PT92165B - Metodo, cassete de expressao e estrutura dna para aumento da capacidade de destoxificacao de superoxidos, pela expressao de um gene de superoxido dismutase - Google Patents

Description

TITULAR: ROUSSEL - UCLAF

EPÍGRAFE: ”METODO, CASSETTE DE EXPRESSÃO E ESTRUTURA DE

DNA PARA AUMENTO DA CAPACIDADE DE DESTOXIΕ1CAÇAO

DE SUPEROXIDOS, PELA EXPRESSÃO DE UM GENE DE

SUPEROXIDO DISMUTASE”

M......E......M......O......R I.....A................D......E.......S.......C.......P.......I........T.......I.......V......A

Referência a.......ped i d os.......:'-_C. ç i ona dos

Este pedido é uma continuação em parte do pedido de patente norte-americana nD de serie 265.(349, depositado em 31 de Outubro de 1983, o qual e uma continuação em parte do pedido de patente norte-americana n.Q de série 229.639, depositado em 8 de Agosto cie 1988, pedidos. estes aqui incorporados para, referência.

Campo......do......i nvento

Este invento relaciona- e com plantas, e métodos para a sua preparaçao, possuinck as ditas plantas uma tolerância. aumentada âs situaçõe·;. de stress ambiental e químico. 0 método emprega a transformação de plantas de forma a aumentar a concentração cia superoxido dismutase nas células da planta, especiaimente nos cloroplastos.

Antecedentes do invento

Nas plantas, tal cozo em outros· organismos aeróbios, o superóxido (Op ' e um -ntermediario da redução do oxigénio vulgarmente encontrado. 0 superoxido é extremamente tóxico para as células. porque ataca os componentes cie ácidos gordos insaturados dos lípidos de membrana, provocando assim'danos na estrutura da membrana. As células aeróbias destoxif i ca.rn o superóxido pela, acção das superóxido dismutases, enzimas contendo metal, que convertem o radical superóxido eru peroxido cie hidrogénio e oxigénio molecular. 0 peróxido cie hidrogénio e subsequentemente convertido, pela catalase, em água e oxigénio molecular. As superóxido dismutases proporcionem assim, urna defesa contra

a. citotoxida.de potencial do radica! superóxido.

t i pos	cie sup	ei	oxida disinutas	e ( SOD i .·
1Ί C O <	‘3 uZriSOT		SOD contendo	manganês
f er r o	<FeSOD		Todos os trés	tipos· de
e m p 1	ant as.		SuZnSODs são	i nibidas
que a	s FeSOD		e as MnSODs ná.	o o s sr o .

o xi gén i o.

constitutivamente

Em organismos procarioticos contendo MnSODs e FeSODs. a MnSOD é inclutível sob condições de elevada concentração cie e pelo Oó , enquanto que a FeSOD é expressa Nas plantas, a. CuZnSOD e a FeSOD são inibidas por f eedback pelo Hodg. enquanto que a. MnSOD não o é. As MnSODs estão geralmente localizadas no interior das mitocôndrias . Nas folhas e fruto cia maior parte da-· plantas b Z da examinadas, a MnSOD representa apenas 3 a act i v i dade total de SOD, embora este valor possa atingir 20 7, nas ervilhas, por exemplo. A FeSOD fci encontrada em apenas algumas famílias de plantas com semente, nas quais ela pode ter surgido por transferência de genes a partir dos procariotas.

A indução da actividade da SOD em células vegetais tem sido correlacionada com o desenvolvimento de tolerância aumentada a vários compostos químicos e situações de stress físico. As plantas que evidenciam resistência a herbicidas como o paraquato contém uma. maior actividade total de SOD num conjunto de tecidos, incluindo o fruto e as folhas, do que os genotipos paracjua to-sens.'-'ei c c orresponder.tes . A tolerância a. gases tóxicos > por exemplo, ozono e dióxido de enxofre ) íi metais (por exemplo, cobre, ferro, zinco e manganês), e ao dano devido a situações de stress ambiental, como processos fotodinámicos, e efeitos térmicos, como a queimadura pelo sol, foram também cor re 1 ac i onados- com níveis aumentados de actividade de SOD.

Considera-se que as situações- cie stress ambiental fazem decrescer em diversos graus a produtividade de culturas, dependendo c!a. severidade e tipo de stress. Assim, o aumento da tolerância das plarr.a.s de cultivo a efeitos adversos, impostas por condições dr. crescimento não-opt i mas , é um objectivo importante para a melheri? da. gesxáo de colheitas. Existe, pois, um ir.terc-se substanciai no capacidade de aumentar a concent r ac ão ,1a SOD no interior de uma célula vegetal, de modo a obter uma planta com uma tolerância. aumentada ambi ental químico .

L i fera t ura......r e1evante

Foi clonado o gene que .-d.ru; pena a MnSOD na

E.coli K-12 (Touati, J,,.Bac t er i ol , 0983' 155:1078-1 087). Foi determinada a sequência de DNA do gene de MnSOD da, E._co.l.i. K12 (Takecla et Nucleic Ac i eis Resma: ch 14:45774589). A sequência de aminoãcidos da MnSOD cia E.cqli B é

conhecida (Steinman, J . Biol . Chem. (1970	‘ 253:8708-8720). Os
clones de cDNa de duas CuunSODs dc· toma	n-- estão descritos em
Perl-Treves et al., Plant Molecular Bu	oioey U938> 11:609-
623 .

Foi descrito o uso de um péptido ele trânsito da pequena subunidade (p;iu de ribulose-1,5-bifosfato carboxilase da ervilha, fundido a um gene exógeno para

proporcionar um gene quimérico, som .	a fim cie dirigir o
produto heterólogo cie um gene para as c	1, oro pias tos . Veja-se,
por exemplo, Van den Broeck et al . , Nak	.;re ‘ 1 985 ) , 313: 358-
363; Schreier et al . , EMBO J. U985) 4:1

Foi assinalado um possivel mamei protector da SOD

contra a lesão pelo ozono nas feijões ,:	le va.gem, por Lee et
al., Flant Physiol. (1982> 69:1444-1449.	efeito ole defesa
da SOD contra a toxicidade do 80? foi ;F	escrito mor Ta.naka et
al. , Plant and Ce 11 Fhvsiol.	1982'' 21:601-611.
Similarmente, foi registado um •.•ttitv	protector da SOD
contra a, lesão foto-oxidati ό oo· f	rufo de tomate a
amadurecer ( Ra bi nowi tc h et ai. , Plr. _	: : ol.Plant . . 1982>.
54:369-374’. Os mutantes 30D- da L.soLi	foram descritos como

I

Ή possuidores de uma sensibilidade aumentada ao paraquato e ao '986 ί 5:623-630) oxigénio (Carlioz e Touati, EMBO.....J papel da SOD na tolerância dos musgos a seca, foi registado por Dhinsa e Matowe, Exg....Botaig v ‘ 981 > 92:79-91.

tratamento de plantas manganês foi descrito como afectanda

SOD; a actividade da. MnSOD foi modificada, apenas pelas conce-nt r açõe al . , Pl.an.t and 5oil (1987' 99:139-14¹

Physiol. (1987) 85:570-577, e xpus e r na actividade mitocondrial da SOD, m· peroxisomal aumentada da MnSOD em plantas Cu-tolerantes» quando comparadas com plantas Cu-sensíveis. Bowler ei...........aí...»

EMBO_J,_ (1988) 8:31-38 descreveram um aumento de rnRNA da SOD após a exposição de uma planta a etileno e acido salicilico, e infecção com Pseuclomonis s. vr i nga.e .

soja, com	f erro	e/ou
acti v i dade	tot	al de
descrita c	orno	sendo
ie manganês	ι Lei	d i et
P a 1 ma e t	3 1... ’	P1 a n t
que não ha	a 1 teração
que há uma	a c t i	vidade

A caracterização da FeSOD Jo tomate foi descrita por kuiakowski etal . . Fui'. D i ao liem. ‘.'985' 1.46:459-466. 0 artigo de revisão seguinte cliz respeito 0 SCO em plantas:

Rabi nowi tch e t al ..., Phqt oc hemi s tr ygd P! ,c t ο!? iç.1 q.gy i 1 983 '

37:679-690.

Re s umod o i n ve n t q

São proporcionadas novis plantas» e métodos para a sua preparação, possuindo as ditas plantas uma actividade aumentada da SOD. As plantas sáa regeneradas a. partir de células transformadas pelo us.o de oassettes de expressão compreendendo uma sequência ue DNA codificando pera a SODreunida a um promotor da planta. Adicιonalmente, o DNA pode ser ligado a sequências ”leader” dc· cloroplasto, para libertação para, e expressão no cloroplasto da planta. As cassettes de expressão são introduzidas na célula hospedeira, da planta, para integração no genoma, cie forma a que seja atingida uma actividade aumentada ds SOD ns célula. vegetal com interesse, espeeialmente no cloroplasto.

Breve descriçaã.Q d q s.....d e s en he '

A Figura 1 mostra a construção cio Aerpbaçt.er_iurn

K61 desarmado.

Desc r i ção......das........f o r mas.......e speçi f iças.......de........r e a 1 i_z aç ão

De acordo com o presente invento, são proporcionados métodos e composições que permitem a modificação da. actividade da SOD em plantas. As células das plantas são transformadas usando cassettes cie expressão, as quais possuem sequências funcionais de regulação da transcrição e da tradução numa célula do planta, e um molde aberto de leitura,· que codifico pato uno 3010 heterologo ou homóloga, sob o controlo transcricional e tio.ducional das

regiões cie	regulação. A tra·..	. i ç á e	cie	uma sequência.
introduz ida	de DNA codificando pai	' 3. 3	SOD \	'a i aument ar	C 5
níveis cia Sí	DD jã presente na. celu	cf .	as s i m ,	a presença	d 3

SOD resultante cia transcrição e tradução do sequencia de DNA adicionada vai aumentar a concentração de SOD no. célula. da planta. 0 molde aberto cie leitura pode também incluir uma sequência cie DNA codificando para um péptido de trânsito.

reconhecido pela planta hospedeira» e para aminoácidos de pós-processamento da extremidade N de uma proteína madura, a qual proporciona o direccionamento cia SOD paro um organito celular.

A introdução de pol ipept í ;los- num organito celular, tal como o cloroplasto ou a mi⁺.'ocorvdr i a , e conseguida reunindo num molde de leitura uma. sequência de DNA que codifica para o péptido de trânsito con; uma sequência que codifica para um gene estrutural da. 500. Quando expressa, a proteina que resultou da fusão do péptido de trânsito com a SOD será clivada pelo organito celular para a introdução da enzima. SOD no organito. Numa primeira forma de realização, o péptido de trânsito e a proteina SOD são fundidas directamente uma na outra. Numa segunda. e preferencia1, forma de realização, o péptido de transito e a. proteina SOD são ligados pelo aminoácido glutam.na. Numa terceira forma, de realização, o péptido de trânsito e a SOD -'ão ligados por cerca de 1 a 30 aminoácidos ch.· pos-processamento da extremidade N de um polipeptido maduro cl a iosu da ribulose bisfosfato carboxilase. A cassette de expiessão incluirá, assim, na direcção 5’ de t r ana: r iç ão , uma região de iniciação cie transcrição e tradução, funcional numa célula da planta; um gene estrutural quv cociific.a pot a .· SOD, incluindo, de preferência, no molde de Leitura um? sequência que codifica para um péptido de trânsito, em que o dito péptido de trânsito dirige a. t rans f < r ê nc i a da. SOD para um organito celular da planta; e u;..> região reguladora. da terminação da transcrição e ola tiadução. As regiões reguladoras da iniciação e terminação são célula da planta e proporc i onam uma expi essã.o eficiente da

SOD, com efeitos desejáveis na viabilidade e proliferação da f une i ona.i 3 numa

planta	hospedei ra.	da
A sequência	de DNA da SOD pode ser nativa
planta	hospedeira ou	hetero Ioga, e po	cl e s e r d eri v a d a	de
fontes	procarióticas	ou eucarióticas.	São preferidas	as
fontes	procarióticas . C	> gene est r ut ura1	para. a SOD pode	ser
obtido	através de uma	variedade de rne i	os. 0 gene pocle	ser
sinteti	zado, no todo ou em parte, oart	icui armente quando	é
desejável proporcionar	codões pref - ido	c pela planta. Ass	i m,
pode ser sintetizado	o todo ou paste	do molde aberto	de
leitura	, usando codões	pref er i d o s ρo 1o	planta hospedeira.	Os
codões	preferidos pel	a planta podem	; e r cl e t e r iii i n a cl o s	St

partir dos codões que surgem com maior frequência nas proteínas de maior abundância na especie particu1 ar da planta de interesse.

