PT92697B

PT92697B - Processo para a preparacao de composicoes de concentrados de proteina de soro do leite e de produtos dieteticos e composicoes farmaceuticas que as contem

Info

Publication number: PT92697B
Application number: PT92697A
Authority: PT
Original assignee: Bounous Gustavo; Gold Phil
Priority date: 1988-12-23
Filing date: 1989-12-22
Publication date: 1995-09-12
Also published as: DK591589A; PT92698A; ATE127321T1; CN1044660A; BR8906661A; CN1044659A; BR8906704A; AU638439B2; NZ231865A; NO894693D0; PT92698B; PT92697A; ES2082762T3; AU4670189A; DE68924142T2; CA1338682C; EP0375852B1; DE68924142D1; EP0375852A1; NO894693L

Description

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere—se a uma composição de proteína do soro do leite biologicamente activa que compreende uma concentração adequada de concentrado de proteí na de soro do leite, caracterizada por o concentrado de proteí na de soro do leite conter proteinas que estão presentes num estado essencialmente nao desnaturado e por a actividade bioló gica do concentrado de proteína de soro do leite ser dependen te do padrao geral de ácidos aminados e de peqienos peptídeos que resultam da contribuição de todos os seus componentes pro teicos, e a um método para a produção da referida composição de proteína do soro do leite que compreende as fases deί

a) imediatamente depois da ordenha, arrefecimento do leite a 4 C e remoção dos componentes de sujidade, ** **

b) após uma outra purificação do leite, precipitação da coa— lhada por redução do pH até cerca de 4,6 com ácido láctico inicialmente a 20° C.

c) adiçao de coalho e elevaÇao da temperatura até cerca de

O **

C durante 20 minutos a fim de promover a expulsão do soro da coalhada» deixando continuar a agitaçao num reser vatório a baixa velocidade,

d) tratamento térmico do tipo de uma pasteurizaçao do produto restante no reservatório a agitaçao a alta velocidade,

e) irradiaçao e separaçao do soro» e

f) ultrafiltraÇao do soro usando uma membrana com um limiar de separaçao de 10 000 Dalton.

A presente invenção refere—se também a várias aplicações das referidas composiçoes de proteínas do soro do leite.

Mostrou-se, em experiencias controladas, pela primeira vez, que a alimentaçao de ratos com proteína do soro do leite, intensifica especificamente a resposta imunitária a glóbulos vermelhos de sangue de carneiro (GVSC) e a sua resis tencia às infecções por pneumococos, inibe o desenvolvimento de cancro do colon induzido por DMH e aumenta os níveis de glu tatiao (GSH) nos tecidos, independentemente da sua qualidade nutritiva.

A presente invenção mostra a correlação entre a conformação no estado nao desnaturado do concentrado da proteína do soro do leite (c.p.s.l.) e a inten sificaÇao imunitária do hospedeiro, sendo dados índices quími cos da desnaturaÇao e a demonstração de que se aplica a mesma função fundamental da conformação molecular (estado nao desnaturado) a promoção de GSH, o que constitui a outra actividade biológica principal do c. p. s. 1.

É igualmente importante a demonstração de que outra origem de proteínas como a clara do ovo, com o mesmo con teúdo elevado de cisteína que o c.p.s.l., nao intensifica a síntese dp GSH, demonstrando adicionalmente a especificidade co c.p.s.l. com respeito à actividade biológica descrita.

A actividade de promoção do GSH do c.p.s.l. nao desnaturado conserva-se durante um longo periodo (3 a ’ meses).

soro do leite e a proteína do soro do leite foram utilizados desde tempos imemoriais para a nutrição. Para além disso, o soro do leite era recomendado pela medicina popular e tradicional para o tratamento de várias doenças (1, 2) e, num caso, mostrou—se que uma dieta de proteína do soro do leite durante toda a vida, aumentou a longevidade de hams— ters sem que fosse dada qualquer explicaÇao (3, 4).

arecem relacionadas de que constitui um ele— de protecção contra os tóxi cos.

Todas estas condiçoes p algum modo com alterações no glutatiao mento omnipresente que exerce um efeito radicais de superóxido e outros agentes

De fini ço e s

a) Proteína do soro do leite:

As proteínas do soro do proteínas do leite que ficam em solução da precipitação das caseínas a pH 4,6 e do soro do leite no leite de vaca sao:

leite sao o grupo de no soro do leite depois a 20°C. As proteínas — lactalbuminas:

alfa-lactalbumina ((λ-L) , 2 a 5% da proteína total, P.M. :

14,2 Dalton x 10 , albumina do soro (AS), 0,7 a 1,3% da proteína total, P.M.: 67 Dalton x 10

- 3 lactoglobulinas:

beta-lactoglobulina (/>-L) , 7 a 12% da proteína total) P.M. :

_ o

18,3 Dalton x 10 , euglobulina, 0,8 a 1,7% da proteína total, P.M. : l80 a 252 Dalton x 10~³;

pseuãoglobulina, 0,6 a 1,4 % da proteína total, P.M.: l80 a 289 Dalton x 10 imunoglobulina, 1,3 a 2,7% da proteína total, P.M.: 150 a 500 Dalton x 10~³;

— proteose/peptona· 2 a 6% da proteína total, P.M.: 4 a 20 Dalton x 10 .

produto da separaçao industrial de uma mistura proteica a partir do soro do leite ê designado por concentrado de proteína do soro do leite (CPSL) ou produto isolado. As principais proteínas do soro do leite sao a />L, a θ(— L, a imunoglobulina e a AS por ordem das suas quantidades decrescentes.

b) C = caseína;

c) GVSC =glóbulos vermelhos de sangue de carbeiroj

d) PFC = células que formam placas (Plaque forming cells) do baçoJ a determinaÇao do número das PFC no baço ê utilizada para a avaliaçao da resposta imunitária humoral a uma injecção de GVSCJ _e) GSH = glutatiao ( L- (f-glut ami 1-L- ci st eini lg li cina ) j

f) DMH = 1,2—d.imeti 1—hi drazina ;

DMH 2 HCl = dicioridrato de 1,2—dimeti1—hidrazinai

g) As dietas de fórmula definida ensaiadas eram diferentes apenas no tipo de proteína»

h) 0 soro de leite de bovino contêm aproximadamente 6 g por litro de proteína, a maior parte da lactose, minerais e vitaminas hi dro-so lúvei s }

i) cpsl = concentrado de proteína do soro do leitej

l) Lacp—ND = concentrado de proteína de soro do leite nao de snaturado j

m) Lacp—D = concentrado de proteína de soro do leite desnaturado (Lacprotan-80 de l) uma marca de Protein A.S.).

Antecedentes históricos

Os produtos lácteos sao amplamente usados co— mo uma boa fonte de nutrição. Para alem disso tem sido afirma do que o efeito de leite integral fermentado (iogurte) é bené fico para a melhoria de certos tipos de infecções intestinais. Tem sido também afirmado que alguns regimens de dieta baseados em produtos lácteos naturais mal definidos ou provenientes de culturas estão associados a uma esperança de vida prolongada em algumas regiões da URSS (Georgia, etc.).

Desde tempos imemoriáveis, administrava-se aos doentes serutn lactis, o termo latino para o soro do ieite, ·* / (1) para o tratamento de numerosas afecçoes. Em Ι0Ο3 Bariacelli referiu-se à utilização terapêutica do soro de leite de vaca ou de cabra, por vezes misturado com mel ou com ervas. 0 espectro das doenças tratadas com o soro do leite incluía icte— ricia, lesões da pele infectadas, lesões do tracto genito—uri nário com secreções purulentas, gonorreia, epilepsia, febre quarta e outros estados febris de varias origens. 0 denominador comum da maioria destas doenças parece ser, sem dúvida, a existência de uma condição séptica. Se bem que os médicos tan to da Antiguidade Remota como da Idade Média tenham estado de acordo em que o tratamento com soro do leite deveria ser leva do a efeito durante um período de vários dias, parece existir uma diferença de opinião no que se refere à quantidade diária recomendada. Deste modo, Galeno, Hipócrates e Dioscórides insistiram numa quantidade mínima diária de duas libras latinas

de 12 onças e até um máximo de cinco libras conforme a tolerância gástrica. Esta quantidade representava entre 1 e 2 litros de soro por dia. Baricelli, por outro lado, reflectindo a tendência dos seus tempos, limitava a quantidade prescrita a uma libra por dia, administrada em doses fraccionadas com o estomago vazio.

Desde então, numerosos artigos publicados na Europa ao longo dos séculos XVII, XVIII e XIX defenderam a uti

-A ( 2) lizaçao terapêutica do soro do leite . Num livro italiano publicado em meados do século XIX' , no alvorecer da mediei na científica, é feita uma interessante distinção entre o lei te integral e o soro do leite. 0 leite é recomendado em primeiro lugar como um nutriente especialmente em pacientes com estenose do tracto gastrointestinal. A este respeito o autor salienta que os benefícios da terapia pelo leite da caquexia e da tuberculose, então popular, é devida apenas às propriedades nutritivzs do leite. Em segundo lugar, o leite era receitado no tratamento de envenenamentos porque os componentes do leite presumivelmente neutralizavam o material tóxico ingeri do.

Em terceiro lugar, a terapia pelo leite foi sugerida pela capacidade alegada deste fluido para revestir e exercer um efeito calmante sobre as ólceras do tracto gastrointestinal. 0 soro do leite, por outro lado, foi aconselhado no tratamento da pneumonia e de doenças inflamatórias agudas dos intestinos e do tracto urogenital, apesar das suas qualidades nutritivas reconhecidamente reduzidas. Por fim, o autor salienta a inutilidade do soro do leite para o tratamento de „ ~ . ₊ , 14) afecções do sistema nervoso!

A principal diferença entre o soro (serum lactis) e o leite integral, reside na quase ausência no primeiro de caseínas, do cálcio e do fosfato ligados a caseína, da maior parte da gordura e das vitaminas lipossolúveis. A con— • centraçao de proteínas do soro no soro do leite e normalmen

te semelhante à do leite. Deste modo, as diferenças quantita— tivas entre o soro e o leite nao podem ser considerados como representando um factor chave no efeito terapêutico alegado do tratamento pelo soro uma vez que, se se pode atribuir qual quer significado a estas diferenças, este implica a ausência no soro do leite de nutrientes importantes.

Alguns dados recolhidos anteriormente^ pelos autores da presente invenção fornecem uma base cientifi ca para os benefícios presumíveis do tratamento intensivo com serum lactis. Foi demonstrada a importância dos ácidos ami— nados nos peptídeos do perfil das proteínas do concentrado de soro do leite no efeito de intensificaÇao imunitária do concentrado de proteínas do soro do leite (CPSL). As caseínas re presentam 80% do conteúdo total de proteínas do leite de vaca enquanto que o CPSL é apenas 20% . Deste modo, é concebível que ê a separaÇao do CPSL das caseínas no soro do leite que representa a alteraçao qualitativa principal, visto que esta alteraçao torna o perfil de ácidos aminados das proteínas do soro do leite independente do das caseínas uma vez que o processo digestivo tenha libertado os ácidos aminados a partir das proteínas ingeridas.

lgét odos para intensificar a resposta imunitária humoral a glóblulos vermelhos de sangue de carneiro e a resistência a infecçoes por pneumococos:

Descrição da técnica anterior!

Um impressionante número de publicações trata da associaçao de deficiências nutritivas, incluindo desnutrição energética de proteínas, com infecçoes em hospedeiros humanos e animais. Por exemplo ratos alimentados com uma quanti dade insufuciente de proteínas apresentam um crescimento infe rior ou mesmo perda de peso e uma susceptibili dade a infecçoes (15 ) por Staphyloçoccus aureus aumentada. Alguns estudos tratam da influência do tipo de proteína em dietas semelhantes e

adequadas do ponto de vista nutritivo sobre as respostas imn— nitárias. Mais em especial as fórmulas predominantes de casei na ou de soro para crianças de termo completo apresentam uma eficiência nutritiva comparável\ Por outro lado vários in vestigadotes têm relatado que a retenção de nitrogénio e o (17) . z . , . , crescimento sao maiores , a proteína de soro e mais eleva— , (19) . , . . , (18 , 19) da e a acidose metabólica e menos grave em crran ças cujo peso de nascimento é muito baixo, alimentadas por meio de fórmulas de soro do leite do que nas alimentadas com formulas de caseína. Nao foi relatada qualquer incidência de diarreia durante a alimentaçao com proteínas do soro

Os exemplos em FR—A—2296428 indicam claramente que a fórmula de proteínas do soro do leite sao mais digeríveis e eficazes do ponto de vista nutritivo uma vez que promovem o crescimento de crianças mal alimentadas, de baixo peso e com diarreias tal como demonstrado por! a) cessaÇao de diarreia presentr des de o nazcimento num bebé de 6 meses e uma rápida inversão de sinais nao especificados de desnutrição de calórica de proteínas (pág. 6, i. 5). b) Cessaçao de acessos recorrentes de infecções intestinas, resistentes a antibióticos, num bebé de 3 meses (pág. 6, linha 15). c) Os exemplos 1, 4 e 5ilus tram a terapia da anemia, o auxílio do crescimento e o tratamento da hiperfenilalaninemia respectivamente. d) Cessaçao de diarreia num bebé de 1 mês bem como da desnutrição com regresso a um equilíbrio positivo do nitrogénio (p 7·10). A reivindicação 5 de FR—A—2296428 defende a prevenção e a cura de problemas digestivos, doenças metabólicas, infecções intestinais e como cosmético nas áreas do tratamento da pele. Ê evi dente que os termos infecções intestinais e diarreia sao utilizados como alternativa um do outro. Em FR—A—2296428 nao se faz qualquer referência ao sistema imunitário. As análises imunológicas nao foram levadas a cabo, nem sequer foi feita uma reivindicação genérica nao substanciada de melhoria da imu nidade intestinal ou sistémica. A avaliaçao pós tratamento da flora intestinal nao foi relatada.

sistema imunitário nao foi investigado em

intestinais baseada na cessaÇao da diarreia nao pode ser con siderada como representando uma intensificação imunitária específica pela fórmula de proteínas de soro de leite independentemente da sua qualidade nutritiva.

