menos tóxica do que o sulfato ferroso e não deve induzir sintomas de toxicidade até 2000 mg/kg»
A toxicidade subaguda com doses repetidas por via oral foi testada com doses de 10®, 250 e 60© mg/kg/dia do derivado (equivalente a 1, 2, 5 e ó vezes o tratamento com 1® mg/kg/dia de ferro). Não foram tornadas evidentes sinais de toxicidade durante o tratamento»
Testes em cães com doses de 1©®, 3©© e 1©©© mg/kg/dia (1, 3 e l€í vezes a dosagem terapêutica) também não evidenciaram sinais de toxicidade» Q aumento de peso corporal, o apetite pela alimentação, as condiçSes oftálmicas, assim como cs dados das análises electrocardiográficas, hematológicas, bioquímicas e à urina não diferem dos dos controlos» ando
ΤΔ
A
No teste de Ames, estirpes faacterianas (Sa1nor
o derivado foi test íella Typhimurium Th ado utiliz 1535, TA 1
1538, TA 98 e TA 100), pelo tratamento na ausência e na de activação metabólica Cpela fracção do fígado 89)» evidenciada nenhuma actividade mutaqênica» presença Não foi
Os estudos de toxicidade provam que a ferrossuccinilalbumina é tolerada no tracto intestinal, tem uma baixa toxicidade aguda e não ê mutagénica, em comparação com o sulfato ferroso, que causa ulcerações gástricas, ê mais tóxico após uma administração única e tem propriedades mutagénicas»
QUADRO 4
Produto
Via de administração LD5®
Ferrossuccinilaibumina Sulfato ferroso Ferrossucc in i1a1bumina Sulfato ferroso
i «pa >200© mg/kg
i = p» 25© mg/kg
O»S, >2000 mg/kg
O»5» Λ 5-íX.X. mg/kg
Testes farmacológicos
Ds modo a caractsrizar farmacologicamente a ferrossuccinilalbumina, foram avaliados os seguintes parãmetross libertação de ferro a nível gástrico, absorção e cinética do ferro e efeito antianémico após um tratamento prolongado, utilizando sulfato ferroso como controlo Cem animais com anemia experimentalments). A ferrossuccinilalbumina estes testes é a preparada no Exempla 3» induzida utilizada para
Α
Libertação de ferro no estômago
Ratazanas macho Wistar (charles Rivsr-Calco), em jejum durante 24 horas, foram tratadas oralmente com 2 mg de equivalentes de Fe/kg em sulfato ferroso ou ferrossuccinilalbumina» í@, 20 ε 30 minutos depois do tratamento, os animais são mortos, o estômago ê retirado e o ferro livre no suco gástrico á doseado com o estojo de Fe (!íFe kit”) CWako).
Os resultados que se relatam no Quadro 5 (que se referem a uma amostra que contém 9,5 de ferro, mas que é representativa de todos os outos compostos) mostram que a ferrossuccinilalbumina causa uma libertação ds ferro mais do que í@ vezes menor do que a do sulfato ferroso, c que explica a menor gastrolesividade do composto do invento comparada com a do FeSO^, que é um agente antianémico largamente utilizado na terapia»
QUADRO 5
Τ ratamento
Fempos de tratamento 90'
3G!
Fer rossucc: in i 1 a 1 bumina 9,0 ± 1::9 8,1 1,8 11,3 Ί
Sulfato de ferro 118,4 ± 7,6 116,7 i 4,7 122,3 ±
Controlos R 4· t-* 3 <· — ·“> ’*> x> 3 x» 2,9 i 1,2 4,9 ±
N = 7
AN0VA$19Chá mais) ; p < 0,01
3«0
Ferrossuccinilalbumina vs. sulfato ferroso
B. Absorção de ferro na ratazana anémica
Foi avaliada a sideremia pelo método da batofenantrolina (Teste de Combinação de Ferro - Boehringer Mannheim) na ratazana anémica Ca anemia foi induzida por meio de dieta isenta de ferro na ratazana Sprague-Dawley e criada com animais de dieta isenta ds ferro de mães anémicas) uma hora depois do tratamento com ferrossuccinilalbumina ou sulfato ferroso em diferentes dosagens. Qs resultados obtidos nos diferentes testes provaram que o sulfato ferroso causa uma carga de ferro mais elevada do que as amostras de ferrossuccinilalbumina.
