PT92698B

PT92698B - Processo para a preparacao de composicoes de proteinas de soro do leite e de produtos diatecticos e de composicoes farmaceuticas que as contem

Info

Publication number: PT92698B
Application number: PT92698A
Authority: PT
Original assignee: Bounous Gustavo; Gold Phil
Priority date: 1988-12-23
Filing date: 1989-12-22
Publication date: 1995-09-12
Also published as: EP0374390B1; EP0374390A1; CA1338682C; DE68924142D1; AU638439B2; PT92697B; AU4670189A; DK591589A; CN1044660A; BR8906661A; CA2005779A1; ATE127321T1; NZ231865A; EP0375852A1; DE68924142T2; CN1044659A; NO309123B1; DE68923162D1; EP0375852B1; BR8906704A

Description

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere—se a uma composição de proteína do soro do leite biologicamente activa que com preende quantidades substancuais de um concentrado de proteína do soro do leite que contêm uma mistura de produto isolado de proteína de soro do leite que tem componentes proteicos e/ ou peptídicos que contêm grupos em que os referisos componentes estão presentes num estado essencialmente nao desnaturado e em que a actividade biológica do concentrado da proteína do soro do leite ê restrita a sua conformaÇao nao desnaturada. A presente invenção refere—se também a um processo para produzir a referida composição de proteína do soro do leite por ul

M ** ** trafiltraÇao e por acçao duma resina de permuta de aniões sobre o soro do leite, o concentrado do soro do leite ou um pó de concentrado de proteína do soro do leite reconstituida,bem como a varias formas de aplicaçao da composição da proteína de soro do leite biologicamente activa como descrito nas reivindicações ló a 24.

A invenção diz também respeito a alimentos ou a suplementos alimentares, produtos para nutrição terapêutica do homem ou de animais, alimentos de dieta, alimentaçao para cuidados intensivos, composiçoes farmacêuticas e composiçoes terapêuticas anti-cancro que contêm a citada composição se so ro biologicamente activa e se necessário em combinação com um

N.

? ζ \ excipiente (veiculo) neutro adequado para alimentaçao oral.

A presente invenção diz também respeito a um método para aumentar os níveis celulares de glutatiao (GSH) por administraÇao oral de quantidades substanciais de compo— nentes nao desnaturados de uma mistura de proteina de soro de leite de vaca que contêm grupos de glutamilei steína (Glu—Cys) isto ê beta-lactoglobulina e albumina do soro e possivelmente imunoglobulina.

soro do leite ê um sub-produto da indústria dos lacticmios bem conhecido. A sua composição e aproximadamente a do leite desnatado sem a caseína. Obteve—se o soro áci do por acidificaçao do leito quer por adiçao de um acido inor ganico ou por produção do ácido láctico (inoculando o leite com fermentos lácticos) a um pH próximo do ponto isoeléctrico da caseina. 0 soro e recuperzdo depois da separaçao da coalha da. A adiçao de coalho ao leite também causa a floculaçao ou coagulaçao de caseina. 0 soro obtido depois da sinêrese ê cha mado soro de coalho. Se a floculaçao ocorre ao pH do leite ou a um pH ligeiramente mais baixo mas acima de 5 »8 a 6>0 o soro ê chamado soro doce.

soro ê por conseguinte definido com respeito à natureza da coagulaçao do leite. 0 soro ácido resulta principalmente da fabricaÇao de coalhadas frescas e de fábricas de caseina. A composição dos soros pode variar em gamas bastante largas dependendo do leite donde se parte e do processamento de queijo empregue. Todos os soros contêm minerais algumas gorduras» uma quantidade de ácido láctico e enzimas «ν M ** de coagulaçao» sendo a fracçao mais interessante a fracçao ni trogenada. Na verdade» ê a fracçao nitrogenada que compreende essencialmente as proteínas solúveis do leite que possuem um alto valor biológico.

A técnica mais antiga para a extracçao de pro teinas do soro consiste em torná-las insolúveis por um trata—

i somento de desnaturaçao a quente a um pH proximo do ponto eléctrico. 0 inconveniente técnico de uma tal técnica ê a des naturaÇao das proteínas.

Como citado atrás, as proteínas do soro sao o grupo das proteínas do leite que permanecem solúveis no soro do leite depois da precipitaÇao de caseínas a pH 4,6 e a 20 C. As principais proteínas do soro no leite de vaca sao a beta—lactoglobulina {fi— L) , a alfa—lactalbumina (0(—L) , a imuno— globulina e a albumina do soro (AS) no sentido das quantidades decrescentes. 0 soro do leite e a proteína do soro do lei te foram utilizados desde tempos imemoriais com finalidades nutritivas. Para além disso, o soro do leite era recomendado pela medicina popilar e tradicional para o tratamento de várias doenças e, num caso, mostrou—se que uma dieta de proteína do soro do leite dada a hamsters durante toda a vida aumen tou a longevidade sem que fosse dada qualquer explicação.

