PT92305B - Metodo para solubilizacao e naturacao da somatotropina - Google Patents

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Description

MÉTODO PARA SOLUBILIZAÇAO E NATURAÇAO DA SOMATOTROPINA
-2.-
concentração adequada, se ajustar o pH para um valor entre
11,5 e 12,5, se manter este pH durante o tempo suficiente para solubilizar os corpos refractáveis,se reajustar o pH para um valor entre 11 e 12, e se manter este pH durante um tempo suficiente de modo a obter-se um teor em somatotropina na solução, que é composto por somatotropina monomêrica apropriadamente naturada, com bom rendimento.
í. · Λ-· ·,
Fundamento do Invento
Nos últimos anos a tecnologia de DNA recombinante tornou possível a produção de proteínas em larga escala. Vários métodos para a so1ubi1ização e naturação da proteína somatotropina foram tema de Patentes U.S. Por exemplo, a Patente U.S. No. 4 51 1 503 descreze um esquema típico para a recuperação de proteínas a partir de corpos refractáveis. Os corpos refractáveis são grânulos insolúveis de somatotropina desnaturada agregada situados no citoplasma da célula de Encherichia col i (E. coli) os quais são visíveis como partes brilhantes quando observados num microscópio de contraste de fase. Os corpos refractáveis são provocados pelo excesso de produção de soratotropina como resultado da manipulação genética do DNA de plasmídeo de E^. col i . Os corpos refractáveis são por vezes tratados com um agente desnaturante ou caotrópico forte que faz com que as moléculas incorrectamente enroladas se desenrolem e tornem solúveis A proteína deve então ser renaturada. 0 objectivo do presente invento é a renaturação correcta de somatotropina monomérica. Os corpos refractáveis não podem ser usados sem este desenrolamento e reenro1amento por serem biológicamente inactivos no seu estado refractável. 0 desnaturante forte mais vulgarmente empregue em esquemas deste tipo tem sido o hidrocloreto de guanidina.
Outros métodos incluíram outros agentes cotrópicos tais como dodeci1sulfato de sódio (SDS) (e.g. Patente U.S. No. 4 677 196) ou desnaturantes fracos tais como ureia (e.g. Patente U.S. No. 4 731 440).
Todos os métodos de solubi1ização e renaturação de somatotropina têm apresentado problemas. Hidrocloreto de guanidina é muito caro e deve ser substituido para que o processo de renaturação se dê. 0 SDS é um
desnaturante altamente eficaz e muito menos dispendioso que o hidrocloreto de guanidina, mas o SDS liga-se á proteína desnaturada muito mais fortemente tornando problemática a sua remoção completa da proteína e aumenta portanto os cistos do processamento. A ureia é geralmente usada como agentes desnaturante ou caotrópico mais fraco. Mas mesmo os métodos que utilizam ureia têm tido problemas tais como contaminação do produto final e manipulação, armazenamento e tratamento dos desperdícios.
Além dos outros problemas dos métodos convencionais, o monómero adequadamente renaturado não é o único produto. 0 monómero de somatotropina é a unidade mais pequena que mantém todas as propriedades e actividade biológica da somatotropina. Tipicamente o monómero de somatotropina consiste em aproximadamente 191 resíduos de aminoácidos e tem uma peso molecular de aproximadamente 22 000 daltons. A molécula monomérica não é ligada covalentemente ou associada não cova lentemente a outras moléculas semelhantes.
dímero de somatotropina consiste em duas moléculas de monómero as quais estão cova lentemente ligadas, e.g. através de pontes dissulfureto intermo1ecu1 a res, pontes dissulfureto ou associadas não covalentemente uma à outra. A molécula dímero consiste no dobro do número de resíduos de aminoácido e no doutro do peso molecular de uma molécula monomérica.
Infe1izmente, empregando métodos convencionais, formam-se alguns dímeros e também proteínas de peso molecular mais elevado. Apenas o monómero e Dão o dímero é biológicamente útil.
Portanto ê necessário um método que possa ser comercializado para a so1ubi1ização e renaturação de somatotropina que dê um bom rendimento do monómero, sem excesso de dímero e sem a utilização de agentes caotrópicos.
