PT94638A - Processo para a preparacao do antibiotico bu-3889v com actividade antiviral e de composicoes farmaceuticas que o contem - Google Patents

Description

RRÍST0L-MYERS_SQUIBB_Ç0MPANI "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DO ANTIBIÕTICO BU-3889V COM ACTIVIDADE ANTIVIRAL E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE 0 CONTÊM" 0 presente -pedido de patente de invenção constitui uma continuação em parte3 do nosso Pedido de Invenção copendente NQ 94.638j que constitui por sua vez uma continuação em parte do Pedido de Patente de Invenção Série NQ 37? 036 requerido em 10 de Julho de 1989.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um novo complexo antibiq_ tico antiviral e aos seus componentes. Refere-se também a métodos para a preparação dos novos produtos utilizados com estirpes novas da espécie Amicolatopsis orientalis3 ã sua aplicação como agentes antivirais e a composições' farmacêuticas que os contem.

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção constitui um complexo antibiótico an tiviral solúvel na ãgua3 designado por BU—3889V3 aos seus componentes com actividade antibiótica que são produzidos por fermentação por uma estirpe produtora de BU-3889V de Amicolatopsis -2- ,¾ orientalis 3 ATOC-53884 ou a uma sua mutante3 numa cultura âe fer_ mentação aquosa em meio nutriente eontendo fontes assimiláveis âe azoto e âe carbono sob condições aerobicas atê obtenção âe uma quantidade substancial do antibiótico BU-3889V -produzida peto or_ ganismo no meio nutriente da cultura de fermentação, Os componentes antibióticos produzidos pelo organismo citado anteriormen^ te são recuperados por separação âe material insolúvel na agua 3 no caldo de fermentação3 para se obter um liquido de fermentação sobrenaãante contendo um antibiótico solúvel na âgua3 que consti_ tui um complexo antibiótico novo e isolanâo-^se os seus componentes mediante aplicação de técnicas cromatogrãficas,

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras de 1 a 5 representam a cromatografia liquida de alta resolução (HPLC) em sistema de varrimento3 do complexo BU-3889V3 e dos componentes A^3 Ã^3 A^ e Drespectivamente,

As Figuras de 6 a 9 mostram aspectos de absorção no infravermelho dos componentes Α^·3 A^3 A^ e D^ através da técnica da pastilha de brometo de potássio. A Figura 10 representa o efeito de Ae D^ na expressão do antigenio de HIV em células infectadas, A Figura 10 representa o efeito de A- e D. sobre o âesen volvimento de células MT-4 e o efeito âe inibição sobre os efeitos citopáticos induzidos pelos vívus em células MT-4 infecta- -5- / cfos #J7. . i

As Frguras 12 a 14 mostram os espectros de RMN-H ãe Aj} Agj Α^ e Dy respectivamente, A Figura 15 representa um pouco da estrutura parcial de

As Figuras 16 e 17 mostram o espectro de absorção no in-fravermelho dos componentes D2 & Dy respectivamenteΛ mediante a técnica da pastilha, de brometo de potássio.

As Figuras 18 e 19 representam os espectros ãe ressonância magnética nuclear protonica dos componentes D2 e D^ respecti vamente. A Figura 20 mostra a cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) em varrimento, de uma mistura dos componentes Dy D2 e Dg de BU-3889V.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO

Num aspectOj a presente invenção refere-se a um novo complexo antibiótico antiviral designado por BU-3889V que é produzi do por fermentação de uma estirpe produtora de. BV-3889V3 de maior preferencia pela estirpe Amicolatopsis orientalis ATCC-53884.

Num outro aspecto3 a presente invenção inclui os componen

tes antivirais BD-3889V Αψ BV-3889 B , BU-3889V A~, BU-3889V

— a O JL BU-3889V Dg e BU-3889V D 'isoladas desse complexo,

Num outro aspecto, a presente ‘invenção inclui as oomposi çoes farmacêuticas que contem o complexo, ou pelo menos um dos seus componentes, conjuntamente com um excipiente aceitável em farmácia.

Num outro aspecto, a presente invenção inclui um processo para a preparaçao e isolamento dos produtos novos mencionados anteriormente.

Ainda num outro aspecto, a presente invenção inclui um processo para a inibição ão desenvolvimento de vírus que consiste em se fazer contactar ss.se vírus com uma quantidade inibidora do crescimento eficaz de um ou mais dos novos produtos da presen te invenção.

Ainda num outro aspecto, _a presente invenção proporciona um novo microrganismo Amicolatopsis orientalis ATCC-53884, sob a forma, de acordo com a presente invenção, de uma cultura biologi_ camente pura, A Amicolatopsis orientalis 0427-8, de nova cultura, foi regista_ da na American Type Culture Collection, Rockvills, MD, tendo-lhe sido atribuído o número de aceitação ATCC-83884, A permanência da garantia desta cultura na "The American Type Culture Collee-· tion" em Rockville, MD e a sua fácil acessibilidade, portanto , pelo publico, estão garantidas através da validade efectiva da

Patente no caso âe a Patente ser aceite. 0 acesso ã cultura e viável durante a pendencia do Pedido de Patente de Invenção sob as designações 37 C,F,R. 1,14 e S5 U.S.C, 112, Todas as restri_ ções da disponibilidade, para o publico da cultura depositada serão irrevogavelmente removidas após a concessão da Patente, 0 microrganismo 1. Taxionomia

Um actinomiceta3 a estirpe ATCC-538843 que produz o complexo antibiótico BV-S889V antiviral foi isolado numa amostra de solo recolhida no Estado de Maharastra3 índia. Os caracteres mor fológicos3 culturais e fisiológicos e a química celular da estir_ pe ATCC-53884 indicam que a estirpe é classificada como Amicola-topsis3 um genero de actinomicetas nocarâiomórficos, Com base nas características fisiológicas diagnosticadas è uma estirpe de Amicolatopsis orientalis. 2. Morfologia 0 substrato e as hifas aéreas são longas3 monopedicula-das e ramificadas e parcialmente dispostas em zigzàg, Avos uma incubação de 3 semanas ocorre a fragmentação parcial das hifas do substrato3 na periferia da colónia intacta. As hifas aereas i comportam cadeias lineares longas e esporos oblongos (036 x 036--33 0 m) com uma superfície lisa. Não se formam suportes moveis3 esporãnglos ou slnemata 3, Caracteristlcas culturais e fisiológicas

As colónias Incolores ou amareladas são cobertas com um mlcéllo aéreo branco. Formam—se um -pigmento amarelo carotlnól-de3 mas não se formam pigmentos melanoides ou outros pigmentos distintos. A temperatura para o desenvolvimento varia entre 1-90 e 40°C. Entre 25 açúcares examinados3 em 22 destes observou-se a produção de 'ácido mas não se observou a formação âe D-melezlto-se3 celulose e .dulcitol, 4s caracteristlcas culturais estão representadas no Quadro 1. As caracteristlcas fisiológicas de diagnostico (Quadro 2) foram determinadas com base nos métodos de Gorãon et al.3 J, Gen, Mlcroblol. 3 109.3 pãg, 69-783 1978 e Lechevaller et al,3 Int, J, Syst. Bacteriol,3 pãg, 29-373 1986, 4. Qulmlotaxlonomla 0 hldrollsado celular total contém ãcldo meso-diamlnopl néllco3 galactose3 arablnose e ramenose. Portanto3 a parede ce lular pertence ao Tipo IVa, Os fosfollpldos contém fosfatlãlle tanolamlna que exibiu duas manchas na cromatografla em camada fl na (CCF)3 fosfatldllgllcerol e fosfatldillnosltol, Portanto3 a estirpe pertence ao Tipo P-II, 0 teste do gllcolato é negativo -7-

(tipo N-acilo de peptidogliea.no: acetilo). Não se deteetou ãci_ do micolico eoo componente prineipal observado foi a menoquino— na MK-9 (H^). 5. Posição taxionomica A estirpe ATCC-53884 pertence aos actinomicetas nocardio_ morf%cos. Entre os onze generos de nocardiomorficos3 (ver Leche_ valier3 et al,3 Loc. cit.s E. Lechevalier3 et al.3 em Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 3 Volume 23 pãg. 1458-1506 3 19863 Williams & Wilkins3 Baltimore3 MD)3 a estirpe ATCC-53884 esta quimiotaxonomicamente colocada nos Amicolatopsis que incluem quatro especies orientalis3 A.orientails suhsp. lurida3 A. mediterranei3 A. rugosa e 4. sulphurea. Os caracteres fisio_ logicos da estirpe ATCC-53884 indicam que esta pode ser classificada como Amicolatopsis oientalis. -8- / 'ÍTfr o & $ σ> co ¢5 o v_ 3 o O B £ ε 3 O 3 'rj ε 05 s 05 as 05 £ 3 ε -a Sn '3 Sn B 3 tS? *35 £ b 3 B Sn a £ "3 0) S'B S B a 05 0-1 fe: a O O ''OS <35 V *3 3 V-5 '« '3 a. a o o 3 S S 3 ε S 0) 3 3 05 3 3 Sn 3 <-£ f£ Sn 3 t£ r£ B 05 £ £ B oj £ £ S <50 05 05 S <=o 05 05 *=d 3 a a "=d 05 a /