«tf

Todas estas condiçoes parecem relacionadas de «tf «tf algum modo com alterações no glutatiao que constitui um elemento sempre presente que exerce um efeito de protecção contra os radicais de superóxido e outros agentes tóxicos.

glutatiao é um tiol tripeptídico omnipresen te (L—ÇAglutami1—L—cisteinilglicina) com uma ampla gama de funções vitais que incluem a desintoxicaÇao de xenobióticos e a protecção de células contra intermediários e radicais livres oxigenados e produtos secundários do metabolismo dependente do oxigénio. A modulaçao de glutatiao intracelular afecta a resposta imune proliferativa de linfócitos que pode ser iniciada por uma lesão oxidativa. 0 glutatiao protege as células contra a radiaçao e contra os agentes de alquilaçao. 0 esgotamen «tf to do glutatiao relacionado com a idade ou induzido experitnen talmente nos meios ópticos encontra—se associado com a formaçao de cataratas. Os danos do ADN devidos a oxidaçao sao repa rados rapidamente com eficácia. 0 corpo humano está continua— «tf «tf «tf mente a reparar ADN oxidado. Uma pequena fracçao de lesões nao

reparadas podem, no entanto, causar alterações permanentes no ADN e podem constituir uma contribuição importante para as doenças do envelhecimento e para o cancro. De facto várias doenças associadas com a idade podem ser induzidas por meio de radicais livres. Parece que enquanto que os dados sobre as al

AZ teraçoes relacionadas com a idade na vitamina E e de outros antioxidantes dos tecidos sao, na melhor das hipóteses, con— traditorios, os níveis de glutatiao nos tecidos estão relacio nados de modo mais consistente com o envelhecimento em animais de laboratório e no homem. Por estas razoes tem havido interesse nos factores que influenciam a sintese do glutatiao intracelular e especialmente nos modos de aumentar os níveis

AZ celulares de glutatiao.

glutatiao é constituido por três ácidos ami nados: ácido glutamico, glicina e cisteina. A disponibilidade da cisteina ê um factor limitante na síntese do glutatiao. A cisteina deriva da proteína da dieta e por trans—sulfuraçao da metionina no fígafo. Têm sido ensaiados vários métodos a fim de aumentar o nível intracelular do glutatiao. A adminis— traçao da cisteina livre nao ê um método ideal porque este áci do aminado ê oxidado rapidamente, ê tóxico e pode na verdade causar uma redução do glutatiao. Tem sido encontrados problemas semelhantes com a injecção i.p. de N-eceti1—cisteína a ratos, se bem que a administraÇao oral deste composto pareça evi az tar o desaparecimento do glutatiao induzido pelo paracetamol.

az az

A administraçao de compostos que sao transportados e converti dos intracelularmente em cisteina, como o L-2—oxotiazoli dina— -4—carboxilato, e util para aumentar o glutatiao celular ac— tuando como um sistema de distribuição intrzcelular para a cis teína. 0 glutatiao hepático duplicou quatro horas após a injecçao, regressou ao normal apos 8 horas, mas estava abaixo do normal após l6 horas. Verificou—se um outro método para o aumento dos níveis de glutatiao nos tecidos por meio de injecçao s.c. de glutamileistina(cisteína) em ratos: o gluta— tiao aumentou no rim em cerca de 55 %, 40 a 60 minutos após a

injecção, regressando para perto dos valores normais 2 horas depois. 0 composto administrado é transportado intacto e ser— ve como substracto para a sintetase de glutatiao. Foi também relatado que cerca de 2 horas após a administraçao i.p. do és ter monometílico (ou monoetilico) de Y—glutamil—ci steinil—gli cilo a ratos, os níveis de glutatiao no figado e no rim dupli caram, regressando aos valores normais após 8 horas. Foram ob tidos aumentos semelhantes nos níveis de glutatiao dos tecidos por Meister através da administraçao de um monoéster alquílico de glutatiao (US—A—4 784 685) a ratos. Estes ésteres ** _z sao transportados para o interior das células dos tecidos e sao desesterificadas dentro das células, conduzindo deste modo a níveis celulares aumentados de glutatiao. A cinética dos incrementos de glutatiao dos tecidos obtidos por este método sao semelhantes aos descritos seguindo a injecção i.p. de es— teres de metilo ou de etilo de glutatiao. A eficacia destes métodos tem sido claramente demonstrada em experiências agudas (US—A—4 784 685); em ratos tratados com L-2—oxotiazolidi— na-4-carboxilato a queda esperada do nível de glutatiao nos tecidos subsequente a injecção de acetaminofeno foi substitui da por um aumento real dos valores de glutatiao de tecido e da sobrevivência. Outros métodos para aumentar os níveis de glu— tatiao dos tecidos baseiam-se no exceder da concentraÇao de glutatioes seguido de redução por dietilmaleato ou SOB. Estes estudos foram feitos in vitro em linhas de células de murino. Descobriu—se também que a prê-exposiçao de ratos a hipoxia au ** z menta o glutatiao do pulmão.

