PT95030A - Processo de preparacao de polipeptidos, de composicoes farmaceuticas que os contem e de deteccao de antigenio da apolipoproteina e em fluidos vasculares - Google Patents

Description

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MEMÕRIft DESCRITIVA

Campo Técnico

0 presente invento refere-se a polipéptidos capazes de iruitietizartan a capacidade da apolipoproteina (apo) E de induzir a função celular diferenciada. Mais particularmente, o presente invento refere-se a um agonista polipeptídico da Apo E útil para a inibição da proliferação de linfócitos e/ou secreção de androgénios pelo ovário. 0 presente invento também se refere ao aumento da clearance do colesterol mediada por estes polipéptidos de ligação de receptor (competentes para o receptor). A esse respeito, o presente invento refere-se à utilização de péptidos em tandem, sintéticos, para modular a absorção e incorporação de proteinas contendo colesterol, pela células hepática e a métodos de diagnóstico utilizando estes péptidos e os seus anticorpos para avaliar a eficácia destas medidas terapêuticas.

Antecedentes

As lipoproteínas são os transportadores primários do colesterol plasmático. Elas são complexos de lipido-proteína micelares (partículas), tendo uma película superficial constituída por uma ou mais proteinas associadas com lipidos polares, a qual rodeia um núcleo que contém colesterol. A classificação original das lipoproteínas baseou-se nas suas densidades de flutuação medidas por ultracentrifugação. Desta forma, foram reconhecidas quatro classes principais de densidade existindo subclasses dentro destas. A primeira classe compreende os quilomicra. São as lipopro-teinas maiores e são ricas em triglicéridos. O local de origem dos quilomicra é o intestino. Quando os quilomicra são expostos ao plasma ou k lipoproteina de alta densidade (HDL) in vitro. a maior parte do seu complemento de apolipoproteínas A é perdido, e são adquiridas as apolipoproteínas C e E. Qs quilomicra também contêm a apolipoproteina B-48. A classe seguinte de lipoproteínas, as lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL) é constituída por partículas produzidas no fígado e está envolvida no metabolismo dos 71 415 SCRF 187.3

-3-triglicéridos e no seu transporte a partir do fígado. As apolipoproteinas, apo B-100 e apo E, são os constituintes principais da partícula de VLDL. A terceira classe de lipoproteínas, compreendendo as lipo-proteinas de baixa densidade (LDL), é um produto especifico do catabolismo das VLDL. A apolipoproteína predominante nas partículas de LDL é a apolipoproteína B-100, ou apo B-100. A quarta classe, lipoproteína de alta densidade (HDL), contém duas apolipoproteínas principais, a apo A-I e a apo A-II. Uma função da apo A-I é a activação do enzima plasmático, lecitina-colesterol aciltransferase, o qual é necessário para a esterificação do colesterol livre nas HDL para transporte para o fígado. O colesterol plasmático é regulado, em parte, pelo receptor de LDL, e em parte, pela capacidade da lipoproteína para transportar colesterol e se ligar ao receptor de LDL. Hofmann et al., Science, 239:1277 (1988). Este receptor é encontrado na superfície de todas as células onde ele medeia a ligação e internação das lipoproteínas ricas em colesterol que fornecem o colesterol de membrana; Brown et al., J. Clin, Invest., 55=783 (1975); Golstein et al., Methods Enzymol., 98-241 (1983); e em algumas células especializadas, que usam o colesterol como substrato para a produção de ácidos biliares ou hormonas esteróides; Gwynne et al., Endocr. Rev., 3=299 (1982), A expressão do receptor de LDL nas células é regulada, inversamente, pela concentração circulante de LDL, isto é, quanto mais elevada for a concentração de LDL circulante menos- serão os receptores de LDL na superfície celular. Hofmann et al., Science, 239:1277 (1988). A ligação da LDL ao receptor de LDL tem sido o foco de muita pesquisa, dada a sua importância na regulação do nível de colesterol plasmático, o qual é considerado um factor de risco principal para o desenvolvimento da doença arterial coronária; Brown et al., Scient. Amer.. 251:58 (1984).

Crê-se que a ligação da LDL ao receptor de LDL seja dependente do tipo de apolipoproteína presente na partícula de

4 -4- J 71 415 SCRF 187.3 lipoproteína.

As apolipoproteinas são componentes proteicos, isentos de lipidos, das lipoproteínas plasmáticas ou séricas, obtidas por tratamento de lipoproteínas intactas com solventes orgânicos, detergentes ou agentes caotrópicos. Nem todas as proteínas capturadas com as lipoproteínas têm, necessariamente, um papel no transporte de lipidos. Um exemplo pertinente é o reconhecimento recente que as proteínas amilóides A, séricas, reagentes de fase aguda, são transportadas no plasma ligadas à HDL. Estas proteínas de baixo peso molecular podem constituir até 30¾ da apo-HDL nos estados inflamatórios, mas é duvidoso que elas tenham papéis específicos de transporte de lipidos. A apo B-100 é reconhecida e ligada pelos receptores de LDL celulares. Pela ligação à apo B-100, estes receptores extraem partículas de LDL do plasma. A LDL é, deste modo, recolhida pela célula e quebrada, cedendo o seu colesterol para satisfazer as necessidades da célula. A interacção entre a apo B-100 e o receptor de LDL joga, deste modo, um papel importante na remoção do colesterol das LDL da corrente sanguínea. Todas as partículas de LDL contêm apo B-100.

Quando comparada com as apolipoproteinas A-l ou B, a concentração relativa de apo E no plasma é baixa. Contudo, a apo E é, de várias formas, um instrumento no metabolismo das lipoproteínas. Mahley et al., J. Lipid Res., 25:1277-1294 (1984). É um local de reconhecimento para vários receptores celulares de lipoproteína, incluindo receptores de hepatócito para partículas residuais de quilomicra e de VLDL [Hui et al., J. Biol. Chern,. 259:860-869 (1984); Shelburne et al., J. Clin. Invest.. 65:652--658 (1980)], receptores de LDL em células hepáticas e extra--hepáticas [Hui et al., J. Biol. Chern.. 256:5646-5655 (1981)] e receptores de VLDL em macrófagos [Wang-Iverson et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.. 126:578-586 (1985)]. A apo E também pode desempenhar um papel na lipólise das lipoproteínas mediada pela lipoproteína.-lipase [Yamada et al., Biochem. Biophys. Res. Communn.. 94:710-715 (1980); Ehnholm et

71 415 SCRF 187.3 -5- al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:5566-5570 (1984)] e facilitar o transporte de esteróis sob certas condições [Fielding et al., Metabolism. 31:1023-1028 (1982)].

Cerca de metade da apo E está associada com VLDL, e a outra metade com partículas do tamanho de HDL. Gibson et al., Biochem. Biophys. fteta., 835:113-123 (1985). Não existe, virtualmente, qualquer apo E no plasma que não esteja associada com lipoproteí-nas.

Existem diferenças significativas na disposição de certos epitopos de apo E nas várias lipoproteínas, afectando as suas funções fisiológicas. Os dados imunoquimicos estão de acordo com as observações que os lipidos das lipoproteínas modulam a conformação da apo E, tal como detectado por dicroísmo circular [Chem et al., Biochemistry. 23:6530-6538 (1984)] e dispersão óptica rotatórias [Klimov et al., Mol. Biol,. 18:404-409 (1984)]. A heterogeneidade da disposição ou conformação da apo E nas superfícies das lipoproteínas também é confirmada pela acessibilidade variável à clivagem pela trombina da apo E em partículas de VLDL de diferentes tamanhos. Bradley et al., J. Biol, Chem., 259:14728-14735 (1984).

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As lipoproteínas são removidas do plasma por ligação a receptores de alta afinidade nas células do fígado e tecidos extra-hepáticos, como as glândulas supra-renais e os ovários. Kowal, R.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 86:5810-5814, (1989). 0 receptor de LDL liga especificamente as lipoproteínas portadoras de apo B e apo E. Mahley, R.W., Science. 240:622 (1988). Assim, a apo E tem importância clínica dado o seu papel na ligação ao receptor de LDL e na facilitação da clearance do colesterol.

A região de ligação ao receptor de LDL da apo E foi mapeada numa sequência interna incluindo os resíduos de aminoácido 140 a 160. Weisgraber et al., J. Biol. Chem.. 258:12348 (1983), Adicionalmente, a apo E liga-se ao receptor de LDL apenas quando está associada com uma lipoproteína ou fosfolípido [Innerarity et al., J. Biol. Chem., 254=4186 (1979)], e 4 moléculas de apo E

71 415 SCRF 187.3 -6- ligam-se ao receptor de LDL com uma afinidade que é 10 a 25 vezes maior do que a ligação de uma única molécula de apo B. Mahley, R.W., Science, 240:622 (1988).

Dois conjuntos distintos de receptores ligam as lipoproteí-nas contendo apo E. O receptor de LDL [Yamamoto et al_7 Cell, 39:27-38 (1984)], 70¾ dos quais se pensa estarem localizados nas células hepáticas, liga as VLDL e as partículas residuais de quilomicra contendo apo E. A existência de um segundo conjunto de receptores para LDL, denominados "receptores remanescentes”, é inferida a partir de estudos mostrando que a clearance plasmática de partículas residuais de quilomicra contendo apo E ocorre a taxas normais em animais com receptores de LDL geneticamente defectivos.

Recentemente, foi descoberta na superfície das células hepáticas uma proteína relacionada com o receptor de LDL (LRP). Herz et al., EHBO, 7:4119-4127 (1988). A LRP partilha sequências de repetição da cisteína com as LDL, e foi demonstrado que liga e medeia a clearence extracelular de lipoproteínas contendo apo E. Kowal, R.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 86:5810-5814 (1989).

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Também foi descrito que as lipoproteínas enriquecidas em apo E têm uma função no sistema imunitário pela inibição da proliferação de linfócitos estimulada por mitogénios ou antigéni-os, in vitro e in vivo. No ovário, apo E inibe a produção de androgénios pelas células intersticiais e da teca cultivadas e estimuladas pela LHs Dyer et al., J. Biol. Chem., 263:10965 (1988).

Em 1976 foi descrito que uma fraeção lipoproteica distinta, isolada a partir de plasma humano normal, inibia a proliferação in vitro de linfócitos humanos estimulada por mitogénios e células alogénicas. (Curtiss et al-, J. Immunol.. 116:1452 (1976). Esta lipoproteína plasmática inibitória foi denominada LDL-In de “Low Density Lipoprotein-Inhibitor“ porque a fraeção activa está localizada numa subfracção menos densa da LDL total, de densidade 1,006-1,063 g/ml. As caracteristicas da inibição in ο 71 415 SCRF 187.3 -7-

vitro mediada pela LDL-In são as seguintes: a LDL-In tem uma actividade inibitória comparável para a proliferação de linfócitos humanos estimulada pela fito-hemaglutinina (PHA), pelo mitogénio "pokeweed" (PWM), e célula alogénica. A actividade inibitória da LDL-In é não tóxica e independente da concentração de mitogénio. A supressão pela LDL-In é dependente do tempo, e são necessárias aproximadamente 18 horas de exposição da lipoproteína aos linfócitos antes da estimulação para indução máxima de um estado suprimido estável. A LDL-In não inibe a absorção e incorporação de ^H-timidina quando esta é adicionada às culturas 18-20 horas após a estimulação, sugerindo que esta lipoproteína influencia os acontecimentos metabólicos associados com uma fase indutiva precoce da activação dos linfócitos.

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Foi estudada a actividade imunossupressora da LDL-In num certo número de sistemas, quer in vitro quer in vivo. Para resumir, as actividade in vitro das LDL-In incluem supressão de: a) absorção e incorporação de ^H-timidina estimuladas por mitogénio, (Curtiss et al. J. Immunol-., 116Í1452 (1976)); b) absorção e incorporação de ^n-timidina estimulada por célula alogénica (Curtiss et al., J, Immunol., 116-1452 (1976), Curtiss et al., J. Immunol.. 118:1966 (1977)); c) a geração primária de células T citotóxicas (Edgington et al., Regulatory Mechanisms in Lymphocyte Activation: Proceedings of the Eleventh Léukocvte Culture Conference, D.O. Lucas, ed. Academic Press, Nova Iorque, pág. 736 (1977)); d) síntese de imunoglobulina estimulada por mitogénio "pokeweed" (Curtiss et al., J, Clin, Invest.. 63:193, (1979)); e e) transformação da célula 8 pelo vírus de Epstein Barr (Chisari et al., J. Clin. Invest., 68:329, (1981)). In vivo, a LDL-In demonstrou inibir: a) a resposta imunitária humoral primária a glóbulos vermelhos de carneiro (Curtiss et al., J. Immunol.. 118=648, (1977), DeHeer et al., Immunopharmacology, 2=9, (1979), Curtiss et al., Cell. Immunol., 49:1, (1980)); b) a geração primária de células T citotóxicas (Edgington et al., Regulatory Mechanisms in Lymphocyte Activation: Proceedings of the Eleventh Leukocyte Culture Conference. D.O. Lucas, ed. Academic Press, Nova Iorque, pág. 736, (1977)); e c) vigilância 71 415 SCRF 187.3 -8- imunológica do crescimento de tumores (Edgington et al., Câncer Res., 41=3786, (1986), Edgington et al., Dietary Fats and

Health.. Monografia de ACOS N?2. 10, Perkins e Visek, ed., pág. 901, (1981)).

Os efeitos das jipoproteínas sobre a função celular imunitá-ria, in vivo, são extremamente complexos. Uma descoberta importante da investigação das implicações fisiológicas da imunossu-pressão in vivo pela LDL-In, é que o resultado funcional observado é surpreendentemente dependente da dose. Este conceito 9

J importante é melhor ilustrado pela descrição com maior detalhe dos efeitos da LDL-In sobre a sobrevivência de animais experimentais desafiados com tumores singénicos. (Edgington et al., Câncer Res., 41:3786, (1981), Edgington et al., Dietary Fats and

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Health.. Monografia de ACOS NÕ. 10, Perkins e Visek, ed., pág. 901, (1981)). São observados efeitos aparentemente divergentes da LDL-In sobre o crescimento do fibrossarcoma SaD2 singénico em ratinhos DBA/2. 0 crescimento de 1 x 10^ células tumorais viáveis em ratinhos de controlo sem imunoprotecção (isto é, 10 dias antes da imunização com 10^ células tumorais irradiadas) é detectável aos 25 dias, e progride rapidamente até à morte a cerca dos 43 dias. Em contraste, o crescimento do tumor é mais lento em ratinhos imunoprotegidos. Este crescimento tumoral é caracteriza-do por uma redução na massa tumoral de, pelo menos, metade e por nenhuma morte pelo dia 60. A administração intravenosa de doses elevadas de LDL-In 24 horas antes da imunoprotecção com células tumorais mortas suprime o efeito protector da imunização. Esta dose corresponde a uma dose que é necessária para suprimir as funções celulares efectoras das células B e das células T. A administração de uma dose intermédia de LDL-In antes da imunoprotecção com as células tumorais mortas não tem efeito discernivel sobre o crescimento subsequente do desafio das células tumorais viáveis. Em contraste, a administração intravenosa mesmo de doses menores de LDL-In 24 horas antes da imunoprotecção com células tumorais mortas resulta no aumento da rejeição do tumor e na sobrevivência do hospedeiro. Esta dose de LDL-In é concordante com a dose necessária para a inibição sélectiva da função celular 71 415 SCRF 187.3 -9- supressora in vitro (Curtiss et al., J. Clir». Invest., 63:193 (1979)). Assim, dependendo da quantidade de lipoproteína imunor-reguladora a que uma população particular de linfócitos é exposta in vivo, resultarão resultados funcionais muito diferentes.

As lipoproteínas plasmáticas diferem da maioria das moléculas imunorreguladoras humorais visto que elas são complexos não--covalentes heterogéneos, grandes, de lípido e proteína. Um passo importante na compreensão do mecanismo de regulação da função celular pelas lipoproteínas, é a identificação do constituinte(s) da partícula de lipoproteína que medeia os efeitos biológicos observados. As lipoproteínas plasmáticas contêm diferentes quantidades de apoproteinas, glicéridos, colesterol livre e esterifi-cado, fosfolipidos, glicolípidos e ácidos gordos livres. Muitos destes constituintes das lipoproteínas podem, por eles próprios, influenciar a função celular,

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A heterogeneidade das apoproteinas em termos de estrutura, exposição e função torna-as candidatos prováveis como constituintes biologicamente importantes da LDL-In, e a contribuição das apoproteinas para a actividade biológica foi amplamente estudada. A LDL-In contém Apo B, apo E, e cada uma das apoproteinas C. 0 papel específico desempenhado pela Apo B e apo E na LDL-In, foi investigado imunoquimicamente, utilizando anticorpos monoclonais específicos para a Apo B e específicos para a apo E (Curtiss et al., Fed. Prod., 40:348, (1981), Curtiss et al., Atherosclerosis. 2(5):A111, (1982)). Alguns, mas não todos, dos anticorpos para a Apo B, e cada um dos anticorpos específicos para a apo E ligam-se e facilitam a precipitação indirecta e a remoção da actividade inibitória da LDL-In de uma fracção lipoproteica. Estes resultados indicam que a LDL-In contém ambas as apoproteinas B e E, mas não identificam qual das apoproteinas é importante ou necessária para a actividade. A constatação adicional que as lipoproteínas contendo apo E e Apo E são reguladores importante da função dos linfócitos proveio de estudos das propriedades inibitórias das lipoproteínas plasmáticas do sangue de cordão fetal (Curtiss et al., J_^

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Immunol., 133:1379 (1984)). Nestes estudos foi estabelecida uma

correlação directa entre a apo E e a inibição. As concentrações de lipoproteinas no sangue de cordão são mais baixas do que as do adulto, isto é, o nivel da lipoproteina de baixa densidade (LDL) no sangue de cordão é 30¾ daquele do adulto, enquanto que o nivel da lipoproteina de alta densidade (HDL) é 50¾ dos níveis do adulto. Em contraste, a concentração de apo E no sangue de cordão fetal é 2 vezes mais elevada do que no adulto (Curtiss et al„, J. Immunol., 133:1379 (1984)). Consequentemente, a capacidade da LDL e da HDL para inibir a absorção e a incorporação de estimulados pelo mitogénio nas células mononucleares do sangue periférico do adulto, foi utilizada como um sistema in vitro para estudar a imunossupressão. Relativamente às lipoproteinas do adulto, a LDL e a HDL do sangue de cordão são 2 a 4 vezes mais potentes na inibição da proliferação celular. Os resultados do doseamento radioimunológico demonstraram uma forte correlação entre a quantidade de apo E nas LDL e HDL do sangue de cordão e a inibição da proliferação celular. Além disso, a remoção selectiva de lipoproteinas contendo apo E diminui a capacidade inibitória da LDL do sangue de cordão e elimina quase completamente a inibição pela HDL. Os resultados indicam que as lipoproteinas do sangue de cordão contendo apo E em associação, quer com LDL quer com HDL, podem suprimir a resposta imunitária (Curtiss et al., J. Immunol., 133:1379, (1984)). 0 feto é um alo-enxerto em relação à sua mãe. Portanto, os níveis fetais relativamente elevados de apo E podem ter significado funcional no estabelecimento do próprio, assim como na manutenção do feto in útero.

Mais recentemente, foi estudda a actividade inibitória da apo E isolada (isenta de lípido). A imunossupressão foi medida como inibição da absorção e incorporação de 3H-timidina pelas células mononucleares do sangue periférico (P8M) com fito--hemaglutinina (PHA). A apo È isolada a partir das lipoproteinas apresenta boa actividade (isto é, foram necessários aproximada-mente 15 ug/ml para uma inibição de 50^ e a inibição máxima ocorreu a 20 wg/ml), enquanto que as fracções contendo as apoproteínas C isentas de lípides não foram inibitórias a >20 ng/

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/ml (Pepe et al., J. Immunol., 126:3716, (1986)). fi supressão da proliferação de linfócitos pela lipoproteina nativa, LDL-In, é irreversível e apresenta exigências temporais distinguíveis (Curtiss et al. J. Immunol.. 115:1452, (1976), Curtiss et al., J. Immunol.. 118:1966, (1977). A supressão pela apo E isolada é idêntica» Isto é, as células expostas à apo E isolada durante 24 horas, e lavadas até ficarem isentas de apo E não associada a células, antes da estimulação pelo mitogénio, permanecem completamente suprimidas» E, a inibição máxima é obtida, quer com LDL--In ou com apo E, apenas após uma exposição de 24 horas das células antes da adição do mitogénio. Períodos de exposição de 18 horas ou menores resultam em pouca ou nenhuma supressão por qualquer dos inibidores. Além disso, as células recebendo os inibidores ou PHA simultaneamente, ou as células recebendo qualquer um dos inibidores após a exposição ã PHA, são inteiramente capazes de responder à indução pelo mitogénio, sugerindo que nem a LDL-In nem a apo E são directamente tóxicas. A irreversibili-dade e as exigências temporais da supressão confirmam que a apo E isolada a partir das lipoproteínas tem as mesmas caracteristicas de imunossupressão que a LDL-In, e que uma porção activa da LDL--In é a apo E (Pepe et al., J, Immunol», 126:3716, (1986)).

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Cardin et al., Biochem. Biophys» Re's. Comm.» 154:741-745, (1988), descreveram que uma porção polipeptidica da apo E tendo uma sequência de resíduos de aminoácido idêntica à dos resíduos de apo E 141-155, inibe a proliferação de linfócitos quando acoplada a albumina de soro de bovino (BSA). Contudo, encontrava--se conspicuamente ausente do estudo de Cardin et al. qualquer controlo para a viabilidade celular permitindo determinar se a inibição observada era ou não devida a citotoxicidade do conjugado péptido-BSft»

Como antecedentes adicionais , Dyer et al., J» Biol. Chem.. 263:10965-10973 (1988), descreveram que a Apo de ratazana, isenta de lípido, isolada, inibe a produção de androgénios pelas células intersticiais e da teca do ovário, induzida pela gonadotrofina, hormona luteinizante (LH).

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Em publicações recentes foram descritos diversos imunoensai-os desenvolvidos para a detecção da apo E_ Foram descritas, por investigadores utilizando anti-soros policlonais em imunoensaios quantitativos, concentrações de apo E humana no plasma largamente discordantes, provavelmente devido à utilização de padrões e anti-soros diferentes. Greg et al., NIH Publication, 83-1266 (1983). ft maior parte dos ensaios exigem a utilização de desnaturantes ou detergentes para “ expor '* todos os epítopos de apo E no plasma humano e em lipoproteinas isoladas. Isto pode acontecer porque a maioria dos anti-soros são produzidos por imunização com apo E isolada, a qual tende à auto-agregação [Greg et al., NIH Publication. 83-1266 (1983); Havei et al., J. Clin. Invest., 66:1351-1362 (1980)] e à formação de hetero e homo--dímeros por meio de pontes dissulfeto. Tada, et al., Biochem. Biophys. Res, Comm., 90:297-304 (1979).