Quadvo 1 . Caraatevtstioas eultuvai-s da estivpe ATCC 53884 o B as B o í 'a-'» o O B 85 Sn £ £ a ai ai 3 B B3 B a *3 ’3 05 05 3 Sn a Sn 3 3 3 Sn 3 05 b a B 'B 'B B £ 1 3 3 3 o a a ε ‘3 B as B 3 O O Sn Ο B o Sn B Sn Sn 0) 3 3 O 3 a 3 o 3 O O O Sn —N 05 *3 3 ca 05 ca 3 05 B 3 O B «O Sn 3 O Sn Sn Sn 3 O Sn -n £ 3 0 g co B B B Sn B Oi B B 05 « Kl B • 'd ε B £ S B ε a £ ε °o Sn 05 £ co - ^ -a H ^d B 'w H. a 3 N B £ B ε **> 05 0 CO C5 O o co o ¢5 O B B co B o B CO a O £ B £ £ B £ B B a 05 B £ B B B O B £ £ 05 a Sn Sn 3 B Sn Sn CO Sn B B 3 í '05 Λ OO Sn tB tB 05 B ai Sh Sn £ a B a tB a tB tB B a e «\ í 05 Kl *N •*N S “3 **\ Sn a O O 3 3 B as -B ^ ^ 150 ca J O O O 3 O •*N 3 a '3 co £ as <B a as 0 B as 3 0D — B O B B ε £ B co co co '05 $ ^ 'B B Sn 3 Sn —•S s B Sn ~n CO 3 CO 3 a 05 ¢5 ¢5 ¢0 £ £ ca a 05 to Sn 05 CO B a B co B Sn "3 co 3 B <b a> o ^ as a as a £ nB as 3 B 3 B <3 a B Pq s—' - tB Sn o =0 O Kl 05 CO O Kl co κι CO Kl K] B tB S2^- §! ^ S! 05 S!^- a 3 a 3 05 05 as as B O Sn ÍB 3 a 3 B O B £ +5 05 Sn a £ o 05 *3 05 O O 3 o Ό O C5 a CO ε ai as £ ai ai ai O as o B ε 05 *3 B B 3 B B B CO B Co to 05 as ¢5 £ £ -3 Sn Sn S. co Sn co co 3 C0 05 05 05 05 05 B 05 B B 05 05 ai •B 0 S <B <B as B as B B ;B as Sn Ό B < B · B o O o co o co co a S! £ a Ϊ3 23 Sl a S! a a B B ?B 3 a Sn B B B tB B 05 £ 3 Sn B Sn ----* '3 B ·. B 05 B '3 B a a £ co ..a —a as O Sn 05 a O B ’3 05 B H <B 3 3 B o. 3 Sn Sn 0 o B <B 05 B I a B B CO 0 O CB 3 £ 05 'B CO -N B B a 'B B +5 I B O 3 oa 05 Ο ΌΝ a Sn £ co a O B 3Í B 3 05 Q <B B a 3 O B 05 B co *3 Sn 05 Sn a 3 3 0. *ç5 O. Sn H H 3 B 3 B 05 3 a +5 *3 B fe; B £ a B — 05 a £ Sn £ o as ís *3 B Sn 05 B r£ <B a 05 "3 B 05 ΪΒ £ 55 05 3 -“N as Sh a £ s aa B B O a-. CO 3 a *3 a B 1 a 3 a •3 a si a 1 £ Sn 1 OO O 3 B Sn B tB 05 0) B B Η H Sn B H 3 *3 Sn B Sn 1 3 3 a CO 05 as Sn O. 3 05 v- BO. £ 3 0 a 05 Sn O- •3 O. 05 3 Sn B O as 3 fe; B ο~, a *3 Sn B 'k s a 3 a co £ 0) £ Sc O <B B Sn 05 O 05 S, <B B co a B £ as 05 Pt) Sn B 3 Sn a co as B B Sn 05 a Sn a B Sn tB *3 B B 3 3 to 3 a3 b a '3 '3 "3 a B 3 a b a 3 B O co B a B 05 H Η B B Bh B S 3 CO a 05 a aa 3 a 05 a B a 3 a i s 3 a b a B ^ 3 3 •=d 3 a a' a

Quadro 2 .

Caraeterísticas fisiológicas da estirpe ATCC-53884

Decomposição de: L(+)-Arabinose + Celobiose + Aâenina Dextrin ND Caseina Fritritol Hipoxantina f D-Galactose 'l· Tirosina ~l· D-Glucose ~h Xantina f Inositol Lactose ~h Descarboxilação âe: :, Maltose ND D-Manitol -h Benzoato - D(+)-Melezitose - Citrato - ou TR Melibiose f Mucato - -Metil-D-glucosião •f Succinato Rafinose f Tartrato - ou TR Ramnose "h Salicina ND Produção do: D-Sorbitol Φ Sacarose ND Nitrato redutase - Treãlose •f Amilase +(w) D-Xilose Vrease + Esculinase + Utilização do: Gelatinase + Fosfatase ND Celulose - Tiro sinase - Dulcitol D-Frutose f Desenvolvimento sobre ou em: D-Manose Salicina + (w) Lisozime caldo - Amido solúvel Salicilato - ND Sacarose 5% NaCl •l· Temperatura: Desenvolvimento a: Desenvolvimento entre 19°C - 40°C 10°C /*) - Desenvolvimento Óptimo 25°C - 34°C Π Γ) 45 C - Ausência de desenvoIvimen 16 C & 43 C to Ácido produzido de: Tolerância a: Adonitol h NaCl3 1% - 8% -l· D(-)Arabinose + 9% pE3 530 - 1-13 5

Abreviatura TR: vestígios3 +(w): Fracamente positivo3 ND; não determinado 6.

Estruturas parciais e espectros de RMN 13 -

Os espectros de RMN-C (Ressonância Magnética Nuclear) d° Quadro 3 indicam 39 sinais de carbono em BU-3889V A^ e 33 si_ nais em BU-3889V DOs espectros de A^ e D2 correspondem bem ex eePto nas ressonâncias próximo de ^ 99*1, 72,0, 70,4, 70,3, 69,3 e 01 ,g de BV-3889V A^ ausentes em BU-3889V DBaseados nos espec_ troe âe ressonância magnética nuclear protônica (Quadro IV) e anã_ Use de RMN-2D, estes sinais -de carbono consideraram-se como sendo os de uma molécula dè galactopiranosião. 1

Os espectros de RMN-B 'determinados a 400 MHz, D^O ou DMSO-d de Αη, A„ e D-, apresentam-se, respeetivamente, nas Figu-0 16 1 vas 12, 13 e 14.

Estes achados sugerem que A^ ê um derivado de galactosido de DBe facto, após metanólise âeiãà moderada, A^ fornece D^ e metil D-galactosido. Um exame exaustivo do espectro de COSI de 1 1 Η -H de A^ revela a presença de estruturas parciais que se representam na Figura 15.

Os pesos moleculares âe BU-3889V A^ e D^ são designados como 1504 e 1180, respeetivamente,' de acordo com espeetrometria de massa de bombardeamento atómico rápido negativo. A diferença de 324 unidades âe massa entre estes correspondem a 'duas moléculas de galactose. A interpretação destes resultados mostra que BU-3889V A^ tem uma estrutura dimêrica de 2 compostos carbono 39 que são compostos pelas estruturas parciais representadas na Fi- 113

gura 15. Os espectros âe ressonância magnética nuclear E e C de BU-3889V Ae A^ são muito similares aos de BU-3389V A^ diferindo apenas nos sinais de aldeídoOs espectros de BU-3889V A3 não representam o protão aldeídico (}^:93 50) e o sinal de carbono (k:19834) observado nos de BU—3889V A^ mas mostram um sinal de hidroximetilo H3 \θ:4324 e 4314 e C^ :6531) que não se ob servam em BU-3389V A . Os espectros de BU-3889V A9 exibem os ·*- u sinais de aldeído e de hidroximetilo com cerca de uma semi-inte-gração destes de outros sinais comuns. Os dados espectrais suge rem que BU-3889V A2 e A^ são análogos reduzidos de BU-3889V A com um (A2) ou ambos (Ag) dos dois aldeídos do ultimo reduzido para -CE^OE. -12-

Quadro 3. Dados de RMN-C13 de BU-3889V e

BU-3889V A, BU-3889V D

Carbono _fp.,0) 1 199.3 2 198.4 3 198.2 4 196.7 5 183.7 6 177.1 7 176.8 8 157.5 9 145.6 10 143.4 11 143.2 12 137.9 13 137.8 14 135.3 15 132.7 16 130.3 17 127.6 18 99.9 19 99.1 20 98.0 21 87.9 22 87.5 23 72.0 24 70.8 25 70.4 26 70.3 27 69.3 28 61.9 29 45.7 30 45.4 31 36.6 32 32.8 33 28.7 34 25.5 35 22.8 36 22.5 37 20.9 38 18.5 39 12.6 ÍPMSO-d^ s 197.3 s d 194.6 d s 193.5 Ξ Ξ 192.7 Ξ S 181.7 S s 174.0 Ξ Ξ 173.9 S d 154.5 d d 146.4 d d 143.1 d Ξ 142.4 Ξ S 141.4 Ξ d 137.9 d s 133.3 s d 126.6 d d 125.7 d d 124.2 d s 96.8 s d - Ξ 93.7 s S 85.0 s Ξ 83.3 s d - t 62.4 t d - d - d - t - s 45.5 s s 43.5 Ξ t 36.0 t t 33.6 t d 27.5 d d 25.0 d q 25.3 q q 21.7 q q 20.3 q q 19.1 q q 12.1 q -13- -13-

Quadro 4. Dados de RMN-Hl de BU-3889V A, e Dn (400 MHz) BU-3889V BU-3889V Dx (D20) (DMSO-dg) 9.50 (1H, s) δ 9.52 (1H, s) 7.38 (1H, d, J=15.8) 7.52 (1H, d, J=15.4) 6.78 (1H, d, J=15.8) 6.99 (1H, s) 6.61 (1H, d, J=14.7) 6.80 (1H, d, J=15.8) 6.54 (1H, br-s) 6.77 (1H, d, J=11.6) 6.31 (1H, dd, J=10.3&14.7) 6.11 (2H, m) 6.20 (1H, d, J=10.3) 5.21 (1H, s) 5.66 (1H, s) 4.04 (2H, s) 4.98 (1H, d, J=4.0) 2.71 (1H, m) 4.50 (1H/ d, J=10.3) 2.38 (2H, m) 4.11 (1H, d, J=2.9) 1.72 (3H, s) 4.05 (1H, dd, J=3.3&10.3) 1.68 (1H, m) 3.93 (1H, t, J=6.2) 1.41 (1H, m) 3.86 (1H, d, J=10.3) 1.27 (1H, m) 3.82 (1H, dd, J=4.0&10.3) 1.24 (3H, s) 3.74 (2H, m) 1.16 (3H, d, J—7.2) 2.87 (1H, m) 1.01 (3H, d, J=6.8) 2.42 (1H, m) 0.98 (3H, s) 2.24 (1H, m) 2.14 (1H, m) 1.93 (1H, m) 1.77 (3H, s) 1.66 ’(1H, d, J=15.8) 1.38 (3H, s) 1.20 (3H, d, J=7.3) 1.06 (3H, d, J=6.6) 0.92 (3H, S) 7* -14- / arçr / .¾ 0 componente BV-Z889V D^3 subsequente aos dados de regis_ to do Fedido de Patente de Invenção principal Série N9 Z77 0Z6 requerido em 20 de Julho de 1989, verificou^se, através de HPLC, conter dois componentes adicionais designados por BU-Z889V Ώ^ e BU-3889V D £ além de BV-Z889V D^ (ver Figura 20). As propriedades fisicoq.uímicas e biológicas destes novos antibióticos componentes estão descritas posteriormente conjuntamente com os seus métodos de preparação.