A própria administraçao de glutatiao tem poucas consequências nos níveis de glutatiao dos tecidos, uma vez que aparentemente nao pode ser transportado intacto através da membrana celular.

Alguns dos métodos mencionados para aumentar os níveis intracelulares de concentração de glutatiao sao to— xicos ou sao perigosos devido aos riscos relacionados com a fase inicial da redução de glutatiao. Os métodos envolvendo o

uso de —glutamileistina(cisteína), atiazolidina ou ésteres de glutatiao (US—A—4 7θ4 685) oferecem uma possibilidade inte ressante para uma intervenção a curto termo. No entanto a sua eficacia a longo prazo na produção de uma elevaçao continuada de glutatiao celular nao foi ainda demonstrada nem foi refuta da a possível toxicidade do seu uso a longo prazo. Com efeito

Μ Μ M descobriu—se que o glutatiao e o dissulfureto de glutatiao sao positivos nos ensaios de curto prazo vulgarmente utilizados para carcinogenicidade e mutagenicicade.

Deste modo, um objectivo da presente invenção é proporcionar uma noca composição de proteínas do soro do lei te que é biologicamente activa e que pode ser usada na alimen taÇao de seres humanos e de animais e como medicamento. A com posição deve conter uma fracçao de proteina do soro do leite especial ou fracções que aumentam o glutatiao celular do hospedeiro, reduzindo a quantidade total necessária em comparaÇao à que é necessária para obter objectivos semelhantes usan do concentrado nao desnaturado de proteína de soro do leite.

novo produto deve ser administrado quer em cápsulas ou sob a forma de um pó para ser facilmente dissolvido em água ou em outros líquidos.

Um outro objectivo da invenção é proporcionar uma via para aumentar os níveis de glutatiao por administra— çao oral do percursor da cisteina sob a forma em que se encon tra contido no concentrado nao desnaturado de proteína do soro do leite de origem bovina. Quantidades semelhantes de cis— tema dada como cisteina livre nao sao eficazes. Por outro la do, verificou-se que as mesmas quantidades de outra proteína tal como clara de ovo, com um conteúdo elevado de cisteina idêntico nao eram eficazes no aumento dos níveis de glutatiao nos tecidos. Deste modo, a composição físico—química especifi ca do concentrado de proteína de soro do leite, na sua forma nao desnaturada (isto e, a posição da cisteina em relaÇao a estrutura primária, secundária e terciária da proteína) parece ser um factor crucial na biodisponibilidade da cisteina co

mo um precursor para a síntese intracelular do glutatiao.

** _z

Outro objectivo da invenção e proporcionar um método para aumentar os níveis celulares de glutatiao sem exposição aos efeitos tóxicos associados a outros métodos conhe eidos: a injestao durante períodos prolongados de concentrado de proteina de soro do leite de bovino mostrou nao ter efeitos tóxicos em ratos, hamsters e seres humanos.

Um objectivo adicional da invenção é proporcionar uma elevaçao estável de glutatiao nos tecidos com qual quer intuito para o qual a elevaçao durante períodos prolonga dos de níveis de glutatiao celular é desejada segundo a técni ca anterior, como seja para a protecção celular contra radiações livres, compostos perigosos estranhos, desintoxicação de ** X medicamentos, radiaçao, estados de imunodeficiência, etc..

Verificou—se surpreendentemente que com alte— rações técnicas nos métodos industriais de preparaçao de soro a partir de leite e do concentrado de proteína de soro do lei te (c.p.s.1.) que o c.p.s.l. devia ser nao desnaturado para ser biologicamente activo.

Assim sendo, e proposto na presente invenção um novo conceito relacionado com a preparaçao do concentrado de proteína do soro do leite, com o desígnio específico de pre servar a conformação nao desnaturada da qual a actividade bio lógica recentemente descoberta está dependente. Isto envolve naturalmente as duas principais fases na produção industrial de proteínas do soro do leite:

1. Um processo de separaçao do soro a partir do leite que pro voca um desvio mínimo da conformação da proteína do soro do leite a partir da gama normalmente aceite como nativa. Assim o processo exclui níveis de tratamento de calor e agitaçao na presença do ar que poderiam desnaturar a proteína do soro do leite.