Os métodos para sintetizar sequência; e ligar sequências estão bem estabelecidos na. literatura, Ouando uma porção do molde aberto de Leitura e sintetizada, e uma porção é derivada de fonte; natur i porção sintetizada pode funcionar como ponte entre d-.ta porções de ocorrência natural. ou pode proporcionar uma terminação 3’ ou D’ . Em particular, quando o péptido de transito e o molde aberto de leitura que codifica para a. SOD são derivados de genes diferentes, serão geralmente en,,. < -_-ç.uec adaptadores sintéticos. Noutras situações podem ;ai empregues ''linkers” quando os vários fragmentos podem ser inseridos em locais de

restrição diferentes ou substituídos por uma sequência no ”linker”.

Geralmentej parte ou o total do eene estrutural da SOD sera de uma fonte natural, de preferência a MnSOD da

E.coli, uma vez que esta enzima, não e inibida por feedback pelo peróxido de hidrogénio. Os métodos para identificar sequências com interesse possuem exemplificação extensiva na literatura, apesar de poderem ser encontrados diferentes graus de dificuldade em algumas situações. Várias técnicas incluem a utilização de sondas quando o possivel procurar sequências complementares em patrimónios genóinicos ou de cDNA.

Quando o gene estrutural a ser inserido é derivado, por exemplo, de MnSOD de origem bacteriana. pode ser desejável eliminar uma grande fracção da região 3’ não cofidicante do gene bacteriano·. Assim, eai algumas circunstâncias, pode ser empregue o. n gene truncado, podendo remover-se até 0,8 kb do região 3’ bacteriana não traduzida da MnSOD. A eliminação cie rui i ?o n u.

traduzida pode ter stabi1idade. e/ou ribulose bisfosfato um efeito positivo na transcrição, tradução do mRNA nas células da planta.

As regiões reguladoras da iniciação da transcrição e tradução podem ser homologas ou heteroloças da planta, hospedeira. São de particular interesse regiões de iniciação de transcriçâ'0 provenientes de genes presentes na. planta hospedeira ou em outras espécies cio plantas, como, por exemplo, a. região de iniciação da 'ra.nsor ição da. psu cia.

carboxilace

o. a planta do tabaco;

d t

regiões de iniciação de transcrição presentes em virus como o virus 35S do mosaico da couve í i or ¹ o aMV ' , incluindo um promotor ”duplo” do virus 35S do CaMV ( ”MAC” * descrito no pedido de patente norte-americana co-pendente nã de serie

339.755 de 18 de Abril de 1988; e as associadas com o T-DilA· tais como a região de iniciação da transcrição do opina sintetase, por exemplo, a. octopina, no.nopi na, agropina e similares.

Numa situação particular pode ser preferida qualquer uma. de um conjunto de sequências reguladoras, dependendo de ser desejável uma ti inscrição constitutiva ou induzida, da eficiência particular lo promotor ern conjunção com a SOD heteróloga, da possibilidade de ligar um promotor forte a uma região de controlo de nm promotor diferente que permita uma transcrição indutivel, da facilidade de

construção e outros. Estas regi	Λο ζ r ·;	? gu1ador	a.s	encontram
ampla referência na literatura.
0 transporte da SOD	he t e t	o 1 o ga	par	a outros
compartimentos celulares pode	s e r c t	t r sc = u i d	o	através da
utilização cie um péptido de trãns	ito par	a. d i r	i g i	r p ara u m
compartimento celular desejado·	o.ur.	um c 1	o r o	p 1 a s t o . D
péptido de trânsito pode prrdr	d: mear	ρ , j p ! j t3	que	a regia o
reguladora da iniciação da tran	•s ' i c ã. r	, e.rn	do	organis mo
hospedeiro, ou de um gene es*·	ra aluo	' o ri *? c	J.l	região de
iniciação de transcrição como ac	C1 r ? a. η i s	ruo hO'SP	ecle	1 I” '?
Reveste-se de partícula	r inter	Θ ã- i? C 3.	ut i	li.cação de
um péptido cie transito que pernut	3. O t t -	1 li 3 pO 1 ·. t?	da	SOD para

o cloroplasto ou a mitocôndria de uma célula da planta. De

outro modo_: encontrada no citoplasma. Os pept idos utilizáveis podem ser obtidos a partir a SOD expressa pela planta transgénica será de trânsito de eenes que urna prote ι na.

o polipéptido codificam para as proteínas do cloroplasto, produzidas no citoplasma e transportadas para o cloroplasto. Tais proteínas incluem a psu da ribulcs·? bisfosfato carboxi lase da planta do tabaco e da soja, a prateina transportadora de grupos acilo (ACP ) , a proteína, de ligação da. clorofila. A/B e outros componentes da. sintese de ácidos gordos.

Para. melhorar a. eficiência, do transporte, pode fundir-se num molde de leitura uma sequência de DNA codificando para o péptido de trânsito com uma. sequencia de

DNA codificando para, um peptido compreendendo aminoácidos de pós-processamento da extremidade N de codificada no núcleo do cloroplasto, como maduro da psu da ribulose bi sf osf a : .:· carboxilase da ervilha.

número óptimo de aminoácidos cie po--processamento será geralmente cie 10 a 30 e. de preferencí··?. de 10 a 20 aminoácidos. A sequência de DNA e g?ra1mcnte introduzida ns fronteira entre a extremidade 3' 'Ja sequência dc peptido de trânsito e a extremidade 5’ cio gene Ja SCD. Pode inserida directamente se estivei disponível restrição conveniente ou pode ser ;risc restrição sintético na fronteir,·· 3’ -5’ . Podem ser adicionados um ou mais aminoácidos a extremidade 5’ da região de codificação da SOD. Na. forras prefereircial de realização, é adicionada uma. glutamina ac gene de SOD. Em outras formas de realização, nm os preferidas, o codão a e r

a.Ig.im local de um local de ι i adicional de glutamina pode ser lewovido! por técnicas conhecidas pelos especialistas, e substituído por um codão (ou codões) de outro(s) aminoacido's ’. õs métodos para a preparação de genes quiméricos compreendendo péptidos de trânsito e aminoácidos de pos-processamento incluem os descritos no pedido de patente nor t e-a.ner i cana co-pendente nQ de série 812 412 de 26 de Setembro de 138b. o qual e aqui incorporado para referência.

A região de terminação pode ser derivada da região i obtida a região de

De preferência a região

3’ do gene a partir do qual iniciação, ou de um gene ditei ent-.

de terminação será derivada de um gene de uma planta, particularmente da região de terminação da psu da ribulose bisfosfato carboxilase da planta do bbaco; de um gene associado com o plasmideo Ti, tal como a região de do gene tml.

Ao desenvolver .

fragmentos compreendendo aberto de leitura, podern so de processamento, tais o<

mutagenese in.......vi tr,o., repz

a. s e	Ol!	ι ds	região de terminação
s s e t	o e	de	expressão, os vários
r e g i	ro -	de	regulação e o molde
u.iei	. z:	a	diferentes condições
ligs	0 5.0	, j -	estricão, resse-ccão,
	o;	’pr	iwer”. utilicação de
utro	s	As 5	im, as transições de
= e r ç	Õ e r	d	eiecções, ou outras,
q u e	- ;	mpr	egue nas regiões de
:„· de	1 e	1 t a	r ·_,..

Durante a. construção da cassette de expressão. os vários fragmentos de DNA serão geraImente clorados num uri!

Obtem-se i nc 1 u i ncio vector de clonagem apropriado, que pernuta. a amplificação do DNA, modificação do DNA ou manipulação arraves da. adição ou remoção de sequências, linkers”. ou czre·?. Normalmente, os vectores serão capazes de replicar-se a fé, pelo meno número de cópias relativamente elevado na. E.cqli facilmente urn conjunto de vectores de ·: lonagem, vectores como a série pBR322 e pUC. a serie Ml 3, etc. O vector de clonagem terá um o.¹ mais marcadores que proporcionam a. selecção dos transfirrnantes. Os marcadores proporcionam, normalmente, resistência a agentes citotóxicos como antibióticos, metais pesados, toxinas, ou afins. Por apropriada restrição do vector e cia cassette, e igualmente apropriada modificação das extremidades, por digestão ou complementação cie extremidades pro ie : r an f e s para criar extremidades cegas, por adição de linkers”, por adição de uma cauda, podem ser obtida para ligar e juntar o vector extremi dades comp1ementares cassette de expressão ou seu componente.

seguir a desenvolvimento da cassette. u c isolado e, quando requerido, η particular da cassette, quanto assegurar que foi obtida a sequência natureza da manipulação. a seciuen extirpada do plasmídeo e inserida nu plasmídeo pocle ser restrirnió: ._· ci do componente cia cassette de eoj.i e..apropriaclo .

cada anrupulacãc do DNA no dec» c- clonado e um componente ue sequência, para rrecta. Dependendo da desejada pode ser e c r o:' i T e r o: ί t. e . o u o uai -se a manipulação , a 1 c o mo f o r ma. i s i 3

.forna:	ão	da E . c o l i.	pe ias	vâri as
1 e o s e	V 1 1	us ' ;.?!?. cl	ona sem	n ã o e
Podem	s e i ·	e tiipregues	a c o n j u	gação,
' O U 0.	t r	o ns foi'mação	como	, po r
cliacla.	o o r	f o s f a to cl e	c á 1 c i o

a tradução, a transfecç exemplo, a transformação

Em adição à cassette de expressão, dependendo da.

forma de introdução da. cassette d? expressão na célula da planta, podem ser necessárias outras sequências de DNA. Por exemplo, quando é usado o plasmtdeo Ti ou Ri para a.

transformação de células vegetais, conto a ·? r a a descrito, pelo menos o lado direito da fronteira e, frequentemente, ambos os lados, direito e esquerdo, da frciTeira do T-DNA dos plasmídeos Ti ou Ri serão reunidos como regiões que servem de flanco à cassette cie exore:

'jtil icaçao do T-DNA para transformar as células ?eselais foi objecto de estudos intensivos e está amplamente

Engi neer i ng , Principies.......and Me t hod · por Setlow e Hollaender, p?es. 22? Ho e ke ma , e m The B i.na ry P i a. n t V q c r >_ ι em

Genet i c >, vo1. 6, ed i t ado

CPienum, N.Y.J; A.

'. em 1 985 edi t ado por Of f setdrukker i j·. Kanters , Εν'?. A11?1 a = a erdo.ni.

Alternativamente, para, melhorar a integração no genoma da. planta, podem ser us,?daa somo fronteiras as sequências repetitivas terminais cie transposões, conjunção com uma. transposase. Nesta situação, a.

da transposase deve ser rnclut ivel p cassette cie expressão estiver integrada ι em e xpressão que , quancto a este Ί a senoma, de forma, relativamente estável, de moclt

DNA.

evi 1 ar 1 to?” de l 4

Ν

Α cassette de expressão sera normal mente ligada a um marcador para selecção cia2 células vegetais. Quando conveniente, o marcador pode ser a resistência, a um biocida, particularmente ura antibiótico, comc· a canamicina, £*41Ô» bleomicina, higromicina, cloranfenicol, ou semelhantes. 0 marcador particular aplicado será tal que permita a selecção das células transformadas do. planto, qua.ndo comparadas com células de plantas às quais falta o DNA introducido.

Existe uma grande variedade de técnicas para introdução de DNA numa célula da planta hospedeira. Estas técnicas incluem a transf cr moção car.: Ti -DNA. empresando como agente transformante o A. tumefaajenç o A.........rhiçppenes, 0 fusão do protoplasto, o injecção, > electroporacão, o bombardeamento com partículas de DNA, e semelhantes. Para o transformação com Agrqbaç t er i uni, os plasmideos podem ser preparados em E. coli , cujos plasmideos contêm DNA homólogo do plasmídeo Ti, part icularmente T-DNA. d plasmídeo pode replicar-se em Agrobacterium por inclusão de um sistema de replicação procariótica de largo espectro, como por exemplo o RK290, se for desejável reter a cassette de expressão num plasmídeo independente em ves cie c fer integrado no plasmídeo Ti. A cassette de expresso^ pode _-er hmisíerida para o Agrobacterium.......tumeíoçiens Troves de um plasmídeo auxiliar, e o organismo tr ensfor ,i: .-dc resultante pode ser usado para, transformar as células das plantas. As células vegetais podem ser quaisquer e1u1ss fotossintéticas vegetais, ou outras em que sejam prados 1das concentrações elevadas do radical supero;; ida.