Sumário do Invento
São descritos um método para a solubilização e renaturação de somatotropina sem a utilização de agentes caotrópicos e a somatotropina monomérica produzida pelo método. 0 método caracteriza-se pela dispersão de corpos refractáveis de saratotropina em água para formar uma concentração adequada, ajuste cb pH a uma gama entre aproximadamente pH 11,5 e 12,5, mantendo a gama de pH durante o tempo suficiente para solubilizar completamente os corpos refractáveis, facultativamente reajustamento do pH da solução a uma gama entre aproximadamente pH 11 e pH 12, manutenção da solução na gama do pH ajustado, resultando numa quantidade de somatotropina composta por somatotropina monomérica adequadamente naturada com bom rendimento.
Surpreendentemente, o presente invento resulta numa formação de dímeros mais baixo e elimina a necessidade de quaisquer passos de renaturação separados ou agentes.
Breve descrição dos desenhos
A Figura 1 representa esquemáticamente a obtenção de monómero em função do pH de envelhecimento e concentração de proteína.
A Figura 2 representa esquemáticamente a quantidade de dímero formado em função do pH de envelhecimento e concentração de proteina.
As Figuras 3-7 mostram os resultados de cromatografia de permeação em gel do novo método ao longo do tempo (5 minutos, 1 hora, 2 horas, 5 horas e 10 horas, respectivamente).
Descrição detalhada do inveto presente invento é dirigido a um método para a solubi 1 ização e naturação de somatotropina que se caracteriza por: dispersão dos corpos refractáveis da somatotropina que se caracteriza por: dispersão de corpos refractáveis de somatotropina em água nura concentração adequada; ajuste do pH dos corpos refractáveis em água para um nível a que se dê a solubi 1 ização; manutenção do pH durante tempo suficiente para solubilizar os corpos refractáveis; reajuste facultativo do pH da solução para um nível que se dê a naturação; e manutenção da solução ao pH reajustado durante tempo suficiente para resultar numa quantidade de somatotropina em solução composta por somatotropina monomérica adequadamente enrolada com bom rendimento.
Somatotropina como aqui é usado significa (1) hormona de crescirento animal, seus derivados análogos e fragmentos de qualquer espécie, por exemplo, humano, bovina ou porcina; (2) precursores da insulina de crescimento, como sejam hormona de crescimento reduzida (-SH) e hormona de crescimento S-protegida, por exemplo, S-sulfonato da hormona de crescimento; (3) variantes da hormona de crescimento ou seus precursores, por exemplo, estruturas que tenham sido modificadas para aumentar e/ou encurtar a sequência de aminoácidos da hormona de crescimento,por exemplo a variante 20K da hormona de crescimento, hormona de crescimento humana metionilada, hormona de crescimento porcina 7 e 9 e similares, e (4) análogos da hormona de crescimento ou seus precursores, por exemplo estruturas em que a sequência de aminoácidos da hormona de crescimento foi modificada por substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos. Tanto a somatotropina obtida por via recombinante como a natural assim como qualquer outro tipo de somatotropina podem ser utilizados de acordo com o presente invento.
primeiro passo no novo método é a dispersão de corpos refractáveis de somatotropina em água (de preferência água desionizada) numa concentração adequada. A concentração de proteína total ê um factor importan te do presente invento. Tal como a Figura 1 mostra a produção de monómero depende da concentração de proteína total.
Uma concentração adequada é inferior a cerca de 5g/l e de preferencia na gama de 0,5g/l a cerca de 5,0g/l. E especiaimente preferida uma concentração de aproximadamente 2,5g/l.
A medida que a concentração aumenta para além da gama de 5,0g/l os resultados do processo tendem a piorar. Apesar das soluções em concentrações inferiores a cerca de 0,5g/l parecer darem melhores resultados em termos de rendimento percentual do mómero, os factores comerciais, tais como armazenamento, custo e tamanho do equipamento assim como os passos adicionais necessários no protESSO para remover o líquido em excesso, não favorecem a utilização de uma solução tão diluida.