Dado que é altamente provável que estes anti-soros contenham populações de anticorpos dirigidas contra epítopos de apo E que são não-existentes ou "mascarados" nas lipoproteinas ricas em lipidos, é necessária a utilização de detergentes ou desnatu-rantes nas amostras de plasma ou de lipoproteina Intacta, tornando o problema ainda mais complexo.

Breve sumário do invento

Foi agora descoberto que a sequência de resíduos de aminoácido correspondente aos resíduos 141-155 da apo E madura pode mimetizar a actividade biológica da apo E apenas quando presente como um péptido multimérico ou como um auto-conjugado. Também foi descoberto que o efeito inibitório sobre a proliferação de linfócitos dos conjugados de péptido-BSft, onde o péptido tem uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente aos resíduos 141-155 da apo E, não é fisiologicamente específico mas antes devido a citotoxicidade. Um polipéptido de apo E multimérico é útil para a preparação de anticorpos, e em métodos de diagnóstico para monitorizar as quantidades de antigénios de apo E num fluido corporal vascular.

Assim o presente invento abrange um análogo polipeptidico

71 415 SCRF 187.3 -13- de apo E caracterizado por uma pluralidade de segmentos possuindo, cada um deles, uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo aos resíduos 141-155 da apo E, por exemplo, (LRKLRKRLLRDADDL)a onde a é um número inteiro de pelo menos 2, indicando o número de vezes que a sequência entre parêntesis está presente dentro da estrutura primária do polipéptido. Numa concretização preferida, o presente invento abrange um péptido em tandem representando duas repetições da sequência 141-155.

Numa outra concretização, o presente invento abrange um auto-conjugado isolado, isto é, polipéptidos tendo as sequências de resíduos de aminoácido correspondentes ligadas operativamente uma à outra, por outra ligação que não uma ligação peptídica, entre o grupo amino alfa e o grupo carboxi de resíduos de aminoácido contíguos. 0 conjugado contém uma pluralidade de polipéptidos ligados operativamente tendo sequências de resíduos de aminoácido correspondendo ã sequência dos resíduos 141-155 de apo E.

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Qs polipéptidos e conjugados de acordo com o presente invento são agentes úteis para modular a função celular diferenciada, tal como a proliferação de linfócitos, a produção de androgénios pelo ovário, a ligação e degradação das IDL, e similares, Também são abrangidas para a modulação de função celular diferenciada as composições terapêuticas contendo um polipéptido ou conjugado de acordo com este invento num excipiente farmacêuticamente aceitável, tipicamente sob a forma de dose unitária.

Um outro aspecto abrangido por este invento é uma composição compreendendo moléculas de anticorpo que imunorreajam com um polipéptido contendo uma pluralidade de segmentos possuindo cada um deles, uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo â fórmula LRKLRKRLLRDADDL (pl41-155) e apo E/VLDL, mas que não imunorreajam com o polipéptido p93-112 ou pl72-182 e, preferivelmente, não imunorreajam com um polipéptido contendo apenas um monómero de pl41-155. É ainda abrangido um processo para detecção de antigénios de apo E numa amostra de fluido vascular, por mistura da amostra com

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um anticorpo anti-apo E para formar uma mistura imunorreaccional, estando o anticorpo, preferivelmente, ligado operativamente a um suporte sólido de modo que a mistura imunorreaccional tenha uma fase liquida e uma fase sólida, e que o referido anticorpo contendo moléculas de anticorpo que imunorreajam com um polipéptido contendo uma pluralidade de segmentos possuindo, cada um deles, uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula LRKLRKRLLRDADDL e com apo E/VLDL, mas que não imunorreajam com o polipéptido p93-112 ou pl72-182 e, preferivelmente, não imunorreajam com um polipéptido contendo apenas um monómero de pl41-155. Esta mistura imunorreaccional é mantida sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para formar um produto imunorreaccional de apo E. Em seguida, a quantidade de produto imunorreaccional assim formado é detectada e, desse modo, é determinada a quantidade de antigénio de apo E presente na amostra de fluido vascular.

Numa concretização mais preferida, o passo de detecção é executado por mistura de um agente de ligação específico, marcado, capaz de ligar uma partícula de lipoproteína contendo apo E com o produto imunorreaccional contendo apo E, para formar uma mistura reaccional marcadora, e manutenção desta mistura sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para o agente de ligação específico marcado se ligar ao produto imunorreaccional contendo apo E para formar um complexo marcado o qual pode ser detectado.

Numa concretização mais preferida, o agente de ligação especifico, marcado é um anticorpo anti-B-100, monoclonal, produzido pelo hibridoma que tem a designação da ATCC HB8746,

Também é abrangido um processo para detecção de um antigénio de apo E nurria amostra de fluido vascular, compreendendo os passos de: (i) mistura de uma amostra de fluido vascular com um análogo peptídico de apo E, ligado a uma fase sólida, contendo uma pluralidade de segmentos possuindo, cada um deles, uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo ã fórmula LRKLRKRLLRDADDL para formar uma primeira mistura de fase sólida-

71 415 SCRF 187.3 -líquida; (ii) mistura de uma composição de anticorpo, contendo uma quantidade limitante de moléculas de anticorpo anti-péptido de apo E de acordo com este invento que imunorreajam com o antigénio de apo E, com a primeira mistura para formar uma segunda mistura; (iii) manutenção da segunda mistura sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para formar um produto imunorreaccional contendo o antigénio do péptido de apo E na fase sólida; e (iv) determinação da quantidade de produto imunorreaccional presente na fase sólida formada e, desse modo, a quantidade de antigénio de apo E no fluido. Numa concretização preferida, o anticorpo anti-apo E de revelação está operativamente ligado a um meio indicador enzimá-tico, e o produto formado é um produto imunorreaccional marcado. Ainda abrangido é um sistema diagnóstico, na forma de conjunto, compreendendo, numa quantidade suficiente para executar pelo menos um ensaio, uma composição de anticorpo contendo moléculas de anticorpo anti-apo E que imunorreajam com um polipêptido contendo uma pluralidade de segmentos possuindo, cada um deles, uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula LRKLRKRLLRDADDL, e com apo E/VLDL, mas não imunorreajam com os polipéptidos p73-112 ou pl72-182 e, preferivelmente, não imunorreajam com um polipêptido contendo apenas um monómero de pl41-155. No caso onde a apo B-100 é utilizada como um marcador para a detecção, é incluída uma composição de anticorpo de revelação contendo moléculas de anticorpo anti-apo B-100. Numa concretização preferida, as moléculas de anticorpo de captura estão ligadas operativamente a uma matriz sólida, e as moléculas de anticorpo de revelação estão ligadas operativamente a um meio indicador enzimático. 45- É ainda abrangido um processo para monitorização da eficácia de um regime terapêutico para facilitar a clearance do colesterol. Este processo compreende: (i) a determinação da quantidade total de componentes de apo E no fluido vascular, e

71 415 SCRF 187.3 (ii) a determinação da quantidade de apo E efectiva associada com partículas de lipoproteína contendo colesterol no fluido vascular. Assim, é determinada a razão receptor de apo E total-apo E competente, e a razão resultante é relacionada com os níveis de concentração predeterminados que foram previamente correlacionados com o grau de eficiência da clearance do colesterol.

Breve descrição dos desenhos

ft Figura 1 ilustra que todos os conjugados de péptido de apo E-BSAT ensaiados tal como descrito no Exemplo 2, inibiam a proliferação de linfócitos duma forma aproximadamente equivalente, indicando, desse modo, uma falta de especificidade. Foram adicionadas concentrações crescentes de conjugados de péptido apo E-BSA às culturas que continham 1 x 10^ células mononucleares de sangue periférico por ml. As células foram cultivadas a 37°C em RPMI com 5¾ de soro de bovino fetal. Todas as células foram expostas a PHft às 24 horas. Cada ponto representa a absorção e incorporação de ^H-timidina média, medida em contagens por minuto (cpm), de quatro alvéolos por tratamento, e o erro padrão foi menor do que 10¾ para todos os pontos.

A Figura 2 ilustra que a inibição da proliferação de linfócitos pelo péptido pl41-155 derivado da apo E, auto--conjugado, o qual é um conjugado especifico quando ensaiado tal como descrito no Exemplo 3. Foram adicionadas concentrações crescentes de auto-conjugados (pl41-155)-(pl41-155), (pl72-182)- -(pl72-182) e (p93-112)-(p93-112) a culturas que continham 1 x x 10& células mononucleares de sangue periférico por ml. As células foram cultivadas a 37eC em RPMI com 5¾ de soro. Todas as células foram expostas a PHA às 24 horas, foram marcadas com -timidina às 48 horas e foram colhidas às 72 horas. As células de controlo incorporaram 124 130 cpm ± 4539. Este valor representa 100¾. A Figura 3 ilustra que a inibição da proliferação de linfócitos pelo auto-conjugado (pl41-155)-(pl41-155), quando adicionado a- culturas que continham 1 x 10& células mononucleares de sangue periférico por ml, não foi devida à citotoxicidade. Tal

-17- J 71 415 SCRF 187,3

J como descrito no Exemplo 3, as células foram cultivadas a 37°C em RPMI com 5¾ de soro de bovino fetal. Todas as células foram, então, expostas a PHA às 24 horas, foram, marcadas com ^H--timidina às 48 horas e foram colhidas às 72 horas. Os sobrenadantes das culturas celulares de alvéolos duplicados foram recolhidos para análise da actividade da lactato-desidrogenase (LDH) de acordo com o método de Carney et al., J, Immunol., 134=1804 (1985). Os dados são expressos como percentagem do controlo, ft absorção e incorporação de ^H-timidina e a actividade da LDH dos linfócitos de controlo expostos ao PBS foi uma variação na D.O. de 0,085 e 1,232, a 340 nm/min, respectivamente. A actividade da LDH foi medida a seguir à lise das células com h20. Cada ponto representa o valor médio de 4 alvéolos por tratamento, e o erro padrão foi menor do que 10¾.

J A Figura 4 ilustra que todos os conjugados de péptido de apo E-BSA inibiram a produção de androgénios pelo ovário duma forma aproximadamente equivalente, indicando, desse modo, uma falta de especificidade, Concentrações crescentes de conjugados de péptido de apo E-BSA foram adicionadas, nas concentrações indicadas, a células do ovário (1 x 10^/ml), que foram cultivadas a 37°C em meio modificado 5a de McCoy, isento de soro, contendo 4 ng/ml de LH e 300 ug/ml de HDL humana, tal como descrito no Exemplo 4. Após 48 horas de cultura, os sobrenadantes foram recolhidos, e a concentração de androstenodiona foi medida por doseamento radio-imunológico. Cada ponto representa a concentração de androstenodiona, média, de 4 alvéolos por tratamento, e o erro padrão foi menor do que 10¾ para todos os pontos. A Figura 5 ilustra que a inibição da produção de androstenodiona pelo ovário, pelo péptido (pl41-155) derivado de apo E, auto-conjugado, o qual é um conjugado especifico quando ensaiado tal como descrito no Exemplo 5. Concentrações crescentes de auto-conjugados (pl41-155) - (pl41-155), (pl72-182) - (pl72--182) e (p93-112) - (p93-112) foram adicionadas às células do ovário (1 x 10^/ml) que foram cultivadas a 37°C em meio 5a de McCoy isento de soro contendo 4 ng/ml de LH e 300 ug/ml de HDL humana. Após 48 horas de cultura, foram recolhidos os sobrena-

71 415 SCRF 187.3 -18- dantes, a concentração de androstenodiona foi medida por imuno-ensaio, e os dados foram expressos como na legenda da Figura 4.

J A Figura 6 ilustra que a produção de androstenodiona pelo ovário foi especificamente inibida pelo auto-conjugado (pl41--155)-(pl41-155) sem causar toxicidade celular directa quando medida tal como descrito no Exemplo 5. Foram adicionadas concentrações crescentes de auto-conjugado (pl41-155)-(pl41-155) â células do ovário (1 x 105/ml), que foram cultivadas a 37°C em meio 5a de McCoy isento de soro contendo 4 ng/ml de LH e 300 ug/ml de HDL humana. Após 48 horas de cultura, foram recolhidos os sobrenadantes e as concentrações de androstenodiona e pro-gesterona (esteróide) foram medidas por doseamento radioimunoló-gico, e os dados foram expressos como na legenda da Figura 4.

A Figura 7 ilustra que o péptido em tandem de apo E, p(141--155)2-(pl41-155)2, afecta a proliferação de linfócitos duma forma dependente da dose, bifásica, tal como descrito no Exemplo 6. Concentrações crescentes do péptido em tandem de apo E foram adicionadas a culturas que continham 8 x 10^ células mononu-cleares de sangue periférico por ml. As células foram cultivadas a 37°C e em RPMI com 5% de soro. Todas as células foram expostas a PHA as 24 horas, marcadas com ^H-timidina ãs 72 horas e colhidas às 90 horas. Foram medidas as contagens por minuto (cpm) de ^H-timidina nas células colhidas, e os dados foram expressos como a média de quatro alvéolos por tratamento, como uma medida da absorção e incorporação de timidina (x 1000 cpm). 0 desvio padrão foi menor do que 10% para todas as médias. A Figura 8 ilustra que a proliferação de linfócitos foi inibida pelo auto-conjugado do péptido em tandem de apo E, p(141--155)2, quando adicionado a culturas que contêm 8 x 10^ células mononucleares de sangue periférico por ml, tal como descrito no Exemplo 6. As células foram cultivadas, marcadas, colhidas, e a absorção e incorporação de timidina foi medida como na legenda da Figura 7. A Figura 9 ilustra que o péptido em tandem de apo E, p(141~ -155)2, afecta a produção de androstenodiona pelo ovário duma -19- SCRF 187.3 forma dependente da dose, bifásica, tal como descrito no Exemplo 7. Foram adicionadas concentrações crescentes do péptido em tandem de apo E a células do ovário (8 x lO^/ml), que foram cultivadas a 37°C em meio modificado 5a de McCoy, isento de soro, contendo 4 ng/ml de LH e 300 ug/ml de HDL humana. Após 48 horas de cultura, os sobrenadantes foram recolhidos, a concentração de androstenodiona medida por doseamento radioimunológico e os dados foram expressos como descrito na legenda da Figura 4. A Figura 10 ilustra que o péptido em tandem de apo E, p(141-155)2, afecta a ligação e degradação da LDL duma forma dependente da dose, bifásica, tal como determinado no Exemplo 9. No painel superior, concentrações crescentes de competidor compreendendo o péptido em tandem de apo E p(141-155)2, LDL, monómero de controlo pl41-155 ou p74-105 de controlo, foram adicionadas a culturas de células THP-1, simultaneamente com a adição de 125I~LDL. 0 desaparecimento da 125i-l_DL solúvel em ácido foi seguido durante uma incubação de cinco horas a 37°C. Cada ponto representa a radioactividade média de 4 alvéolos por tratamento. Os resultados são expressos como B/B0, onde B é igual a cpm ligado menos as contagens solúveis em TCA em sobrenadantes de células tratadas com péptidos, e Bc é igual a cpm ligado menos as contagens solúveis em TCA em sobrenadantes de células tratadas com PBS. 0 desvio padrão foi menor do que 10¾ para todas as médias. 0 painel inferior mostra a especificidade da ligação do péptido em tandem aos receptores de LDL. As células THP-1 foram estimuladas com ΡΙΊΑ durante 4 dias. A LDL foi acetilada, radio--marcada, e precipitada em TCA. Após 5 horas a 37°C, as razões B/B0 foram analisadas e expressas como no painel superior. Nem a LDL nem o péptido em tandem inibiram a degradação da *25I-LDLa, mas o péptido em tandem causou uma inibição de 80¾ da degradação da 125I-LDL. A Figura 11 ilustra que substituições de aminoácidos específicos no péptido em tandem alteram a sua capacidade para inibir a ligação da 125I-LDL a fibroblastos, quando medida tal

como descrito no Exemplo 10. Cada ponto é a média de 3 experiências idênticas e simultâneas (réplicas) por tratamento com o SEM < 10¾. São mostrados^ Lys 143 -> Ala; Leu 144 ->Pro; Arg 150 -> Ala; e o péptido em tandem nativo.

A Figura 12 ilustra que o péptido trimérico é um inibidor mais potente da degradação da LDL do fibroblasto do que o péptido em tandem, quando ensaiados tal como descrito no Exemplo 11. Cada ponto é a média de 5 experiências idênticas e simultâneas (réplicas) por tratamento com SEM <"10%, e os resultados são expressos como B/B0 tal como descrito na legenda da Figura 10. A Figura 13 ilustra a ligação específica, saturável, do 12^1-péptido em tandem, ligado a células THP-1 de acordo com o ensaio descrito no Exemplo 12. Os pontos mostrados são a média de 5 experiências idênticas e simultâneas (réplicas) (SEM < 10¾) e representam pmoles ligadas especificamente de péptido em tandem. A ligação não específica (isto é, a ligação em presença de 500 ug/ml de VLDL) apresentou a média de 23,4¾ do total de contagens ligadas. A análise de "scatchard" dos dados é apresentada na inserção da figura. A Figura 14 sumariza os efeitos in vitro do péptido em tandem de apo E p(141-155)2 sobre a proliferação de linfócitos, a produção de androgénios pelo ovário e a ligação da LDL. Estes dados podem servir como um modelo para a determinação in vivo da quantidade apropriada de péptido e/ou conjugado a ser administrada, baseada no efeito terapêutico desejado, por exemplo, a absorção e incorporação hepática de LDL (degradação).

Descrição detalhada do invento A. Definicdes

Resíduo de Aminoácidos os resíduos de aminoácido aqui descritos estão, preferivelmente, na forma isomérica "L". Contudo, os resíduos na forma isomérica "D" podem substituir qualquer resíduo de L-aminoácido desde que a propriedade funcional desejada seja conservada pelo polipéptido. NH2 refere-se ao grupo amino livre presente no terminal amino de um polipéptido.

71 415 SCRF 187.3 -21 COOH refere-se ao grupo carboxi livre presente no terminal carboxi de um polipéptido, Em harmonia com a momenclatura padrão dos polipéptidos, J, Biol. Chem., 243=3552-59 (1969), as abreviaturas para os resíduos de aminoácido são apresentadas na Tabela de Correspondência seguinte:

TABELA DE CORRESPONDÊNCIA SÍMBOLO AMINOÁCIDO 1-Letra 3-Letras Y Tyr tirosina G Gly glicina F Phe fenilalanina M Met metionina A Ala alanina S Ser serina I Ile isoleicina L Leu leucina T Thr treonina V Vai valina P Pro prolina K Lys lisina H His histidina Q Gin glutamina E 61U ácido glutâmico W Trp triptofano R Arg arginina D Asp ácido aspártico N Asn asparagina C Cys cisteína

Deverá notar-se que todas as sequências de resíduos de aminoácido são aqui representadas por fórmulas cuja orientação da esquerda para a direita se encontra na direcção convencional do terminal amino para o terminal carboxi. Além disso, deverá notar-se que um traço no início ou no fim de uma sequência de resíduos de aminoácido indica uma ligação peptídica a uma outra sequência de um ou mais resíduos de aminoácido.

J 71 415 SCRF 187,3 -22-

Polipéptido: refere-se a uma série linear de resíduos de aminoácido ligados uns aos outros por ligações peptídicas entre o grupo amino alfa e o grupo carboxi de resíduos de aminoácido contíguos» Péptido: tal como aqui utilizado refere-se a uma série linear de não mais do que cerca de 50 resíduos de aminoácido ligados uns aos outros como num polipéptido.

J

Proteína: refere-se a uma série linear de mais do que 50 resíduos de aminoácido ligados uns aos outros como num polipéptido. Péptido sintético: refere-se a uma cadeia, produzida quimicamente, de resíduos de aminoácido ligados uns aos outros por ligações peptídicas, que é isenta de proteínas que ocorrem naturalmente ou de fragmentos destas

B. Polipéptido de Apo E

0 presente invento abrange um polipéptido capaz de mimetizar substancialmente a capacidade da apo E para induzir a função celular diferenciada, tal como a degradação hepática das LDL, a proliferação de linfócitos, a secreção de androgénios pelas células intersticiais e da teca do ovário, e similares. Isto é, um polipéptido objecto actua como um análogo de apo E pelo menos em relação à capacidade da apo E para inibir a proliferação de linfócitos e/ou a secreção de androgénios pelo ovário, e aumento da absorção e incorporação de LDL pelos hepatócitos.

Um polipéptido objecto é adicionalmente caracterizado pela presença de uma pluralidade de segmentos derivados da apo E (regiões) dentro da estrutura primária do polipéptido, sendo cada um dos segmentos definido por uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula:

Leu-Arg-Lys-Leu-ftrg-Lys-ftrg-Leu-Leu-ftrg-ftsp-ftla-Asp-fisp-Leu, também designada como p(141-155), porque a sequência de resíduos de aminoácido corresponde aos resíduos 141 até 155 da proteína apo E nativa.

Os segmentos derivados da apo E são capazes de se ligarem ao

-23- J 71 415 SCRF 187.3 receptor de LDL e/ou à proteína relacionada com o receptor de LDL, [Herz et al., EMBO Journal, 7:4119-4129 (1988)], tal como evidenciado pela capacidade da ligação para ser inibida competitivamente.

Os segmentos derivados da apo E podem ser adjacentes e/ou contíguos dentro da cadeia polipeptidica, sendo os segmentos adjacentes separados na sequência de resíduos de aminoácido do polipéptido por um ou mais resíduos espaçadores. Preferivelmente, os resíduos espaçadores constituem um segmento espaçador na gama de cerca de 1 a cerca de 20, preferivelmente de cerca de 5 a cerca de 15, e mais.geralmente de cerca de 10, resíduos de aminoácido de comprimento. filém disso, um polipéptido objecto pode conter um segmento de comando de 1, até, convenientemente, cerca de 33, tal como cerca de 11, cerca de 18 ou cerca de 22, resíduos de aminoácido, localizado no amino terminal do segmento espaçador ou do derivado de apo E, amino terminal.

J

Duma forma semelhante, um polipéptido objecto não necessita terminar com o resíduo do terminal carboxi de um segmento derivado de apo E ou segmento espaçador. Pode estar presente um segmento de cauda do terminal carboxi contendo 1, convenientemente até cerca de 33, tal como cerca de 11, cerca de 18 ou cerca de 22, resíduos de aminoácido.