Preparação3 isolamento' e purificação de produtos antibióticos 0 processo para a produção de o antibiótico antiviral BU-3889V e dos componentes Aj3 A ^ A^3 D^3 D^ e D^3 de acordo com a presente invenção3 consiste em; a) se cultivar Amjcolatopsis orientalis ATCC-5Z884 ou BU-3889V uma sua variante ou mutante produtoras em meio nutriente de cultura de fermentação contendo fontes assimiláveis de azoto e carbono sob condiçoes aeróbicas submersas ate ã obtenção de uma quantidade substancial de complexo BV-3889V contendo os componentes designados por A^3 A^3 A^3 D^3 e D^3 produzidos pelo organismo no meio de cultura de fermen tação; b) se separar o micélio e outros resíduos não dissolvi dos do- meio de fermentação para se obter um líquido sobrenadante que contém a activiâade antibiótica; -15- f- c) de se absorver os componetes activos antivirais con tidos no liquido sobrenadante proveniente da fase b) numa resina não iónica permutaâora de ioes3 d) se separar os componentes com actividaãe antiviral; e) se absorver os componentes com actividade antiviral numa coluna de gel de sílica; f) se separar e recolher o complexo Β'ϋ-'ΖβδάΎ; g) se separar e recolher os componentes Αη3 A03 A?, Όη3 1 a ó 1 b2 £ D^3 do complexo antibiótico antiviral BV-3889V, pelo menos por meio de uma técnica convencional de adsorção ou de cristalização, 4 fonte de carbono assimilável para se utilizar no meio de cultura de fermentação aquoso pode ser um hidrato de carbono como3 por exemplo3 glucose., ribose3 galaetose3 frutose3 manose3 sacarose3 lactose3 amido solúvel e glicerol entre muitos outros. A fonte de azoto assimilável para se utilizar no meio de cultura de fermentação aquoso pode ser qualquer uma das fontes convencionais conhecidas incluindo proteina de peixe3 proteína de soja3 digesto de milho3 peptonas3 extracto ãe carnef farinha de amendoim3 extracto de levedura e sais de amónio entre muitos outros,

Sais inorgânicos tais como ocloreto de ~éoãio3 o cloreto -16- ί de potássio3 sulfato de magnésio3 carbonato de cálcio3 fosfatos e outros que se podem adicionar se apropriado, Além disso3 oli goelementos como cobre3 mang.anésia3 ferro3 zinco3 etc, que se po-dem adicionar se apropriados ou que podem constituir suplemento como vestígios de impurezas ou outros componentes no meio de fer mentação. A temperatura de incubação pode ser qualquer temperatura a que a estirpe produtora de BU-3889V esteja apta a deselvolver--se. De preferencia3 a temperatura de incubação situa-se entre cerca de 19 e 40°C3 mais preferencialmente entre 25 e 35° C e ain da mais preferencialmente entre cerca de 27 e 32^0.

Utiliza-se de preferência no. meio de fermentação um pE inicial neutro ou próximo do neutro3 por exemplo pH cerca de 6—7 e a produção do complexo antibiótico por fermentação realiza-se geralmente durante um período entre cerca de 2 a 10 dias. Orâi_ nariamente3 a produção Óptima alcança-se entre cerca de 6 a 8 dias. Para a preparação de quantidades relativamente pequenas do complexo antibiótico antiviral3 podem-se utilizar frascos de agitação e cultura superficial3 enquanto que para quantidades relativamente grandes se utilizam de preferencia tanques de fer mentação estéreis para cultura aeróbica submersa, Quando se uti_ liza um tanque de fermentação é apropriado produzir um inoculo vegetativo num -caldo nutriente por meio de inoculação da cultura em caldo com um esporo proveniente do organismo e3 quando se obteve um inoculo vegetativo activo recente3 transferir este assepèicameúte para o meio contido no tanque de fermentação. 0 arejamento dos tanques e dos frascos pode ser fornecido por meio de ar estéril for -17- gado ou ã superfície do meio de fermentação, A agitação do meio pode ser proporcionada mecanicamente e pode adicionar-se, se necessário, um agente anti-espuma como por exemplo o óleo de gordu ra de porco.

Pode seguir-se a produção de BTJ-3889V, no caldo de fermentação, facilmente durante o decurso da fermentação pelo -ensaio de absorção de corante, com vírus de herpes simplex tipo I,

Após a obtenção de poteneiã óptima no- caldo de fermentação (determinado de acordo com o método citado anteriormente) o micelio e os resíduos não dissolvidos são separados âo caldo de fermentação por processos convencionais como por exemplo a filtração ou a centrifugação para se obter um resíduo sobrenaãante (ou filtrado) que contém activiâade antibiótica. Os componentes contendo actividade antibiótica podem recolher—se âo líquido so-brenadante por técnicas de adsorção convencionais, Os aãsorven-tes que se podem utilizar de modo mais, vantajoso são as resinas poliméricas macro-reticulares não iónicas incluindo, por exemplo, a resina Diaion HP-20 (Diaion é a marca registada da Mitsubishi Chemical Industries, Ltd,, Tóquio, Japão) comercializadas pela Nippon Rensui Co., Japan.

Num aspecto preferido, o líquido sobrenadante, neutralizado, se necessário para pH de 7 é agitado com uma resina não iÓ_ nica como por exemplo Diafon HP-20 para adsorver os componentes que contem activiâaãeantibiótica a partir do líquido sobrenadar^ te. Estes componentes incluem o complexo BU—3889Y e os seus -18- -18- |ÍPT"·:' * constituintes Aj, AAg3 DD eDg. A resina ê lavada com agua e um alcanol inferior miscível com agua e actividade eluída com3 por exemplo3 acetona aquosa. Os efluentes que exibem actividade.. de acordo com o ensaio de adsorção de corante são reunidos e con centrados sob vãcuo ate uma solução aquosa cujo- pH e corrigido para 73 03 que se aplica a uma coluna de Diaion e que se dessnvol_ ve com agua e alcanol inferior, A evaporação dos eluatos de alcanol bioactivos sob pressão reduzida, para obtenção de uma solu_ ção aquosa concentrada. que em seguida ê lavada com um líquido po^ lar como por exemplo um éster orgânico concentrada na camada aquo_ sa sob pressão reduzida, permite a obtenção de BV-3889V impuro,

As operações subsequentes para se obterem os componentes Aj3 A2, Agj D^3 D2 & Dg são conduzidas em quarto escuro.

Preparação de BU-388.9V Α±, BU-3889V A^ ΒΉ-38897 Ag, BU-3889V D t, BU-3889V D2 e BU-3889V Dg

No processo presentemente preferido3 os componentes A^ j e Ag obtem-se do BV-3889V solido impuro3 primeiro por associa ção da mistura impura com gel de sílica e impregnação da mistura no topo de uma coluna de gel de sílica (Wakogel C-200, gel de sí_ lica comercializada pela Wako Pure Chemicals Industries3 Ltd,,

Japão) e eluição numa mistura de n-BuOH~n-PrOH--NH^ΟΒ-·Η2O« As \ fracções escolhidas são controladas pelo ensaio antiviral e por CCF. Em seguida são concentradas sob pressão reduzida, e o resí_ duo dissolvido em tampão de fosfato de pH 7,0 e submetido a uma cromatografia de coluna de fase inversa (YMC - ODS, tipo AM, -19 comercializada pela lamamura Chem. Lab, Co,3 Ltd,3 Japao), Desen volve-se a coluna com o mesmo tampão contendo quantidades :cres-centes de metanol. 0 eluato e controlado por CCF, As primeiras fracçoes activas contendo A^ são aonentraâas ate um pequeno voli± me e purificadas e isoladas por meio de uma coluna de Diaion HP--20. 0 segundo e terceiro eluatos activos são tratados de um mo_ do idêntico para se obterem os componentes A^ e A0 componente A2 pode purificar-se posteriorxente por HPLC,

Preparação de BU-3889V Dn3 BU-3889V Dn e BTJ-3889V Z>„ 1 ú ó

Das primeiras fracçoes provenientes da coluna de gel de sílica obteve-se uma misturados componentes flj, Ds e Dg.que se evaporaram ã secura para se obter uma mistura solida impura dos tres componentes. Este produto impuro dissolveu-se em t-butanol aquoso a 50% e submeteu-se a uma cromatografia em coluna C^g de fase inversa. Desenvolveu-se a coluna com solução de tampão de fosfato de 03 022M contendo uma quantidade crescente de metanol (30%3 40% e 50%). Examinaram-se as fracçoes por CCF e purificaram-se as fracçoes apropriadas pojr HPLC preparativa para se obterem os componentes pretendidos purificados,

Descobriu-se que BV-3889V Aj pode converter-se em BV—3889V Dj mediante tratamento com cloreto de hidrogénio metanolico a 135N a uma temperatura entre cerca de 40° e 60°C durante o perto do de 1 a 4 dias3 de preferencia 2 a 3 dias, 0 produto pretendi^ do isolou-se por técnicas cromatogrãficas idênticas ãs citadas anteriormente. -20-

De um modo idêntico -pode converter-se BU-38897 A2 em BU-38897 'D2 e BU-38897 Ag em BU-38897 Dg,

Pode converter-se BU-3889V A~ em BU—3889V A7 mediante re 2 ó — duçao3 por exemplo3 eom boro—hidreto âe sodio a uma temperatura compreendida entre 25°—40°C. Utilizaram—se técnicas cromatogrã ficas para isolamento e purificação de Ag.

De um modo idêntico pouâe convertera-se BJJ 3889.V A2 em Bu-38897 D2 e BU-38897 Az em BU-38897 Dg.

Propriedades físicas e qutmiaas de BU-38897 Αη3 BU-38897 A0 3 2 _a BU-38897 Ag. <? BU-38897 0

Isolaram-se BU-38897 A^» e Az sob a forma de po amorfo amarelo claro de natureza acida fraca. Estes são solúveis em ãgua3 dimetilformamida e âimetilsulfoxido3 ligeiramente solúveis em metanol e acetona mas praticamente insolúveis noutros dissolventes orgânicos, Obteve-se BU-38897 Dj sob a forma de agulhas amarelas claras. Estas foram. solúveis em dimetilformamida e âi_ metilsulfoxido mas apenas ligeiramente solúveis em agua e metanol. BU-38897 Aj e mostraram reacçoes positivas áo ioâo3 clo_ reto férrico3 reagente de Tollen e 2,4-dinitrofenÍl-hidrazina 3 mas reacção negativa ã ni-hidrina3' nos ensaios de Sakaguchi e . Ehrlich, 0 BU-38897 A\^ mostrou-se positivo ao reagente de antro na embora o BU-38897 D^ se mostrasse negativo naquele ensaio, To dos os componentes BU-38897 mostraram labilidade ã luz, Apos ex -21- ί / posição ã luz fluorescente3 ã temperatura ambiente3 decompuseram--se completamente num período de 4 a 5 dias. As propriedades físico-químicas dos quatro componentes resumem-se no quadro seguinte. Os espectros de UV dos componentes foram praticamente idênticos exibindo o mãximo cerca de 238 e 302 mn em agua ou metanol e não se observou alteração em meio acido ou alcalino, Os espec tros de IV de BU-3889V Aj_j-A^3 A^ e D^ representam-se nas Figuras 6 a 9.

