PT91192A - Processo para a isomerizacao da glucose em frutose,usando uma glucose isomerase termoestavel - Google Patents

Description

0 presente invento raiseiona-ss co» um processo «de conversão da glucose a frutos®, liais aspacificamsnie, relacionasse com um processo para a uliliz&cSo da uma nova classe da glucose1 isomerasae, sue síto is a temperatura© elevadas, m gus sSo produzidas por microorgarusíaos termofá1icos, ft frutos© # u& dos açucares mais doces conhecidos, mesmo mafs doce do que o açúcar mais vulgarmante usado e o mais rapidamente disponível, a sacarose e conhecido desde muito tempo a utilização da açúcar menos doce © menos dispendioso, & glucose, como uma bas© para a conversSo em frutos© mais desejável.

Um itótodo vulgarmenhe empregue no passado te» sido s conversão da glucose a frutos©,· alrsvôe da utilização de um catalisador alcalino. Um numero a® aesvaniagens associados com o catalisador é de s&?r rela vi vaíwtniw néo sex sciívo, de produto» secundários indesejáveis. como corpos coloridos, pouerem ser vulgarseníis produzidos com a irolos©, cfc purificação neceseôría do xarope para remover os produtos indesejáveis envolver procadi-fieotos dispendiosos & chílcais. 0 me todo mois preferi ao ae isomenzaçSo õ agora a convsrelo da glucose em írutose utilizanoo um enzima tendo acfeividade ds glucose isolaras*.

Descriçífe» extcríisas do processo da conversão ©nzimatica da glucose a frutose poo© ser aoconirmanB «m Hamilton, at_.._al.. "Glucose ísomer&se a Ca»e Stuor of Enavise-Caial ysed Procem Tscfmolmva» Imntohilizeâ Snzym&s m Food and liicrobial Prossmsaa,, Olson et,,ai , P1 ε-πυτη pj-ssí,. Mos Yorí·· , (. 1974) ι ρρ, S4~i0&? 112, 115-1371 finiris, et al.; "Glucose Isoserase Production of Hígh-Fructos© Syrups", APHJED feÍOCHEMISTKY fthD BI&ePtálNEERZNfih Vol.2, ftcademic Press í!S?9>; Ch&r,s et al - , "Glucose Isomerqss Ca tf

ReviewJ*', , Proeess eiochsm. , í ÍS80S, pp, 36-411 Mardand . , ft. ei ai, "Fructoea Manufacture from Glucose hf Isimobí 1 izsd Glucose Ϊsomarase*j Chem., ftbstrac te , Vol .82, C1975 5., ftbs.Mo, HOSiShí e Tskaeak í, “Prueiose Proauction by Glucose Iao»eras©M; Checi, Abstrac te, yol.Sij C197Ά>, Aos. no.7647a.

Pt mi«ni iaabs d® frutos® cotada a partir da reacçSo d© i some rlKas fio depeneis no eeiuili ora o da raaecio, 0 rendsmenio s» frutos© poda ser suem f ccativaiaenta sslnorado sa a reacção for conduzida a temperaturas au, i&a tic j &0S C, s prsf©rsneialmsríts acima dos 60SC. Contudo. as temperaturas superiores <qim favorecem a produção de rendimento elevados dw frutos®; pode tasídôia ter o efaifc.© Infeliz de desnaturação aa giucoss raostifase.. reduzindo deste íiiodo a estauiliaau^ t< e * c, t i v 1 d«de cio enzima. Por conseguinte» para a ul .1 i izaeSo da uiaa -glucose isosierase para a conversão da slucose a frutosc a »er eoplorada no seu ^otencial total * # necessar ic um i ípo da- «nripa com rssistància elevada â desnaturado têrsiics.

Um número d-· m 1 c ruo r a* η α s®c?s sáo conhecidos corô© produtoras de enzimas cã isomsrizaçSo cí« glucose, A maior par te destes organismos slo »e> f11 o*, i © , eles té® usa teaperatura de crescimento pr@fmriaã que asfca geralmersta entre lS-*45®Cí ss iesperaiuras d» te ar,..«a» ρα-ά o f un<„ lonamsni© das suas glucose ϊ somarasss» são tasoès norsalmente correapondenteiaentes oaixam, A patente cios E.U, 4.3u6,349 dwsc.-ev© a utilização do genero fiapo 11 anis 11a para proc-ucir um enzima gu© pode funcionar a temperaturas entre 45-8S3C, #mc?ors a temperatura preferida para a reacçlf© de ísomer -zecío seia de 60 eC. Feio menos duas estirpes d© Saçillus 1 icehm formis CATCC õiSUd, patente dos EM. no, ,4.349,4801 & ftTCC 31667. patente nos E.U. no,4.3SS.í035 eSo descritas como tendo uma glucose isoíserassu que & optimament© aciiva aos S®*C, mas que pode reter alguma acfcividade aos ?0*C, fi - 4 - *

glucose Isomerâs© ao organismo FÃavooagter íuí» arhorascena ê também conhecida como tendo aetãvadade a temperaturas fcáo elevadas como os 90°C, embora soja prs?arido a sarna de temperatura entre os 60-750 c. è de esperar sue microorgamsmos termof i 1 icos, i „e.» aguei*® que crescem normaImante a temperaturas de 6õaC ou au-psriofSBi devasi' pvoiJuz i r glucose i so^s rasas isais t-ermaments estâveiSí e A um facto que um numero cassas microorganiamos âieis têm sido descritos, 0 japonês *uh&x £9(,1574 5-30685 anota a utilizado ds uma sêrxe de aeiinos»xc©t.oe termofi 1 icos do género TarsBQ&ctlnoiaycas & P' â^yooooc&rdía, doe quais todos gera Imante crescem a tempera tu rss ae psIo menos de 60--608C, As glucoses isofserasee produzidas pof estes mx cr «organismo·® eSo oescritos a ter acçSo com retenção suostansi&í o: actividade aos 100*C. 0

Baci .1.1 us.. atear ptiiarmopoi U-i < Pa t#n &# dos E , li. no, 3,826,7145 cr esc» normalmente aos S56C., e produz uma glucose isomerase que é mcbiva a temperaturas ate o® 60fiC, lip^a estirpe mutante do Ba-caIIus coagulana (Paients dos £ U.no.3.979.261? cresce opixma-mente aos 6CHSS*C* o a sua glucose isomarass pode ser usada desde os 55@"~&5‘sçI sem perder suostanc xai os ae tx vicjade.

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Es ligação com o presente invento» foi ctescooerto um novo tipo de glucose xsossras«e que pode funcionar a temperaturas acima dos 50SC com iermoestacu 1 loacíe em e^cesse? eia raiaçlo s qualquer enzima anteraormente assenta. Organismos orasinando tal enzima foram isolados & partir de uma serie de ecossistemas. Estas áreas incluem ecossxslemas unxcoe, nos quais substâncias organícas eSct dec empoei©···? por um caminho metabólico oKidaiivcn eseanc íalmenta stmrúbico, «sus gera calor substanc ial» normalment» a tá tempera tu !‘«s de &0&C, pela aedo de ®i c roergani smos termo-filicoe. Contudo até esta data» nenhum micrôoio que produza uma glucose ísomeras© foi indicada a partir desses heoííais. ' **«·- β

- S - £3:sscQbriu“s@ gue s organismo do presente invente cresce facilmente1 aos êO~708C & ®s suas glucoses ísomerases, no meu estado natural, possu&m actlvídade de temperatura entra paio ®enos 90-1 08 ® C,

Este invento fornece um enzima cepas da isomsrlaaçSo dâ glucose a frutose caracfcerizaao por possuir un® meia vide de vinte aínuio© ÍT^ft3 ®· uma temperaι-ura cie peio aenos d& S39C e preferencialmente a cerca de S4°C e superior. Este invento fornece também um enzima capaz oe isomsrizaçfio da glucose a frutos», isolôvei a p*r fc χ ** cie um msmbro do género feaci 1 lus, caracterízado por p^sscir uma semu-vida de 20 minutos i1..,,,.3 a uma du temperatura de pelo menos de 535C © imobilizado num suporte insolúvel,

Num outro iiíooo ae r&^iiz^cão do invsniOí fornesβ-ss um processo para a i sofrer a zscâtó aa glucose * frutose gue compreende o contacto de um licor d·?- alimentação, gue contam glucose contsnr* do desde 20 a cerca de SS por canto, eas psso, de glucose com uma glucose ísomarssa a uri!,;* teaípe-ratura cJusda cerca de S0°C a cerca de I308C* a um p.H desde cerca oe 3,5 a cerca de 8 e um tempo de contacto desde cerca cie 10 segundos a cerca de 6 horas, para converter pelo senos cerca oe 53 s cerca de Bú por cento, em peso, da glucose pr©&©r,t© no referido licor a frutose, com nenhuma formaçfio suostancial oe sei cose, g«e compreencia o emprego d© usa glucose isomaras® gue possui up,â ís@mi-~vid$ de vinte minutes CT„pla usa temperatura de p-sio senos S3®C.

Mus modo de rsalizaçSo finait ό invento fornece um enzima capaz de isoraerizaclo da gInces® a fruços®, caracterizado por possuir uma semi-vid·.* de vinte minutos CT.?f,3, m um& temperatura de pelo asnos de 33eCh Μοβ desando© que acomísannsffí esta memória descritiva; a Figura 1 ilustra uma variação de firrh&niim &m relação aos efeitos da temperatura na ©stadi1 idade da glucose isomeraae iisodí lisada* da Patente dos E,U,3.768-9-½. A Figura 2 iludir© uma variação de L,r, vs temperatura; ΐ baseado nos dados da Figura i. A Figura 3 ilustra uaa variação do ζ ΪΎΪ^> vs temperatura para os ciados da Figura £ e dá informsçSo da temperatura vs meia-viaa- ft Figura 4 mostra mapas de várias localidades nas qusis os fflicroorganismcís do invento foram encontrados. 0 presente invento forneça uma glucose isoraeras® iermoestôvel que ê útil em conversão, a temperaturas mlevada©; da glutoss a f rutose. aqui X ibrio

Coíbo mencionado acimat os mveas cl* frutos* atingidos pela isotB#rix«vS© da glucose com glucose isoseras© mão limitado© pelo equilíbrio da rssccãu da isomaras©. Aos 6SeCí o equilíbrio da reacçSo estaoilis.a a apro;cip;aoaments aos 61¾ ds frutos* am peso.; em rslacSo ao substrato cte partida ds dextros© pura. s quando licor de glucose refinado & usado como o substrato <contendo até cerca de ôA d* não mooos®ee3?itdec>S; ©m? peso5 © deixado ficar durante um tempo cs rsaidencaa razoávelt num reactor de enzima^ aproximademeiiie? an® 60¾ ds xarope de frutos© * o teor em· frutos© maia ©levado pus pode ser obtido Crsum-a base seca)? através dos procedimentos referidos enteriormsfiis. Para obter xaropes de teor em frutos* sai© ©levado·; sistema© de fracciona™ nwnto devem ser ©rrpr«gu©s{ que adicionam custos elevados ao custo do produto final. Contudo, a temperatura elevada, o tornar-se mais fawrèvei. por exemplo, u® processo de glucose ísomsras*» enzimôfcica eap&z de ser operado a temperatura® de desde cerca de W^C-loC^C deve aer usado para direetameniô forrweer xaropes de milho de frutos® slevaaa iXP1FE3 mj& contêm 63-60 por cento, sm peso, numa base seca, pop conseguinte, eliminado da necessidade tío freceSonafiieoio & rsciclizaçSfo Contudo, a tendência dos sistemas de glucose isoaerase conhecidos de sofrer desna— iuraçSo térmica cor» uisa '.'eciueSk; bsx/sc® a acompanhar, na activi-bâde tea por conseguinte, frustado muitas tentativas de utilizado d© temperaturas elevadas, para forçar o equilíbrio da isomerizaçSo meus »» favor oa frutose. fts patentes dos E.U, é. 4í0.627; 4.411.936 & 4.S67.142 ensinam intor alia que o controlo cuidado oas condic£»s r®ac~ c:tonais, assim como a e»inc«i 1 ize>;âo química do. enzima poda ser empregue para originar un. produto contendo ®té cerca ae 65 por cento, em peso, de frutose. 0 grau máximo de conversão da glucose a frutose que pode ser atingido è governado &elo equilíbrio termodinâmico entre a glucose © a frutose,· que por suv vez à dependente cia temperatura â qual a xsoiúarisacíto # conduzida. Da analise muito cuidada das misturas de equilíbrio aa glucose a frutose foi estabelecida as seguintes relaçbes, F « 100K/IC + 1) a> 1nK » -755/ÍT + 2751 + 2.5305 C2) onde F é a I de frutose no equilíbrio, baseado no peso testai ds

B glucose e frutose, τ & θ tempera tuγ® l ®G> â qual s isoas-rizacSo # conduzida, e {/«constante a@ sm«I abria da frutose sobre a glucose. - . . -0 ~ 8 -

Ο1 iasípo da rcntecto aciual entre ç< xarope, que cont,#» a gIucose, e a glucose iscffierase nym reacior, pode geralmenis ssr contado e® referência â fórmula seguinte, guando um reaeior que coniéa uma forma imobilizada d# isomeras© é usada. t “ <CV/kA31nUF -- F 3/CF - F)> a & o e onde í t. «= tempo de contacto aetual a C « concentrado da glucose e frutos® V volume J.jvr® aa fluido num reacior (volume do reacto*’ menos o volume ocupado pelas partículas de enzima imooaiizaaas*

Pt ® fracçio de frutose na mistura de glucose mais frutose no eqylliorio, guando á temperatura de ! SORier 12Sv So F * fr&cçáo da frutose ibasiada e« 6 a F3 na solucSo o· que existe no rsactor F ** fraccSo de frutos© Cbasxada em Q + F3 na solução que existe no rsacio? K <* constante da velocidade ca reacçlío para a isomsraroçSo nas, cg^gíxõ&b de isomarizaefo A e aciiviaí«e on Isoineress no reacior

Valores para o ?, Pcu-s a Isouerase imobilizada encorr-tram-se na gama ctesoe cerca de 0.0? a cerca ds 5 a hr 14 a temperaturas tísscte 90CC a iá,o»c; rsspectlvaments. Emtm relação mostra a, necessidade de minimizar o tempo· ue contacto a temperaturas «lavadas, através da utílizacfo ue leito easpacotatíoi* de alta aciúvídade, po*·* unidade de volume.

Contudo» na pf-eilc© com&rt i&l xaropes que contém' frutoee nSo sMo manuraetur^aos a partir aa glucosa pura. Em ves disso, hidro! ssatc/s do a-ddo icomo preparado nas referências aeifiia mene lanadas «So usadas, como fonte ti® glucose © isto SwarJalvTtImante contei sacarádaos ses frutose & se® glucose Creferldo nesta saméria oascriiiva como oligosaftc&rleteos coa D,P. até cerca de S derivado·* da rud^oi isw incompleta do amido, e da inversão da glucose. Tipicamente eles consta toes* desde 31 & &% do peso total dos sacarídeos d^rivaaos da hiãról is© do amido, fi por conseguinte necessário; guando se estima a temperatura à guai a isoaeriaracSo deve ©er conduzia®5 permitir a gualouer olí&os~ eaesrideo, contido no licor de glucose* assim como a outros factoras, como· o teor mt frutos® na base seca total a ser obtida, a formação dm psicose & de outros produtos sem glucose m sem frutoee, durante o tempo de contacto eficaz do licor de glucose a da ísomerase. ffelacdes para o cálculo da temperatura de imo-merlzaçlíb estSo mostradas a «aguiri T * 755/ζ2.3005 ~ ínl<) ~ 2T3 (4) K w F / C 100 ™ F j <&> e " s F ~ lõjOOCKr* * Cl/iiôOQ - Fú) <&) m ondeí T = tampsratura de iso&erizaçSo C°C) F « teor em frutos® no spuiiibrio Cl ra b®ss ds & frutos® o giucoa® total? à temperatura Ϊ, M « ¥t <o& frutos© na base seca, necessária para o P rocio to cio isomerizacáo C b |, gg psicose r outros produtos de degradação formatos owrarste o tampo d® contacto de isoisarisAção eficaz, st - Ϊ c-rt sísyilibíuo atingido durante a reeeção de isewer* izacão P ® teor em % de oligossacariclao no licor cie glucose

Tipicamente, menos do nua II © preferenc ialBier; te {ji^nOã do gue Õi&% de psicose & d& outros produtos de degradação serão Ιό - formados prepa”8 r turas de gluccos e 59,6¾ do eoui1terio ,poae ser obtido. Contudo? para carepas com 66,6% da frutos© Crw bss© seca), as tempera-isomerisaçSo seguintes sSo necessárias psra licores da c:orn os teorss em oi igossacsridaos indicados, T empevatura

Qligessac a r £ d&om no licor ti© glucose de isoaeri C % na base secai C«C> 0 95,7 1 99, 1 2 104,3 3 108,9 4 113,3 6 124,3 8 136 ? 1 0 a?’tigo acaste no comercio conte® em media, 66,6S de frutos® numa baae seca. Isto ô assim? porgue a este nível de frutos©, o xarope a® milno com frutos© elevada CXfirÊ) atinge doçura igual ft da sacarose num peso para o peso na base seca. âl6« disso, XdFE com o teor am frutos® de &6X sstâ firiaemsnte estabelecido no artigo coifiarctevel t oue ê usado e® inter-permuts, co»o substituicSo total ou parcial, para a sacarose em muitos produto® «1Imantaras © especial«ente ®m bebidas nlo alcoólicas carbonatada©. Devido âe complaKicâdss Inerentes na dlstrlbuicSo, armazenamento introdução « íormuiacS© do XMFE a® produtos alimentares, existe uma procura universal para a uniformidade do produto de um fabricante de XrfFE a outro, de modo gus o produtos proveniente de diferentes fontes dm fornecimento p~snâ ser usado em Inter—permuia & simultaneamente,, Por conseguinte, o nível de

frytose de 35-6811 na base seca atingiu significaste especial coroo © nível alvo, na tecnologia assoeiada coro o fabrico de IflFE, A:i,nela qu®, coroo indicado para a discussão anterior, uma série da parfiroetros pode ser os alvo® para o melhoramento· do processo de i.somar isaçHo s o (Snzwã por ei próprio permanece um u foco principal para os me 1 horemooios no processo, pariicularroents em relação â estabilidade térmica, A Figura I mostra uroa variação de firrheruus wa relação eoi ®tfaito» eis w^par* atura na estabilidade da glucose i some rase Cõlreptqfflycas ruoiginosus imooi l izados ©si caluloee DEAE de «corco coro os Ènsirswnioe da Paêenfcs dos E.51,3,786,346) sob condiç fites normal ms-ni© usadas para, a seo-merizaçlo, í .a., um pH optawo sβ„5 - 7,.5/, SOI de concentração de íí* glucose + frutos©{ Wg trob © bâíiSú. a 2~3rorl. Estes dados d© d estabilidade são típicos aos antecedentes cio rase, para m glucose isoserase na forma im&cn 1 israda, A variaçSo sestra a ©esi-vida vs temperatura e revela que aos processos de inactivaçlo diferentes são importantesj ©m di f ®r«?ni©e de temperatura. Abaixo de cerca de QOsC, a inactivação # devido quase intearameni® i reacçlo d© degradação qudues coro a caracteristaca cia dependência d» temperatura nos proeaaaos quã.tacos, mostrando ujbh reiaçSõ ns aceleraçio quatro vmt&s para cada 30*C da aumento na temperatura Cí.a, «4/. A geroa ©nir© cerca de SÕSC m d & 9B°C roosirs uroa u transição a uma regiSo onda uro processo de irsaciivação diferente é pradomínanterosni® coroo aquela acima a® cerca de 3&*Ci a relação da ánactívação é ©norm&<K©nt8i> acelerado pela temperatura © o stlnge o valor fenomenaifianta alto o# 1800. A energia de actívação pera a desnaturação fcênsica fE'1') geralroente esfcâ na garoa desde cerca de 30 a 300 < znã/moi&. festa região, im m&ro aumento de í 6C na teeperatura roais do q;« suplica a velocidade aa inacti— váçio. Este coroporferoeritu e® roIacOo ê ieroperstura ã nopm&lra&rrbm observado· com mmimos & & causado aevido à tendência dos enzi»a« Cqy® são proteínas* para sofrerem a desnaturação, us processo - 12 — φ 4

físico em que a conformação act-xva ã perdida devido a efeitos térmicos,

Vistes quí.» a eficsencaa t.m> s qual a glucose isomsrase pede ssr usada para converter a glucose a frutos© esta dárecia-mente proporcional ô sesiu-vida da isomsr^se í inversemente proporcional â velocidade de mactivaçlíõ) â da apreciar que a temperatura é uma consideracio fotalmento importante na utilidade da glucose ísoraerass para esta fim, Por esta reaisí o presente ramo tende s dar enfâse á utilizado da isomerasa á temperatura mais foaxasa possível, consistente com a nlo permissão d© contaminação microbiana nos í'=ací oras com 1 some rase imobilizada normal mente empregue®. Deste s®do, a isomerizacSo & norssalisente conduzida a SS~fif>sC onde semi-vida das í sumera&us de 1000—2000 horas eSo observadas, Em contrastas, a seisi-vida da isomerase nos antecedentes do ramo» representada na figura 1, & uns menos 2S minutos aos SS0C θ aos i006C e unicamente c© um minuto, é por conseguinte evidente que tée3pe»*atur®*-s as quais a desnaturado torne-se num factor dominante, devam ser ©vitaaas nos proc©esos de isomsri-zaçlteh © ainda, mesmo pequenos ^vmontos na temperatura na gama da desnaturação térmico slo extrem^íserite cràiicos com relação i semi-vidâ © # sfictcia do enzima.

Como ®ãnuoredu énicr 1 ormente, as patentes dos EJJ, 4.4.10.6.27; 4.4II,SS6 e 4,567,142 estipula® o critério sinao para & temperatura de isomacizacio alevada de glucose, para atingir a® SS por cento da frutos© através da um processo de isomarisacão. O eisni ficado cie atingis' com&o® içS©3 do xarope com SSf de frutos© na base ssc« é tamóè® discutido aqui. Devido à influência da temperatura no equilíbrio termodinâmico glucose/frotos©, uma. temperatura mínima da 875C deve ser sai pregue para atingir os 68¾ de convsrsSo partindo da glucose pura a realizando a r&scçSo ao ponto de equilíbrio, Poraue o squtlioric· ê unicamente conseguido 13

am aproximação, ea teoria» a a glucose pura ê impraticável com© um material de partida© pera ©atas reacçfifes» a temperatura mínima para atingir os &B% de í^utose através ds isomarisacSo directa ê cerca de 9©0ϋ e prefiaΪmente cerca de 100gCí como descrito nas patentes citadas anteriormenie. Ha determinação da utilidade· da glucose isomerase para &&% ou mmis, d© frutos© i dm apreciar que várias técnicas de isoserização β/ou de modificaçOes químicas são capazes ds aumenta** a capacidade d© Isoserase pare resistir â desnaturação térmica de modo a que a gama de temperatura crítica» è qual a desnaturado toma-se o mecanismo dominante da inacti-vaçSo do enzimaj está desviada para uma temperatura superior de vários graus. Como um# medida cia tendãncsa de um smzims para resistir a desnatyraçSo térmica * a convenci© T.^ foi adoptada, ?„Λ ô a temperatura expressa em Cs na qual uma semi-vida de 20 minutos & observada. Um procedi «santo pera a determinação de T

aL U

de glucose íeomaraee & dsfimao aoaixo. ΰ Γ_, do S,__faioiflinocMC

diJ '" " J C~3 isoiaerass, como assento amxxo, & as 83» 7*G, Depois de imobx 1,izaclo ©a? celulose D£AE,- o # ausentada a 960C.

Outros sstrategemas para o aumento da resistência dos ©nxiiaas para a desnaturação térmica estão discutidos nas Patentes dos E.U,4,411.393 ® 4.607.1*2 & x&portant# notar que estes métodos para a ©«iabxlxzaçffe dos enzimas βίο iimitactos #m relacífo ao grau de etsatsll iz-sslo que podem ser dados em termos eo efeito no 7^, Por çoneeguinta» a glucose isomsrasa® que &Mo irtaren temente ®ais terso©stávoxs5 co®acswo coa íem vir tua® da sua estrutura primária,, segundaria e terciária da proteína) mesmo por imm poucos de *C Cem termos ds T„„ tèm vantagens enormes sobra

ZU enzimas ds estabilidade inerente menores» psra fins ds construção «te sistemas rececionais cie isomer izaçS'© a temperatura elevada para opsraçSo a 30ÔC e &u&erior, visto que» como discutido acima» ura aumento de unicamente a@ l°C ©m T,,.,, pocl© resultar numa dupli™

ZU caçlo da semi-vida, 0 quadro I mostra as iermoestabiI idade das - 14 - glucoses isoaiemses nos antecedentes do ramo. 0 msrso® termo- estável destas varisçífes tem u» ánicamante de ΘΜ,2°C. 0 mais 2y afííplaaients usado das glucoses isomarases Cdo Stpeptofiiyces sp.» iã£jll.m......SP. , ê fictinoplgneg.. ais-. sour lensis) mostra um "Γ 20 numa gama estreita da valores <S9,3-9i „ 7SC5. A isomerase iarmoes-tevel doe antecedentes do ramo» © do Ampu 1 lar tal la sp. iém um T_,,. as 52 »β SC.

“...... " "' ” ^ * aU

Foi agora descoberto qye( algumas glucose ísomerases do Bac i1lus gp, tsrmofiIIco têm lermoeeiaoiIidaetes muito superiores do que- qualquer das isomerases dos antecedentes do ramo que- foram assim lar-gement® descríto®. Isto ô muito surpreendente tendo em vista um largo número de glucose isomerases até agora reveladas a partir de ums grande- versedad® de fontes microbianas Cpara. ísm discussão ver Chen, fe*~P, Proc. Bioehem,, Jan/Julr» 1380» pg, 30-41>. é estimado, por exemplo» que nâo menos do que &ô glucoses isomerases diferentes foram descritos até agors. Entre as isomerases derivadas de fontes de Baci,1 lus três analmãs dos antecedentes do remo estilo indicados no Quadro 11, Bois deles foram descritos como sendo extremsmenis terraoestévels Cver a Patente dos E. tf, 3.828.714 & m Patente do R.u. 1.4S7.I771. Como mostrado neste memória descrlliva, estas enaimas poesua® única— mente terffloestabi1 idade vulgar, medida como definida p®Io critério- de T e &m facto, sê& bastante manos temossiâvaí, do- -que a

-£.U isom©rase do presente invento.

Quadro I

Termostafailidade de isoiflerase dos Antecedentes do Pai» °C)

C

jíO 8tpeptoiayc.es ac idodyfansCA, E.SiaíayY"' 94,2

Pseudoriocardia thermophi Γ& (Takãs&k 89,3 ff.tfcptowycag rubiglnosus 4-A <Μθίϊ 69,3 ilreptoíBygõs r.ubiflinqBUS C-3 CMBIJ 90,2 f

Bciinoplanss missoup.l,ensxsCanns?user Susch?" 90,? firtfarobacier ÍS CCWBI),J 81*7 92,7 Sírepicmvcss rubaganosus C-3 -a Co ' CNSI) ftmpullerial Ia sp. ZQtw corningS* Kúísero de Acesso a. NfiFL 11489, 11492, U436s 11496' 4,469,3S4 C Pa iente dos b. IF0 No. 22183 &H0 49 Cl974) - 30686 C . NítBL 6-*3-342 3,992,262 CPatente dos d. ATTCC 21743 4 j 693,001 íPatente dos E . U. ) C Japão) E.U. ?e,y. > ®. ATTCC 31351-31384 4,308,343 CPatenta dos E.U.>

§.yadro.......II

Tafffiostabllíú&áe da ism&r&me anterior do Bacanos sp. T*>

Bac 11 lua stgarotnermopni lua (snamProgstfci 3 ~Ú8 , 6 BãCAl.lMl .sfcearotlisraopnilus (CPCiu S9„4

Pacillus coagulsns Cnovo)S*0,1 Mãajero.. ds .ftcesso Caieglfo a, CBS 40473 i.467.177 (Patente tío R. U3 b. ftrcc 2Í3SS 3.Ô2S-714 (Patente do R„U. 3 c, mfíL òur AS""* 3.379,261 (Patente OO R.U. 3

Como discutido sntsrior.isento, o mfeito da temperatura, na vaiocidade de ineciivaçSo dos enzimas ê exeassivssente alta na gama de temperatura oncte os afeitos de desnaturado térmica silo predominantes« fts energias cte «ciivaçâo para a desnaiwracão de 100-300 kl Xocarlorias/meΐe são a regra para «a glucose isomerases invesfcíQâdaa nesta descritiva, 0 ©feito da temperatura na velocidade de isomsrização. por outro lado, segue o padrão usual verificado para as reaccões guSmcas a é me is tipicamente 13 fel locslor ías/mol® para as rsaccdee catalisadas com glucose· isomerase, ft ssnsibD idacw extrema da velocidade de dssnaturacSo com a temperatura Csís oposiçto co» a insensibi 1 idade relativa na velocidade catalíticas a usada como a base· para a ordenacSo da termoestafai 1 idade numa escala cl® temperatura. 17 - 0 sistema e caseado nas cinéticas seguintes= que sSo geralíiant·® válidas pera a «íuco©e 2 stomsrsmm. dl/dT = kECI - Sj/C í7> e dE/DT * ~0,693E/tau CS) onde ; 1 - grau de isoaisrizacfio (fracçe© molar da frwtoss baseada, ssh glucose * fruiogs) 1 « 1 no equilíbrio © K « constante cia velocidade d© reacçâo para a 1somerx zac So E » concentras βο· de isw?n»erese C » concentração total, cia glucose + frutos® tau sa mei a-via© da isoraeras® dl!~ veloe idade de iaomer ímíçIS© α c d£= velocidade da in&citvacão cia 1 soa»rasa dt

Combinando (7) e ¢8) a integrando ob tem-se & e pressão sagu i n ta Lí ι_γ « <kTent/c> m - o,sríi/ço,ss.3n.n cai onde Lr - InCI /il - I,,.)/ CIO/ f & a í “ LT = função d© aciivsdacte, ã temperatura T, como definido ®m (ÍO) E = concentração do enzima no inicio do período de o aquecimento t *= duraçfio do período de aquecimento n s= t/tau Λ baseada nos mento de 40

Figura 2 mostra dados indicados como variação de lt vs temperaturatna Fig.l, para um período cís aqueci-- minutos, ê isofímrizMzão aumenta â medida que a temperatura é aumentada até nua a «ama aa temperatura crítica seja atingida,· Sípôb a qual a desnaturação da isome^ass iorna-se predominante & a velocidade· da isomeriKacSo diminui ate parto do aero ao longo de uma mera g®íB® da &°c. Guando a temperatura está abaixo· da gam® crítica è qual a desnaturação predomina Cpof exemplo, «oaixo d© cerca de 90®ε , na figura 21 o termo no parênteses na Equação 9 é igual a 1 Ctau fc). Deste modo, a temperatura de referência ê escolhida abaixo da gama crítica vo soso que lr * íí-^e, t/c cm

Dividindo C9> por i i.l> aa αγ « ltkr/clrk,í « u'í - õ.sn?/co.gsanj? ci.2> ond© ϊ A « acixvidade relativa, r fi equacSo anterior mostra que A é uma funçSo uni cárneo-- r t© de duraclfo do período os aquecimento* t.= s tía sems vída do enz i ma..

Deste modo» um® variação cie A us temperatura acima da Γ gama crítica Cpgf exemplo na Figura 2, desde cerca de 5& m cerca de luO®Cl dâ informação na temperatura us semi vida. Ua exemplo â - 13 - τ mostrado na figura 3 para os dados aa Figura 2.assumindo que t-40 ιϊι i n. , £.. - O. δ IfilU/ifii; 1,,.-5.660, st™ 0,2 g/ml , *•2* CÍ1 h temperatura ã qual n«2 <tau=20 min.l è determinado» per íntarpolsçlo da vsriacS© & o vaior tirado como uma estimativa

Espscificamenie. © procedimento para a determinação do T,„,„ para se isomerases discutidas aqui foi o seguinte ;

PU 1. A solução tampão & a solução da glucose ©ffo preparadas ®m água destilada do seguinte modo í go 1 uc ã'o tampão - tampão de ma lesto de sôdi© 26 mH; MgS04, 10 mH; pH ajustado a 6,6,

Solução, da substrato de glucose; glucose C r&s.gente> 400g/L; tamplo de mslesto de sódio, 26 sd; flgSO-, 10 biFí; est-abi-lisr&dor K&,&. , F©' * , ffr*' ' , ou Ce ‘ >, coneantraçSes como especificado; pH ajustado a 6,5, £. Duas gramas do bolo nómido colhido foraa suspensas em 2 íV! 1 d© uma solução í-mmã,o e sujeitos a im aparelho ce ultra— -eonsj durante um total de 75 segundos * despedaçando as células era 15 segundosj usanoo uu «Parelho de ultra-sons Sranson C¥“3S05, Ãs células sujeitas aos uii iu-syns s-Sa centrsfueadas a filtradas através de um filtro <ãel«wn de !,£ f-ucron C Acrodisc , Cai no.41951. S. ft activiuácié da gluruse ãsomaras© no extracto da célula é ensaiada peio ~Φtodo descrito por Lloyd, st al. CCerssl Chem. f :§§, &4M-B64 C 1572¾ J s a justada a uma concentrado d© 1,0 -if5 ieru/mi. 20 4. Hicropipetas αβ vidro capilares, da paraaes firns* de 100 íil CVfett €«at #53402--3211 sâo lavadas cora solucfo de ácido crômico, enxaguadas cora agua dssionizadas secas e as extremidades inferior*©® saladas ao foav 5. A soluçSo de glucose isoraerase ajustada ê arrefecida a sprox imadiawerii© leC e # misturada cora um volume igual de eolucâo de glucose i também a ísC) © distribuída nee micropipet-ae capilares de 100 «1, «ue sSo rfapo3s seladas è chama na extremidade superior, (enquanto pteemaneb íaC'i & incubadas ©m banhos de aquecimento a temperatura® seieeclonadas, durante 40 minutos. 0e banhos de aguec iraunio d*v®ns &©p í,spèijéi de raunter a temperatura si® +-0,11, A temperatura cfo» banhos as aquecimento ê estabelecida em intervalos cfe 1 ®C rftiraa da ck. temperatura c»'Iiiea do anzima Cpor sxsmda «a ?) ,>;rs -s, eia serã entre S3S s ííjúsC) . Um banho ê colocado ã ♦.&*»->~r.4cur,* .Je ,-^fsrêr'C is, «;y-i © ©pc ionalmente colocado « cerca os Iõ*C auaixo oo T._... οι. Ό 6. Ensaios ©>4 branco s'-o preparaoos por mistura da solução ísmpêú numa rasSc. i , l cor., a soiuclíu do glucose, selada em «slcroptpstas capilar©·» e mcu.íaoas durante ao minutos, nos mesmos banhos de aquecimento co.«o uno *fl.ostras de enzima, 7. A rsa.ee So i? ter»2,nao« pc-γ ir/iersSs dos micropipatas nua banho d# gelo e sal, a G3C- 4s fiucropipetas sSo depois fiberks, e SS yl os cada sacropip&ia a adicionada a 2 jul de HCL 1M, para estabilizar os teor#® ©» Isoraerass, sendo as concentra-efiee de frutos® s glucose ensaiacae por ÕLAft. 0 grau de isomei'iz®cSo fIT; é calculado a cada temperatura X-j,™ F/(F + a> - £1 ~

%g@B@SS F “ & cie fruiose na miostrm ~ % de frutos© no bronco Θ * de slucose na amostra A fundo da acfcividade a cada temperatura é calculada 1..,.= ma /a - aa C 14) Γ e s- Γ onde ϊ Ϊ * K/CR s as) InfC = 755/CT + 275 J * 2,5006 (16)

• T * temperatura em sC A aetsvidaacie relativa (A ) s catia uma das temperaturas r teste pode ser calculaaa por à « CL--/L-,? Uí„/k.TJ U7) r t η Ki onde ; íunçio d« ectivideae «t temperatura* T.

Ljj" furte fo d* actividacl® á temperatura tíe referência» R. fc 3 constante da veloc iclacía de isoperisaçSo â r tesfperature o© referencia» R,

k~» constante cia velociaade de íso»s ri sacão· s I temperatura de testa, 1 .

As constantes csa velocidaae de isomerizacSo são calculadas usando a axprtsssdo seguinte‘

Irík « --6654/( Γ i- 275) f 15,357 - 22 - A activtç&fcde relativa esta representada vs temperatura, como se mostra na Figura 3 © o T»f> &? determinado por ir-terpolaçSo s partir das coordenadas nas duais A = 0f64iL Cn « 2j-

P

Estirpes úteis, para. _a. Pratica do Invento

Estirpes de bactérias mie produzam glucose isomeras© tendo as novas caracteristicâs descritas nesta ssmdria descritiva, embora nlfes sendo ubíam tar ias , sSo cartomante cossopoi i tae, Os organismos sêo recuperáveis » partir da uma variedade de ecossieternas no· Tsve-s, “ontana, Cal i fôrma, Pensi 1 vânial assim como em Porto Rico. A existência na algumas condições- no solo prognosticarão* numa larga i.<|.snalo, « presença destes micro-organismos Entre as caractetesticas do solo adspuaoos para o crescimento destas baeta?'-ias a» importantes são humía-aas ©levada, un? pH neutro, ante© de 6,6-8, s uma temperatura na superfície etevaoaj temo*® importante è um teor em mineral de inectxvacSo cio snzima baixo © um caixo teor ©m cálcio. 0 guadro ííl apresenta uma lista dos cípos cim haDiiais, nos guaís os mãcroo-rgaríismoe* tere-s ces· .ioei'to-5, © operário pen&o também reconhecerá rapidamente outras fo«tes woteneiais de bactérias, tendo s® vista, os teus tais demonscr^oos «pui .

Quadro III

Local Idades......ag.....quais.......o ..ftatA 1 ly^m^ioí.ilico ioi. Recuperado.

Texas; Ao longo do caninho 46, êproximatíamente a 20 milhas d© Boustoo, na d.iraeçâ© a ôaiv&stoiií num campo d© error lavrado, com solo muito escuro, a temperatura <k? solo ao melo dia, num dia de sol, atinge bem acima cios 87,8C6 í'|00eF> íFigura 4, PSapa 45* -Junhos 1982 a Janeiro, 1,934. '& '*

Myomliig/^Qiiiana? No Parque Nacional de Yel lowsfcone» na área de Mafflmofchí em 1-2 mi lhas da estrada principal, rio seio* no limite das muitss primver&<» quentes ne»tq ares CFIgyrs 4, fiapa b) j •Julho, 1993.

CalafArnial No Parque hacionsã Vvlcênico de Lessen, no solo* nos íímxí-mm das primaveras «osnies no vale da area Lifcile Hot Springa, em Sumpass Heli \Fiqura 4, rlap-ft €>; Setembro, 1594.

PansiIvániaj Entre as cidades de Centralie © Ashland, mesmo ao lado da estrada principal» nume Êrtrnsla dm 2 milhas, no solo com limitas ds correntes tíe vento que são visíveis a partir da estrada CFígyra 4, Mapa 05; Novembro, 1584. porto Riccd Na Floresta Experimental de Luquilio, uma floresta de chuva de EI Yunqu®, ao longo do trajei: to principal que vai a Pico dei Oeste, aproKímãdamenie? & 1/2 milha » noroeste do pico, em wgeiaçJCo degradada (Figura 4, haps E>; Ifeio. I9S4.

Uma v©3 colhidas, es amostras do solo sffo analisadas para a presença de microorg^msíjos produtoras ete glucose iso" meras® israoestável, de acordo com o mecanismo seguinte ·' 24

jleío osadQ_.par.a....propagftr...oe... mierqo.rganigm.os isolarias na primeira, segunda e ctercgira .analise;

Xilose 0»õlCseparadaaenie em auèoclav©>

Licor com milho pracipifcario ¢48¾ da sólido») iS Peptona 0,6¾ feCd 0=2¾ Exiracto de ievadura 0,1¾ MgS0,.7H~jB Os 024¾ ai’ CoC 10,0-024¾

Aga r Kf2HP04 kh2po4 PH 2tSS. 1 , I* 0 : 0¾ 6,8¾

Anà i i se pr i mâr i a : Amostra do solo i

Pratos de ag#r e nilosa grandes fora® snoculades com a suspensão do solo a mcubadoe a 6SsCs durante 16 horas ψ Colónias isolao-as foram recolhidas» lastradas em pratos peiri pegusnos ííúú h 15 w) m incuoadas aos 588C, durante 18 horas. As ccndoias isoladas «rue se desenvolveram a partar w?s lastra® foram encontradas como sendo pyris. v

Estas colónias puras forais uicculscas em pianos incli nados da sç ar © ?αΖ o»e psra a anã lisa segunaâráa & para a manutenção. âBâllm-ÀfiMOdãE.Ífi, Í

As colónias isoladas nos planos inclinados foram listradas em pratos patri de agar © xilose © inoculadas aos SSeCf durante 16 hor^s. J#

As colômas em crescimento de cada colónia isolada foram fpagmeniâaas © c.oíocaoas em tubos de tsst-e# contendo 1,S ml de tamplo de isetaoe CpH & s S) & sujeita® e ult.pa-&onsf durante 10 segundos. Depois 2,5 ml de solução de suosiraio de glucose a 40% descrita anfcs-rioraentej foi adjtlormoo, «nstureoa e os tubos d© teste foram mcuoados ouraota 1 norau aos 9SaC.. ν'

Apâ» » jiicubacSo a **e»cçâo oe isom®risacão nos tubos de teafc® foi ssaraoa por adi cio de IQUuZ de HC1 1M & «s amostras forem enseladus relsi-ivsmeniã Λ frutos©. 0 ensaio para a frutos© foi feito usando um Auto-analisador Tecbnícon, A frutos© reage c&m reagente de ácido de eis-telno-carbazole-sulfurico © a resposta colonmetrica d medida usando um colorímmtro © um registador, (Llordi N.B., et si., Cereal Cbem, , *9, 544-55* £15723.·.

As coiomas iselaaas que mostra® Quantidades superiores do que a médle em frutose vlfc para a análise tercei F‘í a

QnÃlisg

As melhores colónias is o doas, doe resultados? da ônâi.isa aegurd-sr ia foram 11sarados ®m pratos s=>efcri de agar e xilose s xncub-aoa*· aos 5ôeC, durante 16 horas,

V fta colónias em crescimento foram fragmsntaoas em 2 ml de irsíwpã© do «aleato CpH 6iS>» sujeito a ultra-sons durante £-B segnnoos Cf ragmaniaGoe aos 15 segundos ?j cent r ifusados & fíItrados usando um* membrana filtrante com 1,2 «icron, w

Os eatractos oas células obtidas desta modo foram ensaiados para a activxdad® em glucose isome»*ase pelo ma todo da TecNiicon. #

Pm glucose isoas?rases isoladas foram avaliadas pelo método· da ffíicropipeta capilar,, praviamento descrito. Depois de incubado aos DSClC; durante 40 minutos * a rstacçlo foi parada com ftcidos e o taor amt glucose— -frutos© foi ensaiada por GlAR. fis amostras foram automaticamente injectadas est CLftR, ® os açucares foram separados po** uma coluna da hldratos cie carbono 27 ~ <#34038 Waters Assoe . Ir»c j, ummnaa aceionitrilo/âgua <00/203 coeo uma fase atôvel, aos 30SC, 0 aparelho os ra?fratctfo difsTsneiai feteiars R-4ÔI 6 usado cosao deieeior, & fl-730 Data dodule conw registador/grafico. Os resultados mSo eomparedoa ccm o brarscc (nenhum snesiiis) e as colónias isoladas gus mostram aciiviaada fora® novameme avaliada®. Mais do « 14000 suo-st-Snca?s ^soladas fora® investigadas e depois culturas selscr toram avaliadas pelo· teste de T.n„,

'J descrito anteriorfsente, tenco mostraao uri numero ds valores de 7-vft !ϊ*υ® ®sc®d©m ouelguer qss isoseisses da têcrisca anterior <ver quadro V3,

Os «nziniâfe <%*« possuefa valores de que sxcedesi os 93® C» são úteis na pratica de presente invento, Particuiarment© ateis sSo «nimws com τ,.Λ r*a g#m« descia pelo menos os 93°C, ou cerca de 94°Cí a c»re» ae i25aC, Tparticuiarments úteis sSo as enxiRias coç T„s/.t na gama desce cerca de 94SC a cerca a& liGaC. 0 fasconâffllcae do presente quadro ssgyιr*&© relevantes de im invento que indíce âí im eusi. numero de gue eles rio das cerscterCsticae Hiícroorganrsmos isolados sáto do género

Quadro IV

U tn CU U3 U cn H (U CM -P -H -P — p n cd r' Õw: Ο σ a?

Io Ê u Η O 0) EHx: <c -p-H: P W G ei*. v* cH c t· íS r i s i»·· x ç iri © o o 'i s ç? ,15¾ do * CF* O 00 00 * <£> 00 LO KÓ bO CM UD IO * 00 m VD «£> d (D -P íti CU u α s w (ti ffl d u o a <-> bocas Prosksusr Φ rH CM 4* $ c m -η 0 • ,>d m CQ Q,cm fH1 Crescimento anasróbico -* ~ - p obre - Mot i 1 ·. dada «. 370 0 ) - 4 -fce 4* 4·' -a.· -f* φ Hidrólise do amido - -- - φ Cf®fsc imento era MaCI a 7fc - - - - 1 lisozlma - ·- - - - mzida dm Nb - - “ - - dasc i. r o se õ AS í Df-Í Pi , ? / -* - - - - „„ Indo1s „ - - „ - -- IfeacçSo de Sram + f/·-- Φ/ — -J, g v~* Φ + Ca ta 1 ase Λ. »4 o, 4* C i t r a t o •4- .... - - Φ »- FísduçSo cio nitrato “ + •ir 4, 4., Esporos T/ôT 1 / ví l Ϊ / % >r T / O T i / -W- It "Γ / C; T H.-.S - - ~ - - Γ^'ίΐΐ'Ρ'1 , i cfe C 'P'L: 1 fo-çd';1 í fc:U· ITlBKl ITí'3. : " C .: ÔÕ ô7 c c w -m f' λ-~ι 70 70 Temp f. í de c resc 1 issn to mimma, °C, í? ·" 2« 3S 36 40 Bsl&çMo liquidificada 4 4" 4 Φ + - q i yç οΦβ a c s d i f i c aea t-i-í 4 PL; Φ + .4 T Terminal ST a Sob TeriB í na 1 •í* O Ub3 fa Π C Í S. 3.30 ãda cio «luearo ív μ.'

Quadro V } v

VaI ores de Τ^Λ út-sis na pratica do presente invento. Iso1ado No, F©nte..dOoSOÍOft T?,rt 12,117 Parts i1vãnia £Ú- 55,9 .12, 143 Penei 1 vãnis. 96, ,1 12,137 Pensi l vârua S5,S 39 yvo®mg/Nont.aria se,e '330 9 Wvomíng/Hontana 97,3 12,126 rensiIvan3® 37,3 10,050 California 37,3 4510 y yo®ing/Nonte na 37 s 4 12,122 PensxIvftnia se, i 2197 Tesos 98,1 12,124 Psnsi Ivârua 98,2 765'? Porto Pico 98,3 10,054 Cai £ forma 98,3 12,11,3 Penei Ivânza 98,7 6S-Jb Porto Rxco 38 xQ £T. èT O /iT. Porto Psco 66S3 Porto Pico 1o©, y #* Do Quadro IIÍ anterior

Os organismos σο presente invento podem crascar nua meio da licor precipitado d© sxiosa/aiilho, A «ilose asv© estar - 30 - presente no ramo para a produção oa glucose xsossrase, Também* a adlçS© de iMsnêsjo ©o &&io e preterido para promover o cresciaen-t© do organisfflo, Gs organismos sSo capasss ds crescerem a temperaturas ente® cerca de 2A°C & 7G3C; mas o crescimento ocorre entre os SOeC a os 62”C. Sob estas condiçSas, os rendimentos de glucose Isomerass eslão na gama desde cerca cfe Õ,S a í ,ó l&W/ml„ As temperaturas elevadas. As m-í-ug o organismo cresce. fornecera uma vantagem adicional em eua eles paramente permitem uw período rela,vi tassent® curto oa incuc-acSd. Norma Imanta 6-10 noras é um psrlodo suficiente de tampo p&r* *s produção de níveis satisfatórios d® enzima. 0 maio de crescimento & f-fêparado pelo modo seguinte í

Xilese II Cfiltro estareiisado5 Êjíiracto de teveaura 0,1%

Licor precipitado as milíio £LH1 > {«8* d® teiido,? 2í N«C1 0,2 g

Acido cesaraiao l%

MgSO ^ 7Ho0 d, 0-3# fC„HPG. 1,1»

Kf-LPCL 0,6» ií.. "<J,

Syrafactani·® Plurônico Lól ϊ gota CBASF yyantíott-s Corp. ) pH 6,0

Os organismos cresceis ©ra frascos agitados a 200 RPM, a y»s temperatura de 65®C, seguido por* propagação era fermentadores â escala laboratorial cora arejamento í,1 y/v, a umm temperatura de 56CC, e agitação de ôõO ftteí. 0 enzima produzido deste modo ô operâvel numa larss gama de temperaturas. Contudo* constituem uma vantage» principal que a sua actividade óptima ocorra a tenwaeraturas muito supericr-re© do que aquelas associadas com os organismos antariormsnte conhecidos,

Além disso,- os enzimas podam ser usados num estado imobilizado* por exemplo. como nos processos descritos nas Patentes dos E. U. nos.4.411 S5fi ou 4.λιο,.&27, As condi cÕ«rs sob as quais a isoíi*erizaclo pcd® ser realizada varia», mas os melhores resultados aâ’o obtidos qu-uicfo a srauç-fo pmo ceonier» a glucose ©stá na. gama d® cerca d& 5-0 ® 50¾. u pH aa eolucSo» que contém st glucose devo ser mantís·.· no gama as »»0 & 7,0. Ma sonjção que coniéa a glucose pode íwvrí estar xncluido vftrios activadores de ifies s/ou estão®! izadore-s como «n»aoeiíc>s ferro ou cobalto» ou sua. s c omb i naç fites. 0 âmbito do presente invento O ilustrado1 pelo exemple* seguinte, que não deve ser entendido como sendo limitador do âmbito do invento.

Exemplo 1

Este ©xesplo ilustra a pyrificacio a imoba1izaclo da glucose ieostema© teriaoesiavel. ubil rm prática do invento. .Purtfiuas.go Parcial do macrc^gaaismo isolado 6653

Exbr&cçSo - celular congeladas foram suspensas a uma concsntracSo de ig ds c#lulãs/4 ml * nuisa solução que contém m&ka&to 60 mfí, pH 6f5, £0 mg ds líeozima/4 mi * aminm quaterrun? 200 rfti como Cloreto ds õenzalcõnio CCBTte A suspensfo foi agitada vígorosemsni® ouraril® 4 32 horas, aos 4SeC» os fragmentos celulares removidos por cenirifugacfio.

Trst-aTOTito tom aquscisento - 0 extracto foi aquecido aos 80 aC © mantido owrariia 10 minutos* apôs os quais um precipitado branco pesado foi removido por centrifugação. UI traf 11 traçio ~ Cf extracio clareado foi ultraf il trado e diafiltrado com uma aesidrana cortada a© Peso Molecular de ΐΌΟ.ύύϋ CMoPM). 0 anisiisa foa retido. ororsa tografía mn celulose DEAF ·- 0 concantrado da uitrafiItraçlo foi ©placado a usa coluna o& celulose OEAE equilibrada a pH 7 com tampSo Tris 2fi an. Um gradiente cio haõl foi aelicaao para a sluiçfo do enzima a cerca de 3aCl O,26 r'. As frscções activas foram juntas e dess l imsacias numa membrana UF iMCPH? de 50í000 -

Cromaíografla da filtrado em gel - Uaa porçfib do ©leato cia celulose 0£ft£ eoncenfcraao foi aplicado a .uma coluns T&K PU--35 (rs-jinsí cl© vim Sts hidrof£11ca * Herckl x_J: & eluicia cos tamido de fosfato 2S mil.

Uma estimativo aproximada de purificação através da cada passo d# purificação é « seguinte; âci-ivadaga eapeçifica Células E^iracçlío Tratamento com aquec Iraerii© UItraí i1 tração Celulose DEAE FlltracSo em sei 2-S IQIU/g da pasta de célula húmida 0,17 ISIU/rag de proieioa 0,6-0, S 1ÔÍU/F3S de proteína 1 — 1, s 2 lôlU/fis de proteína Zi? leiU/mg de proteína nd,

Usa vez a glucose isomaras© purificada, foi imobilizada de acordo com os procedimentos da Fatani® dos E.U, ã. -BBB.717 & também testada para # estadelidace térmica de modo seguinte; 40 »!, cie glucose isosieraea purificada parcialm©nt© com actividade total de &7& lõíu í11 *86 I6iU/fflII foi ajustada a pH 7,2, depois 8,61« a@ CDQ d,b. í. Celulose Derivada DranuiarJ foi adicionada ao enzis>a © raisiurado durante 13 horas â t-asperatura ambiente» em Cu02¾ de âsisa d* sódio, uuand-o © ansuaa foi ad™ sorvido ss IOOJú a activ4>j«ds do soziraa imobilizado foi encontrada como sendo era *00%. a activioade ao enzima iimodi 1 izado foi encontrado coíbo sendo 72 ISíU/g ras base b&?cs, esi peso, h glicose ieoiaerase Imobilizada í 6 Π V fox testada para a estabilidade térmica aos 50 °C e 100SC, usando 0,51 g/s-1 de substrato (glucose)llgSõ,, 10 raH e FeSCL 0.5 mH. por monotorazacão do 41: 41 efluente cora um polarirastro para a concentração de frutose. Os resultados mostrarem ura· rae?a vtda oe 16,8 minutos aos í00®C s 33,6 minutos aos 30 SC s Ea de 100 Kcal/mole.

Claims (1)

1. fie ivintií cacifes II. - Processo para a obtenção de u?» enzima capaz de isomerizaçSo cie glucose em frutose, carac ter azado por a referida glucose isomeras© ser isolada a partir de im mmúbro de género itllllMS. 2i. - Processo de acordo cor» a rei vinda caçSo 1 torizsdo por se obter um enzima capaz de isonierizaçlfo da era frutos®, «rue possua um*? seca-vida cie vinis minutos i7 temperatura de pelo menos de MSC, carac- glucose 20' a uma 3â. iarizado por 126 0 C. - Processo a referida de acoroo τ ‘20 ser com ® reivindicação 2, carac™ cli cerca de 94®C a cerca de 4§, - Proces&o de acordo com & reivindicação 2 ou 3, cftfacterizado por o referido aniisa ser íhíods,lisado num suporte íneolôvel, SSL - Processo cio scordo som a reivindicação <&, carac- larizado por o referido suporte insolúvel sar d i © i i 1 ass &no·-©i i 1 -“celulose granuíer <DCô> Si. - Proc&w-Sl·* para & isomerizaçff© da glucose em frutos®, gue coiaprsenue o confcacio se us licor al isentar gua contém glucose, cont©ndo desoe ΐύ a cerca tis S4 por cento, de glucose, cow uma glucose íãesseresr, a uma temperatura de desde cerca de 30® a cerca oe I30fí, a um pH de tiesd® cerca de 8,S a cerca de ô a w»· tasm-s c& contacto de desde cerca dm 10 segundos a cerca de 5 horas, para converter p-juu menos 83 a cerca as 60 por cento, ©m peso. da giucosa ore*sente· no referido licor. em frutos© com nenhuma formacSo substiocí® 1 cia psícosí, caracierizado por s© snpregâr uma glucose iBoiaePãsa gue possuí uma «eisi—¥ida de vinte mi nut·os (Τ.-.Λ) a uma teSsPe?*atu“a de pelo menos de 93°C, 7â. - Processo cl® açore» coa a reivindicado &s carsc-tsrlaado por a ser de dasde cerca d® S4°G a cerca a» Í2,S°G. 8i, -"· Processo de acordo com e reivindicação 6 ou 7t caracteriaado por a refenaa glucose ísoiierase ser gujmicajiente estabilizada ou a referida glucose i some rase ser imobilizada num suporta insolúvel, Stô, ~ Processo de acordo cus a reivindicação &t carac~ terízado por o referido suporte insolúvel ser distilamino~afci1 celulose granular CDCS). lOã. - Plicroorganismo® numa forma feiolôgicaraente pura, caractsrizãdo por produzir um enzima capaz da âsoaserisacio da alwcoss* en frutos», sue possuí ume de vinte minutos Cttol a uma temperatura de pelo menos de S3SC, d*\J ííi " Pdcroorgenismos o® acordo coa a rasvindicado li* carãctôfisaõo por ser us memoro do gdnero 5sei1lus. Lisboa, 1? de -Julho c# xúss.

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