Os polipéptidos preferidos de acordo com o presente invento são, por isto, definidos pela fórmula I: 8-(Xn-Leu~ftr g-Lys-Leu-Arg-Lys-ftrg--Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp-Leu--Zm)a-J>

Na fórmula, B é um grupo NH2 do terminal amino ou um segmento lider anteriormente discutido; J é um grupo C00H do terminal carboxi ou um segmento da cauda anteriormente discutido; X e Z são, respectivamente, o primeiro e segundo segmentos espaçadores cujas sequências de resíduos de aminoácido podem ser iguais ou diferentes; n é ou 1 ou 0, de tal modo que, quando n é 1, X está

71 415 SCRF 187,3 -24-

presente, e quando n é 0, X não está presente; m é ou 1 ou 0, de tal modo que, quando m é 1, Z está presente, e quando m é 0, Z não está presente; e a é um número inteiro de 2 a cerca de 10, mais preferivelmente de 2a cerca de 5, e geralmente 2 a 3, indicando o número de vezes que a sequência de resíduos de aminoácido entre parêntesis está presente (repetida) na estrutura polipeptidica primária. Preferivelmente, a sequência entre paren-têsis corresponde na sua totalidade, e preferivelmente é idêntica, a uma porção da sequência de resíduos de aminoácido da apo E. Os polipéptidos preferidos são aqueles cujas fórmulas estão representadas na Tabela 1.

Tabela 1

Designação^ p(141-155)2 P(129-163)2

Sequências de Resíduos de ftminoácido LRKLRKRLLRDADDLLRKLRKRLLRDADDL STEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQSTEEL-RVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQ 1 ft designação para cada péptido indica a posição dentro da sequência de resíduos de aminoácido da proteína Apo E madura à qual a sequência peptídica corresponde, isto é, da qual é derivada.

Deverá notar-se que p(129-163)2 contém um segmento de comando de 12 resíduos STEELRVRLASH (resíduos 1-12), um segmento espaçador de 20 resíduos QKRLAVYQSTEELRVRLASl·! (resíduos 28-47) e um segmento de cauda de 8 resíduos QKRLAVYQ (resíduos 63-70). A designação p(141-155)2 define um péptido em tandem de apo E, o qual contém duas sequências adjacentes do segmento pl41-155. Um polipéptido preferido adicional é um “trímero", contendo três sequências adjacentes do segmento pl41-155, designado p(!41--155)3. Também são preferidos os auto-conjugados dos péptidos em tandem de apo E, designados por p(141-155)2~p(141-155)2, e dos péptidos de apo E, triméricos, designados p(141-155)3~p(141--155)3.

Um polipéptido objecto contém, tipicamente, um total de cerca de 30 a cerca de 450 resíduos de aminoácido, preferivelmente de cerca de 60 a cerca de 120 resíduos. Tipicamente, um

J 71 415 SCRF 187.3 -25- polipéptido objecto contém não mais do que cerca de 1007 preferivelmente não mais do que cerca de 70 e, geralmente, não mais do que cerca de 30 ou 40 resíduos de aminoácidos na sua sequência primária.

J

Um polipéptido objecto inclui qualquer análogo, fragmento ou derivado químico de um polipéptido cuja sequência de resíduos de amino ácido é aqui mostrada, desde que o polipéptido seja capaz de induzir a função celular diferenciada duma forma correspondente à da apo E. Deste modo, um polipéptido presente pode ser sujeito a várias alterações, substituições, inserções e delecções, onde tais alterações proporcionem certas vantagens no seu uso. 0 termo "análogo" inclui qualquer polipéptido tendo uma sequência de resíduos de aminoácido substancialmente idêntica a uma sequência aqui especificamente mostrada, na qual um ou mais resíduos foram conservativamente substituídos com um resíduo funcionalmente semelhante e a qual apresenta a capacidade para mi metizara apo E, tal como aqui descrito. Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo não-polar (hidrofóbico) tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro, a substituição de um resíduo polar (hidrofílico) por outro, tal como entre arginina e lisina, entre glutamina e asparagina, e entre glicina e serina, a substituição de um resíduo básico tal como lisina, arginina ou histidina, por um outro, ou a substituição de um resíduo ácido , tal como ácido aspártico ou ácido glutâmico por outro. A frase "substituição conservativa" também inclui o uso de um resíduo derivado quimicamente no lugar de um resíduo não--derivado, desde que o referido polipéptido apresente a activi-dade de ligação requerida. "Derivado químico" refere-se a um polipéptido objecto tendo um ou mais resíduos derivados quimicamente por reacção de um grupo funcional lateral. As referidas moléculas derivadas incluem, por exemplo, aquelas moléculas nas quais os grupos amino livres foram derivados para formar hidrocloretos de amina, grupos -26- -26- 71 415 SCRF 187.3 jáír ytr~r· p-toluenossulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t-butiloxi-carbonilo, grupos cloroacetilo ou grupos formilo. Os grupos carboxilo livres podem ser derivados para formarem sais, ésteres de metilo e de etilo, ou outros tipos de ésteres ou hidrazidas. Os grupos hidroxilo livres podem ser derivados para formarem derivados de O-acilo ou O-alquilo. 0 hidrogénio do imidazolo da histidina pode ser derivado para formar N-im-benzil-histidina. Também incluídos como derivados químicos estão aqueles péptidos que contêm um ou mais derivados de aminoácido que ocorrem naturalmente, dos vinte aminoácidos padrão. Por exemplos a prolina pode ser substituída por 4-hidroxiprolina; a lisina pode ser substituída por 5-hidroxilisina; a histidina pode ser substituída por 3-metil-histidina; a serina pode ser substituída por homoserina; e a lisina pode ser substituída por ornitina. Os polipéptidos do presente invento também incluem qualquer polipéptido tendo uma ou mais adições e/ou delecções de resíduos relativamente à sequência de um polipéptido cuja sequência é aqui mostrada, desde que a actividade requerida seja mantida. 0 termo "fragmento" refere-se a qualquer polipéptido objecto tendo uma sequência de resíduos de aminoácido mais curta do que um polipéptido cuja sequência de resíduos de aminoácido é aqui mostrada.

Um polipéptido objecto pode ser preparado utilizando metodologias de ácido nucleico recombinante bem conhecidas na arte. Por exemplo, sequências de ADN úteis na produção de um polipéptido objecto são descritas em Paik et al., Proc, Natl. Acad. Sei. USA, 82:3445-3449, (1985); McLean et al., 1, Biol. Chem., 259:6498--6504, (1984); e Rall et al., GL Biol. Chem.. 257-4171-4178 (1982). Um segmento de ADN que codifica um polipéptido do invento pode ser sintetizado por técnicas químicas, por exemplo pelo método do fosfotriéster de Matteucci et al., Am. Chem. Sco. , 103=3185, (1981). 0 segmento de ADN pode, então, ser ligado a um vector de expressão e um hospedeiro transformado com o mesmo pode ser utilizado para produzir o polipéptido. Ver, por exemplo, Current Protocols In Molecular Biology, Ausubel et al., ed., John Willey & Sons, New York, NY; Patentes dos E.U.A. NS. 4 237 334 e

71 415 SCRF 187.3 N2. 4 356 270.

Os vactores de expressão recombinantes capazes de expressarem um polipéptido objecto e os processos para a sua utilização na produção de um polipéptido objecto são abrangidos como parte do presente invento.

Um polipéptido objecto também pode ser preparado utilizando a técnica sintética em fase sólida inicialmente descrita por Merrifield, em Am. Chem. Soe.. 85:2149-2154, (1963). Outras técnicas de síntese de polipéptidos podem ser encontradas, por exemplo, em M. Bodanszky et al,, Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2ã. ed., (1976), assim como em outras obras de referência conhecidas pelos especialistas na arte. Um sumário de técnicas de síntese de polipéptidos pode ser encontrado em J. Stuart e J.D. Young, Solid Phase Peptide Syntesis, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 3§. Ed., Neurath, H. et al., Ed., pág. 104-237, Academic Press, New York, NY (1976). Grupos protectores adequados para utilização em tais sínteses serão encontrados nos textos acima assim como em J.F.W. McOmie, Protective Qroups in Qrganic Chemistry. Plenum Press, New York, NY (1973).

Em geral, esses processos sintéticos compreendem a adição sequencial de um ou mais resíduos de aminoácido ou resíduos de aminoácido adequadamente protegidos a uma cadeia polipeptídica em crescimento. Normalmente, ou o grupo amino ou o grupo carboxilo do primeiro resíduo de aminoácido é protegido por um grupo protector adequado, selectivamente removível. Um grupo protector selectivamente removível, diferente, é utilizado para aminoácidos contendo um grupo lateral reactivo, tal como lisina.

Usando uma síntese em fase sólida como um exemplo, o aminoácido protegido ou derivado é fixado a um suporte sólido inerte através do seu grupo amino ou carboxilo, não protegido. 0 grupo protector do grupo carboxilo ou do grupo amino é, então, selectivamente removido, e o aminoácido seguinte na sequência tendo o grupo complementar (carboxilo ou amino) adequadamente protegido é misturado, e feito reagir sob condições adequadas para formar a ligação amida com o resíduo já fixo ao suporte

71 415 SCRF 187.3 -28- sólido. 0 grupo protector do grupo carboxilo ou amino é, então, removido deste resíduo de aminoácido recém adicionado e o aminoácido seguinte (adequadamente protegido) é, então, adicionado e assim por diante. Após terem sido ligados na sequência correcta todos os aminoácidos desejados são removidos, sequencialmente ou simultaneamente quaisquer grupos protectores de grupos lateris e terminais remanescentes, (e o suporte sólido), para originar o polipéptido final.

Qualquer péptido de acordo com o presente invento pode ser utilizado sob a forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Ácidos adequados que são capazes de formar sais com os péptidos do presente invento, incluem ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromidrico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociânico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico; e ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido antranílico, ácido cinâmico, ácido naftalenossulfónico, ácido sulfanilico, e similares.

Bases adequadas capazes de formar sais com os péptidos do presente invento incluem bases inorgânicas tais como hidróxido de sódio, hidróxido de amónio, hidróxido de potássio, e similares; e bases orgânicas tais como mono-, di- e tri-, alquil e aril aminas (por exemplo, trietilamina, diisopropilamina, metilamina, dimeti-lamina e similares), e etanolaminas opcionalmente substituídas (por exemplo, etanolamina, dietanolamina, e similares). C. Conjugados 0 presente invento abrange ainda um análogo de apo E sob a forma de um conjugado polipeptídico constituído por uma pluralidade de polipéptidos ligados operativamente, por outra ligação que não uma ligação peptídica entre o grupo amino alfa e o grupo carboxi de resíduos de aminoácido contíguos, onde pelo menos dois dos polipéptidos ligados tem uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo àquela representada pela fórmula:

71 415 SCRF 187.3 -29~ S-(Xn-Leu~firg-Lys-Leu-firg-Lys-Arg--Leu-Leu-firg-Asp-Ala-Asp-Asp-Leu- na qual B, X, Z, J, n , m e â são definidos como anteriormente discutido excepto que a, também, pode ser o número inteiro 1.

Auto-conjugados preferidos são pl41-155 ligado a pl41-155, designado por (pl41-155)-(pl41-155), e pl29-163 ligado a pl29--163, designado por (pl29-163)-(pl29-163).

Em concretizações preferidas, um conjugado de acordo com este invento tem um peso molecular de menos do que cerca de 40000 daltons, preferivelmente menos do que cerca de 20 000 daltons, e mais preferivelmente menos do que cerca de 10 000 daltons.

Tipicamente, um conjugado objecto tem um peso molecular de não mais do que cerca de 15 000 daltons, preferivelmente não mais do que cerca de 8 000 daltons e, geralmente, não mais do que cerca de 4 000 daltons. Preferivelmente, o conjugado é dimérico ou trimérico, isto é, é essencialmente constituído por dois ou três cadeias polipeptídicas, respectivamente.

Um conjugado polipéptido de acordo com este invento é, ainda, caracterizado pela sua capacidade para mimetizar substancialmente a capacidade da apo E para induzir a função celular diferenciada, tal como a proliferação de linfócitos, a secreção de androgénios pelo ovário, e similares. Os conjugados objecto também são substancialmente isentos de toxicidade em relação aos linfócitos e ãs células (da teca/intersticiais) do ovário produtoras de androgénios em concentrações de cerca de 20 microgramas por mililitro (ug/ml).

As técnicas de acoplamento ou conjugação de polipéptidos através de grupos funcionais activados presentemente conhecidos na arte são particularmente aplicáveis. Ver, por exemplo, Avrameas, et al., Scand, J. Immunol., Vol. 8, Supl. 7‘7-23 (1978) e Patente dos E_U.fi. HQ. 4 493 795, HQ. 3 791 932 8 NQ 3 839 153. Além disso, pode ser executada uma reacção de acoplamento dirigida ao local de modo que qualquer perda de actividade devida à orientação do polipéptido após o acoplamento possa ser 71 415 SCRF 187.3 -30-

3:889-894 minimizada. Ver, por exemplo, Rodwell et al., Biotech, (1985), e Patente dos E.U.A. N2. 4 671 958.

Podem ser adicionados um ou mais resíduos de aminoácido adicionais aos terminais amino ou carboxi do polipéptido, para auxiliar na ligação do polipéptido para formar um conjugado. Verificou-se que os resíduos de cisteína, geralmente adicionados ao terminal carboxi do polipéptido, são particularmente úteis para formar conjugados por meio de ligações dissulfeto, mas podem ser usados outros métodos bem conhecidos na arte para a preparação de conjugados.

D. Composições para modular a degradação hepática de LDL

Toda a capacidade dos polipéptidos e conjugados de acordo com o presente invento para se ligarem ao receptor de LDL presente nos hepatócitos, o presente invento abrange uma composição para modular a absorção e incorporação hepática de LDL. A composição compreende uma porção de ligação ao receptor de LDL operativamente ligada a uma porção de ligação à LDL. A porção de ligação ao receptor de LDL compreende um polipéptido e/ou conjugado de acordo com o presente invento. Uma porção de ligação ao receptor de LDL, preferida, compreende o segmento polipeptidico designado por p(141-155)2, cuja sequência de resíduos de aminoácido está representada na Tabela 1. A porção de ligação ao receptor de LDL pode ser ligada operativamente à porção de ligação à LDL através de uma ligação peptídica ou através de uma ligação covalente que não é uma ligação peptídica entre o grupo amino alfa e o grupo carboxilo de resíduos de aminoácido contíguos.

Uma porção de ligação à LDL pode ser uma molécula de anticorpo anti-LDL ou um seu fragmento imunologicamente activo. Exemplos de moléculas de anticorpo anti-LDL são as produzidas pelos hibridomas HB8746 e HB8742, os quais foram depositados na American Tissue Culture Collection (ATCC; Rockville, MD), produzindo as duas moléculas de anticorpo anti-apo B-100. 0 polipéptido e/ou conjugado de ligação ao receptor de LDL de acordo com este invento pode ser quimicamente acoplado, tal como aqui 71 415 SCRF 187.3 -31-

anteriormente descrito, com a molécula de anticorpo anti-LDL. Alternativamente, um polipéptido de acordo com este invento pode ser incorporado na sequência de resíduos de aminoácidos primária da molécula de anticorpo por técnicas de ADN recombinante. Tipicamente, o polipéptido de ligação ao receptor de LDL será incorporado em, ou substituirá, uma porção de um dos domínios constantes da molécula de anticorpo. Ver Patente dos E.U.A. N£L 4 816 567, NS. 4 816 397 e N2. 4 647 334.

Em concretizações preferidas, a porção de ligação à LDL é uma sequência lipofílica (hidrofóbica) de resíduos de aminoácido. Mais preferivelmente, a porção de ligação à LDL é um segmento polipeptidico tendo uma sequência de resíduos de aminoácido capaz de formar urra hélice anfipática.

Naturalmente, quando o meio para ligar operativamente a porção de ligação do receptor de LDL e a porção de ligação à LDL é outro que não uma ligação peptídica, a ligação ocorre tipicamente entre cadeias de resíduos de aminoácido nos resíduos localizados nos, ou perto dos, terminais carboxi e/ou amino das porções respectivas de modo a preservar as suas actividades.

Segmentos polipeptídicos anfipáticos helicoidais preferidos de acordo com este invento, incorporados na composição quer por uma ligação peptídica quer por uma não-peptídica, incluem aqueles que têm uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo àquela de uma apolipoproteína, tal como apo B-100, apo B-48, apo C-I, apo C-II, apo C-III, apo A-I, apo A-II, apo D, apo E, e similares. Ver, Fitch, Qenetics. 86:623-644 (1977); Segrest et al., Biopolymers. 16:2053-2065 (1977); e Chan, Klin Mochenscher, 67:225-237 (1989). Pela utilização de um segmento polipeptidico anfipático helicoidal com a sequência de resíduos de aminoácido derivada de apo B-100 ou apo B-48, o polipéptido pode ser preferencialmente dirigido à LDL em oposição a outras espécies de lipoproteína. A hélice anfipática é caracterizada por uma segregação espacial de resíduos de aminoácido hidrofóbicos e hidrofílicos em faces opostas da hélice. Os resíduos não polares agrupados podem -32- SCRF 187.3 então intercalar-se nas partículas lipídicas, tais como LDL. Além desta interacção hidrofóbica, podem também existir interacções de carga especificas entre lipido e péptido. Por exemplo, foi demonstrado que um péptido de 18 resíduos pode ligar-se ao fosfolípido se possuir resíduos carregados positivamente na interface hidrofóbica-hidrofílica de uma hélice anfi-pática e resíduos carregados negativamente opostos à face hidro-fóbica da hélice. Ver Epand et al., JL. Biol. Chem,, 264=4628-4635 (1989).

Um segmento polipeptidico anfipático helicoidal particularmente preferido, útil na ligação da porção de ligação ao receptor de LDL, do segmento polipeptidico derivado da. apo E, à LDL, tem uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo ã fórmula: EWLK AFYEKVLEK LK ELF.

Em concretizações preferidas, a composição é um polipéptido de acordo com a fórmula I, na qual B e/ou J são um segmento polipeptidico anfipático helicoidal tal como descrito acima. Um polipéptido preferido deste tipo tem uma sequência de residuos de aminoácido correspondendo à fórmula: LRKLRKRLLRDADDLLRKLRKRLLRDADDL--EWLKAFYEKVLEKLKELF.

Em concretizações preferidas, o polipéptido ou conjugado objecto é disperso num transportador, tal como um fosfolípido. Mais preferivelmente, o polipéptido ou conjugado objecto é inserido de forma removível num lipossoma, isto é, é incorporado (ancorado) na bicamada do lipossoma por meio da porção de ligação à LDL. Ver, por exemplo, Gregoriadis, Trens in Biotech., 3:235-241 (1985) e Eriksson et al., págs. 141-156 em Liposome

Technology Vol. II, ed 6. Gregoriadis CRC Press, Boca Raton, FL. E. Métodos terapêuticos

Os polipéptidos, conjugados e composições abrangidos pelo presente invento são úteis como agentes para modular aqueles acontecimentos fisiológicos induzidos pela apo E nativa tais como resposta imunitária, génese de esteróides e/ou aumento da ligação hepática de LDL. Por exemplo, um polipéptido e/ou conjugado de -33- SCRF 187,3 acordo com este invento pode ser utilizado como um agente imunossupressor para inibir a proliferação de linfócitos ou como um agente para inibir a produção de androgénios pelo ovário. 0 polipéptido e/ou conjugado é administrado a um animal, tal como um humano, necessitando do referido tratamento, numa quantidade predeterminada calculada para alcançar o efeito desejado, isto é, numa quantidade terapeuticamente eficaz.

Por exemplo, quando utilizado como agente imunossupressor para inibição da proliferação de linfócitos, tal como num doente apresentando os sintomas de uma doença auto-imunitária, o polipéptido e/ou conjugado é administrado numa quantidade suficiente para alcançar uma concentração plasmática de, pelo menos, cerca de 0,8 wg/ml, preferivelmente de, pelo menos, cerca de 1,0 ng/ml, mais preferivelmente de, pelo menos, cerca de 2 wg/ml, e geralmente de 3 ou 4 ug/ml.

Em alguns casos é desejável aplicar o polipéptido e/ou conjugado objecto localmente, como um agente imunossupressor. Por exemplo, podem ser aplicados por injecção numa articulação artrítica (por ex., no fluido sinovial da articulação), cerca de 10 wg a cerca de 1 mg para suprimir a inflamação.

Quando utilizado como agente para inibir a produção de androgénios pelo ovário, tal como em fêmeas com ovários poliquisticos, o polipéptido e/ou conjugado de acordo com este invento é administrado numa quantidade suficiente para alcançar uma concentração plasmática de, pelo menos, cerca de 2 ug/ml, preferivelmente cerca de 5 pg/ml, e mais preferivelmente cerca de 10 ug/ml.

Quando o péptido em tandem de apo E p(141-155>2, ou o seu auto-conjugado, é utilizado para inibir a proliferação de linfócitos, o péptido, ou o seu conjugado, é administrado numa quantidade suficiente para alcançar uma concentração plasmática de, pelo menos, cerca de 8 mg/ml, preferivelmente, pelo menos, 10 mg/ml, e mais preferivelmente, pelo menos, 15 mg/ml. Quando utilizado para aumentar a proliferação de linfócitos, o péptido, ou o seu conjugado, é administrado numa quantidade suficiente

71 415 SCRF 187.3 -34- para alcançar uma concentração plasmática de cerca de 2 mg/ml a cerca de 6 mg/ml, preferivelmente de cerca de 3 mg/ml a cerca de 5 mg/ml.

Quando o péptido em tandem de apo E p(141-155)2, ou o seu auto-conjugado, é utilizado para inibir a produção de androgénios pelo ovário, o péptido ou o seu conjugado, é administrado numa quantidade suficiente para alcançar uma concentração plasmática de, pelo menos, cerca de 0,6 mg/ml, preferivelmente, pelo menos, 1,0 mg/ml, e mais preferivelmente, pelo menos, 8 mg/ml. Quando utilizado para aumentar a produção de androgénios pelo ovário, o péptido ou o seu conjugado, é administrado numa quantidade suficiente para alcançar uma concentração plasmática de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 0,4 mg/ml, preferivelmente de cerca de 0,2 mg/ml a cerca de 0,3 mg/ml,

Quando uma composição, contendo ou o péptido em tandem de apo E p(141-155)2 ou ° seu auto-conjugado operativamente ligado a uma porção de ligação à LDL, é utilizada para aumentar a ligação e absorção e incorporação hepáticas de LDL, como em sujeitos com hipercolesterolémia, a composição é administrada numa quantidade suficiente para alcançar uma concentração plasmática do conjugado ou péptido em tandem de, pelo menos, cerca de 20 mg/ml, preferivelmente, pelo menos, cerca de 50 mg/ml, e mais preferivelmente, pelo menos, cerca de 100 mg/ml. A preparação de composições terapêuticas que contêm polipé-ptidos como ingredientes activos é bem compreendida na arte. Tipicamente, tais composições são preparadas como injectáveis, quer como soluções liquidas quer como suspensões líquidas, podendo, contudo, também ser preparadas formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão, num líquido antes da injecção. A preparação também pode ser emulsionada. 0 ingrediente terapêutico activo é muitas vezes misturado com excipientes, os quais são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo. Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, ou similares e suas combinações. Além disso, se desejado, a composição pode conter -35- 71 415 SGRF 187,3 quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tampão do pH, os quais aumentam a eficácia do ingrediente activo.