pH da somatotropina concentrada é ajustado a uma gama entre aproximadamente pH 11,5 e pH
12,5 de preferencia aproximadamente entre pH 12, Oe pH 12,2 para solubilizar a proteína na água. Qualquer base forte pode ser usada para ajustar o pH da solução (e.g. a adição de hidróxido de sódio ou de hidróxido de potássio).Esta solubilização normalmente dá-se num espaço de tempo relativamente curto, tipicamente cerca de dois a vinte minutos.Com o pH nesta gama pode-se observar a olho uma dissolução dos corpos refractáveis e a clarificação da solução. Após dissolução dos corpos refractáveis da sonatotropina o pH pode ser mantido ou baixado. Se se mantiver a somatotropina gradualmente reenrola-se e dá origem ao monómero adequadamente naturado. Não são necessários passos de renaturação uma vez que não se usa desnaturante. 0 ambiente alcalino proporciona solubi1ização num tipo de ambiente não desnaturante. Um ambiente não desnaturante refere-se à série de condições físicas e do solvente que permitem à somatotropina assumir uma conformação nativa. A somatotropina deve estar num ambiente não desnaturante para atingir o estado adequado de oxidação e conformação necessário !â bioactividade. Devido ao ambiente tipo raturante os corpos refractáveis solubi1izados gradualmente enrolam-se e formam o produto final pretendido do monómero adequadamente enrolado. Isto contrasta marcadamente com os métodos anteriormente descritos usando desnaturantes, os quais requerem então passos de renaturação.
Após dissolução dos corpos refractáveis de somatotropina, o pH pode ser reajustado para uma gama entre aproximadamente pH 11 e pH 12. Se se baixar o pH aumenta-se a velocidade da naturação. 0 pH pode ser baixado por qualquer método, por exemplo através da adição de ácido fosfórico. A gama reajustada situa-se de preferencia entre aproximadamente pH 11,3 e pH 11,7 para minimização do dímero. E especialmente preferido um pH de 11,5. Surpreendentemente, encontrou-se que quando o pH é baixado para a gama preferida, menos dímero e uma quantidade maior de monómero se forma. A fonação de uma menor quantidade de dímero e de uma maior quantidade de monómero através do reajustamento do pH é surpreendente porque seria de esperar que a percentagem de dímero ou monómero formado se mantivesse igual.
A Figura 2 mostra o resultado inesperado da menor formação de dímeros usando a gama de pH preferida do presente invento.
Pode-se usar um pH inferior a pH 11, no entanto o rendimento ê afectado de modo adverso e forma-se uma maior quantidade de dímero. Em adição, se se baixar muito o pH existe o risco de a somatotropina precipitar na solução. Pelo contrário se o pH não fôr reajustado o processo de naturação demora mais tempo e são possíveis :? reacções de degradação tais como desamidação. No entanto,os diferentes tipos de somatotropina (e.g. diferentes análogos, derivados,precursores ou variantes da hormona de crescimento, podem sugerir variação da gama de pH e tais variações são consideradas como estando dentro do âmbito do presente invento .
A solução é mantida na gama do pH reajustado durante cerca de 5 a cerca de 12 horas (de preferencia cerca de lo) a cerca de 20°C-30°C até o monómero atingir o seu máximo. Isto foi determinado por cromatografia de permeação em gel. As figuras 3-7 mostram a evolução ao longo do tempo da proteína usando o método do presente inven-F'' to. Note-se que as Figuras 3-7 mostram que a evolução do processo vai de agregados de proteína de alto peso molecular para monómeros em vez do modelo convencionalmente proposto usando desnaturantes que mostra a formação imediata do monómero e nenhuma alteração (ou um aumento) no peso molecular (ç. à medida que o monómero se enrola correc.tamente ou se liga a outras moléculas de proteína.
A Figura 3 mostra os resultados da cromatografia de permeação em gel (gpc) após 5 minutos.Foram identificados três picos: o pico A a cerca de 0,45 unidades de volume na abcissa, o pico BI a cerca de 0,65 unidades;e o pico B2 a cerca de 0,77 unidades. 0 pico A compreende
impurezas proteicas com pesos moleculares à volta de 1000 000 daltons. 0 pico Bl é somatotrop 1 na agregada juntamente com algumas impurezas proteicas, e.g. contaminantes do hospedeiro £. co1i. 0 pico B2 é a somatotropina monomérica (o pico B2 pode ter ainda alguns vestígios de impurezas assim como monómero).
A Figura 4 mostra os resultados de gpc após 1 hora. Tanto o pico A como o pico Bl têm menor tamanho e o pico B2 é marcadamente mais pronunciado.
A Figura 5 mostra os resultados de gpc após 2 horas. 0 pico A e o pico Bl diminuíram ainda mais de tamanho e o pico B2 aumentou novamente.