Os pesos moleculares de A^ e D^ determinaram—se por espec trometria de massa de bombardeamento atomico rápido negativo (JEOL JMS-SX 1023 matriz: glicerol + tioglicerol), Os ãe A0 e A foram designados com base nas suas diferenças estruturais de A^ revela- * 1 3

das de acordo com as analises de RMN-H^ s C

Os produtos da presente invenção mostraram um espectro de vibração no IV quando tratados com solução diluída de hidróxido de sodio indicando que se podem formar sais de sodio e outros sais metálicos. Es.tes sais são abrangidos pelo âmbito da presente invenção. -22-

Quadro 5A.~ Propriedades físico· -químicas de BU-3889V Aj e A íj .... A2 Batureza: Po. amarelo pálido Po amarelo pálido P. F.I. ; > 250°C >250° C +180° +108° (c 03 563 H20) (c 0,55, E20) Negativo: m/z 1541 (M-2H+K)~ FAB-MS: 1525 (M-2H+Na)~ 3 1563 (M-3E+K+Na)~ Peso Mol.: 1504 1506 Analise encontrado encontrado Elementar: C 523 20% C 53, 23% H 5,06 H 5, 22 uv . nm d) At max : em HgO 238(84,000) 238(74,100) 302(56,300) 302(59,600) em HCl 238(71, 500) 237(72, 700) Ο,ΟΙΝ 304(49,000) 303(55,900) em NaOH 238(79,300) 237(76,900) 0, 01H 302(53, 800) 302(59,800) IV (KBr): 3420, 1710, 1620 3410, 1710, 1620 -1 em 1550, 1450, 1150 . 1550, 1450, 1140 1100 - 1000 1100 - 1000 TLC3 SiO2: Rf 0,05 0, 05 (n-BuOH-n i-PrOH-CONC. NE40H-H20 II TLC3 RP-18: Rf 0,22 0, 43 (Merek; MeOH-Iampão de fosfato-0,022, pH 7,0, 50:500) HPLC Rt 11,6 min 6, 8 min (Capcell pak Cl 8, MeOH-Iampão de Sorensen 0,0 5, pH 8,0, 30-55% gradiente)

Capcell pak C18 e um gel âe sílica esferico revestido aom silieon eomeroializado por Shiseido, Japão. RP-18 e um gel de siliaa de -fase inversa prê^revestido para placa em camada fiiía comercializado pela Merck,

Quadro 5B

Propriedades físico-quimicas de BTJ—3889V 4, e Όη ó 1 A, D.

Natureza Po amarelo pálido Agulhas amarelo pá P. F. >250° C > 250° C Mls . . +36° + 34° (c 03 553 H20) (c 0,5, Piridina) Negativo mjz 1217 CM-2H+K) FAB-MS : 1239 (M—3H+K+Na) ~ 1201 (M~2H+Na) Peso Mol. ; 1508 1180. Análise encontrado encontrado elementar : C 523 64% C 52, 28% H 53 30 E 5,42 uv \ nm (ξ) . Jy max em HgO 237(74, 200) 235(66,000) 301 (643 900) 302(52, 500) em 0,01N 237(823 000) 232(51,600) SCI 302(563 300) 306(46,600) em 03 01N .238(693900) 237(66,000) NaOH 302(60, 600) 301(52,500) IV (KBr) ; 34103 17103 1620 3430, 1710, 1620 -1 cm 15503 14403 1150 1550, 1455, 1380 1100 - 1000 1080, 1000., 800 TLC3 SiO£ : Rf 03 0 5 0, 34 (n-BuOH-n -Pr0H-CPNC,NH40H-H20 = 3 :3:1:1) . TLC3 RP~18: Rf 03 55 0,10 (Merck MeOH-tampão de fosfato- 0, 022M, pH 7,0, 50; 50) HPLC Rt 43 2 min 17,9 min (Capcell pak C183 MeOH-tampão de Sorensen 0,05M, pH 8,0, 30-55% gradiente)

Capcell pak C18 e um gel de sílica esférico revestido aom Silicon comercializado por Shiseido3 Japão, RP-18 ê um gel de sílica de fase inversa prê-revestiâo para placa em camada fina comercializado pela Merck.

Propriedades físicoquímicas de BV-3889V Z?oí BV-3889V D„ ú 6

Obtiveram-se BU-3889V D^ e B^ sob a forma de po amorfá: amarelo pálido. Os componentes Dg e D^ apresentaram a mesma so_ lubilidade3 ensaio de cor e propriedades de estabilidade ã luz como o componente D2· Exibiram propriedades físicoquímicas st milares entre si e também com as de BV-3888V ' Dj (Quadro 6), Os pesos moleculares foram supostos ser 1182 para BU-3889V o 1184 para BU-3889V Ό^ de acordo com FAB-MS (espectros de massa de bombardeamento atomico rápido), Os espectros de BU-3889V D2 e D2 apresentam-se nas Figuras 16 e 17 e os correspondentes es-2 pectros de RMN-H nas Figuras 18 e 193 respectivamente, 0 Qua_ dro 7 mostra os resultados de RMN-H* e RMN-Cde Bu-3889V D^.

Quadro 6. Propriedades fisieo-quvmieas de BV-3889V D^ e B ^

BU-3889V D0 e D

u O BN-3889V Dn BU-3889V D„ Natureza: Po amarelo pálido Po- amarelo pálido P. F. y 250°C > 250°C < .. -13° -17° (C 0343 piriãina) (0 0,4, piridina)

Negativo FAB-MS: m/z 1219 (M-2H+K) m/z 1205 (U-2R+Ra) 1221 (M-2H+K)~

Peso mol. : 1182 1184 Analise :' Encontrado Eneontrado elementar; C 523 47% C 58, 54% H 43 9 7 H 5, 80 uv X ” < í max em HgO 237 (623 200) 237(54,200) 301(50, 400) 300(47, 200) em 0301N HCl 237(523 000) 237(41,000) 302(423900) 301 (37,900) em 0,0 IN NaOH 237(653400) 237(57,100) 301 (493 900) 300(45, 200) IV (KBr) em'1: 34203 17103 1630 3420, 1720, 1620 155Q 3 14503 1080 1540, 1455, 1080 1000 1000 TZjC j S%0 2 · Rf 0,30 0,28 (n-BuOH-n-PrOH-aone. NH^OH-H ^0 = 3;3:1:1) TLC3 RP-18 : Rf 0, 14 03 18 (Merck: MeOH-tampão de fosfato 0,0 22M, PR 73 023 50: 50) HPLC : Rt 12,52 min 93 55 min (Capcell pak C183 MeOH-tampão de Sorensen 0305M3 pH 8303 30-55% gradiente) -27 7 7 3

Quadro 7. Dados de RMN-E e C de BU-3889V D

Dados de ZS-RMN (DMSO-dg) 1 ^

Dados de ' C-RMN LDMSO-dJ ' o b 73 40 (IH3 d3 J=153 4 ) Q 197s3 S 63 79 (IE3 d3 ( 3=1 53 4) 1933 9 s 63 75 (IH3 br-ãj 8=83!) 193 3 7 S 63 10 (2H3 m) I823 3 s 53 67 (IE3 s) 17 4 3 7 s 5 3 21 (1E3 s) 173,9 s *4, 81 (ΙΕ, m) 1463 3 d *71 (IE3 m) 1453 6 d *4λ 51 (IE3 s) 1413 4 s ea.4j 0 (4Ej m) 1393 4 s 23 50 (IE3 m) 1333 7 â 23 39 (2E3 m) 1333 3 s I3 71 (3E3 s) 1253 9 d I3 70 (IH3 m) 1253 7 d I3 50 (IE3 m) 125,1 d I3 40 (ÍE, m) 1243 3 d 13 23 (3E3 s) 96,8 s. I3II (3E3 d3J=7aZ) 943 1 s 13 00 (3E3 d3 3=638) 843 8 s O3 96 (3E3 s) 843 4 s 633 6 t * permutável eom D^O 623 4 t 433 9 s 433 6 s 36, 1 t 343 5 t 273 6 d 273 3 ã 26, 7 213 7 q 203 5 q 19 31 q 12 3 2 q 28

Aetividade antivival de BU-3889V Ay BV-3889V :A& BV-3889V Az e Bu~S889V D^

2. ~ Aetividade antivirgl sobre o yjrus de herpes éimplex tipo 1 e o vivus de influenza A A aetividade antivival in vitvo de BU-3889V foi avaliada usando-se vvrus de hevpes simplex do tipo 1 (EV'S-1) —células Vevo e vivus A de influenza-sistemas de células de vim de canídeo Ma-din Davby de aeovdo aom o método de ensaio de absorção de coran— te (Antivival Reseaveh 3_ 223-2343 1986). Inoculou-se uma alí- aota de 200jul de suspensão eontenâo 2 x 10^ células em cada cavidade de micvoplaeas de 96 cavidades e cultivou-se ã temperatu-va de 37°C duvante 48 e 72 hovas sob uma atmosfera de av a 95% e CO2 a 5% humidificado. Em seguida substituiu-se o meio de cul_ tuva pov 250jxl de um meio vecente contendo o composto em ensaio em que se adicinou 50jil de meio contendo apvoximadamente 10 x x TCID^g de vivus. Apos 72 hovas de incubação detevminou-se o gvau de inibição vivai induzido pov citoxicidade do fãvmaco ou efeito citopãtico, Expvimiu-se a Dl^ sob a fovma de concentração que exibiu uma inibição de 50% do efeito citopãtico do controlo e a DTgg com uma concentração que exibiu citoxicidade de 50% sobre células Vevo ou MDCK sem infecção vivai, Utilizaram--se acicloviv e vibavivina como compostos de preferencia da ac-tividaãe anti-HSy e da aetividade antivivus de influenza A res-pectivamente, Os resultados apresentam-se no Quadro 8, A acti_ vidade antivival exibida pov BU-3889V Ay o A^ contra HVS foi 50 da ordem de valores de Dl^ de 11 jig/ml e com valores de Dl de 63 8 Jig/ml para BU-3889V D contra o vivus de influenza do tipo A. -29-

Quadro 8. Actividade antivirdl sobre vírus de herpes simplex do tipo 1 e vírus influenza A HSV-Cêlulas Vero

Vírus de influenza-céluías MDCK • uSo DT ÕÕ-50 (jig/ml) (jig/ml) BU-3889V Aj 11 > 400 BV-3889V A2 11 > 200 BU-3889V A„ o 11 >200 BU-3889V D1 92 > 200 Aciclovir 0,09 yioo Ribavirina SÍBO -B?60 (jig/ml) (jig/ml) ISO 250 ^150 150 88 180 6,8 160 15 } 200