Um polipéptido pode ser formulado na composição terapêutica como formas de sal farmaceutícamente aceitável, neutralizado. Sais farmaceutícamente aceitáveis incluem, os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres do polipéptido ou molécula de anticorpo), e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como ácidos acético, oxálico, tartárico, mandéli-co, e similares. Os sais formados a partir dos grupos carboxilo livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, de potássio, de amónio, de cálcio ou férrico, e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilami noetanol, histidina, procaína, e similares.

As composições terapêuticas contendo polipéptido são convencionalmente administradas intravenosamente ou no local da inflamação induzida de forma auto-imune, por exemplo, por injecção de uma dose unitária. O termo "dose unitária" quando utilizado em referência a uma composição terapêutica de acordo com o presente invento refere-se a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagem unitária para humanos, contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de material activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o diluente requerido, isto é, transportador ou veículo.

As composições são administradas duma forma compatível com a formulação da dosagem e numa quantidade terapeuticamente eficaz, A quantidade a ser administrada depende do sujeito a ser tratado, da capacidade do sistema imunitário do sujeito para utilizar o ingrediente activo, e do grau de inibição desejado da linfopro-liferação ou da produção de androgénio, As quantidades precisas de ingrediente activo necessárias para serem administradas dependem do julgamento do clínico e são características para cada indivíduo. Contudo, gamas de dosagem adequadas para aplicação

J 71 415 r SCRF 187.3 -36- sistémica encontram-se na ordem dos 0,01 a 10 preferivelmente um a vários miligramas de ingrediente activo por quilograma de peso corporal do indivíduo por dia, e dependem da via de

J administração. Os regimes adequados para administração inicial e injecções de reforço também são variáveis, mas não tipificados por uma administração inicial seguida por doses repetidas, com uma ou mais horas de intervalo, por uma injecção subsequente ou outra administração. Alternativamente, é abrangida a infusão intravenosa continua suficiente para manter concentrações no sangue de dez nanomolar a dez micromolar. F. Anticorpo s anticorpos monoclonais 0 termo "anticorpo" nas suas várias formas gramaticais é aqui utilizado como um substantivo colectivo que se refere a uma população de moléculas de imunoglobulina e/ou porções imunologi-camente activas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um local de combinação do anticorpo ou paratopo.

Um "local de combinação do anticorpo" é aquela porção estrutural de uma molécula de anticorpo, constituída pelas regiões hipervariáveis e variáveis das cadeias leve e pesada, que liga especificamente o antigénio.

J A frase "molécula de anticorpo" nas suas várias formas gramaticais, tal como aqui utilizada, abrange quer uma molécula de imunoglobulina intacta quer uma porção imunologicamente activa de uma molécula de imunoglobulina.

Exemplos de moléculas de anticorpo para utilização nos sistemas e métodos de diagnóstico do presente invento são moléculas de imunoglobulina intactas, moléculas de imunoglobulina substancialmente intactas e aquelas porções de uma .molécula de imunoglobulina que contém o paratopo, incluindo aquelas porções conhecidas na arte como Fab, Fab*, F(ab’ )2 e F(v)'.

As porções Fab e F(abí)2 dos anticorpos são preparadas pela reacção proteolítica da papaina e da pepsina, respectivamente, sobre anticorpos substancialmente intactos, por métodos que são bem conhecidos. Ver, por exemplo, Patente dos E.U.ft. n2. 4342566 de Theofilopolous e Dixon. As porções de anticorpo Fab* também -37- 71 415 SCRF 187.3 são bem conhecidas e são produzidas a partir das porções F(ab’)2 seguindo-se redução das ligações dissulfeto que ligam as duas porções de cadeia pesada, por exemplo com mercapto etanol, seguida por alquilação do mercaptano da proteína, resultante, com um reagente, tal como iodoacetamida. São preferidos anticorpos contendo moléculas de anticorpo intactas, e são utilizadas tal como aqui ilustrado.

Numa concretização, um anticorpo de acordo com o presente invento, isto é, um anticorpo anti-apo E, é caracterizado como sendo capaz de imunorreagir com a apo E presente em partículas de lipoproteína que contêm colesterol, tais como LDL, VLDL e similares. A apo E em associação com VLDL é denominada apo E/VLDL. Um anticorpo anti-apo E desta concretização é ainda caracterizado por imunorreagir com o polipéptido de acordo com este invento constituído por uma pluralidade de segmentos que têm a fórmula p(141-155), preferivelmente p(141-155)2, mais preferivelmente p(141-155)3, e ainda mais preferivelmente auto-conjuga-dos de p(141-155)2 ou p(141—155)3.

Numa concretização preferida, um anticorpo anti-apo E é caracterizado como estando substancialmente isento de moléculas de anticorpo que imunorreajam com o polipéptido LSKELQAAQARLGfiDME-DVR que corresponde aos resíduos 93-112 da apo E madura e designado por p93-112, ou com o polipéptido RGLSAIRERL que corresponde aos resíduos 172-182 da apo E madura e designado por ρ172—182.

Particularmente preferidas são as moléculas de anticorpo que não imunorreagem com um polipéptido contendo apenas um monómero do polipéptido de apo E pl41-155. Os polipéptidos de apo E que contêm apenas um único pl41-155, não apresentam a capacidade de mimetizar a capacidade de ligação ao receptor de LDL da apo E, que resulta na absorção e incorporação e degradação hepáticas aumentadas de partículas de lipoproteína contendo a apo E tal como aqui descrito. Os polipéptidos que mimetizam a função de ligação ao receptor de LDL, da apo E, são aqui referidos como polipéptidos de apo E "competentes para o receptor". As moléculas

71 415 SCRF 187.3 -38 de anticorpo anti-apo E que não imunorreagem com o pl41-155 monornérico apresentam, desse modo, imunoespecificidade para os polipéptidos de apo E competentes para o receptor, e apresentam imunoespecificidade para a apolipoproteína apo E que se encontra numa forma competente para o receptor.

As moléculas de anticorpo anti-apo E que são específicas para os polipéptidos de apo E ou para apo E, competentes para o receptor, têm uma utilidade particular nos imunoensaíos, nomeadamente, para monitorizar o destino dos polipéptidos de apo E administrados terapeuticamente no decurso de regimes terapêuticos, tal como aqui descritos, ou para detectar os níveis de apo E competente para o receptor numa amostra de fluido corporal vascular. A imunorreactividade dos anticorpos com os antigénios contendo apo E pode ser medida por uma variedade de ensaios imunológicos conhecidos na arte. Uma imunorreacção ilustrativa de um anticorpo anti-apo E, de acordo com este invento, por ligação directa com apo E/VLDL ou com polipéptidos de apo E pode ser ensaiada, pelo menos, pelos processos descritos no Exemplo 14.

Um anticorpo de acordo com o presente invento é, tipicamente, produzido por imunização de um mamífero com um inóculo contendo um polipéptido de apo E de acordo com este invento, tal como um auto-conjugado de p(141-155)3, e, desse modo, induzindo no mamífero moléculas de anticorpo tendo imuno-especificidade para o polipéptido de apo E. Alternativamente, a apo E/LDL ou a apo E/VLDL podem ser utilizadas como fonte de antigénio de apo E para imunização. São exemplos os processos de produção para preparação de um anti-soro de polipéptido anti-apo E policlonal, descritos no Exemplo 8. As moléculas de anticorpo são então recolhidas do mamífero e isoladas até ao nível de exigência desejado por técnicas bem conhecidas tais como, por exemplo, pela utilização de DEAE Sephadex para obter a fracção de IgG.

Para aumentar a especificidade do anticorpo, são preferidos os anticorpos que são purifiçados por cromatografia de imunoafi-nidade utilizando polipéptido de imunização afixo à fase sólida.

71 415 SCRF 187.3 -39-

Faz-se contactar o anticorpo com o polipéptido de imunização afixo ã fase sólida durante um período de tempo suficiente para que o polipéptido imunorreaja com as moléculas de anticorpo para formar um imunocomplexo afixo à fase sólida. Os anticorpos ligados são separados do complexo por técnicas padrão.

Num método relacionado para produzir um anticorpo anti-apo E que não imunorreaja substancialmente com o pl41-155 monomérico, o anticorpo anti-apo E preparado pode ser feito contactar com o pl41-155 monomérico da fase sólida de modo a permitir que os anticorpos que imunorreagem o pl41-155 monomérico formem complexos na fase sólida, e o anticorpo na fase líquida é, então, recolhido para formar o anticorpo anti-apo E que é específico para os polipéptidos de apo E competentes para o receptor. 0 anticorpo assim produzido pode ser utilizado, inter alia, nos sistemas e processos de diagnóstico do presente invento para detectar a apo E ou o polipéptido de apo E presentes numa amostra corporal. A palavra "inoculo" nas suas várias formas gramaticais é aqui utilizada para descrever uma composição contendo um polipéptido de apo E, de acordo com este invento, como um ingrediente activo, usado para a preparação de anticorpos imunorreactivos com um polipéptido de apo E. Quando um polipéptido é utilizado num inoculo para induzir anticorpos, deverá compreender-se que o polipéptido pode ser utilizado em várias concretizações, por ex., só ou ligado a um transportador como um conjugado, ou como um polímero polipeptídico, contudo, para facilidade de expressão e no contexto de um inoculo de polipéptido, as várias concretizações dos polipéptidos deste invento são aqui colectivamente referidas pelo termo "polipéptido" e pelas suas várias formas gramaticais.

Para um polipéptido que contém menos dó que cerca de 35 resíduos de aminoácido, é preferível utilizar o péptido ligado a um transportador com o fim de induzir a produção de anticorpos.

Podem ser adicionados um ou mais resíduos de aminoácido adicionais ao terminal amino ou carboxi do polipéptido para

71 415 SCRF 187.3 -40 auxiliar na ligação do polipéptido a um transportador. Verificou--se que os resíduos de cisteína adicionados aos terminais amino ou carboxi do polipéptido são particularmente úteis na formação de conjugados por meio de ligações dissulfeto. Contudo, também podem ser utilizados outros métodos bem conhecidos na arte para a preparação de conjugados. Processos de ligação ilustrativos, adicionais, incluem o uso de produtos da reacção de adição de Michael, dialdeídos tais como glutaraldeído, Klipstein et al., J. Infect, Pis., 147:318-326 (1983) e similares, ou o uso da tecnologia da carbodiimida, tal como no uso de uma carbodiimida solúvel em água para formar ligações amida a um transportador. Para uma revisão do acoplamento ou conjugação de proteínas através de grupos funcionais activados, ver Avrameas et al., Scand, Immunol.. 1:7-23 (1978).

Transportadores úteis são bem conhecidos na arte e são, geralmente, eles próprios, proteínas. Exemplos de tais transportadores são a hemocianina de lapa (género Fissurella) (KLH), edestina, tireoglobulina, albuminas tais como albumina de soro de bovino (8SA) ou albumina de soro humano (USA), glóbulos vermelhos tais como eritrócitos de carneiro (SRBC), toxóide do tétano, toxóide da cólera, assim como poliaminoãcidos tais como poli (D--lisina; D-ácido glutãmico), e similares. A escolha do transportador depende mais do uso final do inoculo e é baseada .era critérios não particularmente envolvidos no presente invento. Por exemplo, deve ser seleccionado um transportador que não gere uma reacção adversa no animal particular a ser inoculado. 0 presente inoculo contém uma quantidade imunogénica eficaz de um polipéptido de acordo com este invento, tipicamente como um conjugado ligado a um transportador. A quantidade eficaz de polipéptido por dose unitária suficiente para induzir uma resposta imunitária ao polipéptido de imunização depende, entre outras coisas, da espécie do animal inoculado, do peso corporal do animal e do regime de inoculação escolhido, tal como é bem conhecido na arte. Os inóculos contêm, tipicamente, concentrações -41— 71 415 SCRF 187.3 de polipéptido de cerca de 10 microgramas a cerca de 500 miligramas por inoculação (dose), preferivelmente cerca de 50 microgramas a cerca de 50 miligramas por dose. 0 termo "dose unitária" no que diz respeito aos inóculos refere-se a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para animais, contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de material activo, calculada para produzir o efeito imunogénico desejado, em associação com o diluente requerido; isto é, transportador ou veiculo. As especificações para a nova dose unitária de um inoculo de acordo com este invento são ditadas por, e são directamente dependentes (a) das características únicas do material activo e do efeito imunológico particular a ser alcançado, e (b) das limitações inerentes à arte na composição de tal material activo para utilização imunológica em animais, tal como aqui descrito em detalhe, sendo estes aspectos do presente invento. 0s inóculos são tipicamente preparados a partir de conjugado de polipéptido sólido, seco, por dispersão do conjugado de polipéptido num diluente fisiologicamente tolerável (aceitável), tal como água, solução salina ou solução salina tamponada com fosfato, para formar uma composição aquosa.

Os inóculos também podem incluir um adjuvante como parte do diluente. Os adjuvantes, tais como adjuvante completo de Freund (CFA), adjuvante incompleto de Freund (IFA) e alúmen, são materiais bem conhecidos na arte e estão comercialmente disponíveis a partir de diversas fontes.

As técnicas de acoplamento ou conjugação do polipéptido através de grupos funcionais activados presentemente conhecidas na arte, são particularmente aplicáveis. Ver, por exemplo, Avrameas, et al., Scand. J. Immunol.. Vol. 8, Supl. 7:7-23 (1978) e Patente dos E.U.A. N°. 4 493 795, m. 3 791 932 e N2 3 839 153. Além disso, pode ser efectuada uma reacção de acoplamento dirigida ao local de modo que qualquer perda de actividade devida ã orientação do polipéptido após o acoplamento possa ser minimizada. Ver, por exemplo, Rodwell et al., Biotech-, 3:889-894

71 415 SCRF 187-3 -42- (1985), e Patente dos E.U.ft. N52- 4 671 95S.

Podem ser adicionados um ou mais resíduos de aminoácido adicionais ao terminal amino ou carboxí do polipéptido para auxiliar na ligação do polipéptido para formar um conjugado, Verificou-se que os resíduos de cisteina, geralmente adicionados ao terminal carfooxi do polipéptido, são particularmente úteis na formação de conjugados por meios de ligações dissulfeto, mas podem ser usados outros métodos bem conhecidos na arte para a preparação de conjugados.

Um anticorpo anti-apo E particularmente preferido é um anticorpo monoclonal. ft frase "anticorpo monoclonal" nas suas várias formas gramaticais refere-se a uma população de moléculas de anticorpo que contêm apenas uma espécie de local de combinação do anticorpo capaz de imunorreagir com um epítopo particular, Um anticorpo monoclonal, por conseguinte, apresenta, tipicamente, uma afinidade de ligação única para qualquer epítopo com o qual imunorrea-ja. Um anticorpo monoclonal pode, portanto, conter uma molécula de anticorpo possuindo uma pluralidade de locais de combinação do anticorpo, cada um deles imunoespecífico para um epítopo diferente, por ex., um anticorpo monoclonal bi-especifico.

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Os anticorpos anti-apo E, monoclonais preferidos, são preparados tal como aqui descrito.

Anticorpos monoclonais adicionais úteis para a prática dos métodos de diagnóstico deste invento são aqueles que imunorreagem com LDL, VLDL, HDL, e partículas de lipoproteína similares. Particularmente preferidos são os anticorpos anti-apo B-100.

Um exemplo de hibridoma que segrega moléculas de anticorpo monoclonal que imunorreagem com a apo B-100 foi anteriormente descrito na Patente dos E.U.ft- NQ. 4 677 057, a qual é aqui incorporada por referência, e as moléculas de anticorpo monoclonal segregadas pelo hibridoma são aqui referidas com MB47. 0 anticorpo monoclonal M847 imunorreage com mais do que cerca de 90¾ da 125i_ldl, e com uma determinante antigéniea, conservada,

71 415 SCRF 187.3 -43- separada s distinta da apo B-100. Tal como salientado em Young et al-, Clln. Chem.. 32/8-1484-1490 (1986), ο MB47 apenas reage com a apo B-100. 0 hibridoma anterior foi depositado na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, HE), de acordo com o Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos com o objetivo de Procedimento de patente, em 6 de Março de 1985, e foi-lhe atribuída a designação HB 8746. 0 depósito anterior foi feito de acordo com as exigências do Tratado de Budapeste no qual a duração do depósito é contada ou 5 anos após o último pedido de depósito na entidade de depósito ou é a duração vigente de uma patente dos E.U.A. que provém deste pedido, qualquer que seja o mais longo. 0 hibridoma é reabasteci-do caso ele se torne não-viável na entidade de depósio e é tornado disponível para o público pela ATCC após a concessão ds uma patente a partir deste pedido. Q. Preparação de anticorpos monoclonais

Um anticorpo monoclonal é tipicamente composto por anticorpos produzidos por clones de uma única célula, denominados hibridoma, que segrega (induz) apenas um tipo de molécula de anticorpo. A célula de hibridoma é formada pela fusão de uma célula produtora de anticorpos e com/^i.ieloma ou com outra linha celular que se auto-perpetue. A preparação de tais anticorpos foi primeiro descrita por Kohler e Milstein, Nature. 256:495-497 (1975), cuja descrição é aqui incorporada por referência. Os sobrenadantes do hibridoma assim preparado podem ser examinados quanto à presença de moléculas de anticorpo que imunorreajam com um polipéptido de apo E deste invento.

Resumidamente, para formar o hibridoma a partir do qual é produzida a composição do anticorpo monoclonal, um mieloma ou 6 outra linha celular que se auto-perpetue, é fundida com linfócitos obtidos a partir do baço de um mamífero hiperimunizado com um polipéptido de apo E deste invento, ou com uma molécula de apo E nativa, tal como está presente numa partícula de lipoproteína contendo apo E. A tecnologia de hibridoma induzido

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71 415 SCRF 187.3 -44- por polipéptido está descrita por Niman et al„, Proc. Hatl. Sei,, U,S.A.. 80:4949-4953 (1983), cuja descrição é aqui incorporada por referência.

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Prefere-se que a linha celular do mieloma utilizada para preparar um hibridoma seja da mesma espécie que os linfócitos. Tipicamente, o mamífero preferido é um ratinho de estirpe 129 G1X+. Mielomas de ratinho adequados para uso no presente invento incluem as linhas celulares sensíveis ã hipoxantina, aminoptorina e timidina (HAT) P3X63-Ag8,653 e Sp2/0-Agl4 que estão disponíveis na American. Type Culture Collection. Rockville, MD, sob as designações CRL 1580 e CRL 1581, respectivamente.

Os esplenócitos são tipicamente fundidos com as células de mieloma utilizando polietilenoglicol (PEG) 1500. Os híbridos fundidos são seleccionados pela sua sensibilidade a HAT. Os hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal de acordo com este invento são então identifiçados por pesquisa das imunoespe-cificidades de um anticorpo anti—apo E tal como aqui descrita, por exemplo, pelo ensaio de imunossorção com enzima ligado (ELISA) descrito no Exemplo 16, ou utilizando o doseamento radioimunológico em fase sólida (SPRIA) descrito no Exemplo 14.

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Um anticorpo monoclonal de acordo com o presente invento também pode ser produzido pela iniciação de uma cultura de hibridoma monoclonal compreendendo um meio nutriente contendo um hibridoma que segrega moléculas de anticorpo da imunoespecifici-dade apropriada. A cultura é mantida sob condições e durante um período de tempo suficientes para que o hibridoma segregue as moléculas de anticorpo para o meio. fts moléculas de anticorpo podem então ser posteriormente isoladas por técnicas bem conhecidas.

Os meios úteis para a preparação destas composições são bem conhecidos na arte e estão comercialmente disponíveis e incluem meios de cultura sintéticos, ratinhos co-sanguíneos e similares. Um meio sintético ilustrativo é o meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM; Dulbecco et al., Virol., 8=396 (1959)) suplementado com 4,5 g/1 de glucose, 20 mM de glutamina e 20¾ de

71 415 SCRF 187.3 -45-soro de vitelo fetal. Uma estirpe . de ratinhos co-sanguineos ilustrativa é a Balb/c.

Outros métodos de produção de um anticorpo monoclonal, de uma célula de hibridoma ou de uma cultura celular de hibridoma também são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, o método de isolamento de anticorpos monoclonais a partir de um reportório imunológico, tal como descrito por Sastry, et al., Proc. Natl, flcad. Sei., 86:5728-5732 (1989); e Huse, et al., Science. 246:1275-1281 (1981).

Também estão abrangidos por este invento a célula de hibridoma, e as culturas contendo uma célula de hibridoma que produzem um anticorpo monoclonal de acordo com este invento. 0 anticorpo monoclonal produzido pelo método anterior pode ser utilizado, por exemplo, nas modalidades de diagnóstico aqui descritas onde é desejada a formação de um produto imunorreac- cional contendo apo E.

0 hibridoma HB 8746 produz moléculas de anticorpo monoclonal ΙΊΒ47 e foi formado pela fusão de esplenócitos de ratinhos, imunizados com LDL, com células de mieloma P3X63ftg8.653.1. A preparação detalhada do anticorpo monoclonal MB47 e do hibridoma foi relatada por Young et al., Arteriosclerosis. 6:178-188, (1986). H. Processos de ensaio São aqui discutidos processos de ensaio em fase sólida e líquida úteis. Contudo, o invento não é assim limitado. Mais, enquanto os processos de ensaio particularmente descritos utilizam um meio indicador de enzima ligado, o presente invento não é especificamente limitado aos referidos ensaios. Processos de ensaio adicionais são aqui descritos abaixo com ênfase particular em processos de imunoensaio em fase sólida.

Os especialistas na arte compreenderão que existem numerosos processos de imunoensaio em fase sólida que podem ser aqui utilizados. Exemplos de ensaio em fase sólida úteis incluem as técnicas de imunoensaio de enzima multiplicado (EMIT) e os 71 415 SCRF 187.3 -46-

imunoensaios de fluorescência (FIA), além do RIA especificamente discutido, radioimunoensaio em fase sólida (SPRIA) do Exemplo BB e do ELISA. Contudo, é considerado qualquer processo que resulte num sinal conferido pela reacção da apo E com um anticorpo de acordo com este invento. Cada um desses processos de ensaio pode empregar técnicas de anticorpo único ou duplo nas quais é utilizado um meio indicador para assinalar a imunorreacção e, deste modo, a ligação de uma apo E que está a ser ensaiada, com um receptor de acordo com este invento. Exemplos de técnicas podem ser encontrados explicados em Maggio, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Cleveland, OH (1981); e em Qoldman, Fluorescent Antibody Methods, Academic Press, New York, NY (1980).