C. Determinação da cinética do ferro
Foram medidos os valores de sideremia na ratazana anéfftica em instantes diferentes após um único tratamento oral com sulfato ferroso e ferrossuccinilalbumina a uma dose ds 0,3 mg de equivalente de Fe» Os resultados mostram para ambos os compostos ο
um pico ds absorção de ferro uma hora depois do tratamento (ver Quadro 6>
QUADRO 6
Valores de sideremia na ratazana anémica em instantes diferentes após um único tratamento oral com ®,3 mg/kg de ferro na forma de sulfato ferroso ou ferrossuccinilalbumina (pg/100 ml ± E„P„>
Tratamento mg Fe/kg
Tempos de tratamento
Ferrossuccinil-albumina
.. φ λ / η ΟΣ X / r,b
FeSO
19/:,ο'±ί8,5++ 247,9+15,5++ ___, ,
2W8,6±2®,3 ++
307,7±19,2++
Controlos anémicos
ΎΑ 74· 1 Z. *. *.:«xi ,a
2b
QUADRO 6 ícontinuaçãa)
Tratamento
Temoos de tratamento
0,3 mg Fe/kg
9h óh
24h
Ferrossuccinil-albumína
FeSO
118,3114,3^ 104,8115,0'··'''' 55,81 5,1 29,611,1
Ψ4· -$··4·
261,5121,5++ 219,7+28,1++ 93,9+22,8++ 23,0+0,8
ANOVA em 2 factores;
« .. , -1 P 0,ΐ?1 albumina ++ ρ < ©, 0 í ' p < 0,05 s Ferrossuccinil, FeSO.
ρ < 0,©5 s dentro dos grupos vs» instante 0 (controlos anémicos)
D. Efeito antianémico
Foi levado a cabo um tratamento prolongado durante 6 semanas, na ratazana anémica, por administração oral de ferrossuccinilalbumina e sulfato ferroso como controlo, em doses de 3, 10 e 30 mg Fe/kg/dia,
Os animais, em grupos de 5 animais cada um, foram mortos nos dias 0, 7, 14, 21, 35 e 42 a partir do tratamento,
Os dados dos níveis de hemoblobína hemâtica e de ferro no soro (Teste de Combinação de Ferro - Boehringer Mannheim), obtidos com o composto preparado como se descreveu no Exemplo 3, são indicados no Quadro 7, Estes resultados mostram que os compostos são equiactivos na reposição dos níveis de hemoglobina.
ainda que o sulfato ferroso seja mais rápido e reposição dos valores ds ferro no soro» poderoso na
ff
Parâmetros hematológicos durante um tratamento de 6 semanas em ratazanas anémicas com diferentes compostos que contêm ferro (3? '1© e 30 mg FeZkgZdia) (Média ± E»P»)
ANOVAs ** ρ < 0,0Í * ρ < 0,05 vs, controlos anémicos.