2. - Aotividade anti-HIV

Avaliou-se a Aotividade ánti-HIV utilizando-se células MT-4 transportando vírus linfo trópico T humano do tipo III B (HTLV-IIIB) e ETLV do tipo I, 0 numero de oelulas MT-4 viáveis infectadas oom HIV com um múltiplo de infecção de 0,002 ãiminuíu durante a cultura e quase todas as células morreram em seis dias apos a infecção como se determinou pelo método de eclosão de corante azul de--tripan (Antimicrob. Agents anã Chemother, 30_ 933-~37, 1986). 0 dano causado nas células por HIV foi inibido signifi-eativamente por BU-3889V A^dD^ com concentrações superiores a -30- 25 y-g/ml (Figura 11) de BU-3889V A1 e B v e observou-se pacacitotoxicidaâe,

a 100

A expressão do antigénio de HIV examinou-se por imuno-fluorescencia. Quando se infectaram células MT-4 com HIV 3 as cé_ lulas positivas ao antigénio virai aumentaram durante o tempo de incubação e todas as células se tornaram positivas 6 dias apos a infecção. As células positivas ao antigénio HIV foram suprimidas significativamente quando se cultivaram células MT-4 infecta^ das com HIV na presença de BV-3889V Aj e e as células positivas foram apenas menos de 1% numa concentração superior a 50 j,ig/ml dos compostos apresentados na Figura 10. A activiãaâe inibiâora de BV-3889V A^ e foi examinada sobre transcriptase inversa (RTase) proveniente de vírus de mieloblastose aviaria (AMV), Con centrações maiores do que 3 Jug/ml de BU-3889V A^ e D^ inibiram em mais de 95% uma unidade de actividade de RTase de AMV (Quadro 9).

Quadro 9. Efeito de BV-3889V Α2 e D1 na activiâade âaAMV transcriptase inversa Concentração do composto (y.g/ml) BV-3889V 4, BV-3889V D„ 1 100 159 + 14a 185 -l· 66 (99,7 )b (99,6) 50 235 ± 73 198 + 80 (99, 5) (99,6) 25 621 + 402 134 + 55 (98,8) (99,8) 12 , 5 920 + 271 116 + 14 (98,2) (99,8) 6 976 ±Λ45 287 + 98 (98,1) (99,4) 3 1, 584 + 1, 292 785 + 69 (96,9) (98,5) 0 ' 51, 494 +_ 1,865 (Control ) a: contagem - (cpm) b; inibição em 7o Actividaâe antiviral de BV-3889V ADn e D, sobre vírus herpes simplex tipo 1 e vírus de influenza ·.A A activiâade antiviral in vitro de BU-3889V A? e de D e D2 foi avaliada utilizando-se vírus de herpes simplex tipo 1 (HSV-1)-células Vero e vírus de influenza A-sistemas de células de canino Madin Darby (MDCK) através de um ensaio de absorção de -32- «t* corante (Antiviral Research 3^, p. 223-234, 1986). Inoculou-se uma aliquota de 200 jil de suspensão celular contendo 2 x 10^ ce_ lulas em cada cavidade de microplacas de 96 cavidades e culbi-vou-se ã temperatura de 37°C durante 48 a 72 horas sob atmosfera humidificada de CO 2 5%- ar 95%. Em seguida substitui-se o meio de desenvolvimento por 250Jil de um meio fresco contendo o composto de ensaio, a que se adicionou 50 jil de meio contendo apro_ ximadamente 10 x TCDI5q de virus. Apos 72 horas de incubação, determinou-se o, grau de inibição de efeito citopãtico induzido pelo vírus e a aitoxicidade induzida pelo fãrmaao, Expressou-se a DIçq sob a forma da concentração que exibiu uma inibição de 50% de o efeito citopdtico do controlo e a DT^ com uma concentração que exibiu uma citotoxicidadè·· de 50% sobre células Vero ou células MDCK sem infecção virai. Vtilizaram-se aciclovir e riba_ virina como compostos de referência da activiãaãe anti-HSV e an-tivirus de influenza A, respectivamente. Os resultados estão re_ presentados no Quadro 10.

Quadro 10. Actividade antiviral sobre virus de herpes simplex tipo 1 e virus de influenza A

Virus influenza-células MDCK DI50 DT50 (jug/ml) (jig/ml) 3,3 68 24 yioo 41 >100 9, 5 > 100 HSV-Celulas Vero DIS0 DT 1 50 (jig/ml) (jAg/ml) BU-3889V D2 35 >100 BU-3889V 20 >100 BU-3889V A_3 6, 3 >100 Aciclovir Ribavirina 0,09 yioo -33- / (

Actividade anti-HIV de BTJ-38897 An3 A„ e A„

' j. 12/ ' » Q

Avaliou-se a actividade £n vitro anti—EIV de BW-3889V Aj3 A2 s A^ no ensaio de captura de antigénio p24gag utilizando--se eelulas CEM-F. Como eomposto de referencia incluiu-se \AZT. A metodologia utilizada neste ensaio e. a que se descreve de segui-da:

Metodologia Células e Vírus

As células e os vírus desenvolveram—se em meio LAV/CEM, 0 meio consiste em RPMI 1640 suplementado com 1% de L-glutamina3 100 U/ml de penicilina3 100 yg/ml de estreptomicina3 2 jig/ml de polibreno e 10% de soro bovino fetal inactivado pelo calor (EyClo ne Labs). As células CEM originaram inicialmente de leucemia lin foblãstica humana aguda e representam uma linha de células linfo-blastoiâes T estabelecida, 0 LAV/BRU de vírus de imunodeficien cia humana (EIV) obteve-se do Doutor L, Montagnier3 Instituto Pasteur de Paris3 França, 0 vírus foi adaptado para células CEM e stõcks de vírus infecciosos foram conservados sob a forma de líquidos sobrenadantes isentos de células em alíqudta-s de 1 ml èm azoto liquido. Determinou-se o titulo do stock de acordo com "end point" da titulação utilizando-se células CEM em placas mi crotituladoras de 96 cavidades, A'titulação realizou-se com 10 réplicas para cáda ponto e calculou—se a dose infecciosa de cultura de tecido a 50% (TICD5Q) utilizando-se o método de Reed e Muench (Amer. J, Eygiene3 27/3 (1938) 493-497),

Inibição âa replicgção de HIV c

Plaquearam-se células CEM (135 x 10 cêlulas/ml) em placas de 96 cavidades e incubaram-se com vírus âumvnte 45 minutos, ApÓs 45 minutos adieionou-se eada um dos compostos em quadripli-cado. No fim do dia3 testaram-se seis sobrenadantes para detec-ção da presença da proteína do núcleo vivai p24gag num ensaio de captura de antigenio ELISA (Genetic System Company), A densidade das leituras (absorvãncia a 450/630 mn)3 abrangeram tres cate gorias: Experimentais - valores das células contidas nas cavida_ des3 inoculo Virai e fãrmaeo; Controlo = valores das cavidades com células e vírus (1007o); e Residual - valores das cavidades apenas com inoculo virai,. 0 valor residual foi subtraído a todas as densidades ópticas experimentais, 0 efeito antiviral foi expresso sob a forma âa dose infecciosa ou eficaz 50 (Dl n ou

b U DE 50} β e representa a quantidade de fãrmaeo necessário para reduzir a replicação virai em 507o3 avaliado através da ligação com p24gag.

Analise da Cito toxicidade

Avaliaram-se as toxicidades dos fãrmacos sobre células CEM não infectadas, As células CEM plaqueram-se3 do modo descri to anteriormente e cultivaram-se durante cinco dias na presença ou sem a presença do fãrmaeo. No quinto dia adicionou-se 1 y.Ci/ 3 ,, , /cavidade de H-timidina e recolheram—se as células decorridas tres horas. Os resultados foram expressos sob a forma de dose tóxica 5Q (DTj-q) e representam a quantidade de fãrmaeo necessã- -35- ria para reduzir a proliferação oelular em 50% medida através da incorporação de timidina. Os resultados do ensaio representam--se no Quadro 11.

Quadro 11. Aetividade anti-HIV utilizando-se o ensaio de captura de antigénio p24gag

Composto /‘íMso /3£lso BU-3889V 4 3,2 >100 BU-3889V A% 23 5 >100 BU-3889V As 63 8 95 AZT 0 30 55 432

Aetividade anti—EIV- de BTJ-38897 D^ e Ό,

Avaliaram-se os componentes BV-3889V relativamente ã aetividade sobre o vírus de imunodeficiência humana (estirpe LAV^^y obtida de Luc Montagnier3 Instituto Pasteur3 Paris3 França) em células CEM-SS (P. L, Nana et_ al_, in AIDS Res, ffuman Retrovirusee 3 3 3 283-3023 1987)3 utilizando-se o ensaio XTT descrito por D. S, Weislow3 et aV em £, Natl, Câncer Institut, 3 813 577-586 3 1989, Obtiveram-se as células CEM-SS de Owen Weislow do National Câncer Institute, -36- 0 efeito antiviral foi expresso sob a forma âe concentra ção de eomposto que aumenta o número de células viáveis das cul-turas infectadas anteviovmente de células não tratadas, culturas de controlo não infectadas, A toxicidade celular foi expressa sob a forma de concentração do composto e reduz o número âe célu las viáveis em 50% relativamente aos controlos não tratados (DTç-q). 0 Quadro 12 representa os resultados deste ensaio.

Quadro 12. Actividade anti~HIV dos componentes BU-38897 em c£ lulas CEM-SS avaliada pelo ensaio XTT seis dias pos--infecção

Composto UO/ml ED„„ Jig/ml DTrQ BU-3889V A2 20 300 BU-38897 A2 10 200 BU-3889V A3 25 600 BV-3889V D2 20 > 500 BU-3889V D2 20 > 500 BU-38897 D3 10 100

AZT 03 005 >500 -37-

Sfipp"" . Métodos de Aplicação e de Composições Farmacêuticas 0 complexo antibiótico antivral3 Bu-3889V & os seus com-ponentes Α^3 A^3 A^3 D^3 D ^ e D 3 3 de acordo aom a presente invenção e as composições farmacêuticas- que os incluem são aplicáveis para inibir o desenvolvimento do viru&3 incluindo os virus herpes simplex e de influenza, Estes efeitos antivirais foram demonstrados e descritos anteriormente, Além ãisso3 BV-38897 A^3 A2λ DD2 e D3 s®° úteis para- a inibição de virus HIV,

Em geratj os antibióticos da presente invenção podem ser administrados por via oral ou parentérica sob a forma solida pu-ra3 em soluções diluídas ou em suspensões ou em concentrados ou preparados sob formas de dose unitárias ou de mui ti dose. Quando se administram por via parentérica3 isto é3 por injecção endo_ venosa ou intramuscular ou subcutânea3 ou quando se administram por via oral3 a posologia a administrar depende da idade e do pe so e da espécie de mamífero a tratar3 da via de administração Λ tipo e gravidade da doença infecciosa. a tratar e de outros faeto_ res que são avaliados facilmente, pelo médico .ou veterinário res-peotivo.