Neste processo de ensaio é utilizada uma amostra de fluido vascular. A amostra pode ser quer soro quer plasma. Verificou-se previamente que os resultados obtidos utilizando as duas composições são estatisticamente indistinguíveis. Independentemente de ser utilizado soro ou plasma, a amostra de fluido vascular é preferivelmente obtida a partir de pessoas que fizeram jejum durante, pelo menos, cerca de doze horas, tal como é conhecido na arte. A referida amostra de sangue é denominada amostra de

II jejum

Um processo de ensaio abrangido determina a presença, e preferivelmente a quantidade, de uma apo E numa amostra de fluido vascular. Este processo inclui os passos seguintes: (a) Uma amostra de fluido vascular é misturada com uma composição de anticorpo anti-apo E para formar uma mistura imunorreaccional. As moléculas de anticorpo na composição são preferivelmente ligadas operativamente a um suporte sólido de modo que a mistura imunorreaccional tem uma fase líquida e uma fase sólida. Estas moléculas de anticorpo imunorreagem com: (i) um polipéptido contendo uma pluralidade de segmentos, possuindo cada um deles uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo ã fórmula: Leu-ftrg-Lys-Leu-Arg-Lys--firg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp- 71 415 SCRF 187.3

-47- -Leu, e (ii) apo E/VLDL, mas não imunorreagem com um polipé-ptido correspondendo a uma das fórmulas p93-112 e pl72-182, e preferivelmente não imunorreagem com um polipéptido contendo apenas um monómero do polipéptido pl41-185. (b) A mistura imunorreaccional é mantida sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para formar um produto de imunorreacção contendo apo E na fase sólida. (c) É então determinada a presença e preferivelmente a quantidade, de produto de imunorreacção formado no passo (b) sendo, deste modo, determinada a^htigénio de apo E na amostra de fluido vascular.

As condições de ensaio biológico são aquelas condições que são capazes de manter a actividade biológica dos reagentes imunoquímicos deste invento e do antigénio que se procura ensaiar. Essas condições incluem uma gama de temperaturas de cerca de 4°C a cerca de 45°C, um valor do pHí na gama de cerca de 5 a cerca de 9, e uma força iónica variando desde a da água destilada até ã· do cloreto de sódio de cerca de um molar. Os métodos para optimizar as referidas condições são bem conhecidos na arte.

Numa concretização preferida do processo anterior, a quantidade de produto de imunorreacção é determinada de acordo com o passo (c) por (i) mistura de um agente de ligação específico, marcado, capaz de ligar uma partícula contendo apo E, com o produto de imunorreacção contendo apo E para formar uma mistura reaccional marcadora, (ii) manutenção da mistura reaccional marcadora sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para o agente de ligação específico, marcado, se ligar ao produto de imunorreacção contendo apo E para formar um complexo marcado, e (iii) detecção da quantidade de qualquer complexo marcado formado e, deste modo, detecção da quantidade de produto de imunorreacção contendo apo E.

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Numa concretização particularmente preferida, o agente especifico marcado é um anticorpo monoclonal anti-B-100 produzido pelo hibridoma que tem a designação da ATCC HB 8742.

Outro ensaio abrangido, de acordo com este invento, é um processo para detecção da presença, e preferivelmente da quantidade, de um antigénio de apo E numa amostra de fluido vascular. Este processo de ensaio compreende os passos seguintes:

J (a) uma amostra de fluido vascular é misturada com um péptido de apo E ligado a fase sólida, contendo o péptido uma pluralidade de segmentos possuindo, cada um deles, uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde à fórmula:

Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys- -ftrg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-fisp-Asp- -Leu, para formar urna primeira mistura de fase sólida-líquida. (b) Uma composição de anticorpo, contendo uma quantidade lifíiitante de moléculas de anticorpo anti-péptido de apo E que imunorreagem com:

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(i) um polipéptido contendo uma pluralidade de segmentos possuindo, cada um deles, uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde à fórmula: Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys- -Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp--Leu, e (ii) apo E/VLDL, mas não imunorreagem com um polipéptido correspondendo a uma das fórmulas p93-119 e p72-182, e preferivelmente.não imunorreagem com um polipéptido contendo apenas um monómero do polipéptido pl41-155, é misturada com a primeira mistura para formar uma segunda mistura. (c) Esta segunda mistura é mantida sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para formar um produto de imunorreacção contendo apo E na fase sólida.

71 415 SCRF 187.3 (d) A quantidade de produto de irnunorreacção presente na fase sólida formada no passo (c) é determinada, sendo, por isso determinada a quantidade de apo E na amostra de fluido vascular.

Numa concretização alternativa, o polipéptido de apo E ligado à fase sólida é substituído por uma lipoproteína contendo apo E, tal corno uma partícula de VLDL.

Numa concretização mais preferida, o componente contendo apo E ou o polipéptido de apo E, ligado ã fase sólida é o análogo de polipéptido competente para o receptor, anteriormente descrito, e o anticorpo anti-análogo de apo E no passo (b) é ligado operativamente a um meio indicador de enzima, e o produto formado no passo (c) é um produto imunorreaccional marcado.

Na medida em que os processos de diagnóstico presentes podem ser utilizados para monitorizar o destino de polipéptidos de apo E administrados terapeuticamente7 tal como aqui descrito, deverá compreender-se que os processos descritos para detecção de um antigénio de apo E podem ser prontamente aplicados para monitorizar um análogo do antigénio de apo E, nomeadamente, um polipéptido de apo E. Por esta razão, a frase "antigénio de apo E" refere-se a moléculas antigénicas que imunorreagem com os anticorpos do presente invento, quer as moléculas antigénicas sejam apo E nativa, polipéptidos de apo E ou combinações de análogo e proteína nativa.

Em concrtetizações para seguir o destino de um polipéptido de apo E administrado terapeuticamente, deverá compreender-se que a apo E nativa e o polipéptido de apo E podem ser indistinguíveis numa amostra de fluido vascular na qual os dois componentes imunorreagem com os anticorpos anti-apo E. Por conseguinte, é útil e preferido medir os níveis vasculares de antigénio de apo E num doente antes da administração de uma composição terapêutica a fim de estabelecer uma linha de base de antigénio de apo E no doente. É então recolhida uma amostra do sangue do doente, a intervalos de tempo predeterminados após a administração do péptido terapêutico, e os níveis de antigénio de apo E são novamente medidos para determinar o efeito e destino da composi-

71 415 SCRF 187.3 -50- ção terapêutica sobre o antigénio de apo E circulante.

Também está abrangido um processo relacionado para detecção da apo E presente em partículas de lipoproteína numa amostra de fluido vascular. A amostra de fluido é misturada com um anticorpo anti-S-100 em fase sólida, isto é, ligado operativamente a uma matriz sólida, para formar uma mistura imunorreaccional de fase liquida-sólida. A mistura é mantida sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para formar um produto de imunorreacção na fase sólida, 0 produto de imunorreac-ção, contendo partículas de lipoproteína com apo B-100, é então misturado com um anticorpo anti-apo E deste invento, para formar uma segunda mistura imunorreaccional de fase líquida-sólida, ft segunda mistura é mantida como anteriormente para permitir que os anticorpos anti-apo E imunorreajam com as partículas de lipoproteína em fase sólida e formem um segundo produto de imunorreacção em fase sólida. 0 segundo produto resultante é detectado para indicar a presença de apo E no fluido vascular.

Em concretizações preferidas, o anticorpo anti-apo E é marcado, e o segundo produto é, deste modo, detectado por

J detecção da presença do marcador na fase sólida. Mais preferivelmente, o anticorpo anti-apo E tem a capacidade de se ligar a polipéptidos de apo E competentes para o receptor, e pode, portanto, ser útil para determinar a apo E competente para o receptor em vez da apo E total.

As técnicas para ligar operativamente um enzima a uma molécula de anticorpo para formar um conjugado são bem conhecidas na arte, Técnicas ilustrativas são discutidas em Maggio, Enzyme--Irnmunoassay, Capítulo 4 por Kabakoff, CRC Press, Boca Raton, FL (1980), páginas 71-104,

As moléculas de anticorpo monoclonal podem ser utilizadas tal como obtidas a partir dos sobrenadantes de híbridoma ou como fluido ascítico. Contudo, é preferido que sejam utilizadas moléculas de anticorpo monoclonal purificadas.

Diversos meios para purificação das moléculas de anticorpo monoclonal são bem conhecidas na arte e, tipicamente, utilizam

71 415 SCRF 187.3 -51 técnicas de cromatografia. ft cromatografia liquida de proteína rápida (FPLC) é, aqui, a técnica de purificação de escolha.

Os conjugados de molécula de anticorpo monoclonal ligado a enzima são fornecidos às misturas na fase fluida. Essas moléculas são tipicamente dissolvidas numa composição aquosa. As composições típicas contêm sais tampão, tal como é o caso das composições contendo anticorpo monoclonal purificado ilustrativas aqui utilizadas que incluem solução salina tamponada com fosfato (PBS) como diluente. 0 fluido ascitico diluído também é útil.

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Preferivelmente, os locais de ligação da proteína, não específicos, na superfície do suporte de fase sólida estão bloqueados. Assim, as moléculas paratópicas ligadas à fase sólida são ligadas por adsorção ou por outros meios bem conhecidos de afixação à matriz sólida. Em seguida, uma solução aquosa de uma proteína livre de interferências com o ensaio, tal como albumina de soro de bovino, de cavalo ou outra, e que também está livre de contaminações com apo 8-100 ou apo E humanas, é misturada com a fase sólida para adsorver a proteína misturada sobre a superfície do suporte sólido contendo moléculas paratópicas nos locais de ligação da proteína sobre a superfície, que não estão ocupados pela molécula paratópica monoclonal.

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Uma solução aquosa de proteína, típica, contém cerca de 3¾ a cerca de 10Ss, em peso, de albumina de soro bovino em PBS a um valor de pH de 7,1-7,5. A mistura de suporte sólido-solução aquosa de proteína é tipicamente mantida durante um período de tempo de, pelo menos, uma hora a 37°C, e a fase sólida resultante é, em seguida, lavada a fim de ficar isenta de proteína não ligada. A amostra de fluido vascular pode ser plasma ou soro, tal como já foi observado. A amostra é preferivelmente diluída a cerca de 1=500 até cerca de 1=5000, e mais preferivelmente a cerca de 1=1000. O uso de uma diluição menor pode fornecer demasiado antigénio da apolipoproteína à mistura e prejudicar a linearidade dos resultados do ensaio, assim como diminuir ou eliminar o excesso de molécula paratópica ligada ã fase sólida em -52- -52- 71 415 SCRF 187.3 4A- relação ao antigénio misturado. A utilização de uma diluição superior a cerca de 1:20 000 tende a diminuir a precisão.

Os tempos de manutenção utilizados podem variar amplamente com pequena variação nos resultados desde que seja utilizado um tempo mínimo de cerca de 30 minutos à temperatura ambiente (cerca de 20-25°C). Onde for desejado utilizar um tempo de manutenção mínimo de 30 minutos, é preferido que a mistura mantida seja agitada durante esse período de tempo para assegurar imunorreac-ção substancialmente completa entre o antigénio da apolipoproteí-na e as moléculas paratópicas monoclonais. Onde foram utilizados tempos de manutenção mais longos, tal como uma hora ou mais, à temperatura ambiente, a agitação não é, tipicamente, necessária. A agitação desejada pode ser prontamente produzida por meio de um agitador giratório operado a cerca de 100 rpm. Cada um dos ensaios utilizado no processo é capaz de ser levado a cabo utilizando tempos de manutenção da mistura de imunorreacção de cerca de 30 minutos a cerca de 60 minutos, â temperatura ambiente. A quantidade de antigénio da apolipoproteína presente no iunorreagente ensaiado é determinada pela mistura da fase sólida contendo apolipoproteína ligada a enzima, separada, com uma quantidade predeterminada de reagentes ou reagente de visualização. Onde é utilizado HRPO como meio indicador de enzima, os reagentes de visualização, tais como peróxido de hidrogénio e um precursor de corante oxidativo como o-fenilenodi-amina (OPD), presentes num meio aquoso são misturados com o imunorreagente ligado à fase sólida, separado. A mistura assim formada é mantida sob condições de ensaio biológico durante um período de tempo predeterminado tal como, pelo menos, cerca de 30 minutos à temperatura ambiente, para que a cor se desenvolva. 0 desenvolvimento da cor é, em seguida, parado pela mistura de um reagente de paragem, tal como o ácido sulfúrico. A densidade óptica da composição é, em seguida, lida, comparada com o valor da curva padrão e a quantidade de apolipoproteína é determinada, tal como é bem conhecido.

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Assim, uma vez que o suporte sólido e a amostra de fluido vascular estejam preparados, cada ensaio pode ser executado à temperatura ambiente num período de tempo de cerca de uma hora, isto é, um período de manutenção de 30 minutos com agitação para misturas formadas a partir de moléculas paratópieas e de uma alíquota da amostra, e um outro período de manutenção de 30 minutos para desenvolvimento da cor. Ma realidade, não é necessário preparar o suporte sólido imediatamente antes de cada utilização, mas em vez disso, os referidos suportes tal como aqui descritos, podem ser preparados e armazenados, húmidos e cobertos, sob as condições de refrigeração habituais, durante um período de, pelo menos, uma mês antes da utilização. I. Sistemas de diagnóstico

J 0 presente invento também abrange um sistema de diagnóstico, tipicamente sob a forma de um conjunto, que pode ser utilizado na execução dos processos de ensaio anteriormente descritos. 0 sistema inclui, numa quantidade suficiente para, pelo menos, um ensaio, um polipéptido de apo E objecto e/ou anticorpo anti-apo E ou anticorpo monoclonal de acordo com este invento, como reagentes imunoquímicos embalados separadamente. As instruções para o uso do reagente embalado estão, também, tipicamente incluídas.

Numa concretização, um sistema de diagnóstico sob a forma de um conjunto inclui um suporte sólido compreendendo uma matriz sólida, tal como uma placa de microtitulação, tendo um anticorpo monoclonal anti-apo E, de acordo com este invento, afixado a ele (ligado operativamente à matriz sólida), numa quantidade suficiente para executar, pelo menos, um ensaio»

Em concretizações preferidas, o sistema de diagnóstico anterior inclui ainda, como um reagente embalado separadamente, um segundo anticorpo, um anticorpo de revelação, que contém moléculas de anticorpo que imunorreagem com as partículas de lipoproteina contendo apo E. Mesta concretização, o anticorpo de revelação pode imunorreagir com qualquer componente presente na partícula de lipoproteina contendo apo E. Tais partículas incluem

71 415 SCRF 187.3 -54- apo E/LDL, apo E/VLDL, apo E/HDL, e similares. Os anticorpos de revelação preferidos são aqueles que imunorreagem com a apo B-100 dado que é um epítopo conservado nas partículas de lipoproteína contendo apo E„ Moléculas de anticorpo anti-B—100 particularmente úteis são os anticorpos monoclonais segregados pelos hibridomas HB47, os quais estão disponíveis na ATCC e têm o número de acesso HB8746.

Numa outra concretização utilizada para ensaiar uma amostra de fluido quanto ã presença de partículas de lipoproteína contendo apo E ou polipéptido de apo E, um sistema de diagnóstico inclui um suporte sólido compreendendo uma matriz sólida à qual está afixado um polipéptido de apo E de acordo com este invento. 0 sistema pode ainda incluir, como um reagente embalado separadamente, um anticorpo anti-polipéptido de apo E de acordo com este invento para uso num formato de ELISA de competição.

Preferivelmente, um sistema de diagnóstico ainda inclui um ou mais dos seguintes: (i) um suprimento de peróxido de hidrogénio de concentração conhecida; (ii) um precursor de corante oxidativo de visualização tal como GPD; (iii) uma solução de um agente de paragem, tal como acido sulfúrico 4N, para extinguir a reacção de formação da cor; (iv) um ou mais tampões na forma seca ou líquida para utilização no ensaio; e (v) materiais para preparação de curvas padrão de referência.

Tal como aqui utilizado, o termo "embalagem" refere-se a um material ou matriz sólidos, tal como vidro, plástico, papel, filme ou similares, capazes de fixarem dentro de limites fixos um polipéptido, anticorpo policlonal ou anticorpo monoclonal de acordo com o presente invento. Assim, por exemplo, uma embalagem pode ser um frasco de vidro utilizado para conter quantidades na ordem dos miligramas de um polipéptido contemplado ou pode ser um alvéolo de uma placa de microtitulação ao qual foram afixados operativamente quantidades, na ordem dos microgramas, de um polipéptido contemplado, isto é, ligad.o de modo a ser capaz de ser ligad=o imunologicamente por um anticorpo. uma "Instruções para a utilização" tipicamente inclui -55- SCRF 187.3 expressão tangível descrevendo a concentração do reagente ou, pelo menos, um parâmetro do método de ensaio, tal como as quantidades relativas de reagente e da amostra a serem misturadas, os períodos de tempo de manutenção para as misturas de reagente/amostra, a temperatura, as condições de tampão, e similares.

Em concretizações preferidas, um sistema de diagnóstico de acordo com o presente invento ainda inclui um marcador ou meio indicador capaz de assinalar a formação de um complexo contendo um polipéptido ou molécula de anticorpo de acordo com o presente invento. A palavra "complexo" tal como aqui utilizada refere-se ao produto de uma reacção de ligação específica, tal como uma reacção anticorpo-antigénio ou receptor-ligando. Complexos ilustrativos são os produtos de imunorreacção.

Tal como aqui utilizados, os termos "marcador" e "meio indicador" nas suas várias formas gramaticais, referem-se a moléculas e átomos simples que estão envolvidos, quer dírecta quer indirectamente, na produção de um sinal detectável para indicar a presença de um complexo. Qualquer marcador ou meio indicador pode ser ligado a ou incorporado numa molécula de anticorpo, polipéptido ou proteína expressa que faça parte de uma composição de anticorpo ou anticorpo monoclonal, de acordo com o presente invento, ou pode ser utilizado separadamente, e esses átomos ou moléculas podem ser utilizados sós ou em conjunção com reagentes adicionais. Tais marcadores são, eles próprios, bem conhecidos na química de diagnóstico clínico e constituem uma parte deste invento apenas na medida em que eles são utilizados com novos" sistemas e/ou processos com proteínas. . ’

Qs meios marcadores podem ser um agente marcador fluorescente que se liga quimicamente a anticorpos ou antigénios sem os desnaturar para formar um fluorocromo (corante) que é um traçador imunofluorescente, útil. Agentes marcadores fluorescentes, adequados, são fluorocromos tais como o isocianato de

J 71 415 SCRF 187.3 -56- fluoresceína (FXC), o isotiocianato de fluoresceína (FITC), o cloreto de 5-dimetilamino-l-naftalenossulfonilo (DANSC), o isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), a lissamine, o cloreto de sulfonilo de rodamina 8200 (RB 200 SC) e similares. Uma descrição de técnicas de análise da imunofluorescência é encontrada em DeLuca, "Immunofluorescence Analysis" em Antibody As a Tool, Marchalonis, et al., ed., John Wiley & Sons, Ltd., págs. 189-231 (1982), o qual é aqui incorporado por referência.

Em concretizações preferidas, o grupo indicador é um enzima, tal como peroxidase de rábano-picante (HRP), glucose-oxidase e similares. Em tais casos, onde o grupo indicador principal è um enzima, tal como HRP ou glucose-oxidase, são necessários reagentes adicionais para visualizar o facto de se ter formado o complexo receptor-ligando (imunorreagente). Tais reagentes adicionais para a HRP incluem o peróxido de hidrogénio e um precursor de corante de oxidação como a diaminobenzidina. Um reagente adicional útil com a glucose-oxidase é 2,2,-azino-di—(ácido 3--etil-benztiazolino-6-sulfónico) (ABTS).

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Os elementos radioactivos também são agentes marcadores úteis e são aqui usados ilustrativamente. Um exemplo de um agente radiomarcador é um elemento radioactivo que produz emissões de raios gama. Os elementos que, eles próprios, emitem raios gama, tais como 124j ^ 125128j^ 132j e 51qFj representam uma categoria de grupos indicadores com elementos radioactivos produtores de emissão de raios' gama. Particularmente preferido é o 125j _ Um outro grupo de meios marcadores úteis são aqueles elementos, tais como Hc, 1®F, 1¾ e 13^ os quais, eles próprios, emitem positrões. Os positrões assim emitidos produzem raios gama devido a choques com eiectrões presentes no corpo do animal. Também é útil um emissor beta, tal como Hlíndio ou ^H. A ligação dos marcadores, isto é, a marcação de polipéptidos e proteínas é bem conhecida na arte. Por exemplo, as moléculas de anticorpo produzidas por um hibridoma podem ser marcadas por incorporação metabólica de aminoácidos que contêm radio-isótopos fornecidos como um componente no meio de cultura. Ver, por

71 415 SCRF 187.3 -57-

exemplo, Galfre st al., Meth. Enzvmol., 73:3-46 (1981). As técnicas de acoplamento ou conjugação de proteínas através de grupos funcionais activados são particularmente aplicáveis. Ver, por exemplo, Aurameas, et al., Scand. JL. Immunol.. Vol. 8, Supl. 7:7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech.. 3:889-894 (1984), e Pat. dos E.U.A. m. 4 493 795.

Os sistemas de diagnóstico também podem incluir, preferivelmente corno uma embalagem separada, um agente de ligação específico. Um "agente de ligação específico" é uma entidade molecular capaz de ligar selectivamente uma espécie reagente de acordo com o presente invento ou um complexo contendo a referida espécie, mas não é ele próprio uma composição de moléculas de anticorpo ou polipéptido de acordo com o presente invento. Exemplos de agentes de ligação específicos são segundas moléculas de anticorpo, proteínas do complemento ou fragmentos das mesmas, proteína A de aureus, e similares. Preferivelmente, o agente de ligação específico liga a espécie reagente quando essa espécie está presente como parte de um complexo.

Em concretizações preferidas, o agente de ligação específico está marcado. Contudo, quando o sistema de diagnóstico inclui um agente de ligação específico que não está marcado, o agente é tipicamente utilizado como um reagente ou meio amplificador. Mestas concretizações o agente de ligação especifico, marcado, é capaz de ligar especificamente o meio amplificador quando o meio amplificador é ligado a um complexo contendo a espécie reagente.

Os conjuntos de diagnóstico de acordo com o presente invento podem ser utilizados num formato "ELISA" para detectar a quantidade de apo E numa amostra de fluido vascular, tal como sangue, soro ou plasma. "ELISA" refere-se a um ensaio de imunos-sorção com enzima ligado que emprega um anticorpo ou antigénio ligado a uma fase sólida e um conjugado enzima-antigênio ou enzima—anticorpo para detectar e quantificar a quantidade de um antigénio presente numa amostra. Uma descrição da técnica do "ELISA" é encontrada no Capítulo 22 da 4ã. Edição de Basic and

Clinicai Immunology por D.P. Sites et al., publicado por Lange -58- 71 415 SCRF 187,3

Medical Publications of Los Altos, CA em 1982 e nas Patentes dos E.U.ft. m. 3 654 090s 3 850 752; e m. 4 016 043, os quais são aqui incorporados por referência.

Um reagente é tipicamente afixado a uma matriz sólida por adsorção a partir de um meio aquoso, apesar de poderem ser utilizados outros modos de afixação aplicáveis a proteinas e polipéptidos bem conhecidos dos especialistas na arte.