QUADRO 7
Parâmetros Tratamento __ de t t- a tamen to
to 1 oy ÍCOS mg FeZkgZdia 0 7 14
— — — — —
Hemoglobina Con tro1os normais 13,311, © 1 o , o 1©, 5 lo, / i© , o
(mg Z dl) Controlos anémicos 3,31©, O 4 y 2 4 tf y 2
Ferrossuccini1-
-albumina 3 z 7,910,6** 8,211,2**
Fsrrossuccin i1 —
-albumina 1© / 1© ? ©1©,7 11,11©,4
Ferrossuccin!1—
-albumina 3© 11,210,3 12,810,2
FeSCk 3 4 / “t -'ΪΛ.η -r ?-t ,
FeSO„ ί© / 11,210,1 11,210,8
FeS04 3© / íl,5i©,3 Í2,l±©,2
— —
Ferro séríco Controlos normais f •í oo ,7119,5** 11ί,©111,4**
( p.g Z100 m 1) Controlos anémicos / 19 ,91 6,5 38,91 3,7
Ferrossucc in i1-
-albumina 3 / 27 «4 j ώ 54 ô 8*
F er rossuc c i n i1-
-albumina í© z Í42 ,7131,7* * í 23,5114,4* *
Ferrossucc in i1-
-albumina 3© / 184 ,óí 9,©** i©2,óí 4,9**
FeSO- 3 / 67 ,817,8** 81,8114,8**
FeSQA í© / n,d. 183,7142,2
FeSík 3© 4 / Í89 # & A 'è iX7C ÍA7 “74-0 L· «•y*’*· 3 ÚÍ.-JU j v λ *r / y ·_'Ζζ..ΰ y ai
- 2Ρ
QUADRO 7 C C ΟΠ i?. J. n LAíS-Ç ôG j
Parâmetros
hemato- Tratamento UÍ-5/Ξ- OS 11 i ratamento
lógicos mg t-e/Kg/dia --ι·3 Z. X 28 •it··*!
Hemo- Controlos normais 13,8i0,4 13 5ó±2 ? 2 15,1±0,5
globina Controlos anémicos 4,8±0,8 3 , à±05 7,1±0,8
(mg/dl> Ferrossuccinil- --albumina 3 Ferrossucc in i1— 9,7±0,6ιν' 10,2±1?0*J
-álbum irra 10 Í2,l±0?3 13,0+0,1 13,9±0,í
Ferrossucc in i1-
—albumina 30 il,9+©,4 12,9+©,3 14,1+0,9
FeSO. 3 12,5±1,0^* 11,5±0,B* $
FeSO^ 10 12. ó+0„ 4 1 aÍ q O1— 0 3 4 13,6+0
FeS04 30 ií,7+©,2 í 2 tj /130~ i '13,1+0,4
Ferro Controlos normais 1 21 , i±7,3’** 114 55± i 9, © 139.3+9,8
sérico .. S $, v } <«>
(p-g-7 Con trolos anémicos 34,2±3,© 3©,7+ 2,8 4©, 6 ±4,9
/100 ml) F errossucc in i 1 - -albumina 3 Ferrossuccin i1— —r 7 -5 £3^· Z / 5 A X g s 143,5+38,0 O
-albumina 10 1 C7~y rr-T- C“t SS* vJ·».1 t; d tj ·—/ (*»>’ S Z «J C/X •M’ ti 5 ÍÍ3,5±2,3 C°>
Fer rossuc c i rt i 1 -
-albumina 30 1 33, ó± 9,1^ 112,4+ 8,0 í**) 133,5+4,© <**}
FeSCs^ 3 1 03,2±32,2® 133,8±Í0,8:
FeSDa 10 1 33,B± 3 , 2 113,R+ 9,2 '<»»>' 129.3±23,! í°)
FeSG4 30 1 AC .-3.Λ. “7 ii sí‘ ** ·» -~scr T.Í. -Í -y rt · ©vJjZ-a. / , » ϋα,/£ιο,4 && Φ ft· -í SS’“* gATT
15,4+0, <**) « Cr·· <**) ;© -
\ proteína a albumina ou a principalmente na cadeia análises físico-químicas.
Us dados anteriores provam que a ferrossuccinilalbumina é um complexo de ferro e proteína Co conteúdo de ferro pode variar desde 3 até 2© K numa base ponderai), sendo a componente lactaibumina extensivamente aciladas, lisina, como ficou evidenciada par particularmente1 a electroforese, composição de aminoácido, conteúdo de ácido succínico, (RMN), com estrutura desorganizada Cdicroísmo circular-CD)»
A proteína pode complexar com elevadas quantidades ferro na forma de um estrutura amorfa, em complexo hidratado polinuclear CESR) que os aquo-complexos são mantidoí solução pela proteína succinilada, formando desta maneira estrutura agregada com pesos moleculares maiores do que Da1ton« de com em uma ί©0
Ds compostos que se obtêm são altamente· insolúveis em meio ácido e altamente solúveis em meios de valor de pH neutro ou básico.