No que se refere ãs composições -farmacêuticas que contem os antibióticos3 os veículos e outros componentes devem ser por forma a não diminuírem os efeitos terapêuticos do antibiótico . Formas posológicas apropriadas para uso oral são os comprimidos3 pós dispersíveisj grânulos3 capsulas3 xaropes e elixires, Exemplos para formas parentéricas são as soluções3 suspensões3 dispersões 3 emulsões3 etc. As eomposiçoes para uso oral podem con- -38- /» ter ura ou mais adjuvantes convencionais somo por exemplo agentes edulcorantes, agentes apaladantes, agentes de coloração e ·agentes oonservantes a fim âe proporcionarem uma composição com um aspecto farmacêutico adequado. Os comprimidos podem conter o componente activo misturado com excipientes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico convencional, incluindo dissolventes iner tes como por exemplo o carbonato de cálcio, o carbonato âe sódio, a lactose e o sal’, agentes de granulação e desagregação como por exemplo o amido e ácido algtniao; agentes âe ligação como por exemplo o amido, a gelatina, a acácia e agentes de lubrificação como o estearato de magnésio , o ácido esteárico e o sal. Os com primidos podem ser revestidos ou não revestidos mediante aplicação de técnicas conhecidas, de forma a retardar a desagregação e a absorção no tracto gastro-intestinal e, portanto, proporcionar uma acção prolongada durante um pertoão maior.

Identicamente, as suspensões, xaropes e elixires podem· conter o componente activo misturado com qualquer excipiente con vencional utilizado para a preparação destas composições como por exemplo agentes de suspensão (metileelulose, tragacanta e algincp to de sodio), agentes de humidificação (por exemplo lecitina , estearato de polioxietileno) e agentes conservantes como por exem_ pio o p-hidroxibenzoato de etilo, As cápsulas podem conter o componente activo apenas ou misturado com um dissolvente sólido inerte como por exemplo o carbonato de cálcio, o fosfato de cãl_ cio e o caolin, 4s composições injectáveis são preparadas de acordo com a técnica habitual e podem conter agentes de dispersão ou de humidificação apropriados e agentes de suspensão idênticos ou similares- aos referidos anteriormente.

\,ν A posologia diãria para o tratamento ãe um ser humano adulto varia de preferencia entre cerca ãe 100 mg e cerca de 1000 mg do agente terapêutico escolhido para um adulto de 70 kg3 dependendo da natureza da infecçdo e da frequência e via ãe administração j entre outros factores, Deve considerar-se que em alguns casos, por exemplo no tratamento de recém-nascidos 3 crian ças e jovens se devem utilizar doses menores do que as apropriadas para adultos. .As composições farmacêuticas da presente invenção 3 por-tanto3 compreendem de um modo geral uma quantidade inibidora do crescimento 3 isto ê3 uma quantidade eficaz para inibir o cresci_ mento dos virus que causam a doença infecciosa que se pretende tratar3 de BU-3889V ou os seus componentes num veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico3 como por exemplo a agua ou álcoois que podem conter cargas, agentes de estabilização3 agentes de humidificação3 agentes de emulsificação e agentes, de dispersão, para citar apenas alguns dos veículos convencionais e adju vantes e excipientes que podem utilizar-se,

Os exemplos que se seguem são dados para ilustrar apenas e não para serem considerados como limitações da presente invenção3 podendo muitas das variações evidentes possíveis ser realizadas sem afastamento do espírito e do âmbito da presente inven ção, -40- -40-

Exemplo 1

Inooulou-se um pouco ãe cultura inclinada madura de Ami-colatopsis orientalia ATCC-53884, num balão Erlenmeyer de 500 ml contendo 100 ml de um meio de aementeira comportando amido solúvel (Nichiden Kagaku) 0,5% , 0,5% de glucose, 0,1% de extracto de peixe (Mikuni), 0,2% âe NZ-case (Shefield), 0,2% de NaCl e 0,1% de CaCO^, a pH 7,0. Incubou-se a cultura âe sementeira ã temperatura de 32°C durante 4 dias num agitador rotativo com 200 rpm. Transferiu-se uma porção de 5 ml da sementeira anterior pa ra um balão Erlenmeyer de 500 ml contendo 100 ml ãe meio âe expe_ rimentação composto por amido solúvel a 2%, 1% de melaço de beterraba (Nihon Tensai Seito) e 0,5%, de CaCQ3 a pH 7,0. RêaliZou--se a fermentação ã temperatura de 28°C dupante 7 dias num agita dor rotativo com 200 rpm. A produção de antibiótico no local de fermentação foi determinada de acordo com o ensaio de absorção de corante utilizando-se virus de herpes simplex tipo 1, 0 caldo de fermentação exibiu a activiãade antiviral numa diluição de 12 x durante quatro a sete dias de fermentação , A fermentação de ATCC-55884 em grande escala foi realizada num tanque fermentaâor de 200 l. Transferiu-se uma porção de 2 l da cultura em sementeira preparada por fermentação em- frasco, vara um fermentaâor -âe 200 l contendo 120 l de meio de produção com a mesma composição âe o meio que se utilizou para a fermentação em frasco, A fermentação em- tanque foi conduzida a 32°C com uma agi' tação de 250 rpm e uma taxa de arejamento de 120 l por minuto,

Centrifugou-se o caldo de fermentação (20 l, 50-1-00 mcg/ /ml) por meio âe uma centrífuga de Sharples, Corrigiu-se o pH do sobrenadante classificado (200 l) para 7,0 eom doido clorídrico 6N, agitou-se vigorosamente eom resina Diaion HP-20 (20 l), durante 1 hora e filtrou-se, Lavou-se a resina oom 30 l de água e3 em seguida, com 30 l de metanol aquoso a 20%, Após o controlo de acordo com o ensaio âe absorção de corante com vírus de herpes simplex tipo 1, avaliou-se a actividade com acetona aquo_ sa a 80% com um eluente3 pH 83 0 (20 l). Os eluentes activos fo_ vam reunidos e concentrados sob vdcuo para se obter uma solução aquosa a 4, 5 l que3 após aorrecção do pH para 73 03 se aplicou a uma coluna Diaion HP-20 (2,4 1). Desenvolveu-se a coluna com âgua e metanol aquoso a 807o sucessivamente (9 1), 0 eluato meta nólico bioactivo foi evaporado sob pressão reduzida ate ã obtenção de uma solução aquosa (335 1) que se lavou com 135 l âe acetato âe etilo, Retomou-se a fase aquosa e concentrou-se para se obter 31,6 g do solido impuro BU-3889V.

Todas as operações descritas posteriormente foram realizadas em quarto escuro.

Uma parte do sólido, impuro obtido anteriormente3 23, 8 g, foi misturado com 130 ml de gel âe sílica e introduzida no topo de uma coluna de gel de sílica Wakogel C-200, 350 ml, Desenvol^ veu-se a coluna cuidadosamente por fases com n-BuOH-n-PrOH-oon.NH "OH-H^O, (em mistura a 5:5:1:1, 2 l, fr. Nos. 1-20 e 3:3:1:1, 4 l3 fr. Nos. 21-66). As fracções eluíâas (100 ml) foram controladas por meio de um ensaio antiviral e por CCF (SiO^j n-BuOH-n-PrOH--conc.NHgOH-HgO, 3:3:1:1; UV e para detecção), As frac- çoes Nos. 8 e 9 reuniram-se e concentraram-se sob vãcuo para se

obter um solido impuro de BU-3889V D (410 mg). Os segundos pools activos3 fraeções E9s 31 a 41 foram trabalhados de igual maâo. pa ra se obter uma mistura (63 35 g) que se verificou ter três componentes BU-3889V A2 e Apor meio de um ensaio de HPLC. Este solido (390 mg) dissolveu-se em 4 ml de tampão de fosfato 03022 M (pH 7) e submeteu-se a uma eromatografia de eoluna 01ο inversa 18

(YMC-ODS3 AM type3 lamamura Chem. Lab. Co.3 Ltd. 800 ml). Desenvolveu-se a coluna com tampão de fosfato 0S022M contendo uma quan tidade crescente de metanol (25%3 28%3 30% e 35%) e analisou-se o eluato por CCF (RP-183 Merck3 MeOH-tampão de fosfato Q3 022M pH 73 50:50). As primeiras fraeções activas contendo o componente A ó foram recolhidas e concentradas ate ao pequeno volume de 30 ml que se aplicou Diaion- HP-20 (50 ml). Após lavagem com agua elutu— -se a coluna com metanol aquoso a 80% para se obter um solido puro de BU-3889V A^ (70 mg3 pureza por. HPLC), 0 segundo e o terceiro eluatos activos foram tratados de igual modo para se obter sólidos purificados de BV-3889V A2 (87mg3 97% de pureza e A^ (54 mg3 91% de pureza) respectivamente. A purificação de 52 mg de BU-3889V A2 realizou-se por EPLC preparativa Ceoluna; Capcell pak Shi_ seido3 30 x 250 mn3 fase móvel; MeOH tampão âe Sorensen 0305M3 pH 83 03 gradiente linear 30 a 55%3 âetecção: UV 254 mn3 debito; 5 ml/min). Recolheram-se os picos e concentraram-se para um pe± queno volume (35 ml) cujo pR se corrigiu para 730 e aplicaram-se numa coluna de Diaion HP-20 (80 ml). Após lavagem com agua eluíu- -se a coluna com metanol aquoso a 80% para se obter um sólido es curo de BU-3889V Aj (39 mg3 pureza 983?%).

Purificação de BU-3889V Ώ^ 0 solido impuro do componente D(410 mg) obtido como descrito anteriormente dissolveu-se em 4 ml de solução aquosa a 50% de t-BuOH e aplicou-se numa coluna IMV-ODS (AM type3 800 ml). Desenvolveu-se a coluna suaessivamente com uma mistura de MeOE--tampão de fosfato de 03 022M3 pE 73 0 a 20:803 -50:70 40:60.e 50:

Examinaram-se fracções de 20 ml por CCF (SiO n-BuOE-n-PrOH-conc. NE^OH-H^03 5:3:1:1) e concentraram-se as fracções apropriadas pa ra se obter um sólido semipuro de BU-5889V D^ (18 mg3 pureza 45%). Purificou-se posteriormente o solido por HPLC preparativo nas mesmas condições que se utilizaram para BV-3889V A^ para se obter o sólido puro de BU-3889V (336 mg3 pureza 96%).