Assim, em concretizações preferidas, um polipéptido de apo E, ou uma molécula de anticorpo anti-apo E, do presente invento pode ser afixada numa matriz sólida para formar um suporte sólido que compreende uma embalagem no sistema de diagnóstico objecto.

Matrizes sólidas úteis também são bem conhecidas na arte para a preparação dum suporte sólido contendo um reagente a ele afixado. Tais materiais são insolúveis em água e incluem o dextrano reticulado disponível sob a marca registada SEPHADEX de Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ); agarose; pérolas de polistireno com cerca de 1 rnicron a cerca de 5 milímetros de diâmetro, disponíveis de Abbott Laboratories de North Chicago, IL; poli(cloreto de vinilo), poliestireno, poliacrilamida reticulada; teias à base de "nylon" ou nitrocelulose tais como folhas, faixas ou palhetas; ou tubos, placas ou os alvéolos de uma placa de microtítulação, tal como aquelas feitas de poliestireno ou poli(cloreto de vinilo). A espécie reagente, agente de ligação específico, marcado, ou reagente amplificador de qualquer sistema de diagnóstico aqui descrito, pode ser fornecido em solução, como uma dispersão líquida ou como um pó substancialmente seco, por ex., na forma liofilizada. Onde o meio indicador é um enzima, o substrato do enzima também pode ser fornecido numa embalagem separada de um sistema. Um suporte sólido tal como a placa de microtítulação anteriormente descrita e um ou mais tampões também podem ser incluídos como elementos embalados separadamente neste sistema de ensaio diagnóstico.

Os materiais de embalagem aqui discutidos em relação aos sistemas de diagnóstico são aqueles habitualmente utilizados em 71 415 SCRF 187.3

-59 sistemas de diagnóstico. Tais materiais incluem garrafas e frascos de vidro ou plástico (por ex., polietileno, polipropileno e policarbonato), envólucros de plástico e de pelicula de plástico laminado, e similares. J. Exemplos

Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar, mas não a limitar, o presente invento. 1. Preparação de Polipéptidos e Con.jugados a. Síntese

Os polipéptidos p(141-155)2, referidos como "péptidos em tandem", o p(141-155)3, os polipéptidos de controlo apresentados na Tabela 2, e outros polipéptidos descritos foram sintetizados utilizando a técnica clássica de fase sólida descrita por lierrifield, ftdv, Enzymol. ^. 32:221-96 (1969), adaptada para utilização com o sintetizador de pêptido, automatizado, modelo 430A (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia). Os polipéptidos foram clivados da resina por fluoreto de hidrogénio, extraídos e analisados quanto á pureza por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) utilizando uma coluna C18 de fase inversa fabricada por Waters Associates, Milford, MA.

Tabela 2

Designação1 Sequência de resíduos de aminoácido P93-112 LSK ELQAAQAR LGADMEDVR P139-149 SHLRKLRKRLL P141-155 LRKLRKRLLRDADDL pl45-154 RKRLLRDADD plSO-160 RDADDLQKRLA pl61-171 VYQAGAREGAE pl67-176 REGAERGLSft pl72-182 RGLSAIRERL pl74-203 LSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGGPL 1 A designação para cada péptido indica a posição dentro da sequência de resíduos de aminoácido da proteína de Apo E madura à qual a sequência peptídica corresponde, isto é, da qual é derivada. 71 415 SCRF 187.3

60- b, Auto-coniugação dos Péptidos de Apo E P141-155 e p!29-165

Os péptidos sintéticos contendo os resíduos de aminoácido 141-155 ou 129-?163 de apo E ou o péptido p(141~155)2 foram autoconjugados (isto é, pl41-155 foi acoplado ao pl41-155 e pl29--163 foi acoplado ao pl29-163) de acordo com o processo de Hoare et al., Biol. Chem.. 242:2447, (1967). Resumidamente, foram dissolvidos 100 mg de péptido sintético em 10 ml de água de elevada pureza (sistema Nanopure). Foi misturado à solução do péptido um grama de EDG [hidrocloreto de l-etil-3-(3-dimetilami-nopropil)carbodiimida]. A reacção prosseguiu rapidamente á temperatura ambiente e estava completa após uma hora. Durante os primeiros cinco a dez minutos o pH da mistura reaccional foi monitorizado. A solução de partida, antes da adição de EDG, estava a um pH de aproximadamente 3,7. Com a adição de EDG, o pH aumenta para, aproximadamente, 5,0 nos primeiros cinco minutos. Aos cinco minutos, foram adicionados 50 μ.1 de HC1 0,1N_ Não foi necessária mais nenhuma adição de ácido durante o resto da incubação. A mistura foi rodada enquanto é incubada para assegurar reacção completa. A reacção foi extinta com 10 ml de tampão acetato 2M, pH 4,75.

Para isolar os péptidos conjugados (ligados operativamente) dos péptidos e reagentes químicos que não reagiram, a preparação de auto-conjugação foi dialisada em tubagem de diálise para corte a peso molecular de 2000, de 18 milímetros de largura e aproximadamente duas vezes o comprimento do volume da amostra. A diálise de partida foi feita contra ácido acético 2M. Consegue-se um gradiente que reduz a concentração do ácido acético de 2M para <0,01M por troca do tampão de diálise (um litro) a cada hora, diminuindo escalonadamente a concentração do ácido acético em 50¾ em cada troca. Uma vez a concentração do ácido acético diminuída para <10 mM, a amostra é então dialisada contra um litro de água de elevada pureza durante toda a noite, à temperatura ambiente com, pelo menos, cinco trocas de um litro* A amostra é liofilizada até à secura e redissolvida em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e está pronta para adição à cultura

J 71 415 SCRF 187.3 celular.

-61-

J 0 rendimento em péptido auto-conjugado a partir deste processo é baixo, geralmente não superior a 5¾. Por exemplo, numa conjugação iniciada com 100 mg de péptido sintético, foram recuperados 2,82 mg de péptido pl41-155, auto-conjugado. A concentração polipeptidica do péptido redissolvido em PBS foi determinada pelo método de ensaio de proteína, de Lowry. Todas as adiçóes de péptido ã cultura celular desta preparação de auto--conjugado foram baseadas no valor do ensaio de Lowry. A actividade na preparação de pl41-155 auto-conjugado é estável durante, pelo menos, dois meses quando armazenada a -20°C. 2, Os péptidos monoméricos e os conjugados péptido-BSA não inibem especificamente a proliferação de linfó-citos

Foi utilizado um sistema de cultura celular de linfócitos para examinar a capacidade de vários polipéptidos e conjugados para mimetizarem a capacidade da Apo E para inibir a diferenciação de linfócitos tal como evidenciada pela proliferação.

J Células mononucleares do sangue periférico humano (PBM) são isoladas do sangue inteiro num gradiente de Ficoll-Hypaque. As P8M escolhidas são lavadas três vezes com meio fresco (RPMI-1640 mais 5% de soro de bovino fetal, glutamina, penicilina, estreptomicina e tampão de HEPES). Após a lavagem, as células são contadas e distribuídas numa densidade de 1x10^/ml. Para cultura, são colocados 0,2 ml das células por alvéolo de uma placa de microtitulação de 96 alvéolos. 0 péptido ou conjugado é adicionado aos alvéolos num volume de 50 u.1 que pode ser filtrado ou esterilizado por UV. 0 tempo de duração típico para esta experiência consiste na exposição das células ao auto-conjugado ou polipéptido de apo E durante toda a noite. A PHA, o mitogénio que estimula o crescimento e proliferação dos linfócitos, é adicionada no dia seguinte. Quarenta e oito horas após a adição da PHA, é adicionado por alvéolo 1 wCi de ^H-tímidina num volume de 1 ul e 18-24 horas depois as células são colhidas numa pasta. 0 dispositivo para recolha de células em pasta funciona para

J

recolher as células num papel de filtro onde elas são lavadas com tampão para remover a 3H-timidina livre. Os papéis de filtro são secos, colocados em frascos de cintilação com um "cocktail" de cintilação, e são obtidas as emissões β.

Quando examinados pelo ensaio anteriormente descrito, os polipéptidos representados na Tabela 2 não apresentaram efeito sobre a proliferação dos linfócitos, quando utilizados na forma monomérica não-conjugada. Contudo, tal como apresentado na Figura

J 1, quando esses mesmos polipéptidos foram utilizados conjugados à albumina de soro de bovino (BSft), a proliferação dos linfócitos foi aparentemente inibida duma forma equivalente por todos os estudos de péptidos, tal como evidenciado pelas quantidades decrescentes de absorção e incorporação de timidina com doses crescentes de conjugado. 3. Os péptidos multiméricos e os auto-conjugados de péptido inibem especificamente a proliferação de linfócitos duma forma não citotóxica A capacidade dos polipéptidos e conjugados de acordo com este invento para inibirem especificamente a proliferação de linfócitos foi examinada utilizando o ensaio descrito no Exemplo 2. Especificamente, foram comparados quanto à capacidade para

J inibir a proliferação de linfócitos os auto-conjugados (pl72--182)~(pl72~182), (p93-112)~(p93-112) e (pl41-155)-(pl41-155).

Como apresentado na Figura 2, os auto-conjugados (pl72-182)--(pl72-182) e (p93-112)-(p93-112) não demonstraram capacidade significativa para inibir a proliferação de linfócitos. tal como evidenciado pela sua falha na redução da absorção e incorporação de -^H-timidina. Em contraste, um auto-conjugado deste invento (pl41-155)-(pl41-155) começou a demonstrar actividade inibitória significativa na gama de concentrações de cerca de 0,8 a cerca de 1,0 ug/ml.

Para examinar se a inibição da proliferação observada foi devida, ou não, à morte celular (citotoxicidade directa), as culturas celulares tratadas foram submetidas a um ensaio de libertação de lactato-desidrogenase (LDH) tal como descrito por

71 415 SCRF 187.3 -63-

Carney et al., Immunol,. 134:1084, (1985). fi presença de LDH no sobrenadante da cultura celular indica toxicidade dado que esta é libertada pelas células que foram lisadas. De acordo com os resultados deste estudo, apresentados na Figura 3 para o auto-conjugado (pl41-155)-(pl41-155), existe menos de 4% de libertação de actividade de LDH à concentração de auto-conjugado que inibe a proliferação de linfócitos em mais de 95¾. Estes resultados demonstram que os polipéptidos e auto-conjugados deste invento não são directamente citotóxicos e inibem especificamente a proliferação de linfócitos. A inibição pela apo E da proliferação de linfócitos estimulada por mitogénio não é prontamente reversível. A reversibilidade da inibição pelos péptidos auto-conjugados deste invento foi testada pela incubação dos linfócitos durante a noite com os péptidos, seguida de lavagem das culturas antes da adição de PHA. Tal como apresentado na Tabela 3, o auto-conjugado (pl41-155)-(pl41-155) foi maximamente inibitório sob estas condições. Mais, esta actividade inibitória não pode ser invertida pela remoção por lavagem do péptido auto-conjugado não associado a células antes da estimulação com PHA. A este respeito, a actividade inibitória do auto-conjugado (pl41-155)-(pl41--155) mimetizou a actividade inibitória irreversível observada com a Apo E nativa.

Tabela 3 A proliferação dos linfócitos foi inibida irreversivelmente por um auto-conjugado do péptido 141-1553

Absorção e Incorporação de -^H-timidina (cpm ± 5D)

Tratamento Sem lavagem_ PBS 69 106 ± 6 555 57 123 ± 8 842

Auto-conjugado de apo E141—155C 1 035 ± 170 425 ± 100 64 524 ± 4 200 83 480 ± 4 027

Auto-conjugado de apo A-I95_105c

J 71 415 SCRF 187.3 -64- a Todas as culturas continham 1x10^ células PBM por ml. fis células foram cultivadas a 37°C em RPMI 1640 com 5¾ de soro de bovino fetal. Todas as células foram expostas a PHft às 24 horas, marcadas com 3H-timidina às 48 horas e colhidas às 72 horas. k Âs 24 horas, as células foram lavadas três vezes em meio e ressuspensas até ao seu volume original em RPMI 1640 contendo 5¾ de soro.

J c Os péptidos foram utilizados a uma concentração final de 40 u.g/ml. 4. Os péptidos monoméricos e os conjugados de péptido--BSA não inibem especificamente a produção de androgénios pelo ovário 0 sistema celular usado para examinar o efeito dos vários péptidos e conjugados sobre a produção de androgénios pelo ovário foi aquele descrito por Curtiss et al., Biol. Chem.. 263:10965, (1988). Resumidamente, ratazanas fêmeas imaturas

J

hipofisectomizadas (com a glândula pituitária removida) são sacrificadas por desarticulação cervical. Os ovários retirados das ratazanas são separados da gordura e outros tecidos não ováricos, contados em aproximadamente seis a oito fragmentos por ovário e dissociados numa solução de colagenase/ADNase a qual degrada o tecido conjuntivo libertando cachos celulares. São necessárias aproximadamente uma a duas horas de incubação a 37°C para dissociar o tecido. As células são lavadas três vezes com meio modificado 5a de McCoy suplementado com glutamina e penicilina/estreptomicina. Não é adicionado soro a este meio. As células são cultivadas durante toda a noite em 10 ml de meio num balão T-25 para permitir que as células não-esteroidogénicas adiram. No dia seguinte, as células não aderentes são recuperadas, lavadas três vezes com meio fresco, contadas e colocadas em placas a uma densidade de lxl03/ml, distribuindo uma aliquota de 0,2 ml por alvéolo de uma placa e microtitulação de 96 alvéolos. Todos os meios na experiência contêm hormona luteinizante (LH) a 4 ng/ml e lipoproteina de alta densidade (HDL) humana a 300 ug de proteina/ml. As preparações de péptidos monoméricos, de conjuga-

71 415 SCRF 187.3 dos péptido-BSA e de péptido auto-conjugado são adicionadas num volume de 50 μ.37 wl em PBS. As células são cultivadas durante 48 horas? em seguida os sobrenadantes são recuperados, transferidos para uma placa de microtitulação de 96 alvéolos limpa, e mantidos a -20 °C até as concentrações de androstenodiona e progesterona serem medidas por doseamento radioimunológico.

Quando examinados no ensaio anteriormente descrito, todos os polipéptidos da Tabela 2 que foram estudados, quando utilizados na forma monomérica não conjugada não tinham efeito sobre a secreção de androgénios. Contudo, como apresentado na Figura 4, quando foram utilizados aqueles mesmos péptidos conjugados com BSA, a produção de androgénios foi aparentemente inibida duma forma equivalente por todos os péptidos estudados, tal como evidenciado pelas quantidades decrescentes de produção de androstenodiona com doses crescentes de conjugado.. 5, Um péptido multimérico e um péptido auto-conjugado inibem especificamente a produção de androgénios pelo ovário A capacidade dos polipéptidos e conjugados deste invento para inibirem especificamente a produção de androgénios pelo ovário foi examinada utilizando o ensaio descrito no Exemplo 4. Tal como apresentado na Figura 5, o auto-conjugado (pl41-155)--(pl41-155) demonstrou a capacidade para inibir a produção de androgénios pelas células intersticiais/da teca do ovário numa concentração tão baixa como aquela na gama de cerca de 1,5 wg/ml. Em contraste, outros auto-conjugados não contendo a apo E 141-155 não inibiram a produção de androgénios. A inibição, pela apo E, da produção de androstenetíiona pelas células do ovário é reversível. Para testar se a actividade inibitória do auto-conjugado (pl41-155)-(pl41-155) era reversível, as células do ovário foram cultivadas com o péptido durante 48 horas. No final desta cultura, o meio foi removido, e substituído com meio fresco sem o péptido auto-conjugado. Tal como representado na Tabela 4, a produção de androstenodiona pelo ovário foi inibida durante as primeiras 48 horas de cultura, mas após o péptido ter sido removido e as células de ovário

71 415 SCRF 187,3 realimentadas com meio fresco, a sua produção de androstenodiona durante as 48 horas subsequentes retornou aos niveis de controlo, Neste aspecto, a actividade dos polipéptidos ε/ou conjugados do presente invento mimetizou a actividade da apo E nativa.

Tabela 4 A produção de androgénios pelo ovário foi inibida reversi-velmente por um auto-conjugado do péptido de apo E 141-1553

Acumulação de androstenodiona _( ng/ml)_

Primeiras 48 h de Segundas 48 h de

Tratamento_cultura_cultura_ PBS 12,13 ± 0,26 11,27 ± 0,84 Péptido auto- -conjugado 6,27 ± 1,26 13,34+2,75 a As células intersticiais/da teca do ovário (20 000/0,25 ml) foram cultivadas na ausência ou presença de péptido auto--conjugado. Após 48 h de cultura, os sobrenadantes foram removidos e as células realimentadas com meio fresco sem péptido auto-conjugado.

Para examinar se a inibição da produção de androgénios observada era devida ou não à morte celular (citotoxicidade), as culturas celulares tratadas foram ensaiadas quanto à produção de progesterona tal como descrito por Dyer et al., ÇL Biol. Chem., 263=10 965-10 973, (1988). ft presença de progesterona na cultura indica que as células são viáveis. De acordo com os resultados deste estudo, também apresentado na Figura 6 para o auto--conjugado (pl41-155)-(pl41-155), não há diminuição significativa na produção de progesterona à concentração de auto-conjugado que inibe 95¾ da produção de androstenodiona (Adione). Este resultado indica que a actividade inibitória observada era específica e não o resultado de morte celular (citotoxicidade).

t > J 71 415 SCRF 187.3 -67 6. Um péptido dimérico e auto-coniugados do péptido dimérico afectam a proliferação de linfócitos

J A capacidade do péptido dimérico p(141-155)2 e cios auto--conjugados deste péptido p(141-155)2-(pl41-155)2 para afectarem a proliferação de linfócitos foi examinada utilizando o ensaio descrito no Exemplo 2. Como representado na Figura 7, o péptido em tandem de apo E, p(141-155)2, em concentrações baixas, aumentou a proliferação de linfócitos, e em concentrações elevadas inibiu a proliferação de linfócitos. Esta capacidade de aumentar e inibir a proliferação de linfócitos, dependendo da dose do péptido, mimetiza a actividade da apo E nativa. 0 aumento da proliferação de linfócitos foi observado a doses de péptido em tandem de apo E desde cerca de 2 ug/ml até cerca de 6 ug/ml, enquanto que a inibição da proliferação foi observada a concentrações de, pelo menos, 8 ug/ml. Como apresentado na Figura 8, os auto-conjugados do péptido em tandem de apo E foram ainda mais potentes do que o péptido em tandem de apo E sozinho, na sua capacidade para afectar a proliferação de linfócitos. 7. Um péptido dimérico e auto-conjugado deste péptido afectam a produção de androgénios pelo ovário

J

A capacidade do péptido em tandem de apo E e de auto--conjugados deste péptido para afectarem a produção de androgénios pelo ovário foi examinada usando o ensaio descrito no Exemplo 4. Como representado na Figura 9, quando o péptido em tandem de apo E foi adicionado em concentrações menores do que cerca de 0,4 ug/ml, a produção de androstenediona foi aumentada. Concentrações de péptido em tandem de apo E maiores do que cerca de 0,6 ug/ml inibiram a produção de androstenediona duma forma dependente da dose. 8. 0 polipéptido de apo E liga lipoproteínas

Para avaliar o grau de ligação do péptido em tandem às lipoproteínas, foi misturado ^^5j_péptido em tandem com lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL), LDL, lipoproteína de alta densidade (HDL) ou soro empobrecido em lipoproteína (LPDS) para medir a ligação directa. Resumidamente, as lipoproteínas foram isoladas por ultracentrifugação de acordo com Curtis -68- 71 415 SCRF 187,3 et al., Biol, Chem., 257:15213 (1982). 0 soro empobrecido em lipoproteina (LPDS) foi obtido como a fracção do fundo remanes-cendo após flutuação da HDL a uma densidade de 1,25 g/ml. Todas as fracções foram diluídas em PBS contendo 3¾ de albumina de soro de bovino (BSA). 0 péptido em tandem p(141-155)2 foi radiomarcado utilizando o método do monocloreto de iodo de Brown et al., Methods Enzimol., 98:241 (1983), para uma actividade especifica de 7,99x10^ cpm/wg e em 99¾ precipitável em ácido tricloroacético (TCA) a 10¾. Os ensaios de ligação foram efectuados em tubos siliconizados, num volume total de 0,3 ml de PBS que continha 3¾ de BSA, 20 ng de lipoproteina ou LPDS e 250 ng de 125j_pgp^do em tandem. Após 1 hora a 37°C, o péptido ligado à lipoproteina foi separado do péptido livre. Os tubos contendo VLDL, LDL e LPDS foram precipitados com 0,3 ml de ácido fosfotúngstico 555 uiM e M9CI2 25 mM, e os tubos contendo HDL foram precipitados com 0,3 ml de um anti-soro específico para apo AI. Cada condição de precipitação tinha sido previamente optimizada pela utilização de lipoproteínas radio-iodadas e foi concebida para alcançar 100¾ de precipitação das lipoproteínas. A radioactividade precipitada foi medida por detecção da radiação gama e expressa com base na actividade especifica como nanogramas (ng) de péptido ligado por micrograma (wg) de proteína.

Os resultados, apresentados na Tabela 5, indicam que menos do que 0,7¾ do ISSj-pgptidQ em tandem adicionado foi associado com HDL, e que 58¾ e 39¾ do péptido adicionado foram encontrados associados com VLDL e LDL, respectivamente. Calculado como o número de moléculas de péptido em tandem ligadas por partícula de lipoproteina, cada uma das VLDL, LDL e HDL continha, respectivamente, 1,8, 0,25 e 0,0043 moléculas de péptido por partícula. Deste modo, o polipéptido de apo E p(141—155)2 preferencialmente as partículas de lipoproteina na ordem seguinte: VLDL>LDL>HDL.