Apesar de nao ser dada qualquer indicaçao em FR-A-2296428 com respeito ao tipo de alimentaçao anterior à alimentaçao com a fórmula de soro de leite, é de supor que os bebes se encontravam num estado de grave desnutrição e que a s ** melhoria no crescimento relatado subsequente a alimentaçao com a fórmula de soro de leite foi concebivelmente associada com o aumento dis níveis de albumina de soro.

De facto, a pre—albumina de soro ê uma medida sensível da adequaçao proteica ou calórica em crianças prematuras (20). θ efeito de hipoalbumineraia na absorçao do fluido intestinal e na diarreia, tem sido reconhecido desde o traba** (2122) lho original de Starling sobre a absorçao de fluidos ’

Para além desta diarreia de tipo osmótico, a desnutrição, especialmente a desnutrição proteica, pode produzir atrofia das mucosas já que o epitélio intestinal é alimentado primariamen (23) ~ ~ te por nutrientes luminais . A desnutrição conduz a uma ( 24 ) diminuição absoluta na mucina intestinal . A capacidade reduzida de manter a quantidade e o limite de mucina da mucosa é considerada como uma causa de diarreia por meio da redução da resistência intestinal contra infecçoes entéricas ) . + (25> 26) e contra proteaseas pancreaticas

Por fim, a possibilidade de que a mucosa intestinal de mamíferos recém-nascidos seja temporariamente per meável a imunoglobulinas intactas provenientes do leite da mae, conforme indicado em WO87/O4O5O, nao está relacionada com o presente estudo. 0 referido documento relata um método para a concentração a partir do soro do leite de um produto que con tém imunoglobulina /~Ig_7 imunitariamente activa (que se liga a antigenes) que, quando utilizados a vitelos recém-nascidos

Ic l·'!

a uma concentração muito alta de 7% de sólidos totais, propo ciona uma transferência substancial de imunidade passiva nat ral como se torna evidente pelos níveis de Ig do sangue e pe— po aumento da resistência as infecçoes. Este aumento temporário na imunidade passiva encontra—se associado em WO87/O4O5O com o início da actividade do sistema imunitário do animal, mas nao prova uma relaçao de causa—efeito entre a imunidade passiva e o desenvolvimento da imunidade activa.

A medicina tradicional e vários estudos indicaram que os lactobacilos constituem um dos grupos dominantes da flora intestinal e que o efeito adverso dos organismos putrzfactivos pode ser minimizado por meio da manutenção de uma ( 27 ) flora adequada de lactobacilos no intestino . Esta consideração tem contribuído para o interesse do efeito terapêutico dos lactobacilos e dos produtos lácteos fermentados com na etárias lácticas sobre várias afecçoes gastrointestinais. Pa— ra alem disso, recentemente foi provado que em ratos a que sao dasos a beber leites fermentados com Lactobacillus casei e com Lactobacillus acidophilus a resposta do sistema imunitário ao GVSC foi intensificada· Esta intensificação da resposta do sistema imunitário foi atribuída pelos autores às substâncias produzidas por estes organismos durante o processo da fermentaçao, como sejam alguns metabolitos e peptídeos de caseína, enzimas bacterianos e/ou por substâncias contidas na parede celular dos lactobacilos . Ê impossível separar neste mo— delo a função relativa das bactérias da dos componentes do leit e.

MECANISMO RESPONSÁVEL PELO EFEITO DE INTENSIFICAÇÃO IMUNITÁRIA DO CONCENTRADO DE PROTEÍNAS DO SORO DO LEITE NA DIETA

Durante os últimos anos têm sido feitas tenta tivas para identificar as alterações induzidas pelo tipo de proteína da dieta que pode directa ou indirectamente afectar o poder de resposta imunitário humoral. Em ratos nao estimula . dos por uma provocação imunogênica, verificou—se que o tipo

de proteínas na dieta tinha um efeito reduzido ou nao tinha qualquer efeito sobre vários parâmetros examinados. Deste modo, o crescimento corporal, o consumo de alimentos, as proteí nas do soro, os minerais e os metais vestigiais, os leucócitos em circulação e mais especificamente a génese de linfóci— tos B da medula óssea conservaram—se todos dentro dos limites (5-9) normais .

A busca do mecanismo possível da intensifica— çao imunitária por meio de alimentaÇao com proteínas do soro do leite revelou—se a possibilidade estimulante de que o concentrado de proteínas do soro do leite pudesse contribuir para um efeito biológico mais amplo de uma natureza protectora que envolve a susceptibilidade ao cancro e a desintoxicação de agentes ambientais. 0 presente estudo mostrou que a intensificação observada da resposta imunitária se encontra associada com uma maior produção de glutatiao em ratos imunizados alimentados com concentrado de proteína do soro do leite em comparaçao com ratos alimentados com caseína, com caseína enriquecida com cisteína ou com proteina da clara do ovo em con centraçoes semelhantes na dieta- A eficiência da cisterna da dieta na indução de níveis de glutatiao superiores ao normal ê mais elevada quando esrá é fornecida na proteína do soro do leite do que sob a forma de cisteína livre ou em proteína da clara do ovo. 0 glutatiao foi encontrado a níveis mais eleva— dos no coraçao e no fígado de ratos idosos alimentados com proteína do soro do leite em comparaçao com ratos alimentados com a dieta de caseína correspondente, com a proteína da clara do ovo ou com alimento para ratos Purina.

MÉTODO PARA AUMENTAR 0 GLUTATIAO DOS TECIDOS

Descrição da técnica anterior glutatiol ê um tiol tripeptídico omnipresen te (L—p-glutami1—L—cisteinilglicina) com uma ampla gama de fun * ** *** z . çoes vitais que incluem a desintoxicação de xenobioticos e a

protecção de células contra intermediários e radicais livres oxigenados e produtos secundários do metabolismo dependente , ( 31) ** do oxigénio . A modulação de glutatiao intracelular afecta a resposta imunitária proliferativa de linfócitos que pode ~ (32) ~ ser iniciada por uma lesão oxidativa · 0 glutatiao prote— ge as células contra a radiaçao e contra os agentes de alquilaÇao. 0 esgotamento do glutatiao relacionado com a idade ou induzido experimentalmente nos meios ópticos encontra—se asso “ (33) ~ ciado com a formaçao de cataratas . Os danos do ADN devidos a oxidaÇao sao reparados rapidamente com eficacia. 0 corpo humano está continuamente a reparar ADN oxidado. Uma peque na fracçao de lesões nao reparadas podem, no entanto, causar alterações permanentes no ADN e podem constituir uma contribui çao importante para as doenças do envelhecimento e para o can cro \ De facto várias doenças associadas com a idade podem ser induzidas por meio de radicais livres. Parece que enquanto que os dados sobre as alterações relacionadas com a idade na vitamina E e em outros antioxidantes dos tecidos sao, na melhor das hipóteses, contraditórios (35) , os níveis de glutatiao nos tecidos estão relacionados de modo mais consistente com o envelhecimento em animais de laboratório ^θ) _θ ( 37 ) ~ no homem . Por estas razoes tem havido interesse nos factores que influenciam a síntese do glutatiao intracelular e especialmente nos modos de aumentar os níveis celulares de glu tatiao.

glutatiao é constituído por três ácidos ami nados: ácido glutâmico, glicina e cisteína. A disponibilidade da cisteína ê um factor limitante na síntese do glutatiao A cisteína deriva da proteína da dieta e por trans—sulfuraÇao da metionina no fígado. Tem sido ensaiados vários métodos a fim de aumentar o nível intracelular do glutatiao. A administraçao da cisteína livre nao é um método ideal porque este áci do aminado é oxidado rapidamente, é tóxico e pode na verdade causar uma redução do glutatiao Tg_ra sido encontrados problemas semelhantes com a injecção i.p. de N-acetii—cisteína a ratos, se bem que a administraçao oral deste composto pa

reça evitar o desaparecimento do glutatiao induzido pelo para (39) ~ ~ — cetamol . A administração de compostos que sao transporta dos e convertidos intracelularmente em cisteina, como o L-2-oxotiazolidina-4-carboxilato, ê útil para aumentar o gluta~ (4o) ~ tiao celular actuando como um sistema de distribuição in tracelular para a cisteina. 0 glutatiao hepático duplicou quatro horas após a injecção, regressou ao normal após 8 horas, mas estava abaixo do normal após 16 horas \ Verificou-se um outro método para o aumento dos níveis de glutatiao nos te eidos por meio de injecção s. c. de ]p—glutami lei stina ( ci st eína ) em ratos! o glutatiao aumentou no rim em cerca de 55%, 40 a 60 minutos após a injecção, regressando para perto dos valores normais 2 horas depois . 0 composto administrado ê transportado intacto e serve como substrato para a sintetase de glu tatiao. Foi também relatado que cerca de 2 horas após a administração i.p. do éster monometílico (ou monoetílico) de ^-glu tami1-cisteini1—glicilo a ratos, os níveis de glutatiao no fí gado e no rim duplicaram, regressando aos valores normais após 8 horas. Foram obtidos aumentos semelhantes nos níveis de glu tatiao nos tecidos por Meister através da administraçao de um monoêster alquílico de glutatiao (US—A—4 784 685) a ratos. Es tes ésteres sao transportados para o interior das células dos tecidos e sao desesterificados dentro das células, conduzindo deste modo a níveis celulares a mentados de glutatiao. A ciné tica dos incrementos de glutatiao dos tecidos obtidos por este método é semelhante à descrita seguindo a injecção i.p. de ésteres de metilo ou de-etilo de glutatiao. A eficácia destes métodos cem sido claramente demonstrada em experiências delicadas (US-A—4 784 685)j em ratos tratados com L—2—oxotiazolidi na-4—carboxilato a queda esperada do nível de glutatiao nos te eidos subsequente a injecção de acetaminofeno foi substituída por um aumento real dos valores de glutatiao de tecido e da sobrevivência. Outros métodos para aumentar os níveis de glutatiao nos tecidos baseiam-se no exceder da concentração de glutatioes seguido de redução por dietiimaleato ou BSO. Estes estudos foram feitos in vitro em linhas de células de murino. Descobriu—se também que a pré—exposiçao de ratos a hipoxia au

menta o glutatiao do pulmão.

A própria administraÇao de glutatiao tem poucas consequências nos níveis de glutatiao nos tecidos, uma vez que aparentemente nao pode ser transportado intacto através da mambrana celular.

Alguns dos métodos mencionados para aumentar os níveis intracelulares de concentração de glutatiao sao to— xicos ou sao perigosos devido aos riscos relacionados com a fase inicial da redução de glutztiao. Os métodos envolvendo o uso de ^-glutamileistina(cisteína), atiazolidina ou ésteres de glutatiao (US—A-4 784 685) ofere cem uma possibilidade interes sante para uma intervenção a curto termo.