ó

Quando conveniente, podem ser cultivados explantes corn A,_________tu met aciens ou A.............rhizggerieo para. permitir o transferência da cassette cie exprestãc para as células vegetais, estando estas dispersas num meio cie selecção apropriado. 0 hospedeiro A&rpbj^XerXuin conterá um plasmídeo possuidor cios genes vir necessários à transferência.

Após a transformação, o tecido celular tpor exemplo, protoplastos, explantes ou cotilédones) e

transferido para um meio cie	i ege n	eι oção,	f o i c	o mo o me	i o cie
Murashige-Skoog. (MS) para.	cult	Ll [' 3 d 3	f o c i	cic -cego	tal e
células, até formação de	um ca.	1 o . As	ce 1 u 1	as que	f oram
transformadas podem ser cu	1 t i vo.cl	0 S : 1 ·? o	i i 0 i 11	a r e ιη p 1	antas.
de acordo com os métodos	cο ϊλ v e n	c i ona i -:·.	Con	sulte - se	, por
exemplo, Mc Cormick et al.,	R.ion'..	.....Ce 1.1.......he	icccCc	(198b ’	ó : S1 -

84. As plantas transformadas podem, então» ser analisadas para determinar se o cies·? procluto ..L· gene ccnfinus’ a ser produzido em todas as células vegetai- -_-u so em algumas. Após ter sido demonstrada na planta a expressão dc produto desejado, a planta pode ser cult.¹' ado e pc1 i η i z ad a corn a mesma estirpe transformada ou com estirpes diferentes, sendo depois identificado o híbrido :-u! t .· .> 11 o que possua a desejada caracteristica íenotipicj., rociem ser cultivadas duas ou mais gerações para assegut or que a caracteristica fenotípica em estudo e mantida o transmitida de forma estáve1.

Existem várias técnicos por a. .ie termi. imm se estão presentes as desejadas sequências cie Dhd uc >. e i u 1 o vegetal, e se estas estão a ser 11 a. >.-* c r i t s·· s . -edeu ser empregues r

mRN A técnicas, como a técnica de Morthei detectar o que codifica para a MnSOD. Adicionâliitóiite, a existência de expressão pode ser detectada atrav?-s de urm· multiplicidade de formas. A expressão da MnSíãP em plantas t ransf or macia s·

pocle ser detectada por diversos meios, ir.c	luindo o- ensaio da.
enzima	em solução, a análi	se de Western..	e a electroforese
nat i va	com coloração para, av	al ração ds o_ '.	[Iclade. Para. alem
disso,	podem ser empreguei	a nt r s o n:?-? ·	pos if icos para a

MnSOD madura.

A resposta das plantas transformadas a diversas situações de stress, tais como *' en:.:··;: ·'? t ur j ξ altas or. baixas (enregelamentob deficiência em a. ? , e 1 evade com toudo em metal na rizosfera. exposição a herbicidas como o clicloretc de paraquato ('dicloreto do 1,1 limei i 1-4 > 4-bi piridi 1 io > >

salinidade ou condições favorecedoras de lesão fotooxidativa. ou f otoinibição pode ser medida de diversas manei ras.

f actores

Λ situação de stre acima referidos· - menos um outro factor'.

luminosa.

I:

er apenas um dos mb inação ·_□!« peio . - ' - .-1^ i p +· pi ro £, 5 r] ·£) -I p

As plantas transsénicaa podem ser avaliadas directamente Por exemplo, ;·.·- pl,<n o ' : ...conico : podem se:

avaliadas quanto à sua tole;' i.ncia r e s- i s t è nc i a , em particular, a situações -ie stress i m i . .. somo herb i o i cias e metais; quanto J sua capa·: idade .de : mente ».? presença de concentrações rnais ei-e.rn.j_o :m un somponente tóxica.

quando comparadas com p l -u i'. s s n ss -t r s us sor. i c as - ou com plantas transformadas com outra que não a cassette de

SOD.

expressão que proporciono o aumento de actividade da

A exposição de plantas a condições de stress (consulte-se S . Powlee ‘1984·' 1₃n n u aí Re y i e v............q f.................Plant

Ph vs i o 1 ogy, 35.:15-44.) resulta na 1 n i b iã_W do fotosintese.

Assim, os efeitos de toxicidade do oxigénio o a fotoinibição influenciam fortemente a. fotosíritese. Em condições fisiológicas normais, a íotosinteae o d·:.·!, inicio como o transporte de electrões. vectorial e l o r o s i n t e t i c o (PET).

com a subsequente reduoao cie õ'uo. ~i s u s o e p t i b i. 1 i dade relativamente elevada do Potosist eme ί [ e írequentemente relacionada com uma perda de f 1 ,_:or esc ènc i a variável cia clorofila. Como o PET é ofeoto.dc por -ariaí situações de stress, pode ser usado para -mal loção ' ’ i n situ” cia.

resistência das plantas transgénicas ã.s situações de stress.

Plantas modificadas para produzir niveis superiores cie octivido.de dc- 90D nome m?, p.. n .· o situações ambientais de stress. utilidade :. . : .e! em capazes de crescer sob condições que inibem o o re = o i nome o ola estirpe parental, em particular. :·;·.·!? condiçõe. que aumentou o nivel do superõxido (CA > na planta ícaro niveis- inibidores dc crescimento. Exemplos de t o i o condiç·.'·?- incluem aumento cie salinidade. seca, e ele -ado ou ••eiyrçi. de mu f ο ι : no.

rizosfera. Estos plantas pedem t. uti lidado quando e desejável utilizar herb:idas ..0.10 -· ·> i z cie .nompoatocdi pi r i dí 1 i cos de amónio quo terno : io , p:cu exemplo· paroquato, para controlo de planta; dormnlnas.

A avaliação do -olor ao. _·. ' , Lin do ido ;OIo nao plantas transeénicas também, pode ser u > como um indicado!

8 de deficiências nutricionais cio solo, entendendo-se que um aumento reflecte uma situação cie deficiência indutora de stress. Assim, as próprias plantas podem ter utilidade como indicadores, na colheita, da presença no solo cie componentes indesejáveis, ou da ausência cie nutrientes desejáveis, possuindo os ditos componentes desejáveis ou indesejáveis. a capacidade de afectar a actividade cia. SOD. A resposta relativamente ampla a situações de stress ambiental, devida ao número aumentado de cópias do gene SOD e à utilização de um enzima indutivel (e.g. MnSOD) , proporciona uma indicação de maior confiança do que a obtida com plantas padronizadas.

Os exemplos seguintes são apresentados com fins meramente ilustrativos e não se poclem entender como

1i mi tat i vos.

E xper i mentaçao

Foram usadas técnicas '! c boratoriai = padronizadas de restrição, ligação, transiormaç-o e analise (Maniatis et al . , (1982) Mo lecular........Çlqni.n,g_;.........A. Labor ator y Maneia. 1 , Col d

Spring Harbor Laboratory, lie'..· York ' Foi preparado um molde sequência do DNA

Câncer Langer et........ai . , Proç_...

¹ . 0' DNA de cadeia de DNA de cadeia simples e deter mi. ns.ck usando a técnica de didesoxi de

Na_t.’_l..._........Acad...Sc i... USA (19 7 7 dupla foi sequenciado usando a. técnica de Maxam e Gilbert (1980) Me_thpd5.......EnzjÍlSSXx. 65:499-560’. A analise da. sequência foi executada. usando um conjunto de programas para computador produzidos pela I n t e 1.1 i Gene t i c s Inc.

Os vectores cie elonasem .isacloc- incluem vectores '9 pUC» pUC8 e pUC9 (Vieira e Messing. Gene (1983) 19:259-268 ) , pUC18 e pUC19 (Norrander eta1. , Gene ( 1983 26: 101 -106;

Yanisch-Perron et al,, Gene (1985' 33:103-119½ e vectores análogos, trocando a resistência ao cl.oranteni.col (CAM) corno marcador pela resistência, à ampicilina dos vectores pUC acima descritos (pUC-CAM [pUC12-Cm, pUC13-Cml Buckley, K. , tese de Ph.D. , U.C.S.D. , GA 1985). 09 múltiplos locais de clonagem dos vectores pUC18 e pUC19 foram trocados com os do pUC-CAM para criar os pCGN555 e pCGN566. que são resistentes ao CAM. Os vectores fágicos usados incluíram o M13mp8 e M13mp9 (Messing e Vieira, Gene (1982'’ 1.9:269-276) e o

M13mpl8 e M13rnpl9 (Norrander et........a ' . , supra.; Yanisch-Ferron et al., supra).

E xemplo.......1,

Purificação da suiaeróxiclo......dismutase.......e.......produção_______de.

ant. Í...Ç...2..DP.2..ã

A manganês superoxido dismutase (MnSOD) foi purificada a partir do íq. c o l i Β, que foi cultivada sob condições destinadas a induzir a produção cia enzima (ΙΟΟμΜ Fe904.7H20, ΙΟΟμΜ MnSOq, 100 piM 8-hidroxiquino1ina. 10 μΜ met i 1 viologénio ) . 0 esquema de put '. 1icação foi baseado no de Keele et a_l. , J . Biol. Chem. ( '1 9O ’ 245:6176-6181 . A actividade cia enzima foi monitorizada com base no ensaio descrito por Misra et al . , Are!... Biuse he m, Bi p.phys. (1977)

181:308-312. A enzima purificada foi Liofilizada a ck para a produção cie anticorpos. Uma. vez que podem acontecer reacções cruzadas entre o anticorpo prepo.ra.clo contra a MnSOD a MnSOD bacteriana e a MnSOD presente nos c1oropias tos, vegetal e a bacteriana, destinadas ã analise de Western, são separadas num gel de separação isoeléctrica ou usando um sistema normal de gel de SDS.

Sucintamente, foram isolados cloroplastos intactos a partir de folhas de tabaco, usando um protocolo de isolamento como o descrito por Jensen etal., ProcNat’1.

Acad,Sei.USA (1966) 56:1095-1101. Os cloroplastos foram então osmoticamente lisados por ressuspensão num tampão de extracçâo contendo 100 mM de citrato cie sedio, pH 5,5, 10 mM de EDTA, 150 mM de NaCl, 0,057 f v / v ¹ de Nonident P-40.

mg/ml de ASB, 1 mM de DTT, 10 mM de tioureia e 10 μΜ de leupeptina. As amostras foram então submetidas a.

imunoprecipitação das proteinas responsáveis pelas reacções cruzadas, usando bacteriana o antisoro jara a SOl purificada, tal como segue. Foi adicionado a 1 ml do líquido sobrenadante 25 μΐ de antisoro e 125 μΐ de S......._aureus (células desidratadas pelo trio), incubadas à temperatura ambiente centrifugadas a 3000 x s durante 5 minuto· e o obtido foi lavado duas vezes com 20 mM de Tris, pH de EDTA, 50 mM de NaCl e 0,057 iv/v¹ de Nonident P-40. A proteína precipitada foi ressuspensa e desnaturada em tampão

A s s mos t r as for am urante 45 minutos,

5, 1 mM de electroforese (Anderson

Anderson, Proc. Nat’ 1. Acad.

Sei. USA (1977) 74 : 542 1 - 5-125 ' co:r.?

is·/'/? cie SDS, 27 (v/v) de Triton X-100, 57 ner-, apt oetano 1 , 207 (v/v>

de glicerol e 27 (p/v) de LKB Amphoiin.es ¹ pH 3,5 -IC’. A uma.

arnostra foi adicionado •;Ie MnSOD purificada, de ,í,·

No método do gel de separação isoeléctrica, as amostras ureia, a 500 V, num gel de poliacri1amida

r i c		em 9 M	de
, T	7	c o m 1 , 5	mm
3,5	- 1	0 ) a 0	,CC
amo	s t	ras for	am

separadas usando o sistema típico de 303-PAÕE para Westerns, como exposto no Exemplo 8.