Tabela 5

Lipoproteína ou proteína mg de ^^1-péptido em tandem ligado por ug de proteína Razão molar de péptido por particula de lipoproteína VLDL 7,25 1,8 LDL 1,87 0,25 HDL 0,07 0,0043 LPDS 0,76 —

9, Um oéptido em tandem afecta a ligação e degradação da LDL

As propriedades de ligação ao receptor de LDL do péptido em tandem foram avaliadas utilizando fibroblastos humanos normais e uma linha de células humana transformada do tipo manocitico, THP-1 como uma fonte de receptor de LDL. As células THP-1 foram estudadas porque o receptor de LDL e outro receptor de lipopro-teina, o receptor depurador, estão presentes e a ligação com esses receptores é facilmente examinada. No estado indiferenciado, as células THP-1 expressam receptores de LDL que são regulados pelo conteúdo lipoproteico do meio de cultura; Hara, et al., Biochem, Biophys. Res. Commun.. 146=802 (1987); Via, et al., Lipid Res.. 30:1515 (1989). Após estimulação com éster acetato miristato de forbol (PHA), as células param de se dividir, diferenciam-se em células semelhantes a macrófagos, perdem eventualmente a maior parte dos seus receptores de LDL e adquirem receptores depuradores que ligam LDL acetilada ou modificada; Hara, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 146:802 (1987); Via, et al., Lipid Res.. 30:1515 (1989). a. Inibição da degradação por células THP-1 não estimuladas

As células THP-1 foram adquiridas da American Type Culture Collection e foram cultivadas em meio RPMX-1640 isento de soro, suplementado com 1¾ de Nutridoma-HU, durante 48 horas para aumentar de modo regulado os receptores de LDL, A LDL foi isolada

71 415 SCRF 187.3 -70 por ultracentrifugação e radiomarcador utilizando o método do monocloreto de iodo tal como descrito no Exemplo 8 para uma actividade específica de 200-300 cpm/ng. Hais do que 99¾ do ligando 125χ_ι_Β!_ era precipitado por TCA a 10¾. Os péptidos indicados na Figura 10 foram sintetizados tal como descrito no Exemplo 1, purificados até >95% por cromatografia líquida de alta pressão e a composição em aminoácidos foi verificada. Todos os péptidos foram soiubilizados em PBS. A ligação e degradação da LDL foi avaliada como o desaparecimento da radioactividade de 125I-LDL, solúvel em ácido, a partir da incubação, durante uma incubação de 5 horas a 37°C. Foram co-incubadas várias concentrações de péptido em tandem de apo E e de LDL não marcados com ^2^I-LDL para determinar os seus efeitos sobre a ligação e degradação.

Para ensaio, foram incubadas 5x10^ células THP-1 em 0,5 ml de DMEM num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com 2-5 ug/ml de 125I-LDL a 37°C. Após 5 horas, as células foram pelotizadas a 5000 x g e os sobrenadantes foram removidos e extractados com TCA a 10%. Os resultados foram expressos como B/Bo onde B = cpm solúvel em TCA em presença de LDL ou péptido, e Bo = cpm solúvel em TCA em células de controlo em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Cada ponto é a média de 4 ensaios simultâneos (réplicas) com erro padrão da média (SEM) de 10%.

Como representado na Figura 10 (painel superior), o péptido em tandem de apo E, 141-155, aumentou a degradação da LDL pelas células THP-1 não estimuladas, a baixas concentrações e inibiu a degradação da LDL a concentrações altas. Nesta experiência, o aumento da concentração da LDL ocorreu para concentrações do péptido em tandem de apo E variando desde cerca de 0,08 até cerca de 1,5 wM. A inibição da degradação da LDL começou a ocorrer a níveis do péptido em tandem de apo E de 2,0 a 5,0 uM. A LDL não marcada inibiu a degradação da ^2^I-LDL, indicando a especificidade do receptor de LDL.

Pode ser observado que nem o péptido de apo A-I 74-105, de controlo, ou péptido de apo E 141-155, monomérico, inibiram a -71- 71 415 SCRF 187.3 degradação da contraste, o péptido em tandefn de apo E inibiu a degradação da em 50¾ a 5 nM. Foi necessário um excesso molar de, aproximadamente, 200 vezes do péptido em tandem de apo E comparado com a LDL para alcançar uma inibição da degradação de 50¾. b, A inibição é especifica do receptor de LDL Para verificar que a inibição da degradação da LDL foi especifica para o receptor de LDL, foi testado o efeito do péptido em tandem sobre o processamento da LDL acetilada (LDLa) pelo receptor depurador.

As células THP-1 (5x10^ em 1,0 ml de meio DMEM por placa de cultura de 16 mm) foram estimuladas com PMA (10-¾) durante 4 dias. A LDL foi acetilada (Hara, H. et al., Biochem, Biophvs, Res. Comm., 146(2)=802-808, (1987)) e, em seguida, radiomarcada como descrito no Exemplo 8 para uma actividade especifica de 300-500 cpm/ng resultando em ^^I-LDL que era mais do que 99¾ precipitável por TCA a 10¾. As células foram lavadas com PBS, ε o ensaio foi executado em meio de DMEM suplementado com 1¾ de Nutridoma-HU, mais 25 ug/ml de 125i_L£H_a. Após 5 horas a 37°C, os sobrenadantes foram removidos dos alvéolos e extractados com TCA a 10¾. As razões B/Bo foram analisadas como anteriormente descrito. Os resultados estão representados na Figura 10 (painel inferior).

Nem a LDL nem o péptido em tandem inibiram a degradação da 125I-LDLa pelas células THP-1 estimuladas por PMA. Tal como pode ser observado na Figura 10 (painel inferior), a 12,5 uM, o péptido em tandem de apo E causou uma inibição de 80¾ na degradação da 125j_|_j)|_ mas n§0 apresentou efeito sobre a degradação da 10. Confirmação da ligação pelo receptor de LDL e identificação de aminoácidos críticos 0 papel de aminoácidos específicos dentro dos resíduos 141- -155 da apo E intacta foi estudado por Lalazar et al., ÇK Biol.

Chem.. 263=3542 (1988) com variantes da apo E humana contendo substituições de aminoácidos, únicas. As variantes foram produzi- 71 415 SCRF 187.3 -72-

das num sistema de expressão bacteriano complexado com o fosfolípido, dimiristoilfosfatidilcolina (DifPC), e testadas quanto à sua capacidade para se ligarem aos receptores de LDL dos fibroblastos. Lalazar et al., Biol, Chem., 263^3542 (1988). Para confirmar que o péptido em tandem foi ligado pelo receptor de LDL e para identificar os aminoácidos dentro deste péptido que eram criticos para a ligação, foram preparados, tal como descrito no Exemplo 1, três péptidos em tandem que continham as mesmas substituições de aminoácidos em ambas as posições na sequência em tandem. As alterações incluiam substituições dos aminoácidos básicos Lys 143 por Ala, Arg 150 por Ala, e Leu 144 por um aminoácido que rompe a hélice alfa, Pro. Foi utilizado a uma actividade específica de 700-900 cpm/ng (>99% precipitável por TCA a 10%), para o ensaio de ligação tal como descrito no Exemplo 9. Os fibroblastos normais foram colocados em placas de cultura de 16 mm, cultivados durante 72-96 horas em meio de DHEM com 10% de soro de bovino fetal (FBS) e, em seguida, transferidos para meio de DHEM com 10% de soro empobrecido em lipoproteína (LPDS) durante 48 horas para regular para aumentar. os receptores de LDL. A quantidade de ^^I-LDL ligada por alvéolo foi normalizada para o conteúdo proteico de cada alvéolo, o qual foi medido com reagente de ensaio de proteína Bio-Rad usando albumina de soro de bovino (BSA) como padrão.

Tal como ilustrado na Figura 11, cada uma das substituições no p(141-155)2 reduziu a capacidade do péptido em tandem para inibir a ligação da 125j_ldl aos fibroblastos. A substituição da Lys 143 por Ala teve o menor efeito, enquanto a substituição da Leu 144 por Pro teve o maior impacto. Na realidade, o péptido em tandem com a substituição Leu 144 para Pro não apresentou actividade a 60 pM, um efeito que era semelhante ao observado com a variante de apo E nativa. Lalazar et al., JL. Biol. Chem., 263-3542 (1988). 11. Multimeros de ordem mais elevada da sequência 141--155 podem ter actividade de ligação maior

Foi sintetizado um trímero do péptido pl41-155, p(141-155)3

71 415 SCRF 187,3 -73- como no Exemplo 1 e a sua actividade comparada com a dos péptidos p(141-155) (monomérico) e p(141-155)2 (dimérieo), Foram colocados fibroblastos normais em alvéolos de uma placa de cultura de 96 alvéolos e foram cultivados durante 96. h em meio de DMEM com 10¾ de FBS. As células foram transferidas para meio de DMEM com 10¾ de LPDS durante 48 horas para aumentar de modo regulado os receptores de LDL. 0 ensaio de degradação da LDL foi efectuado de acordo com o Exemplo 9, com 2 wg/ml de 125j_lj>l (300-500 cpm/ng) em 0,2 ml/alvéolo em meio de DMEM com 10¾ de LPDS e incubado durante 5 horas a 37°C. Os sobrenadantes removidos dos alvéolos foram extractados com TCA a 10¾. As contagens solúveis em TCA foram normalizadas para o conteúdo proteico por alveólo tal como medido pelo ensaio de proteína Bío-Rad.

Comparado numa base molar quanto à sua capacidade para inibir a degradação da 125j_|_j)j_ pexos fibroblastos, o péptido trimérico era 15 vezes mais eficaz do que o péptido dimérieo (Figura 12). Os resultados indicam que multímeros de ordem mais elevada da sequência 141-155 têm actividade de ligação ao receptor aumentada, 12. Número total de locais de ligação por célula

Foi medida a ligação directa do i25i_pgptido em tandem às células T.HP-1 em divisão. As células THP-1 foram cultivadas durante 48 horas em meio RPMI-1640 isento de LDL, contendo 1¾ de Nutridoma-HU. Foram adicionadas quantidades crescentes de 125j_ -péptido em tandem (17 444 cpm/pmol), marcado como descrito no Exemplo 8, a 5x10^ células/0,05 ml de meio de DMEM, contendo 1¾ de Nutridoma-HU combinada com 0,05 ml de PBS ou 0,05 ml de VLDL a 500 ug/ml, em tubos de vidro siliconizados, Após 20 minutos a 4°C, o 125j_péptido em tandem livre foi separado do péptido ligado por sedimentação das células através de óleo de silicone. As contagens de fundo foram <1 000 cpm/tubo.

Verificou-se que a ligação do 125I-péptido em tandem era linear com o número de células, saturável e alcançava um estado estacionário aparente dentro de 20 min, a 4°C. A ligação do 125j_péptido em tandem às células THP-1 foi inibida especifica- -74- 71 415 SCRF 187,3 mente por lipoproteínas contendo apo B e apo E, com a capacidade de inibição ordenada como se segue: VLDL > LDL > HDL. A ligação do 125j_p£ptido em tandem às células era, também, dependente do Ca++, Foi obtido um aumento de 2 vezes na quantidade de 125j_péptido em tandem ligado às células quando foram aumentadas as concentrações de Ca++ de 0,1 para 2,0 mM, enquanto que aumentos do Mg++ até 2,0 mM não apresentaram efeito. Finalmente se as células THP-1 fossem privadas de soro contendo LDL durante 96 horas, antes da ligação do 125I-péptido em tandem ser ensaiada, era observado um aumento de 2-3 vezes com ambos os ligandos, indicando o aumento regulado do receptor de LDL e do local de ligação do péptido em tandem.

Quando a ligação do ^^I-péptido em tandem às células THP-1 cultivadas em meio isento de LDL, foi estudada em presença de Ca++ 2,0 mM e na ausência e presença de 500 wg/ml de VLDL, foi observada ligação saturável específica com uma Kd de 1,1χ10~7 M (Figura 13). A partir destes dados, calculou-se que o número total de locais de ligação por célula era 1 500.

Embora os dados indiquem que o péptido em tandem se liga ao receptor de LDL, o receptor de LDL pode não ser o único local de ligação para o péptido em tandem no fibroblasto ou THP-1. A proteína relacionada com o receptor para lipoproteína de baixa densidade (LRP) é uma proteína de superfície celular recentemente descrita que contém sequências reiteradas, as quais são homólogas a sequências semelhantes no receptor de LDL; Herz et al., EMBQ J^, 7:4119 (1988); Beísiegel, et al., Natyre, 341:162 (1989).

Estudos recentes indicam que a LRP apenas pode interactuar com lipoproteínas enriquecidas em apo E incluindo a beta-VLDL; Kowal, et al-, Proc. Natl, Acad. Sei. USA, 86:5810 (1989), Ao contrário do receptor de LDL, o receptor de LRP nos fibroblastos não parece ser diminuído de um modo regulado pela exposição das células à LDL; Kowal et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:5810 (1989).

71 415 SCRF 187.3 -75- 13. Aplicação terapêutica

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Alvejamento especifico de um polipéptido de apo E tal como o péptido em tandem para lipoproteinas ricas em colesterol é alcançado projectando um péptido sintético que tem propriedades de alta afinidade de ligação a receptores e a lipidos. A ligação da sequência em tandem 141-155 a um péptido ou molécula lipofilica facilita uma associação especifica de alta afinidade da sequência em tandem com lipoproteinas ricas em colesterol e aumenta a clearance hepática da lipoproteina da circulação. Foi observado um aumento significativo e reprodutível da degradação das LDL pelas células THP-1 (Figura 10, painel superior) e pelos fibroblastos (Figura 12) a concentrações baixas do péptido em tandem, quando o péptido em tandem foi posto em contacto com as células, in vitro.

Existem diversos exemplos citados na literatura nos quais foi observado que a função da apo E é dependente do número de moléculas de apo E por partícula de lipoproteina- (a) a redução do número de moléculas de apo E por complexo de DMPC resulta em ligação diminuída, Mahley et al., Biochim. Biophvs. ficta, 737:197 (1983); (b) a absorção e incorporação de VLDL pelo fígado é

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aumentada pela adição de cópias adicionais de apo E acessível a trombina; Bradley et al., Biol, Chem.. 259:14728 (1984); (c) é necessária uma média superior a uma molécula de apo E por partícula para que a VLDL estimule a esterificação do colesterol pelos macrófagos; Soltys et al., Lipid Res,, 29 = 191 (1988); (d) as VLDL que transportam mais apo E são removidas mais rapidamente do sangue; Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86=665 (1989) e finalmente (e) apenas a beta VLDL enriquecida em apo E é apreendida pelo receptor de LRP; Kowal et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 86:5810 (1989). Acredita-se aqui que esta exigência reflecte a estreita associação de, pelo menos, duas cópias de apo E para formar um ligando de apo E competende para o receptor de LDL. -76- 71 415 SCRF 187.3 14. Preparação de anti-soros policlonais para polipéptidos sintéticos a. Preparação de imunogénio A LDL foi isolada a partir do plasma obtido por plasmaforese de sangue de coelho normal reunido (Scripps Clinic and Research Foundation Vivarium, La Jolla, Calif.). 0 plasma assim obtido foi ajustado para conter uma concentração final de benzamidina de 2 milimolar (mM), de ácido etilenodiamina-tetraacético 14 mil (sal dissódico) (EDTA), 20 microgramas por mililitro (WS/ml) de inibidor da tripsina de soja. 10 000 unidades por ml de aprotinina, 20 ug/ml de inibidor da tripsina de feijão de lima, 25 iig/ml de polibreno, e D-fenilalani 1-1-prolil-l-arginina cio-rometil cetona (PPACK). A LDL foi então isolada a partir deste plasma ajustado por ultracentrifugação sequencial utilizando brometo de potássio sólido (KBr) para ajustamento da densidade.

Primeiro, o plasma ajustado foi centrifugado a 186 000 x g durante 18 a 24 horas, a '4°C. A camada superior do sobrenadante resultante contendo apo/VLDL foi removida e conservada. A camada do fundo do sobrenadante foi recuperada e misturada com a camada de KBr sólido até a densidade ser superior a 1,063 gramas por mililitro (g/ml). A mistura resultante foi então estratifiçada sob uma solução de EDTA a 0,1¾ contendo KBr a uma densidade de 1,063 g/ml, e centrifugada a 186 000 x g durante 18 a 24 horas.

Após a segunda centrifugação, a camada superior contendo a LDL foi recuperada, e a camada do fundo contendo a HDL foi rejeitada. A camada superior foi misturada com KBr sólido até a densidade ser ajustada para mais do que 1,063 g/ml. A camada ajustada foi estratifiçada sob uma solução de EDTA a 0,1¾ contendo KBr a uma densidade de 1,21 g/ml, e foi centrifugada a 186 000 x g durante 18 a 24 horas, a 4°C. A camada superior foi, então, recuperada e foi misturado KBr sólido até a densidade ser maior do que 1,063 g/ml. Essa camada superior, ajustada, foi estratifiçada sob uma solução de EDTA a 0,1¾ contendo KBr a uma densidade de 1,063 g/ml e ainda foi adicionalmente centrifugada a 250 000 x g durante 18 a 24 horas, \

71 415 SCRF 187,3 -77— a 4°C. A camada superior contendo LDL concentrada foi recuperada e dialisada contra PBS (solução salina tamponada com fosfato, pH 7,2) e armazenada a -70°C.

Os análogos multiméricos do polipéptido de apo E, (pl41--155)2, (pl41-155)3 e os seus auto-conjugados, foram sintetizados tal como descrito no Exemplo la e b. 0 polipéptido de apo E ρ(141-155)2 foi dissolvido em acetato de sódio 1,5 M, pH 7,8, até uma concentração final de 6 mg/ml num volume total de 5 ml, Um polipéptido dissolvido foi misturado com 2,5 ml cada, de uma solução de LDL a 2 mg/ml e de uma solução de acetato de sódio 3 M, pH 7,8, para uma razão péptido:LDL de 1 000:1. Foi adicionada uma solução de glutaraldeído 500 mH à mistura reaccional de LDL e polipéptido, utilizando um excesso molar de glutaraldeído para péptido de 2,7, A mistura foi mantida à temperatura ambiente durante 10 minutos, após o que foi adicionada uma solução 40 mH de boro-hidreto de sódio até uma concentração final de 0,2 mM. A mistura foi, em seguida, mantida a 37°C durante 5 a 8 horas, seguida péla diálise contra PBS durante 5 dias com duas trocas de tampão por dia, utilizando tubagem de diálise tendo um corte a peso molecular de 12 000 a 14 000. A solução dialisada foi centrifugada a 2 500 x g durante 10 minutos, e a pelota resultante foi ressuspensa em 5 ml de PBS para formar um imunogénio de péptido-LDL, Foi preparado um imunogénio de péptido-LDL utilizando o polipéptido anteriormente descrito, nomeadamente p(141-155)2- b. Imunização e recolha de anti-soro policlonal 0 imunogénio de péptido-LDL preparado no Exemplo 14a, acima, foi emulsionado utilizando o Ribi Adjuvant System (Ribi Immunochem Research, Inc„, Hamilton, Montana) de acordo com as instruções do fabricante, Os antigénios de péptido-LDL foram incorporados na emulsão a uma concentração de 300 ug/ml. Depois de serem recolhidas as amostras de soro pre-imunitário foram injectados dois coelhos com 1 ml da emulsão preparada. A dose de 1 ml de emulsão foi administrada como se segue: 0,30 ml intradermicamente (0,05 ml em cada um de 6 locais); 0,40 ml intramuscularmente (0,2 ml em cada pata traseira; 0,10 ml

71 415 SCRF 187.3 -78- subcutaneamente (na região do pescoço);, e 0,20 ml intraperi- tonealmente. Os coelhos foram injectados 6 vezes a intervalos de três semanas, de acordo com o protocolo de injecção tal como detalhado. Uma semana após a segunda à sexta injecções, foram recolhidas amostras de sangue para verificar o titulo de anticorpo contra o péptido específico utilizado como o imunogénio pelo ensaio de SPRIft descrito abaixo. As amostras de sangue recolhidas foram agitadas numa estufa a 37°C, durante 1 hora, após o que as amostras foram centrifugadas a 3 000 x g durante 20 minutos. A interface foi recolhida e centrifugada numa microcen-trifuga a 12 000 x g durante 5 minutos. 0 sobrenadante contendo anticorpos anti-péptido foi recolhido e armazenado a -20°C.

Os títulos de anticorpo anti-péptido foram determinados doseamentos radioimunológico em fase sólida (SPRIA) essencialmente como descrito em Curtiss e Edgington, Biol. Chem.,, 257:15213-15221 (1982). Resumidamente, 50 μ.1 de PBS contendo 5 ng/ml de péptidos sintéticos foram misturados nos alvéolos de placas de microtitulação. As placas foram mantidas durante toda a noite (cerca de 16 horas) a 4°C para permitir que os péptidos adiram às paredes dos alvéolos. Após lavagem dos alvéolos quatro vezes com tampão de SPRIA (KC1 2,68 mM, KH2PQ4 1,47 mM, NaCl 137 mM, Na2HP04 8,03 mM, 0,05¾ de Tween-20, 0,1 KlU/rnl de Traysol, 0,1¾ de BSA, 0,015¾ de NaN3), foram misturados 200 wl de tampão SPRIA contendo 3¾ de soro de cabra normal (NQS) e 3¾ de albumina de soro bovino (BSA), em cada alvéolo para bloquear o excesso de locais de ligação de proteína. As placas foram mantidas durante 30 minutos a 20°C, os alvéolos foram esvaziados por agitação, e secos com material absorvente para formar um suporte sólido, isto é, uma matriz sólida à qual um polipéptido de apo E estava afixado operativamente.

Foram, então, adicionados a cada alvéolo 50 ul de um sobrenadante de soro contendo anticorpos anti-péptido para teste de uma mistura imunorreaccional de fase sólida-líquida por formato SPRIA. A mistura foi mantida durante 2 horas a 37°C para permitir a formação de produtos de imunorreacção de fase sólida. Após lavagem dos alvéolos como anteriormente descrito, foram

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J misturados, em cada alvéolo, 50 ul de um segundo anticorpo de revelação, IgG de cabra, ánti-ratinho, marcado com i25I, a 0,25 iig de proteína por ml, para formar uma mistura reaccional marcadora. Essa mistura foi mantida durante 1 hora a 37°0 para permitir a formação dos produtos de imunorreacção de fase sólida marcados com ^-25 j Após lavagem dos alvéolos como anteriormente descrito, a quantidade de produto marcado com 125j Ugado a cada alvéolo foi determinada por medição da radiação gama do produto marcado. Foram, deste modo, determinados os títulos de anticorpo especifico anti-péptido nas amostras de soro recolhidas de coelhos imunizados, e foram comparados com os títulos medidos utilizando amostras de soro de coelho normal pré-imunizado as quais são uma medida do fundo não específico. Considera-se que as amostras de soro contêm anticorpos policlonais anti-péptido se o sinal radioactivo for 5 vezes maior do que o observado com soro de coelho normal.

Os anticorpos anti-polipéptido de apo E foram obtidos pelo procedimento anterior quando foram utilizados imunogênios de péptido-LDL que continham o péptido de apo E p(141-155)2- ftnticorpos anti-polipéptido de apo E, adicionais, são preparados usando imunogênios de péptido-LDL baseados nos pépti-dos de apo E p(141-155)3 e nos auto-conjugados de p(141-155)2 e J p(141-155)3. 0 ensaio anteriormente descrito é utilizado para determinar se este anti-soro policlonal liga a apo E/VLDL. ft apo E/VLDL . é preparada como descrito no Exemplo 14a acima. Em vez de péptidos sintéticos, são misturados nos alvéolos das placas de microtitu-lação, 50 μ.1 de PBS contendo 5 ug/ml de apo E/VLDL. Os ensaios de SPRIft efectuados desta forma indicam que os anticorpos ligam a apo E/VLDL- 15. Preparação de anticorpo monoclonal a. Geração de hibridomas

Ratinhos Salb/c ByJ (Scripps Clinic and Research Foundation Vivarium, La Jolla, CA) são imunizados intraperitonealmente (i.p.) com 50 pg de lipoproteina (é utilizado o complexo

71 415 SCRF 187.3 -80- polipéptido-transportador no caso da apo E) em adjuvante completo de Freund (CFA), seguida por uma segunda imunização em tampão de lipoproteina no dia 28, 3 dias antes da fusão.