No entanto a sua eficácia a longo prazo na pro duçao de uma elevaçao continuada de glutatiao celular nao foi ainda demonstrada nem foi refutada a possível toxicidade do seu uso a longo prazo. Com efeito descobriu-se que o glutatiao e o dissulfureto de glutatiao sao positivos nos ensaios de cur to prazo vulgarmente utilizados para carcinogenicidade e muta genecidade, Sao relevantes para a presente invenção dados recentes indicando especificamente que ê mais uma falta do per cursor de GSH, cisteína, do que uma diminuição das activida— des enzimáticas biossintêticas a responsável pela deficiência (4l) de GSH notada em animais envelhecidos . De forma semelhan te a queda em GSH citosólico no fígado de ratos a que foi admi nistrado etanol de forma crónica nao parece ser causada por uma limitaçao na capacidade de actividade sintetase de K—glu— . . . . ₊ , (44) tanulcistema

MÉTODOS PARA INIBIR 0 CRESCIMENTO DE CANCRO DO COLON

INDUZIDO QUIMICAMENTE

Té eni ca anterior

Verificou—se que uma defi ciência protei ca na

dieta reduz a incidência de tumores espontâneos ou trans plantados \ & maior parte dos estudos definitivos sobre proteínas e cancro têm utilizado a subaiimentaçao proteica. Apesar de algumas provas indicarem que quanto mais alta a (48 for a entrada da proteína maior c a incidência de tumores' ’ 49) , dados referentes ao efeito do aumento de consumo de proteínas na carcinogénese e no desenvolvimento de tumores nao ~ (50) Λ sao definitivos . Os estudos tem referido mais a quantida de de proteína e o seu conteúdo em ácidos aminados do que a <50) _A . . , .

sua origem . Apenas existem poucos dasos disponíveis sobre o efeito do tipo de proteína em dietas adequadas e semelhantes do ponto de vista nutritivo e o desenvolvimento de tu mores. Especificamente a presente invenção relaciona—se com o efeito na dieta de um concentrado de proreína de soro do leite de bovino nao desnaturado numa dieta adequada do ponto de vista nutritivo no desenvolvimento de cancro de cólon induzido por DMH em ratos.

Jacquet et al· ^l) descreveram que a alimentaçao por meio de leite retardava em média por um factor de 0,4 o crescimento de timores em ratazanas a que tinha sido im plantado o epitelioma T8. Este resultado é consistente com a guns estudos epidemiológicos que mostram que o consumo de le # (52 re ou de produtos lácteos pode reduzir o risco de cancro ’

IH· lh

53)

Em ratos em que foram inoculadas células de tumor ascíti co de Ehrlich a alimentaçao por iogurte reduziu o numero de células de tumor por um factor de 0,2 a 0,28 . Também foi descrito que os ratos que foram alimentados com uma dieta baseada numa fórmula de proteínas do leite apresentaram uma ini biçao do volume de tumores com um factor de 0,2 a 0,7 a seguir a injecções s.c. de células de tumor de colón induzido por DMH em comparaçao com ourros ratos que foram alimentados com outros tipos de proteínas Um grau comparável de inibição de tumores foi notado em ratos alimentados com proteínas do leite em que se injectaram s.c. células transformadas por vírus de herpes^^. No entanto, em outro artigo, submeti do para publicação alguns meses mais tarde, o mesmo grupo de

autores relatou resultados ...diferentes dos esperados tendo em vista as nossas descobertas anteriores. A alimentaçao por meio de proteinas do leite nao inibiu o crescimento de turno— ( 57) res na mesma estirpe de ratos a que se injectou DMH . A pro priedade biológica anti-cancerígena anteriormente descrita de proteínas de leite na dieta estava ausente, apesar da conser~ (57) ~ vaçao da boa qualidade nutritiva . Os autores nap dao explicaÇao desta aparente contradição.

Verificou-se recentemente que vários tipos de queijos e de iogurte suprimem o crescimento de vários tumores experimentais em ratos em proporção com a duraÇao da sua admi nistraçao na dieta. A ditftensao dos timores foi reduzida por (58) um factor de 0,17 a 0,7 dependendo do tipo de tumor

Os tumores do cólon induzidos por DMH parecem ser semelhantes aos que se encontram nos seres humanos pelo menos no que se refere ao tipo de lesões e ao tipo de respos. . . . - (59, 60) ta quimioterapeutica ·

Cerca de 80% das proteínas do leite de bovino sao caseínas e os restantes 20% sao proteínas do soro^^’ 62). Para além disso, na utilização do processo tradicional para a preparaçao de caseína, a quantidade de proteína do soro que co—precipita juntamente com a caseína varia desde cerca de 40 a 60% da quantidade total de proteína do soro presente no lei (63) . Por conseguinte é concebível que os escassos efeitos anti-cancerígenos verificados com a caseína sejam devidos a quantidade relativamente pequena (em relaÇao às caseínas) de proteína do soro que co—precipita.

Em GB—À—1495940 (Willadsen) descreve—se um efeito anti—leucemico em ratos de uma fracçao de proteina do soro do leite presumivelmente de origem bovina. Ratos inocula dos com células de leucemia foram injectados i.p. com o material de ensaio numa quantidade que eu estimei ser de cerca de 0,04 mg/proteína por dia (peso molecular de 6 000 a 20 000 re presentando cerca de 60% do toatl de proteína do soro do lei te) durante 9 dias.

As únicas proteínas nao eficazes na redução do cancro usadas em GB—A—1495940 constituíam as fracções do so ro de peso molecular inferior a 6 000 ou superior a 20 000, isto ê, a albumina do soro (peso molecular 66 000) e a imunoglobulina (153 000 a 1 000 000). A maioria das proteínas alér genicas têm um peso molecular entre 15 000 e 40 000 Daltons.

principal alérgeno do leite de vaca ê a lactoglobulina (P M. l8 3θθ) (64)^ Portanto a fracçao da proteína do soro do leite que se verificou possuir este efeito anti—Ieucémico (pe so molecular 20 000 a 6 000) incluiria esta á-lactoglobulina·

Ê muito possível que o efeito anti—cancerígeno descrito em GB **

-A-l49594O seja o resultado da imunomodulaçao por estimulação antigénica de proteínas estranhas.

Verificou—se que um componente da proteína do soro do leite humano, a lactoferrina, exerce, em dependência das condiçoes da cultura, um ligeiro efeito de inibição ou um efeito de estímulo do crescimento de uma linha de células do adenocarcinoma do cólon humano in vitro · Esta proteina particular, presente no leite humano, enconxra—se totalmente ausente ou apenas em quantidades vestigiais no soro do leite de bovino

Processamento do leite e preparaçao do soro

Imediatamente após a ordenha, o leite ê arrefecido a 4°C e é conservado num tanque arrefecido para entre— ga a fábrica do queijo. A precipitação da coalhada e obtida por-reduçao do pH atê cerca de 4,6 com ácido láctico inicialmente a 20°C. À seguir à adiçao de coalho (normalmente tres onças por 1000 libras de leite /Ϊ88 ml/t_/, eleva—se a temperatura atê cerca de 30°C durante 20 minutos a fim de provocar a expulsão do soro da coalhada, deixando em seguida em agitaçao lenta no reservatório para desagregar a massa.

Quando se obteve uma quantidade suficiente de soro, o produto que ficou no reservatório ê pasteurizado domo do habitual a fim de se obter uma redução das bactérias e ê agitado a alta velocidade para a produção de queijo. 0 soro é então irradiado com uma fonte de radiaçao gama. A dose de radiaçao variará de 3 a 15 kGy de acordo com o conteúdo bacte— riano do soro, a fim de atingir um efeito antibacteriano equi valente a pasteurizaçao normal com um mínimo de desnaturaçao das proteínas (medida pelas alterações nas proteínas solúveis, isto ê, pela concentração proteica no soro antes e depois do tratamento).

Deste modo, constitui um objectivo da presente invenção proporcionar uma composição de proteína do soro do leite com uma actividade biológica específica que nao se en contra relacionada com a qualidade nutritiva já conhecida e que deve ser independente de influências genéticas específicas ou hormonais a fim de intensificar o conteúdo de glutatiao celular, a resposta imunitária humoral (PFC) a glóbulos verme lhos do sangue de carbeiro, a resistência a infecções por pneu mococos, a resistência ao carcinoma do cólon induzido por di— meti1-hidrazina e o atraso da mortalidade por doenças e devido a idade.

Ê um objectivo da presente invenção proporcio nar uma composição de proteína do soro do leite que pode ser utilizada para a nutrição humana ou animal, por exemplo como um substituto ou como suplemento para fins profiláticos e/ou terapêuti cos.

cionar meio de

Outro objectivo da um método para a preparaçao ultrafiltraçao.

presente invenção é pro or de CPSL nao desnaturada por

Outro objectivo da presente invenção é propor cionar um modo de aumentar os níveis intracelulares de gluta— tiao por administraçao oral do precursor de cisterna sob a forma como se encontra contido no concentrado de proreína do

soro do leite de origem bovina. Quantidades semelhantes de cisteína dadas sob a forma de cisteína livre nao sao eficazes. Por outro lado verificou-se que as mesmas quantidades de outra proteína, como por exemplo clara de ovo, com um conteúdo elevado idêntico de cisteína, sao ineficazes na elevaçao dos níveis de glutatiao nos tecidos. Por conseguinte, a composição fisico—quími ca do concentrado de proteína do soro do leite específico na sua forma nao desnaturada (isto ê, sem alteraçao da posição da cisteína em relaçao com a estrutura prima ria, secundária e terciária da proteína) parece ser um factor crucial na biodisponibilidade da cisteína como um precursor para a síntese intracelular do glutatiao.

Um outro objectivo da presente invenção é pro potcionar um método para o aumento dos níveis celulares de glu tatiao sem exposição aos efeitos tóxicos associados com outros métodos conhecidos: provou-se que a ingestão a longo termo de proteína do soro do leite de bovino nao é tóxica para ratos, hamsters e seres humanos.

Um objectivo adicional da presente invenção e proporcionar uma elevaçao continuada do glutatiao nos tecidos para qualquer finalidade para a qual se deseje uma elevaçao prifilática de longo termo rios níveis de flutatiao de acordo com a técnica anterior, como seja para protecção celular contra radicais livres, contra compostos estranhos perigosos, pa ra desintoxicação de produtos farmacêuticos, radiaçao, estados de imuno defi ci ênci a , etc..

Estes problemas sao resolvidos por uma composição de proteína do soro do leite que contêm uma concentração adequada de concentrado de proteína do soro do leite, con tendo este concentrado de proteína do soro do leite proteínas que estão presentes num estado essencialmente nao desnaturado e sendo a actividade do concentrado de proteína do soro do lei te dependente do padrao de ácidos aminados e de pequenos peptídeos que resultam da contribuição de todos os seus compo—

nentes proteicos.

A invenção ê desenvolvida mais completamente pelas sub—reivindi caçoes. E importante notar que o CPSL e o concentrado de proteína de soro do leite de bovino e/ou de car neiro e/ou humano.

De acordo com a presente invenção proporciona _z M

-se um método para a produção de uma composição de concentrado de proteína do soro do leite de acordo com as reivindica— ** Λ çoes 1 a o, 11 e 12 que compreende as seguintes fases!

a) imediatamente depois da ordenha, arrefecimento do leite a 4°C e remoção dos componentes de sujidade,

b) apos uma outra purificação do leite, precipitação da coalhada por redução do pH até cerca de 4,6 com ácido láctico inicialmente a 20°C.

** «w _z cJ adiçao de coalho e elevaçao da temperatura ate cerca de 30 C durante 20 minutos a fim de promover a expulsão do soro da coalhada, deixando continuar a agitaçao num reser vatório a baixa velocidade,

e) irradiaçao e separaçao do soro e

f) ultrafiitraçao do soro usando uma membrana com um limiar de separaçao de 10 000 Dalton.

sendo o referido método caracterizado por a fracçao do soro do leite a ser usada para a subsequente produção de concentra do de proteína do soro do leite nao ser aquecida e por o mate rial do qual esta fracçao e derivada ser agitado lentamente a fim de minimizar a desnaturaçao proteica e a referida ultrafiltraÇao ser levada a efeito numa linha de produção contendo até 20 módulos do tipo quadro com um grande número das referi das membranas obtendo—se um concentrado final de matéria seca

de proteína do soro do leite.

A composição de protexna do soro do leite po— de ser usada de acordo com a presente invenção conforme reivindicado nas reivindicações 18 a 26.

Os nossos estudos interesse no efeito da ingestão de ácidos aminados sobre o sistema imunitário foi suscitado por uma ob— servaçao feita há vários anos. Alimentaram—se ratos com uma dieta constituída por uma fórmula definida que continha uma mistura de ácidos aminados livres com uma composição equivalente à da caseína. Alimentou—se um outro grupo de ratos com uma dieta demelhante mas com a restrição moderada de fenilala nina e de tirosina compensada por um incremento correspondente na mistura de ácidos aminados nao essenciais. 0 segundo grupo de ratos ganhou peso à mesma velocidade do que os ratos alimentados com a mistura equivalente a caseína ou com alimen to para ratos Purina. No entanto, quando desafiados com glóbu los vermelhos de sangue de carneiro, estes ratos produziram mais anticorpos e células que formam placas contra os gmóbu— los vermelhos do sangue de carneiro do que os ratos alimentados com Purina ou com a mistura equivalente a caseína.