2. Um processo para a produção de concentrado de proteína do soro do leite destinado a recolher do soro do leite as pro temas na sua conformação nativa. Assim a ultraf'i ltraçao e outras fases do processo sao muito suaves excluindo ou limitando o calor, as bombagens, o arejamento e outros trata mentos processuais que provocam a desnaturaçao da proteína.

Os problemas atrás mencionados foram resolvidos pelos aspectos que caracterizam as reivindicações de 1 a 11, respectivamente.

A invenção e desenvolvida mais em pormenor pe m

las sub—reivindi caçoes.

As reivindicações de 16 a 24 compreendem vá— rias formas de aplicaçao da nova composição de proteina do so ro do leite.

As vantagens oferecidas pela invenção sao prin cipalmente que!

1. A administraçao oral de quantidades substanciais de concen trado de proteína de soro do leite de bovino aumenta o con teúdo de glutatiao no fígado, no coraçao e no baço do rato (ver Figs. 1, 2 e 3).

2. Esta mudança ê moderada mas mantém—se no tempo e ê biologi camente significativa.

3. Esta propriedade é restrita ao concentrado de proteína de soro do leite de conformação nao desnaturado.

glutatiao é um tripeptídeo cina ).

,L-Jp—glutami 1—L-ci st eini 1—gli

A administraçao quer da cisteina (substracto limitante) quer do glutatiao propriamente dito ou de outras _z MM fontes de proteina tal como clara de ovo nao sao eficazes no aumento dos níveis celulares de GHS. Contudo, verificou

-se que a injecção i.p. de y-glutami 1- ci st ema aumenta por algumas horas o nível de GSH nos tecidos do rato.

5· 0 concentrado de proteína de soro do leite contém quantida des substanciais de grupos de glutamilei steína, ao contrário da caseína que nao aumenta o GHS no tecido quando dada como alimento ao rato.

6. Os grupos de glutamilei steína estão localizados na beta—la ctoglobulina e nas fracções de albumina do soro (ver quadro l).

A sequência de ácidos aminados da imunogiobulina do leite ** _z de bovino nao e totalmente conhecida.

7· A digestão pancreatica nao parte a ligaçao de dissulfureto das proteínas do soro do leite, pelo contrário sabe-se que a desnaturaÇao pelo calor parte esta ligaçao abrindo deste modo a estrutura globular da molécula para formar uma con— formaçao em espiral aleatória.

A invenção é em seguida descrita com referência aos desenhos e aos quadros que se apresentam!

Fig. l: conteúdo de glutatiao no baço de ratos alimentados com diferentes dietas,

Figs. 2 e 3^: conteúdo de glutatiao no fígado e no coraçao de ratos alimentados com diferentes dietas,

Fig. 4: intensificação da resposta imunitária das células de baço para GVSC, no rato alimentado com diferentes dietas que continham concentrado de proteína de soro do leite nao desnaturado,

Μ **

Fig. 5: papel do glutatiao no efeito da intensificação imunitária da proteína do soro do leite sob a forma de dieta.

Fig. 6 ** f quadro l: composição de proteína dos leites de vaca e humano,

Fig· 7 ** _z quadro 2J composição em ácidos aminados de concentrado de pro teína do soro do leite e de proteína da clara do ovo.

Explorou-se a interacçao da proteina da dieta e do GHS e a resposta imunitária do hospedeiro. Investigou—se se uma origem de proteína diferente tal como clara de ovo,com o mesmo nível elevado de cisteina que o concentrado de protéí na de soro do leite (Quadro 2), tinha um efeito semelhante na promoção de conteúdos mais elevados de GSH nos tecidos. Veri# ** ficou—se que a proteina da clara do ovo nao melhora»resposta imunitária do hospedeiro acima da média. Enquanto que se veri ficou que o nível de GSH estático no baço ficava inalterado ** Λ por alimentaçao de Lacp-ND durante tres semanas, os estudos presentes em ratos adultos jovens C3H mostraram que a melhoria da resposta imunitária das células de baço aos GVSC (Fig. 4) está assocoada com a elevaçao estável do GSH do baço duran te a expansao cional dos linfócitos provocada pelo antigene em ratos alimentados com Lacp—ND (proteína do soro do leite nao ** ** desnaturado) em comparaçao com um padrao de diminuição observado em níveis de GSH de baço em ratos alimentados por dietas quer de Lacp—D (proteína de soro do leite desnaturado) equiva lente do ponto de vista nutritivo, quer de caseína enriquecida por cisteina ou clara de ovo (Fig. l). Os últimos quatro grupos apresentam uma resposta imunitária mais baixa (Fig. 4). A administraçao de sulfoximina de S—(n—buti1)—homocisteína, que reduz o nível de glutatiao de baço a metade, produz uma descida marcada na resposta imunitária humoral de rato alimen tado por uma dieta de proteína do soro do leite (Lacp—ND). Is to é uma evidência adicional do papel importante do glutatiao no efeito da proteína do soro do leite sob a forma de dieta na intensificação da imunidade (Fig. 5)·

Análise do Qlutatiao nos Tecidos: Homogeneizaram—se noventa miligramas de coraçao ou de fígado de rato em acido 5^— sulfos— salicílico (5 % p/v). Os homogeneizados foram centrifugados

durante 5 minutos numa microcentífuga a 10 000 x g. A análise ê realizada usando os sobrenadantes no mesmo dia de acordo com o método de Anderson. Os valores sao expressos em ^imol/g de tecido húmido (Fgs. 2 e 3)·

Depois de três meses de qualquer das dietas iniciadas na idade de 17 meses, verificou—se que o conteúdo de GSH era mais elevado no fígado e no coraÇao de ratos ali— mentados com Lacp—ND (proteina de soro do leite nao desnatura da) em comparaçao com os alimentados com Lacp—D (proteína de soro do leite desnaturado), caseína, proteína da clara de ovo ou Purina (Fig. 2 e Fig. 3)· Os valores de GSH no coraÇao e no fígado de ratos alimentados com alimento de laboratório de purina foi semelhante na idade de 10 semanas, 17, 20 e 21 meses. A dieta de Lacp—ND parece melhorar o conteúdo de GSH do coraçao e do fígado acima dos valores normais depois de 3 a 4 meses de alimentaçao contínua (Figs. 2 e 3)·

Em conclusão, depois de tres semanas coma die ta de Lacp—ND, o conteúdo de GHS de baço aumentou durante a expansao clonal dos linfócitos provocada pelo antigene em ratos adultos jóvens C3H/HeN quando comparado com uma diminui— çao nos grupos de comparaçao alimentados com dieta de Lacp—D, caseína pu proteína da clara do ovo (Fig. 1). Em ratos velhos C57BL/6N1A, a alimentaçao prolongada por dieta de Lacp—ND tem como resultado um aumento moderado mas contínuo nos níveis de GSH do fígado e do coraçao (Figs. 2 e 3^· A actividade de intensificação do GSH do CPSL (concentrado de proteína de soro do leite) está restrita à sua forma nao desnaturada (Lacp—ND). Esta propriedade nao e somente devida ao conteúdo elevado de cisteina do CPSL porque outra fonte de proteína com um conteú do de cisteina semelhante (clara de ovo) nao apresenta esta actividade biologica. Esta propriedade de Lacp-ND nao depende especificamente da sua eficiência nutritiva, conforme avaliado pelo peso corporal, pelas proteínas do soro e pelo consumo de comi da,mas parece depender da estrutura primária, secundária e terciária da proteína na sua forma nativa.

Os dados das Figs. 2 e 3 mostram que a concen traçao de glutatiao no fígado e no coraçao nos ratos alimenta

M dos com Purina para comparaçao, permanece praticamente constante no tempo. Por outro lado notou-se uma elevaçao moderada mas contínua de GSH nos tecidos nos ratos alimentados com a dieta de proteína de soro do leite nao desnaturada (Lacp-ND) m

equivalente do ponto de vista nutritivo. Somente sao excreta— _ MM das na urina quantidades minúsculas de glutatiao e nao se encontram produtos de decomposição que possam ser imediatamente atribuídos ao glutatiao. A magnitude da mudança na concentração de glutatiao celular que pode ser atingida pode ser bastante limitada, talvez reflectindo a importância crítica desta molécula e o controlo regulador apertado que o acompanha.

proprio glutatiao serve como uma realimentaçao negativa nas enzimas da síntese de GSH, o que limita obviamente a capacida

M de celular para aumentar a concentração de GSH. A redutase de glutatiao mantém o GSH na sua forma reduzida predominante ( > 90 %). Isto serve, quer para manter este estado funcional, quer também para controlar a concentração celular, uma vez que o glutatiao reduzido (GSH) nao pode atravessar a membrana, en quanto que a forma oxidada (GSSG) pode e de facto atravessa, dando como resultado uma diminuição de glutatiao total. Para além destas enzimas, a gama-glutamiltranspeptida se (GGT) é im portante no metabolismo de GSH. A GGT serve como uma via de salvamento para fracções de glutamilo a nível da membrana pas sando—as novamente para o citosol para serem usadas na síntese de GSH. A actividade aumentada desta enzima tem sido associada com a concentração de GSH elevada em várias linhas de células e em tecidos meiignos.