Exemplo 2

Preparação de BU-58897 D^ a partir de BU-3889.V A^

Agvtou-se a temperatura de 50 C durante 2 dias3 uma solu ção de BU-3889V Aj (870 mg3 pureza 83%) em 40 ml de cloreto de hidrogénio metanólico 135N. Neutralizou-se a mistura reaccional com Amberlite IR-45 (OE ) e concentrou-se sob o vãcuo. Agitou--se o resíduo vigorosamente com uma mistura de n-butanol e água (200 ml de cada). Retomou-se a fase de n-BuOE e evaporou-se ã secura. Purificou-se o resíduo de 690 mg por cromatografia sobre coluna YMC-ODS (tipo AM3 80Q ml) para se obter uma amostra mais pura de sólido D^ (390 mg3 pureza 80%). Este (80 mg) foi finalmente purificado por EPLC preparativa para se isolar uma y

amostra pura de 30 mg de BU-3889V D^ idêntica ao produto natural em todos os aspeetos. Esta amostra cristalizou-se de uma mistura de álcool metílico - acetato de etilo depositando-se agulhas amarelas pálidas de BU-3889V homogéneas (14 mg). A fase aquosa do hidrolisaâo obtido anteriormente foi eorv oentrada ate um pequeno volume que se introduziu numa eoluna Se-phedex LH-20 (250 ml). Após desenvolvimento com metanol a 50% , reuniram-se as fracçães antróna-positivas e evaporaram-se para se obterem 60 mg de um solido amorfo branco. Identificou-se es_ te produto como D-galactosido metílico, por comparação directa com uma amostra autentica e pelo valor da rotação, optica £ + + 72°, c 33 03 H20j.

Exemplo 3

Preparação de BU-3889V A^ a .partir de BU-3889V Aj A uma solução etanôlica aquosa (1:1, 100 ml) de BU—38897 A2 (03 96 g) adicionaram-se 131 g de boro-hidreto de sodio sob agitação3 ã temperatura ambiente. Decorridos 3 minutos, verteu--se a mistura reaccional sobre água arrefecida com gelo e corrigiu-se a solução aquosa para pH 7 com ácido clorídrico 6N. Apli_ cou-se a solução numa coluna-de Diaion HP-20 (320 ml) que se lavou com água e eluíu com acetona aquosa a 80%. 0 eluato conten do o produto3 foi concentrado sob vácuo para se obterem 1Λ18 g de um po amarelo. Uma porção do po, 390 mg, foi purificada por cromatografia em coluna de fase inversa (IMC-ODS, 680 ml) com uma -45-

tampão de Sorensen (pH 82 mg.. Esta era identi de fermentação quer nos de alta resolução. eluiçao cuidadosa de metanol 20-40% em 730) para se obter uma amostra pura de aa com BU-3889V A^ obtido dos produtos dados espectrais quer na cromatografia

Exemplo 4

Isolamento de BU-3889V D„ e D3

Uma porção do solido impuro BU-38897 Ό^ (1,47 g) obtido de acordo com o método geral descrito no Exemplo 13 dissolveu--se em 8 ml de t-butanol aquoso a 50% e subemteu-se a uma croma tografia de fase inversa em coluna Cl8 (IMC-ODS, tipo AM3 lama-mura Chem. Lab. Co.3 Ld., 600 ml). Desenvolveu-se a coluna com tampão de fosfato 03022M contendo uma quantidade crescente de metano.l (30%3 40% e 50%) e analisou-se o eluato por CCF (RP-18, Merck3 MeOH-tampão de fosfato Q3 0 22M3 pE 73 0= 50:50 v/v). Reuniram-se as primeiras fracçoes activas (Rf. 0,18) concentraram-se sob vácuo até um pequeno volume de 40 ml que se aplicou numa coluna Diaion HP-20 (100 ml). Após lavagem com água slutu-se a coluna com metanol aquoso a 80% para se obter um sólido semipuro de EU-3889V D^ (260 mg, de pureza 53% por HPLC). A segunda (Rf 0314) e terceira fracçoes activas tMf 0,10)3 foram tratadas do mesmo modo para se obterem sólidos de BU-3889V D^ (154 mg, pureza 48%) e de BU-3889V Dj (97 mg, pureza 33%) respectivamente. Posteriormente purificaram—se estes materiais por HPLC preparati^ va (coluna Capcell pak Cjg, Shiseido, 30 x 250 mm, fase móvel:' MeOH-tampao de Sorensen Ο,ΟδΜ, pH 8, gradiente linear 30-55% , -46f

V r * ãetecção: UV254mn3 débito 15/ml/min). Os picos que continham o Z?0 puro e os que eontinham o D puro foram recolhidos e dessati-

a O fieados por uma coluna Diaion HP-20 para se obterem sólidos .razoavelmente puros ãe BU-38897 Dg (32 mg 3 pureza 92%) :e ãe BU-3889V (77 mg3 pureza 91%)s respeotivamente,

Exemplo 5

Derivação química de BU-3889V D^ A. Conversão de BU-3889V A^ para

Dissolveram-se 475 mg de BU-3889V A^ ·com pureza de 80% 3 em 40 ml de cloreto de hidrogénio metanólico a 13 5 N que se manteve em agitação à temperatura de 50°C durante 24 horas. Neutra lizou-se a mistura com hidróxido de sódio 6N e concentrou-se sob vãeuo. Aplicaram-se os 30 ml do concentrado numa coluna Diaion HP-20 (100 ml) que se lavou com água e elutu com metanol aquoso a 50% (250 ml). Evaporou-se o eluato activo para se obte_ rem 380 mg de um pó castanho claro. Purificou-se posteriormente este sólido por cromatografia em coluna IMC-ODS (tipo AM3 800 ml)j seguida de dessalificação com Diaion HP-20 para se obter uma amostra pura de 173 mg que era idêntica em todos os aspetos a BU-3889V D^ obtido a partr do caldo de fermentação. B. Conversão do BU-38897 A^ - ΰ^

Hidrolisou-se BU-38897 A3 (600 mg3 82%) em cloreto de hi_

drogénio metanôlico IjSN ã temperatura de 50°C durante 24 horas. A solução reaccionaol foi tratada como indicado anteriormente na fase A para se obterem 81 mg de BU-3889V D puro. 0 material ó era idêntico ao produto obtido por fermentação âe acordo com o método descrito no Exemplo 4.

Claims (15)

1. -48- fíiif»1 r_e ΛΛΛΛ-Ό.-1-Ο.Λ-Ο.10.Λ-§. 1,- Processo para a preparação. do antibiótico antiviral designado por BU 3889V A^ que, quando purificado, se apresenta sob a forma de um sólido amarelo pálido com um ponto de fusão superior a 250°C, uma rotação óptica especifica [ ^£*7 25 de + 180 graus (C 0,56, H O), um peso molecular de 1504, um valor u de Rj, de 0,05 na análise por cromatografia em camada fina sobre gel âe silica com n-BuOH-n-PrOB-conc.NH^OH-H^0 a 3:3:1:1 eâe.0,22 aplicando-se um gel de sílica de fase inversa com Me-OH-Tampão de fosfato, pH 7,0, a 50:50, solúvel em ãgua, dimetilformamida e dimetilsulfóxido e ligeiramente solúvel em metanol e acetona, dá resposta positiva ao reagente de antrona, iodo, cloreto férrico, reagente de Tollen e 2,4-dinitrofenil-hidrazina e uma resposta -49-

   negativa à nini.dvi.na, testes de Sakaguchi e Ehrlich, sensível â luz, apresenta um espeetro no infravermelho substancialmente como se mostra na figura 6, um espectro ãe cromatografia líquida de alta resolução substancialmente como se mostra na figura 2 um espectro de ressonância magnética nuclear RMN-C substancial^ mente como se mostra no quadro 3, um espectro de RMN-H1 substancialmente como se mostra na figura 12, com actividade inibiãora eficaz do desenvolvimento de vírus, caracterizado pelo facto ãe se cultivar uma estirpe produtora de BU-3889V A^ de Amycolatopsis orientalis em um meio nutriente aquoso contendo fontes assimiláveis de carbono e de azoto sob condições aerÕbicas submersas até que seja produzida uma quantidade substancial de BU-3889V A^ pe-: lo citado organismo no referido meio de cultura e de se recuperar depois o BU-3889· .A^ do meio ãe cultura substancialmente isento de outras substâncias produzidas conjuntamente.
2. 2,- Processo para a preparação de um antibiótico com acção antiviral designado por BU38897 A^ que, quando'--purificado, se apresenta sob a forma de um sólido amarelo pálido com um ponto de fusão superior a 250°C, uma rotação óptica específica [ ^ de + 108 graus (0=0,56, um Peso molecular de 1506, um valor de R^=0,05 nà análise por cromatografia em camada fina utilizando gel de sílica com n-BuOH-n-PrOH-conc. NH^OH-H^0 a 3:3:1:1 e Rj, igual a 0,43 utilizando gel de sílica de fase inversa com MeOE-Tampão de fosfato 0;022M, pH?,0, 50:50, è solúvel em água f -50--3»’ f dimetilformamiâa e dimetilsulfóxido, ligeiramente solúvel em meta nol e acetona, dá resposta positiva ao reagente de antrona, iodo, cloreto férrico, reagente de Tollen e 2,4-dinitrofenil-hiârazina e negativa à ninidrina, testes de Sakaguchi e Erlich, é sensível ã luz, com um espectro no infravermelho substancialmente como o que se mostra na figura 7, tem um espectro por aromatografia líquida de alta resolução substancialmente como o que se mostra na figura 3, com actividaâe inibiâora eficaz do desenvolvimento de vírus, caracterizado pelo facto de se cultivar uma estirpe pro_ dutora de BU-3889V A^ de Amyaolatopsis orientalis em um meio nutriente aquoso contendo fontes assimiláveis de carbono e de azoto sob condições aerôbicas submersas atê que sega produzida uma quantidade substancial de BU-2889V Apelo organismo citado antes no meio de cultura referido antes e de se recuperar depois o BU-3889 A^ do meio de cultura substancialmente isento de outras substâncias produzidas conguntamente.
3. 3,- Processo para a preparação de um antibiótico antiviral designado por BU-3889V A^ que, após purificação, se apresenta sob a forma de um solido amarelo pálido com um ponto de fusão superior a 250°C, uma rotação ôptica específica ] de +'36 graus (0=:0,55, Hg = ), um peso molecular de 1508, um Valor de R ^,= 0,05 na análise cromatogrãfica de camada fina sobre gel de sílica com n-BuOE-n-PrOH-conc.M^E-UgO a 3:3:1:1 e R^-0,55 em gel de sílica de fase inversa com MeOH-Tampão de fosfato 0,22M, pH 7,0, a 50:50,