Foi deste modo criado um novo conceito, nomea damente o de que as alterações no perfil de ácidos aminados da dieta podem influenciar a resposta imunitária independente mente de qualquer efeito sistémico no estado de nutrição do hospedeiro. No entanto, é mais importante notar que as altera Çoes no perfil de ácidos aminados, isto é o tipo das proteínas, pode provavelmente intensificar a resposta imunitária hu moral para além do que tem sido tradicionalmente considerado como uma resposta normal.

Avaliou—se o efeito na resposta imunitária de diferentes tipos de proteínas em dietas nutritivamente adequa

das e semelhantes. Verificou—se que ratos alimentados com die tas constituídas por uma fórmula que continha 20% de um hidro lisado pancreático de proteína do soro do leite (LAD, Nestle) produziam mais células que formam placas perante glóbulos ver melhos de sangue de carneiro do que ratos alimentados com ali mento para ratos Purina que continha cerca de 22% de proteína de várias origens e com uma eficiência nutritiva semelhante.

efeito de intensificação imunitária do LAD foi máximo a uma ** .

concentração de 20%.

Uma dieta de 20 g, líquidos de proteína/100 g proporciona um bom método para avaliar o efeito do tipo de proteína no sistema imunitário. A este nível a maior parte da proteína fornece a necessidade mínima diária de todos os áci— a z ₊ 4. (11-13) dos ammados indispensáveis para o crescimento dos ratos e este facto ê importante porque a adequaçao dos ácidos amina «» z dos nao constitui a variavel que se pretende investigar·

Em estudos subsequentes comparou-se o efeito do concentrado de proteína do soro do leite (CPSL) da dieta com o de outras proteínas purificadas em dietas de fórmulas de valor nutritivo semelhante. Investigou-se o efeito de quan tidades graduais de proteína de CPSL, de caseína (C), de soja (S), de trigo (W) e de alimento para roedores Purina (diera de criaçao) na dieta sobre o grau de resposta imunitária de ratos C3H/HeN por meio da medida da resposta imunitária humo— ral específica a glóbulos vermelhos de sangue de carneiro (GVSC) e glóbulos vermelhos de sangue de cavalo (GVSCav). A eficiência nutritiva destas dietas era normal e semelhante. Verificou—se que a resposta imunitária dos ratos alimentados com a dieta de CPSL era quase cinco vezes superior à dos ratos alimentados com as dietas correspondentes C. A resposta imunitária humoral dos ratos alimentados com as dietas C, S e W era substancialmente mais reduzida do que dos ratos alimentados com a dieta de criaçao, enquanto que a dos ratos alimen tados com a dieta L (CPSL) era superior. O efeito imunitário descrito acima de todas as proteínas ensaiadas foi obtido com

uma concentração de 20 g/100 g sem outros incrementos com 3θ e 40 g/100 de proteína na dieta.

Uma vez que o concentrado de proteína do soro do leite foi ensaiado em comparaçao com um número limitado de proteínas, nao foi possível assegurar nesse momento se a in— tensificaÇao da resposta imunitária humoral observada em cinco (5) estirpes de ratos nao relacionadas entre si alimentados coin uma dieta de proteína do soro do leite era devida a ** z uma intensificação imunitária real em termos absolutos pela alimentaçao com proteina do soro do leite ou a uma imunodepre sao provocada pelas outras proteínas ensaiadas.

Na verdade, ê possível afirmar, em retrospec— tiva, que esta pequena variedade de proteínas alimentares purificadas (caseína, soja e trigo) utilizada para comparaçao com a mistura de proteína do soro do leite era imunossupresso ra quando comparada com todas as outras proteínas alimentares purificadas subsequentemente ensaiadas, embora adequadas sob o aspecto nutritivo e semelhantes a uma concentração a 20% na dieta.

De facto, subsequentemente ensaiou—se a proteína do soro do leite em comparaçao com a maioria das proteí nas alimentares disponíveis no comércio (caserna, soja, trigo, milho, clara de ovo, carne, peixe, gama globulina, beta—lacto globulina, alfa—lactalbumina, albumina do soro, proteína das algas Spirulina máxima ou Scenedesmus) e verificou—se que sem dúvida os ratos alimentados com o concentrado de proteína do soro do leite apresentavam a resposta imunitária mais elevada a antigenes estranhos (GVSC) (Figura l).

Estas proteínas sao semelhantes sob o aspecto nutritivo e sao adequadas numa concentração na dieta de 20 g/ 100 g (ver Quadro 1 e Quadro 2).

Concluiu—se que a actividade biológica de inten sificaçao imunitária descoberta por nós do concentrado de pro

teína do soro do leite nao está relacionada com a qualidade nutritiva já conhecida desta proteína, a qual ê principalmente baseada na digestibili da de e no conteúdo em ácidos amina— dos. De facto, as propriedades nutritivas do concentrado de proteína do soro do leite a uma concentração de 20 g em proteína por 100 g de alimento conforme se usou nas nossas experiências ê semelhante às de outras proteínas ensaiadas.

MATERIAIS D MÉTODOS

1h* lo Iφ

Uma origem adequada de concentrado de proteína do soro do leite ê constituída pelo material conhecido pela marca registada PROMOD, que ê um suplemento proteico forn eido em pó pelos Ross Laboratories, uma divisão de Abbot Lab ratories, E.U.A.. Este material constitui uma fonte de prore na de alta qualidade que ê útil para proporcionar um suplemen to proteico a pessoas que tenham necessidades de proteínas acrescidas ou para quem nao possa obter satisfaçao para as suas necessidades em proteínas na dieta normal. Este material contêm concentrado de proteína do soro do leite e lecitina de soja. Possui os seguintes nutrientes!

NUTRIENTES

POR 5 S DE PROTEÍNA (uma concha)

Proteína 5,0 S

Gordura	Nao	superior	a	o,	6o g
Hidratos de carbono	Nao	superior	a	0,	6? g
Ãgua	A/ Nao	superior	a	0,	60 g
Cálcio	Nao	superi o r	a	23	mg	(1,15	mEq )
Só dio	Nao	superior	a	13	mg	(0,57	mEq)
Potássio	Nao	superior	a	65	mg	(1, oó	mEq )
Ró sforo	Nao	superior	a	22	mg
Calorias		28

e composição típica em ácidos 100 g de proteína de PROMOD g de ácidos aminados.

Possui a seguint aminados por 100 g de proteína, dá origem a aproximadamente 105

COMPOSIÇÃO TÍPICA EM ÃCIDOS AMINADOS por 100 g de proteína

Ãcidos aminados essenciais:

Hi sti dina,

Isoleucina, Leucina ,

Li sina , Metionina, Fenilalanina, Treonina > Triptofano, Valina, ’· « o * <T «

O * rr « o ,

1,9 g>

6.2 g; 10,8

9.3

2,2

3,6 _s;

7.3 Si 1,9 si

6,0 g.

**

Aciaos aminados nao essenciais:

Alanina, 5,3 S»

Arginina, 2,6 gj

Ãcido aspártico,11,2 gi Cisteína, 2,6 gi

Ãcido glutâmico, 13,2 g;

Gli cina, Prolina, Serina, Tiro sina,

2,1 gi

6.5 g i

5.6 g; 3,½ S.

Dietas usadas nos nossos estudos:

As dietas foram preparadas do seguinte modo:

g de proteína pura seleccionada, 56 g de xarope de milho contendo proteína em pó para alimentaçao produto SOO56, óleo de milho, amido de tapioca, vitaminas e minerais (Mead—Johnson Co. Inc., E.U.A.), 13 g de amido de milho, 2 g de farelo de trigoj 0,05 S Ue pre—mix Nutramigen vit—iron (Bristol-Myers Ontário, Canadá), 2,65 g de KC1J 0,84 g de NaCl. Os componentes hidratos de carbono e lípidos das fórmulas das dietas eram os mesmos. A única variável nas várias dietad purificadas era o tipo de proteína (20 g de protá.na/100 g de dieta). A esta concentração na diet_a todas as diferentes proteínas ensaiadas

forneciam as necessidades diárias em ácidos aminados essenciais para os ratos em idade de crescimento As vitaminas e os minerais eram os mesmos em cada conjunto de experiên cias e eram adicionados nas quantidades necessárias para fornecer as necessidades diárias para os ratos em idade de crescimento ’ . 0 Quadro 1 indica a variaçao nas necessida des de vitaminas sugeridas para as dietas para os ratos e os respectivos conteúdos em algumas das nossas formulações. Por conseguinte todas as fórmulas das dietas foram calculadas a fim de fornecer uma nutrição adequada, como se demonstra pelo ganho de peso corporal normal, proteína do soro 9) θ p_ej__aausência de perda de pêlo, de dermatites, de cataratas, de ataxia, de fígado gordo, etc.. Estes últimos sintomas ocorriam evidentemente, em ratos muito velhos e estavam relacionados com o processo do envelhecimento.

Animai s

Obtiveram—se ratos C3H/HeJ machos de Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine) com 7 semanas de idade.

Imunização para análises de placa

Os ratos alimentados com dieta foram imunizados por uma injecção intravenosa de 5 ^x 10^ de glóbulos verme lhos de sangue de carneiro obtidos semanalmente do Institut Armand—Frappier, Lavai des Rapides, Quebec, Canada.

Análise de células que formam placa (Plaque forming cell =PFC) método usado para analisar as células que formam placas de IgM foi essencialmente o descrito por Cunnin gham e Szenberg (67) com certas modificações de pormenor. Pre pararam—se suspensões de células do baço fazendo passar suave mente o baço através de uma rede de aço inoxidável de 5θ ma— lhas e recolhendo as células numa solução salina equilibrada . (BSS) suplementada com 10% de soro de vitela inactivado pelo

calor (Grand Island Biological Company, Montreal, Quebec, Canada). As células de baço foram lavadas e o volume foi preenchido a 15 ml com BSS. Os glóbulos vermelhos de sangue de car neiro foram lavados duas vezes e a concentração foi ajustada a 20%. Diluiu—se soro de cobaia 1/15 com BSS (Grand Island Bio logical Company, Montreal, Quebec, Canada) para origem de com plemento. Todas as soluçoes maes foram conservadas em agua ge lada até serem usadas. 0 ensaio consistiu em misturar 0,05 ml de células de baço, 0,15 ml de glóbulos vermelhos de sangue de carneiro e 0,75 ml da solução de complemento num tubo de ensaio a 37°C. A mistura completa foi imediatamente retirada e colocada em câmaras de contagem sobre laminas de microscópio, selou-se com parafina quente e incubou-se a 37°C durante 4-5 a 60 minutos. Contou—se o numero de células que formam pia ca e estimou—se o seu número total por baço multiplicando o número de células que formam placa em cada amostra (0,05 ml de células de baço) por 3θθ· Cs valores estão expressos no total z ~ ~ 6 , por orgao e nao por 10 células de baço, uma vez que esre modo de exprimir parece reflectir de modo preciso o estado funcional do baço em si.

Para cada rato analisou-se a resposta sob a forma de células que formam placa aos glóbulos vermelhos de sangue de carneiro normalmente no quinto dia após a imunização quando se verificou que a resposta estava no seu máximo ou, no estudo cinético, nos dias 3j 4, 5 θ 6 após a imunizaÇ 3 O ·

Estatí sti ca

Compararam—se os valores médios de células que formam placas entre os grupos com diferentes dietas usando quer o teste de Student, quando dois grupos estavam sendo com parados, ou a análise de variância (ANDVA) para mais de dois grupos. Em virtude da heterogeneidade das variâncias entre os grupos, usou—se o ajustamento dado por Brown e Porsythe.

(42)

Anderson . Os valores foram expressos em umo 1 por g de te

Conteúdo de glutatiao do baço

Pesaram—se 90 mg de baço de rato usando uma balança Mettler PM-300 e as amostras apresentaram pesos afastados de 90 mg em menos do que 5 mg (5%)· Em seguida homogeneizaram-se as amostras em ácido 5—sulfossalicílico (5 % p/v). As amostras homogeneizadas foram centrifugadas durante 5 min. numa mi cro cent rí fuga a 10 000 x g. A análise foi efectuada usando os sobrenadantes no mesmo dia de acordo com os mêtosde

Γ eido húmido.

Experiências com sulfoximina de butionjna

Em algumas experiências, três semanas a seguir ao início da alimentaçao com proteína do soro do leite e um dia antes da imunização com glóbulos vermelhos de sangue de carneiro, injectaram—se nos ratos i.p. 450 mg/kg de sulfoximi na de butionina (SOB) (sulfoximina de S-/n-butil7-homocisteí— na), um inibidor específico da sintetase de ÇÃglutami lei st eí— na. Ao mesmo tempo adicionou—se SOB 20 mM à água dc beber.