As proteínas separadas foram transferidas para nitroceiulose (BA 85 da Schleicher e Schuell)· como descrito por Burnette ( Anal . Bioc heru. ·’1381 ) Π 2 : 195-203), a 100 V, durante três horas numa unidade de transferência Hoefer TE

42. 0 filtro de nitroce 1u1ose foi então incubado em Blotto durante 1 hora à temperatura ambiente, seguindo-se uma incubação de 12 horas a 4^ώ0 em Blotto:antisoro a 50:1. 0 filtro foi lavado durante 10 minutos com 20 mM cie Tris, pH

7,5, 150 mM de NaCl, durante 20 minutos no mesmo tampão contendo 0,05’/. de Tween 20, e durante mais 10 minutos em tampão sem detergente. Foi então aticionado ao filtro Blotto η '1 ° n , - - .

contendo 10 cpm/ml de proteina n marcada com i . ημοi/mg; NEN) e fez-se a. incubação ã tempera furo ambiente durante duas horas. 0 filtro foi então lavado durante 12 horas em mM de Tris, pH 7,5, 1 M de NaCl e 0,40. <p/v ’ de Oarkosvl.

Após terem sido enxaguados e secos, os filtros. foram expostos, durante 24 horas , ·., 7f Ό . ;· nm filme cie raios X

Kodak XAR, usando um écran infensificador DuPont Cranex.

' D

Exemplo.......2

Subclonagem......e.......sequenc lação.......dg ....gene......de.......MnGOD

Foi obtido um eene de MnSOD <codA’ d?. E..goli R12, por Danielle Touati, no plasmídeo pDT'1 -5 (Touati, J_L

Bacteriol . (1983 ) 155: 1078-1087 . G plasmídeo continha um fragmento de restrição de EcoRI/BamHl, de 1,8 kb, do DNA genómico da. E . col i , A sequência nir 1 eot ι di ca do gene da SOD foi já publicada (Takeda e Ávila., Nuc J.......Acicís.......Res., (1986)

14: 4577-4589 ). Uma sequência nuc 1 eot l dica obtida autonomamente em Calgene a partir cto pDTl-5 e idêntica a descrita, excepto no que respeita a um resíduo C, que surge em lugar do resíduo T publicado, no terceiro nucleótido do codão #58. Este facto cria um Local adicional de restrição da Bell. Foi subclonado um fragmento de restrição de

HincII/BamHI, com 3,5 kb, do pDT'1 -5 , no !118mp8 restringido pela BamHI e Smal, para criar o pCGN1300a.

Exemplo.......'

Cr iação......de________um loca.l cieres t. r i ç ão cia 3ph’ oura inserção de uma sequènc ia' ’ i ea de r ’ ’.......do.......c lo r o pia s t p .

Construção......d o.... pÇ G N I 3 a 3 .

Um DNA de cadeia simples do clone pCGN¹. 300a foi submetido a rnutagénese in vitro ''Adeiman et al₄„. DNA (198-3) 2: 183-193 t para inserir um local cie restriç ão da Sphl no codão de iniciação do gene da. MnGOD, aendo sintetizado o o 1 igonucleótido 5’ -GCAGGGTATAGCTCTG,/.ATCCATTGTCGCGCCCCA -3¹ , de 35 bases. Após a rnutagénese ir, y..i..,t..r.c , foi seleccionado um clone pCGNl303 e a sequência cia. região que sofreu mutagénese foi confirmada pela sequenciação. por Maxam e C-iibert. do local de restrição cia. Nç.p I . situado a 68 nucleótidos cio codão inicial cia SOD. e pela -c-ubc Dana gem cio fragmento de restrição do pCGNl303 por Sphí/BarnHI no Ml3. com uma sequenciação subsequente, pelo método cie clidesoxi cie Saneer. A mutagénese i n vitro . p a ι - '-· :< cl i :: i cn o r o loc a 1 3 p h I a extremidade 5’ cia SOD. adicionou um aminoácido (. gl ut a mi naO à região codificante.

Expressão da MnSOD al teracla.......num......mut ant e.......SOD

Para investigar o efeito do aminoácido extra na actividade da SOD, o fragmento de restrição do pCGNl303 por

EcoRI-Hindi II, contendo o gene SOD e o seu próprio promotor, foi transferido do seu suporte de M13mp8 para o pUC19 que fora digerido com EcoRI e HindIII ro.ra originar o pCGNl309. 0 pCGNl309 foi então usado para transformar uma estirpe de E. co 1 i SOD . similar à cio mutante duplo 'MnSOD e FeSOD ) descrito por Carlioz e Touati. EMBO1 . !986 · 5:623-63?. n actividade da SOD foi detectada ro; celular SOD transformadas pelo pCGNl '309 através da electroforese de extractos preparados como deacrito por Touati. J ·. .liacter io.1... <1383) 1_55 : 1078 - 1087 , em seles cie po I i a c r i 1 ami da. nãodesnaturantes e fazendo uma coloração para avaliação da actividade (Beauchamp o Fridovich. Ara 1. B. i oçnem. < 1 9 7 I )

44:276-287). Não foi ver i f i ca ? a. qualquer actividade detectável nas células SOE¹ Isoladas ou quando transformadas com pUClS. As células SOD transformadas com pCGN1309 ? Λ «_ -i evidenciaram aproximadamente o mesmo valor de actividade, 1 unidade/30 pg de proteína total, que as células cie E.coli

7118 (Messing et.....al . , Pr oc ..........Nagj l.......Açaor.........3 c i ,...............USA ·, 1 'à77

74:3642-3546).

Exemplo4

Construções.......de......expressão cia Mn8CD.....para ciirecçipnamento para........o.......cloroplasto é necessário que os sinais de expressão cio gene da planta (sequência promotora e 3’ ) e uma sequência leader sejam adicionadas ao gene bacteriano da MnSOD para, que o produto do gene seja expresso e transportado para os cloroplastos da planta.. Um vector binário denominado pCGN1332, contendo as sequências promotora e leader” da psu da ribulose bisfosfato carboxilase (RuBPcase) cia planta do tabaco, o gene de MnSOD e sequências 3’ reguladoras da psu da planta do tabaco com um marcador, para selecção da planta, de resistência à ca na mi c i η·¹ , tol construido como se

segue: um fragmento de restri	Cãr. -ia.	EcoRI. de 3,-	1 kb,	do
clone lambda. TSSU3-8 (0’Neai et	.....a 1 . . N	luc , . Aq i ds.....Re ;	?. 1 1 98	- ,
15:8661-8677), contendo um gene	c oc i fi	cardo içara a	RuBPca	Ξ· 6?
da psu da planta do tabaco,	i o i ?	ub:lonado nc	M i 3rnp	1 8
digerido com EcoRI para cr	i a r o	plasmideo 2(	:> 18.	As
sequências promotora e leader	da ps	u cia planta, dc	; tíjJoS.	c o

foram retiradas do plasmideo 2018 poi digestão com HindIII e Sph I e ligadas ao pPMG72 digerido con. Hi nd I I I /Sph I (como descrito no pecliclo de patente nort e - a.me r i c a na co-pendente nÇ de série 097 498, de 16 de Setembro de 1 38. pedido esse que aqui é incorporado para referencio;, para criar σ pCGNEDO. 0 pPMG72 contém as sequências ”leader” da carlwxilase ds soja ligadas a um gene aroA modificado. No pCGNGoO. a sequência ”leader” da psu da soja e substituída pelas sequências promotora e leader” da psu da. planta do tabaco.

gene aroA foi substituído, no pCGM650, por digestão com Sphl/BamHI e ligação ao pCGNl3O3 digerido com Sphl /BamHI . O plasmideo resultante, pCGNl304, contem as sequências promotora e leader” cia psu do tabaco do TSSU3-8 e a região que codifica para a MnSGD. Foi adicionado um sinal cie pol iadenilação ao pCGN13O4 digerido peia EcoRI, através do isolamento e ligação de um fragmento resultante da digestão parcial do pCGN632 pe,i<. EcoRI. 0 pCGN632 contem um fragmento de restrição cic TSSU2-2 peia Hae I I I , com 1,6 kb (0’ Neal et al.. (1987), supra). adaptado usando linkers” de Sal I no pUC18 digerido peio bali. 0 fragmento cie restrição da Hae Ι Ι I completo inclui 123 nucleótido-: do exon 2, intron 2, exon 3, o local cie po 11 adeni lac ão e 1 kb desde a extremidade 3’ até ao local de po11adeni1ação de um gene da psu do tabaco. A construção de expressão contendo as sequências promotora e ”leader” da psu do tabaco, o gene mutante cie MnSOD e as sequências 3’ da psu do tabaco e designada, por pCGNl305,

ΓΊ	gene de MnSOC1 contiru r,a.	c ons t rução	inicial,
pCGNl 303., e	a construção de exore;.não.	oCGN I 305 ,	c o n t è m	o
gene completo cie MnSOD desde o codão A	TG i n ic ia 1	l 5Ϊ13.1 5	um
ami noác i do	extra) até o codão de paras·	em do gene,	e 0,8	kb
cie região	3’ bacteriana não traduzido	P o. r a e 1 i r	u nar u	ima

Ά * grande parte das sequências 3’ não codificantes bacterianas» foi executada a mutagénese in vi.tro do pCGN1303 de forma a.

inserir um linker contendo locais de restrição de X.bal ,

BamHl e EcoRI» 18 nucleótidos a jusante cio codão de paragem. 0 ol igonucleot iclo 5’ - ATACGCCTCATG AATTCGG.ATCC 7GTAGAGCAGCAGGC GGC-3’ , de 42 bases, foi usado para executar a mutagénese, e o clone resultante é o pCGN132d. A longa sequência de MnSOD contida na construção de expressão pCGNIÕOã foi substituída pela sequência mais curta de MnSOD, do locai de restrição da

Sphl (no ATG) para o novo local oe re·;	Zí-içào da. BamHl, a
jusante do coclão de paragem, a.través cia	digestão cio pCGN1329
com Sp_hl e BamHl e ligação ao pCG! 11 i’.’G	digerido com Sphl e
BamHl, para criar o pCGN1331. 0 pCGNldi	:· I foi d i ger i cio pe 1 a

HindIII, de forma a linearizar o plasmídeo, no unico local

de restrição da Hind I I l , situado ne	e xtremidade 5 ’ do
promotor da psu do tabaco, e o pLasmidec	completo foi ligado

ao vector binário pCGN7<33 digerido pela HindIII , de forma a criar a construção pCGN 1332 · para ;· construção do pCGN733,

veja-se o pedido de patente norte ameri	cari? co-pendente n2
de série 078 538,'· de 28 de Julho cie li	Z7 , o qual é aqui
incorporado para referènc i ? 1 . 0 ••ectot	pina rio inclui as
fronteiras cio T-DNA < fronteira esquerc	! v , L B e f r o n t e i r a
direita, RB), as quais delimitam o DMA v	r.;e -ora trunsierido

para. a planta, um marcador bacteriano (resistência a

gentamicina’· s um marcador seleccionáv	ol ds planta, que é
co-transf er ido j untament com o o-	v-- cie interesse,
consistindo de um gene de resistencis o	csnainicina expresso
a partir cio promotor constiG.it> vc do i r	-o. idi do mosaico ds»

Q '?

couve-flor, e de um sinal dc- 3’ -poliadenilação do produto de clonado em qualquer restrição da HindIII do pCol orientação tal que o genc-

içrobact er i	,ιω.	!d oCCN	H 33		pode ser
duas ori	e n t	ações	no	1	ocal de
pCGiruã õ .	Ι'	põõN í 3 3	·—Ϊ	rj	ta nurna
MnSOD e		ene de	res	i =	tência a
em direcções	o pos- tas	•
ia segunda	C O 11	s t r uc ào	de		xpressão
o . Ν ε s t c c	ons	t rução,	pC	GN	1323, o
. partir do	pr	o mo tor	co	ns	f itut ivo
•uéneia ”le	ade	r'1 da p	Ξ Ll	dc	f ei jão
namento p	•3. 3	o c 1	oro	pi	a s t o . 0

pCGN1328 foi construído como segue: o gene mutagenizado cie MnSOD na construção pCGN1303 foi combinado com a sequência ”leader” da. psu do feijão d SphI e BamHI e da ligação ja., através da digesta· c<Gli 350' dl cer ido com

Sphí

BamHI, para criar o pCGN!3dõ. 0 plasmideo pCGNÕbO cantem a sequência ”leader” da psu da ribulose bisfocfato carboxila.se da soja e foi construído como segue: o, plasmideo pPMG70 (descrito no pedido de parente no. ta-. mar ícona. co-pendente n2 de série 097. 498, de ! b de 'Setembro ole 1937) foi restringido pela Dele I c r i aram - se -1 he extremidades cegas· através do fragmento de Hlenoa du digerido com BamHI, e foi isolado o f psu. 0 fragmento foi ciciado no plJC8 gene ”1eader”/MnSOD da s clonado na cassette de expressão pCGN por digestão com EcoRI, complementaça

DNA polimerase I e restrição pe1 a BamHI

DNA polimerase, foi

- a emento do promotor da .-•arfado por '5maI /BamH I .