A Figura 6 mostra os resultados de gpc após 5 horas. Note-se que apareceu um quarto pico pequeno ou patamar a cerca de 0,7 unidades de volume. Este patamar representa o dímero formado. 0 patamar na Figura 6 mostra a formação baixa do dímero pelo presente método. Nos métodos em que se formam grandes quantidades de dímero é evidente um pico bem distinto.
A Figura 7 mostra os resultados de gpc após 10 horas. Existe pouca alteração relativamente à Figura 6 mas o pico B2 representando o monómero aumentou 1 igeiramente.
As Figuras 3-7 mostram que o presente invento cria um ambiente naturante. As moléculas de proteínas nos corpos refractáveis des 1 igam-se unas das outras e reenrolam-se correctamente para formar a somatotropina monomérica biológicamente activa sem a utilização de quaisquer desnaturantes e sem quaisquer outros passos ou agentes de renaturação.
A solução resultante compreende somatotropina monomérica adequadamente naturada com um bom rendimento. Um bom rendimento é cerca de 30% a cerca de 45% ou mais da proteína total dissolvida. A proteína total inclui todas as formas de somatotropina assim como todas as outras impurezas proteicas que não sejam somatotropina tais como contaminantes do hospedeiro £. co1i. Os rendimentos calculados com base apenas na somatotropina são muito mais elevados. Os rendimentos para os métodos que utilizam agentes caotrópicos são sensivelmente os mesmos. Porém, devido ao presente invento não usar agentes caotrópicos a somatotropina monomérica resultante não tem vestígios de agentes contaminantes indesejáveis tais como SDS, hidrocloreto de guanidina ou ureia. 0 invento é ainda ilustrado pelos exemplos não limitantes que se seguem.
EXEMPLO 1
Somatotropina bovina
meio de fermentação contendo células de £. co1i que foram préviamente modificadas genéticamente para produzir corpos de inclusão de somatotropina bovina foi centrifugado para separar as células do caldo. As células foram ressuspensas e rebentadas usando duas passagens a 8000 psig através de um homogeneizador Gaulin. A suspensão foi centrifugada e sedimento ressuspenso e tratado com lisozima e o detergente Triton® X-100 a 37°C. A suspensão foi centrifugada e o sedimento lavado duas vezes com ãgua e centrifugado após cada lavagem. 0 sedimento resultante, contendo a somatotropina bovina desnaturada insolúvel foi adicionado a água e ajustado a pH 12,15 com NaOH para levar a concentração de proteina total a aproximadamente 2,5g/l.Após 20 minutos a pH 12,15 e 25°C, a solução límpida foi ajustada a pH 11,5 e mantida assim durante 8 horas. A solução foi ul-12X'*· ι
trafiltrada numa cassete de fibras ocas com um peso molecular de exclusão de 100K, Amicon^ H1P100-43. 0 permeato foi colhido e concentrado usando uma cassete de fibras ocas com (r) um peso molecular de exclusão de 10K Amicon^HlPlO-43 atê aproximadamente 5 g/1. A solução concentrada foi ajustada a pH 9 usando HCl IN e aplicada a 20 g de bST por L de resina num permutador aniónico, DEAE-Sepharose Fast Flow® que tinha sido préviamente equilibrado com borato lOmM, pH 9. Após lavagem com o tampão de equilíbrio, a bST foi eluida usando uma solução borato lOmM e NaCl lOOmM a pH9. 0 pico de bST foi concentrado e removido o sal com uma solução de
D amónia diluida usando uma cassete de fibras ocas Amicon H1P10-43 até a conductividade do permeato ser 100 microsiemens)cm. A solução a que se removeu o sal a aproximadamente 2g/l foi liofilizada para dar somatotropina bovina que passou nos testes biológicos e químicos estabelecidos.
EXEMPLO 2
Somatotropina pcrcina meio de fermentação contendo células de E_. col i que foram préviamente modificadas genéticamente para produzir corpos de inclusão de somatotropina porcina foi centrifugada para separar as células do caldo. As células foram ressuspensas e rebentadas usando duas passagens a 8000 psig através de um homogenizador Gaulin. A suspensão foi centrifugada e o sedimento ressupenso e tratado com lisozima e detergente Triton®X-100 a 37°C. A suspensão foi centrifugada e o sedimento lavado duas vezes com água e centrifugado após cada lavagem. 0 sedimento resultante, contendo a somatotropina porcina insolúvel foi adicionado a água desionizada de modo a que a concentração de proteína total foi de aproximadamente 2,5g/l. A pasta resultante foi bem misturada ao mesmo tempo que se adicionava NaOH 5N
-13<7·
da por fim do muitas para aumentar o pH para 12,2. A solução vai ficando lentamente mais límpida durante cinco minutos. A solução foi dej_ xada em repouso durante 20 minutos a 20°C. 0 pH foi então baixado para 11,5 usando HgP04 IM e deixada em repouso durante dez horas. A concentração do monómero conforme medicromatografia de permeação em gel é de 1,05g/l no período de envelhecimento.