   ·»* 4, solúvel em água, dimetilformamida e dimetilsulfóxido e ligeiramente solúvel em metanol e acetona, dando resposta positiva ao reagente de antrona, iodo, cloreto fêrrico, reagente de Tollen, e 2,4-dinitrofenil-hidrazina. e resposta negativa ã ninidrina, testes de Sakaguchi e Ehrlioh, é sensível ã luz, apresentando um espectro no infravermelho substancialmente como.se mostra na figura 8, um espectro de cromatografia líquida de alta resolução suhstancialmente idêntico ao que se apresenta na figura 4, um espectro de ressonância magnética nuclear protônica substancial^ mente idêntico ao que se apresenta na figura 13, com actividade inibidora do desenvolvimento de vírus, caracterizado pelo facto de se cultivar uma estirpe de Amycolatopsis orientalis produtora de BU-3889V A^ em um meio nutriente aquoso contendo fontes assimiláveis de carbono e de azoto, sob condições aerôbicas submersas, até que seja produzida uma quantidade substancial de BU-3889V A pelo organismo referido no citado meio de eultura 0 e de se recuperar depois o BU-3889V A^ do meio de cultura substancialmente isento de substâncias produzidas conjuntamente.
4. 4.- Processo para a preparação de um antibiótico antivi-ral designado por BU-38889V D^ que, após purificação, se apre--senta sob a forma de um sólido amarelo pálido com um ponto de fu são superior a 250°C, uma rotação óptica específica [ 06 J25 de +34 graus (C=0,5, piridina), um peso molecular de 1180, um valor de Rj>=0,34 na análise cromatogrãfica de camada fina sobre gel dé sílica com n-BuOB-n-PrOE-conc.ΝΉ^OH-Ba 3:3:1:1 e R^=0,10 na cromato-grafia liquida de alta resolução sobre gel de silica com MeOB--Tampão de fosfato 0,022M, pH 7,0, 50:50 ê solúvel em âimetil_ formamida e em ãimetilsulfóxido e ligeiramente solúvel em metanol e aeetona, dã uma resposta positiva ao iodo, cloreto férrico, reagente de Tollen e 2,4-dinitrofenil-hidrazina e negativa aos testes com antrona, niniãrina, de Sakaguchi e de Ehrlich, é sen-sivel à luz, dando um espectro no infravermelho substancialmente idêntico ao que se apresenta na figura 9, um espectro de cromato_ grafia liquida de alta resolução substancialmente idêntico ao da figura 5, ressonância magnética nuclear 130 .substancialmente co_ mo se mostra no quadro 3, RMN-1H substancialmente como se mostra na figura 14, com actividade inibidora eficaz do desenvolvimento de virus, caracterizado pelo facto de se cultivar uma estirpe pro_ dutora de Bu-3889V D^ de Amycolatopsis orientalis em um meio aquo_ so nutriente contendo fontes assimiláveis de carbono e de azoto, sob condições aeróbicas submersas ate se obter uma quantidade substancial de BU-3889 D^ produzida pelo citado organismo no meio de cultura referido anteriormente e de se recuperar em seguida o BU-3889V D^ desse meio de cultura substancialmente isento de subs_ tâncias produzidas conjuntamente.
5. 5,- Processo para a preparação de um antibiótico antiviral designado por BU-3889V D^, que, após purificação, se apresenta sob a forma de um pó amorfo amarelo claro com um ponto de fusão. -53- /

   camada fina sobre gel ãe sílica com n-BuOH-n-PrOH-eonc.NH^OR-UgO}

   -Tampão de fosfato 0,022M, pH 7,0, a 50:50 v/v, é solúvel em ãimetilformamida e em dimetilsulfóxido e ligeiramente solúvel, em metanol e acetona dando resposta positiva ao iodo, cloreto férri-co, reagente de Tollen e 2,4-dinitrofenil-hiãrazina e resposta negativa em antrona, niniãrina, testes de Sakaguchi e de Ehrlich, sensível à luz, apresentando um espectro de infravermelho substancialmente como se mostra na figura 18, um espectro de croma-tografia líquida de alta resolução substancialmente como se mos_ . 7 tra na fvgura 20, espectro de RMN H substancialmente como, se mostra na figura 18, exibindo os máximos de absorção no UV seguin tes: UV‘ nm Λ

   max em agua 237 (62.200) 301 (50.400) em HCl 0,01N 237 (52.000) 302 (42.900) 237 (65.400) em ΝαΟΗ Ο,ΟΙΝ 301 (49.900) e sendo um inibidor eficaz do desenvolvimento de vírus de herpes -54-

   simplex tipo 1 e vírus de influenza A, caracterizaão peto faoto de se cultivar uma estirpe produtora de BU-3889V Ό-âe Amycolatopsie orientalis em um meio aquoso nutriente contendo fontes assimiláveis de carbono e de azoto sob condições aerÓbicas submersas, ate que seja produzida uma quantidade substancial âe BU-3889V D u pelo organismo referido no meio de cutlura citado antes e de se recuperar em seguida o BV-3889V Ddo meio de cultura, substancialmente isento de substâncias produzidas conjuntamente.
6. 6,- Processo para a preparação de um antibiótico antiviral designado por BU-3889V D^ que, após purificação, se apresenta sob a forma de um pó amorfo amarelo pálido com um ponto de fusão superior a 250°C, uma rotação óptica especifica [ ®C] 26 D _ de -17 (C-0, 4, piridina) um peso molecular de 1184 determinado por FAB-MS, um valor de R ^,= 0,28 na análise cromatográfica em camada fina sobre gel de sílica com n-BuOH-n-PrOH-cone.NH^OH-H^O a 3:3:1:1 e R^=0,18 em gel de sílica dei fase inversa com MeOH-Tampão de fosfato 0,022M, pH7., a 50:50 v/v, é solúvel em ãimetilformamida e dimetilsulfóxido e ligeiramente solúvel em metanol e acetona, apresenta resposta positiva ao iodo, cloreto férrico, reagente de Tollen e 2,4-dinitrofenil-hidrazina e uma resposta negativa em antrona, ninidrina e aos testes de Sakaguchi e Ehrliçh, é sensível ã luz, com um espectro no infravermelho substancialmente como se mostra na figura 17, um espectro por cromatografia líquida de alta resolução substanaciálmente como se mostra na figura 20, um espectro ãe RMN H substancialmente aomo se mostra na figura 19 e exibe os máximos de absorção no UV seguintes: U7 nm )u < <3 ): max em água 237 (54.200) 300 (47. 200) em HC1 Ο,ΟΙΝ 237 (41.000) 301 (37.900) em ΝαΟΗ Ο,ΟΙΝ 237 (57.100) 300 (45.200) 13 apresenta um espeetro de RMN-C com os sinais que se mostram no quadro 7 e ê um inibidor eficaz do desenvolvimento do virus herpes simplex tipo 1 e do virus A da influenza, caracterizado pelo facto de se cultivar uma estirpe produtora de BU-38897 £>s de Amycolatop-sis orientalis em um meio aquoso nutriente contendo fontes ãe carbono e de azoto assimiláveis, sob condições aerõbicas submersas, até se obter uma quantidade substancial de BU-38897 D pro- 3 dusiâa pelo organismo citado no meio ãe cultura referido anterior_ mente e de se recuperar em seguida o BU-38897 Dg desse meio, subs_ tancialmente isento de substâncias produzidas eonguntamente. ?.- Processo para a preparação de um complexo antibiótico antiviral designado por BU-38897, caracterizado por se promover a fermentação aeróbica de uma estirpe produtora ãe BU-38897 de Amycolatovsis orientalis ATCC-53884, sob condições aerõbicas submersas em um meio de crescimento contendo uma fonte de carbono -56- sstp-

   e de azoto assimiláveis e eontendo õs antibióticas BU-38897 A^, BU-38897 Ã2> BU-3889V ABU-38897 Dv BU-3889V Dg e BU-3889V Dy
7. 8.- Cultura biologicamente pura do microrganismo Amycolatop-sis orientaíis ATCG-53884, caracterizada pelo facto de ser capaz de produzir o antibiótico BU-38897 em uma quantidade recuperãvel mediante cultura em um meio de cultura contendo fontes de carbono e de azoto assimiláveis sob condições aerôbicas submersas.
8. 9.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para o tratamento de uma infeeção virai em um mamifero incluindo um animal hospedeiro infectado, com.EI7caracterizaâo pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz, inibidora do desenvolvimento do virus, do antibiótico antiviral designado por BU-38897 A^, preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 1, como ingrediente activo, com um veicuto aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
9. 10.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para o tratamento de uma infeeção virai em um mamífero incluindo um animal hospedeiro infectado com HIV, caracterizaâo pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz, inibidora do desenvolvimento de vírus, do antibiótico antiviral designado por BU-38897 Α^, preparado de acordo com o método descrito na reivin_ dicação 2, como ingrediente activo, com um veiculo aceitável do ponto de vista farmacêutico.
10. 11. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para o tratamento de uma infecção virai, em um mamífero incluindo um animal hospedeiro infectado com HIV, caracterizado peto facto âe se misturar uma quantidade eficaz, inibiãora do desenvolvimento de vírus, do antibiótico antiviral designado por BU-3889V A^, preparado de acordo com o método descrito na reivindicação 2, como ingrediente activo, com um veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico.
11. 12. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para o tratamento de uma infecção virai em um mamífero incluindo um animal hospedeiro infectado com HIV, caracterizado peto facto de se misturar uma quantidade eficaz, inibiãora do desenvolvimento do vírus, do antibiótico antiviral designado por BU-2889V D preparado âe acordo com o processo descrito na reivindicação 4, como ingrediente activo, com um veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico.
12. 13. - Processo para a preparação ãe composições farmacêuticas apropriadas para o tratamento de uma infecção virai em um mamífero incluindo, um animal hospedeiro infectado com HIV, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz, inibiãora do desenvolvimento do vírus, do antibiótico antiviral designado por

    ί { BU-Z889V preparado de acordo com o processo descrito na rei_ vindicação 5, como ingrediente activo, com um veiculo aceitável do ponto de vista farmacêutico.
13. 14.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para o tratamento de uma infecção virai em um mamífero, incluindo um animal hospedeiro infectado com HIV, ca-racterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz inibi-dora do desenvolvimento do vírus, do antibiótico antiviral designaç_ do por BU-Z889V D„, preparado de acordo com o processo descrito ó na reivindicação 6, como ingrediente activo, com um veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico.
14. 15.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para o tratamento de uma infecção virai em um ma mífero, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz inibidora do desenvolvimento do vírus, do complexo antibiótico antiviral designado por BU-S889V, preparado de acordo com o processo descrito na reivindicação 7, como ingrediente activo, com um veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico.
15. 16.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de se utilizar o organismo Amyco- latopsis orientalis ATCC-5Z884 como estirpe produtora ou uma sua variante ou mutante produtora de BU-S8897. Q Agente Oficial da Propriedade Industrial C