Os compostos são caracterizados por uma muito baixa toxicidade no animal, devido à libertação ds traços de ferro, que não podem dar origem a um aumento de radicais livres» Os efeitos acima mencionados sSo completamente imprevistos e são devidos â presença de albumina no composto» □ presente invento também se refere à utilização dos novos compostos como agentes eficazes no tratamento de anemias, assim como a todos os aspectos industriais relacionados com isto, incluindo a sua utilização em composiçã-es farmacêuticas, que constituem um outro objectivo especifico do presente invento» Os compostos do presente invento podem ser incorporadas em composições farmacêuticas, particularmente em formulações adequadas à administração oral»
Para a administração oral, as compostos são formulados na forma de granulados, pre pa rações excipientes comprimidos, pós dispersíveis, cápsulas, drageias, suspensões, xaropes, eiixir&s ou soluções.
para a utilização oral podem conter fiaoituais.
taií como adoçan tes,
As um ou mais dos a roma t i z an tes, corantes, agentes de cobertura e de conservação, de modo a obter-se uma preparação agradável e saborosa» Os podem conter o ingrediente activo misturado com os comprimidos excipientes farmaceuticamente aceitáveis habituais, por exemplo diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, lactose e talco, agentes de granulação e desintegração, tais como ácido algínico e carboximetiIcelulose de sódio, agentes de ligação, tais como amido, gelatina, goma arábica e polivinilpirrolidona, agentes de conservação, tais como benzoatos ou hidroxibenzoatos de metilo, etilo, propilo, bufcilo ou de metais alcalinos» e lubrificantes tais como talco, estearato de magnésio, ácido esteárico, palmi toestear-ato de glicerilo e semelhantes»
Ds xaropes, elixires, suspensões e soluções são preparados de acorda com os métodos conhecidos» Conjuntamente com o ingrediente activo, eles podem cor como propileno-glicol, metilcelui de tragacanto, agentes molhantes, de polioxietileno e manooleato de habituais conservantes, agentes agentes de tamponização» A adir alcalino, pode, por vezes, ser necs ridas das referidas formulações por ampolas bebíveis e saqueias, suspenso extemporaneamente em águi iter agentes de suspensão, tais ;ose, hidroxietilcelulose, goma tais como lecitina, estearato polioximetilenossorbitano e os tensioactivos, adoçantes e ;ão de um hidróxido de metal rssário» As formas mais prefefarmacêuticas são constituídas cujo conteúdo é dissolvido ou
As dosagens de ingrediente activo podem variar dentro de largos limites, dependendo da natureza do composto utilizado, □s resultadas eficazes são geralmente obtidos administrando os compostos do presente invento em dosagens diárias que se situam numa gama desde cerca de 5 até cerca de 5Ô mg/kg de peso corporal . As formas de dosagem farmacêuticas contêm geralmente desde cerca de /·&& até cerca de 15©© mg do ingrediente activo, conjuntamente com um ou mais dos agentes de suporte farmacêuticos sólidos ou líquidos convencionais, e elas podem ser administradas uma ou mais vezes por dia.
έ em seguida indicada a descrição de alguns exemplos de composições farmacêuticas.