Eóbvio que podem ser feitas alterações ao presente invento por algém dentro da matéria sem abandono do espirito e âmbito do presente invento como definido nas reivindicações que se seguem.

Claims (14)

  1. l3. - Método para a solubilização e naturação de somatotrop1 na caracterizado por compreender:
    (a.) a dispersão de corpos refractáveis de somatotropina em água numa concentração adequada;
    (b) o ajustamento do pH a uma gama entre aproximadamente pH 11,5 e pH 12,5;
    (c) a manutenção da gama de pH durante tempo suficiente para solubilizar os corpos refractáveis;
    (d) o reajustamento do pH da solução a.uma gama entre aproximadamente 11 e 12; e (e) a manutenção da solução na gama do pH reajustado durante um tempo suficiente para resultar um teor de somatotropina em solução, que é composto por somatotropina monomêrica adequadamente naturada com bom rendimento.
  2. 23. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a formação de dímeros ser diminuída.
  3. 3-. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a somatotropina ser somatotropina bovina ou porcina.
  4. 4®. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a somatotropina ser somatotropina derivada por via recombinante.
  5. 5a. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a somatotropina ser somatotropina bovina ou porcina.
  6. 6a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o pH no passo (b) ser justado a uma gama entre aproximadamente pH 12,0 e pH 12,2 e a gama de pH ser reajustada no passo (d) entre aproximadamente pH
    11,3 e pH 11,7.
  7. 7a. - Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a concentração no passo (a) ser inferior a cerca de 5 g/1, o tempo no passo (c) ser entre cerca de dois minutos e vinte minutos, e o tempo na passo (e) ser de cerca de cinco horas a doze horas a uma temperatura entre cerca de 20°C e cerca de 30°c.
  8. 8a. - Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a concentração no passo (a) ser entre cerca de 0,5 g/1 e 5g/l.
  9. 9a. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a concentração no passo (a) ser de aproximadamente 2,5 g/1 o pH ser reajustado no passo (d) a pH 11,5 e o tempo no passo (e) ser de cerca de 10 horas.
  10. 10a.- Método para a solubilização e naturação de somatotropina, caracterizado por compreender :
    (a) a dispersão dos corpo refractâveis de somatotropina em âgua numa concentração adequada;
    (b) o ajustaiento do pH a uma gama entre aproximadamente pH
  11. 11,5 e pH 12,5; e (c) a manutenção da gama de pH durante tempo suficiente para resultar num teor em somatotropina em solução que é composto por somatotropina monomérica adequadamente naturada con bom rendimento.
    ll5. - Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a concentração ser inferior a cerca cfe 5 g/1.
  12. 125. - Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por um pH estar entre cerca de pH 12,0 e cerca de pH 12,2, a concentração ser de aproximadamente 0,5 g/1 a aproximadamente 5g/l e o tapo ser de cerca de 5 horas a cerca de 12 horas a uma temperatura entre cerca de 20°C e cerca de 30°C.
  13. 135. - Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a somatotropina ser somatotropina bovina ou porcina.
  14. 145. - Método para a solubilização e naturação de saratotropina, caracterizado por compreender:
    (a) a dispersão dos corpos refractâveis de somatotropina em água numa concentração adequada;
    (b) o ajustamento do pH dos corpos refractâveis em água a um nível que permite efectuar a so1ubi1ização;
    (c) a manutenção do pH durante tempo suficiente para solubilizar os corpos refractáveis;
    (d) o reajustamento do pH da solução a um nível que permita efectuar a naturação; e (e) a manutenção da solução no pH reajustado durante tempo suficiente para resultar num teor em somatotropina em solução, que é composto por somatotropina monomêrica adequadamente naturada com bom rendimento.
PT92305A 1988-12-16 1989-11-14 Metodo para solubilizacao e naturacao da somatotropina PT92305B (pt)

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