Análise do glutatiao nos tecidos

Homogeneizaram—se 90 mg de coraçao ou fígado de rato em ácido 5—sulfossalicílico (5 % p/v). Os órgãos homo geneizados foram centrifugados durante 5 minutos numa microcentrífuga a 10 000 x g. A análise foi efectuada usando os sobrenadantes no mesmo dia, de acordo com o método de Anderson ( 42 ) . Os valores foram expressos em ^imol/g de tecido húmido (Figuras 6, 8 e 9)· ** _z

Em seguioa, a presente invenção e descrita em pormenor eom referência aos desenhos, nos quais:

A Fig. 1 e a Fig. 2 apresentam as células que formam placa por baço (PFC) no dia em que se verificou a produção xima de PFC a seguir à imunização com GVSC, má28

A Fig· 3 mostra o efeito de várias origens de concentrado de proteína do soro do leite e de caseína na resposta de PFC do baço,

A Fig. 4 mostra o efeito de inibição da desnaturaçao pelo calor na propriedade de intensificação imunitária do CPSL,

A Fig. 5 mostra a intensificação da resposta imunitária das células de baÇo a GVSC a seguir a imunização em ratos alimentados com Lacp—ND,

A Fig. 6 mostra os níveis de glutatiao no baço em ratos imuni zados expresso em % dos valores dos ratos nao imunizados alimentados com as dietas correspondentes,

A Fig. 7 mostra o efeito da administraçao de SOB a ratos alimentados com a dieta de proteína do soro do leite,

A Fig. 8 e a Fig. 9 mostram o conteúdo de glutatiao no fígado e o conteúdo de glutatiao no coraÇao após uma alimen taçao de longo termo com dieta,

A Fig. 10 mostra a curva de sobrevivência de ratos alimentados com dietas de purina, de caseína e de proteína do soro do leite,

A Fig. 11 mostra o efeito de 26 dias de tratamento com dieta sobre a resposta de PFC aos GVSC.

As Figs. 12 a 22 apresentam os quadros 1 a 10.

A Figura 1 apresenta o efeito sobre as células que formam placas por baço (PFC) no dia em que se verificou ocorrer a produção máxima de PFC a seguir à imunização com 10^ GVSC de 2 semanas de tratamento com dieta eom 20 g/100 g de dieta de lactalbumina (L), isto ê, concentrado de proteína do soro do leite, caseína (C), proteína de Spirulina máxima (Sp), proteína de soja (S), proteína de trigo (W), proteína de Scenedesmus (Sc), proteína de milho (CO), proteína de cla29

ra do ovo (E), proteína de carne (B), proteína de peixz (F), alimento para ratos purina (P) ou 20 g/100 g de dieta de uma mistura que contêm 50% de L e 50% de S (L/S) ou 80% de L e 20% de C ou 20% de L e 80% de C (L/C). Cada valor representa a mê dia i o DP.

Conforme indicado na Fig. 1, os ratos alimentados com a dieta de lactalbumina (CPSL) durante 2 semanas apresentaram uma resposta de células que formam placa aos gló bulos vermelhos de sangue de carneiro que ê superior à dos ra tos alimentados com qualquer outro tipo de proteína ou com alimento para ratos Purina. 0 número médio de células que for mam placa por baço 5 dias após a injecção i.v. de 5 ^χ 10 gló buios vermelhos de sangue de carneiro nos ratos alimentados com dieta de lactalbumina era de 487 %, 494 %, 736 %, 927 %, 309 %, 248 %, 23θ %, 2l4 % e 177 % do verificado nos ratos alimentados com caseína, Spirulina, proteína de soja, proteína de trigo, Scrnedesmus, proteína de milho, albumina do ovo e proteína de carne ou de peixe, respectivamente, e 168 % do dos ratos alimentados com Purina. Estas diferenças sao todas estatisticamente significativas (P = 0,0004). 0 número de células que formam placa por baço em ratos alimentados com Puri na era de 170 % do dos ratos alimentados com a dieta de proteína de milho (P = 0,0005) e o valor do último grupo era de 171 % do verificado nos ratos alimentados com caseína (P = 0,0005). Nao se observaram diferenças significativas entre os grupos alimentados com dieta à base de proteína de peixe, com dieta à base de proteína de carne e com Purina.

A adiçao de lactalbumina (CPSL) a proteína de soja ou a caseína teve como resultado um aumento significativo na resposta imunitária humoral do hospedeiro. Numa mistura a 50:50 com proteína de soja, a lactalbumina induziu um aumen to de 4 vezes na resposta imunitária em comparaçao com uma dieta unicamente de proteína de soja. Numa mistura a 80:20 com caseína, a lactalbumina induziu um aumento de 3 vezes e numa . mistura a 20:80 com esta proteína verificou-se um aumento de

vezes na resposta imunitária em comparaçao com uma dieta unicamente de caseína.

Em conclusão, os ratos alimentados com uma dii ta de lactalbumina durante pelo menos 2 semanas apresentaram uma intensificação estável da resposta imunitária humoral a glóbulos vermelhos de sangue de carneiro em comparaçao com ra tos alimentados principalmente com proteínas animais ou vegetais comestíveis disponíveis comercialmente em dietas à base de fórmulas de valor nutritivo comparável. Este efeito-persis tiu enquanto se continuou o tratamento com a dieta (ensaiou— se até um período máximo de 2 meses). Tornou—se claro que, apesar das grandes diferenças na resposta imunitária aos GVSC nao se verificaram diferenças no consumo de alimento, no peso final e nas proteínas do soro entre os ratos alimentados com as várias proteínas purificadas a 20 g/100 de concentração na dieta (ver Quadro 2).

A Figura 2 apresenta o efeito sobre as células que formam placa/b2ço (PFC) no dia em que se verificou o máximo de produção de PFC a seguir à imunizaÇao com 10 GVSC de 3 semanas de tratamento na dieta-com 20 g/100 g de dieta de concentrado de proteína do soro do leite (CPSL), caseína (C), hidrolisado de concentrado de proteína do soro do leite, hidrolisado de caseína, beta-lactoglobulina ($L), alfa—lactai bumina (ÁL), gama-globulina CfG) ou albumina de soro de bovino (SA). Cada valor representa a média A o DP. Quando se admi nistrou hidrolisado de proteína, verificou—se que a resposta de células que formam placa em ratos alimentados com dieta de proteína de soro do leite era superior em 504 % à verificada com os ratos alimentados com dieta de caseína (p*= 0,0004) (Fig. 2). Quando se administrou uma mistura de ácidos aminados livres, verificou-se que a resposta de células que formam placa em ratos alimentados com a dieta de ácidos aminados de proteína do soro do leite era 332 % da dos alimentados com a dieta de ácidos aminados de caseína (p = 0,0001) (Fig. 2). Os nossos resultados (Fig. 2) indicam que os animais alimentados

com dietas que contêm 20 G/100 g de dieta de qualquer dos qua tro componentes principais da proteína do soro do leite q/L, (h e SA) desenvolveram uma resposta de células que formam placa aos glóbulos vermelhos de sangue de carneiro inferior (p = 0,0002) à dos ratos alimentados com uma dieta que continha 20 g de proteína do soro do leite/100 g de dieta.

Factores responsáveis pelo efeito de intensificação imunitária do concentrado de proteína do soro do leite na dieta

a) Mistura de proteínas do soro do leite

Os presentes estudos mostram que o efeito de intensificaçao imunitária do CPSL em comparaçao com C se mantém quando estas duas proteínas sao substituídas nas fórmulas das dietas por hidrolisado pancreático (20 % de amina livre e 80 % de oligopeptídeos com um P.M. inferior a 1000) (Fig. 2). Estes resultados indicam também que as dietas dadas aos ratos que continham qualquer dos quatro componentes proteicos mais importantes da mistura de CPSL desenvolveram uma resposta de PFC aos GVSC inferior à dos ratos alimentados com a correspon dente mistura de proteína do soro do leite. Ê possível concluir que o efeito de intensificação imunitária do CPSL ê dependente da contribuição de todos os seus componentes proteicos. Por estas razoes pode—se assumir que este fenómeno nao está relacionado com a alergia a proteína do leite ou a qualquer outra manifestaçao de imunização oral.

b) Conformação nao desnaturada do concentrado de proteína de soro do leite

Observações recentes revelaram-nos que a acti vidade biológica descrita do concentrado de proteína do soro do leite, que já se mostrou nao estar relacionada com as suas qualidades nutritivas, depende na verdade da conformaÇao nao desnaturada das proteínas. Esta descoberta foi feita acidentalmente quando um lote de concentrado de proteína do soro do leite que nos foi enviado pelo fornecedor habitual nao apre—

sentou o efeito de intensificação imunitária anteriormente descrito, mas apresentava o mesmo valor nutritivo. Por análise verificou—se que este preparado era menos solúvel e que apresentava todos os sinais característicos de desnaturaçao (Lacp—D), muito diferentes sem dúvida das amostras anteriores de proteína do soro do leite nao desnaturada (Lacp—ND) que apresentava uma forte actividade biológica. Os dados da Figu— ra 3 indicam a relaÇao entre o grau de desnaturaçao do concen trado de proteína do soro do leite e a resposta imunitária de PFC do hospedeiro. 0 Quadro 3j relacionado com estes resultados, indica ainda a ausência de correlação entre o valor nutritivo e a desnaturaçao da proteína. No estado natural, as proteínas do soro do leite possuem uma conformação definida que, quando exposta ao calor acima de um certo nível crítico, é destruída. Ao contrário das caseínas, as proteínas do soro do leite sao rapidamente desnaturadas pelo calor. A desnatura çao das proteínas do soro do leite causa um desdobramento da sua estrutura globular dando origem a uma conformação em espi ral aleatória. Para além do calor, outros tratamentos de processamento, por exemplo a bombagem, a mistura, o arejamento, a evaporaçao sob vácuo e a secagem também provocam a desnaturaçao da proteína.

Nos presentes estudos, a desnaturaçao do concentrado de proteína do soro do leite foi avaliada pelos seguintes métodos: Medições de solubilidade: Após dispersão de uma solução a 3% de proteína em égua destilada à temperatura ambiente e, em alguns casos, ajuste do pH, a solução foi agitada e em seguida centrifugada durante 20 minutos a 40 000 x g. 0 conteúdo proteico do sobrenadante foi determinado pelo método de Lowry. A solubilidade em percentagem foi calculada pela porção da proteina total recuperada na fracçao do sobrenadante. Transmitância da luz: A solução de proteína a 3% ini ciai foi diluida até 0,15 % em H^0 destilada· Mediu—se a trans mitância da luz de um branco (H0 destilada) e da amostra a 75θ nm com um espectrofotómetro imediatamente após a mistura.

Torna—se evidente a partir da Figura 3 que existe uma relaÇao positiva entre o estado nao desnaturado do concentrado de proteína do soro do leite na dieta e a intensi dade da resposta imunitária humoral aos GVSC.

nível da resposta imunitária nao está relacionado com o valor nutritivo do concentrado de proteína do soro do leite mas sim com a sua conformação nao desnaturada. Por conseguinte, confirma—se a independeência da actividade biologica (intensificação imunitária) em relaÇao ao aspecto nutritivo do concentrado de proteína do soro do leite verificada nas nossas experiências anteriores de curto termo (Figuras 1 e 2, Quadro 2). Obteve-se ainda uma confirmaÇao adicio— ** nal do efeito de inibição da desnaturaÇao pelo calor sobre as propriedades de intensificação imunitária do concentrado de proteína do soro do leite por meio do aquecimento de um concentrado de proteína do soro do leite parcialmente desnaturado (Promod). Este procedimento provocou uma redução acentuada nas propriedades de intensificação imunitária da dieta sem al teraçao no seu valor nutritivo (Figura 4).

Um tratamento pelo calor preliminar da solução de proteína do soro do leite concentrada nao melhora a sua digestibilidade geralj por conseguinte o centrado de proteína do soro do leite usado na preparaçao do hidrolisado pancreáti co LAD nao foi desnaturado. A ausência de cisteina na fracçao de ácidos aminados livres do LAD (Quadro 4) está de acordo com o facto de se saber que a tripsina pancreática nao hidrolisa as ligações cruzadas de dissulfureto caracterídticas da proteína do soro do leite nativa, as quais sao, peio contrário, cindidas no processo de desnaturaÇao.

PROTEÍNA DO SORO DO LEITE NA DIETA E INFECÇOES POR PNEUMOCOCOS

Uma vez que os nossos estudos tinham mostrado que o tipo de proteína da dieta influencia a resposta imunitária humoral, nós procedemos em seguida a uma investigação sobre o efeito da Lacp—ND na dieta sobre a resistência de ratos a infecções por pneumococos. Os Pneumococos representam o grupo de organismos encapsulados de elevada virulência contra os quais o corpo utiliza uma resposta imunitária humoral. Verificou-se uma melhoria da sobrevivência de ratos C3H/HeJ ali mentados com uma dieta que continha 20 g de Lacp—ND/100 g de dieta apos injecção i.v. com Streptococcus pneumoniae tipo 3 em comparaçao com ratos infectados do mesmo modo alimentados com uma dieta de 20 g de C/100 g de dieta de valor nutritivo semelhante (Quadro 5)·

Com base nos nossos vários estudos, mostrou-se que a resistência melhorada dos ratos alimentados com proteína do soro do leite a infecções com Streptococcus pneumoniae tipo 3 era independente do peso do animal no momento da infe— cçao e do ganho de peso antes da infecção (os animais foram alimentados com a dieta durante 2 semanas antes da infecção).