Os efeitos de um pequeno aumento no GSH celular podem ser maiores do que o esperado. Por exemplo existem muitos relatos de linhas de células de tumores humanos e muri nos seleccionadas in vitro pela resistência a uma variedade de agentes quimioterapêuticos. Em várias destas linhas de células o GSH celular aumentou de modo consistente para o dobro em comparaçao com a linha de células progenitora sensível â

substância, a despeito do facto de que o nível de resistência à substância é muitas vezes muito maior, podendo atingir por exemplo 3θ vezes. Nestas linhas de células o esgotamento de GSH celular por inibição selectiva de síntese restaura a sensibilidade da substância para as células resistentes. Este fa cto apenas se verifica se o esgotamento de GSH ê mantido ao longo do período de tratamento.

Dado o facto de que o GSH celular ê regulado muito estreitamente, de que o aumento para o dobro pode ser o máximo e de que o efeito de pequenos aumentos no GSH pode ser amplificado por várias enzimas que utilizam GSH (por exemplo a glutatiao-peroxida se e a glutatiao-transferase) , a mudança reproductivel na concentração de GSH observada em animais ali mentados por dieta rica em soro do leite tem provavelmente uma importância biológica. A natureza crónica deste aumento contribui significativamente para este efeito.

Dados recentes que indicam especificamente que a responsabilidade pela deficiência de GSH notada em animais que envelhecem é uma falta do percursor de GSH, a cisteina, e nao uma diminuição das actividades da enzima biossintetica sao relevantes para a presente invenção. De modo semelhante a que bra no GSH citosólico no fígado de ratos a que foi dado eta— nol de forma crónica nao parece ser causada por uma limitaçao na capacidade da actividade da sintetase de glutamil—cist eína.

Resumo e Significado da Invenção

a. A actividade provocada pelo glutatiao do concentrado de proteína de soro do leite da dieta está dependente dos grupos de glutamilei steína contidos na beta—lactoglobuli— na e nas fracções de albumina do soro e possivelmente na fracçao IgG.

b. A conservação da ligaçao de dissulfureto (que envolve a

cisteina) pode ser crucial para a libertaÇao, por digestão, do peptídeo de glutamilei steína intacto para absor—

M ** çao pela mucosa intestinal. A desnaturaçao, por outro la— do, pelo desdobramento da molécula de proteína, expoe a sequência de glutamilcisteína a enzimas digestivas com su bsequente libertaÇao dos ácidos aminados simples ou de o ** z tras combinações peptidicas. Este facto estaria em conco dancia com a ausência observada da actividade provocada pelo glutatiao na forma desnaturada do concentrado de pro teína de soro do leite.

A presente invenção proporciona um método para remover da proteína do soro do leite a alfa—lactalbumina (quadro l).

Id IP

A administraçeo oral da fracçao de proteína do soro do leite ou de fraeções que se verificou libertarem mais grupos de glutamilei steína com a digestão, com o propósito de aumentar o glutatiao celular do hospedeiro. A quantidade total requerida ê significativamente menor do que a necessária para obter objectivos semelhantes usando concentrado de pro— tema do soro do leite nao desnaturado. Assim o produto pode ser administrado quer em cápsulas ou sob a forma de um pó para ser dissolvido (nao desnaturado) facilmente em água ou ou tros líquidos.

Claims

REIVINDI CAÇOES

Processo para a preparaçao de uma composição de um concentrado de proteína de soro do leite biologicamente activai que compreende quantidades substanciais de um concentrado de proteína de soro do leite que contém uma mistura iso lada de proteína de soro do leite tendo componentes proteicos e/ou peptxdicos que contêm grupos de glutamilei steína em que

M os referidos componentes estão presentes essencialmente num estado nao desnaturado e em que a actividade biolégica do con centrado de proteína de soro do leite nao desnaturada e res—

MM trita a sua conformação nao desnaturada compreendendo as seguintes fases:

a) imediatamente depois da ordenha, arrefecimento do leite até uma temperatura na gama de
2°C até 10°C, especialmen— te a 4 C, e remoção dos contaminantes,

b) depois de uma outra purificação do irite, precipitação da coalhada por redução do pH até cerca de 4,6 com ácido láctico inicialmente a 20°C, coalho e subida da temperatura até cerca de 30° 20 minutos para provocar a expulsão do soro da

M deixando em agitaçao num recipiente para desa— uma velocidade baixa, adi çao do C durante coalhada, gregar a

d) tratamento térmico do tipo da pasteurizaçao do produto que

M ficou no recipiente e agitaçao a alta velocidade,

Μ M

e) irradiaÇao e separaçao do soro e

f) ultrafiitraçao do soro usando uma membrana que tem um limiar de separaçao de peso molecular de substancialmente

10 000 ou menos, ou

g) ultrafiltraÇao do soro usando uma membrana que tem um li— miar de separaçao de peso molecular de substancialmente 17 000 ou menos para reter a ^-lactoglobulina e a albumina de soro, caracterizado por a fracçao de concentrado de proteína de so— ro do leite nao ser aquecido e o produto do qual e derivada, ser lentamente agitado para minimizar a desnaturaçao da proteína e por a citada ultrafiltraÇao ser realizada numa linha de produção que compreende mais de 20 módulos de tipo quadro suportando um grande número das citadas membranas conseguindo um concentrado final em produto seco de proteína nao desnaturada, em que a citada ultrafiltraÇao ê realizada a uma temperatura na gama de 4°C até 20°C, especialmente a 4°C.