Exemplo 9
Um comprimido contéms
Ferrossuccinilalbumina (Exemplo 3) 40© mg 120© mg
Palmitoestearato de glicerilo 55 F*g 165 mg
CarboximetiIcelulose de sódio '27 mg 8© mg
p-Hidroxibenzoato de metilo í mg -ÍI* mg
p-Hidroxibenzoato de propilo í mg 3 mg
Exemplo 1©
Um comprimido contéms
Ferrossuccinilalbumina (Exemplo 1) 12©© mg
Palmitoestearato de glicerilo 165 mg
Carboximetilcelulose de sódio 8© mg
p-Hidroxibenzoato de metilo mg
p-Hidroxibenzoato de propilo mg
Exemplo 11
Uma ampola bebível contéms
Ferrcssuccinilalbumina (Exemplo 3) 40© mg Ó0© mg 120® mg
Propi1enog1i c o1 1000 mg 150® mg 3000 mg
Benzoato tíe sódio 35 mg 52 mg i®5 mg
p-Hidroxibenzoato de metilo 3© mg 45 mg ?® mg
p-Hidroxibenzoato de propilo 15 mg mg 45 mg
Sacarina de sódio 10 mg 15 mg 3© mg
Ca r ame lo (E 13® > 19® mg 285 mg mg
Hidróxido de sódio 1 N 1 00® mg 150® mg 300® mg
Agua depurada q.b. para 1® ml 15 ml 3® ml
Exemplo 12
Uma ampola bebível contêms
Fer r ossuc ε in i1-α-1ac taIbumxna CExsmpio 3) 400 mg
Propilenog1icol 1 vs*u0 mg
p-Hidroxibenzoato de metilo w w mg
p-Hidroxibenzoato de propilo 4® mg
Sacarxna de sódio 3® mg
Caramelo 4®6? mg
Hidróxido de sódio 1 N J 00® mg
Ãgua depurada q»b„ para 2® ml
Exemplo 15
Uma ampola bebível contêms
Ferroasparti I a 1 bumina 1200 mg
Me t i1c b1u1ose 800 mg
Benzoato de sódio 500 mg
ρ-Hidroxibenzoato de propilo 20 mg
Sacarina de sódio 3® mg
Hidróxido de sódio 1 M í ®0® mg
Agua depurada q,b, para 15 ml

Claims (8)

  1. REIVINDIÇftCQES lê,. Processo para a preparação de albuminas aciladas com resíduos de ácido dicarboxílico, que contêm ferro numa forma biodisponívei, caracterizado por se proceder è acilação das referidas albuminas com resíduos de ácidos dicarboxílicos, seguido tíe reaeção das albumin aciladas obtidas, de preferência em meio aquoso, com iões ferro»
  2. 2i« Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as albuminas aciladas derivarem de albumina bovina ou de lactoalbumina»
  3. 3ã» Processo de acordo com as reivindicações i e 2, caracterizado por as albuminas serem aciladas com resíduos de ácido dicarboxílico escolhidos de entre os dos ácidos succínico, glutárico, maleico, mélico, malónico, aspártico s glutâmico.
  4. 4ã« Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por as albuminas, serem aciladas com resíduos succinilo.
  5. 5â. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 4, caracterizado por se obterem compostos que contêm de 3 até 26 % de ferro numa base ponderai, óâ= Processa para a preparação de compostos que contêm ferro biodisponívei, caracterizado por se a partir de albuminas aciladas com resíduos de ácido dicarboxílico e se submeter estas a interacção com iões ferro num meio aquoso de p-H que se situa numa gama desde 2 até 12, preferivelmente desde 3 até 7.
  6. 7ã» Processo para, a preparação ds composições farmacêuticas, caracterizado por se incluir nas referidas composições.
    juntamente com um agente de suporte ou excipiente
    Processo de acordo com a reivindicação 7, caracteincluir nas referidas comoosicSes» o inaredisnte como ingrediente activo, um composto de acordo com as reivindicações 1 até 6, adequados»
  7. 8ã« rizado por se activo em quantidades que podem variar entre desde cerca de 300 até cerca de 1500 mg»
  8. 9ã» Método para o tratamento de condiçSes anémicas em animais de sangue quente, caracterizado por compreender a administração de uma dose terapeuticamente eficaz de um dos compostos de acordo com a reivindicação 1, dose essa que se situa numa gama desde cerca de 10 até cerca de 50 mg/kg de peso corporal»
    Lisboa, 15 de Novembro de 1990
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