Mecanismo responsável pelo efeito de intensificação imunitária do concentrado de proteína do soro do 1eite na dieta

Durante os últimos anos fizemos tentativas pa ra identificar as alterações induzidas pelo tipo de proteína da dieta que poderia afectar directa ou indirectamènte o grau de resposta imunitária humoral. A uma concentraÇao de 20 g/100 g de dieta, as proteínas proporcionam um fornecimento diário adequado de ácidos aminados essenciais para os ratos em idade de crescimento. Verificou—se que o único efeito significativo do tipo de proteína era uma alteraçao no perfil de ácidos ami nados no plasma, o qual se conformava essencialmente à composição de ácidos aminados da proteína ingerida, com a excepção notável da cisteína (Quadros 6 e 7).

Verificou—se surpreendentemente que, apesar de um conteúdo 8 vezes superior de cisteína no CPSL, o nível de cisteína no plasma em ratos alimentados com uma dieta de CPSL

’bad original $

base de C. 0 destino da cisteina em excesso revestia—se de grande interesse. A cisteina na dieta constitui um substracto limitante da velocidade para a síntese do glutatiao (GHS), o qual e necessário para a proliferação de linfócitos. 0 GHS en contra—se na dependência do fornecimento de cisteina, a qual deriva da proteína da dieta. 0 estado de redox dos linfócitos pode modular a concentração intracelular da GMP cíclica,a qual se sabe estar intimamente envolvida na proliferação dos linió cito s.

Os presentes estudos mostraram que a intensificação observada na resposta imunitária se encontra associada com a maior produção de glutatiao esplenico em ratos imuni zados alimentados com proteína do soro do leite em comparaçao com ratos alimentados com uma dieta de caseína ou de caseína enriquecida com cisteina. A eficácia da cisteina da dieta para a indução de níveis de glutatiao s periores ao normal é maior quando é fornecida na proteína do soro do leite do que sob a forma de cisteina livre (Fig. 6).

Método para o aumento do glutatiao nos tecidos

À interacção entre a proteína na dieta, o GSH e a resposta imunitária do hospedeiro foi explorada mais em pormenor. Investigou—se se uma origem diferente da proteína, como a clara do ovo, com um nível tao elevado de cisteina como o concentrado de proteína do soro do leite (Quadro 8), pos sui um efeito semelhante na promoção de um conteúdo mais elevado do GSH nos tecidos. Verificou—se que uma dieta de proteí na de clara de ovo nao intensifica a resposta imunitária do hospedeiro acima da média (Fig. l). Enquanto que se verificou que o nível estático de GSH no baço nao se alterava com uma alimentaçao por Lacp—ND durante três semanas, os presentes es tudos sobre ratos C3H adultos jovens mostraram que a intensificação da resposta imunitária das células do baço aos GVSC (Fig. 5) se encontra associada com uma elevaçao estável do GSH do baço durante a expansao cional dos linfócitos provoca—

da pelo antigene em ratos alimentados com Lacp-ND (proteína ** Μ M do soro do leite nao desnaturada) em comparaÇao com um padrao de declínio observado nos níveis de GSH do baço em ratos alimentados tanto com Lacp-D (proteína do soro do leite desnaturada) de valor nutritivo equivalente como com dietas de casei na, caseína enriquecida em cisteína ou proteína da clara do ovo (Fig. ó), Os últimos quatro grupos também apresentaram uma resposta imunitária mais reduzida (Fig. 5)· A administraçao de sulfoximina de S-(n—buti1)-homocisteína, que reduz o nível de glutatiao do baço a metade, produz uma baixa acentuada da resposta imunitária humoral dos ratos alimentados com proteína do soro do leite (Lacp—ND). Este facto constitui uma evidencia adicional da função importante do glutatiao no efeito de intensificação imunitária da proteína do soro do leite da dieta (Fig. 7).

Após três meses de qualquer das dietas inicia das com a idade de 17 meses, verificou-se que o conteúdo de GSH era superior no fígado e no coraçao de ratos alimentados com Lacp-ND (proteína do soro do leite nao desnaturada) em com paraçao com os grupos alimentados com dietas de Lacp—D (proteína do soro do leite desnaturada), caseína, proteína da cia ra de ovo ou Purina (Figuras 8 e 9)· Os valores de GSH no co— raçao e no fígado de ratos alimentados com alimento de labora tório Purina era semelhante na idade de 10 semanas e de 17, e 21 meses. Parece que a dieta com Lacp-ND intensifica o conteúdo de GSH do coraçao e do fígado acima dos valores nor mais após 3 a 4 meses de alimentaçao contínua (Figuras 8 e 9 λ

Em conclusão, após três semanas de dieta de Lacp-ND, o conteúdo de GSH do baço aumenta durante a expansao clonal dos linfócitos provocada por antigenes em ratos C3H/HeN adultos jovens em comparaÇao com uma redução nos grupos de com paraçao alimentados com dietas de Lacp—D, caseína ou proteína de ciara de ovo (Figura 6). Em ratos C57BL/6N1A idosos, uma alimentaçao de longo termo com dieta de Lacp-ND tem como resultado um aumento moderado mas estável dos níveis de GSH no

fígado e no coraçao (Figuras 8 e 9)· A actividade de elevaçao do GSH do CPSL restringe—se a sua forma nao desnaturada (Lacp—ND). Esta propriedade Nao é*devida apenas ao alto conteúdo em cisteína do CPSL uma vez que outras origens de proteína com um conteúdo em cisteína semelhante (clara de ovo) nao apresen taram esta actividade biológica. Esta propriedade da Lacp—ND nao depende especificamente do seu valor nutritivo conforme se pode avaliar pelo peso corporal, pelas proteínas do soro e pe lo consumo de alimento mas parece depender da estrutura prima ria, secundária e terciária da proteína na sua forma nativa.

Os dados das Figuras 8 e 9 mostram que a concentração do glutatiao no fígado e no coraçao em ratos alimen tados com Purina para comparaçao mantém—se consideravelmente constante no tempo. Por outro lado, notou—se uma elevaÇao moderada mas estável do GSH nos tecidos em ratos alimentados com uma dieta de proteína do soro do leite (Lacp—ND) de valor nutritivo equivalente.

Dado o facto de que o GSH celular se encontra estritamente regulado, de que um aumento para o dobro pode ser o máximo e de que o efeito de pequenos aumentos no GSH pode ser amplificado por várias enzimas que utilizam o GSH (por exemplo a glutatiao—peroxidade de e a glutatiao—S-transfera— se), a alteraçao reproductível na concentração de GSH observa da em animais alimentados com a dieta rica em soro do leite tem provavelmente uma considerável importância biológica. A natureza crónica deste aumento pode contribuir significativamente para este efeito.

Um método para a inibição do crescimento do cancro do colon induzido quimicamente λ luz das presentes descobertas sobre o carác ter lábil das propriedades biológicas do concentrado de pro— tema do soro do leite, pode-se conceber que a fracçao protei ca do soro do leite da mistura de proteínas do leite usada nas

últimas experiencias (57) foi parcialínente ou totalmente desnaturada. Apesar das variações no tipo de tumor e nas dietas

A* de comparaçao usadas em todos os estudos mencionados na técni ca anterior, torna—se evidente que o nível da inibição dos tu mores, descrito com uma alimentaçao de produtos lácteos ê com parável à que nos obtivemos com uma dieta baseada numa fórmula que continha caseína como fonte de proteína.

As presentes descobertas mostram que em ratos alimentados com uma dieta de caseína o número e a dimensão de carcinomas do colon induzidos por DMH foram reduzidos num fa— ctor de 0,3 e 0,4 respectivamente em comparaçao com grupos ali mentados com Purina (Quadro 9)· No entanto, em ratos alimenta dos com a dieta de proteína do soro do leite com um valor nutritivo semelhante o número e a dimensão de carcinomas do cólon induzidos por DMH foi reduzido de quatro vezes em compara Çao com grupos alimentados com Purina (Quadro 9)· A superiori dade do efeito anti—cancro da proteína do soro do leite em com ** _z paraçao com a caseína foi descrita no nosso estudo anterior. Torna—se evidente a partir dos estudos descritos acima que a actividade anti—tumor dos produtos lácteos se encontra na fra cçao proteica e mais especificamente, conforme a presente in— vençao demonstra, no componente proteico do soro do leite.

A quantidade de concentrado de proteína do so ro do leite dada oralmente aos nossos ratos pode ser estimada em 0,8 g de proteína por dia, por conseguinte cerca de 20 000 vezes mais proteína do que a injectada em GB—A—1495940.

Este facto torna a técnica anterior nao compa rável com a reivindicação presente em que se verificou que uma mistura proteica específica (concentrado de proteína do soro do leite) exerce o seu efeito anti-cancro após a alimentaçao orai de longo termo, digestão e absorçao por uma via fisiológica que essencialmente exclui, particularmente nos ratos adul tos, a absorçao de material antigênico. Para além disso, outras proteínas estranhas, tais como a caseína ou as várias pro

teínas que estão contidas na Purina, nao apresentam um efeito anti—cancro quando dadas oralmente em quantidades semelhantes.

Os presentes estudos mostraram de forma consistente que a actividade anti—cancro do concentrado de proteína do soro do leite da dieta, na sua forma nao desnaturada, está directamente correlacionada com a análise de PFC utiliza da nas nossas experiências. Esta actividade de intensificação imunitária do CPSL resulta da contribuição de todos os seus componentes proteicos. Nos presentes estudos, ratos alimentados com as fracções de CPSL (peso mol. 6000 a 20 000) que se verificou em GB—A—1^95940 exercerem um efeito anti—leucemia por injecção i. p. (zX— lactalbumina e fi— lactoglobulina ) desenvolveram uma resposta de PFC aos GVSC significativamente infe rior do que a dos ratos alimentados com o concentrado de proteína do soro do leite integral (Fig. 2). Por conseguinte, na medida em que o efeito anti—cancro do CPSL se encontra corre— laciona com a actividade de intensificação imunitária do CPSL, a nossa reivindicaçao nao está relacionada com o fenómeno des crito em GB—A—1495940.

Finaimenro, nao apenas a concentração mas, em virtude das vias de administraçao diferentes, o tipo e o destino metabólico dos produtos intermediários biologicamente activos difere nos dois estudos.

ESTUDOS DE SOBREVIVÊNCIA: A ACTIVIDADE BjOLÕGICA DEPENDE DA

CONFORMAÇÃO NAO DESNATURADA DO CPSL (a) Sobrevivência de ratos idosos durante um período de tempo limitado

Os nossos estudos mostram que o tempo de sobrevivência médio, durante um período de observaÇno limitado de 6 a 7 meses que terminou quando tinham morrido 55% dos ratos C57BL/6N1A machos, aumentou em cerca de 30 % ratos em que se iniciou uma dieta de proteína de soro do leite nao desnatu

rada (Lacp—ND) no princípio da velhice (com a idade de 21 meses) em comparaçao com grupos de comparaçao alimentados com o alimento para ratos Purina de valor nutritivo equivalente. A curva de sobrevivência dos ratos alimentados com Purina era muito semelhante à dos ratos alimentados com a dieta de casei na (Figura 10). Νσ entanto, nos quatro meses subsequentes, al terou—se a dieta dos ratos alimentados com proteína do soro do leite nao desnaturada para uma dieta de concentrado de pro teína do soro do leite desnaturada (Lacp—D). Durante este período, o tempo de morte dos restantes ratos alimentados com uma dieta de proteína do soro do leite tornou-se semelhante ao dos grupos correspondentes alimentados com a dieta de caseína. Durante os estudos as bioanálises repetidas da formaçao de PFC confirmaram a correlação entre a intensificaçao imu nitária dos hospedeiro e o estado nao desnaturado do CPSL na dieta conforme indicado na Figura 3· Na segunda parte do estu do, quando a diferença entre as curvas de sobrevivência come— ** z ça a ser menor, a propriedade de intensificação imunitária do CPSL estava ausente se bem que a sua qualidade nutritiva se conservasse (Lacp—D). Ao longo de todo o estudo nao se verifi cou qualquer diferença intergrupos significativa na absorçao caióríca e no peso corporal. Uma vez que a longevidade depende em primeiro lugar do genoma do indivíduo é pouco provável que a mortalidade retardada durante um período de tempo limitado tivesse influenciado a longevidade geral. No entanto, pe lo menos em termos do efeito de intensificação imunitária da dieta, este estudo pode ser encarado como um desvio uni direc— cional do grupo da dieta em análise (Lacp-ND) para o de compa raçao (Lacp—D), que mostra que a actividade biológica do CPSL sobre a sobrevivência dos ratos idosos depende do seu estado desnaturado e que se correlaciona directamente com a análise de PFC usada no nosso estudo (conforme ilustrado na Figura 3)· (b) Sobrevivência de curto e longo termo de ratos com cancro do cólon induzido por DMH:

Notámos em ratos tratados com DMH uma diferen

ça entre a mortalidade no ponto final de 28 semanas e o tempo de sobrevivência no final da experiência em relaçao com o tipo de proteína da dieta. Durante os sete primeiros meses do estudo, nos ratos alimentados com proteína do soro do leite nao desnaturado (Lacp—ND) nao ocorreram mortes, enquanto que se observou uma mortalidade de 33 % para o fim deste período nos grupos da dieta de caseína e de Purina. Nos quatro meses subsequentes os ratos da dieta de proteína do soro do leite foram alimentados com proteína de soro do leite desnaturada (Lacp—D). Durante este último período verificou-se que a dieta de Lacp—D nao tinha qualquer efeito favorável sobre a sobrevivência em comparaçao com a dieta de caseína (Quadro 10). Durante o estudo foram realizadas bioanálises repetidas de PFC do baço a fim de documentar os efeitos fisiológicos das dietas sobre a função imunitária, conforme descrito anteriormen— te, e a estabilidade destes efeitos. 0 efeito de intensificação imunitária da dieta de Lacp—ND foi confirmado de forma con sistente para os 7 primeiros meses do estudo; no entanto, nos quatro meses seguintes (Lacp-D), nao se verificou o efeito de intensificação imunitária anteriormente observado em ratos ali mentados com a dieta de Lacp-D. Os valores da resposta de PFC em relaçao quer com a dieta de Lacp—ND quer com a dieta de Lacp-D eram consistentes com os apresentados na Figura 3· Este estudo confirma por conseguinte a hipótese de que a activi dade biológica do CPSL sobre a sobrevivência de ratos com tumores depende do estado desnaturado deste concentrado em cor— relaçao directa com a analise de PFC usada no nosso estudo.

Função sinergístjca das Vitaminas e no efeito de intensificação imunitária do concentrado de proteína do soro do leite

Enquanto que a proteína do soro do ieite repre senta uma fonte óptima de cisteína, ou seja do substrato limi

Xante da velocidade da biossíntese do GSH, as vitaminas B₂ e

B^ sao elementos importantes na função do ciclo redox de GSH.

estado do glutatiao (GSH) nos tecidos ê man tido principaimente na forma reduzida (GSHíGSSG = 25θ), a qual é atingida pelo sistema eficiente de peroxidase e de redutase de GHS acoplado ao par redox NADP+/NADPH. 0 H^O^ tóxico é reduzido a H^O através da oxidaçao de GSH a GSSG catalisada pela peroxidase de GSH. 0 GSSG ê reduzido eficazmente novamente a GSH à custa de NADPH celular pela redutase de NADPH:GSSG, man tende deste modo o balanço de tiol. Como resultado, a reduta— se de GSSG tem uma grande capacidade de protecção das células contra a toxicidade do oxigénio de espécies oxidantes endógenas.

acçao lateral de origem a NADPH e

À vitamina B^ (tiamina) est transquetolase do fosfato pento se.

r a

de envolvida na pentose que r e— dá

A vitamina (riboflavina) ·' Os derivados de coenzima da riboflavina, mononucleótido de flavina (FMN) e di nucleótido de flavina e adenina (FAD), sao sintetizados sequen cialmente a partir da riboflavina. Os animais com deficiência em vitamina B_q apresentam uma diminuição acentuada nas act.ivi dades das enzimas que necessitam de FMN e de FAD, tais como a redutase de GSH.

Neste sentido, é de supor que todas estas vitaminas hidro—solúveis presentes naturalmente no soro do leite desempenham um papel essencial para a função óptima do ciclo redox do GSH especialmente quando a ingestão de proteína do soro do leite, como se demonstra nas nossas experiências, produziu um nível mais elevado da síntese de GSH e da sua armazenagem nos tecidos.

Os presentes estudos (Fig. 11) mostram que os níveis das vitaminas e B^ na dieta ligeiramente acima da margem recomendada (Quadro tía, dietas 5 θ 6) contribuem signi ficativamente para o efeito de intensificação imunitária do concentrado de proteína do soro do leite. A proteína do soro do leite, ao proporcionar uma biodisponibilidade óptima do

substrato limitante (cisteina) intensifica a síntese e o arma zenamento do GSH. Por outro lado, a ingestão a níveis superio res aos normais das vitaminas B^ e B^ ê necessária a fim ds manter o ciclo de redox do GSH a um nível mais elevado do que o normal, permitindo deste modo o desenvolvimento de uma resposta imunitária aos GVSC melhor do que o normal. Individualmente, o efeito de cada uma das vitaminas nos ratos alimentados com proteína do soro do leite é limitadoi no entanto, o seu estado sinergístico sobre a resposta imunitária dos ratos alimentados com proteína do soro do leite é evidente (Fig. 11 dietas 5 e 6 dieta l). As mesmas vitaminas nao sao eficazes sobre a resposta imunitária de ratos alimentados com dieta de caseína. Se bem que todas estas vitaminas hidro-solúveis este jam presentes no soro do leite, ê interessante notar que a fon te natural principal da vitamina que isoladamente e mais acti va, a riboflavina, e o soro do leite, ao qual a vitamina B^ dá a sua cor caractarística.

Em conclusão, a ingestão na dieta de vitamina B e especialmente de vitamina B acima da margem recomendada contrubui para o desenvolvimento duma resposta imunitária melhorada nos animais alimentados com proteína do soro do leite: parece que as vitaminas B₃ + B^ produzem o efeito mais forte. Quando a ingestão destas vitaminas está a estes níveis ou li— geiramente abaixo, o crescimento corporal e a aparência do animal sao normais, mas a resposta a um desafio imunitário es tá abaixo do potencial máximo dos ratos alimentados com proteína oo soro do leite. A composição da proteína do soro do leite de acordo com a presente invenção compreende em combina çao o referido CPSL em conjunto cotn as vitaminas e B_p em quantidades de 1,5 a 2,0 mg de B^ e 1,5 a 2,0 mg de B^.

No estômago o soro do leite c separado do lei te pela acçao do suco gástrico. Pode-se admitir que o transito e a absorçao das vitaminas hi dro—so lúvei s e das proteínas do soro do leite ocorram mais rapidamente do que dos constituintes proteicos (caseína) e vitamínicos do coágulo do leite

(coalhada). Por conseguinte a proteina e as vitaminas do soro do leite incluindo as vitaminas B, e B„ podem entrar na circ laçao sistémica a uma velocidade tituintes do leite e expressar o bre o sistema imunitário e sobre

I tn I p diferente da dos outros con seu efeito sinergístico soo cicio redox do GSH.

A intensificação imunitária e as outras propriedades biológicas específicas da proteína do soro do leite da dieta descritas no presente pedido de patente sao lábeis perante o aquecimento e dependem do estado nao desnaturado (nativo) da proteína (o qual pode também ser afectado por agi taçao vigorosa, por solventes, por alterações extremas de pH, etc.) e sao independentes do seu valor nutritivo, o qual nao ê alterado pelos processos de desnaturaçao.

Ao contrário da maior parte das proteínas do soro do leixe comerciaimente disponíveis, que sao desnaturadas, a. proteína do soro do leite usada nas nossas experiências produziria na Dinamarca (Lac-rodan - 80) é 90 % nao desnaturada (U.D. na Fig· 11). Esta proteína apresenta uma enorme tendência para se desnaturar pela acçao do calor expondo deste modo o seu grupo sulfidriio livre. Quando se fizeram experiên cias usando um lote de c. p. s. 1. recebido após um longo transporte por superfície a partir da Dinamarca até aos E. U. com um tempo excepcionalmente quente e húmido (Verão de 1988), as propriedades de intensificação imunitária do c.p.s.1. tinham— -se perdido (Fig. il, 2d-8d). Estas experiências, que indicam o papel sinergístico das vitaminas e sobre o efeito de intensificação imunitária da dieta, mostram também o efeito negativo de uma proteína do soro do leite presumivelmente des naturada em parte. Estudos anteriores tinham mostrado que as propriedades de intensificação imunitária da proreína do soro do leite se encontra provavelmente relacionada com um transporte e com uma disponibilidade da cisteina, que é um precursor limitante para a síntese do glutatiao. Ê possível conceber que a desnaturaçao parcial desta proteína tenha provocado a perda das suas propriedades biológicas específicas alterando

- 45 a cisteina e a síntese do GSH, sem qualquer eíeito sobre as suas qualidades nutritivas.

Processamento do leite e preparaçao do soro do leite

Imediatamente após a ordenha, o leite é arrefecido a 4°C e conservado num tanque arrefecido para entrega à fabrica do queijo. A precipitação da coalhada é obtida por redução do hospedeiro até cerca de 4,6 com ácido láctico inio * ~ cialmente a 20 C. A seguir a adiçao de coalho (normalmente tres onças por 1000 libras de leite /”188 ml/t_/)> eleva—se a temperatura até cerca de 3θ°^ durante 20 minutos a fim de pro vocar a expulsão do soro da coalhada, deixando em seguida em agitaçao lenta no reservatório para desagregar a massa.

Quando foi obtida de soro, o produto que ficou no re do modo habitual a fim de se obter e ê agitado a alta velocidade para ro é então irradiado com uma fonte de radiaçao variará de 5 a lb kGy cteriano do soro, a fim de atingir equivalente a pasteurizaÇao norma raçao das proteínas (medida peias iúveis, isto é, pela concentração pois do tratamento).

uma quantidade suficiente servatório é pasteurizado uma redução das bactérias a produção de queijo. 0 so de radiaçao gama. A dose de acordo com o conteúdo ba um efeito antibacteriano 1 com um mínimo de desnatu— alterações nas proteínas so proteica no soro antes e de

A diferença entre o nosso método e o método normal reside em que a fracçao do soro do leite a ser usada para a subsequente produção do concentrado de proteína do soro do leite nao ê aquecida e o material de que deriva é apenas agitado lentamente a fim de minimizar a desnaturaçao da proteina. A prevenção da desnaturaçao mantendo uma alta solubilidade evita a coprecipitaçao das proteínas do soro do leite com as caseínas, aumentando deste modo o conteúdo proteico do soro do leite. 0 soro do leite ê em seguida arrefecido a 6°C

/

Concentraçao e isolamento da proteína do soro do leite

Para a produção de concentrado de proteína do soro do leite, o soro do leite é separado e concentrado por meio de ultrafiltraçao, o que permite a separaçao selectiva entre a proteína e a lactose, os sais e a água em condiçoes suaves nas quais uma solução pressurizada é feita passar sobre uma membrana porosa. A membrana permite a passagem apenas de moléculas relativamente pequenas.

A fim de evitar um crescimento microbiano excessivo durante o período de residência e a desnaturaÇao da proteína, a instalaçao é operada abaixo de 10°C durante a maior parte do tempo. Usa—se uma fina membrana de material polimêri— co (polissulfona) com um valor de limiar de separaçao de apro ximadamente 10 000, de tal modo que os componentes proteicos com um P.M. de 15 000 ficam retidos. À fim de acelerar a fil— traçao, o líquido é alimentado sobre a membrana a uma pressão de 5 bar (lcg/cm2).

(Jm modo do tipo quadro ê construído a fim de conter um grande número destas membranas. A linha de produção consiste de 1° destes mod los. Nos últimos 10 módulos adiciona-se água desmineralizada que se elimina em seguida através das membranas arrastando a lactose e os minerais. A fim de man ter velocidades adequadas para minimizar a polaridade de concentração e o entupimento usam—se bombas de recirculaçao em cada fase.

Ê possível deste modo obter um concentrado pro teico finai com 80% de proteína (nao desnaturada) expresso em matéria seca.

Relevância dos dados experimentais sobre o concentrado de proteína do soro do leite para os seres humanos

A actividade de intensificação imunitária do concentrado de proteína do soro do leite foi descrita em cin47 -

cinco estirpes de ratos machos nao relacionadas.

efeito anti-cancro do concentrado de proteí na do soro do leite (c.p.s.l. ) foi verificado numa estirpe di ferente de ratos fêmeas.

Birt et al. (3» 4) mostraram um aumento de lon gevidade em hamsters de ambos os sexos alimentados com c.p.s.l.

A actividade biológica do c.p.s.l. parece então ser independente de influências específicas ou humorais. Para além disso ê geraimente aceite que se um fenómeno biológico deste tioo ocorre em duas espécies diferentes, será possível aplicá—lo a outras espécies incluindo o homem.

tipo de cancro do cólon contra o qual o c. p. s. 1. mostrou ser eficaz ê semelhante ao cancro do cólon humano em aparência histológica e na sua resposta à quimioterapia.