- 2f Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida mistura do produto isolado de proteína de soro do leite conter ^-Lactoglobulina e/ou albumina de soro e/ou imunoglobulina.

-
3^a Processo de acordo com qualquer das reivindi— ** ~ _z caçoes 1 ou 2, caracterizado por na composição de proteína de soro do leite obtida, a fracçao de CA—Lactalbumina ser removida.

-
4 al6 Processo de acordo com qualquer das reivindi— «ar caçoes 1 a 3, caracterizado por a mistura do produto isolado de proteína de soro do leite ser adicionalmente concentrada e refinada até a uma pureza medicinal.
5^a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o concentrado de proteína de soro do leite ter proteínas que intensificam a imunidade sendo lábeis ao calor e insensíveis à digestão e por as proprie— dades de intensificação da imunidade dependerem do estado nao desnaturado dos peptídeos e das proteínas contidas na citada mistura de proteínas de soro do leite.

- 6a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o concentrado de proteína de soro do leite ser um concentrado de proteína de soro do leite de bovino e/ou de cabra e/ou de ovelha e/ou humano.

- 7^a Processo de acordo com qualquer das reivindicaçoes 1 a 3> caracterizado por a citada quantidade substancial de concentrado de proteína de soro do leite ser uma quan tidade terapêutica ou profilática de 18 a 28 g de proteína de soro do leite/100 g de dieta, especialmente 20 g de proteína de soro do leite/100 g dieta.

Processo de acordo com qualquer das reivindi— caçoes 5 a 7» caracterizado por a combinação de concentrado de proteína de soro do leite obtida» pode ser constituida por uma combinação do citado concentrado de proteína do soro do leite em conjunto com vitaminas e B^ em excesso sobre o mí nimo das necessidades diárias.

Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por as quantidades de vitaminas serem de 1,5 a 2,0 mg de B^ e 1,5 a 2,0 mg de B^·

- 10a _

Processo de acordo com qualquer das reivindi** ** caçoes 1 a 8, caracterizado por a combinação de concentrado de proteína de soro do leite obtida» ser isenta de lactose.

- lia _

Processo de acordo com qualquer das reivindi— caçoes 1 a 10, caracterizado por o concentrado de proteína de soro do leite ser produzido submetendo o soro do leite, um con centrado líquido de proteína de soro do leite ou um pó de con centrado de proteína de soro do leite reconstituído a ultra— filtraçao usando uma membrana que tem um limiar de separaçao de peso molecular de substancialmente 100 000.

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Processo de acordo com qualquer das reivindi— caçoes 1 a 10, caracterizado por o concentrado de proteína de soro do leite ser produzido submetando o soro do leite, um con centrado líquido de proteína de soro do leite ou um ρδ de concentrado de proteína de soro do leite reconstituído a ultra— filtraçao através duma membrana que tem um limiar de separa— Çao de peso molecular de substancialmente 5θθ 000.

- 13^a Processo de acordo com qualquer das reivindi— caçoes 1 a 10, caracterizado por o produto retido pela ultra— ** M filtraçao usando uma membrana que tem um limiar de separaçao de peso molecular de 10 000 ou menos, ser submetido a uma ultrafiltraÇao posterior usando uma membrana que tem um limiar de separaçao de peso molecular de substancialmente 500 000 e/ ou 100 000 para formar um concentrado que ê em seguida seco para formar um pó.

- 14 a Processo de acordo com qualquer das reivindi— caçoes 1 a 13 precedentes, caracterizado por o soro do leite, um concentrado de proteína de soro do leite ou um pS de concentrado de proteína de soro do leite reconstitui do ser subme tido à acçao duma resina de permuta de aniões para produzir um efluente, cujas proteínas de soro contem uma proporção mai s alta de á-lactoglobulina e/ou de albumina do soro e/ou de imu noglobulinas do que no soro do leite original ou no concentra do de soro do leite ou no pó reconstituído e um eluido, cuja proteína do soro do leite contêm uma proporção residual de /3— lactoglobulina e/ou de albumina do soro e/ou de imunoglobulinas e por pelo menos o efluente ser submetido a concentraÇao por ultrafiltraçao

- 15^a Piro cesso para a preparaçao de uma composição que contem numa forma essencialmente nao desnaturada as fracçoes de proteína do soro do leite ou seus variantes que contêm grupos de glutamilcisteína, caracterizado por estes serem removidos do leite ou do soro do leite, ou inactivados por desnaturaçao a temperaturas entre 100° e l40° Fahrenheit (37,8°C e 87,8°C) durante 3θ minutos.