,i j a da pcGN 1 30E , foi :'3Õ^: s seguir descrita ' a a - u ai emi aasie s pelo f r a g me n t o ligado ao pCGN985, que fora digerida com pela DNA polimerase I e digerido clones contendo ambos os locai;.

EcoRI> regenerados apos a ligação que não continham nenhum dos

Xbod , complementado om BamHI. Fors.m isolados

..Ie ros-rição cia Xbal e çpoádiI303a. > e as clones

Loesis de restrição (pCGN1308b).

pCGN986 contem um promotor cio vírus 35S do mosaico da couve-flor (CaMV?5S) e uma região 3’ do gene trnl do T-DNA, com múltiplos locais de restrição entre eles. 0 pCGN986 é derivado de outia casse te . p ” 3N2dt. , que· contem um promotor do CaMV35S e uma região 3’ diferente, s. extremidade

3’ da i	região dl	do	CaMV. í? promotor <.	;!o Cald 3 ã d foi cl	orado.
sob a	forma de	um	fragmeidc cie rc u	i; ao cia Alui 1 pb	7 1 4 4 -
7734 )	(Gardner	et
_____a l . , ibp .1...... rlC 1 \ m.....	ne _ . l ã o l c :	dl d , i -
2888 ) ,	no local	de	restrição cia Hin-d	II cio Ml Gmo' Máe s s	i n s e t

al . , Nucl. Acids Res. (' 1 9 3 ! · 7: 3''9 32’ para criar oC6!4. A

digestão	cio CB14 com	E 3 O R ί ρ:' Q Z! Ll 'o I
restrição	do CS14 pela	EcoRI contendo
foi c1 ο 11 a	do no local de	re s 1 i ; . á>;,· da· Ec
Me s s i n g,	Gene (1982) 19:	259 3 produz inc!
	0 pCGN148a,	contendo uma.
marcador	se 1accionave1 1	K AN o o m u ais Λ'

um fragmento o promotor 359. cR! dc p'JC‘3 ' die ir .· a pCGNl-17.

cg ião promotora, e uma resrião de que a e foi preparado através da digestão do pá inserção cio fragmento de resfriçs.' depor BamH1/BgliI. Este fragmento ioi restrição da Bgl I I do paá-Nááa , d- : a ί restrição cia Bg l II se encontre ra ·' 1 c resistência a canamicina do pCCN528,

de cie cie d

Ο vector de vai-vem usadc i.ar pCGN528> foi preparado como z digerindo ura plasmídeo contende resistência ã. canamicina t .Jor.t (1979 ) 127.: 65 ) , com Hindi l I /BamH ί , o de restrição de Hindi I í/BamHI ,

3.dC l.mdl d?	· - < H 7,	sonstrução,
ue: prepat	* o U - S a	o pCGN525
Tn5, que	a. L o j su	um gene de
- o n e t ο· I .	Mo 1	.Cen,Ge ne t .
I , o iro e r	diclo o	f r a.gme n t o
I . conte:	5 d O	-ene de

res t r i ça o

Hindi II/BamHI do gene da tetrac1c1ina do PACYCI84 (Chang e

Cohen, J. Bacteriol. (1978: I	3 f : I 1 -I	I - I I	o 8 ’f	0 DC	GN	526 foi
preparado inserindo o fragme	ntc ale	r o	>- id ç ã.	o 19	cí	o pTiAG
Del a BamHI íThomashow et al	: d	u	198«)	i ! 3	, 7	23 - 739 d
modificado com ”linkers’’ rie	X ho ’	i It - e	r i. do 3	! 'i O	1	oc ad de
restrição da Smal, no laça	1 ?. r?	re 7 h	i' i. ç ão	da	d	amHI do
pCCN525. 0 pCGN528 foi elidi	dc pe L	a d	e 1 c ç c	ào d	Q	pequeno
fragmenta de restrição de pC	GN526	pe i a	Λ itO	I . 3.	tr	a. ves da
digestão com Xhol e re-li gação
0 pCGN149a foi prepa	r ado ρ	or	I onac.	em dc	-	r a g me n t o
de restrição. pela BamHI,	dc g	•2 ! ie	Je	r e s i z-	t A	ncia ã
canamicina do pMBGKanXXI , nc I	ocal d	P t ’ 3	c f r i ç	ãc da	B	a mH I no
pCGN14Sa. 0 pMB9K'anXXI e uma	V 3. Γ Í 3	n t <?	dc pU'	71H	1' 1 f	: e ί r 3 e
Messing, Gene (1982) 13:259-2	38 ' qu	e : a 3	0 O O £	:> 3 L õ	i	o c a 1 d e
restrição da Xltql, mas que	- r -j [d f ’	cm.	·- e ! Ί o	f un	c i	tita I de

cr m: t i r resistência, á canamicina do 7tt9G . de ra-j!

selecção eficiente em Ag.r ς· ο a c t e r i.uni pCGN149a foi digerido cora ri.it ligado ao pUCS digerido cor. Hincll li e BamH pCGNlS3. Este procedi mento !é:ioreu o ma:

do Tn903. 0 OCGN565 e o oCGΝI63 foram íIícoí e BamH I e produzir o ç- na mieina cm HindIII u rn e PstI, sendo então ligados para formar o pCCN203, plasmídeo que contém o promotor rlo <IaMV353 & parte da. extremidade 5’ do gene de resisfeeoia á onamicina do Tn5 (ate ao local de restr ição da Pst ; Jorgensor. et..............al.. (1979), supra) . Foi adicionada uma região 3’ reguladora do pCGN204 ao pCGN203 (um fragmento de reafrição do CaílV pela EcoRI, pb 408-6105, contendo a região V! 3’ clonada no pUC18i Gardner et....._a,l. (1981 >, supro t s - vés da digestão com

HindIII e PstI» e ligação. A cassette resultante, pGGN206, foi a base para a. construção do pCCHGra.

As sequências 3’ de gene t foram subclonadas no fragmento de res

Bam 19 (Thomashov et......ai. ''13:30-, s . pn fragmento de restrição de Ba mH! 'E. f^;d al·? T-PÍTA do pTi AG .ção do T-B9A peia sol? o forinG de um iclootidos 9062 a 12

823, nu mera:? d	c segundo Bar!:	.er et a. 1 . , r I	pç.......Mal	...33-1 V·	( 1 982 i1
2:335-350) e	combinadas	c o m a ? r i g e m	de	e p 1 i s	ção do
pACYC184 <Clo	ang e Coher. '	1987' aorpr	so!? a	f orne	de sim
fragmento de	restrição- de	Es oR 1 .91: nd 1 1 I ,	3' COI'li	OITU tr	á.rcãdor
de resisténoi	a a gentami s ir	- dr plamnle	o pLidl	: · s la t	ido de
L . E i g u r s k i ’	, sob’-a forma	de um fra.sment	o de	res·ri	;; 3 o d e
BsrnHI/Hindi I 1	, para produzi único local ú	: o pEGNll d st re s t r i ç ão as	gra, i	de	pCGN417
fnucleotido 1	1207 do fraeme	i i f de r e a t r i ...	so pe 1	a Bae.d	'? f c i
t ransfer i do	para um loca-	1 de rs/úc/.?	-a da.	das I	assando
” 1 i n k e r s ” , e	o fragmenf:	de nrsm ro?	.it? &3.	mHI ''da	ç - f o 1
subcIonado no pCGN565 na	ra ?ria. o :d ,	99 “ 1 .	0 i o	aa de

restrição da. Ba.mHI no peGNÕ .•ansferido para. um loca. 1 nkerã’. 0 f ras men to de de restriç da EcoRI restrição por EcoRI/Saç! resultante, contendo as sequências

3’ reguladoras do gene tnt 1 , foi leunidc	ao pCGNEOo através
de digestão com EcoRI/Saci, para criar c	pGGN975. A pequena

porção do gene de resistência a canaraicina do Tnb foi delectada da extremidade 3’do promotor cio CaMV35S, por

digestão com Sa.ll e Bgl II criação cie ex	tremiclades cegas, e
ligação com ”linkers” de Sal I . A cas	set te de expr essão
final, pCGN‘386, contém o promotor do G,	aMV35S seguido por
dois locais de restrição cia Sal I , um lo;	sal de res t ri o ao de
cada. uma. das enzimas Xba I · BamHI , Smal e	Kpn: , e a reeião ?·’

do gene tm.1 (nucleótidos I ! 20 7-9023 do T-DNA

A construção de expressão do í	iaMVGgã com. o gene
MnSOD/'Ίeader” da soja, pC'GN’1 308b, foi	transferida. para uru
suporte de resistência ao cloranfenicol	•tatu' t por inserção
no vector resistente ao cloranfenicol. ι	cSGNGbG, nos locais
de restrição da EcoRI e Hindi ί I p ?ra cri	Lar o pCCNI312.

Semelhante ao pCCN!305, : ccnffrução de expressão

da psu cio tabaco/MnSOD puGN13!2, corda	o gene do MnSGD
completo e uma longa regiã- 3’ rã'.. 1 ra	J'.i/ l· í!í? -, b-3 C a 6 í~ I .
Para remover a maior parte da região 3'	não traduz ida, c
pCGN1312 foi parcialmente digerido pelo í	3C1 I , complemente
digerido pela. BamHI e re-ligado.

A digestão parcial foi necessária porque o pCGN1312 contém três locais de restriçãc da BG.I.I um r.s

região codificante do clone do HnSOD, ur:	na região 3' não
traduzida, situada a 95 pb do codão de	paragem, e um no
fragmento 32 cie poliA do gene t ml . dm r I	one em quo apenas
foi identificado, pela sua dimensãc e oac	; r a o d e r e a t : c c a o · o

fragmento 3’ não codif icante da MnSOD ba.c t e r i ana resultante da. restrição por BC.il/BsniHI, foi dasignacio por pCGN1322. 0 pCGN1322 contem o gene cia MnSc-D completo e apenas- '35 nucleótidos da sequência 3’ não codificante. 0 pCGN1322 foi clonado no vector binário pOGN783 pot digestão ao nível do único local de restrição da HindIII e ligação ao pGGN783 digerido com HindIII, 0 pCCN!328. o vector binário final, contém o gene da MnSOD aue -era '· i a ι isc r i r o na mesma direcção que o marcador .- e I ec o 1 onàa/o I oe resistência á canamici na.

f oram (Ooms

Os dois vectores binários introduzidos nas estirpes de et al . , Plasmicl ’ ! 832 ’ 7:15 pCCHI 328 e p

A. torne façiene

Sl ’ e K91 (a

ΟΝ I332.

LBA4404 seeuir descrita), respectivamente, por t: s ns f or ma.

uma cultura de 10 ml de ΑερρΙιρρΐρρίυπι, a horas, em caldo de cultura. MO 2

Nester , J_,.Bacter.iol (1980’ 1...4..4 : '7 3 0 -I ;

sua. diluição para 100 ml com caldo cie cultura, a 30°C, num incubaclot de agitação

As células foram '· centrifu.sadas, para a”pellet”, a 4000 rpm durante 10 minutos. · ressuspenso em 1 ml de MG/L, sendo entoo a-, congelado (-70*0 em aliquotas de 208’ al.

Poi colocado -apr suxi nadament e pla-smídico <pCGNl328 ou pCGNlãa - ¹ em a.

ção. Poi cultivada

3ⁿ’C, durante 12

Garfinkel e lo?-se, então, a cultura MG/L, e , durante 5 horas.

o iate nção de um e ”pelief” foi o Lo. solo er:. selo ou

DNA cultura MG/L ’cerca de .le células de

ASO. °.bã.£Í!ã.G.Í HM no estado de competência faia num tubo e imediatamente conseladas rum banho de o e i. o seco etanol, durante 5 minutos. 0 tubo foi descongelado num banho de agua a 37*C, durante 5 minutos, e ad ι c ι oraram - = e 2 ml de caldo de cultura MG/L às células,. A cultura foi colocada a

30°G, num incubador de agitação, durante très horas. As células foram semeadas em MG/L conter mg/1. Foi isolado o DNA plasmidico individualizadas resistentes a genta miciηa> para transformação de E.çoli e analise por enzimas de restriçàestirpe EHA101, resistente t gent<

intactas cio pCGN1328 ou pCGN1332.

Exemoio 5

a f endc	g e n t a m i	r- r· r,	a 100
c	!...u tir	(I-	ό1oni as
o mi c i	ns , sons!	C S s t	e usado
st r c ι	erixadc	a t r et	ves de
, par	a ’ · c r i f	i c a r	que 3
m i c ί n	3 t C O 1 j t	i n! ia	cópias
ι ameη 1	O ijO.íOj. O	c i 1 o	is ias mo.
mi de o	para expres	são da
. corno	—. θ IJ co	c g	ene ds
lã ,!C :	crifs) f	Ο ί i	nser i dc
1 i n a	j t ;*y’/βn	da d	igestão

H indI I I e com Hindi fl e Sjphl e ligação ao sdl 13 digerido com Sjqh I . 0 plasmídeo 'resultante, pCdtillGs, roí entes com Sall e BamHI e ligado ao pGGNIGO-la ‘coíuio .is-ri to' digerido com Sai I e BamHI para aerar o pCGNllGE·. Tal procedimento substituiu s sens HnSOr-fleader” ds soja, proveniente ds pCGN'13O8a, nela versão encurtada do gene ds

MnSOD 'corri apenas 18 nucleótidos ds sequência 3’ não codificante bacteriana d ·? gene cia MnEOD nc pC0N136£ e flanqueado seis promotor ds ·. jM1'3‘oG e pelas cequénc ias de pol iadeni 1 ação cio gene ttr.l ds T-DNA, de farma a constituir premo cor cio uma cassette de expressão. As sequências 3’.

CaMV35S/MnS0D/tml, foram transferidas para um suporte de resistência ao cloranfenicoL atrauss da digestão do pCGN136b com Hindi I I e EcoRI e ligação ac produto cie digestão do pCGN566 com EcoRI e Hi ndIII, para criar o pCGN1367. 0 pCGN1367 foi clonado no vector binário pCGN783. no único local de restrição da HindIII, atracas da digestão com

HindIII e ligação ao pCGN783 digerido ociií HindIII. 7ⁱ vector binário resultante, pCGN1371, contem a unidade de transcrição da SOD na mesma orientação que a unidade de transcrição da canamicine. 0 pCGN'1371 foi usado para transformação cia estirpe ESI de A. ty ine t ac i e ns. s como descrito abaixo) a qual será co-cultivada com discos de folhas de tabaco.

ExemploE

Ç.on s.t_r Liça qda estirpe......HE! de Agr pbac t er 1 umdes ar medo

Cp ns.tr yç se do qC G N b 3 7

As regiões de fronteira, esquerda e direita, cio

plasmídeo Ti p7iA6 (Garfi	,nke	i, ;.	Baci. 133 8 3 1 1	4 4 : 7 3	2-743 i
foram ligadas no pUCS. 0	p 1 s	s m i cl e o	resultante, põ	GN50 3	, t e m
a. região de fronteira		'.;·=} Γ ·_*! £·	ci a. ί : a se 3 3 b a.	?? 1 ,	A
fronteira direita da base	I 3	7 H c,	1 5298 ' usando o	s i st	à ΠΊ3 d £
numeração de Barker e.	+·	al . 1	fundidas na		n t 3. C 3 o
conveniente e flanquead	as	pe 1 o;	Icc o ic de re	.— Η » ϊ .··	ão ds
Hincll II. 0 fragmento de	re?	c t r içá	cio iC'_U'Hb<j3 pe	1 a H	inc! I 1 ‘
foi transferido para o c	Ο Ξ IiL	idec p	VCE102, de larg	3. £ ç?.	ru3. d£

hospedeiros i Enauf , Plasmicl ¹ 3933 3:43-b4', inactivando o locus de resistência à canamicina deste olasmideo e o r i ando o pCGN506. 0 pCGN567 foi preparado ligando o locus de resistência à canamicina do plJC4K (Messing, Gene ¹ 1982) 1.9:269-272) ao único local de restrição da BamHI entre as duas regiões de fronteira.

Construção.......final......da.....K‘.

pCGN567 foi introduzido na estirpe A722 de Agrobacter i um (que contem o pT: ,-\6 a r f i n Ice 1 , J.,.Bac t .

(1980) 144:732-743), oor transfornaçào 'Holsdor: ef.

Mo l.. Ge n...0e.net . ( 1978)) e selecção basends na. resistência ã canamicina. 0 plasmideo pPHlJ 1 «Hirzch. Plasmid (1984 >

1.2:139-141) foi introduzido por conjugação (Ditta et......_aL·.,

Proc.Nat'1.Acad,Sei.USA (1980) 77:7347-7351 '· e as colónias de Agrobaç t e_rul u m foram seleccionadas com gen t ami c i ns. e canamicina num meio cie conservação, ume -ez que o pCGNõí· e o pPHlJl são plasmídeos incompatíveis, a selecção pare·, ambos os marcadores resulta em colonias de crescimento muito lento, jã que os dois plasmídeos ''ordem ? sofrer segregação para duas cél ul as-f'i 1 has diferente que ocorre com baixa frequência homólogas cie fronteira dc pGGfdõG e :i. pãiAG. i ·? .· 11.1 c· n.-, dos oncoaenrr ui dup 1 .a recombi nação · as duos regiões e :i. ρ , i nu .

pTir,G pelo ie o pTiAP csubs t i t ui ção resistência à canamicina.

unidades de replicação c contendo o pPHlJl e c relativamente depressa gentamicina. A construção c pPHlJl são .•ucc ,· recombinante

I e s a r ma d o c r e s c e m m c an umi c i na. e mc

Sh três

A estirpe K61 pode ter resul todo de uni processo em passos, como evidenciado mela Figura 1. Uma vez que o » homologo cio aaiicina do pVCK 1 02 · uma faria a. de Leeção da gene de resistência Δ cano mi o 1 na '.lo pUC-lK locus inactivado de resistência a e recombinação interna no pCGNõC⁷ região de fronteira direito lEb Pela introdução do pPHlJl, o plasmideo delectado poderá recombihor - se com a região de fronteira esquerda do pTiAb 'F >, estabilizando deste modo o locus de resistência â canamicina, embora a presença da unidade de replicação pCGN567 no pTiAt recombinante ainda desestabilize replicação do pFHÍJl , retardando o crescimento ate que uma delecção espontânea remova a unidade de replicação pCGN567 (G). No oo.so da estirpe K61, a delecção espontânea removeu, apar;ntemente, não apenas as porções que codificam a incompa11r;1idade do co - integrado. mas também os oncogenes e reziie· adjacentes. Foi feito um depósito da estirpe Kb 1 no Ameri.oi Tj sulfure Collecfion em 20 de Maio de 1987 e foi-ihe atribuído um numero de acesso ATCC 53621.

Exemplo.....7

Tr a nsf o r maç 3 c de p l a n t a s .io s abac p

Foi executada a t nane f ormaç ão io plantas do tsbacc· usando Aerobac terium contendo o a nuTrussus pCÕNl 32? o· pCGN'1332, tal como descri fo em 8ceu. 1 et si,.,. Nature ^: 138-5' 3.1.7.: 7 4 1 -7 44 , sendo esta publica·:! j aa.,e incorporada para referência.

õ

E ;<empl q 8

Anál ise.......qia......act ividade......cte 1InOcuLc pr transeeiiicas do

Ao serem analisado pela técnica de Western, cs construções pCGN1328 ou pGGN correspondente à dimensão ua '!

As enzimas necessárias ao trânsito da. osu encontrai»-;

u pena indica que as plantas da eonsfnu a enzima no seu cloroplasto. Fo adicional) tal como a seeuir e estes resultados.

tolhas de plantas não t r a n s f or rnacr tecido restante foi colocado· numa de pectoliase v23 ; 0,427 de ceiu dextranoP7 cie

15-20 io^;Impo táss ico de a pr o x i me cie me n t e enz i mát i

G tecido foi

palco, c o	id aC t o .			an t as
~3.C t O S	t c t a : s		cie	f o 1 has
nas t	f a: s f on	p	tacis -	pe 1 a s
a ρ r e s	e n t a. t' a t ;	l	uma	banda
: :>í' r ec	r a me n t e		prOC	e . s ..· ci a..
- s o me 11	r a do		pe ρ r	i do de
na a i	oroplas	t	O ' ’	a q u e a
'or rec	t a me ro 1 e		F<o	c e cc s a. ci a
pCGNl	332 ou		Ί Ç' w	possue m
isernna	1 v 1 < 1 o	Ll	til t	r aba 1 lo o
t O , CJ	ue veio	c o n f i r ma r
le pro	to ml o. st	O
a m,.da	r cam	1”	i”'.” H t	Λ 2 /3 t ,2
cana	aantro	1 1	o	coíi;
	1			.·· j /-J [ ' f. 1
i.i _· .	.... . Ό..? -		• --	CP G1 to. G u..
ic a r r	i r de		p 1 an	Γ35 gíO
.tra.	cam 3-4		se ma	t'i.?·< dé
e a * e ct	o ·.· u	6	Ί O i t	éd é.. 0
1 uc aa	a oco r noa	r		’ d,0 4
	t- J .			- . . 1 r - í .·
- · · 1	- ’ -		• ' -
or bi t·	a i ·, pH		t-t R	Ί éorr;
	ml	;.i		solução
ela a.	c 1. UÇOÕ		,·?, | η “ ’ ;	uc v i c a.

fei to co1ocando as usando o vácuo até 300 rnilitorr. Isto foi folhas e a solução enzimatica num aobele. coi.oca.ndo uoa rocie por cima das folhas para evitar que e;da_ se.Mm _n toi:·'. j.ias , pelas bolhas de ar, para fora do gobele, enquanto estão sob vácuo, e, por fim, colocando o sobele num exsicador e

aplicando vácuo. 0 vácuo foi	então lenta	me n t e	clest r ui	do ,	até
se atingir a pressão atmosfér	ica.
0 tecido com	— o inc 0 er.	c i rr.at i	C 3 i G 1	e	nt ão
transferido para placas· de 2	otri, cs no	a. 1 s 1 0	['_i.ru GG	1 - ·	Odãs
num agitador orbital, a '50	rpm, curooh	-1	1 fcr.:,	0 ,	3 0 b
ampliação, 0 surgimento do or	redondame nt	0 c e 1 u	lar oien	f r 0	do
tecido e a libertação de cr	O t O D1 ? C t O S	do fe	eido f	0 i	uma
indicação drs que a digestão s	0 a pro x i us .···	e. ol 0 f	i m . U s a	ndo	uma
pipeta ''japonesa” de 10 ml . 0	teci d 0 r 0 i	lenta.	mente p»	i pe	ta cio

e agitado para favorecer ainda πη· i s a digestão. Oofragmentos de tecido e a; células nde tigeridas tcraiii então removidas por passagem através :ie -.00 filtro cie 52 ,im Λ solução enzimática foi removida, pc·- centrifugação a 150 x g. 0 sobrenadante foi rejeita·.!·.:· e reJh¹'·’ cie pretop]as tos foi enxaguado com^uma soluça? ds 1 a .· a oe η < 0 , 5 Z de sulfato

potâSSICO	cie dextranol	b de 00; bi	* 0 1 , pH 5,5',	e“ então
centr i fug	ado, rejeitando	0 ~0 orenada 1	ite. d passo de	i G V G. :£ e m
	ido por duas vez			contados
foi repet	es . .'G cu g t; g	ρ I s s t 0 s t 0 ram
usando um	liemoci tómetro .	Testes real:	oacios indicarar	n GUe GΓG.

necessário um mínimo de ld ml· cie or cu ood a.s t o sare continuar

Isolamento dos clore;.....· t- ;

protop1 as cos o cie bo v i na cie PBF-Percoli a

A suspensão de protoplastos foi passada através de um tarniz de 30 pmesh, acoplado a umu ---r:ngo de 5 cc , atê à lise dos protoplastos. A suspensão to: então colocado num gradiente de Percoll, 15 ml de PBF - Percoll u -10 poliet ilenoel icol (PEG) 4000'. I 7. de olluumino séri (ASBK 1 Z Ficoll; em Percoll > sobre o u

Z num tubo Corex de 3. o mi. 0 gradiente to: centrifugado num rotor de braço osc i lorde, : ÕOOO x g, duram e 15 minutos. Os cloroplastos ol i s po--e em bardos. uma de cloroplastos lisados, perto da pat t·^-· .supor mor Jo gradiente, e uma segunda, de cloroplastos irisemos, íris -iooiuc no gradiente. A banda lisada foi removida e rejeitada. A bando intacta foi transferida, moro um tubo us cuimr? ds 50 ml. 0 = cloroplastos intactos fotai.; i essuspen.-. ·. em 5- í 0 volumes de tampão CR (50mM de HEPE3-ΡΟΗ, pH ? , 50 , 3 3 M cie sorbitol'.

2,0 mH cie EDTA; 1,0 mM de Mgulot 1,0 mM cie MnOlo', o mM de sscorbato de sodio). So . í c: -ορ·’ o ’ _ - o - ; ,a punoc :orom então oent r i t ugados a. 1 Sum rpm num? . r. - -r : 1 o. g 1 11 3 uu; uude segundos, começando ? mudomiii do remoo <· 1 00 0 rpm 0’ sobrenadante foi removido o o. lo: cploeto- furam ressuspenso? em 5-10 voluaes de t . spsm SR. A centrifugação foi então repetida e os cioroplastcs re s s us pensos em õ ml cie sorbitol-HEPES <0,33 M cie m.r lei -. ,· 1 , ^0 mM de HEPEõ-KOH.

pH Z5 b

Metade de caos preparação de cloropl a-t;:· ^: 1 ml foi submetida a digesls; <om professe 'ripeuo., TPor

trstãdo a 25 pe/ml durante -!	5 ri; i n	u t o· s .ι -1 ' 6'	' para	destruir
as proteínas exteriores o	me mbr	ano	sss c 1	ouoplas	to. 0 0 rno
controlo, os cloroplastcs p	.τ epar	ido -	o saiu	i 1' d e	N . tabaoum
var.xanthi não transformo;	i a f o	ram	r £t	sios” 0	om Mn300
purificada., antes do tratame	, j' P /-	om pu	-SdSSS	’ í; .?í j	• e 1 i f i c a r
a eficácia do tratamento. A	! Λ Γ '	ase f	os dil	ui da po·	r adição
de 30 volume;· de sorbitol )	166 63 .	' -	lo ,-04:6	? s ί 0	di geri dos
foram então lavados por cio	:o.s ve	c c s	soc, S	0 mpão	oorbi to 1 -
HEPES.
Análise cios cloropi.	,,r o	. nua	rito a	MnSOO,
pela tecni	/ a cl e	Wo u t
Os cl oropias tos	f o r a m	res	£ Upênz	0 s e m	1 m 1 d e
tampão de extração Western	! 'TI p ;	616'	uii de	s i 1 r 0 ’· ·.'	s! e sodio
pH 5,6; 10· mH cie EDTA; 150-	mH d	? Γ 1 '	1 ; 25	mg/ml	de AGP;
0.05 X de Tveen 20 1 no	no 1 ou	! - j }· ·	:le	po 1 i s, y	iet i1eno
sorbitsnob 2 mM de fen.	i 1 me f	1 ! su 1	f 0!': i 1 f	1; 10 r e t c	1 prççp '
dissolvido em 100 ml cie	d 1 ,'j :	s . n g ·.;		ssão; 1	u mM de
leupeptina; 10 mM cie 11	>· i *. i-.		l.-TT	1 3'	mM de
t ioureia.) ’ , e homogene i s u.:.	S USÚ.1	sd, u	m 6ol|’·	Woro	s 0 rn d 0 i s
impulsos· de 5 segundos, a no	1 os i d;	d < a i	s ler ssi	s. psuue	1 r s 0 : .; s
c loroplastos. As amostras·	s o tl r e:	• u.m		• e1 p i	s,nãs com
100 ui de anticorpo policiou	o 1 o n	6 j . ,	’ 1	mu'ml	s 26,0 ui
de células de 31 aplovl pç pccn	τ;.....A. ;	;ί i! r 3.ΙΊ	r .0 i 2 !	nuns .	f i >
com agitarão. ,-is amostras fo	r .o r i e t	: r ãs	1 ...., --	; frés '	esc: os:.;
TB3T (10 mM cie Tris, pH -3,0;	150 :	,.-ί,η	• 0. -, ·	0 05 /1	de Tu-een
20) e ressuspeusas com 30 ul	de 6;	j !àp j,C	n a r a :	: mo 31 r ;·	s de 308 -
PAGE (0,125 M de Tris pH 6.3	• 1 ι·*· ’ ι U	' de	- f -U 2	1’ / do	s ’ i s e r 01 ;

PAGE (0,125 M cie Tris pH Ç. ,

Z de 2-0-mercaptoetano1 azul de bromofenol para a coloração), postas em ebulição durante 3 minutos e mantidas a 4 °C durante 1 a 6 horas,

As amostras foram então aplicadas num gel de SDSpoliacr i lamida a 11 Z, com 5 '< de gel de concentração, fazendo-se a electroforese a 50 V (tensão constante), durante aproximadamente 18 horas. 0 gel foi sujeito a electrotransferência durante 3 horas, a. 100 V, em tampão de electrotransferência (para E Litros: 18,2 g de base Tris; 85)5 g de glicina; 1200 ml de metanol; agua desfilada ate E 1). Após a transferência, a nitroce 1u1ose foi lavada com áeua destilada e incubada com Bloffo >' 20 mM cie Tris. pH 7,5',

X de leite desnatado e desidratado;

M de NaCl: 0.1 Z de ant i-espuma A; 10 mM de az ida cie soclio) durante 1 hora., a temperatura ambiente, com agitação suave. A nitroce 1uiose

foi então	i ncubada	com anticorpo··’	blotto		soro po	1 i c 1 ona. 1
ant i-MnSOD	em Blotto	a 1:5 3·, / \> ) ,	dura n f	e 1	2 horas ,	3 -1 ' C >
com agitaç	ão suave.	A nitroceiu	lose	foi	então	1avada,
durante 20	mi nutos	, ern tampão T3	( 20 mM	; cie	Tr i s ,	pH 7,5;
150 mM de	NaCl), de	novo durante 2'	0 m i nu tos	com tampao TS
adicionado	de 0,05 Z	de Tween 20, e	Ί G Π f 3.		cie novo	clurant e

minutos, com tampão nitrocs1u1ose foi então incubada durante 2 horas, a temperatura ambiente, em 100 ml l - h cie Blotto + I-proteina A (NEN Research Broduets,

0,5 pCi/ml cie Blotto), com agitação suave. A nitroce1ulose foi então lavada brevemente, com aproximadamente 100 ml cie água destilada, e incubada dursr.re -1 noras em tampão cie lavagem #1 (50 mM cie Tris, pH 7.5; 1 M de NaCl; 0,4 X de pH 7.5; 1 M de NaCl;

-ϊ laurilsarcosina), à temperatura ambiente, com agitação suave. A nitrocelulose foi rapidamente enxaguada. com ãgua destilada, e, então, seca sob ume lâmpada de aquecimento.

Foi efectuada a autoradiografia dur ante um período cio tempo apropriado. Esta análise demonstrou a presença cie MnSOD de E.coli, convenientemente processada, nos cloroplastos cie plantas transgénicas, transformadas pela construção 1328.

Exemplo 9

Anál iso da actividade.......çl a.......SOD......e ni......pl a n t a s.......transgên j ca s

Os extractos totais de folhas de plantas transgénicas obtidas com o pCGN1328 foram analisadas para avaliação da actividade da SOD, nco. sistema de electroforese em gel nativo seguida de colei-ação para avaliação da actividade da SOD, sistema esse capaz de resolver a actividade total da SOD em múltiplas banclas cios seus componentes. As bandas cia MnSOD foram, então, cletectadas pela ligação a anticorpo policlonal anti-MnSOD.

Os ensaios de coloração para avaliação da actividade foram 'executados como segue: foram colhidas amostras de folhas, as quais foram rapidamente congeladas em azoto líquido e conservadas a -70’C até o seu uso. O.b c cio tecido congelado das folhas. foi, então, esmagado num almofariz, pré-refrigerado com asoco liquido, ato se obter um pó fino, Foi adicionada poli nilpirrolidona íPolvclar AT) às amostras esmagadas (0,'lb §/..<, 5 g de tecido de folha).

Foi então inserido na misturo, citrato de sódio a 0,1 M. pH b,E (750 pl/0,5 g cie tecido cie folha) . As amostres forem descongeladas e a mistura de tecidos foi imediatamente transferida para tubos Corex cie centrífuga, e incubada em gelo durante 10 minutos. As amostras foram) entáo, centrifugadas a 20000 x g, a 4’C, durante 15 minutos.

Retiraram-se 120 μΐ do sobrenadante de cada amostra e adicionaram-se 20 μΐ cie corante de sacarose <25 g de sacarose; 5 ml de azul cie bromofenoi a 17., perfazendo o volume até 50 ml com ãgua destiladal de preparação extemporânea) e as amostras foram submetidas a electroforese num gel nativo.

As soluções usadas na coloração para avaliação cia actividade da MnSOD para o gel nativo são as descritas:

Solução A: ecrilamida a 307, <58,4 g de acri1amida: 1 ,8 g de bisacr i larnida; perfaz-se o volume até 200 ml); Solução B: 8x tampão Laemmli de gel de resolução (LRB), 3M de Tris-HCl, pH 8,8; Solução C: 4x tampão Laemmli cie gel cie concentração (LSB), 0,5 M de Tris-HCl, pH 6,3; Solução D: 10:-: tampão para a câmara <0,25 M cie Tris-HCl, pH 8,5; 1,92 M cie glicina).

gel foi uma prancha vertical de 20 x 16 x 0,15 cm. 0 gel de resolução foi um gel .·,& ac r i 1 amida. a 107 <11,7 ml de acrilamida, 30:0,8); 8x LRB pH 8,3) 4,38 ml; 1S,8 ml cie água.’, 150 μΐ de APS a 107,, preparadc extemporaneamente (persulfato de amónio em âgua), 35 ml de TEMED; perfez-se o

vo1 ume	par	a 35 ml. 0 gel foi	po 11 me r i z a do em n-	butanol.
		0 gel de concentra	ção foi um gel do	acr i ’. amida
37 (4	ml	de acr i 1 ami da ?<? :	0,8); 4x L3B· )pH	Η , V '1 g Γ;,	1 :
'1 0,7 ml	de	agua.; 0,3 ml de AL	'3 < l 07 > < 20 μ 1 Oe	TEMED.

Fez-se uma corrida lenta cio sei la cerc-s cie 5 a

4

I mA), durante 12 horas, a 4°C , 0 gel foi, então, corado por imersão em corante de actividade (50 rnM de Tris, pH 8',

0,0037. de riboflavina; 2 x 10 de EDTA; 0,017. de azul de nitrotetrazó1io (ANT)), fazendo-se a incubação durante 30 minutos, no escuro, com agitaçao suave. O líquido foi, então, decantado e o gel foi imediatamente iluminado com uma luz brilhante. Quando as manchas re tornaram mais intensas, o gel foi rapidamente enxaguado cot. agua e fotografado.

Os geles nativos para a ensaio de sctivida.de foram, então, complexados com anticorpo anti-MnSOD, como segue: os geles foram impregnados com 25 rnM de Tris-HCl ‘' pH 8,5), 0,192 M de glicina e SDS a 0,17. (p/v), durante 1,5 horas, com agitação suave. Os geles foram sujeitos a.

electrotransf erência e hibr idizaclos, como atrás clescnfc para a técnica de Western.

Uma banda adicional de actividade de 800, não presente em plantas de tipo selvagem de N. tabacum.......xang ói , foi detectada nas plantas t ransfc t macias através da ligação do anticorpo anti-MnSOD, apos a transferência. Estes dados indicam que a proteína MnSOD da E,çoli , expressa pelas plantas transgénicas do tabaco, é ztiva.

Exemplo 10

Tolerância.......aumentada das ρ1aiatas.......t ranseánicas......do......t ábac o à seca

Descrição domater ia 1 genet iço h planta do tabaco Xanthi-nc 1328-10-C foi regenerada através da. co-cultura de tecido das folhas cie

Xanthi-nc com o pCGNl '328 , usando o método dos discos de folha., e após selecção em meio contendo canamicina. Testes de Southern e Northern e um teste ELISA de anticorpos específicos revelaram que as novas sequências genéticas da

MnSOD foram integradas no genoma des plantas Tl regeneradas, e que foram produzidos o mRNA e a proteina eta MnSOD correspondentes,

Após a selecção da planta Tl, foram obtidas as sementes da geração T2, as quais exibiram unt padrão mendelia.no de segregação quando germinadas num meio contendo canamicina, como mostra a Tabela 1, sugerindo que o novo gene foi integrado num só locus,

Tabela 1 ( 1 '

Transmissão.......daresistênc ia........à canamicina à descendência

Condições Sementes .Raz,ã_p ,._de de polinização Total Não Sensíveis Resis- sagres;,; ã.o ge rjn i. n a d a s .tentes S : R

1328-10-C 200

14E

As sementes sofreram uma esterilização da superfície, germinaram, sob condições de assépsia, em sólido contendo 100 mg/1 de canamicina, e foram insu durante 12 dias com exposição á luz.

(2 ) 2

A análise do Qui indica que os valores observados razoáveis para uma razão de segregação de (sensíveis:resistentes ) , indicando um genotipo de 1:2:1 sua

•.cias

A geração T2 e uma. população de plantas segregativas compostas por três grupos de genotipos:

Grupo A: genotipo Xanthi-nc transformada

I

Ή resistente homozigótica (duas novas doses de gene da MnSOD)

Grupo B: genotipo + , -; Xanthi-nc transformada resistente heterozigót ica. (uma. nova dose de gene da MnSOD)

Grupo C: genotipo - , -Xanthi-nc transformada homozigótica recessiva (nenhum novo gene da MnSOD).

Partindo-se do princípio de cjue não ocorreram variações somaclonais durante o processo de regeneração, todas as plantas acima mencionadas são consideradas como isolinhagens: elas exibem o mesmo património genético, excepto no que toca ao novo gene da MnSOD.

A comparação dos diferentes fenotipos pode revelar o efeito do novo gene nos desempenhos agronómicos das plantas, quando cultivadas em situações de stress ambiental, como o stress causado pela seca (stress hídrico combinado, ou não, com o stress de elevação da temperatura). A expressão aumentada da enzima, manganês superóxido dismutase nas plantas transformadas pode contribuir para uma melhor protecção do aparelho fotossintético contra o superóxido Dó gerado quando as plantas são deste modo sujeitas a stress.

A resistência das plantas T2 ao stress foi testada como segue. As plantas segregai!vas T2 1328-10-C foram cultivadas em campo, sofrendo diferentes tratamentos de stress causado pela seca. As pl sntas Xanthi-nc de tipo selvagem foram também cultivadas sob as mesmas condições (grupo D, Xanthi-nc não transformada); os tratamentos foram aplicados no mesmo local. Três condições ambientais” foram usadas como segue: Condição ambiental 1: stress violento”:

as plantas foram cultivadas num campo aberto sob uma 'Ή cobertura plástica de estufa; eram esperados violentos efeitos de stress hídrico e de temperatura elevada. Condição ambiental 2: stress natural”: as plantas foram cuítivadas. em campo aberto. As condições agro-cl imaticas locais indicaram um elevado risco de stress por seca desde o estádio de florescimento até ao de maturidade. Condição ambiental 3: ”boa irrigação”: as plantas foram cultivadas em campo aberto e a irrigação foi espaçada cie formo, a mancer o perfil de humidade do solo dentro da capacidade do campo.

As plantas individuais- serão avaliadas segundo as seguintes características: número total de folhas; datas de início e final dos estádios de florescimento; data da senescência dos orgãos específicos; peso no estado de maturidade; biomassa total e fertilidade ao tempo da colheita.

Testes de ELISA executados sobre uma subamostra de plantas T2 escolhidas ao acaso ciarão uma estimativa do conteúdo em proteína da MnSOD das plantas. 0 estudo da descendência, em sementes de T3 colhidas em todas 3? plantas

T2 , determinará os genotipos cor re·· pondent es .

Exemplo___1_1_

To lerAnç ia aumentada.......aos......metais......cias......plantas transsenic as do........tabaco.

A N. tabacum xanthi -nc transgsnica, transiormada com o pCGNl-328, foi obtida tal como descrito no Exemplo para a obtenção de plantas transgénicas 1328-4. As plantas foram cultivadas em meio padronizada de crescimento sais de

Murashige e Skoog com 1 mg/1 de IAA e 1,5 mg/1 de cinetina). 0 meio padronizado de crescimento contém 0,025 mg/1 de CUSO4.5HoO e 8,6 mg/1 de ZnSO^.VHgO· Anteriormente a transferência para o meio de experiéncis, retiraram-se as pontas dos rebentos das plantas cultivadas em meio estéril (de 3 a 4 semanas de idade), incluindo 3 a 4 nódulos. As folhas foram removidas, excepto as dos meris temas.

Para avaliar a resposta das plantas transgénicas a concentrações aumentadas de cobre e zinco, a concentração de cobre e zinco no meio padronizado de crescimento foi aumentada 10 vezes, 20 vezes, 40 vezes, 60 vezes ou 100 vezes em relação à concentração ncrmal. Cada tipo de meio foi ajustado com 0,77. de Fitoagar. ^roram adicionados 100 ml de meio a uni quarto de frasco de Mason, que foi coberto com uma película plástica e esteril. zado por' aut oc 1 avagera durante 20 minutos, Após o arrefecimento do meio, as pequenas plantas foram transferidas para os frascos, 2 plantas por frasco, em duplicado. Como controle;, foram usadas plantas Xanthi-nc não transformadas e plantas transformadas com \ um gene de resistência ao glifosato ( aro A).

As plantas foram cultivadas a 25°C, com um fotoperíodo de 12 horas. A intensi lade luminosa durante. o fotoperíodo foi de 60 a 30 mi croe i r.s t e i n/rn~/s . As plantas foram avaliadas 24 dias após terem sidc plantadas . Para. ib vezes a concentração normal cb Õu/Zn, as plantas transgénicas 1328 ultrapassaram claramente as plantas Xanthi-nc e transgénicas aroA, como determinado por observação visual da altura das plantas. Os resultados são resumidos na Tabela 2, abaixo.

Tabela 2

Cresciniento relativo de plantas......expostas aniveisauiuenf..açlos deCu/Zn

Ç..Q..Q.Ç'ã.Dt r'..açàp’ç!e.......Çu/Zn

Planta	Meio normal	10 x	20 x	40 x	60	γ	1 00 x
SOD +	+ + + +	+ H t-	+ + + +	t f t		t
a.roA	+ + + +	+ + + +	+ +	t		·♦·	-t-
Xant hi-	+ + + +	+ + + +	+ + +				í

-nc

Os resultados acima expostos demonstram que se podem transformar eficientemente espécies de plantas com construções cjue proporcionam a expressão da superóxido dismutase num organito celular como o cloroplasto. Como evidenciado pela exposição acima, ão proporcionadas plantas que apresentam uma tolerância aunoritada as situações de stress ambiental e químico, tais ccrno a seca e a. toxicidade por metais.

Todas as publicações e pedidos cie patente mencionados nesta Memória Descritiva são indicativo: do nível dos peritos no ramo ao qual esta invenção diz respeito. Todas as publicações e pedidos de patente referenciados, aqui incorporados para referência, atribuiuse a mesma importância, como se cacia publicação individual, ou pedido de patente especifico. fossem indicados 'Τ individual mente para serem incorporados para referência.

Tendo sido descrita a patente por completo, evidente, para um técnico cio ramo, que se poderão introduzir muitas alterações e modificações na mesma, sem que se abandone o espirito ou âmbito das rei vindicações anexas.

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Um método para aumentar a capacidade de uma planta hospedeira de destoxificar superóxidos, sendo o diro método caracterizado pelo facto de compreender:

   a transformação da dita planta, ou de suas células paren-

   tais, através de uma c a s s e t t e de expressão (sequênc: í a de expres- são), inclui nd o uma primeira sequência DNA cod i f içando p a r a uma s upe r óx ido d i smu ta s e. , sob o controle transcr i pc i ona 1 e t r a d u c i ona

   de regiões reguladoras da iniciação e da terminação, que são funcionais nas ditas células, o que confere à planta uma capacidade a ume ntada de destoxificar superóxtdos.
2. 2 - Um mé t odo , con f o rmc r eivindιcado na reivindicação 1 , caracterizado pelo facto da dita cassette de expressão compreender ainda uma segunda sequência de DNA codificando para um peptido de trânsito, reunida, no molde de leitura, à extremidade 5' da dita primeira sequência de DNA, de forma a que a dita superóxido dιsmutase possa ser transportada para um organito de uma célula vegetal
3. 3 - Um método, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o dito organito da célula vegetal ser um cloroplasto.
4. 4 - Um método, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracter i zado pelo facto de o dito péptido de trânsito ser um péptido de trânsito da pequena sub-unidade da planta do tabaco ou do feijão de soja.
5. 5 τ Uti método, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a dita cassette de expressão compreender, ainda, uma terceira sequência de DNA codificando para cerca de 10 a 20 aminoácidos de pós-processamento da extremidade N cie um polipéptido maduro da pequena sub-unidade, estando a dita terceira sequência de DNA reunida, no molde de leitura, a extremidade 3' da dita segunda sequência de DNA.
6. 6 - Um método, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o dita polipéptido maduro da pequena sub-unidade ser um polipéptido da pequena sub-unidade da ervilha.
7. 7 - Um método, conforme reivindicado na reivindicação 2 ou 5, caracterizado pelo facto de a dita cassette de expressão compreender ainda, pelo menos, um codão reunido, no molde de leitura, à extremidade 3' da dita segunda sequência de DNA.
8. 8 - Um método, conforme reivindicado na reivindicação 7, caratcerizado pelo facto de o dito codão codificar parai o ácido glutâmico.
9. 9 - Um mé todo, confo rme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a dita superóxido dismutase, codificada na dita cassette de expressão ser uma superóxido d ismi.it a se i ndu t tve 1 .
10. 10 - Um processo de produção de uma cassette de expressão caracterizado pelo facto de compreender as fases de:

    reunir, no molde de leitura, e na direcção da transcrição, regiões de iniciação da transcrição e tradução, funcionais na dita célula vegetal;

    reunir, no molde de leitura, e na direcção da transcrição uma sequência DNA compreendendo uma sequência que codifica para um péptido de trânsito, com uma sequência codificando para uma superóxido dismutase, em que o dito péptido de trânsito dirige o transporte da dita superóxido dismutase para um organito celular;

    Reunir, no molde de leitura, e na direcção aa transcrição uma região de terminação da transcrição e tradução, funcional na dita célula vegetal.
11. 11 - Uti processo, conforme reivindicado na reivindicação 10, caracterizado pelo facto de a dita sequência de DNA compreender ainda uma sequência condi ficando para cerca de 10 a 20 aminoácidos de pós-processamento da extremidade N de um polipéptido maduro da pequena sub-unidade reunida, no molde de leitura, à extr em idade 3' do dito péptido de trânsito.
12. 12 - Un processo, conforme reivindicado na reivindicação 11, caracterizado peio f a c t o de a dita superóxido d i s mu ta se ser a manganês superóxido dismu tase.
13. 13 - Un processo, conforme reivindicado na reivindicação 12, caracterizado pelo facto de a dita região de iniciação da transcrição compreender, pelo menos, um promotor 3 5S do vírus do mosaico da couve-flôr.
14. 14 - Uti processo, conforme reivindicado na reivindicação 13, caracterizado pelo facto de a dita região de iniciação da transcrição compreender dois promotores 3 5S do vírus do mosaico da.couve-flôr, reunidos sequencialmente.
15. 15 - Um processo para a produção de uma estrutura DNA caracterizada peio facto de c omp r e e n d e r:

    um processo, conforme reivindicado na reivindicação 14, e compreendendo ainda a fase de reunir suficiente DNA-T, para permitir a transferência e integração da dita cassette de expressão produzida pelo método da reivindicação 14, no genoma de uma célula vegetal.