Os recém-nascidos prematuros humanos, ao contrário das crianças de termo, necessitam de fórmulas predominantemente de soro do leite a fim de evitar a acidose metabólica e sobreviverem.

Talvez seja ainda mais importante notar que o leite humano possui de longe a maior proporção de proteína do soro/caseína em comparaçao com qualquer outro mamífero. Prova velmente a natureza preparou os seres humanos através da única forma obrigatória de nutrição para processarem as proteínas do soro do leite nao desnaturadas para tirarem uma vantagem metabólica. De facto ê possível prever que a actividade biológica—favorável do c.p.s.l. observada em roedores possa ser mais pronunciada no hospedeiro humano.

Claims

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REIVINDI CAÇOES

Processo para a preparaçao de uma composição de um concentrado de proteína de soro do leite biologicamente activa que compreende uma concentração adequada de concentrado de proteína de soro do leite em que o concentrado de proteína de soro do leite contêm proteínas que estão presentes essencialmente num estado nao desnaturado e em que a activida de biológica do concentrado de proteína de soro do leite nao desnaturada e baseada no padrao do conjunto dps ácidos amina— dos e peptídeos pequenos que resultam da contribuição de todos os seus componentes proteicos que compreende as seguintes fases:

a) imediatamente depois da ordenha, arrefecimento do leite atê uma temperatura na gama de 2°C atê 10°C, especialmente a 4°C, e remoção dos contaminantes,

b) depois de uma outra purificação do leite, precipitação da coalhada por redução do pH atê cerca de 4,6 com ácido lác tico inicialmente a 20°C,

c) adiçao do coalho e subida da temperatura ate cerca de 30 C durante 20 minutos para provocar a expulsão do soro da coalhada, deixando em agitaÇao num recipiente para desagregar a uma velocidade baixa,

d) tratamento térmico do tipo da pasteurizaçao do produto que ficou no recipiente e agitaÇao a alta velocidade, . ** **

e) irradiaçao e separaçao do soro e

f) ultrafiltraçao do soro usando uma membrana que tem um limiar de separaÇao de peso molecular de substancialmente . 10 000 ou menos, • caracterizado por a fracçao de concentrado de protexna de so— ro do leite nao ser aquecida e o produto do qual ê derivada ser lentamente agitado para minimizar a desnaturaÇao da pro— # ** tema e por a referida ultrafiltraÇao ser realizada numa li— nha de produção que compreende mais de 20 modulos de tipo qua dro suportando um grande número de membranas, obtendo—se um concentrado final em produto seco de proteína nao desnaturada, em que a citada ultrafiltraÇao ê realizada a uma temperatura na gama de 4°C atê 20°C, especialmente a 4°C.

- 2a Processo de acordo com a reivindicaÇao 1, caracterizado por o concentrado de proteína do soro do leite ob tido ser um concentrado de proteína de soro do leite de bovino e/ou de cabra e/ou de ovelha e/ou humano.

- 3^a Processo de acordo com qualquer das reivindicaçoes 1 ou 2, caracterizado por o concentrado da proteína do soro do leite obtido compreender uma mistura isolada de proteína de soro do leite que tem dois ou mais componentes proteicos de concentrado de proteína de soro do leite.

Processo de acordo com qualquer das reivindi— caçoes 1 a 3j caracterizado por a concentração adequada citada de concentrado de proteína de soro do leite ser uma quanti dade terapêutica ou profilática de l8 a 28 g de proteína de soro do leite/100 g de dieta, especialmente 20 g de proteína

59 de soro do leite/100 g dieta

- 5^a Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado por o concentrado de proteína de soro do lei te ter uma fracçao de lactalbumina e/ou de imunoglobulina e ou de imunoglobulina e ou de fr— lactoglobulina e/ou de albumina de soro melhorada.

- 6a Processo de acordo com qualquer das reivindi— caçoes la 3j caracterizado por o concentrado de proteina de soro do leite ter uma fracçao de q(—lactalbumina e de albumina de soro melhorada e por a fracçao de fj—lactalbumina ser removi da.

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4- ·, ou complemento para produtos lácteos, para alimentaçao humana ou animal, caracterizado por se incorporar uma composição de ** proteina de soro do leite de acordo com as reivindicações 1 a l6.

- 20a Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica útil para aumento da velocidade de síntese, da velocidade de reabastecimento e/ou dos níveis de concentração de glutatiao em orgaos humanos ou de animais, para melhorar a resistência do hospedeiro em seres humanos e animais, compreen dendo resistência melhorada às infecçoes bacterianas e/ou resistência melhorada para reduzir o crescimento do carcinoma e/ou resistência melhorada para o processo de envelhecimento e/ou uma combinaÇao dos anteriores, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo uma quantidade eficaz terapêutica ou profilaticamente de uma composição de proteína de soro do leite obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a l6.

- 21^a Processo para a preparaçao de uma composição

Λ ** farmacêutica destinada a administraçao oral para uso em medicina humana ou veterinária, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo uma quantidade eficaz terapêutica ou profilaticamente de uma composição de proteína de soro do lei ** te obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 16 em ** A combinação com uma substancia veicular adequada para utilização alimentar.

Processo para a preparaçao de como uma composição terapêutica anti—cancro, especialmente para a profilaxia do cancro do cólon, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo uma quantidade eficaz terapêutica ou profi laticamente de uma composição de proteina de soro do leite ob tida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a l6.

- 23^aProcesso para a preparaçao de um alimento ou suplemento alimentar, caracterizado por se incorporar uma com posição de proteína de soro do leite obtida de acordo com qual quer das reivindicações 1 a l6, adaptada para necessidades de nutrição específica.

- 24a Processo para a preparaçao de um produto para ** A a nutrição terapêutica humana ou animal, caracterizado por se incorporar uma composição de proteína de soro do leite obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a l6.

65 25^a Processo para a preparaçao de um alimento de dieta, caracterizado por se incorporar uma composição de proteína de soro do leite de acordo com as reivindicações 1 a l6 em combinação com um veículo para alimentaçao oral.

- 26a Processo para a preparaçao de um alimento de cuidado intensivo, caracterizado por se incorporar uma compo— ** # siçao de proteina do soro do leite de acordo com as reivindicações 1 a l6 em combinação com um veículo neutro adequado pa ra alimentaçao oral.

Os requerentes reivindicam a prioridade do pe dido norte—americano apresentado em 23 de Dezembro de 1988, sob o número de série 289,971.

Lisboa, 22 de Dezembro de 19θ9 0 AGE5TE OFICIAL DA PROPUIEDADE LVDCSTKIAL

66 •'PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE COMPOSIÇOES DE CONCENTRADOS DE PROTEÍNA DE SORO DO LEITE E DE PRODUTOS DIETÉTICOS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE AS CONTÊM

RESUMO

A invenção refere—se a um processo para a pre paraÇao de uma composição de um concentrado de proteína de so ro do leite biologicamente activa que compreende uma concen— traçao adequada de concentrado de proteína de soro do leite em que o concentrado de proteína de soro do leite contêm proteí—

M ** nas que estão presentes essencialmente num estado nao desnatu rado e em que a actividade biológica do concentrado de proteí na de soro do leite nao desnaturado e baseada no padrao do con junto dos ácidos aminados e peptídeos pequenos que resultam da contribuição de todos os seus componentes proteicos caracteri zado por compreender as seguintes fases:

a) imediatamente depois da ordenha, arrefecimento do leite até uma temperatura na gama de 2°C até 10°C, especialmente a 4°C, e remoção dos contaminadores,

b) depois de uma outra purificaÇao do leite, precipitaÇao ca coalhada por redução do pH atê cerca de 4,6 com ácido lác tico inicialmente a 20°C,

c) adiçao do coalho e subida da temperatura atê cerca de 3θ C durante 20 minutos para provocar a expulsão do soro da coalhada, deixando em agitaÇao num recipiente para desagregar a uma velocidade baixa,

d) tratamento térmico do tipo da pasteurizaçao do produto que ficou no recipiente e agitaÇao a alta velocidade,

e) irradiaçao e separaÇao do eoro e

f) ultrafiltraÇao do soro usando uma membrana que tem um liA* miar de separaÇao de peso molecular de substancialmente «w **

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- 7& Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o concentrado de proteína de soro do leite ter uma fracçao de imunoglobulina e por a fracçao de fy—lactoglobulina ser removida.

- 8a Processo de acordo com qualquer das reivindi— • caçoes 5 a 7> caracterizado por a actividade biológica do con centrado de proteína de soro do leite depender do padrao de ácidos aminados e de peptídeos pequenos que resulta da contri ** *»* ** buiçao da fracçao ou fracçoes melhoradas.

- 9^Ô Processo de acordo com qualquer das reivindi— caçoes precedentes, caracterizado por a combinação de concentrado de proteína de soro do leite obtida, ser constituída por uma combinação do citado concentrado de proteína de soro do leite em conjunto com vitaminas B^ e B^ em excesso sobre o mí nimo das necessidades diárias.

Processo de acordo com a reivindicaÇao 9» caracterizado por as quantidades de vitaminas serem de 1,5a 2,0 mg de B^ e 1,5 a 2,0 mg de B^/lOO g de dieta.

- lia _

Processo de acordo com as reivindicações 1 a

7. BOUNOUS, G., LETOURNEAU, L., KONGSHAVN, P.A.L. Influence of dietary protein type on the immune system of mice.

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8, caracterizado por o concentrado de proteína de soro do lei ·* z te obtido, possuir propriedades de intensificação imunitária, labilidade ao calor e insensibilidade à digestão e por as pro priedades de intensificação imunitária - dependerem do estado nao desnaturado das proteínas contidas no soro do leite.

- 12a 6l -

Processo de acordo com qualquer das reivindi— caçoes 1 a o, caracterizado por a combinação de concentrado de proteína de soro do leite obtida ser isenta de lactose.

- 13& Processo de acordo com qualquer das reivindi— ** rs caçoes 1 a o, 11 e 12, caracterizado por o concentrado de pro teína de soro do leite ser produzido submetendo o soro do lei te ser produzido submetendo o soro do leite, um concentrado líquido de proteína de soro do leite, u um pó de concentrado de proteína de soro do leite reconstituído a ultrafiltraçao usando uma membrana que tem um limiar de separaçao de peso mo— mecular de substancialmente 100 000.

- l4ô Processo de acordo com qualquer das reivindi— caçoes 1 a o, 11 e 12, caracterizado por o concentrado de pro teína de soro do leite ser produzido submetendo o soro do lei te, um concentrado líquido de proteína de soro do leite ou um pó de concentrado de proteína de soro do leite reconstituído a u trafiltraÇao através duma membrana que tem um limiar de separaçao de peso molecular de substancialmente 500 000.

- 15^a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 ou 11 a l6 precedentes, caracterizado por o produto retido pela ultrafiltraçao usando uma membrana que tem um limiar de separaçao de peso molecular de 10 000 ou menos, ser submetido a uma ultrafiltraÇao posterior usando uma membrana que tem um limiar de separaçao de peso molecular de sufes tancialmente 5θθ 000 e/ou 100 000 para formar um concentrado que e em seguida seco para formar um pó.

Processo de acordo com qualquer das reivindi— caçoes 1 a o ou 11 a l6 precedentes, caracterizado por o soro do leite, um concentrado de proteína de soro do leite ou um pó de concentrado de proteína de soro do leite reconstituído \ ** ** ser submetido a acçao duma resina de permuta de anioes para produzir um efluente, cujas proteínas de soro contêm uma pro— porção mais alta de£(-lactalbumina e/ou de albumina do soro e/ou de imunoglobulinas do que no soro do leite original ou no concentrado de soro do leite ou no pó reconstituído e um eluído, cuja proteína do soro do leite contém uma proporção residual de X—lactalbumina e/ou de albumina do soro e/ou de imunoglobulinas e por pelo menos o efluente ser submetido a concentração por ultrafiltraÇao.

- 17^a Processo para a preparaçao de um substituto de leite ou de proteína do leite, caracterizado por se incorporar uma composição de proteína de soro do leite obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a lb numa concentração adequada.

Processo para a preparaçao de um substituto do leite ou de proteína do leite em produtos destinados a seres humanos com tendência para uma má absorçao da lactose, caracterizado por se incorporar uma composição de proteína de soro do leite preparada de acordo com a reivindicação 12.

- 19^a Processo para a preparaçao de um substituto

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10 000 ou menos, nao sendo aquecida a fracçao de concen— trado de proteína de soro do leite e sendo o produto do qual é derivada lentamente agitado para minimizar a desna turaÇao da proteina e realizando—se a ultrafiltraÇao numa linha de produção que compreende mais de 20 modulos de ti po quadro suportando um grande número de membranas obten— do—se um concentrado final em produto seco de proteina nao desnaturada, realizando—se a ultrafiltraçao a uma tempera tura na gama de 4°C até 20°C, especialmente a 4°C.