- l6ô Processo para a preparaçao de uma composição que contêm numa forma essencialmente nao desnaturada as fracçoes de proteína de soro do leite ou seus variantes que contêm grupos de glutamilcisteína, caracterizado por estes serem removidos do leite bruto ou do soro do leite, isto ê, inactivados por desnaturaçao por tratamento com vapor indirecto a l48°C durante 2,5 segundo s.

- 17^a Processo para a preparaçao de uma composição que contêm numa forma essencialmente nao desnaturada as fracçoes de proteína de soro do leite ou seus variantes que contêm grupos de glutamilcisteína, caracterizado por estes serem removidos do leite bruto ou do soro do leite, isto ê, inacti** ** o vados por desnaturaçao por pasteurizaÇao a 77 C durante 15 se gundos.

18a Processo de acordo com qualquer das reivindi—

Μ M caçoes 1 a 17> caracterizado por a composição obtida conter ** « numa forma essencialmente nao desnaturada outras proteínas co mestíveis (alimento) que contêm grupos de Glu—Cis como ovomu— coide de clara de ovo de galinha·

- 19^a Processo para a preparaçao de um substituto de leite ou de proteína do leite, caracterizado por se incor— porar uma composição de proteina de soro do leite obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a l8 numa concentra— Çao adequada.

- 20ô Processo para a preparaçao de um substituto do leite ou de proteína do leite em produtos destinados a seres humanos com tendência para uma má absorçao da lactose, ca racterizado por se incorporar uma composição de proteina de soro do leite preparada de acordo com a reivindicação 10.

- 2ia Processo para a preparaçao de um substituto ou complemento para produtos lácteos, para alimentaÇao humana ou animal, caracterizado por se incorporar uma composição de proteina de soro do leite de acordo com as reivindicações 1 a 18.

22â

Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica útil para aumento da velocidade de síntese, da velocidade de reabastecimento e/ou dos níveis de concentração de glutatiao em órgãos humanos ou de animais, para melhorar a resistência do hospedeiro em seres humanos e animais, compreen dendo resistência melhorada às infecções bacterianas e/ou resistência melhorada para reduzir o crescimento do carcinoma e/ou resistência melhorada para o processo de envelhecimento e/ou uma combinação dos anteriores, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo uma quantidade eficaz tera— peutica ou profilaticamente de uma composição de protexna de soro do leite obtida de acordo com qualquer das reivindica** çoes 1 a lo.

Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica destinada a administraÇao oral para uso em medicina humana ou em veterinária, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo uma quantidade eficaz terapêutica ou profilaticamente de uma composição de proteína de soro do leite obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a lo ** A em combinação com uma substancia veicular neutra adequada para utilização alimentar oral.

Processo para a preparaçao de como uma compo— ** A siçao terapêutica anti—cancro, especialmente para a profilaxia do cancro do cólon, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo uma quantidade eficaz terapêutica ou profi «* laticamente de uma composição de proteina de soro do leite ob tida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 18.

- 25^a Processo para a preparaçao de um alimento ou suplemento alimentar, caracterizado por se incorporar uma com— posição de proteina de soro do leite, obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a lo, adaptada para necessidades de nutrição específicas.

- 26a Processo para a preparaçao de um produto para a nutrição terapêutica humana ou animal, caracterizado por se incorporar uma composição de proteina de soro do leite obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a l8.

- 27^a Processo para a preparaçao de um alimento de dieta, caracterizado por se incorporar uma composição de proteína de soro do leite de acordo com as reivindicações 1 a 18 em combinação com um veiculo neutro para alimentaçao oral.

Processo para a preparaçao de um alimento de

23 cuidado intensivo, caracterizado por se incorporar uma compo— sição de proteína de soro do leite de acordo com as reivindicações la l6, em combinaÇao com um veículo neutro adequado

A/ para alimentaÇao oral.

- 29^a Processo para a preparaÇao de uma composição rerapêutica anti—cancro, caracterizado por se incorporar uma composição de proteína de soro do leite, obtida de acordo com as reivindicações 1 a lo em combinaÇao com um veiculo neutro para alimentaÇao oral.

Os requerentes reivindicam a prioridade do pe dido norte-americano apresentado em 23 de Dezembro de 1988, sob o número de série 289,971·