Os animais imunizados com o análogo multimérico do polipé— ptido de apo E, (pl41-155)2, conjugado com LDL como descrito no Exemplo 14a, são sacrificados e é recolhido o baço de cada ratinho. £ então preparada uma suspensão de células de baço. Em seguida, as células do baço são extraídas da suspensão de células do baço por centrifugação durante cerca de 10 minutos a 1 000 r.p.m,, a 23°C, Após a remoção do sobrenadante, a pelota celular é ressuspensa em 5 ml de tampão de lise de NH4CI, frio, e é incubada durante cerca de 10 minutos. Ã suspensão de células lisadas são misturados 10 ml de Dulbecco^s Modified Eagle Médium (DMEM) (GIBCO) e tampão HEPES [ácido 4-(2-hidroxietil)-l-piperidinoetanossulfónico] e essa mistura é centrifugada durante cerca de 10 minutos a 1 Ò00 r.p.m., a 23°C. 0 sobrenadante é decantado, a pelota é ressuspensa em 15 ml de DMEM e HEPES e é centrifugada durante cerca de 10 minutos a 1 000 r.p.m,, a 23°C. 0 processo anterior é repetido. A pelota é, então, ressuspensa em 5 ml de DMEM e HEPES» Uma aliquota de células do baço é então removida para contagem. As fusões são conseguidas da forma seguinte utilizando a linha celular de mieloma de ratinho não segregante P3x63Ag8.653„1, um subclone da linha P3X63Ag8.653 (ATCC 1580). Utilizando uma razão de mieloma para células do baço de cerca de 1 para 10 ou cerca de 1 para 5, uma quantidade suficiente de células de mieloma são centrifugadas numa pelota, lavadas duas vezes em 15 ml de DMEM e HEPES, e centrifugadas durante 10 minutos a 1 000 r.p.m., a 25°C.

As células do baço e as células do mieloma são combinadas em tubos de 15 ml, de fundo redondo. A mistura celular é centrifugada durante 10 minutos a 1 000 r.p.m., a 23°C, e o sobrenadante é removido por aspiração. Em seguida, são misturados 200 w.1 de polietilenoglicol aquoso a 50¾ (peso por volume), de peso molecular 4 000 (PE8; ATCC Baltimore, MD), a cerca de 37°C,

71 415 SCRF 187.3 81- usando urna pipeta de 1 ml, com agitação vigorosa para romper a pelota e as células são suavemente misturadas durante entre 15 e 30 segundos» ft mistura celular é centrifugada 4 minutos a 700 r -p.m.. A cerca de 8 minutos a partir do tempo de adição do PE6, são misturados, lentamente, à pelota 5 ml de BMEM mais tampão HEPES, sem perturbar as células» Após 1 minuto, a mistura resultante é quebrada com uma pipeta de 1 ml, e á incubada durante mais 4 minutos. Esta mistura é centrifugada durante 7 minutos a 1 000 r.p.m.. 0 sobrenadante é decantado, são adicionados, lentamente, à pelota, 5 ml de meio HT (hipoxantina/ /timidina) e a mistura é mantida sem perturbações durante 5 minutos. A pelota é então quebrada em pedaços grandes e a suspensão celular final é colocada em balões T75 (2,5 ml por balão), nos quais tinham sido, previamente, colocados 7,5 ml de meio HT. A suspensão celular resultante é incubada a 37°C para crescimento das células fundidas. Após 245 horas, são misturados 10 ml de meio HT aos balões, seguidos, 6 horas mais tarde, por uma mistura de 0,3 ml de aminopterina 0,04 mil» São misturados 10 ml de meio HAT (hipoxantina/aminopterina/timidina) nos balões, 48 horas após a fusão.

Três dias após a fusão, as células viáveis são colocadas em placas de cultura de tecido, de 96 alvéolos, a cerca de 2x10^ células viáveis por alvéolo (total de 768 alvéolos) em meio tampão HAT, tal como descrito em Kennett et al., Curr. Top. Microbiol, Immunol., 81:77 (1978). As células são nutridas, sete dias após a fusão, com meio HAT e, depois disso, a intervalos de 4-5 dias com meio HT como necessário, 0 crescimento foi seguido microscopicamente e os sobrenadantes de cultura foram recolhidos cerca de duas semanas mais tarde e ensaiados quanto à presença de moléculas de anticorpo que imunorreajam com o polipéptido de imunização por doseamento radioimunológico em fase sólida (SPRIA), como descrito no Exemplo 14b.

Resumidamente, são misturados nos alvéolos de placas de micro titulação, 50 μ.1 de PBS contendo 5 pg/ml do polipéptido de

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apo E de imunização, (pl41-155)2- As placas são mantidas durante 3 horas à temperatura ambiente para permitir que o polipéptido adira ãs paredes dos alvéolos. Após lavagem dos alvéolos quatro vezes com tampão SPRIft (KC1 2,68 mM? KH2PQ4 1,47 mii, NaCl 137 mM, Na2HP04 8,03 mM, 0,05¾ de Tween-20, 0,1 KlU/ml de Traysol, 0,1¾ de BSA, 0,015¾ de NaN3), são misturados a cada alvéolo 200 wl de tampão SPRIA contendo 3¾ de soro de cabra normal (NGS) e 3¾ de albumina de soro de bovino (BSA) para bloquear os locais de ligação da proteína, em excesso. As placas são mantidas durante 30 minutos a 20°C, os alvéolos esvaziados por agitação e secos com um material absorvente para formar um suporte sólido, isto é, uma matriz sólida à qual o polipéptido de apo E estava afixado operativamente*

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Foi, então, misturado em cada alvéolo contendo um polipéptido de imunização, 50 ul de sobrenadante de cultura de tecido de hibridoma produzido pelo polipéptido de imunização correspondente, para formar uma mistura imunorreaccional de fase sólida--liquida. A mistura é mantida durante 2 horas a 37°C para permitir a formação de produtos de imunorreacção de fase sólida. Após lavagem dos alvéolos como anteriormente descrito, são misturados em cada alvéolo, 50 u.1 de IgG de cabra anti-ratinho marcada com 125j a o,25 ug de proteina por ml, para formar uma mistura reaccional marcadora. Essa mistura é mantida durante 1 hora a 37°C para permitir a formação de produtos de imunorreacção de fase sólida marcados com Após lavagem dos alvéolos como anteriormente descrito, é determinada a quantidade de produto marcado com ^25j ligado a cada alvéolo por medição da radição gama do produto marcado. Considera-se que os sobrena-dantes de cultura de hibridoma contêm anticorpos monoclonais anti-polipéptido de apo E se o produto de imunorreacção formado, produzir um sinal radioactivo cinco vezes maior do que um sinal medido utilizando um sobrenadante de cultura de hibridoma de controlo. 0 anticorpo monoclonal anti-B-100 MB47 foi preparado essencialmente como descrito acima, excepto que foi utilizada a LDL como imunogénio e o anticorpo foi seleccionado por pesquisa de

71 415 SCRF 187,3 -83 imunorreacção com apo B-100 isolada.

b, Isolamento da imunoglobulina Foram preparados fluidos ascíticos contendo moléculas de anticorpo monoclonal, úteis aqui,utilizando ratinhos Balb/c com 10 semanas de idade. Os ratinhos foram primeiro primo-infactados com 0,3 ml de óleo mineral e injectados intraperitonealmente com 3-50x10^ células de hibridoma MB47, preparadas como descrito no Exemplo 15a. 0 tempo médio para desenvolvimento da ascite foi de 12 dias, 0 fluido aseitico resultante foi recolhido e clarificado por centrifugação a 15 000 x g durante 1 hora, a 4°C, para formar fluidos ascíticos clarificados, os quais podem ser reunidos e armazenados, se desejado, a -20°C. fts moléculas de anticorpo monoclonal M847, isoladas, foram preparadas por cromatografia dos fluídos ascíticos clarificados numa coluna para proteína ft-Sepharose 48 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ). 0 anticorpo foi eluido da coluna com ácido acético 0,1 molar (M) para formar o anticorpo monoclonal isolado MB47.

As moléculas de anticorpo monoclonal isoladas também foram preparadas por cromatografia líquida da proteína : rápida (FPLC) de um fluido ascitico clarificado numa coluna de permuta aniónica da Pharmacia Mono Q HR 5/5 num sistema de FPLC da Pharmacia utilizando um gradiente de NaCl 0-0,5M em Tris 10 mM, pH 8,0 e seguindo as indicações fornecidas com a coluna. As moléculas de anticorpo monoclonal, isoladas, resultantes foram concentradas utilizando uma célula de ultrafiltração agitada Amicon (Danvers, MA; membrana de PM 30) a uma concentração de 1 mg/ml, dialisadas em PBS (solução salina tamponada com fosfato, pH 7,2) e armazenadas a -70°C para formar o anticorpo monoclonal purificado.

As moléculas de anticorpo monoclonal anti-polipéptido de apo E podem ser purificadas como anteriormente usando o hibridoma que pode ser preparado pelos métodos do Exemplo 15a para formar um anticorpo monoclonal anti-polipéptido de apo E, purificado.

J 71 415 SCRF 187.3 -84- 16. ELISA em fase sólida do polipéptido

Polipéptidos de apo E preparados no Exemplo 1 imunorreagern com um anticorpo anti-polipéptido de apo E num ELISA de ligação directa. Mo ensaio, sao dissolvidos 50 ug/ml de uma solução contendo o polipéptido de (ρ141-155)2, em PBS para formar uma solução de revestimento de péptido da qual são misturados 150 wl nos alvéolos de uma placa de microtitulação. Os alvéolos são, então, mantidos durante cerca de 16 a 20 h, a 4°C, para permitir que o péptido se adsorva (revista) as paredes dos alvéolos. Após a remoção da solução de revestimento de péptido,por agitação, os alvéolos são lavados uma vez com 350 nl de tampão de lavagem (PBS contendo 1 g/1 de BSA, 0,5 ml/1 de Tween 20, e 2 M.g/1 de aprotinina). Os locais de ligação de proteína, em excesso, são bloqueados por mistura de 200 μ.1 de tampão de bloqueio (P8S contendo 3¾ de BSA) em cada alvéolo, mantendo os alvéolos durante 1 hora, a 37°C, removendo o tampão de bloqueio por agitação e, em seguida, lavagem dos alvéolos 3 vezes, como anter iormente descrito. A placa é então seca durante 1 hora a 37°C, ao que se segue a adição de 100 ul de PBS contendo anticorpo anti-(pl41--155)2 conjugado com peroxidase de rábano-picante a 0,5 ug/ml, preparado de acordo com o processo de Nakane, et a!., J. Histochem. Cytochem., 22:1084 (1974), para formar uma mistura )

imunorreaccional de fase sólida-líquida. A mistura imunorreac-cional de fase sólida-líquida, resultante, é mantida a 20°C durante 1 hora para permitir a formação de um produto de imunorreacção em fase sólida contendo polipéptido. Os alvéolos são, então, lavados 3 vezes com tampão de lavagem para remover o anticorpo não ligado.

Os ensaios são executados duma forma idêntica utilizando anticorpos policlonais anti-p(141-155)3, os quais são preparados tal como anteriormente descrito e são conjugados com peroxidase de rábano-picante. A quantidade do produto de imunorreacção presente na fase sólida é então determinada misturando duzentos microlitros de substrato de 0PD (3¾ de H2O2 e 0,67 mg/ml de o-fenilenodiamina) em cada alvéolo para formar uma mistura reaccional de revelação.

J 71 415 SCRF 187,3 -85-

A mistura é mantida durante 30 minutos a cerca de 2Q°C. Subsequentemente, são misturados em cada alvéolo 50 u.1 de H2SO4 4N para parar a reacção de revelação, e a solução resultante é analisada quanto à absorvência a 450 nanometros, utilizando um leitor de placa de microtitulação (Dynatech) para detectar a quantidade de produto de imunorreacção formado,

A fim de determinar a especificidade das moléculas de anticorpos utilizando o mesmo ensaio, é preparado um péptido monomérico, pl41-155, tal como descrito no Exemplo 1, e testado como acima. Adicionalmente, são preparados e testados os péptidos de controlo p93-112 e pl72-182. Os resultados em todos os casos indicam que estes anticorpos não se ligam quer ao monómero quer aos péptidos de controlo.

Um ELISA de competição é útil para detectar polipéptido de apo E ou apo E numa amostra de fluido tal como um soro. As placas de microtitulação são revestidas com o dimero p(141-155)2 tal como aqui antes descrito. Após o passo de secagem do ensaio aqui antes descrito, 50 μ.1 de uma amostra de fluido (isto é, uma amostra de fluido contendo apo E ou contendo polipéptido de apo E) ou um padrão (isto é, um polipéptido de apo E como um padrão) a ser analisado são misturados no alvéolo revestido por polipéptido, simultaneamente com 50 μΐ de anticorpo anti-péptido conjugado com HRP0, para formar uma mistura imunorreaccional. No ensaio aqui descrito, são testados dois competidores (padrão de polipéptido ou a amostra de fluido), em misturas imunorreaccio-nais separadas, quanto à sua capacidade para competir para ligação do anticorpo anti-apo E ao análogo de polipéptido revestido numa gama de diluições do anticorpo, Q padrão de polipéptido em solução é adicionado numa concentração de partida de 1 mg/ml e é diluído em série até uma concentração final de 0,0156 mg/ml. As amostras de fluido de soro ou plasma são adicionadas numa diluição de partida de 1:10 e diluídas em série até uma diluição final de 1:320, A placa é, então, incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente, lavada, e o ensaio é desenvolvido como aqui antes descrito para determinar a quantidade de produto de imunorreacção formado, e, desse modo, a

J 71 415 SCRF 187.3 -86- quantidade de competidor presente na amostra de fluido adicionada. 0 ELISA de competição é particularmente preferido para medir partículas de lipoproteína que contêm apo E num fluido corporal, tal como a apo E total, e também pode ser usado para monitorizar o destino do polipéptido de apo E administrado terapeuticamente presente no soro de um doente após administração de composições terapêuticas do polipéptido de apo E.

a. Ensaio de sanduíche de apo E É aqui descrito um ensaio de sanduíche ou de captura. São revestidas placas de microtitulação de poliestireno (Munc-Immuno Plate I) com 150 ul de tampão de bicarbonato de sódio, pH 9,0, contendo 1 ug/ml de anticorpo policlonal anti-p(141-155)3 purificado, durante 16 horas, a 4°C, para preparar um anticorpo de captura em fase sólida, fts placas são lavadas 3 vezes com PBS contendo 0,1¾ de BSA, 0,05¾ de Tween, e são, então, bloqueadas com 3¾ de BSfí exactamente como anteriormente descrito. 0 padrão de apo E/VLDL (preparado como no Exemplo 14) é diluído a 1=200 em PBS contendo 0,5¾ de Tampão de Diluição (=LPDP/PBS) até concentrações variando de 0,125 a 4,0 ug/ml. São utilizados neste ensaio os mesmos controlos tal como descritos acima para o ELISA de competição. As amostras de plasma ou soro e os controlos são diluídos 1 000 vezes em tampão de diluição. São adicionados, em triplicado, aos alvéolos cinquenta ul de padrões e amostras desconhecidas.

As placas são incubadas exactamente 30 minutos a 25°C e a fase liquida é removida dos alvéolos. Cinquenta ul de PBS, contendo uma concentração fixa de anticorpo de revelação anti-B--100, monoclonal, ligado a HRPO (HB47), anteriormente descrito, são imediatamente pipetados para os alvéolos contendo 1 alíquota das amostras de plasma, fis placas são incubadas exactamente 30 minutos a 25°C, lavadas, e são adicionados 100 ul de solução de substrato de 0PD para uma incubação adicional de 30 minutos a 25°C. A revelação da cor é parada pela adição de 50 ul de H2SO4. 4N, e as placas são lidas num leitor de microplacas, tal como -87- 71 415 SCRF 187.3 anteriormente descrito.

Embora o presente invento tenha agora sido descrito em termos de certas concretizações preferidas e exemplificado em relação às mesmas, um especialista na arte apreciará prontamente que podem ser feitas diversas modificações, alterações, omissões ou substituições, sem se afastarem do espirito do mesmo. Pretende-se portanto, que o presente invento apenas seja limitado pelo âmbito das reivindicações seguintes,

Claims (15)

1. J

   71 415 SCRF 187,3 -88- REIVINDI Ç A £ Q E S 1 — Processo de preparação de um polipêptido possuindo a capacidade de inibir a proliferação de linfócitos e/ou a secreção de androgénios pelo ovário, caracterizado por compreender o acoplamento de uma pluralidade de segmentos possuindo cada um deles uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula: Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Leu-Leu-Arg--Asp-Ala-Asp-ftsp-Leu.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipêptido ser definido pela fórmula: 8-(Xn—Leu-Arg-Lys-Lsu—Arg-Lys-Arg-Leu-Leu--Arg-Asp-Ala-Asp-Asp-Leu-Zm)a-J, na qual 8 é um grupo amino terminal NH2 ou um segmento de comando com 1 a 20 resíduos de aminoácido, J é um grupo carboxi terminal C00H ou um segmento de cauda com 1 a 20 resíduos de aminoácido, X é um primeiro segmento espaçador com 1 a 20 resíduos de aminoácido, η é 1 ou 0, de tal modo que, quando n é 1, X está presente e, quando n é 0, X não está presente, Zé um segundo segmento espaçador, m é 1 ou 0, de tal modo que quando m é 1, Z > está presente e, quando m é 0, 2 não está presente e a é um número inteiro de 2 a 10 e a sequência entre parentêsis está repetida o número de vezes indicado pelo-valor de a.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o polipêptido ter a seguinte fórmula: NH2-Leu-Arg-Lys-Arg-Lys-Arg-Leu-Leu-ftrg-Asp- -ftla-Asp-Asp-Leu-Leu-Arg-Lys-Leu-firg-Lys- -Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp-Leu-COOH.
4. 4 - Processo de preparação de uma composição para regular a proliferação de linfócitos e/ou síntese de androgénios pelo ovário, num animal, caracterizado por se associar um excipiente farmaceuticamente aceitável com um polipêptido compreendendo uma pluralidade de segmentos, sendo cada um dos segmentos definido -89- 71 415 SCRF 187.3 por uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula: Leu-ftrg-Lys-Leu-ftrg-Lys-firg-Leu-Leu-ftrg--Asp-Ala-Asp-Asp-Leu.
5. 5 - Processo de preparação de uma composição para modular a absorção e a incorporação hepáticas de lipoproteinas de baixa densidade, caracterizado por se ligar operativamente uma parte de ligação de receptor LDL a uma parte de ligação LDL compreendendo a referida parte de ligação de receptor LDL uma pluralidade de segmentos de polipéptido possuindo, cada um, uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula: Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys- -Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp- -Leu.
6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida parte de ligação à LDL ser um polipéptido capaz de formar uma hélice antipática possuindo resíduos de aminoácido carregados positivamente na interface hidrofobica-hidrofilica da hélice, e resíduos carregados negativamente situados opostamente ã face hidrofobica da hélice.
7. 7 - Processo de preparação de uma composição, caracterizado por compreender a associarão de moléculas de anticorpo que imuno-reagem com: (a) um polipéptido contendo uma pluralidade de segmentos, possuindo cada um deles uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula: Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys--Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp--Leu, e (b) apo E/VLDL, mas que não imunorreage com um polipéptido correspondendo a uma das fórmulas: LSKELQAAQARLSADMEDVR e RGLSAIRERL 71 415 SCRF 187.3

   -90-com um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
8. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por as referidas moléculas de anticorpo não imuno-reagirem com um polipéptido contendo um só segmento com a sequência de resíduos de aminoácido com a fórmula seguinte: Leu-ftrg-Lys-Leu-ftrg-Lys--Arg-Leu-Leu-firg-Asp-Ala-Asp-ftsp--Leu.
9. 9 - Processo para a determinação de quantidade de antigénio apo E numa amostra de fluido vascular, caracterizado por compreender os passos de: (a) misturar uma amostra de fluido vascular com um anticorpo anti-apo E para formar uma mistura imuno-reaccional, contendo o referido anticorpo, moléculas de anticorpo que imuno-reagêm com: (i) um polipéptido contendo uma pluralidade de segmentos possuindo, cada um, uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula: Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys--Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp--Leu, e (ii) com apo E/VLDL mas que não imunorreage com um polipéptido correspondendo a LSKELQAAQARLGADMEDVR e RSLSAIRERL; (b) a manutenção da referida mistura imuno-reaccional sob condições de ensaio biológico, durante um período de tempo suficiente para formar um produto de imuno-reacção contendo apo E; e (c) a detecção da quantidade de produto de imuno-reaccção formado no passo (b) e, assim, a quantidade de antigénio apo E presente na referida amostra de fluido vascular.
10. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o referido anticorpo estar operativamente ligado a um suporte

    71 415 SCRF 187.3 -91- sólido, de tal modo que a referida mistura imumo-reaccional tem ambas as fases liquida e sólida e o produto da imuno-reacção formado no passo (b) está presente na fase sólida.
11. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por as referidas moléculas de anticorpo não imuno-reagirem com um polipéptido contendo um só segmento com uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula: Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys- -Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-ftla-Asp-Asp- -Leu.
12. 12 - Processo de produção de um conjunto de diagnóstico, caracterizado por se inserir, numa matriz sólida, uma quantidade, suficiente para realizar pelo menos um ensaio, de um anticorpo contendo moléculas de anticorpo anti-apo/^ue imuno-reagem com: (i) um polipéptido contendo uma pluralidade de segmentos possuindo, cada um, uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula: Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys--Ar g-Leu-Le u-Arg-Asp-AIa-Asp-Asp--Leu, e (ii) com apo E/VLDL mas que não imunorreage com um polipéptido correspondendo a LSKELQAAQARL6ABMEDVR e RGLSAIRERL.
13. 13 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por as referidas moléculas de anticorpo não imuno-reagirem com um polipéptido contendo um só segmento com a sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmula: Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys- -Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp- -Leu.
14. 14 -Processo de acordo com a reivindicação 12,.caracterizado anti-apo por o referido anticorpo . /_- E ser operativamente ligado a uma matriz sólida. -92-

    71 415 SCRF 187.3
15. 15 - Processo de produção de um conjunto de diagnóstico, caracterizado por compreender a embalagem de uma quantidade, suficiente para realizar pelo menos um ensaio, de um polipéptido contendo uma pluralidade de segmentos possuindo, cada um, uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à fórmulas Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys- -Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp- -Leu. Lisboa, 17 ASQ. i990 Por SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION