PT91099B

PT91099B - Processo de preparacao de peptidos de ligacao a proteases de retroviros, dos seus intermediarios e de composicoes farmaceuticas

Info

Publication number: PT91099B
Application number: PT91099A
Authority: PT
Inventors: William Francis Huffman; Brian Walter Metcalf; Geoffrey Bainbridge Dreyer; Thomas Downing Meek; Michael Lee Moore
Original assignee: Smithkline Beecham Corp
Priority date: 1988-07-08
Filing date: 1989-07-07
Publication date: 1995-01-31
Also published as: EP0352000A3; IL90872A0; ZW8289A1; CN1039596A; EP0352000A2; PT91099A

Description

MEMORIA DESCRITIVA

ANTECEDENTES

Os retrovirus, isto é, vírus dentro da família dos Retr viridae, são uma classe de vírus que transportam o seu material genético como ácido ribonucleico em vez de como ácido desoxirribonucleico. Também conhecidos como vírus ·'tumor-ARN, a sua presença foi associada com um grande número de doenças em humanos e animais. Acredita-se que eles sejam os agentes causadores de estados patológicos associados com infecção pelo vírus do sarcoma de Rous (RSV), vírus da leucemia murina (MLV), vírus do tumor mamário de ratinho (MMTV), vírus da leucemia felina (FeLV), vírus da leucemia bovina (BLV), vírus do macaco Mason-Pfizer (MPMV), ví_ rus do sarcoma símio (SSV), síndrome de imunodeficiência adquirida símia (SAIDS), vírus linfotrópico T humano (HTLV-I, -II) e vírus da imunodeficiência humana (HIV-1, HIV-2), o qual é o agente etiológico da SIDA (síndrome de imunodeficiência adquirida) e de complexos relacionados com a SIDA, e muitos outros. Embora os p_a togéneos tenham sido, em muitos destes casos, isolados, não foi desenvolvido nenhum método eficaz para o tratamento deste tipo de infecção. Entre estes vírus, o HTLV e o HIV foram especialmente bem caracterizados.

Embora diferentes em detalhe, todos os retrovirus são bastante semelhantes na estrutura global. A partícula de vírus extracelular é composta por uma membrana exterior eriçada com gl_i coproteínas virais, um núcleo de proteínas estruturais e um genoma de ácido ribonucleico de cadeia simples. 0 genoma retroviral tem uma organização regional caracteristica, referida como estrutura 5'-qaq-pol-env-5’, em que a região qaq codifica para as proteínas estruturais do núcleo, a região pol codifica para certos enzimas virais críticos tais como a transcriptase inversa, integrase e protease, e a região env codifica para as glicoproteínas do envólucro. A replicação virai ocorre apenas dentro das células hospedeiras e é dependente das funçães celulares do hospedeiro. A produção de proteínas virais funcionais é crítica para esta replicação. A síntese proteica é efectuada pela translação do

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í.-3quadros de leitura abertos para as construções de poliprotelna, correspondentes aos quadros de leitura de qaq, pol e env, que são processadas, pelo menos em parte, por uma protease virai nas proteínas funcionais. A actividade proteolítica determinada pela protease virai no processamento das poliproteínas não pode ser fornecida pelo hospedeiro e ê essencial para o ciclo de vida dos retrovírus. Na realidade, demonstrou-se que os retrovírus que não possuem a protease ou que contêm uma sua forma mutacionada, não possuem infecciosidade. Ver Katoh e colab., Viroloqy, 145, 280-92 (1985), Craujford, e colab., 3. Virol., 53, 899-907 (1985) e Debouk, e colab., Proc. Natl. flcad. Sei. USA, 84, 8903-6 (1987). A inibição da protease retroviral representa, portanto, um método de tratamento para a doença retroviral.

As proteases retrovirais não foram bem caracterizadas. Tanto as proteases como os seus substratos poliproteicos são recu perados a partir das partículas do virião com um rendimento muito baixo. Para avaliar a sua actividade é necessário estipular um substrato para expressar a actividade proteolítica. A utilização do substrato natural para analisar a actividade proteolítica apresenta dificuldades experimentais na produção, purificação e quantificação do substrato e dos seus produtos de hidrólise. Mui. tas destas desvantagens podem ser ultrapassadas pela utilização de um pequeno péptido, o qual pode ser produzido sinteticamente e na forma pura, para analisar a actividade proteolítica. E, portanto, altamente desejável e vantajoso produzir pequenos péptidos que podem ser utilizados como substratos para estes enzimas.

As proteases são enzimas que clivam as ligações peptídi. cas nas proteínas e polipéptidos. Estão presentes na maior parte dos sistemas biológicos, onde cumprem funções quer metabólicas quer reguladoras. 0 seu papel no metabolismo ê o de hidrolisar os polipéptidos em péptidos mais pequenos e, em última análise, nos seus aminoácidos constituintes. 0 seu papel na regulação bio lógica é difuso e é o tema de diversas investigações. Ver, como um exemplo, Bioloqical Eunctions of Proteinases, editado por H. Holzer e H. Tschesche, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-Neiu York (1979).

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-4Um dos seus papéis reguladores é o de processamento pó.s -translaccional de polipéptidos para formar proteínas, enzimas e mediadores. Essencial para a sua função reguladora é a sua capacidade para actuar selectivamente sobre os polipéptidos. Esta se lectividade é constituída por dois factores, 1.) a sua capacidade para actuar sobre substratos específicos, e 2.) a sua capacidade para hidrolisar apenas as ligações peptídicas especificas. A um nível estrutural, esta especificidade de substrato é o resultado da sequência de aminoácidos primária, a conformação local resultante do polipéptido substrato e dos aminoácidos que formam a ligação peptídica no sitio de clivagem.

A informação da sequência concernente ao suposto sítio de clivagem nos substratos naturais poliproteicos está disponível para diversas retrovirais. Contudo, os substratos peptídicos para as proteases retrovirais são, até agora, desconhecidos. Além disso, dado que as interacções de ligação do substrato natural são desconhecidas, é muitas vezes dificil predizer qual o tamanho do péptido que será satisfatório. De forma semelhante, dado que a conformação de um polipéptido grande pode ser significativamente diferente da de um péptido pequeno, é difícil predizer qual a sequência de aminoácidos que se ligará de forma satisfatória num péptido pequeno.

estudo de proteínas virais pelo sequenciamento de ami noácidos sugeriu alguns resíduos de aminoácidos comuns dentro da região de clivagem para as proteases retrovirais. Por exemplo, Casey, e colab., 0. Virol♦, 55, 417-23 (1985) revela a sequência terminal amino da proteína qaq p24 madura do HIV-1 como sendo Pro -Ile-Val-Gln-Asn, indicando que o resíduo de prolina está enuolv_i do no sítio de clivagem. diMarzo 1/eronese, e colab., Science,

231, 1289-90 (1986) propuseram um sítio de clivagem (indicado por *) para a transcriptase inversa (RT) de Thr-Leu-Asn-Phe*-Pro, o qual atribui à RT um terminal amino de prolina. Debouck, e colab., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84, 8903-06 (1987), sugeriram que a protease do HIV-1 é autocatalítica e revelaram que o terminal ami no da protease contém a sequência Pro-Gln-Ile-Thr-Leu. Pearl, e colab., Nature, 328, 482 (1987) compararam alguns substratos pol_i

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-5peptidicos precursores do núcleo para um vasto grupo de retrovírus e sugeriram uma preferência da sequência para clivagem no X-Pro para as proteases retrovirais, em que X é geralmente quer um aminoácido aromático (Phe, Tyr) quer um aminoácido grande e hi drofóbico (Met, Leu). E ainda sugerido que esta sequência é geralmente flanqueada, em qualquer dos lados, por um aminoácido pequeno e hidrofóbico.

A estrutura de muitas proteases retrovirais foi examina da, baseada primariamente na sua estrutura de aminoácidos predita a partir da sua estrutura nucleotidica. Elas são geralmente cod_i ficadas na extremidade 5' da região pol, na extremidade 5’ da região qaq ou entre (mas fora de quadro com) as duas regiães. Yasunaga e colab., FEB5 Lett., 199, 2, 145-49 (1986) revelam boa homologia de sequência entre famílias de retrovlrus e demonstraram diversas sequências altamente conservadas entre os membros da família dos lentivlrus e da subfamllia HTLU/BLU de retrovlrus.

Métodos para expressar as proteases retrovirais em E. coli foram revelados, para o virus HIU-1, por Debouck e colab., Proc. Natl. Açad. 5ci. USA, B903-06 (1987) e Graves, e colab., Proc. Natl. Açad. Sei, USA, B5, 2449-55 (1988).

Até à data foi empreendida pouca caracterização bioquímica das proteases retrovirais. Contudo, foi sugerido por Katoh, e colab., Nature, 529, 654-6 (1987), que certas proteases retrovirais podem ser proteases ácidas. Isto é baseado na observação que a pepstatina, um conhecido inibidor da protease ácida, é um inibidor fraco das proteases retrovirais associadas com o virus da leucemia bovina, o vírus da leucemia murina de Moloney e o virus da leucemia de células T humanas.

Métodos para a produção de inibidores da protease de proteases retrovirais foram revelados por Kettner, e colab., Patente dos EUA NS. 4 656 492 e Kettner, e colab., Patente dos EUA NS. 4 644 055. Desta maneira, tri- e tetra-péptidos, os quais correspondem substancialmente à sequência de aminoácidos do sítio de clivagem do substrato da protease, são modificados para passarem a possuir, no terminal C, uma porção halometilcetona. A halo

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-6metilcetona, sendo uma porção reactiva, é pressuposta reagir com a protease uma vez que a ligação do péptido se tenha efectuado.

Apesar de não relacionados com as proteases retrovirais, Umezatua e colab. , isolaram inibidores de um grupo diferente de proteases por exame de filtrados de culturas microbianas. Ver Proteinase Inhibitors; Medicai and Bioloqical Aspects, ed. Katunuma e colab., págs. 3-15 (1983), Japan Sei. Soc. Press. Tokyo/ /Spr inger-Verlag, Berlin. Alguns destes inibidores peptldicos, tais como a bestatina, amastatina e pepstatina, contêm aminoácidos incomuns que não são aminoácidos ot . Acredita-se que estes inibidores actuam por apresentarem uma ligação carbono-carbono, não hidrolisável, à enzima proteolltica no sitio cissil.

A pepstatina, um inibidor pentapeptidico isolado a partir de uma cultura de 5treptomyces, demonstrou inibir uma larga variedade de proteases ácidas, e atraiu a atenção devido à sua capacidade para inibir a renina e a pepsina. Uer Umezawa, H. e colab., 3. Antibiot., Tóquio, 23, 259-263 (1970). A pepstatina contém o aminoácido incomum, ácido (3S,4S)-4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptanóico (AHMHA), denominado estatina, em duas posições do pentapéptido. Este aminoácido incomum não é um aminoácido o<, mas acredita-se que funciona como mímico dipeptldico e apresenta a enzima uma ligação carbono-carbono em vez de uma ligação peptí. dica cissil. Os derivados peptldicos contendo estatina têm sido utilizados para inibir as proteases humanas renina e pepsina.

(Uer Cazaubon e colab., Patente dos EUA l\J5. 4 481 192).

Foram feitas modificações da pepstatina, por diversos grupos, para optimizar a sua actividade em relação à inibição da renina. Rich e colab., 3. Med. Chem., 23, 27-33 (1980) mostraram que a quiralidade da estatina incorporada na pepstatina é im portante para a ligação e fizeram modificações da estatina para provar a relação entre a estrutura e a actividade inibidora. Assim, o ácido (3S,4S)-4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanóico (AHPPA) apresentou actividade semelhante à da estatina quando incorporado nos péptidos em lugar da estatina.

Outros análogos dipeptldicos, que contêm uma ligação

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-7carbono-carbono em lugar de uma ligaçSo peptídica, foram sintetiza, dos e estudados por diversos grupos. Muitas destas tentativas e_n volveram estruturas estreitamente relacionadas com a estatina por modificação do carbono portador do grupo hidroxilo e do carbono adjacente. Assim, derivados oxo, derivados diamino, derivados d.i -hidróxi (Thaisrivongs e colab., 3, Med. Chem., 30, 976-82 (1987)), derivados desidroxi (Rich, e colab., 0. Med. Chem., 23, 27-33 (1980)), derivados contendo fósforo (Grannousis, e colab., 3. Med. Chem., 1603-09 (1987)) e derivados flúor (Fearon e colab.,

3. Med. Chem., 30, 1617-22 (1987) e Thaisivongs e colab., 3. Med. Chem., 20, 2080-87 (1986)) da estatina foram todos sintetizados e a sua capacidade para inibir a renina ou a pepsina foi relatada. Foram também descritas variações, nas quais um grupo metileno substituído é inserido ct em relação ao grupo carboxilo da estat_i na, para inibição da renina (Luly e colab., Requerimento de Pateri te Europeia EP 229667; Fung e colab., Requerimento de Patente do PCT PCT/WO 88/05050; Evans, Patente dos E.U.A. 4 655 055; Hester e colab., Requerimento de Patente Europeia EP 173481). Estes análogos dipeptídicos apresentaram capacidades variáveis para inibir a renina e a pepsina, sendo a sua actividade especifica também dependente das porções adjacentes, as quais medeiam a liga ção a estes enzimas. 0s métodos sintéticos empregues nestas reve lações são aqui incorporadas por referência.

Existe uma necessidade para péptidos que ligam proteases retrovirais a fim de testar a actividade da protease e para fornecer inibidores da actividade da protease retroviral para uso farmacêutico. Tal uso farmacêutico proporciona tratamento para doenças que, até agora, foram não tratáveis.

X

SUMARIO D0 INVENTO presente invento compreende o processo para a preparei ção de péptidos, daqui em diante representados como fórmula (i), que se ligam a proteases retrovirais. Num ponto, estes péptidos são úteis como substratos para analisar a actividade da protease. Noutro ponto, estes péptidos são inibidores das proteases virais e são úteis para o tratamento de doenças relacionadas com a infec

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-8ção por estes agentes.

Este invento refere-se também ao processo para a preparação de uma composição farmacêutica, a qual compreende um compo_s to de fórmula (i) e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Este invento compreende ainda um método para o tratameri to da doença virai, o qual compreende a administração, a um mamífero necessitando do mesmo, de uma quantidade eficaz de um compos to de fórmula (I),

Este invento fornece ainda um método para analisar a actividade da protease virai.

Ainda num outro aspecto, este invento refere-se ao processo para a preparação de um composto, representado daqui em diante como fórmula (ilb), o qual pode ser utilizado como um intermediário na preparação dos pêptidos de fórmula (i), que torna o péptido resistente à degradação pela protease virai.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Os pêptidos de acordo com este invento são ilustrados pela fórmula (I):

A-B-(Q)_a-(C)_b-(D)_c-M-(w)_d-(X)_e-Y-Z (I) em que:

A é BocNH, CbzNH, H, R'RN, RCONR' ou DnsNH, ou se a, b e c são 0 e Y é uma ligação covalente, então A é H, Boc, Cbz,

R ou RCO;

B é um ou mais aminoácidos D ou L, /3-Ala ou é uma ligação covalente;

C e D são iguais ou diferentes e são Glx, Asx, Ala, β, -Ala, Arg, Gly, Ile, Leu, Lys, Ser, Thr, l/al, Met ou His ;

é um aminoácido D ou L e ê Ser, Thr, Asp, His, Cys, Arg ou Ala;

W é Pro ou Δ 3-desidro-Pro;

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-9X é Ala, Gly, Ile, Leu, Vai, Met, Lys, Glx ou Asx;

Y é um ou mais aminoácidos D ou L, ou é uma ligação cavai ente ;

Z é C0₂R, CDNR'R, COR’, CH₂0H, CH₂NR'R ou H, ou se d e e são 0 e Y é uma ligação covalente, Z é OR ou NR’R;

a, b, c, d e e são, cada um deles independentemente, 0 ou 1, desde que c e e não sejam simultaneamente 0;

M é Cha, Phe(4’R ) ou -NHCHR.R»-;

x z em que:

R^ é, independentemente, AlqC^_^, (CH₂)_nSAlqC_{1 5}, (CH₂)_n0AlqC^ 5, (CH₂)_n cicloalquilo C^ ? ou (CH-) C.H.-R ;

' 2 ’ m 6 4 a ’

R_q é halogéneo, OR’, N0₂, NH₂ ou H;

R, é (CH„) -, CHR,(CH„) CO-, CO(CH_) CO-,

2 n 3 2 m 2 m

CHR-.CHR-., (CH„) CO-, CHR ,CHR , , CHR. (CH„ ) CO-, j 3 ’ 2 m ⁷ 3 3’ 1 2 m

CHRCHRCHR'(CH) CO-, CHR CHR ¹ CHR, (CH„) CO-,

2m 3 12m

COCHR.CHR’(CH„) CO-, COCF„CR’R(CH„) CO-, COCF_n(CH„) C01 2 m ⁷ 2 ' 2 m ’ 2 2' m

CH=CR’CHR(CH„) CO-, C0CH=CR'(CH_n) CO-, z m z m

CH„5(0) CHR'(CH„) CO-, CH„NR’CHR(CH„) CO-, ζ p zm z z m

P=O(OR’)(CH₂)_mC0-,

R-j e Rj, são, cada um deles independentemente, OH, H ou NH₂;

R₄ é OH, H, NH₂ ou =0;

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-10m é, independentemente, 0, 1, 2 ou 5;

n é, independentemente, 1 ou 2, p ê 0, 1 ou 2 ; e

R ' é H ou AlqC^ ;

R” é H ou AlqC^^^g;

R é H, AlqC^ cicloalquiloC, (CHg^CgH^, (CH,) C-H.N, (CH,) OH, (CH ) NH,, ou (CH ) NHC(NH)NH,;

Ζ n 5 4 Zn znz ζ η z e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Também incluídos neste invento estão os processos para a preparação de sais de adição, complexos ou pródrogas farmaceut_i camente aceitáveis dos compostos de acordo com este invento. As pródrogas são consideradas como sendo quaisquer veículos ligados covalentemente, os quais libertam, in vivo, a droga de acordo com a fórmula (i) original activa.

Porquanto possa diferir da notação convencional, deverá notar-se na fórmula (I) que A compreende o grupo terminal amino do péptido e Z compreende o grupo terminal carboxilo do péptido. Assim, quando A e 1 são H, os resíduos terminais dos péptidos são, respectivamente, aminoácidos des-amino e descarboxi.

Empregando esta representação, A compreende o grupo te_r minai amino do resíduo correspondente a Β, ou, quando B é uma ligação covalente, a Q; ou, quando a é 0 e B é uma ligação covalen te, a C; ou, quando B é uma ligação covalente e a e b são 0, a

D. Quando B é uma ligação covalente e a, b, e c são 0, o grupo amino de M é substituído por um grupo acilo ou alquilo, como esp_e cialmente determinado por A na fórmula (i). De modo semelhante,

Z compreende o grupo terminal carboxilo do resíduo de aminoácido correspondente a Y; ou, quando Y é uma ligação covalente, a X; ou, quando Y é uma ligação covalente e d e e são 0, o grupo termi nal carboxilo de M é substituído por Z, como especialmente determinado na fórmula (i).

A operação dos subscritos a-c na fórmula (i) ê para assinalar que os resíduos podem ser removidos do terminal amino do

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-11péptido com retenção da utilidade nos compostos. Tal operação destina-se a prosseguir duma forma sequencial; de modo que a não é 0 excepto se Y é uma ligação covalente, b não é 0 excepto se a é 0, e c não é 0 onde b é 0. No terminal carboxi, e não é 0 excepto se Y é uma ligação covalente. Tal como mais compietamente descr_i to daqui em diante, d opera independentemente e é 1 quando M 6 Cha ou Phe(R ), e quer 1 quer 0, preferivelmente 0, quando M é -NHCHR₁R₂Outras abreviaturas e símbolos, comummente utilizados

na especialidade, Aminoácido	são aqui utilizados para descrever os péptidos.
Código de 5 letras	Código de 1 letra	A minoácido	Código de 3 letras	Código de 1 letra
Alanina	Ala	A	Leucina	L eu	L
Arginina	Arg	R	Lisina	Lys	K
Asparagina	Asn	N	Metionina	Met	M
Acido aspártico	Asp	D	Fenilalanina	Phe	F
Cisteína	Cys	C	Prolina	Pro	P
Glutamina	Gin	Q	Serina	S er	s
Acido glutâmico	Glu	E	T reonina	Thr	T
Glicina	Gly	G	T riptof ano	T rp	w
His ti dina	His	H	T irosina	Tyr	Y
Isoleucina	Ile	I	Ualina	Uai	u
Asparagina ou Acido Aspártico		Asx	B
Glutamina ou Acido	Glutâmico		Glx	Z
De acordo com a	representação convencional, o terminal
amino está à esquerda e o	terminal	carboxi está à	direita.	A não

ser se especificado doutro modo, presume-se que todos os aminoáci.

dos quirais (AA) são da configuração absoluta L. (4'R )Phe refere-se a fenilalanina substituída, na posição 4 do anel fenilo, por R . Seria apreciado que, quando R é hidrogénio, o residuo constitui fenilalanina e quando R é DH, o resíduo constitui tiro 3 — sina. β-Ala refere-se ao ácido 3-amino propanóico. Cha refere-se à ciclo-hexilalanina. Boc refere-se ao radical t-butiloxicar

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-12bonil, Ons refere-se ao radical dansilo que é 1-dimetilamino naftileno-5-sulfonilo, Cbz refere-se ao radical carbobenziloxi,

BrZ refere-se ao radical O-bromobenziloxicarbonil, Clz é o radical p-clorocarbobenziloxi, C1₂Z refere-se ao radical 2,4-diclorocarbobenziloxi, Bzl refere-se ao radical benzilo, MeBzl refere-se ao radical 4-metilbenzilo, Ac refere-se a acetilo, Alq ou AlqC^_^ refere-se ao alquilo C^ Ph refere-se ao fenilo, DCC refere-se à diciclo-hexilcarbodiimida, DMAP refere-se à dimetilaminopiridina, HOBT refere-se ao 1-hidroxibenzotriazol, NMM é N-metilmorfoli. na, DTT é ditiotreitol, EDTA é ácido etilenodiamina, tetracético, DIEA é diisopropil etilamina, OBU é 1,8-diazobiciclo/~5.4.0_7unde.ç -7-eno, DMSO é dimetilsulfóxido, DMF é dimetilformamida e THF é tetra-hidrofurano. HF refere-se ao ácido fluoridrico e TFA refere-se ao ácido trif luoroacético. Alquil C^ tal como aqui apl_i cado, destina-se a incluir metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, butilo terciário, pentilo e isopentilo. Tal como aqui utilizados nos compostos de acordo com es te invento, Asp e Glu, os quais têm cadeias laterais de ácidos carboxílico, abrangem ácidos carboxílicos livres, alquilo C^ e cadeias laterais de éster de benzilo. AlqC^ θ destina-se a inclui qualquer grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada de 1 a IB carbonos.

Os péptidos de acordo com este invento ligam-se às proteases virais de uma forma que imita a ligação ao substrato natu ral. Os péptidos são, na generalidade, dodecapéptidos ou menores. Contudo, péptidos mais longos, que englobam os resíduos aqui definidos como -Q-C-D-M-W-X, como fornecido na fórmula (i), também se acredita serem activos e são considerados dentro do âm bito deste invento. Os resíduos mais próximos do sítio de cliva gem suposto do péptido, designado como M-W, são os mais importari tes para ligação, X é, preferivelmente, um aminoácido neutro ou ácido. Adequadamente, X é Ala, Gly, Ile, Leu, Vai, Met, Lys,

Glx ou Asx. A valina é especialmente adequada. D é, preferive_l mente, um aminoácido neutro ou hidrofóbico, apesar de certos resíduos hidrofílicos, tais como Asp e Ser, serem aceitáveis. Gin, Asn, Ala, /3-Ala, Ile, Leu, Vai e Met são preferidos. Gin, Asn

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e Ala são especialmente preferidos. 0 resíduo correspondente a C pode ser um aminoácido neutro, ácido ou básico. Glu, Gin, Arg, Lys, Ser, Ala, /i-Ala, Asn e Gly são adequados. Gin, Asn e Ala são especialmente preferidos para C. D resíduo Q é, preferivelmente, um resíduo hidrofílico, tal como Ser, Thr, Asp ou Kis, D ou L. Especialmente preferidos são Thr e Ser.

B corresponde a um ou mais aminoácidos, os quais podem ser hidrofílicos ou hidrofóbicos, ou pode ser, nos péptidos mais curtos, uma ligação covalente. A identidade de B não é crítica e um resíduo pode ser escolhido pelas propriedades físico-químicas e bioquímicas que confere ao péptido global, tais como solubilidade na água e resistência às exopeptidases. A escolha de um aminoácido D confere, muitas vezes, resistência às exopeptida^ ses quando o aminoácido D se encontra no terminal do péptido. Quando B é uraa ligação covalente, poderá ser vantajoso para Q ser um aminoácido D. Quando B não é uma ligação covalente, B é, pre ferivelmente, um ou dois aminoácidos D ou L escolhidos a partir de Ala, /i-Ala, Gly, Ile, Uai, Leu, Met, His, Lys, Arg, Glx, Asx, Cys, Ser ou Thr. Para a produção dos péptidos mais pequenos de acordo com este invento, os quais se ligam à protease retroviral, B é preferivelmente uma ligação covalente.

Y pode corresponder a um ou mais aminoácidos, ou a uma ligação covalente. Se é um ou mais aminoácidos, estes podem ser hidrofílicos ou hidrofóbicos. São preferidos um a três resíduos, mas uma cadeia mais longa é aceitável. De forma muito semelhante à de B, os resíduos de Y podem ser utilizados para conferir propriedades físico-químicas e bioquímicas favoráveis ao péptido. Desse modo, o uso de resíduos hidrofílicos poderá ser utilizado para conferir propriedades de solubilidade desejáveis ou aminoácido D no terminal carboxi poderão ser utilizados para conferir resistência às exopeptidases. Preferivelmente, Y é um a três aminoácidos escolhidos a partir de Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Uai, Arg, Lys, Thr, Ser, Cys, Glx ou Asx. Para os péptidos mais curtos de acordo com este invento, Y pode ser uma ligação covalente, mas um aminoácido único é especialmente apropriado. Ala, Gly, Ile, Met, Arg, Asx e Uai são preferidos. A valina é especialmeri

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-14<?

te preferida.

Os pêptidos em que M é Cha ou Phe(4’Ra) e d é 1 podem actuar como substratos e são hidrolisados em pêptidos menores. Apesar dos substratos poderem ser, na generalidade, de qualquer comprimento, são preferidos 6-9 resíduos. Estes são conveniente mente utilizados para analisar a actividade da protease. Além disso, podem competir com is substratos virais naturais e, assim, servir para inibir a replicação virai e, portanto, a progressão da doença in vivo? se bem que, dada a sua instabilidade metabólica, a sua duração de acção poderia ser curta. Tipicamente, ejs tes pêptidos podem ser utilizados na análise da actividade da protease submetendo o péptido à protease num meio tamponado adequado. A análise da actividade é efectuada de modo a detectar a clivagem do péptido. Tal método estabelece a separação de, pelo menos, um dos produtos do péptido ou um dos seus derivados, e a sua quantificação.

Numa tal análise, os recursos cromatográficos podem ser utilizados para efectuar a separação dos produtos do péptido usan do suportes sólidos convencionais, tais como gel de sílica, octa decilsilano, Sephadex^⁷ , resinas permutadoras de iães ou resinas de adsorção. A detecção/quantificação dos produtos é efectua da por absorção de ultravioletas ou outras análises espectroscópicas. Alternativamente, a incorporação ou substituição de um isótopo radioactiva no péptido, tal como trítio ou em um ou mais dos aminoácidos, fornece uma detecção/quantificação baseada na radioactividade. Noutra alternativa, a incorporação de uma porção fluorescente, tal como um grupo dansilo no terminal amino do péptido, fornece uma detecção/quantificação por fluorescência. Os métodos fluorogénicos, os quais incorporariam um agente de e_x tinção no péptido, tal como um oxi-éster de 3-(4-N-metil-piridil) -propilo do terminal carboxi, além do marcador fluorescente, ta_m bém seriam úteis para testar a actividade da protease. Tais métodos são descritos, por exemplo, por Dunn e colab., Anal. Biochem., 129, 502 (1983), e fornecem a monitorização continua da actividade. Estes métodos fluorogénicos têm vantagens dado que a hidrólise ê directamente observada sem a necessidade da separa

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-15ção dos produtos da hidrólise.

A	actividade de ligação	da	protease dos péptidos de
acordo com	este invento, em que M	é	Cha ou (4’Ra)Phe, é	demonstra
da pela sua	capacidade para actuarem	como substratos. A	tabela
seguinte ilustra as cinéticas do substrato destes péptidos	•
	T abela	I
Cinéticas de	Substrato de péptidos	de	liqação à protease	do rHIV
Composto do	Rei.		^KM	^Kcat .
Exemplo Na.	V 0		(mM)	(min 1)
1	1,0		6,7	42
39	1,0		6,9	41
40	0,35		8,6	16
41	X ins.		-	—
42	1,34		1,9	21
43	0,48		20	30
44	0,48		2,2	5
45	0,46		11	21
46	1,23		2,3	12
47	0,36		8	15
48	1,0		6,8	35
49	0,65		6,0	18,4
50	0,32		5,0	1,8
51	X ins.		—
52	X ins.		-	—
53	0,71		1,6	12
54	0,39		0,71	2,03
55	0,86		6,5	23,0
56	1,45		1,2	31
57	X ins.		-
59	0,56		3,3	8,0
60	0,54		8,0	18
61	0,51		2,3	6,4
62	0,05		-
63	0,045		4,9	1,8

5Θ5

SKB CASE 14415

-16Tabela I

Cinéticas de substrato de péptidos de ligação à protease do rHIV
Composto do	Rei.	^KM	^Kcat _χ
Exemplo N 9.	V 0	(ml*l)	(min”
64	1,24	—
65	0,11	19	14
66	1,25	11,7	1B3
67	0,07	-	-
6Θ	0,98	-	-
69	0,70	-	—
70	0,56	-	—
95	ins.	12,8	5,3
96	0,34	17 ,7	90,4
9B	0,16	25	65
99	0,09	6,2	1,4
100	0,045	1,8	0,38
101	0,06	6,2	7,8
102	1,27	7,7	96
105	1,09	-	—
107	0,24	-
108	X ins.	-	—
109	1,24	-	—
110	1,29	9,8	103
111	1,33	34	374
112	X ins.	-
115	X ins.	-	—
115	0,48	7,1	16
118	X ins.	-
119	X ins.	30
121	0,80	0,96	16,6

insignificante não efectuado

5Β5

SKB CASE 14415 f'

-17Noutro aspecto, estes péptidos substrato, nos quais M é Cha ou (4'Ra)Phe, são também indicadores úteis para a descoberta de sequências de aminoácidos que se ligam às proteases virais e, portanto, inibem a actividade proteolltica. As modificaçães de tais péptidos que se ligam às proteases virais de modo a retardar a hidrólise do péptido fornecem um meio de produzir inibição de maior duração da actividade da protease.

Consequentemente, ura outro grupo subgenérico de compostos de acordo com este invento compreende os péptidos em que o re siduo M é -NHCHR^Rg-. Estes péptidos contêm um aminoácido não na tural, o qual não é um aminoácido ot · Estes péptidos não possuem uma ligação peptidica do mesmo modo que um substrato e, portanto, apesar de eles se ligarem à protease de uma forma que mimetiza a ligação ao substrato natural, são resistentes à hidrólise. Os péptidos de 2-9 resíduos são adequados. Os péptidos de 3-6 resíduos são preferidos. Preferivelmente, quando M é -NHCHR^Rg-, d=0 e W está ausente, desde que o aminoácido não natural possa actuar como um mímico dipéptidico. Numa concretização preferida, R^ é CHgC^H^-Ra, CHgC^H^^ ou AlqC^_^. Rg é preferivelmente

CHR^CHR2 , ( CHg ) ^CO-, CHR^CHR^ , CHR^O- , CHR^CHR CHR’CO-,

CHR₇(CH„) CO-, CO(CH„) CO-, COCHR,CHR’(CH„) CO-, CHR..CF (CH_q) CO-, j z m z m J. z m j z z m

COCF„(CH_Q) CO-, -P=O(OR·)(CH„) CO-,

2 m 2 m ⁷

em que R’, R^, R^₍, m e n têm os significados definidos na fórmula (I). Nas concretizaçães preferidas, R, é CH C.H -R e R„ é ι z o ó a z

CH(0H)CH₂CH₂C0-.

Quando administrado a um animal infectado ou potencialmente infectado com um vírus, o qual é dependente de uma protease codificada pelo vírus para processamento de poliprotelnas virais, a replicação virai é inibida e, consequentemente, a progressão da doença é retardada. Visto que parecem existir sequências consen69 585

SKB CASE 14415

-18suais para os substratos poliproteicos de vários retrovlrus, um inibidor ou substrato será provavelmente largamente activo sobre uma série de retrovlrus. Os vírus de AON, os quais são dependentes de proteases codificadas pelo virus, tal com o vírus da hepatite, podem ser também sensíveis ao referido tratamento.

Os compostos seguintes estão incluídos em, mas de forma alguma limitam, o âmbito deste invento:

2-(acetil-seriglutaminilasparaginil)amino-3-fenilpropil-prolilvalil valinamida;

2-(serilglutaminilasparaginil) amino-3-fenilpropilprolil. valil valinamida;

2- (acetil-serilglutaminilasparaginil)amino-3-hidroxi-l-ox0-5-fenilpentilprolilvalil valinamida;

2-(acetil-serilglutaminilasparaginil)amino-3-hidroxi-1-oxo-5-fenilpentilvalil valinamida;

2-(seril-glutaminilasparaginil) amino-5(S )-hidroxi-l-ox_o -5-fenilpentilvalil valinamida;

éster de metilo de 2-((2-(terc-butoxicarbonil-serilalanilalanil) a mino-1-oxo-3-fenil prop il )ciclopentilcarbonilvalil val_i na;

éster de metilo de 2-(2-(serilalanilalanil)amino-l-oxo-3-fenilpropil)ciclopentil-carbonilvalilvalina, sal de ácido acético trifluoroacético;

éster de metilo de 2-(2-(terc-butoxicarbonil-serilalanilalanil)amino-l-hidroxi-3-fenilpropil)ciclopentilcarbonilvalil vaiina;

éster de metilo de 2-(-1-hidrox i-3-f enil-2-(serilalanil. alanil)aminopropil)ciclopentilcarbonilvalilvalina, sal de ácido trifluoroacético;

éster de metilo de 2-((1-metoxi-l-(2-f enil-1-(ter c-but_i loxicarbonil-serilalanilalanil) amino) etil) f osf inil )ciclopentilcajr bonilvalilvalina;

585

SKB CASE 14415

X’

-19éster de metilo de 2-( ( 1-hidroxi-1-(2-f enil-1-( serilal_a nilalanil)amino)etil)fosfinil)ciclopentilcarbonilvalil vaiina;

éster de metilo de 5-(terc-butoxicarbonil-serilalanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexilvalil vaiina;

éster de metilo de 5-(terc-butoxicarbonil-serilalanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-hidroxifenil)hexilvalil vaiina ;

éster de metilo de 4-(terc-butoxicarbonil-serilalanilalanil)amino-2,2-difluoro-3-hidroxi-l-oxο-5-fenilpentilvalil valina cloridrato;

éster de metilo de 4-(serilalanilalanil)amino-2,2-difluoro-3-hidroxi-l-oxo-5-fenilpentilvalil valina cloridrato;

éster de metilo de 4-(serilalanilalanil)amino-2,2-difluoro-1,3-dioxo-5-fenilpentilvalil valina cloridrato;

5-(t-butiloxicarbonilserilalanilalanil)amino-4-hidroxi-6-(4-hidroxi)fenil-1-oxo-hexilvalil amida;

éster de metilo de 5-((carbobenziloxi-D-seril)alanilalanil)amino-4-hidroxi-1-oxo-6-fenil-hexilvalil valina;

éster de metilo de 5-((D-seril)alanilalanil)amino-4-hidroxi-1-oxo-6-fenil-hexil-valil valina;

5-(t-butiloxicarbonilserilalanilalanil)amino-6-(4-hidro xi)fenil-4-hidroxi-l-oxo-hexilvalil valina;

5- (serilalanilalanil) amino-6- (4-hidroxi ) f enil-4-hidrox_i -1-oxo-hexilvalil valina cloridrato;

éster de metilo de 2-((l-hidroxi-2-(serilalanilalanil)amino-3-ciclo-hexil)propil)ciclopentanocarbonilvalil valina cl or_i drato;

2-((2-(terc-butoxicarbonil-serilalanilai anil)amino-l-oxo-3-fenilpropil)ciclopentilcarbonilvalil valinamida;

2-(2-(serilalanilalanil)amino-l-oxo-3-fenilpropil) cicl_o pentilcarbonilvalilvalinamida, sal de ácido acético trifluoroacético;

585

SKB CASE 14415

-202-(2-(terc-butoxicarbonil-serilalanilalanil)amino-l-hidroxi—3-fenilpropil)ciclopentilcarbonilvalil valinamida;

2-(-1-hidroxi-3-fenil-2-(serilalanilalanil)aminopropil)ciclopentilcarbonilvalilvalinamida, sal de ácido acético trifluoroacético;

2-((l-raetoxi-l-(2-fenil-1-(terc-butiloxicarbonil-serilalanilaianil)amino)etil)fosfinil)ciclopentilcarbonilvalilvalinami da;

2-((1-hidroxi-l-(2-fenil-1-(serilalanilalanil)amino)etil)fosfinil)ciclopentilcarbonil-valil vaiinamida;

5-(terc-butoxicarbonil-serilalanilaianil)amino-4-hidrοχ i-1-oxo-6-fenil-hexil-vaiil vaiinamida;

5- (t e rc-bu t ox ic arbonil-s e r il al a ni 1 al a nil) a mi no-4-hi droxi-1-oxo-6-(4-hidróxi-fenil) hexil-valil vaiinamida;

4-(terc-butoxicarbonil-serilalanilai anil)amino-2,2-difluoro-3-hidroxi-l-oxo-5-fenilpentil-valil valinamida, cloridrato ;

4- (seril ala nil al anil) amino-2,2-difluoro-3-hidroxi-l-oxo. -5-fenilpentilvalil valinamida, cloridrato;

4- (serilalanilalanil)amino-2,2-difluoro-l,3-dioxo-5-fenilpentil-valil valinamida, cloridrato;

5- ((carbobenziloxi-D-seril)alanilalanil)amino-4-hidrox_i -1-oxo-6-fenil-hexil-valil valinamida;

5- ((D-seril)alanilalanil)amino-4-hidrox i-1-oxo-6-fenil-hexil-valil valinamida;

5-(t-butiloxicarbonilserilalanilalanil)amino-6-(4-hidro xi)fenil-4-hidroxi-l-oxo-hexil-valil valinamida;

5-(serilalanilalanil)amino-6-(4-hidróxi)fenil-4-hidroxi-1-oxo-hexil-valil valinamida, cloridrato;

2-((l-hidroxi-2-(serilalanilalanil)amino-3-ciclo-hexil)propil)ciclopentanocarbonilvalil valinamida, cloridrato;

éster de metilo de (4S,5S)-5-(alanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-hidroxifenil)hexil-valil valina, sal de ácido ac6 tico ;

535

5KB CASE 14415

-21éster de metilo de (45,5S )-5-( ( carbobenzilox i-/3-alanilJalanilJamino^-hidroxi-l-oxo-ó-^-hidroxifenilJhexilvalil valina ;

éster de metilo de (4S , 5S )-5-( ( ^3-alanil) alanil) amino-4-hidroxi-1-oxo-6-(4-hidroxifenil)hexilvalil valina, cloridrato;

éster de metilo de (45,55)-5-(alanilalanil)amino-4-hidroxi-1-oxo-6-ciclo-hexil-hexil-valil valina;

éster de metilo de (4S,55)-5-(carbobenziloxialanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina;

éster de metilo de (45,5S)-5-(alanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxο-6-fenil-hexil-valil valina;

(45.55) -5-(alanilalanil)amino-4-hidroxi-1-oxo-6-(4-hidroxifenil )hexil-valil valinamida, sal de ácido acético;

(45.55) -5-((carbobenziloxi-/3-alanil)alanil)amino-4-hidrox i-1-oxo-6-(4-hidroxifenil)hexilvalil valinamida;

(45.55) -5-((β-alanil)alanil)amino-4-hidroxi-1-oxo-6-(4-hidroxifenil)hexilvalil valinamida, cloridrato;

(45.55) -5-(alanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-ciclo-hexil-hexil-valil valinamida;

(45.55) -5-(carbobenziloxialanilalanil)amino-4-hidroxi-1-ox0-6-fenil-hexil-valil valinamida;

(45.55) -5-(alanilalanil)amino-4-hidroxi-1-oxo-6-feni1-hexil-valil valinamida;

éster de metilo de (4S ,5S)-5-(carbobenziloxialanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexilvalil valina;

(4Ξ , 5S )-5-(alanil)amino-4-hidroxi-l-oxο-6-fenil-hexilvalil valina, sal de ácido acético;

éster de metilo de (4S,55)-5-(terc-butiloxicarbonilalanil)amino-4-hidroxi-l-ox0-6-(4-hidroxifenil)hexil-valil valina;

éster de metilo de (4S,5S)-5-alanilamino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-hidroxifenil)-hexil-valil valina, sal de ácido acético;

5Θ5

SKB CASE 14415

-22(45.55) -5-(carbobenziloxialanil)amino-4-hidroxi-1-oxo-6-fenil-hexil-valil valinamida;

(45.55) -5-(alanil)amino-4-hidroxi-1-oxo-6-fenil-hexilvalil ualinamida;

(45.55) -5-(terc-butiloxicarbonilalanil)amino-4-hidroxi-1-oxo-6-(4-hidroxifenil)hexilvalil valinamida;

(45.55) -5-(alanil)amino-4-hidroxi-1-oxo-6-(4-hidroxifenil)-hexil-valil ualinamida, sal de ácido acético;

éster de benzilo de (4RS,5S) -5-amino-6-(4-hidroxi)fenil-4-hidroxi-l-oxo-hexil-valil valina, cloridrato;

éster de metilo de (lR ,2R)-2-(((lS,2S)-l-hidroxi-2-amino-3-ciclo-hexil)propil)-ciclopentanocarbonil-valil valina, clor_i drato;

éster de metilo de (4S,5S)-5-amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina, cloridrato;

éster de metilo de (4S,5Ξ)-5-(terc-butiloxicarbonil)ami no-4-hidroxi-1-oxo-6-fenil-hexil-valil valina ;

(4RS,5S)-5-amino-6-(4-hidroxi)fenil-4-hidroxi-l-oxo-hexil-valil valinamida, cloridrato;

(lR,2R)-2-(((lS,2S)-l-hidroxi-2 -amino-3-ciclo-hexil)pro pil)-ciclopentanocarbonil-valil valinamida, cloridrato;

(45.55) -5 -amino-4-hidroxi-1-oxo-6-fenil-hexil-valil valinamida, cloridrato;

(4S,5Ξ)-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-4-hidroxi-1-oxo-6-fenil-hexil-valil valinamida;

( 5Ξ ) -5-(car bobe nzi loxi alanil )amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valina, isobutil amida;

(5S)-5-( miristil)amino-4-hidroxi-1-oxo-6-fenil-hexil va lina, isobutil amida;

(55)-5-(carbobenziloxialanilalanil)amino-4-hidroxi-1-οχο-6-f enil-hexil valina, isobutilamida ;

585

SKB CASE 14415

-23(5S)-5-(estearil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil valina, isobutil amida;

éster de metilo de 5-(carbobenziloxialanil)amino-4-hidroxi-2-meti1-1-oxo-6-fenil-hexilvalil valina;

7-metil-5-(carbobenziloxialanil)amino-3,4-di-hidroxi-2-fenil-l-oxo-octil valina, isobutilamida;

5-(carbobenziloxialanilalanil)amino-4-hidroxi-1-oxo-6-fenil-hexil valina, isobutil amida;

5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi(l-oxo)hexil-valil valinol;

carbobenziloxi-alanil-(3-hidroxi-5-amino-6-fenil)hexanoil-valil-(4-aminometil)piridina;

5-(carbobenziloxialanilalanil)amino-4-hidroxi-6-fenil(l-oxo)hexil-valina isobutilamida;

(45.55) -5-( metoxicarbonil-alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-1-oxo-hexil-valil valina;

(4S , 5S)-5-(carbobenziloxi-alanilai anil)amino-6-feni1-4-hidroxi-1-oxo-hexil-valil valina;

(45.55) -5-(alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-l-oxo-hexil-valil valina;

éster de metilo de ácido (4RS ,5S)-5-((terc-butiloxicarbonil) isoleucil)amino-7-metil-4-hidroxi-1-oxo-octi1-1eucil- ( 0-be.n zil)aspártico; e éster de metilo de ácido (4RS,55)-5-((terc-butiloxicarbonil)isoleucil)amino-7-metil-4-hidroxi-l-oxo-octil-leucil-aspártico.

Alguns compostos individuais preferidos são:

éster de metilo de (4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-1-oxo-hexil-valil valina ;

éster de metilo de (4S,5S)-5-(alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-l-oxo-hexil-valil valina;

éster de metilo de (4S,5Ξ)-5-(carbobenziloxi-alanil)-

585

SKB CASE 14415

-24amino-6-fenil-4-hidroxi-1-oxo-hexil-valil vaiina ;

éster de metilo de (4S,5S)-5-(alanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-l-oxo-hexilvalil valina; e éster de metilo de ácido (4RS,5S)-5-((terc-butiloxicarbonil)isoleucil) amino-7-metil-4-hidroxi-l-oxo-octil-leucil- (Ο-ben, zil)aspártico; e os seus ácidos carboxílicos e carboxamidas.

Os péptidos de acordo com este invento são preparados por acoplamento dos resíduos de aminoácido apropriados, facultati. vamente removendo-se quaisquer grupos protectores e facultativamente modificando os terminais amino ou carboxi do péptido. SSo preparados, preferivelmente, pela técnica de fase sólida de Merrifield (3. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1964)), apesar de métodos em solução conhecidos na especialidade poderem ser empregues com sucesso. Métodos em solução ou uma combinação dos métodos de fase sólida e de solução, podem ser utilizados numa síntese convergente, na qual os fragmentos di-, tri-, tetra-, ou pentapeptidicos são preparados por síntese de fase sólida ou de solução e quer l_i gados a outros di-, tri- ou tetrapéptidos, quer adicional mente mo dificados por sintese de solução. Os métodos de síntese de pépt_i dos descritos, na generalidade, em 3. M. Stewart e 3. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, II (1984) ou M. Bodonsky, Y. A. Klauser e M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, 3ohn Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y.

(1976) podem ser utilizados para produzir os péptidos de acordo com este invento e são aqui incorporados por referência.

Cada aminoácido ou péptido é adequadamente protegido, tal como conhecido na especialidade relacionada com os péptidos. Por exemplo, o grupo Boc ou carbobenziloxi é preferido para protecção do grupo amino, especialmente na posição o(_. Um grupo be_n zilo ou, adequadamente, um grupo benzilo substituido, é utilizado para proteger o grupo mercapto da cisteina ou outros aminoácidos contendo tiol; ou o hidroxilo de serina ou da treonina. 0 grupo tosilo ou o azoto pode ser utilizado para protecção da guanidina da Arg ou o imidazol da His, e um grupo carbobenziloxi ou benzilo adequadamente substituído pode ser utilizado para o grupo hidroxi. lo da Tyr, Ser ou Thr, ou para o grupo í -amino da lisina. A subs

5Β5

SKB CASE 14415

-25tituição adequada dos grupos protectores carbobenziloxi ou benzil é uma substituição orto e/ou para com cloro, bromo, azoto ou meti lo e é utilizada para modificar a reactividade do grupo protector. A cisteina e outros aminoácidos contendo enxofre podem ser também protegidos pela formação de um dissulfeto com um grupo tioalquilo ou tioarilo. Excepto para o grupo Boc, os grupos protectores são, o mais convenientemente, aqueles que não são removidos por tratamento ácido suave. Estes grupos protectores são removidos por mé todos tais como hidrogenação catalítica, sódio em amónia liquida ou tratamento de HF, como conhecidos na especialidade.

Se são utilizados métodos de fase sólida, o péptido é construído sequencialmente a partir do terminal carboxi e trabalhando em direcção do terminal amino do péptido. A síntese de fei se sólida inicia-se pela ligação covalente do terminal C de um aminoácido protegido a uma resina adequada, tal como uma resina de benz-hidrilamina (BHA), resina de metilbenz-hidrilamina (MBHA) ou resina de clororaetilo (CMR), tal como descritas na generalidade na Patente dos E.U.A. N9. 4 244 946. Uma resina de suporte BHA ou MBHA é utilizada se o terminal carboxi do péptido produto é uma carboxamida. E geralmente utilizado um suporte de CMR se o terminal carboxi do péptido produto é um grupo carboxil, embora esta também possa ser utilizada para produzir uma carboxamida ou um éster.

Uma vez que o primeiro aminoácido (AA) protegido tenha sido ligado à resina desejada, o grupo amino é hidrolisado por tratamento ácido suave e o carboxilo livre do segundo AA protegido é acoplado a este grupo amino. Este processo é executado sequencialmente, sem isolamento do intermediário, até que o péptido desejado se tenha formado. 0 péptido completo pode então ser des. bloqueado e/ou separado da resina portadora, em qualquer ordem.

tratamento de um péptido suportado pela CMR com HF ou HBr/ácido acético separa o péptido da resina e produz o aminoácido do terminal carboxi como um ácido carboxílico. 0 tratamento de um péptido suportado pela CMR com amónia ou alquilaminas num solvente alcoólico fornece uma carboxamida ou uma alquilcarboxamj. da no terminal carboxi.

585

SKB CASE 14415

-26Se ê desejado um éster, a resina CMR pode ser tratada com um álcool apropriado, tal como álcool metilico, etílico, propllico, butilico ou benzilico, em presença de trietilamina, para clivar o péptido da resina e produzir o éster directamente.

z

Esteres dos péptidos de acordo com este invento podem também ser preparados, por métodos convencionais, a partir do pre cursor do ácido carboxílico. Tipicamente, o ácido carboxílico é tratado com um álcool em presença de um catalisador ácido. Altear nativamente, o ácido carboxílico pode ser convertido num intermediário acilo activado, tal como um haleto ácido ou um éster ou ani drido activado e tratado com um álcool, preferivelmente em preseri ça de uma base.

método preferido para a clivagem de um péptido da resina de suporte é pelo tratamento do péptido suportado pela resina com HF anidro em presença de um depurador de catiões adequado, tal como anisol ou dimetoxi benzeno. Este método, simultaneamente, remove todos os grupos protectores, o grupo tioalquilo prote£ tor do enxofre, e separa o péptido da resina. Os péptidos hidrolisados deste modo da CMR são ácidos carboxílicos, e aqueles sep_a rados da resina BHA são obtidos como carboxamidas.

A modificação do grupo amino terminal do péptido é efe£ tuada por alquilação ou acetilação, tal como é geralmente conhec_i do na especialidade. Estas modificações podem ser realizadas no aminoácido antes da incorporação no péptido, ou no péptido após este ter sido sintetizado e o grupo terminal amino libertado, mas antes dos grupos protectores terem sido removidos.

Tipicamente, a acetilação é realizada no aminoácido livre utilizando o haleto de acilo anidrido ou éster activado, do ácido de alquilo correspondente, em presença de uma amina terciária. A mono-alquilação é levada a cabo, o mais convenientemente, por alquilação redutora do grupo amino com um aldeído alifático ou cetona apropriados em presença de um agente redutor suave, tal como cianoboro-hidreto de lítio ou de sódio. A di-alquilação pode ser efectuada por tratamento do grupo amino com um excesso de um haleto de alquilo em presença de uma base.

Crê-se que os gru69 585

SKB CASE 14415 fiLÁ-27pos alquilo e acilo de cadeia mais longa de acordo com este inveri to tenham propriedades vantajosas dada a sua afinidade para as membranas lipídicas. A miristilação e a estearilação, por exemplo, são úteis.

A sintese em solução dos péptidos é executada utilizari do os métodos convencionais usados para formar ligações amida. Tipicamente, um aminoácido protegido com Boc, o qual tem um grupo carboxilo livre, é acoplado a um aminoácido protegido, o qual tem um grupo amino livre, utilizando um agente de acoplamento de carbodiimida adequado, tal como a N,N’-diciclo-hexilcarbodiiraida (DCC), facultativamente em presença de um catalisador tal como 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) e dimetilaminopiridina (DMAP). Outros métodos, tal como a formação de haletos de ácido, anidridos ou é£ teres activados, do carboxilo livre de um aminoácido protegido cora Boc, e posterior reacção com a amina livre de um aminoácido protegido, facultativamente em presença de uma base, são também adequados. Por exemplo, um aminoácido ou péptido protegido com Boc é tratado num solvente anidro, tal como cloreto de metileno ou tetra-hidrofurano (THE), em presença de uma base, tal como N-metilmorfolina, DMAP ou uma trialquilamina, com cloroformato de isobutilo para formar o anidrido activado, o qual, subsequentemente, reage com a amina livre de um segundo aminoácido ou péptido protegido. 0 péptido formado por estes métodos pode ser selej: tivamente desprotegido, usando técnicas convencionais no terminal amino ou carboxi, e ser acoplado a outros péptidos ou aminoácidos utilizando técnicas semelhantes. Após o péptido ter sido completado, os grupos protectores podem ser removidos, como aqui anter_i ormente descrito, tal como por hidrogenação em presença de um catalisador de paládio ou platina, tratamento com sódio em amoniaco líquido, ácido fluorídrico ou álcali.

Os ésteres são, muitas vezes, utilizados para proteger o grupo terminal carboxil de péptidos na síntese de solução. Podem ser convertidos em ácidos carboxílicos por tratamento com um hidróxido ou carbonato de metal alcalino, tal como o hidróxido de potássio ou o carbonato de sódio, numa solução alcoólica aquosa.

Os ácidos podem ser convertidos nos outros ésteres por meio de um

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US»

-28intermediário acilo activado como anteriormente descrito.

As amidas e as amidas substituídas de acordo com este invento são preparadas a partir dos ácidos carboxílicos dos pépt_i dos de modo muito semelhante. Assim, a amónia ou uma amina substituída pode reagir com um intermediário acilo activado para produzir a amida. 0 uso de reagentes de acoplamento, tal como DCC, é conveniente para a formação de amidas substituídas a partir do próprio ácido carboxílico e de uma amina adequada.

Além disso, os ésteres de metilo de acordo com este invento podem ser convertidos nas amidas, ou amidas substituídas, directamente por tratamento com amónia, ou uma amina substituída, numa solução de metanol. Uma solução de metanol do éster de meti lo do péptido é saturada com amónia e agitada num reactor pressurizado para produzir a carboxamida simples dos péptidos. As carboxamidas s3o concretizações preferidas deste invento dada a sua estabilidade aumentada em relação aos ésteres.

aminoácido que constitui o resíduo M do péptido compreende fenilalanina, um derivado da mesma ou um aminoácido não natural designado por -NHCHR^Rg-. Os derivados da fenilalanina incluem tirosina, (θ-alquilo 6^_θ) tirosina, 4'-halofenilalanina, 4'-nitrofenilalanina e 4'-aminofenilalanina, como são geralmente bem conhecidos na especialidade relacionada com os péptidos.

Um intermediário útil na síntese de péptidos de acordo com este invento, em que M é -NHCHR^Rg, é representado pela fórmu la (lia):

(Ha) em que:

R^ é, independentemente, AlqC^ θ, (CHgJf^SAlqC^ θ, ( ^CH2 n^0Alc,Cl-5 ’ ^CH2 ) n^ci^cloalquilo ^3-7 ^ou ^^CH2 m^C6^4“^a’

R é halogéneo, OR', NO , NH„ ou H;

Ζ Z

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-29^R2 ^{6 (CH}2⁾n’ CHR₃(CH₂)_mC0-, C0(CH₂)_mC0-, CHR^CHR₃,(CH₂)

CO-, CHR₃CHR₃,CHR₁(CH₂)_mC0-, CHR^CHR^CHR · ( ΟΗ_? ) _mCO- ,

CHR,CHR’CHR.(CH„) CO-, COCHR.CHR·(CH_) CO-, COCFCR'R(CH„)CO-,

1 2 m 1 z m z z m

C0CF₂(CH₂)_mC0-, CH=CR'CHR''(CH₂)_mC0-, COCH = CR ' ( CH₂ ) _mCO-,

CH₂S(0)pCHR’(CH₂)_mC0-, CH₂NR’CHR^M(CH₂)_mC0-, P=0(OR’)(CH₂)^00-,

^R3 ^{e R}3' ^s^°» ^cada um deles independentemente, OH, H ou NH₂;

R^ é OH, H, NH₂ ou =0; m é, independentemente, 0, 1, 2 ou 3; n é, independentemente, 1 ou 2; pé, 0, 1 ou 2 j

R₅ é H;

R^ é CH^CO, AlqC^ Dns, Cbz ou Boc, ou, quando tomados em conjunto, R^ e Rg são ftalimido;

X é H, halogéneo, OR, OAlqC·^ , NHR’R ou OCOAlq^ ₅;

R' é H ou AlqC} ç. ; e R é H ou AlqC^

Estes aminoácidos não naturais têm utilidade, neles mas mos, como intermediários que podem ser utilizados para preparar os inibidores da protease. Consequentemente, um substrato peptídico que se liga à protease pode ser convertido num inibidor por substituição de um ou ambos os aminoácidos no sítio cissil por um

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'.•4·* 4ΐ«&Β·5ιϋϋ>

-30composto de fórmula (Ha) adequado.

Os aminoácidos não naturais/são, geralmente, o< -aminoácidos , mas são derivados dos aminoácidos ot. Assim, a identid_a de de R^ é estabelecida pela escolha de um aminoácido de fórmula (HI), em que R^ é escolhido como anteriormente descrito.

co₂h (HI)

(IV)

CHO (V)

A protecção do grupo amino do aminoácido C< , por exemplo por um grupo Boc, acetilo ou ftaloil, e a conversão do ácido ou do éster num álcool de fórmula (IV) ou num aldeído de fórmula (l/), fornece um intermediário versátil para a introdução do substituin te R₂, e a preparação de compostos de acordo com este invento, os quais são designados pela fórmula (lia). As N-metoxi-metil amidas destes aminoácidos são intermediários úteis para este uso. Estes aminoácidos οά podem ser obtidos a partir de fontes naturais fontes comerciais ou podem ser sintetizados por um certo número de métodos bem conhecidas na especialidade relacionada com os péptidos.

Os álcoois de fórmula (IV) podem ser obtidos a partir da redução por diborano dos aminoácidos protegidos correspondentes.

Os aldeídos de fórmula (V) podem ser obtidos a partir da redução do éster de metilo do aminoácido correspondente, por exemplo com hidreto de diisobutilalumínio (DIBAL). Alternativamente, o álcool de fórmula (IU) pode ser oxidado no aldeído utilizando um age_n te oxidante suave, tal como o periodinano de Dess-Martin ou utili. zando o método de Sujern (DMSO, cloreto de oxalilo, trietilamina).

Em exemplos, nos quais R^ é Alq, os aminoácidos alanina, valina, leucina e isoleucina são especialmente úteis para a produ. ção de aldeídos quirais. 0 ácido X-aminobutírico, o ácido &Z-am_i noisobutírico e o ácido ot-amino pentanóico estão comercial mente disponíveis como racematos. Em geral, qualquer ácido ^2-amino al

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SKB CASE 14415

-31quilo pode ser sintetizado por alquilação de um éster do ácido ni troacético com um haleto de alquilo apropriado em presença de uma base, tal como a trietilamina, DBU ou outra amina terciária. Os alquóxidos tais como o metóxido ou o etóxido de sódio, são também bases adequadas. A redução subsequente do éster ou ácido oi-nitro alquilo com hidrogénio e um catalisador de paládio ou platina pro duz o aminoácido. Alternativamente, é comum produzir os aminoáci dos ot por alquilação de um éster de N-benzilidino glicina, tal como um éster de metilo ou etilo. Assim, o tratamento da benzili dina com uma base forte, tal como o hidreto de sódio ou potássio ou a diisopropilamida de litio, seguida pela alquilação com um cloreto de alquilo apropriado, e a subsequente hidrólise ácida do grupo benzilideno, produz o aminoácido desejado. Estes métodos também são adaptáveis ã formação de cicloalquil aminoácidos, por exemplo, pelo uso do brometo de cicloalquil metilo ou o brometo de 2-cicloalquil etilo. Outros métodos para a síntese de aminoácidos quirais foram revelados por Evans e colab., Tet. Let.,

1123 (1987).

A maior parte dos aminoácidos, nos quais R^ é arilo ou aralquilo, estão disponíveis comercialmente, ou são bem conhecidos na especialidade, tal como fenilalanina, 4'-halo e 4'-nitrofenilalanina, tirosina, (0-alquil)tirosina, fenilglicina e (4'-hi droxi)fenilglicina. Homólogos destes compostos podem ser prepara dos por técnicas convencionais de síntese de aminoácidos. Assim, a alquilação de um éster de ácido nitroacêtico ou de N-benzilideno glicina com l-fenil-2-bromoetano ou 1-fenil-3-bromopropano, tal como descrita acima, produz os aminoácidos homólogos.

Os aminoácidos nos quais R contém oxigénio ou enxofre são obtidos a partir da serina, homo-serina, treonina, cisteína ou metionina ou da alquilação destes aminoácidos com excepção da metionina. A alquilação é efectuada por tratamento do composto hidroxilo ou tiol correspondente com uma base, tal como trietilamina, DBU □□ hidreto de sódio, e um haleto de alquilo apropriado, tal como o brometo de metilo, etilo, isopropilo ou isobutilo. Os di-homoanálogos são preparados por técnicas convencionais para a produção de aminoácidos tal como descritas acima. Consequentemen

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SKB CASE 14415

-32íb, um éster de ácido nitroacético ê tratado com uma base, tal co mo anteriormente descrito, e acroleína, numa reacção de Michael.

□ aldeído produzido é subsequentemente reduzido por um agente redutor suave, tal como o boro-hidreto de sódio, para produzir o grupo hidroxi desejado. A redução catalítica subsequente do grupo nitro produz o ácido oL-amino 5-hidroxi pentanóico. D análogo mercapto correspondente pode ser sintetizado a partir do intermediário hidroxi. Assim, após protecção dos grupos amino e carboxi lo como conhecido na especialidade, o grupo hidroxilo é convertido num haleto, quer por tratamento com tribrometo de fósforo ou brometo ou cloreto de oxalilo em presença de trietilamina ou outra amina terciária, quer por tratamento com trifenilfosfina ou tetrabrometo de carbono. 0 tratamento do haleto com sulfeto de sódio ou tioacetato de potássio, seguido pela saponificação com hidróxido de sódio, produz o ácido 5-mercapto-2-amino pentanóico. Este intermediário pode ser adicionalmente alquilado da mesma foj? ma, descrita acima, que a cistelna ou a serina.

Tal como anteriormente indicado, os aminoácidos oí aqui descritos podem ser convertidos em aldeídos e álcoois de fórmula (IV) e (V). A elaboração subsequente destes intermediários para introduzir o substituinte R^, e, portanto, formar os compostos de acordo com este invento designados na fórmula (lia), é dependente da natureza de Rg.

A introdução de um substituinte hidrocarboneto em Rg é adequadamente efectuada por reacção do aldeido de fórmula (l/) com um hidrocarboneto organometálico, tal como o reagente de Grignard ou espécie de organo-lítio. A funcionalidade do ácido carboxllico incipiente de Rg está na forma protegida, como num éster orto, ou mascarada, como numa olefina oxidável. Numa concretização, a espécie organometálica é um alquileto de magnésio ou litio gerado a partir de litio ou magnésio e de um haleto de alquileno, tal c_o mo o brometo de alilo, 1-bromo-3-buteno, l-bromo-4-penteno, ou 1-bromo-5-hexeno, ou um seu derivado substituído de alquilo.

A adição do reagente organometálico a um aldeido de fórmu la (IV) produz um hidroxialqueno de fórmula (Vila) ou (l/Ib), em que Rg é DH, R^ ' é H, AlqC^_^, ( CHg ) ^DAlqC, (CHg)^cicloalquilo

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SKB CASE 14415 cA

R, men são tal como

-33R (CH„) C H -R , 2 m 6 4 a ' -I <7 ww \ ' ¹ Q / “ X ’ ' ' 7 θ R -i , ς- , 3-7 2 m 6 4 a 1 3 definidos para a fórmula (lia).

OU

6’

(Via) (Vila)

(VIIb) (VIIc)

Alternativamente, a adição de um alquilideno organometálico, tal como um reagente de Crignard, à N-metoximetilamida de um aminoácido de fórmula (lli), produz os ceto-alquenos de fórmula (Via) e (VIb), em que Rg é =0. Utilizando os mesmos processos, excepto a substituição por l-metalo-2-propenii ciclopentano ou 1-metalo-2-propenil ciclo-hexano, são preparados os cicloalquil a.1 quenos de fórmula (VIc) correspondentes, em que R^, R^, R^, R',

R, men são tal como definidos na fórmula (lia). Consequentemente, um processo para a preparação de um composto de fórmula (Vila), (VHb) ou (VIIc), em que Rj ’ é H, AlqC^ (Cí^^OAlqCi ^^CH2^n^{CÍcloalqUÍloC}3-7 °^U ^^CH2^m^C6^H4“^Ra’ ^{e R}1’ %’ ^R5» ^Ró^{1 R}’’

R, X, m e n são tal como definidos na fórmula (lia), compreende

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-34a oxidação de um composto de fórmula (Via), (VIb) ou (VIc) num ácido ceto-carboxilico (l/IIa), (V11 b) ou (VIIc), em que R^ é =0 e X é OH, e, em seguida, em qualquer ordem, facultativamente reduzir ou aminar redutivamente o grupo ceto, e facultativamente converter o ácido carboxílico num éster, amida, aldeído, anidrido ou haleto de acilo. Adequadamente, R’éHemêO, e numa concre tização preferida do composto (Vila), R ¹ ê H.

A oxidação do hidroxi- ou ceto-alcano é efectuada por mê,com todos convencionais, tais como/um permanganato de potássio ou por ozonólise seguida por exame padrão com sulfeto de dimetilo e oxidação subsequente com permanganato de potássio ou reagente de Jones. Como seria óbvio para um especialista na matéria, este mét^ do não é aplicável quando R^ contém um substituinte de enxofre. Outros métodos adaptáveis para preparar certos compostos deste t_± po são descritos por Holladay e colab., 3. Med. Chem., 30, 374-B3 (1987) e Kempf, D., 3. Org. Chem., 51, 21, 3921-26 (1986).

A redução dos compostos ceto de fórmula (l/IIa) , (l/IIb) e (VIIc) (Rq é =0) utilizando um agente redutor convencional, tal como o boro-hidreto de sódio, produz o álcool correspondente. Se o álcool é desejado, é muitas vezes útil protege-lo pela formação quer de um éter benzílico ou silílico quer de um acetato, para prevenir reacções laterais não desejadas, tal como a lactonização e para melhorar a eficiência da incorporação posterior nos péptidos de acordo com este invento. Tal protecção do álcool é converi cionalmente efectuada antes ou depois dos passos de oxidação conduzindo ao ácido carboxílico. 0 hidroxilo pode ser adicionalmente convertido no cloreto ou brometo utilizando um agente de halogenação, tal como o tricloreto de fósforo ou o tribrometo de fósforo e posteriormente reduzido num grupo metileno com hidrogénio e níquel Raney®. Se é desejado um grupo amino, o grupo ceto pode ser aminado redutivamente com cianoboro-hidreto de sódio e um haleto de amónio, tal como um cloreto ou brometo de amónio. 0 ác_i do carboxílico pode ser convertido num éster, amida, aldeído, ani drido ou haleto de acilo por métodos comuns bem conhecidos na especialidade química.

A introdução de insaturação em R2 pode ser derivada dos

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-35produtos de aminoácido correspondentes às fórmulas (VII). A redjj Ção do grupo carbonilo num grupo hidroxilo, como anteriormente i_n dicado, fornece os compostos insaturados de acordo com este inve_n to. 0 grupo hidroxilo pode ser eliminado por conversão num mesilato ou haleto, como anteriormente descrito, e tratamento com uma base, tal como DBU ou diisopropilamida de litio. Outros métodos de eliminação do grupo hidroxilo, tal como o tratamento com ácido mineral suave (HC1, podem também ser adequados. Outros métodos para a introdução de insaturação em envolvem a olefinação de Wittig de um aldeído de fórmula (v). A redução destes compostos insaturados com hidrogénio e um catalisador de paládio fornece um método global alternativo para executar a remoção do grupo cetona nos compostos de fórmulas (VII) (Rg é =0).

A introdução de um substituinte de azoto em R£ é efectuada pela reacção de um amino-aldeído de fórmula (V), sob condiçães redutoras, com um éster de um ácido aminoalcanóico C^ ou ácido alquil aminoalcanóico C^ ou uma estrutura onde a porção amino está incluída num anel de 5 ou 6 membros saturado ou insaturado. Exemplos de tais aminas são os ésteres de benzilo ou metilo de glicina, alanina, ácido 3-amino-propiónico, ácido 4-amino-pentanóico, ácido butanóico, prolina, A3-desidro-prolina, e 2-carboxi-piperidina. Condiçoes redutoras adequadas incluiriam o uso de hidrogénio e de um catalisador de paládio ou platina, ou cianoboro-hidreto de sódio. Consequentemente, os compostos de fórmula (VIII):

(VIII) em que R^ , R^, R^, X e n são tal como definidos na fórmula (lia), são preparados por um processo que compreende a reacção de um com posto de fórmula (v), sob condiçães redutoras, com um éster ou ácido de prolina, Δ3-όθ5Ϊ0Γθ-ρΓθ1ϊη3 ou 2-carboxipiperidina, e,

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-36em seguida, em qualquer ordem, conversão do éster num ácido carbo xilico, éster, aldeído ou amida; ou conversão do ácido num éster, amida, anidrido ou haleto de acilo.

A introdução de um substituinte de enxofre em é executada por reacção de um éster ou ácido tioalcanóico com um derivado de um aminoácido cá· Consequentemente, um ácido hidroxi-amino de fórmula (IU) ê convertido no haleto correspondente utilizando um reagente convencional, tal como o tribrometo de fósforo, oxicloreto de fósforo ou cloreto de tionilo, em presença de uma base, tal como t,rietilamina ou piridina, e tratado com o éster ou ácido tioalcanóico, novamente em presença de uma base. 0 sulfeto prodjj zido deste modo pode ser adicionalmente oxidado num sulfóxido por tratamento com um agente oxidante suave, tal como o metaperiodato de sódio, ou numa sulfona, por tratamento com permanganato de potássio.

A introdução de um substituinte de fluorocarbono em R₂, em que o flúor é y para o grupo amino, é efectuada por tratamento de um aldeído de fórmula (1/) com difluorobromoacetato de etilo e pó de zinco activado. Thaisrivongs e colab., 3. Med. Chem., 29, 2080-87 (1986) descrevem tal química para os compostos do tipo da fluorostatina. Os homólogos destes compostos podem ser preparados a partir de oí-cetodiésteres, tais como o oxaloacetato de dimetilo

Ilustrando o método, o oxaloacetato de dimetilo é tratado com trifluoreto de dietilamino enxofre para produzir o succinato de o4-difluorodimetilo. A redução preferencial da funcionalidade do ot-difluoro éster com boro-hidreto de sódio produz o difluoro álcool, o qual pode ser oxidado no aldeído correspondente utilizando um método de oxidação suave, tal como o reagente de Collins, o periodinano de Dess-Martin ou o método de Siuern (DM50, cloreto de oxalilo, trietilamina). A condensação do ot-difluoro aldeído com o composto de azoto de fórmula R^CH₂N0₂, tal como 2-nitrofenil etano ou 1-nitro alcano em presença de uma base, tal co mo DBU ou K₂C0₃, e redução subsequente do grupo azoto com hidrogé nio e quer Pd a 5%/C quer catalisador de negro de platina, produz os homólogos de difluoro desejados. Os derivados alquilados destes homólogos podem ser preparados por alquilação do oá-ceto diés

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-37ter inicial com uma base e haleto de alquilo antes de dirigir a sequência. Por exemplo, a alquilação do oxalacetato de dimetilo com 2 equivalentes de iodeto de metilo em presença de DBL) produz o succinato de 2-ceto-3,3-dimetilo. A conversão adicional pela sequência acima em butanoato de 2,2-dimetil-3,3-difluoro-4-oxo-rne tilo, a condensação com 2-fenilnitroetano e a redução com hidrog_é nio e Pd a 5%/C produz o hexanoato de 2,2-dimetil-3,3-difluoro-4-hidroxi-5-amino-6-fenil metilo. A oxidação posterior destes com postos para fornecer a fluorocetona pode ser levada a cabo neste estádio, mas é, muitas vezes, mais adequadamente efectuada após o resíduo ter sido incorporado nos péptidos. A oxidação de Mffatt (DMSO, anidrido acético), o periodinano de Dess-Martin ou a piridina/trióxido de crómio são oxidantes adequados.

A introdução de um substituinte fosfonilo em R^ é efectua da por uma condensação do carbamato de benzilo com fosfito de tr_i fenilo e um aldeído de fórmula geral R^CHD, tal como o fenilacetaldeído, isobutiraldeído ou 2-metilbutiraldeído, em ácido acético, para produzir um fosfonato de fórmula (IX).

(IX) tratamento adicional do fosfonato com um alquóxido fornece o éster de monoalquilo do ácido fosfónico correspondente. A_s sim, o tratamento com o metóxido de sódio produz o éster de monoetilo de ácido fosfónico. A conversão deste ácido fosfónico no haleto de fosfonilo com um reagente de halogenação adequado, tal como cloreto ou brometo de tionilo, fornece um intermediário rea_ç tivo adequado para a elaboração posterior da cadeia lateral. 0 tratamento com um reagente organo-metálico, tal como o litio ou o reagente de Crignard derivado do brometo de alquilo, bromo 3-bute no, 2-(2-metilpropenil)clorociclopentano ou 2-(2-metilpropenil)ciclo-hexano, produz os fosfinatos de alquenil metilo de acordo

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-38com este invento, tal como fórmulas (Xa) e (Xb):

fornecidos pelas

em que , R^, Rg, R’, R, men são tal como definidos na fórmula (lia) e R' é alquilo C^ A oxidação subsequente, por exemplo com permanganato de potássio ou por ozonólise como aqui anteriormente descrita, fornece os fosfinatos de alquilo de ácido car boxílico de acordo com este invento. Consequentemente, os compos. tos de fórmula (XI):

(Xla) ,¹ OR' ^Ι^π,νο-χ

II (Xlb) em que R , R , R , R', X e n são tal como definidos na fórmula (lia), podem ser preparados por oxidação de um composto de fórmula (Xa) ou (Xb) num ácido carboxilico, facultativamente por hidró lise do fosfinato de alquilo no ácido fosfínico e facultativamente por conversão do ácido carboxilico num éster, amida, aldeido, anidrido ou haleto de acilo. A hidrólise do fosfinato de alquilo no ácido fosfinico pode ser alcançada por tratamento com um ácido forte, tal como o brometo de hidrogénio. Como seria óbvio para os especialistas na matéria, este método não é aplicável quando Rj contém um substituinte de enxofre. Métodos adaptáveis para a sintese de alguns destes compostos são descritos, por exemplo, por Giannousis e colab., 3. Med. Chem., 30, 1603-09 (1987).

Um aspecto adicional deste invento refere-se à preparação

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-39de aminoácidos completamente novos os quais, quando adequadamente incorporados nos péptidos, fornecem uma imitação não hidrolisável de uma ligação peptídica. Estes compostos são preparados tal como anteriormente aqui descrito e estão adicionalmente ilustrados nos Exemplos que se seguem. Eles são incorporados nos péptidos de acordo com este invento por métodos conhecidos na especialidade e são apresentados pela fórmula (ilb) como:

^R5^R6^{N R}2 (Ilb) em que:

é, independentemente, AlqC^ -(CH^)^SAlqC^

-(CHg)_nOAlqC^_^, -(CHg)_ncicloalquilo C^ _? ou ”(_m^6^4^-Ra’

R_& é halogéneo, NOg, OH, OAlqC^ θ, NHg, ou H;

R_ é (CH_) -X, (CH„) CO-X, CHRCHR.CHR'(CH„) CO-, z 2 n 2 n 3 1 2 m ’

COCR,CHR'(CH„) CO-X, CHR.CF„(CH„) CO-X, COCF„CR'R(CH„) CO-X, 1 2' m ’ 3 2^X 2 m ’ 2 ^K 2 m

CHR(CH) CO-X, CO(CH ) CO-X, > Z m Z m

ou

CO-X

n)

CO-X

R₃ é H, NHg ou OH;

R^ é H, NH₂, OH ou =0; R₅ é H;

R₆ é CHjCO, AlqCj· θ , Dns, Cbz ou Boc, ou, quando tomados

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-40em conjunto, R^ e R^ são ftalimida;

X é H, halogéneo, OH, OAlqC^ NHR'R ou OCOAlqC^

R’ e R são H ou AlqC^ m é, independentemente, 0, 1, 2 ou 3; e n é, independentemente, 1 ou 2;

desde que R₂ não seja CHR^CHgCO-X, COCH^CO-X, COCF^CO-X ou CHRjCF₂C0-X, quando R^ é fenilmetileno, isobutilo ou ciclo-hexilmetileno, e R₂ não seja CH( 0H)CH₂CH₂C0-X ou C0CH₂CH₂C0-X, qua_n do R^ ô isobutilo.

A incorporação de um composto de fórmula (ilb) num péptido em lugar de um ou dois resíduos de aminoácido que sofrem clive) gem por uma protease, especial mente uma protease retroviral, fornece um método para produção de actividade inibitória da protease. Será apreciado que os métodos de síntese acima introduzam centros quirais de uma forma não-selectiva ou racémica. Como é muitas v.e zes o caso em sistemas biológicos, uma configuração única de centros quirais é geralmente satisfatória. Em muitos dos compostos, existe mais do qus um centro quiral, o que torna os compostos com centros quirais variáveis diastereoméricos. Estes diastereómeros são geralmente separáveis por cromatografia em gel de sílica ou um suporte cromatográfico de octadecil silano com uma fase móvel adequada. Se é utilizado o gel de sílica, é usada uma mistura de acetato de etilo e hexano ou metanol e clorofórmio ou cloreto de metileno para eluir os diastereómeros. Be é utilizado um suporte de octadecil silano, pode ser usada uma mistura de água e metanol ou acetonitrilo para purificar os diastereómeros. No caso de com postos ácidos ou básicos, a fase móvel pode ser tamponada pela adição de 0,02 a 0,5% de ácido acético, ácido trifluoroacético ou tampão fosfato. Se o resíduo, designado como M, possui apenas um centro quiral único, ou se os diastereómeros são difíceis de sepa rar, será preferível incorporar o resíduo no péptido, em que os centros quirais dos outros aminoácidos constituintes conferem ass_i metria adicional e tornam os diastereómeros resultantes separáveis num estádio mais tardio. Contudo, enquanto pode ser, por vezes, preferível separar os diastereómeros, não é por qualquer meio ne69 5Β5

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-41cessário separar os centros quirais para aplicar este invento.

Ds aminoácidos não naturais do resíduo M são incorporados nos pêptidos de acordo com este invento, tal como anteriormente aqui descrito, por métodos comuns na especialidade relacionada com os pêptidos.

Se o péptido final, após ter sido desprotegido, contém um grupo básico, pode ser preparado um sal de adição de ácido. Os sais de adição de ácido dos pêptidos são preparados de uma maneira padrão num solvente adequado a partir do composto de origem e de um excesso de um ácido, tal como clorídrico, bromídrico, sulfjj rico, fosfórico, acético, maleico, succínico ou metano-sul fónico.

A forma do sal acetato é especialmente útil. Se o péptido final contém um grupo ácido, podem ser preparados sais catiónicos. Tipicamente, o composto de origem é tratado com um excesso de um rea gente alcalino, tal como um hidróxido, carbonato ou alquóxido, con tendo o catião apropriado. Os catiães, tais como Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺ e sâo exemplos de catiães presentes em sais farmaceuticamente aceitáveis. Alguns dos compostos formam sais, internos ou zwitte riónicos que também podem ser aceitáveis.

Os compostos de fórmula (i), em que M é -HNCHR^R^-, são utilizados para induzir a actividade anti-viral em doentes que eq tão infectados com vírus susceptíveis e requerem o referido tratai mento. 0 método de tratamento compreende a administração por via oral, parentérica, bucal, trans-dérmica, rectal ou por insuflação, de uma quantidade eficaz do composto escolhido, preferivelmente disperso num veículo farmacêutico. As unidades de dosagem do ingrediente activo são seleccionadas a partir da variação de 0,05 a 15 mg/kg. Estas unidades de dosagem podem ser administradas uma a dez vezes diariamente oara a infecção aguda ou crónica.

As propriedades de inibição da protease dos pêptidos de acordo com este invento, em que M é -HNCHR^R^-, são demonstradas pela sua capacidade para inibir a hidrólise de um substrato pep t_í dico pela protease do rHIV entre os limites de cerca de 10 nM e de cerca de 250 ^.M. A tabela seguinte é representativa das cons tes de inibição destes pêptidos.

585

SKB CASE 14415

-42Tabela II

Inibição da protaase de rHIV Composto do Exemplo N2. K ÇixM)

15	14
16	1
17	68
18	6,7
19	7
20	32
21	160
22	47
23	27
24	6
25	40
26	60
27	0,26
2B	0,026
29	>28
30	14
31	1,2
32	220
33	3,6
34	0,140
35	0,110
36	10
37	3,5
38	0,15

As composiçSes farmacêuticas dos péptidos de acordo com este invento, ou dos seus derivados, podem ser formuladas como s_o luçSes ou pós liofilizados para administração parentérica. Os pós podem ser reconstituídos por adição de um diluente adequado ou outro veículo farmaceuticamente aceitável, antes da utilização A formulação líquida ê geralmente uma solução aquosa tamponada e isotónica. Exemplos de diluentes adequados são o soro fisiológi69 585

SKB CASE 14415 r Λ

-43co isotónico, dextrose a 5% padrão em água ou solução de acetato de sódio ou amónio tamponado. A referida formulação é especialmente adequada para a administração parentérica, mas também pode ser utilizada para a administração oral ou ser colocada num inala dor ou nebulizadorcom doseador para insuflação. Poderá ser desejá^ vel adicionar excipientes tais como polivinilpirrolidona, gelatina, hidroxi celulose, goma arábica, polietileno glicol, manitol, cloreto de sódio ou citrato de sódio.

Uma composição preferida para administração parentérica pode compreender, adicionalmente, uma quantidade do composto encapsulado num veículo lipossómico. 0 lipossoma pode ser formado pela dispersão dos péptidos numa fase aquosa com fosfolípidos, com ou sem colesterol, utilizando uma variedade de técnicas, incluin do agitação manual convencional, extrusão a alta pressão, evaporação de fase invertida e microfluidificação. Um método adequado de preparação das referidas composiçães é mais completamente descrito . noc Pedido . co-pendente com o NS. de Série 06/763 4B4 e é aqui incorporado por referência. 0 referido veiculo pode ser facultativamente dirigido para o seu local de acção por uma imuno globulina ou proteína reactiva com a partícula virai ou as células infectadas. A escolha das referidas proteínas seria, evidentemente, dependente das determinantes antigénicas do vírus infectante. Um exemplo da referida proteína é a glicoproteína da célu la T CD-4, ou um seu derivado tal como a sCD-4 (CD-4 solúvel), a qual é reactiva com o envólucro glicoproteico do vírus de imunode ficiência humana (HIV). As referidas proteínas estão descritas no Requerimento co-pendente com N9. de Série 07/160 463, que é aqui incorporado por referência. Proteínas alvo semelhantes podem ser delineadas, por métodos conhecidos na especialidade, para outros vírus e são consideradas como estando dentro do âmbito deste invento.

Alternativamente, estes péptidos podem ser capsulados, comprimidos ou preparados numa emulsão ou xarope para administração oral. Veículos sólidos ou líquidos farmaceuticamente aceitáveis podem ser adicionados para aumentar ou estabilizar a composi. ção, ou para facilitar a preparação da composição. Veículos lí69 585

SKB CASE 14415

Z’/

£.-i

-bbquidos incluem xarope, óleo de amendoim, azeite, glicerina, soro fisiológico e água. Veículos sólidos incluem amido, lactose, sul. fato de cálcio di-hidratado, magnésia branca, estearato de magnésio ou ácido esteárico, talco, pectina, goma arábica, ágar ou gelatina. 0 veiculo também pode incluir um material de libertação controlada, tal como monoestearato de glicerilo ou diestearato de glicerilo, sozinho ou com uma cera. A quantidade do veiculo sóli do varia mas, preferivelmente, estará entre cerca de 20 mg e cerca de 1 g por unidade de dosagem. As preparações farmacêuticas são preparadas seguindo as técnicas convencionais de farmácia envolvendo trituração, mistura, granulação e compressão, quando necessária, para formas em comprimido; ou trituração, mistura e e_n chimento de formas em cápsula de gelatina dura. Quando é utiliz.a do um veículo líquido, a preparação estará sob a forma de um xaro pe, elixir, emulsão ou uma suspensão aquosa ou não aquosa. A referida formulação líquida pode ser administrada directamente p.o. ou enchendo uma cápsula de gelatina mole.

Para administração rectal, um pó pulverizado dos pêptidos de acordo com este invento pode ser combinado com excipientes tal como manteiga de cacau, glicerina, gelatina ou polietileno glicóis e moldado em supositórios. Os pós pulverizados também podem ser combinados com uma preparação oleosa, gel, creme ou emulsão, tamponada ou não tamponada e administrados através de um emplastro transdérmico.

Os Exemplos que se seguem servem para ilustrar este inven to. Os Exemplos não se destinam, de forma alguma, a limitar o S_m bito deste invento, mas são fornecidos para mostrar como se prep_a ram e utilizam os compostos de acordo cora este invento.

Nos Exemplos, todas as temperaturas estão em graus Centígrados. As análises dos aminoácidos foram executados num Dionex Autoion 100. A análise do conteúdo peptídico é baseada na Análise dos Aminoácidos. Os espectros de massa FAB foram efectuados num espectrómetro de massa VG Zab utilizando bombardeamento de átomos rápido. As abreviaturas utilizadas para representar a cora posição do eluente para a cromatografia de camada fina e distri69 585

SKB CASE 14415

-45buição em contracorrente são B: n-butanol, A: ácido acético, W: água, E: acetato de etilo e IP: isopropanol. A RMN foi registada a 250 MHz utilizando um espectrómetro Bruker AM 250. As multipl_i cidades indicadas são: S = singuleto, d=dupleto, t=tripleto, q = qua_r teto, m=múltipleto e br indica um sinal amplo. 0 ácido 4(S)-amino-3(R)-hidroxi-5-fenil hexanóico AHPPA_7 e o seu epímero 3(R) /~3-R-AHPPA_7 foram preparados pelo método de Rich e colab.,

3. Med. Chem., 23, 27-33 (1980). 0 racemato /~3-R,S-AHPPA_/ foi obtido pela omissão da cromatografia final neste método.

Purificação da protease de HIV recombinante

Os métodos para expressar a protease de HIV recombinante em E. coli foram descritos por Debouck e colab., Proc. Natl. Açad. Sçj. USA, 84, 8903-6 (1987). 0 enzima utilizado para testar o péptido de acordo com este invento foi produzido deste modo e purificado a partir do sedimento celular, como se segue. 0 sedime_n to celular de E. coli foi resuspenso num tampão constituído por Tris-HCl 50 mM, pH 7,5; DTT, EDTA e PMSF (fluoreto de fenilmetH sulfonilo), 1,0 mM de cada. As células foram lisadas por sonicação e o material insolúvel foi removido por centrifugação a 15 000 x g médio, durante 15 min. 0 sobrenadante clarificado foi então levado até à saturação de 40% com sulfato de amónio. Esta suspensão foi agitada à temperatura ambiente durante 30 min. e, em seguida, centrifugada como acima. 0 precipitado resultante foi redissolvido/ressuspenso num volume mínimo de Tris-HCl 20 mM, pH 7,5; NaCl 200 mM; DTT e EDTA, 0,1 mM de cada. A amostra foi novamente centrifugada antes da aplicação (em alíquotas de 5 ml) a uma coluna de filtração em gel de HPLC preparativa Beckman TSK G2000SW (2,1 cm x 60 cm). A coluna foi equilibrada no mesmo tampão a uma velocidade de fluxo de 4 ml/min. 0 efluente da coluna foi monitorizado a 280 nm e foram recolhidas fraeçães de 1 min. Tipicamente, a HIVPRTr (protease de HIV recombinante) eluiu 45-46 min para a corrente. Neste estágio, a protease era N85-95% pura. Por análise de imunomancha >90% do material imunorreactivo foi precipitado no passo do sulfato de amónio. Pela análise da actividade, o pico de actividade mais alto foi encontrado nas fraeçães recolhidas aos 45 e 46 minutos. A análise das fraeçães da coluna

585

SKB CASE 14415

-46TSK por HPLC-RP e SDS-PAGE indicou que a maioria da proteína de 11 00C Mr também é encontrada nas fracções 45 e 46 minutos. A própria actividade não pode ser utilizada para obter dados de recuperação fidedignos dado que é influenciada pelo sal elevado, is to é, com sal aumentado foram obtidos níveis aumentados de activ_i dade. Assim, com cada passo na purificação, foi recuperada mais actividade total do que aquela com que se iniciou. 0 rendimento global do HIVPRTr foi de NI mg a partir de um sedimento celular de E, coli de 50 g.

Cinéticas do substrato para a actividade da protease de HIV

Os dados da velocidade inicial para os oligopéptidos foram determinados a pH 6,0, 373C. As misturas reaccionais (0,01-0,1 ml) continham Mes (ácido 2-N-morfolino)etano-sulfónico) 50 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, NaCl 0,2 M, Triton X-100 a 0,1% (v/v) (pH 6,0), DMSO a 10%, e concentrações variáveis dos péptidos.

Após incubação a 37SC durante alguns minutos, a reacção foi iniciada pela adição de protease de HIV purificada (0,01-2 mg), e as reacções foram rapidamente arrefecidas após 10-30 min com um volume igual de, quer ácido tricloroacético 0,6 N quer ácido trifluoroacético a 0,2%, gelados. As amostras foram centrifugadas a 17 000 rpm durante 5 min e os substratos e produtos peptldicos fo ram separados e quantificados (por integração de pico) por HPLC de fase invertida. As velocidades iniciais foram determinadas c_o mo (produto peptidico formado mM)/min, baseado na percentagem de conversão do substrato no produto, para uma dada concentração do substrato. Tipicamente, as velocidades da reacção foram lineares em relação ao curso do tempo da reacção, e menos de 15-20% do substrato tinha sido convertido no produto no final da reacção.

As constantes cinéticas (constantes de Michaelis, velocidades máximas) foram determinadas ajustando os dados da velocidade inicial à equação de Michaelis-Menten (v = V (S)/(K + (S))), utilizando o programa Fortran de Cleland (W. W Cleland, Adv, Enzymol.

29, 1 (1967)). 0 número de renovação (turner-over) (k .) foi

C 31 obtido como k . = V /Ε, , onde é admitido que está presente um

L· u L (11Q z\ u sítio activo por dimero 22-kD de protease de HIV.

5Β5

SKB CASE 14415

>2

-47Uma estimativa da viabilidade do substrato foi obtida por determinação de uma velocidade inicial relativa (rei Vθ). Esta análise foi efectuada da mesma maneira, excepto por a percentagem de hidrólise do substrato após 10-20 min ter sido comparada com a percentagem de hidrólise de Ac-Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH₂ (controlo), após uma incubação semelhante. Isto estabeleceu uma comparação da velocidade reaccional inicial num ponto do tempo relativamente ao péptido de controlo.

Inibição da actividade da protease de HIV

Um ensaio típico continha 10 ml de tampão MENDT (Mes 50 mM (pH 6,0; ácido 2-(N-morfolino)etano-sulfónico), EDTA 1 mM, ditiotreitol 1 mM, NaCl 200 mM, Triton X-100 a 0,1%); N-acetil-L-arginil-L-alanil-L-seril-L-glutaminil-L-asparaginil-L-tirosil-L-propil-L-valil-L-valinamida, 2, 3 ou 6 mM (Ac-Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH₂ ; Κ^=7 niM) ; e concentrações micromolares e sub-micromolares de compostos sintéticos. A seguir à incubação a 372C durante alguns minutos, a reacção foi iniciada com 0,01-1 mg de protease de HIV purificada. As misturas reaccionais (37SC) foram rapidamente arrefecidas após 10-20 minutos com um v_o lume igual de ácido tricloroacético 0,6 N gelado e, após centrift[ gação para remover o material precipitado, os produtos da peptido lise foram analisados por HPLC de fase invertida (Beckman Ultrasphere ODS, 4,5 mm x 25 mm; fase móvel: 5-20% de acetonitrilo/ /H₂0 - TFA a 0,1% (15 min), 20% de acetonitrilo/H₂0 - TFA a 0,1% (5 min) a 1,5 ml/min, detecção a 220 nm). As posições de eluição de Ac-Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH₂ (17-18 min) e Ac-Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Tyr (10-11 min) foram confirmadas com materj. al autêntico. As velocidades iniciais de formação de Ac-Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Tyr foram determinadas a partir da integração destes picos e, tipicamente, as propriedades inibitórias dos compostos sintéticos foram determinadas a partir da analise do declive/ordena da/ongem de um gráfico de l/v versus /inioidor_/ (Análise de Dixon). Os valores de K^ resultantes deste tipo de análise primária são exactos apenas para os inibidores competitivos e sob condições em que a constante de Michaelis do substrato utilizado é bem determinada.

585

SKB CASE 14415

/r

-40Exemplo 1

Procedimento geral para a sintese peptidica de fase sólida

As amidas peptidicas são sintetizadas por sintese peptidica de fase sólida utilizando resina de benz-hidrilamina como suporte. Os aminoácidos protegidos são adicionados sequencialmen te, a partir do terminal carboxilo, até que a sequência desejada tenha sido obtida. 0 grupo t-butiloxicarbonilo (Boc) é utilizado para protecção do grupo amina . Os grupos funcionais das cade_i as laterais são protegidos como se segue: arginina e histidina, tosilo (Tos); cisteína, p-metilbenzilo (MeBzl); serina e treoni na, éter benzílico (Bzl); lisina, p-clorocarbobenzoxi (Clz); áci. do glutâmico e ácido aspártico, éster de benzilo (OBzl); tirosina, p-bromocarbobenzoxi (BrZ). A remoção do grupo Boc é efectuada com ácido trifluoroacético (TFA) a 50% em cloreto de metileno.

A neutralização do sal de TFA-amina é executada por tratamento com diisopropilamina (DIEA) a 7% em cloreto de metileno. Os aminoácidos são acoplados ao péptido em crescimento utilizando 3 equiv. de amonoácido-Boc, 3 equiv. de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) em DMF e 3 equiv. de diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) em cloreto de metileno. A perfeição da ligação é verificada pelo teste da ninhidrina e as ligaçães são repetidas, se necessário. 0 protocq lo geral é dado abaixo.

1. 2.	Lavagem com CH^l^ Lavagem com TFA a 50%	1 1	x 1 min.
X	1 min.
3.	Desbloqueia com TFA a 50%	1	X	20 min.
4.	Lavagem com CH₂C1₂	6	X	1 min.
5.	Neutralização com DIEA a 7%	3	X	2 min.
6.	Lavagem com CH₂C1₂	4	X	1 min.
7.	Lavagem com DMF	2	X	1 min.
8.	Boc-AA + HOBt em DMF	nãO	drenar
9.	DCC em CH_?C1₂	2	h.
10.	Lavagem com DMF	2	X	1 min.
11.	Lavagem com CH₂C1₂	3	X	1 min.
	Para ligação do primeiro resíduo	(terminal	C) à resina
a	síntese começa no passo 5. Para	todos aminoácidos subse

585

SKB CASE 14415

-49quentes, a síntese inicia-se no passo 1.

Preparação de Ac-Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NHq

A resina-nonapéptido protegido Boc-Arg(Tos)-Ala-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada da forma usual. Após remoção do grupo Boc do terminal N com TFA a 50% em CH₂C1₂e neutralização do sal de TFA resultante com DIEA a 7% em o péptido ligado à resina foi acetilado com anidrido acético (2 ml) em CH^Cl^ (30 ml) durante 30 minutos.

péptido foi clivado da resina com remoção dos grupos pro tectores das cadeias laterais por tratamento com HF líquido anidro (10 ml) em presença de anisol (l ml), a OSC durante 50 minutos. Após remoção do HF sob vácuo, a resina foi lavada com éter etílico e seca ao ar. A resina foi então extraída com 2 x 30 ml de HOAc a 1%/H₂O, seguida por 2 x 30 ml de HOAc a 1O%/H₂O. Ds extractos combinados foram liofilizados produzindo 476 mg do péptido em bruto.

péptido em bruto foi purificado por distribuição em cori tracorrente utilizando o sistema n-BuOH/HOAc/H^O 4:1:5. As fracções apropriadas foram reunidas, evaporadas até à secura e o res_í duo foi liofilizado de HOAc a l/o/H^O produzindo 294 mg do péptido parcialmente purificado. Uma aliquota de 100 mg do péptido parei, almente purificado foi adicionalmente purificada por filtração em gel numa coluna de SephadexG-15 de 2,6 x 70 cm, utilizando HOAc a 1% como eluente. As fracções apropriadas foram reunidas e liofilizadas produzindo B9 mg do composto do título purificado.

TLC (n-BuOH/HOAc/H₂0 4:l:l) R_f=0,49.

HPLC: (Hamilton PRP-1, CH₃CN/H₂θ/TFA a 0,1%, 5% a 40% de CH^CN, minutos, gradiente linear, 1,5 ml/min.) k'=2,6; FAB-MS: m/ z 1074 (M+H⁺).

Exemplo 2

Preparação de (2S)-N-(2-N-terc-butiloxicarbonil)amino-3-fenil)propil-prolina

Ester de metilo de N-terc-butiloxicarbonil-L-fenilalanina

585

SKB CASE 14415

-50a) 0 cloridrato do éster de metilo de L-fenilalanina (10,0 g, 46,4 mmol) foi dissolvido numa mistura de trietilamina (12,9 ml, 92,0 mmol) e DMF (60 ml). Bicarbonato de N-t-butilo (16,0 ml, 69,6 mmol, excesso de 50%) foi adicionado durante 5 min. à temperatura ambiente. Após agitação durante 16 h, a mistu ra foi filtrada e concentrada sob pressão reduzida. A cromatogra fia flash sobre gel de sílica utilizando EtOAc a 20% em hexano forneceu 13,0 g do composto do título.

TLC: (EtOAc a 20% em hexano) Rp=0,31.

RMN (COC1₃): 6 7,23 (m, 5H), 5,16 (d, IH, 0=8 Hz), 4,57 (q, IH,

0=7 Hz), 3,66 (s, 3H), 3,07 (d, 2H, 0=6 Hz), 1,40 (s, 9H).

N-terc-butiloxicarbonil-L-fenilalaninai

b) Boc-Phe-OMe (12,9 g, 46,4 mmol), preparada como acima, foi dissolvida em tolueno seco (50 ml) e arrefecida até -7880. H_i dreto de diisobutilalumínio (25% bui tolueno, 77,3 ml, 116 mmol, excesso de 150%) foi adicionado durante 2 min. Após agitação durante 15 min a -7880, foi adicionado metanol (15 ml), lentamente, para controlar a efervescência. A mistura foi vertida em sal de Rochelle (94 g de tartarato de sódio e potássio em 1 1 de água,

150 ml) e agitada com éter (100 ml) até ser extraível. A fase aquosa foi lavada com éter (3 x 100 ml). As fases orgânicas foram combinadas, secas (Mg50^) e evaporadas. 0 produto resultante foi utilizado directamente no passo seguinte.

TLC: EtOAc a 20% em hexano) R^=0,21

RMN (CDC1₃): S9,69 (s, IH), 7,28 (m, 5H), 5,05 (s, IH), 4,43 (q, IH, 0 = 7 Hz), 3,10 (d, 2H, 0 = 7 Hz), 1,43 (s, 9H).

Ester de benzilo de (2S)-N-(2-(N-terc-butiloxicarbonil)amino-3-fenil)propil-L-prolina

c) 0 aldeido em bruto, preparado como acima, 2(b), foi dissolvido em ácido acético a 1% em metanol (250 ml) com cloridra to de éster de benzilo de prolina (18,1 g, 75 mmol). Cianoboro-hidreto de sódio (3,06 g, 48,7 mmol, excesso de 5%) foi adiciona do, e a mistura foi deixada, sob agitação, à temperatura ambiente durante 16 horas. A solução foi então evaporada e o resíduo foi

585

5KB CASE 14415

-51diuidido entre EtOAc e HC1 IN. A camada orgânica foi lavada com HC1 IN (2x) , NaHCO^ IN (3x), e água (lx). A evaporação da fase orgânica originou 13,5 g do éster de benzilo do título. A cromatografia flash de uma porção do material em bruto (gel de sílica, EtOAc a 20% em hexano) forneceu o produto puro o qual foi cristalizado de CHCl^ e hexano. Estes cristais forneceram uma estrutura do cristal aos raios X satisfatória (S,S).

p.f.: 79-79,5SC.

TLC: (EtOAc a 20% em hexano); Rp=0,31.

RMN (CDC1₃): £7,33 (s, 5H), 7,20 (s, 5H), 5,14 (s, 2H), 4,95 (d,

1H, 3=9 Hz), 4,05 (d, 1H, 3=7 Hz), 3,17 (m, 2H), 2,63 (m, 5H),

1,87 (m, 4H), 1,35 (s, 9H).

MS: m/z 439 (M+H)⁺, 383, 365, 347, 339, 303, 231, 218, 91, 79.

Anal, calculado para C Η N 0 : C, 71,21; H, 7,81; N, 6,39;

Zo >4 Z 4

Encontrado C, 71,00; H, 7,83; N, 6,25.

(2S)-N-(2-(N-terc-butiloxicarbonil)amino-3-fenil)propil-L-prolina

d) 0 dipéptido reduzido protegido (0,44 g, 1,0 mmol), pre^ parado tal como acima, 2(c), foi dissolvido em metanol (100 ml) com Pd a 10%/C (0,50 g) e hidrogenado, sob H^ a 3,1 x 10^ Pa, durante 1 h. A mistura foi filtrada e concentrada originando 0,35 g (100%) do composto do título.

TLC: (:A:W 4:1:1); R=0,66.

RMN (DMSO-dg): δ 7,26 (s, 5H, 6,80 (d, 1 H, 3=9 Hz), 6,00 (s, 2H),

3,78 (s, 1H), 2,9 (m, 6H), 1,85 (m, 4H), 1,30 (s, 9H).

Executando a mesma sequência, excepto substituindo por piperidina-2-carboxilato de benzilo o éster da benzilo de pro lina, produziu-se ácido (2S)-N-(2-(N-t-butiloxicarbonil)amina-3-fenil)propilpiperidino-2-carboxIIico.

Executando a sequência 2(a)-2(c), excepto substituindo por éster de metilo de Δ 3-desidro-prolina o éster de benzilo de prolina, produziu-se metil (25 )-N-(2-(N-t-butiloxicarbonil )amino-3-fenil)propil-L-prolina. A saponificação do éster de meti lo com 5 equivalentes de ^00^ em metanol:água 4:1 originou 2(S)-N-(2-(N-t-butiloxicarbonil)amino-3-fenil)propil-L-prolina.

585

SKB CASE 14415

-52Exemplo 3

Preparação de ácido (lR,2R)-2-(((25)-2-terc-butiloxicarbonilamiηο-3-fenil-1-oxo)propil)ciclopentanocarboxilico

6-carbometoxibiciclo/~3.1.0_7hexano

a) Diazoacetato de etilo puro (53 ml, 0,50 mol) foi adic_i onado, por meio de um propulsor de seringa, durante um período de 4 horas, a uma mistura agitada do dlmero de acetato de ródio (l,0 g, 0,0023 mol) e ciclopenteno (250 ml, 2,5 mol) imersa em banho-maria a 20-25SC. Após mais 30 minutos, o ciclopenteno em excesso foi removido por evaporação rotatória. 0 resíduo foi diluído com CF^C^» filtrado através de Celite® e concentrado por evaporação rotatória. 0 residuo foi destilado a 44-46SC/66,7 Pa para fornecer o composto do titulo (46,5 g, 0,302 mol) como uma mistura de epímeros de carboetoxi, com rendimento de 60%.

TLC: (Hexano: acetato de etilo - 80:20) R^=0,67.

RMN (CDCl^): £ 4,1 (2H, quartetos em sobreposição), 2,0-1,5 (7H,

m), 1,45-1,1 (5H, m).

6-(l-hidroxi-l-metiletil)bicicl o/~3.1.0_J7hexano

b) Uma solução 1,4 M de metil litio em éter (350 ml, 0,50 mol) foi agitada rapidamente sob Ar a -782C, enquanto o produto do Exemplo 3(a) (27,67 g, 0,180 mol) foi adicionado puro, por meio de seringa, durante um periodo de 15 minutos. A mistura foi agitada durante 1 hora a -789C, em seguida foi deixada aquecer z

até à temperatura ambiente durante um período de 2 horas. Agua (400 ml) foi adicionada, cautelosamente, seguida por HC1 3N (cerca 200 ml) até que a solução se tornou neutra. A camada do éter foi separada e a camada aquosa foi extraída, duas vezes, com éter. 0s extractos do éter combinados foram secos sobre MgSO^ e concentrados por evaporação rotatória. 0 resíduo foi destilado (802-902C/l999,8 Pa) fornecendo o produto do titulo (19,79 g, 0,141 mol) como uma mistura de epímeros, com rendimento de 79%.

TLC: (Hexano: acetato de etilo - 80:20) R^ = 0,36, 0,17.

RMN (CDC1₃): δ 2,0 - 1,6 (5H, m), 1,5 - 1,0 (9H, m), 0,55 (lH, m).

585

SKB CASE 14415 χϊ /5

-53(+_)-trans-2-(2-metilpropenil) clorocicl opentano

c) Uma solução do produto do Exemplo 3(b), acima, (19,6 g, 0,140 mol) em THF (125 ml, foi adicionada, de uma só vez, a uma mistura, sob agitação rápida, de HCI aquoso a 37% (250 ml) e THF (125 ml), arrefecida num banho de gelo. Após 3,5-4,0 minutos, a mistura foi vertida em salmoura (l l) e foi rapidamente e_x traída com pentano (3 x 250 ml). Ds extractos do pentano foram lavados com NaHCO^ a 5% (200 ml), secos sobre MgSO^ e concentrados por evaporação rotatória (252C/15 mm). 0 resíduo foi destil_a do a 782-80SC/l999,8 Pa, através de uma coluna Vigreux de 20,32 cm, originando o composto do título (18,65 g, 0,118 mol), com rejn dimento de 84%.

TLC: (hexano) Rp=0,71

RMN (CDClj): 04,95 (lH, dm), 3,84 (lH, quarteto aparente) 2,87 (lH, quinteto aparente), 2,2 (lH, m), 2,07 - 1,75 (4H, m), 1,72 (3H, d; 3=1,2 Hz), 1,68 (3H, d; 3=1,2 Hz), 1,33 (lH, m).

GC-MS (isobutano): m/z 158 (M)⁺, 123 (M+H-HCl)⁺.

IR (película): 2900, 1455, 1382, 838 cm^-1

2-(2-metilpropenil)litiociclopentano

d) Um frasco de 50 ml seco adaptado com um condensador de refluxo foi purgado com Ar. Lítio pulverizado (0,34 g, 49 mmol; conteúdo de Na de 1%; 25 peso % de dispersão em óleo mineral) foi introduzido e foi lavado com 2 x 100 ml de pentano s_e co para remover o óleo mineral. Uma solução do produto do Exemplo 3(c) (1,58 g, 10,0 mmol) em pentano desgasifiçado por congelação-descongelação, seco, (20 ml) foi adicionada. A mistura foi agitada sob refluxo num banho de óleo a 55SC durante 19 horas e, em seguida, deixada assentar. 0 sobrenadante foi retirado por meio de uma seringa e filtrado, sob Ar, através de um filtro de vidro fritado seco. A solução amarelo claro resultante (17,6 ml) era de 0,45 M no composto do título por titulação contra mentol com 1,10-fenantrolina como indicador. 0 composto do título foi produzido com rendimento de 79%.

585

SKB CASE 14415

-54(lR,2R)-2-((23)-2-terc-butiloxicarbonilamino-3-fenil-l-oxo)propil-2-metilpropenilciclopentano

e) A uma solução agitada de Boc-L-fenilalanina (l,59 g, 6,00 mmol) em éter (40 ml) a -78SC, sob Ar, foi adicionado n-butillítio (4,00 ml, 1,50 M em hexano; 6,00 mmol). Após 10 minutos, o produto do Exemplo 3(d) (37 ml, 0,32 M em pentano, 11,8 mmol) foi adicionado, gota a gota, durante um período de 10 minutos. Após 10 minutos, a solução foi aquecida atê OSC e agitada 1 hora e 45 minutos e, em seguida, foi adicionada água (200 ml) com agitação vigorosa. A mistura foi extraída com acetato de etilo e o produto em bruto foi purificado três vezes por cromatografia flash (hexano: acetato de etilo - 95:5) fornecendo o isómero B (0,356 g, 9,60 mmol; 16% de rendimento baseado na Boc-L-Phe), que eluiu em segundo lugar e o isómero A (0,314 g, 8,46 mmol; 14% de rendimento), que eluiu em primeiro lugar.

(isómero 8) (lR,2R)-2-(2S )-2-_terc-bu til oxicarbonil ami no-3-f enil-1-oxo) prop il-2-metilpropenilciclopentano

TLC: (hexano: acetato de etilo - 95:5) Rp=0,19.

RMN (CDC1 ): ΐ> 7,28-7,08 (5H), 5,06 (IH, d; 0 = 7,8H_Z; NH) ,

4,95 (lH, d; 0=9,6Hz; vinilo), 4,61 (lH, quarteto aparente),

3,11 (lH, m), 3,10 (lH, dd; benzílico), 2,83 (lH, dd; benzilico), 2,77 (IH, m), 2,05 - 1,25 (6H), 1,68 (3H ; metilo), 1,62 (3Hj metilo), 1,39 (9H, s; Boc).

MS (DCI/NH ): m/z 372 (M+H)⁺, 316, 272.

(isómero A) (13,25)—2—((2S)—2 -terc-butiloxicarbonilamino-3-fenil-l-oxo)propil_

-2-metilpropenilciclopentano

p.f. 42-44SC.

TLC: (hexano: acetato de etilo - 95:5) R^=0,26.

RMN (CDC1₃): & 7,27-7,08 (5H), 5,18 (lH, d; 0 = 7Hz; NH) , 5,00 (lH, d; 0=9,3 Hz; vinilo), 4,57 (lH, quarteto aparente), 3,05 (lH, dd; 0=13,9, 6,7 Hz! benzílico), 2,95 (lH, dd; 0=13,9, 5,8 Hz; benzílico), 2,79 - 2,58 (2H, m), 1,95-1,20 (6H, m), 1,70 (3H; metilo), 1,52 (3H; metilo), 1,41 (9H; Boc).

MS (DCI/NH-j): m/z (M+H)⁺, 372 , 316, 272.

5Θ5

SKB CASE 14415

-55ácido (lR,2R)-2-(((2S)-2-terc-butiloxicarbonilamino-3-fenil-l-oxo)propil)ciclopentanocarboxílico

f) Uma solução do produto do Exemplo 3(e) - isómero B (186 mg, 0,50 mmol) em CF^C^/CH^OH 4:1 (5 ml) foi agitada a -78SC, e foi introduzido ozono numa corrente até que uma cor azul persistisse (cerca de 2 min.). A solução foi purgada com árgon, foi adicionado (CH-j^S (0,5 ml) e a solução foi deixada aquecer até 203C. Após 2 horas, os componentes voláteis foram removidos sob vácuo. 0 aldeído em bruto resultante foi dissolvido em 5 ml de acetona e tratado com reagente de Oones (0,25 ml, 0,2M), a OSC com agitação durante 3 min. Foi adicionado isopropanol (0,2 ml). A mistura foi diluída com água e extraída com CF^C^, e os extractos foram concentrados. A cromatografia flash (hexano: acetato de etilo 80:20, seguido por hexano:acetato de etilo:ácido acético 80:20:4) forneceu o composto do título (148 mg, 0,410 mmol), como um vidro, com rendimento de 82%.

p.f. 94,5-969

TLC: (hexano:acetato de etilo:ácido acético 80:20:4) R^=0,27.

RMN (CDC1₅): δ 7,26-7,13 (5H, m), 5,12 (lH, d; 3=8,0 Hz), 4,70 (lH, quarteto aparente), 3,46-3,27 (2H, m), 3,16 (lH, dd; 3=14 Hz, 6,2 Hz), 2,93 (lH, dd; 3=14,0 Hz, 6,5 Hz), 2,14-1,67 (6H, m), 1,39 (12H, s).

MS (DCI/NH ): m/z 362 (M+H)⁺.

A execução da mesma sequência, excepto substituindo por ciclo-hexeno o ciclopenteno em 3(a), produziu ácido 2-(((25) -2-terc-butiloxicarbonilamino-3-fenil-l-oxo)propil)ciclo-hexanocarboxílico.

Exemplo 4

Preparação de ácido (IS ,2S)-2-(((2S)-2-terc-butiloxicarbonilamino

-l-oxo-3-fenil)propil)ciclopentanocarboxílico

Pelo mesmo processo utilizado para preparar o composto do Exemplo 3(f), excepto pela substituição pelo isómero A (186 mg, 0,50 mmol) do Exemplo 3(c), foi obtido o composto do titulo (135 mg, 0,37 mmol), como um sólido branco, com rendimento de 75%.

585

SKB CASE 14415

z'.

f

V-56TLC: (hexano: acetato de etilo:ácido acético 80:20:5) R =0,41.

RMN (CDC1₃): δ 7,32-7,12 (5H, m), 5,13 (lH, d; 0=8,1 Hz), 4,71 (lH, quarteto aparente), 3,42 (lH, quarteto aparente), 3,22-3,08 (2H, m) , 2,91 (lH, dd; 0=13,8, 6,9 Hz; benzilico), 2,20-1,62 (6H, m), 1,38 (12H, s).

MS (DCI/NH₃): m/z 362 (M+H)⁺, 323 (M+ΝΗ^+H-tBu)⁺, 262, 120.

Exemplo 5

Preparação de ácido (lR,2R)-2-(((lR5,2S)-l-hidroxi-2-terc-butiloxicarbonilamino-3-fenil)propil)ciclopentanocarboxílico

A uma solução do Exemplo 7(f) (216 mg, 0,598 mmol) em metanol (5 ml) a 09C foi adicionado NaBH^ (25 mg, 0,66 mmol), com agitação. Após 20 min., foi adicionado HC1 diluído e a mistura foi extraida com CH2CI2 produzindo o composto do titulo como uma mistura de epímeros (216 mg, 0,595 mmol), com rendimento de 100% e uma proporção de 2:1, aproximadamente.

RMN (CDC1₃): δ 7,35-7,15 (5H), 5,05 (lH; NH), 3,87-3,56 (2H), 2,95-2,60 ( 3H), 2,38 (lH), 2,19-1,55 (óH) , 1,38 (9H).

MS (DCI/NH ): m/z 364 (M+H)⁺, 325, 308 (M-C(CH3)3+Η)⁺, 264 (M0C0C(CH3)₃+H)⁺, 183, 160, 120.

A execução da mesma redução sobre ácido 2-(((2S)-2-terc-butiloxicarbonilamino-3-fenil-l-oxo)propil)ciclo-hexanocarboxilico produziu o ácido 2-(((2S)-2-terc-butiloxicarbonilamino-3-fenil-l-hidroxi)propil)ciclo-hexanocarboxilico correspondente.

Exemplo 6

Preparação de ácido (lR,2R)-2-(((lS,25)-l-hidroxi-2-terc-butiloxicarbonilamino-3-fenil)propil)ciclopentanocarboxílico (lR,2R)-metil-2-(((lS,2S)-2-terc-butiloxicarbonilamino-l-hidroxi-3-fenil)propil)ciclopentanocarboxilato

a) Uma solução dos epímeros do Exemplo 5 (140 mg, 0,386 mmol) em éter (5 ml) a OSC foi tratada com diazometano etéreo em excesso, durante cerca de 5 min (até que uma cor amarela persistisse). Eoi adicionado ácido acético (0,1 ml) e a solução foi concentrada por evaporação notatória. A separação por HPLC (ace-

585

SKB CASE 14415

-57tato de etilo:hexano 80:20) sobre sílica forneceu o isómero A (47,0 mg, 0,125 mmol), que eluiu em primeiro lugar, seguido pelo isómero B (50,6 mg, 0,134 mmol).

isómero A (lR,2R)-metil-2-(((lS,25)-2-terc-butiloxicarbonilamino-1-hidroxi-3-fenil)propil)ciclopentanocarboxilato

TLC: (hexano:acetato de etilo - 2:l) R^=0,54.

RMN (CDC1 ): 6 7,32-7,18 (5H, m), 4,85 (lH, d; 0=8,7 Hz; NH) , 3,72 (IH, m), 3,66 (3H, s), 3,52 (lH, dd), 2,90 (2H, d aparente; benzílico), 2,58 (lH, quarteto aparente), 2,40 (lH, m), 1,92-1,50 (6H, m), 1,39 (9H, s).

MS (DCI/NH₃): m/z 378 (M+H)⁺, 339, 322 (M-C(CH_?)₃+H) ⁺, 321,

304 (M-0C(0CH₃)₃+H)⁺, 278 (M-OCOC(CH₃)₃+H)⁺, 120.

A configuração do hidroxi na posição 2 foi determinada como se segue. 0 isómero A foi convertido no seu derivado de oxa zolidinona por tratamento com TFA para remover o grupo protector Boc, seguido por tratamento com fosgénio e trietilamina. Os hidrogénios do anel oxazolidinona tinham uma constante de ligação da RMN consistente com uma relação trans (0=5,3 Hz), a qual foi confirmada com uma falta observada em NOE, estabelecendo deste ιπο do a configuração do hidroxi na posição 2 como sendo (S). isómero B (lR,2R)-metil-2-(((IR,25)-2-terc-butiloxicarbonilamino-l-hidroxi-3-fenil)propil)ciclopentanocarboxilato

TLC :(hexano: acetato de etilo - 2:l) R^=0,42.

RMN (CDC1₃): 7,31-7,16 (5H, m), 4,92 (lH, d; 0=0,7 Hz), 3,89 (lH, m), 3,72 (3H, s), 3,64 (lH, d aparente), 3,41 (lH, dd;

= 14,2, 4,2 Hz; benzílico), 2,72 (2H, m) , 2,36 (lH, quinteto apa. rente), 2,06-1,40 (6H, m), 1,32 (9H, s).

MS (DCI/NH₃): m/z 378 (M+H)⁺, 322, 278, 120.

A configuração do hidroxi na posição 2 do isómero B foi determinada do mesmo modo que para 0 isómero A.

Num processo alternativo, os dois epímeros foram clarameri te separados por HPLC preparativa (coluna de sílica Rainin Dynamax8 2,54 cm x 25 cm, 20 ml/min, hexano:acetato de etilo:ácido

585

SKB CASE 14415

-58fórmico - 75:25:1) para fornecer o isómero A (rendimento de 49%) e o isómero B (rendimento de 35%).

acido (lR,2R)-2-(((lS,2S)-l-hidroxi-2-terc-butiloxicarbonilaroino-3-fenil)propil)ciclopentanocarboxIlico

b) A uma solução do isómero A do Exemplo 6(a) (23,7 mg,

63.2 mmol) em THF:água:metanol - 2:1:1 (2 ml) foi adicionado NaOH a 10% (cerca de 0,2 mmol). Após 2,5 horas, a mistura foi diluída com acetato de etilo e lavada com HC1 a 5%. A secagem sobre MgSO^ e a evaporação forneceram o composto do titulo (21,4 mg, 59,0 mmol), com rendimento de 94%.

p.f.: 120-122SC

TLC: (hexano: acetato de etiloíácido acético 80:20:4) R^.= 0,34.

RMN (CDjOD): £7,23 (5H), 3,73 (lH, m), 3,53 (lH, m), 2,85 (lH, dd; benzilico), 2,73 (lH, dd; benzilico), 2,55 (lH, m), 2,37 (lH, m), 1,90-1,57 (6H), 1,35 (9H, s).

Exemplo 7

Preparação de ácido (lR,2R)-2-(((lR,2R)-2-(((lR,2S)-l-hidroxi-2-terc-butiloxicarbonilamino-3-fenil)propil)ciclopentanocarboxIIico

Pelo processo do Exemplo 6(b), o isómero B do Exemplo 6(a) (20,1 mg, 53,6 mmol) forneceu o composto do título (19,3 mg,

53.2 mmol; rendimento de 99%).

p.f.: 133-135SC

TLC: (hexano:acetato de etilo:ácido acético - 80:20:4) Rg=0,27

RMN (CD^OD): 6 7,21 (5H), 3,75 (lH, m) , 3,49 (lH, dd), 2,96 (lH, dd; benzilico), 2,77-2,42 (3H), 1,95-1,83 (3H), 1,78-1,60 (2H),

1,50 (lH, m), 1,30 (9H, s).

Exemplo 8

Preparação de ácido (lS,25)-2-(((lRS,2S)-2 -terc-butiioxicarbonilamino-1-hidróxi-3-fenil)propii)ciclopentanocarboxílico

Utilizando o processo do Exemplo 5, excepto substituindo pelo composto do Exemplo 4 (38 mg, 0,105 mmol), foi obtido o composto do titulo (35,5 mg, 0,0978 mmol), numa proporção de 1:1

585

SKB CASE 14415 fy'

e com rendimento de 93%, como um sólido branco.

TLC: (hexano:acetato de etilo;ácido acético - 80:20:5) Rj,= 0,26.

RMN (CDC1₃): 8 7,32-7,14 (5H, m), 3,93-3,60 (2H, m) , 3,38-3,21 (lH, dois multipletos), 3,05-2,70 (2H, m), 2,55-2,38 (lH, m), 2,35-1,54 (7H, m), 1,31-1,14 (9H, dois singuletos).

Exemplo 9

Preparação de cloridrato do metil éster de valil valina

Ester de metilo de fenilmetoxicarbonil-valil valina

a) Cloro formato de isobutilo (l,30 ml, 10,0 mmol) foi adicionado, gota a gota, durante 10 min, a uma solução agitada de N-Cbz-L-valina (2,51 g, 10,0 mmol) e N-metilmorfolina (l,21 ml, 11,0 mmol) em THF (30 ml), a -40°C sob árgon. Após 1 hora, foi adicionado cloridrato de éster de metilo de L-valina sólido (l,68 g, 10,0 mmol), seguido por mais N-metilmorfolina (l,21 ml, 11,0 mmol). A mistura foi agitada, com aquecimento até 20SC, durante 24 horas; em seguida foi filtrada e concentrada até um sólido por evaporação rotatória. · A cromatografia flash (gradiente, a 5% de CH^OH em CHCl^) forneceu o composto do titulo (3,44 g,

9,50 mmol) como um sólido branco, com rendimento de 95%.

RMN (CDC1₃): 6 7,34 (5H, m), 6,B0 (lH, d), 5,62 (lH, d), 5,13 (2H,

s), 4,56 (lH, dd), 4,17 (lH, dd), 3,74 (3H, s), 2,15 (2H, m), 1,00-0,88 (l2H, dupletos em sobreposição).

Cloridrato de metil éster de valilvalina

b) Uma solução do composto do Exemplo 9(a) (535 mg, 1,47 mmol) em ácido acético (4 ml) foi agitada com Pd a 10% em carbono (50 mg), sob uma atmosfera de H₂ durante 5 horas. A mistura foi filtrada, diluída com CH^OH, acidificada com HC1 a 37% (0,2 ml), e concentrada sob vácuo até uma goma. 0 residuo foi triturado com éter e seco sob vácuo, originando o composto do título (395 mg, 1,47 mmol) como um pó branco

RMN (CD^OD): £ 4,36 (lH, d; 0=5,8Hz), 3,81 (lH, d; 0=5,7 Hz),

3,73 (3H, s), 2,21 (2H, septeto), 1,09 (3H, d; 0=7,0 Hz), 1,06 (3H, d; 0=6,9 Hz), 0,998 (6H, dupletos em sobreposição), MS

585

SKB CASE 14415

-60(FAB + VE): M/z 231 (Μ + H)⁺, 1BB, 171, 132, 72, 55.

Exemplo 10

Preparação de terc-butiloxicarbonil-(O-fenilmetil)serilalanil alanina z

Ester de metilo de terc-butiloxicarbonil-(0-fenilmetil)seril alanina

a) Cloroformato de isobutilo (2,59 ml, 20,0 mmol) foi adicionado, gota a gota, durante 15 min. a uma solução agitada de éter de N-Boc-L-serina-O-benzilo (5,90 g, 20,0 mmol) e N-metilmo_r folina (2,74 ml, 25,0 mmol) em THF (100 ml) a -402C, sob árgon. Após 45 minutos, foram adicionado N-metilmorfolina (2,75 ml, 25,0 mmol) e cloridrato de éster de metilo de L-alanina sólido (3,22 g, 23,0 mmol). A mistura foi deixada sob agitação, com aquecimeri to gradual até 20°C. Após 18 horas, a mistura foi diluída com acetato de etilo e lavada sucessivamente com HCI a 5%, NaHCO^ a 5% e salmoura. A filtração e a remoção do solvente sob vácuo, forneceram o composto do título (7,54 g, 19,8 mmol) como um óleo, com rendimento de 99%.

TLC: (acetato de etilo:hexano l:l) R^=0,5.

RMN (CDC1₃): Ò 7,32 (5H, m), 7,11 (lH, br m), 5,41 (lH, br m), 4,65-4,53 (3H, m), 4,30 (lH, br m), 3,92 (lH, dd; 3=9,2 Hz, 3,9

Hz), 3,73 (3H, s), 3,58 (lH, dd; 3=9,2 Hz, 616 Hz), 1,45 (9H, s), 1,39 (3H, d; 3=7,1 Hz).

terc-butiloxicarbonil-(Q-fenilmetil)seril alanina

b) Hidróxido de sódio (0,8 g, 20 mmol), em água (50 ml) foi adicionado fraccionadamente durante 2 horas, a uma solução do composto do Exemplo l0(a) (7,5 g, 19,7 mmol) em metanol:água 2:1 (225 ml). A agitação continuou durante mais uma hora até que a solução ficou aproximadamente neutra e TLC indicou a reacção como completada. A solução foi concentrada por evaporação rotatória, diluída com água e extraída com acetato de etilo. A camada aquosa foi acidificada com HCI a 10% e extraída, duas vezes, com acetato de etilo. A secagem sobre MgSO^ e a concentração sob vácuo produziram o composto do título (6,89 g, 18,8 mmol), como um vi69 585

SKB CASE 14415

dro, com rendimento de 96%.

RMN (CDCl-j): 6 7,32 (5H, m) , 5,62 (lH, largo), 4,60 (lH, m) ,

4,55 (2H, s), 4,36 (lH, largo), 3,87 (lH, dd), 3,61 (lH, dd),

1,46-1,40 (12H, m).

*

Ester de metilo de terc-butiloxicarbonil-(0-fenilmetil)serilalanil alanina

c) Cloroformato de isobutilo (2,42 ml, 18,8 mmol) foi adicionado, gota a gota, durante 18 min., a uma solução agitada do composto do Exemplo 10(b) (6,89 g, 18,8 mmol) e N-roetilmorfolj. na (2,74 ml, 25,0 mmol) em THF (100 ml) a -408C sob argon. Após 20 min., foram adicionados N-metilmorfolina (2,74 ml, 25,0 mmol) e cloridrato de éster de metilo de L-alanina sólido (3,07 g, 22,0 mmol). A mistura foi deixada sob agitação, com aquecimento gradual até 208C, durante 20 horas; em seguida foi diluída com acetato de etilo e lavada suoessivamente com HCl a 5%, NaHCO^ a 5% e água salgada. A filtração e a remoção do solvente sob vácuo produziu 0 produto em bruto (7169 g), como um sólido. A recristalização (hexano:acetato de etilo 2:l) forneceu 0 composto do título (7,55 g, 16,7 mmol) com rendimento de 89%, como cristais brancos. TLC: (acetato de etilo:hexano l:l) R^.= D,15.

RMN (CDC1₃): 6 7,32 (5H, m), 7,00 (lH, d), 6,90 (lH, d), 5,44 (lH,

d), 4,58 (2H, s), 4,54 (2H, m), 4,30 (lH, largo), 3,90 (lH, dd),

3,74 (3H, s), 3,64 (lH, dd), 1,44 (9H, s), 1,3B (6H, dupletos em sobreposição).

terc-butiloxicarbonil-(0-fenilmetil)serilalanil alanina

d) Hidróxido de sódio (0,25 g, 6,2 mmol) foi adicionado, fraccionadamente durante 4 horas, a uma solução do composto do Exemplo 10(c) (2,79 g, 6,19 mmol) em metanol:água 2:1 (75 ml), a uma velocidade tal que o pH permaneceu entre 7 e 9. A agitação continuou durante mais 10 horas e, em seguida, a solução foi concentrada por evaporação rotatória. Foi adicionada água e a solução foi extraída, duas vezes, com acetato de etilo. A camada aquo sa foi acidificada com HCl a 10% e extraída, três vezes, com acetato de etilo. A secagem (MgSO^) do extracto orgânico e a remoção do solvente sob vácuo originaram o composto do título (2,58 g,

585

SKB CASE 14415

-625,90 mmol), com rendimento de 95%), como um pó branco.

RMN (CDCl^): ζ>7,30 (7H, m; aromático + NH) , 5,57 (lH, largo), 4,64-4,46 (4H, m), 4,38 (lH, largo), 3,86 (lH, dd), 3,65 (lH, dd), 1,44 (9H, s), 1,39 (6H, dupletos em sobreposição), MS (FAB + VE): m/z 43B (M+H)⁺, 382, 338, 293, 249, 221, 203.

MS (FAB-VE): m/z (M-H)~, 336, 254.

Exemplo 11

Preparação de ácido trans-2-((1-metoxi-l-(2-fenil-1-fenilmetoxicarbonilamino)etil)fosfinil)ciclopentanocarboxílico ácido (+)-2-fenil-l-fenilmetoxicarbonilaminoetil fosfónico, éster de monometilo

a) Fosfonato de (_+)-difenil-(2-fenil-l-fenilmetoxicarbonilamino)etilo foi preparado como descrito em 5ynthesis, 985 (1979). Resumidamente, uma mistura de fosfito de trifenilo (0,1 mol), fenilacetaldeído (0,15 mol, distilado recentemente), carbamato de benzilo (0,1 mol) e ácido acético glacial (15 ml) foi agitada durante 1 hora até que a reacção exotérmica acalmasse. A mistura foi então aquecida a 80-85SC durante 1 hora e os produtos voláteis foram removidos num evaporador rotatório sob pressão reduzida, com aquecimento num banho-maria em ebulição. 0 resíduo oleoso foi dissolvido em metanol (180 ml) e deixado para cristal_i zação a -1090. Após 1-3 horas, o éster cristalino foi recolhido por filtração e recris talizado por dissolução numa quantidade mí nima de clorofórmio quente (30-40 ml) e adição de um volume 4 vezes superior de metanol.

Uma porção do fosfonato de difenilo resultante (2,44 g, 5,00 mmol) foi agitada durante 2 dias em metanol (75 ml) com metóxido de sódio (l,6 g, 30 mmol). A solução foi diluída com HCl a 5% (250 ml) e extraída com éter. A camada do éter foi extraída com Na^CC^ a 5% e salmoura, sendo, em seguida, concentrado. 0 fosfonato de dimetilo em bruto foi agitada durante 1 dia como uma solução em 50 ml de metanol e 50 ml de NaOH a 10%. A solução foi acidificada com HCl a 10% (300 ml) e extraída com CH Cl . A remo ção do solvente forneceu um sólido que foi dissolvido em CHCl-j quente (100 ml). Foi adicionado hexano (50 ml) e a solução foi

585

SKB CASE 14415 ,-7

-63armazenada durante toda a noite a -209C. Os cristais resultantes foram recolhidos por filtração originando o composto do titulo (l,53 g, 4,38 mmol), com rendimento de 88%.

Brometo de 2-(2-metilpropenil)ciclopentilmaqnésio

b) A uma suspensão, sob agitação, de aparas de magnésio (432 mg, 18 mmol) em éter seco (15 ml) e benzeno seco (5 ml), sob Ar num frasco equipado com um condensador de refluxo, foi adicionado 1,2-dibromoetano puro (l,55 ml, IB mmol), cautelosamente e gota a gota, durante 30 min. Uma alíquota de 10,0 ml (9,0 mmol) da solução de MgB^ límpida resultante foi adicionada a bma solução a -78SC de 2-(3-metilpropenil)litociclopentano (o composto do Exemplo 3(d)) (8,6 mmol) em pentano (20 ml) e THF (20 ml). A mis^ tura heterogénea resultante foi aquecida até 09C, originando uma solução cor de laranja clara do reagente de Grignard corresponderi te (θ,6 mmol), a qual foi rearrefecida até -78SC para utilização no passo (b).

trans-2-(l-metoxi-1-(2-fenil-l-fenilmetoxicarbonilamino)etil)-fos finil-2-metilpropenilciclopentano

c) A uma solução do composto do Exemplo 11 (a) (l,92 g,

5,50 mmol) em Ch^C^ seco (15 ml), sob Ar, foi adicionado SDC^ (0,40 ml, 5,5 mmol). Após 2,5 horas, o solvente foi removido sob vácuo. 0 HCl residual foi removido por adição e re-evaporação de CH2CI2 seco (10 ml), seguido por THF seco (10 ml). 0 cloreto de fosfonilo viscoso restante foi diluído com THF seco até um volume de 11,0 ml; uma alíquota da solução (8,6 ml, 4,3 mmol) foi adicionada, com agitação, a uma solução a -78SC de reagente de Frignard (8,6 mmol) tal como preparado no passo (a) acima. A mistura homogénea foi deixada sob agitação durante 1 hora a -789C e, em seguida, 1 hora a -209C. HCl a 10% aquoso (50 ml) foi adicionado, seguido por água (200 ml). A mistura foi extraída, três ve zes, com éter. Os extractos do éter combinados foram lavados com NaHCO^ a 5%, secos sobre MgSO^ e concentrados até um óleo (2,1 g) A cromatografia flash (CHCl^) forneceu 0 composto do título como uma goma (864 mg, 1,90 mmol; rendimento de 44%) e como uma mistjj ra de quatro diastereómeros.

585

SKB CASE 14415

-64TLC: (CHC1₃:CH₃OH 25:l) R_f=0,4.

GC (coluna: CHROMPACK 51 mm x 0,22 mm i.d.; fase líquida CP sil 5 CB. Forno: 240°C): RT (área rei.) 4,04 (l,0), 4,17 (l,3),

4,42 (1,2), 4,58 (l,9).

RMN (CDC1 ); 07,35-7,03 (lOH, m), 5,56-5,10 (lH, m; NH), 5,05-4,87 (3H, m), 4,33 (lH, m), 3,76-3,60 (3H, m), 3,29-2,69 (3H, m), 2,08-1,56 (12H, m), 1,29 (lH, m).

MS (DCI/NH₃): m/z 456 (M + H)⁺, 378, 365, 34B, 322, 213, 203,

120, 10B, 91.

acido trans-2-((1-metoxi-l-(2-fenil-1-fenilmetoxicarbonilamino)etil)fosfinil)ciclopentanocarboxílico

d) Utilizando o processo de ozonólise do Exemplo 3(f), o composto anterior do Exemplo ll(c) (680 mg, 1,49 mmol) forneceu o composto do título como uma goma em bruto. A cromatografia flash (CHC1₃:CH₃OH 25:1, seguido por CHC1₃:CH₃OH:ácido acético 25:l:l) forneceu o produto puro (365 mg, 0,820 mmol), com rendimento de 55%, como uma espuma friável.

RMN (CDC1₃): è 7,32-7,12 (lOH, m), 5,00-4,91 (2H, m), 4,45 (lH, m), 3,78-3,64 (3H, m), 3,35-2,68 (4H, m), 2,08-1,60 (7H, m).

A execução da mesma sequência, excepto substituindo por 4-bromo-l-buteno o 2-(2-metil propenil)1itiociclopentano, produziu o ácido 2-((1-metoxi-1-(2-fenil-1-fenilmetoxicarboxilami no)etilfosfinil)propanóico correspondente.

Exemplo 12

Preparação de ácido (55)-4-oxo-5-(t-butoxicarbonilamino)-6-fenil-hexanéico (65)-7-fenil-6-(t-butoxicarbonilamino-hept-l-eno-5-cna

a) A uma solução sob agitação de pó de magnésio (l,82 g, 75 mmol) em éter dietilico seco (lO ml), sob árgon, foram adicionadas diversas gotas de 4-bromo-l-buteno. Uma vez iniciado o refluxo espontâneo, foi adicionado 4-bromo-l-buteno (6,75 g, 5U mmol), gota a gota, a uma velocidade que mantivesse um refluxo sua ve. A mistura foi agitada durante mais 3U minutos com aquecimento até ao refluxo. Após arrefecimento, a solução de reagente de

5Θ5

SKB CASE 14415

•rC-- »

-65Grignard foi adicionada a uma solução agitada de (Boc)-L-fenilalq nina-N-metoxi-N-metilamida (l,0 g, 3,2 mmol) em éter dietilico s_e co (10 ml) a OaC. Após 1,5 horas, a mistura reaccional foi diluí, da com HCI a 10% e extraída 3x com éter dietilico. A camada orgj5 nica foi lavada sucessivamente com HCI 1 M, bicarbonato de sódio aquoso saturada e cloreto de sódio aquoso saturada, seca (MgSO^) e evaporada sob pressão reduzida, originando o composto do titulo (7Θ0 mg, rendimento de 81,8%), como cristais brancos.

RMN (CDCl-j): 6 7,20 (5H, m) ; 5,73 (lH, m) ; 5,1 (lH, d);

5,05 (2H, m); 4,55 (lH, quarteto); 3,05 (2H, m);

2,48 (2H, quarteto); 2,30 (2H, m); 1,40 (9H, s).

MS (DP/NH₃): m/z (M+H)⁺ 304; 248, 204, 120.

z

Acido (5-5)-4-oxo-5-(t-butoxicarbonilamino)-6-fenil-hexanóico

b) Foi introduzido ozono numa solução do composto do Exem pio 12(a) (400 mg, 1,32 mmol) em CH^C^iMeOH 4:1 (5 ml) a -7830, até que uma cor azul persistisse. A solução foi purgada com árgon durante diversos minutos, sendo, em seguida, adicionado sulfeto de dimetilo (2 ml). A mistura foi aquecida até à temperatura ambiente durante 2 horas, sendo, em seguida, concentrada sob pressão reduzida até um óleo. 0 resíduo oleoso foi dissolvido em acetona e arrefecido, com agitação, até Q3C. 0 reagente de Jones (l,32 mmol, 2M soln.) foi adicionado, gota a gota. Após 5 minutos, foi adicionado isopropanol. A mistura foi diluída com H₂0 e extraída 3x com diclorometano. A camada orgânica foi seca (MgSO^), filtra da e concentrada até um óleo. A cromatografia flash sobre gel de sílica (hexano:acetato de etilo 60:40, seguido por hexano:acetato de etilo:ácido acético 65:35:5) forneceu o composto do título como um óleo (175 mg, rendimento de 41%).

RMN (CDCl-j): 6 7,24 (5H, m) ; 5,1 (lH, d);

4,55 (lH, quarteto); 3,05 (2H, m); 2,68 (5H, m); 1,38 (9H, s).

MS (FAB⁺): m/z 322; (FAB^-): m/z 320.

Utilizando a mesma sequência, excepto substituindo por Boc-fenilglicina a Boc-(0-benzil)tirosina, originou ácido 4-oxo-5-(terc-butiloxicarbonil-amino)-5-fenilpentanóico.

585

SKB CASE 14415

-66Exemplo 13

Preparação de ácido (5S)-4-oxo-5-(terc-butoxicarbonilamino)-6-(4-benziloxifenil)-hexanóico

Boc-(O-benzil)tirosina-N-metoxi-N-metil amida

a) a uma solução de Boc-(0-benzil)tirosina (7,42 g;

30,0 mmol) em CH^Cl^ seco (20 ml) foram adicionados trietilamina (3,0 ml, 21,5 mmol) e hexafluorofosfato de benzotriazol-l-iloxitris (dimetilamino) fosfónio (6,96 g, 20,0 mmol). Apôs 10 minutos, trietilamina (3,0 ml, 21,5 mmol) e 0,N-dimetil-hidroxilamina (2,15 g, 22,0 mmol). Apôs 16 horas, a solução foi diluída com acetato de etilo e lavada sucessivamente com HC1 a 5%, bicarbonato de sódio aquoso saturado, e cloreto de sódio aquoso saturado.

A solução orgânica foi seca (MgSO^), filtrada e concentrada até uma espuma. A cromatografia flash sobre gel de sílica (hexano: :acetato de etilo 50:50) forneceu o composto do titulo (5,B7 g, rendimento de 71%) como um pé branco.

RMN (CDC1 ): 8 7,40 (5H, m) ; 7,02 (4H), dd;

5,12 (IH, d); 5,05 (2H, s); 4,90 (lH, largo);

3,62 (3H, s); 3,15 (3H, s); 2,92 (2H, m);

1,38 (9H, s).

MS: m/z (M+H)⁺ 415; 359, 341, 315 (6S)-7-(4-benziloxifenil)-6-(terc-butoxicarbonilamino)hept-l-eno-5-ona

b) A uma suspensão de pé de magnésio (6,68 g, 0,275 mol) em éter dietilico anidro (100 ml), sob uma atmosfera de árgon, fo ram adicionadas diversas gotas de 4-bromo-l-buteno. Uma vez iniciado o refluxo espontâneo, foi adicionado 4-bromo-l-buteno (24,72 g, 0,183 mol) a uma velocidade que mantivesse um refluxo suave. Após terminar a adição, a mistura continuou sob refluxo durante mais 30 min. Foi preparada uma solução de t-butiloxicarboniltiro sina-(0-benzil)-metoximetilamida (lB,95 g, 0,046 mol) em THF anidro, que foi lentamente adicionada a OSC, ao reagente de Grignard previamente preparado. Após 90 min, a reacção estava completada, tal como indicado por TLC e foi rapidamente arrefecida com HC1 aquoso a 10%. A mistura reaccional foi extraída com éter, três

585

SKB CASE 14415 vezes, e os extractos orgânicos combinados foram lavados sucessivamente com HC1 1 M, NaHCO^ aquoso saturado, e NaCl aquoso satura do. A solução foi seca (MgSO^), filtrada e evaporada sob pressão reduzida originando um sólido branco. A purificação por cromatografia de coluna em gel de sílica eluindo com acetato de etilo a 17%/hexano forneceu o composto do título como um sólido branco (18,1 g, 96%)

RMN (CDC1₃): ^7,42 (5H, m) ; 6,96 (4H, dd) ;

5,72 (IH, m) j 5,10 (lH, br d); 5,06 (2H, s); 4,95 (2H, m) ;

4,48 (lH, q); 2,95 (2H, m); 2,5-2,0 (4H, m) ; 1,38 (9H, s).

MS: m/z (M+H)⁺ 410, 371, 354, 310.

ácido (55)-4-oxo-5-(terc-butoxicarbonilamino )-6-(4-benziloxifenil)-hexanóico

c) Numa solução do composto do Exemplo 13(b) (8,0 g,

19,6 mmol) em CHCljZMeOH 4:1, a -78SC, foi introduzido ozono até que uma cor azul persistisse. A solução foi então purgada com árgon durante alguns minutos, seguida pela adição de sulfeto de dimetilo (6 ml). A mistura resultante foi agitada durante 2 h à temperatura ambiente e, em seguida, evaporada. 0 resíduo oleoso foi dissolvido em acetona (175 ml) e arrefecido até OSC. Foi adi. cionado reagente de Oones (12 ml de uma solução 2 Μ), gota a gota e a mistura foi agitada durante 10 minutos antes de ser rapidame_n te arrefecida com isopropanol. A solução foi vertida em H₂ 0 e ex traída, três vezes, com CH Cl . 0s extractos orgânicos combinados foram secos (MgSO^), filtrados e evaporados sob pressão reduzida. 0 resíduo oleoso foi purificado por cromatografia de coluna utilizando gel de sílica, eluindo, primeiro com acetato de etj. lo:hexano 2:3, seguido por ácido acético:acetato de etilo:hexano 5:35:60, originando o composto do titulo como um sólido castanho-amarelado (3,39 g, rendimento de 40%),

RMN (CDC1₃): S 7,40 (5H, m); 7,0 (4H, dd) ;

RMN (CD^OD): & 5,05 (lH, obsc.); 5,03 (2H, s); 4,52 (lH, quarte to); 3,2-2,5 (7H, m); 1,40 (9H, s).

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SKB CASE 14415

-68Exemplo 14

Preparação de ácido (3R,45)-4-(N-benziloxicarbonil)amino-2,2-diflu oro-3-hidroxi-5-fenilpentanóico (3R,4S)-4-(N-benziloxicarbonil)amino-2,2-difluoro-3-hidroxi-5-fenilpentanoato de etilo

a) Uma solução de N-Cbz-L-fenil-alanol (0,77 g, 2,75 mmol) em 10 ml de CHgClg seco foi adicionada a uma solução do periodinano de Dess-Martin (l,28 g, 3,02 mmol) em 15 ml de CHgC^ seco, num fluxo uniforme e lento. Após agitação durante 30 min., foram introduzidos 100 ml de uma solução de 1 parte de tiossulfato de sódio aquoso a 10% e 1 parte de NaHCO^ aquoso saturado, e a mistura foi agitada virogosamente durante 30 min. A mistura foi extraída, três vezes, com CF^C^ e os extractos orgânicos combina dos foram secos sobre MgSO^, filtrados e concentrados in vacuo, originando N-Cbz-L-fenilalanal como um sólido amarelo. Uma suspensão de zinco (0,54 g, 8,24 mmol) e CuBr (60 mg, 0,22 mmol) em 15 ml de THF seco foi tratada com cloreto de dietilaluminio (6,04 ml, 6,04 mmol, 1 M em hexano) e arrefecida até -20QC. A esta sus. pensão foi adicionada uma solução do N-Cbz-L-fenilalanal em bruto e de bromodifluoroacetato de etilo em 25 ml de THF seco, gota a gota, durante 20 min. A mistura reaccional foi agitada durante 45 min., em seguida foi rapidamente arrefecida pela adição de HCI aquoso a 5% e deixada aquecer até à temperatura ambiente. A mistura foi extraída, três vezes, com Et₂0, e os extractos orgânicos combinados foram secos sobre MgSO^, filtrados, e concentrados. A cromatografia flash sobre gel de sílica (Et^Oihexano l,5:l) prodjj ziu 0,78 g (70%) de uma mistura de diastereómeros de 3:2. Os diastereómeros foram separados por cromatografias flash repetidas (hexano:Et₂0 1 ·* 1) fornecendo 468 mg (42%) do composto do título como um sólido branco.

RMN (CDCl^): ^7,27 (lOH, m); 5,02 (3H, m); 4,31 (2H, q; 3=7,5 Hz); 4,23 (lH, m); 4,09 (lH, m); 3,86 (lH, br d; 3=6,2 Hz); 3,01 (2H, m); 1,31 (lH, t, 3=7,5 Hz).

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SKB CASE 14415

χ*·

-69âcido (3R,4S)-4-(N-benziloxicarbonil)amino-2,2-difluoro-3-hidroxi-5-fenilpentanéico

b) 0 éster do Exemplo 14(a) (l,0 g, 2,45 mmol) foi dissol_ vido em 40 ml de MeOH:THF 3:2. Esta solução foi adicionada a K₂C0^ (2,7 g, 19,6 mmol) em água (25 ml), e a mistura foi agitada vigorosamente durante 3 horas. A solução aquosa foi lavada coro Et₂0 (rejeitado), acidificada com HCl e extraída, uma vez, com Et₂0, e, duas vezes, com CH₂C1₂. Os extractos orgânicos combinados foram secos sobre MgSO^ e filtrados. A evaporação do solvente in vacuo forneceu o ácido do titulo (0,93 g, 90%) como um sól_i do branco.

RMN (CDC1 ): 5 7,21 (lOH, m); 4,91 (3H, m); 4,22 (3H, m); 2,97 (2H, m)

MS : m/z 38 0

Exemplo 15

Preparação de 2 - (acetilserilqlutaminilasparaqinil)amino-3-fenil-propil-prolilvalilvalinamida composto do Exemplo 2(d) (0,35 g, 1,0 mmol) foi ligado a Val-l/al-BHA (l,0 mmol) utilizando DCC (0,21 g, 1,0 mmol) e HOBT (0,15 g, 1 mmol) em CH₂C1₂ a 50%/DMF, durante toda a noite. A re sina-peptidilo foi acetilada com Ac₂0 (l ml em 30 ml de CH₂Cl₂) até que o teste da ninhidrina fosse negativo. 0 péptido foi então completado e acetilado, de acordo com o processo do Exemplo 1, utilizando metade da resina. 0 intermediário resina-peptidilo foi clivado com 10 ml de HF anidro e com 1 ml de anisol, durante lha OSC. 0 péptido foi extraído da resina com HOAc glacial. A liofilização forneceu 150 mg do péptido em bruto (37%). 0 péptido foi purificado por distribuição em contracorrente (n-butanol: :ácido acético:água 4:1:5) produzindo 60 mg. 0 péptido foi adicionalmente purificado por HPLC preparativa, k' 4,00 (coluna de HPLC semi-preparativa Hamilton PRP-1 305 x 7 mm, água-acetonitrilo-TFA a 0,1%, 95:5 a 78:22 em 13 min, 78:22 a 60:40 em 6,5 min) originando 17,9 mg.

TLC: R 0,34 (B:A:W 4:l:l), 0,68 (B:E:A:W 1:1:1:1).

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SKB CASE 14415

-70HPLC: (coluna de HPLC analítica Hamilton PRP-1 250 X 4,1 mm, água-acetonitrilo - TFA a 0,1%, 95:5 a 60:40 durante 15 min.) k' 2,73.

FAB-MS: m/z 817 (M+H)⁺.

Análise de aminoácidos: Ser 0,57, Gin 1,00, Asn 1,00, Uai 2,00.

A execução da mesma sequência, excepto substituindo por 1,1 equivalentes molares de cloreto de butirilo o anidrido acético, produziu 2-(butiril-serilglutaminilasparaginil)amino-3-fenil-propil-prolilvalil valinamida.

Exemplo 16

Preparação de 2-(serilqlutaminilasparaqinil)amino-3-fenilpropil-prolilvalil valinamida composto do Exemplo 2(d) (0,87 g, 2,5 mmol) foi ligado a Ual-Ual-BHA (l,2 mmol) com DCC (0,52 g, 2,5 mmol) e HOBt (0,38 g, 2,5 mmol) em 30 ml de CH^Clg a 50%/DMF, durante toda a noite.

teste da ninhidrina mostrou ligação completa. 0 pêptido foi completado utilizando 0,6 g (0,4 mmol) da resina. 0 pêptido foi clivado da resina utilizando 15 ml de HF com 1,5 ml de anisol a OSC durante 1 h. A mistura resina-peptidilo foi lavada com éter (3x) seguido por HOAc (4x). A liofilização do HOAc originou 192,5 mg do pêptido em bruto (62%). Uma fracção de 100 mg do pêptido em bruto foi purificada por filtração em gel através de Sephadex G-15 utilizando HOAc a 1%. Isto forneceu 33,3 mg de pêptido, o qual foi adicionalmente purificado por HPLC preparativa (coluna de HPLC semi-preparativa Hamilton PRP 305 x 7 mm, água-acetonitrilo-TFA a 0,1%, 85:15 a 60:40 em 15 min) originando 8,10 mg.

R_f 0,93 (B:A:W 4:l:l), 0,97 (B:E:A:W 1:1:1:1).

HPLC: (coluna de HPLC analítica Hamilton PRP-1 250 X 4,1 mm, água-acetonitrilo - TFA a 0,1%, 95:5 a 60:40 durante 15 min.) k'

2,87

FAB-MS m/z 775 (M+H)⁺

585

SKB CASE 14415

Exemplo 17

Preparação de 4-(acetilserilqlutaminilasparaqinil)amino-3(RS)-hidroxi-l-oxo-5-fenilpentil-prol ilvalil valinamida intermediário suportado pela resina, Ac-Ser(Bzl)-Gln-Asn/~”3( RS )-A HPPA_7-Pro-Vai-Val-BHA , foi preparado numa escala de 1 mm da forma usual, de acordo com o Exemplo 1. D Boc-AHPPA utilizado era racémico na posição 3. D péptido foi clivado da resina, e o grupo benzilo foi removido do hidroxilo da serina por tra tamento, a OSC, com 10 ml de HF anidro e 1 ml de anisol, durante 60 min. 0 HF foi removido in vacuo a OSC. 0 residuo foi tritura do com éter dietílico, o péptido foi extraído com ácido acético (3 x 20 ml) e liofilizado, originando 302 mg. A purificação foi efectuada por distribuição em contracorrente (n-butanol:ácido acé tico:água 4:1:5; 200 transfrências). As fracçoes principais foram reunidas, concentradas, diluídas com ácido acético e liofilizadas, produzindo 103 mg do composto do titulo.

TLC: (B:E:A:W, l:l:l:l) R =0,51;

FAB-MS: m/z 875 (M+H)⁺;

Análise de aminoácidos: Asp=l,00, Ser=0,14, Glu=0,94, Pro=l,09, Val=2,24, conteúdo em péptido (baseado em Asp)=80,8%.

Exemplo 18

Preparação de 4-(acetilserilqlutaminilasparaqinil)amino-3(R5)-hidroxi-l-oxo-5-fenilpentil-valil valinamida intermediário suportado pela resina Ac-5er(Bzl)-Cl π-Asn/~3(RS)-AHPPA_7-Val-Val-NH2, foi preparado da forma usual numa es cala de 0,5 mmol. 0 Boc-AHPPA utilizado era racémico na posição 3. 0 péptido foi clivado da resina com HF anidro (10 ml) em presença de anisol (l ml), a OSC durante 60 minutos. Após remoção do HF a OSC sob vácuo, a resina foi triturada com éter dietílico e seca ao ar. 0 péptido foi extraído da resina com ácido acético (4 x 20 ml), e liofilizado, originando 110 mg. 0 péptido foi pur_i ficado utilizando distribuição em contracorrente (B:A:W 4:1:5; 200 transferências). As fracçães principais foram reunidas, concentra das, diluídas com ácido acético e liofilizadas, produzindo 21 mg

585

5KB CASE 14415

-72do composto do título.

TLC: (B:E:A:W, 1:1:1:1) R_f=0,53

HPLC: (4,5 mm X 25 cm Altex Ultrasphere 5 m ODS, acetonitrilo-água-TFA a 0,1%, gradiente de 10-50% de acetonitrilo durante 20 min.), k’ = 4,47, 4,37 FAB-MS: m/z 778 (M+H)⁺;

Análise de aminoácidos: Asp=l,00, Ser=0,71, Glu=l,00, Ual=2,09; Conteúdo em péptidos (baseado em Asp)=72,75%.

Exemplo 19

Preparação de 4-(serilqlutaminilasparaqinil)amino-3(R)-hidroxi-l-οχο-5-fenilpentil-valil vaiinamida intermediário suportado pela resina, Boc-Ser(Bzl)-Gln-Asn/^-3(R)-AHPPA_7-Val-Val-BHA, foi preparado da forma usual numa escala de 1 mmol. Omitindo o passo de acetilação, o péptido foi clivado da resina com remoção do grupo protector benzilo por tratja mento com HF (10 ml) e anisol (l ml), a 03 durante 60 min. 0 HF foi removido sob vácuo a 09C. 0 resíduo foi triturado com éter dietilico e o péptido foi extraído do resíduo com ácido acético (4 x 10 ml). 0 extracto do ácido acético foi liofilizado produzinco 85 mg. 40 mg do péptido em bruto foram purificado por HPLC preparativa (Ultrasphere ODS, 15% de acetonitrilo/H₂0-TFA a 0,1%). As fracções contendo o produto desejado foram combinadas, concentradas in vacuo, diluídas com ácido acético e liofilizadas originando 20 mg do péptido do título.

HPLC: (4,6 X 25 cm Altex Ultrasphere ODS, 15% de acetonitrilo-água-TFA a 0,1%) k’=6,33.

FAB MS: m/z 736 (M+H) ⁺

Análise de aminoácidos: Asp 1,00, Ser 0,71, Glu 0,99, Vai 1,96

Exemplo 20

Preparação de 4-(serilglutaminilasparaqinil)amino-3(S)-hidroxi-l-oxo-5-fenilpentil-valil vaiinamida intermediário do péptido suportado pela resina, Boc-Ser( Bzl )-Gl n-Asn/ 3(S )-AHPPA_7-Val-Val-l\IH₂ foi preparado da maneira

585

SKB CASE 14415

-73usual numa escala de 1 mm. 0 péptido foi clivado da resina, desbl£ queado e purificado da mesma forma que no Exemplo 19, produzindo 12 mg do composto do titulo.

HPLC (4,6 mm X 25 cm Altex Ultrasphere ODS, 15% de acetonitrilo-água-TFA a 0,l%): k’=6,33

FAB MS: m/z 736 (M+H) ⁺

Análise de aminoácidos: Asp 1,00, Ser 0,71, Glu 0,99, Vai 1,96

Exemplo 21

Preparação de éster de metilo de (IR ,2R)-2-(((25)-2-(terc-butiloxicarbonilserilalanilalanil)amino-1-oxo-3-fenil)propil)ciclopentilcarbonil-valil valina

X

Ester de metilo de (IR,2R)-2-(((25)-2-terc-butiloxicarbonilamino-1-oxo-3-fenil)propil)ciclopentilcarbonil-valil valina

a) A uma solução do composto do Exemplo 3(f) (10,5 mg, 29,0 mmol) em THF (0,4 ml), sob árgon a -40SC, foram adicionados N-metilmorfolina (6 ml, 55 mmol) e cloroformato de isobutirilo (3,8 ml, 29,1 mmol). Após 20 min., mais N-metilmorfolina (6 ml) foi adicionada, seguida por uma solução de cloridrato de éster de metilo de ualil valina (16 mg, 60 mmol) em THF (0,5 ml). A mistu ra foi agitada a -40°C durante 30 min., em seguida 209C durante 17 horas. A mistura foi diluída com acetato de etilo, lavada com HC1 a 5%, seca sobre MgSO^ e concentrada. A cromatografia flash (CHCl^CH^OH 50:l) forneceu o composto do título como um sólido branco (13,4 mg, 23 mmol; rendimento de 81%).

TLC: ( CHC1: CH.jOH 50:l) R =0,28.

RMN (CDCl^): δ 7,26 (3H, m; aromático), 7,10 (2H, m, aromático),

6,50 (IH, d; 3=8,7 Hz; NH), 6,35 (lH, d; 3 = 8,6 H_z; NH), 5,11 (lH, d; 3=7,9 Hz; BocNH), 4,70 (lH, quarteto aparente), 4,52 (lH, dd; 3=8,7, 4,9 Hz), 4,26 (lH, dd; 3=8,6, 7,1 H_z), 3,73 (3H, s), 3,51 (lH, quarteto aparente), 3,16 (lH, dd; 3=14,1,

5,5 Hz; benzilico), 3,07 (lH, quarteto aparente), 2,86 (lH, dd; 3=14,1, 6,7 Hz; benzilico), 2,25-1,60 (8H, m), 1,38 (9H, s), 0,941-0,874 (l2H, dupletos em sobreposição).

MS (FAB + VE): m/z 574 (M + H)⁺, 518, 474, 443, 387, 343, 244,

229.

585

SKB CASE 14415

-74Ester ds metilo (IR,2R)-2-(((25)-2-amino-l-oxo-3-fenil)propil)ciclopentilcarbonil-valil valina, sai de ácido trifluoroacético

b) 0 composto do Exemplo 2l(a) (13 mg, 23 mmol) foi dissolvido em ácido trifluoroacético (0,5 ml). Após 2 horas, a soIlj ção foi concentrada sob vácuo, e o residuo foi combinado com cloreto de metileno e reconcentrado, originando o composto do titulo (13 mg) como um sólido branco.

Ester de metilo de (IR ,2R)-2-(((25)-2-(terc-butiloxicarbonil-(0-fenilmetil)serilalanilalanil)amino-1-oxo-3-fenil)propil)ciclopen tilcarbonil-valil valina

c) A uma solução de Boc-Ser(Bzl)-Ala-Ala (15,1 mg, 34,5 mmol) em THF, a -409C sob árgon, foram adicionado N-metilmorfolina (7,7 ml) e cloroformato de isobutilo (4,5 ml, 35 mmol). Após agitação durante 20 min., foi adicionada mais N-metilmorfolina (7,7 ml), seguida por uma solução do tripéptido do Exemplo 2l(b) (13 mg) em THF. A mistura foi aquecida até 2DSC e agitada toda a noite. A mistura reaccional foi diluída com CH^Cl^, e lavada com HCl a 5%, NaHCO^ a 5% e água. A evaporação do solvente forneceu um produto em bruto que foi purificado por cromatografia flash (gradiente de eluição, CHCl^zCH^OH 50:1 a 25:l), originando o pro duto do título (17,9 mg, 20 mmol) como um sólido branco.

TLC: (CHC1 zCH-jOH 95:5) R =0,35.

RMN (CD^OD: CDCl-j l:l): § 7,35 - 7,20 (5H, m) , 4,80 (lH, dd;

0=8,7, 4,8 Hz), 4,54 <2H, s; PhCH₂0), 4,42-4,16 (5H, m), 3,73 (3H, s), 3,78-3,62 (2H, m; BnOCH₂), 3,40 (lH, m), 3,20 (lH, dd; 0 = 14,4, 4,7 Hz benzílico), 3,09 (lH, m) , 2,92 (lH, dd; 0 = = 14,4, 8,7 Hz; Benzílico), 2,25-1,95 (4H, m) , 1,85-1,65 (4H, m) , 1,47 (9H, s), 1,35 (3H, d; 0=7,2 Hz), 1,23 (3H, d; 0=7,2Hz), 0,956-0,922 (12H, dupletos em sobreposição).

MS(FAB + VE): m/z 893 (M + H)⁺, 793, 762, 706, 662, 645, 634, 514, 474, 420, 364.

z

Ester de metilo de (IR,2R)-2-(((25)-2-(terc-butiloxicarbonilseril alanilalanil)ami no-1-oxo-3-fenil)propil)ciclopentilcarbonil-valil valina

585

SKB CASE 14415

-75d) Uma solução do hexapêptido do Exemplo 2l(c) (8,1 mg, 9,1 mmol) em metanol (4 ml) foi agitada com Pd a 10%/C (7 mg), sob uma atmosfera de H^, durante 15 horas. A filtração e a evapjg ração forneceram o composto da titula (7,2 mg, 9 mmol) como um s_6 lido branco.

TLC (CHCl-jí CH^OH 95:5): R_f=0,15.

RMN (CD-jOD: CDC12 l:l): 6 7,21 (5H, m) , 4,80 (lH, m) , 4,36-4,12 (5H, m), 3,81 (lH, dd; 0=10,9, 5,3 H_z; CH₂0H), 3,72 (3H, s),

3,67 (lH, dd; 0=10,9, 5,8 Hz ; CH₂0H), 3,41 (lH, m), 3,20 (lH, dd; 0=14,3, 4,6 Hz; Benzílico), 3,07 (lH, m), 2,88 (lH, dd; 0=14,3, 9,0 Hz; benzílico), 2,22-1,96 (4H, m), 1,81-1,67 (4H, m), 1,47 (9H, s), 1,38 (3H, d; 0=7,3 Hz), 1,27 (3H, d; 0=7,3 Hz), 0,960-0,932 (12 H, supletos em sobreposição).

MS (FAB + UE): m/z 803 (M + H)⁺, 787, 703, 672, 616, 572, 544, 473, 330, 315, 298, 274, 244, 203.

MS (FAB - UE): m/z 802, 698, 307, 273, 241, 201, 185, 153.

Exemplo 22

Preparação de éster de metilo de (lR,2R)-2-(((25)-2-(serilalanilalanil)amino-l-oxo-3-fenil)propil)ciclopentilcarbonil-valil valina, cloridrato composto do Exemplo 2l(d) (5 mg, 6,2 mmol) foi dissolv_i do em ácido trifluoroacético (0,25 ml). Após 90 min., a solução foi concentrada sob vácuo, o resíduo foi dissolvido em metanol (0,5 ml) e foi adicionado HC1 concentrado (cerca de 0,025 ml). A solução foi concentrada, sendo a goma resultante triturada com éter e seca sob vácuo, fornecendo o composto do titulo (4,5 mg) como um sólido branco.

RMN (CD₃0D): 6 7,20 (5H, m), 4,72 (lH, dd; 0=8,5, 5,0 Hz),

4,38 (lH, m), 4,31 (2H, m), 4,19 (lH, d), 3,92 (3H, m), 3,70 (3H, s), 3,48 (lH, m), 3,19 (lH, dd; 0=14,3, 5,0 Hz; benzílico),

3,08 (lH, m), 2,83 (lH, dd; 0=14,3, 8,5 Hzj benzílico), 2,21-1,98 (4H, m), 1,84-1,65 (4H, m) , 1,35 (3H, d; 0=7,2 Hz), 1,29 (3H, d; 0=7,1 Hz), 0,958-0,921 (12H, dupletos em sobreposição).

MS (FAB + UE): m/z 703 (M + H)⁺.

585

SKB CASE 14415

-76Exemplo 23

Preparação de éster de metilo de (lS,2S)-2-(((lS,2S)-2-(terc-buti1oxicarbonilserilalanilaianil)amino-l-hidróxi-3-fenil)propil)ciclopentilcarbonil-valil valina

Ester de metilo de (lS ,2S )-2-(((lRS,2S)-2-terc-butiloxicarbonilami no-1-hidróxi-3-fenil)propil)ciclopentanocarboni1-L-vaiil-L-yalina

a) D produto do Exemplo 8 (35,5 mg, 97,B mmol) e HOBT (26 mg, 196 mmol) foram dissolvidos em dioxano (0,5 ml) e DMF (0,1 ml), e, em seguida, foi adicionado DCC' (20,2 mg, 98,1 mmol). Após 20 mini de agitação, foram adicionados N-metilmorfolina (32 ml, 290 mmol) e cloridrato de éster de metilo de valil valina (52 mg, 195 mmol). Após 3 dias, a mistura foi diluida com acetato de etilo, filtrada e extraída com HCl diluído. A camada orgânica foi concentrada. A cromatografia flash (CHCl^sCH^OH 50:l) do produto em bruto forneceu o isómero A (26 mg, 45,9 mmol; rendimento de 47%) que eluíu primeiro e o isómero B (25 mg, 43,1 mmol; rendimento de 44%).

isómero A:

z ester de metilo de (lS ,2S)-2-(((IR,2Ξ)-2-(terc-butiloxicarbonil)amino-1-hidróxi-3-fenil)propil)ciclopentanocarbonil-valil valina TLC: (CHC1₃:CH₃OH 25:l) R =0,55.

RMN (CDC1₃): 8 7,28 (5H, m), 6,73 (lH, d; 3=8,7 Hz ; NH) ,

6,42 (IH, d; 3=8,6 Hz; NH), 5,16 (lH, d; 3 = 9,5 H_z ; BocNH),

4,58 (IH, dd; 3=8,8, 5,2 Hz), 4,32 (lH, dd; 3=8,6, 6,0 Hz),

3,91 (lH, quarteto aparente), 3,76 (3H, s), 3,25 (lH, dupleto ap.a rente; 3=10,2 Hz), 2,95-2,B3 (2H; benzílico), 2,52 (lH, quarteto aparente), 2,30-2,10 (3H, m) , 2,00-1,55 (6H, m), 1,39 (9H, s), 0,990-0,907 (12H, quarteto aparente).

MS(FA0 + VE): m/z 576 (M + H)⁺, 476, 389, 345, 317, 246, 225. isómero B:

ester de metilo de (15,25)-2-(((15,25)-2-(terc-butiloxicarbonil)amino-1-hidróxi-3-fenil)propil)ciclopentanocarbonil-valil valina

TLC: (CHCl^CH^OH 25:l) R_f=0,45.

585

SKB CASE 14415 fi

-77RMN (CDC1₃): à 7,24-7,15 (5H, m) , 6,77 (lH, d; 3=8,3 Hz), 6,56 (lH, d; 3=8,2 Hz), 4,80 (lH, d; 3=8,4 Hz), 4,47 (lH, dd; 3=8,4, 4,9 Hz), 4,36 (lH, tripleto aparente), 3,80-3,60 (5H, m), 3,08 (IH, dd), 2,69 (2H, mí benzilico), 2,53 (lH, m), 2,25-2,05 (2H, m) , 2,00-1,60 (6H, m), 1,32 (9H, s), 0,979-0,855 (l2H, dupletos em sobreposição).

MS(FAB + VE): m/z 576 (M + H)⁺, 476, 389, 246, 231, 152, 132.

Ester de metilo de (15,25)-2-(((15,25)-2-amino-l-hidroxi-3-fenil) propil)ciclopentanocarbonil-valil valina, cloridrato

b) 0 isómero B do Exemplo 23(a) (25 mg, 43 mmol) foi dis solvido em ácido trifluoroacético (0,25 ml). Após 1 hora, a solu ção foi concentrada por evaporação rotatória. 0 residuo foi dissolvido em CHjOH, tratado com HCl concentrado (0,05 ml) e re-concentrado. A trituração com Et₂0 e secagem sob vácuo forneceram o composto do titulo como um pó branco (22 mg, 43 mmol).

*

Ester de metilo de (15,2S)-2-(((lR,25)-2-amino-l-hidroxi-3-fenil) propil)ciclopentanocarbonil-valil valina, cloridrato

c) 0 isómero A do Exemplo 23(a) (26 mg, 45 mmol) foi tra tado com ácido trifluoroacético e HCl de acordo com o processo do Exemplo 23(b), fornecendo o composto do título (19,9 mg, 39 mmol)

Ester de metilo de (lS,25)-2-(((lS,25)-2-(terc-butiloxicarbpnil-L-(0-fenilmetil)serilalanilalanil)amino-l-hidroxi-3-fenil)propil)ciclopentilcarbonil-valil valina

d) A uma solução de Boc-Ξer(Bzl)-Ala-Ala (19,4 mg, 44,4 mmol) em THF (0,5 ml), a -40SC sob árgon, foram adicionados N-metilmorfolino (8,8 ml) e cloroformato de isobutilo (5,8 ml, 44,4 mmol). Após agitação durante 20 min., foi adicionada mais N-metilmorfolina (8,8 ml), seguida por uma solução do composto do Exemplo 23(b) (22 mg, 43 mmol) em THF (l,0 ml). A mistura foi aquecida até 20SC e agitada durante toda a noite. A mistura reac cional foi diluída com ⁶ ^^{avacJa com} 8C1 a 5%, seca (MgSO^) e concentrada. A cromatografia flash do resíduo forneceu o composto do título como um sólido branco (25 mg, 28 mmol; Rendimento de 65%).

535

SKB CASE 14415

-78RMN (CDC1 ): 6 7,40-7,05 (llH, m), 7,00-6,80 (4H, m; NH), 5,53 (IH, d; BocNH), 4,52 (2H, s), 4,47-4,30 (4H. m), 4,19-4,06 (2H, m), 3,97 (lH, largcí, 3,80-3,62 (2H, m) , 3,69 (3H, s), 3,07 (lH, dd), 2,83 (IH, dd), 2,66 (lH, m), 2,52 (lH, m), 2,34 (lH, largo), 2,23-2,03 (2H, m), 2,00-1,84 (2H, m) , 1,80-1,60 (4H, m), 1,46 (9H, s), 1,32 (3H, d; 3=7,0 Hz), 1,15 (3H, d; 3=7,1 Hz), 0,939 (6H, dois dupletos em sobreposição), 0,871 (6H, dois dupletos em sobreposição).

MS (FAB + VE): m/z B95 (M + H)⁺, 795 (M-Boc + H)⁺, 764, 708, 664 618, 565, 547, 476, 416, 388.

Ester de metilo de (lS,2S)-2-(((lR,25)-2-(terc-butiloxicarbonil-L-(0-fenilmetil)serilalanilaianil)amino-1-hidroxi-3-fenil)propil )ciclopentilcarbonil-valil valina

e) Por um processo substancialmente idêntico ao do Exemplo 23(d), utilizando o tripéptido preparado no Exemplo 25(c) (19,9 mg, 39 mmol), Boc-Ser(Bzl)-Ala-Ala (17,5 mg, 40 mmol), cloroformato de isobutirilo (5,2 ml, 40 mmol) e N-metilmorfolina (2x8,8 ml), foi obtido o composto do titulo como um sólido branco (23,2 mg, 26 mmol; rendimento de 67%).

RMN (CDC1₃): 67,38-7,17 (lOH, m), 7,10 (2H, m; NH), 6,96 (lH, d; 3 = 8,3 Hz; NH), 6,87 (lH, d; 3=9,1 Hz 5 NH), 6,63 (lH, d; 3=8,4 Hz; NH), 5,50 (lH, d; 3=6,4 Hz; BocNH), 4,56 (2H, s; benzílico), 4,53-4,36 (4H, m) , 4,39 (2H, m), 4,15 (lH, quarteto aparente), 3,84 (lH, dd; 3=9,4, 4,6 Hz), 3,74 (3H, s), 3,66 (lH, dd; 3=9,4, 5,8 Hz), 3,33 (lH, tripleto aparente), 2,94-2,91 (2H, m; benzílico), 2,57 (lH, quarteto aparente), 2,26-2,08 (4H, m),

1,95-1,75 (3H, m), 1,67-1,50 (2H, m), 1,45 (9H, s), 1,37 (3H, d; 3=7,1 Hz), 1,30 (3H, d; 3=7,1 Hz), 0,950-0,892 (l2H, dupletos em sobreposição).

Ester de metilo de (lS ,2S )-2-(((lS,2S)-2-(terc-butiloxicarbonil-L

-serilalanilalanil)-amino-1-hidroxi-3-fenil)propil)ciclopentilcar bonil-valil valina

f) Uma solução do composto do Exemplo 23(d) (25 mg, 28 mmol) em metanol (l ml) foi agitada com Pd a 10%/C (l2 mg), sob uma atmosfera de H^, durante 15 horas. A filtração e a evapora69 585

SKB CASE 14415

-79ção do solvente forneceram o composto do título (20,7 mg, 25,7 mmolj rendimento de 92%) como um sólido branco.

TLC: ( CHCl-j: CH^OH 95:5) R_f=0,39.

RMN (CDC1 ): 0 7,71 (lH, largo; NH), 7,58 (lH, d largo; NH) ,

7,16 (5H, m) , 6,97 (2H, m; NH), 6,12 (lH, largo,* NH), 4,75 (lH, largo; BocNH), 4,42 (lH, dd), 4,40-4,04 (5H, m), 3,89 (lH, largo), 3,70 (3H, s), 3,64 (2H, m), 3,03 (lH, dd), 2,82-2,44 (4H, m) , 2,23-1,87 (4H, m), 1,80-1,60 (4H, m) , 1,45 (9H, s), 1,35 (3H, d; 0=6,8 Hz), 1,09 (3H, d; 0=6,9 Hz), 0,963 (6H; dois dupletos), 0,853 (6H, dois dupletos).

MS (FAB + UE): m/z 805 (M + H)⁺, 789, 705, 674, 618, 574, 476,

416, 388, 300.

MS (FAB-UE): m/z 803 (M-H)“.

Exemplo 24

Preparação de éster de metilo de (l5,25)-2-(((l5,25)-2-(L-seril-L-alanil-L-alanil)-amino-l-hidroxi-3-fenil)propil)ciclopentilcarbonilvalil valina, sal de ãcido trifluoroacético produto do Exemplo 23(f) (l,3 mg, 1,6 mmol) foi dissolvido em ácido trifluoroacético. Após 90 min., a solução foi concentrada até â secura sob vácuo. 0 resíduo fci triturado com éter e o éter foi removido sob vácuo, produzindo o hexapêptido do titulo como um sólido branco.

Exemplo 25

Preparação de éster de metilo de (15,2S)-2-(((IR,25)-2-(terc-butiloxicarbonilserilalanilaianil)amino-1-hidroxi-3-fenil)propil)~ ciclopentilcarbonil-L-valil-L-valina

Utilizando o processo do Exemplo 23(f), o hexapêptido do Exemplo 23(e) (23 mg, 26 mmol) foi desbenzilado para originar o composto do título, como um sólido branco (l8,9 mg, 23,5 mmol; rendimento de 90%).

TLC: (CHC1-j: CH-jOH 95:5) R_f=0,45.

RMN (CDC1 ): 5 7,47 (lH, d; 0=7,3 Hz; NH), 7,34 (lH, d; 0=6,8 Hz; NH), 7,29-7,16 (5H, m), 7,09 (lH, d; 0=8,9 Hz, NH), 6,79

595

SKB CASE 14415 <* /

/ /

S'

-80(1H, d; 0=8,5 Hz; NH), 5,79 (lH, d; 0=6,5 H_z; NH), 4,76 (lH, largo), 4,45-4,20 (5H, m), 4,11 (lH, quarteto aparente), 3,94 (IH, dd; 0=10,9, 4,3 Hz), 3,74 (3H, s), 3,66 (lH, dd), 3,31 (lH, dupleto largo), 2,91 (2H, dupleto aparente), 2,58 (lH, quarteto aparente), 2,44 (2H, largo), 2,28-2,08 (3H, m), 1,95-1,71 (3H, m), 1,59 (2H, m), 1,45 (9H, s), 1,41 (3H, d; 0=7,1 Hz),

1,30 (3H, d; 0 = 7,1 Hz), 0,951-0,906 (l2H, m).

MS (FAB + UE): m/z 805 (M + H)⁺, 787, 731, 705, 674, 618, 547, 519, 476.

MS (FAB-VE): m/z 803, 711, 699.

( Exemplo 26

Preparação de éster de metilo de (15,25)-2-(((lR,25)-2-(serilalanilalanil)amino-1-hidroxi-3-fenil)propil)ciclopentilcarbonil-valil valina, sal de ácido trifluoroacético composto do Exemplo 25 (l,2 mg, 1,5 mmol) foi dissolvido em ácido trifluoroacético. Após 90 min., a solução foi concen trada até à secura, sob vácuo. 0 residuo foi triturado com éter, originando um sólido branco.

Exemplo 27

Preparação de éster de metilo de (IR , 2R)-2-(((IS,2S)-2-(terc-butiloxi-carbonilserilalanilaianil)amino-1-hidroxi-3-fenil)propil)ciclopentilcarbonil-valil valina (lR,2R)-2-(((lRS,2S)-l-hidroxi-2-terc-butiloxicarbonilamino-3-fenil)propil)ciclopentilcarbonil-valil valina

a) A uma solução dos epímeros do Exemplo 5 (36 mg, 0,10 mmol) em dioxano (0,4 ml) foram adicionados N-hidroxibenzotriazol (27 mg, 0,20 mmol) e DCC (22 mg, 0,11 mmol). Após 20 min. de agi_ tação. foi adicionada N-metilmorfolina (27 ml, 0,25 mmol), seguida por cloridrato de éster de metilo de valil valina (53 mg, 0,20 mmol). A mistura foi agitada durante 5 dias, sendo, em seguida, filtrada e concentrada. A cromatografia flash (CHCl^íCH^OH 25:l) forneceu os compostos epimêricos do titulo, com rendimento de 89%, como uma espuma branca (51 mg, 0,089 mmol).

SKB CASE 14415

Λ

585

-81TLC (CHCIjíCH^OH 20:l): R_f=0,37.

RMN (CDC1₃): £>7,35-7,15 (5H, m) , 7,05-6,75 (2H, mj NH) , 5,13 (lH, m; BocNH), 4,50 (lH, m) , 4,30 (lH, m), 3,85-3,60 (5H, m) , 2,95-2,58 (3H, m) , 2,43-1,55 (8H, m) , 1,45-1,25 (9H, dois singuletos; Boc), 1,05-0,90 (12H, m).

MS(FAB⁺): m/z 576 (M+H)⁺, 476 (M-OCOC(CH₃)_?)⁺.

z

Ester de metilo de (IR ,2R)-2-(((1R5,25)-l-hidroxi-2-amino-3-fenil) propil)ciclopentilcarbonil-valil valina, cloridrato

b) Os péptidos do Exemplo 27(a) (48 mg, 83 mmol) foram dissolvidos em ácido trifluoroacético (0,5 ml). Após 1 hora, a { solução foi concentrada por evaporação rotatória, e o residuo foi dissolvido em CH₃0H, tratado com HCI concentrado (0,1 ml) e re-concentrado. A trituração com éter e a secagem sob vácuo, forne ceram os compostos do título epiméricos, como um pó branco (42 mg, 82 mmol).

Ester de metilo de (lR,2R)-2-(((lRS,2S)-2-(terc-butiloxicarbonil-(0-fenilmetil)-serilalanilaianil)amino-l-hidroxi-3-fenil)propil)ciclopentil-carbonil-valil valina

c) A uma solução de 8oc-Ser(Bzl)-Ala-Ala (35 mg, 0,080 mmol) em THF (0,4 ml), a -402C sob árgon, foram adicionados N-metil morfolina (ll ml, 0,10 mmol) e cloroformato de isobutirilo (10,4 ml, 0,0B0 mmol). Após 20 minutos de agitação, foi adiciona da N-metilmorfolina (li ml), seguida por uma solução dos compostos do Exemplo 27(b) (42 mg, 0,082 mmol) em THF (l ml). A mistura foi agitada com aquecimento até 20SC durante toda a noite, em seguida foi dissolvida em CH₂C1₂ e lavada com HCI a 5%, NaHC0₃ a 5% e água. A evaporação do solvente forneceu 61 mg de um produto em bruto. Uma fracção de 50 mg do produto em bruto foi purificada por cromatografia flash (gradiente de eluição, CHCl^CHjOH 50:1 a 25:l), eluindo o isómero A puro (16 mg), seguida por uma fracção mista (ll mg), e finalmente o isómero B puro (13 mg).

isómero B:

éster de metilo de (lR,2R)-2-(((lS,2S)-2-(terc-butiloxicarbonil-L-(0-fenilmetil)serilalanilaianil)amino-l-hidroxi-3-fenil) propil)ciclopentilcarbonil-valil valina

585

SKB CASE 14415

ι.

-82TLC: (CHC1^:CH^DH 25:l) R_f=0,40.

RMN (CDClj): δ 7,40-6,95 (15H, m; arilo + NH), 5,58 (lH, d;

BocNH), 4,53 (2H, s; benzilico), 4,51 (lH, dd), 4,37 (2H, m),

4,26-4,20 (3H, m), 3,75 (2H, m), 3,71 (3H, s), 3,54 (lH, largo),

2,96-2,90 (2H; benzilico), 2,69 (lH, m), 2,38 (lH, m) , 2,15 (2H, m; CH(CH₃)₂), 1,90-1,60 (6H, m), 1,46 (9H, s; Boc), 1,37 (3H, d; 0=7,2 Hz; CH ) , 1,20 (3H, d; 0=7,2 Hz; CH^), 0,937 - 0,980 (l2H, dupletos em sobreposição; CH^).

isómero A éster de metilo de (lR,2R)-2-(((lR,2S)-2-(terc-butiloxicarbonil-L-(0-fenilmetil)serilalanilalanil)amino-1-hidrox i-3-fenil)propil)ciclopentilcarbonil-valil vaiina

TLC: CHC1₃:CH₃OH 25:l) R_f=0,45

RMN (CDC1 ): 87,79 (l4H, d; NH), 7,40-7,10 (llH, m; arilo + NH),

6.70 (2H; NH), 5,59 (lH, d; 0=3,3 H_z; NH), 4,93 (lH, d; 0=3,2 Hz), 4,54 (2H, s; benzilico), 4,47 (lH, dd; 0=8,5, 5,0 Hz),

4,30-4,20 (4H, m), 4,14 (lH, m), 3,78 (lH, m), 3,71 (3H, s), 3,67 (lH, m), 2,90 (1H, dd; benzilico), 2,77 (2H, m), 2,35-2,10 (4H, m) , 1,95-1,55 (6H, m), 1,49 (9H, s; Boc), 1,40 (3H, d; 0 = 7,3 Hz; CH^), 1,12 (3H, d; 0=7,3 Hzj CH^) , 0,99 (6H, dois dupletos; CH^) ,

0,91 (6H, dois dupletos; CH^).

*

Ester de metilo de (lR,2R)-2-(((lS,25)-2-(terc-butiloxicarbonilserilalanilalanil)amino-1-hidróxi-3-fenil)propil)ciclopentilcarbonilvalil valina

d) Uma solução do isómero B do Exemplo 27 (c) (13 mg, 15 mmol) em metanol (5 ml) foi agitada com Pd a 10%/C (10 mg), sob uma atmosfera de H₂ , durante 15 horas. A filtração e a evaporação forneceram o péptido do titulo (l2 mg, 15 mmol), como um sóli. do branco.

TLC: CHC1₃:CH₃OH 95:5) R_f=0,21.

RMN (CD^OD): 8 7,21 (5H, m), 4,35 (lH, m), 4,30-4,13 (4H, m),

4,08 (lH, largo), 3,85 (lH, dd; 0=10,8, 5,4 Hz) ÇH₂0H), 3,73 (1H, m), 3,72 (3H, s), 3,58 (lH, t aparente; 0=4,3 Hz), 2,92 (lH, dd; 0=13,7, 6,2 Hz; benzilico), 2,75 (lH, dd; benzilico),

2.71 (lH, m), 2,37 (lH, m largo), 2,19-2,02 (2H, m; CH(CH₃)₂),

585

SKB CASE 14415

-831,85-1,60 (6H, m) , 1,48 (9H, s; Boc), 1,41 (3H, d; 3=7,3 Hz;

CH^), 1,21 (3H, d; 3=7,3; CH^), 0,934-0,928 (12H; dupletos em sobreposição; CH^).

MS (FAB + VE): m/z 805 (M + H)⁺, 674, 618, 574, 476, 309, 274, 246, 228, 203.

Exemplo 2B

Preparação de éster de metilo de (IR,2R)-2-(((15,25)-2-(serilalanilaianil)amino-1-hidroxi-3-fenil)propil)ciclopentilcarbonil-valil valina, cloridrato ({' 0 produto do Exemplo 27(d) (12 mg, 15 mmol) foi dissolvido em ácido trifluoroacético (0,5 ml). Após 90 min, a solução foi concentrada sob vácuo; o resíduo foi dissolvido em metanol (l ml) e foi adicionado HCI concentrado (cerca de 0,05 ml). A solução foi concentrada, a goma resultante foi triturada com éter e seca sob vácuo, originando o composto do título (ll mg) como um pó branco.

RMN (CD₃0D): ί>7,23 (5H, m) , 4,50-4,25 (3H, m) ,

4,16	(1H,	m) ,	4,05-3,90	(3H,	m), 3,70 (3H, s),
3,51	(1H,	dd)	, 3,00-2,70	(2H,	m) , 2,56 (1H, m) ,
2,32	(1H,	m) ,	2,20-1,95	(2H,	m), 1,80-1,58 (6H, m) ,
1,40	(3H,	d ;	3=7,1 Hz),	1,27	(3H, d; 3=7,2 Hz),

0,959-0,931 (12H, dupletos em sobreposição).

MS (FAB + VE): m/z 705 (M+H)⁺, 574, 476.

Exemplo 29

Preparação de éster de metilo de (IR,2R)-2-(((IR,2S)-2-(terc-butiloxicarbonilserilalanilalanil)amino-1-hidroxi-3-fenil)propil)ciclopentilcarbonil-yalil valina isómero A do Exemplo 27(c) (15,5 mg, 17,3 mmol) foi agi tado com Pd a 10%/C (10 mg) em metanol (5 ml), sob uma atmosfera de H₂, durante 15 horas. A filtração e a evaporação forneceram o péptido do titulo (13,8 mg, 17,2 mmol).

TLC: (CHC1₃:CH₃OH 95:5) R_f=0,27.

RMN (CD₃0D): é.7,22 (5H, m) , 4,40 - 4,10 (6H, m) , 3,86 (lH, dd;

585

SKB CASE 14415

-843=11,0, 5,5 H_Z; CHgOH), 3,78 (lH, dd; 3=11,0, 6,0; CHgOH),

3,72 (3H, s), 3,58 (lH, dd; 3=10,0, 1,8), 2,98 (lH, dd; 3=14,1,

3,4 Hz; benzílica), 2,81-2,71 (2H, m), 2,34 (lH, m) , 2,24-1,60 (8H, m), 1,50 (9H, s), 1,40 (3H, d; 3=7,3 Hz; CH ), 1,11 (3H, d; 3=7,4 Hz; CH₃), 1,02-0,940 (l2H, quatro dupletos; CH(CH₃)₂). MS (FAB + VE): m/z 805 (M + H)⁺, 674, 618 , 574, 519, 475, 308, 264.

Exemplo 30

Preparação de éster de metilo de (IR,2R)-2-(((IR ,2S)-2-(serilalanil-L-alanil)amino-hidroxi-3-fenil)propil)ciclopentil-carbonil-valil valina, cloridrato

Utilizando o processo do Exemplo 28, o hexapêptido do Exemplo 29 (l3,8 mg, 17,2 mmol) foi tratado com ácido trifluoroacético e HCl, originando o composta do título (13 mg).

RMN (CD^OD): 6 7,20 (5H, m), 4,39-4,17 (4H, m), 4,07-3,92 (4H, m) , 3,70 (3H, s), 3,52 (lH, dd; 3=9,5, 2,9 Hz), 2,98 (lH, dd; 3=14,2,

3,4 Hz; benzilico), 2,82-2,68 (2H, m), 2,38 (lH, m), 2,21-1,55 (8H, m) , 1,35 (3H, d; 3=7,2 Hz), 1,20 (3H, d; 3=7,1 Hz), 1,01-0,889 (12H, quatro dupletos).

MS (FAB + VE): m/z 705 (M + H)⁺, 575, 476.

Exemplo 31

Preparação de metil éster de (IR ,2R)-2-(((lRS ,25)-2-(acetil-serilalanilaianil)amino-1-hidróxi-3-fenil)propil)ciclopentilcarbonil-valil valina

Metil éster de (IR,2R)-2-(((1R5,2S)-2-(acetil-(0-fenilmetil)serilalanil alanil)amino-1-hidróxi-3-fenil)propi!)ciclopentilcarbonil-valil valina

a) Uma mistura de 1:1 dos epímeros do composto do Exemplo 27(c) (10,8 mg, 12,2 mmol) foi dissolvida em ácido trifluoroacétj. co (0,5 ml). Após 75 min, a solução foi concentrada sob vácuo. 0 resíduo foi dissolvido em ^H^Clg e extraído com NaHCO^ a 5%. A ca mada do CH^Clg foi seca sobre MgSO^ e concentrada atê um sólido branco (8,8 mg, TLC: (CHCl^CH^OH 25:l) R_f=0,13). 0 sólido foi

585

SKB CASE 14415

agitado como uma suspensão em CF^C^^:dioxano 1:1 (2 ml) e anidrido acético (l,l ml, 12 mmol). Apés 30 min., o solvente foi removido por evaporação rotatória. 0 resíduo foi purificado por cromatografia flash (CFICl^: CHjOH 9:l) fornecendo a mistura epimérica do titulo como um sólido branco (9,2 mg, 11,0 mmol).

TLC: (CHCl^:CH^OH 25:l) R_f=0,25, 0,18.

RMN (CD-jOD): 8 7,38-7,11 (lOH, m), 4,57 (2H, s), 4,53-3,97 (6H, m), 3,78 (2H, tripleto aparente), 3,70 (3H, s), 3,68 (lH, m),

3,53 (IH, m), 3,00-2,59 (2H, m), 2,35 (lH, m), 2,18-1,98 (5H, m) ,

I, 95-1,55 (6H, m), 1,37 (3H; dupletos em sobreposição), 1,17-1,07 (3H, dois dupletos), 0,94 (l2H, dupletos em sobreposição).

z

Ester de metilo de (IR ,2R)-2-(((1R5,2S)-2-(acetil-serilalanilalanil)amino-l-hidroxi-3-fenil)propil)ciclopentilcarbonil-vaiil valina

b) Uma solução dos epímeros do Exemplo 3l(a) (9,2 mg,

II, 0 mmol) em ácido acético (l ml) foi agitada com Pd a 10% em carbono (6,0 mg), sob hidrogénio (l atmosfera) durante 18 horas.

A solução foi filtrada e concentrada sob vácuo fornecendo a mistu ra epimérica do título como um sólido branco (8,2 mg, 11,0 mmol). TLC: (CHC1CH^OH 9:l) R_f=0,35, 0,27.

RMN (CD^OD): 87,21 (5H, m), 4,42-4,09 (6H, m), 3,89-3,60 (2H, m), 3,70 (3H, s), 3,04 (lH, m), 2,99-2,59 (2H, m), 2,34 (lH, m), 2,18-1,99 (5H, m), 1,92-1,55 (6H, m), 1,38 (3H, dupletos em sobrepos_i ção), 1,20-1,08 (3H, dois dupletos), 0,93 (12H, supletos em sobre posição).

MS (FAB + VE): m/z 747 (M + H)⁺, 616, 517, 476, 317, 272, 246, 228, 201, 133.

Exemplo 32

Preparação de éster de metilo de trans-2-((1-metoxi-1-(2-fenil-1-(terc-butiloxicarbonil-serilalanilalanil)amino)etil)fosfinil)ciclopentilcarbonil-valil valina

Ester de metilo de trans-2-((l-metoxi-l-(2-fenil-l-fenilmetoxicarbonilamino)etil)fosfinil)ciclopentilcarbonil-valil valina

585

SKB CASE 14415

a) Fai adicionado cloroformato de isobutilo (13 ml, 0,10 mmol) a uma solução sob agitação do composta do Exemplo ll(d) (45 mg, 0,10 mmol) e N-metilmorfolina (17 ml, 0,15 mmol) em THF a -4Q2C. Após 30 min, foi adicionada N-metilmorfolina (17 ml, 0,15 mmol), seguida por cloridrato de éster de metilo de ualil valina sólido (40 mg, 0,15 mmol). A mistura foi deixada aquecer até 20SC com agitação. Após 14 horas, a mistura foi diluída com HCl a 5% e extraída com CH^Cl^. 0 extracto do CH^Cl^ foi concentrado e purificado por cromatografia flash (CHC1^:CH^OH 25:l) originando o composto do titulo como um sólido branco (65 mg, 98,9 mmol), com rendimento de 99%.

TLC: (CHC1₃:CH₃DH 9:l) R =0,6.

RMN (CDClj): è 7,33-7,10 (lOH, m) , 5,08-4,77 (2H, m), 4,70-4,24 (3H, m), 3,82-3,66 (6H, m), 3,41-2,63 (3H, m), 2,24-1,51 (8H, m),

1,03-0,89 (13H, m).

*

Ester de metilo de trans-2-((l-metoxi-1-(l-amiηο-2-fenil)etil)fosfinil)ciclopentilcarbonil-valil valina

b) Uma solução do composto do Exemplo 32(a) (30 mg, 46 mmol) em metanol (l,5 ml) foi agitada com Pd a 10%/C (30 mg), sob hidrogénio (l,0l3 x 10^ Pa) durante 9 horas. A mistura foi filtrada e concentrada sob vácuo originando o composto do título como um vidro (20 mg, 38 mmol; rendimento de 84%).

RMN (CDC1₃): 8 7,38-7,18 (5H, m), 4,51 (lH, m), 4,30 (lH, m),

3,90-3,68 (6H, m) , 3,44-3,03 (2H, m), 2,93-2,48 (lH, m), 2,25-1,67 (8H, m), 1,27 (lH, m), 1,01-0,85 (13H, m).

Ester de metilo de trans-2-((l-metoxi-l-(2-fenil-l-(terc-butiloxicarbonil-(O-fenilmetil)serilalanilalanil)amino)etil)fosfinil)ciclopentilcarbonilvalil valina

c) Por um processo substancialmente semelhante ao do Exemplo 27(c), utilizando o composto do Exemplo 32(b) (20 mg, 38 mmol), Boc-Ser(Bzl)-Ala-Ala (18,4 mg, 42 mmol), N-metilmorfolina (7,0 ml, 63 mmol) e cloroformato de isobutirilo (5,5 ml, 42 mmol), e cromatografia flash subsequente (CHCl₃:CH₃0H 50:l), foi obtido o composto do título como um vidro (23,5 mg, 24,9 mmol; rendime_n to de 65%).

585

SKB CABE 14415

-87TLC: (CHCl^zCH^OH 9:l) R_f=0,5.

RMN (CDCl ): 0 7,39-7,13 (lCH, m), 4,80-4,20 (SH, m) , 3,90-3,60 (8H, m), 3,45-2,70 (3H, m) , 2,22-1,64 (BH, m) , 1,50-1,25 (l2H, m), 1,10 (3H, m), 1,04-0,85 (13H, m).

z

Ester de metilo de trans-2-((l-metoxi-l-(2-fenil-l-(terc-butiloxicarbonils erilalanil alanil)amino)etil)fosfinil)ciclopentilcarbonilvalil valina

d) Utilizando o processo do Exemplo 27(d), o composto ac_i ma do Exemplo 32(c) (23 mg, 24 mmol) foi hidrogenolisado originari do o composto do título (19,1 mg, 22 mmol; rendimento de 93%), como um sólido branco.

RMN (CD^OD): 07,32-7,16 (5H), 4,75-4,10 (6H), 3,87-3,66 (BH), 3,32-2,72 (3H), 2,20-1,62 (8H), 1,50-1,28 (l2H), 1,13 (3H), 1,05-0,85 (13H).

MS (FAB + VE): 853 (M + H)⁺, 753.

Exemplo 33

Preparação de bromidrato de éster de metilo de trans-2-((1-hidroxi-l-(2-f enil-1-(serilalanilalanil)amino)etil)fosfinil)ciclopentilcarbonil-valil valina

Brometo de trimetilsililo (4,0 ml, 30 mmol) foi adiciona, do a uma solução do composto do Exemplo 32(d) (9,6 mg, 11,3 mmol) em Ch^C^ seco (l ml). Após 4,5 horas, foi adicionada água:ácido acético 1:1 (0,5 ml). A mistura foi concentrada e seca sob vácuo, até um sólido. 0 resíduo foi dissolvido em metanol (l ml) e tratado com HBr a 30% em ácido (50 ml), em seguida foi concentrada e seco sob vácuo originando o composto do título (9 mg) como um pó amarelo claro.

RMN (CD₃0D): 07,30-7,15 (5H, m), 4,55-3,92 (5H, m) , 3,83-3,66 (5H, m), 3,30-2,08 (4H, m), 2,20-1,64 (8H, m) , 1,47-1,25 (4H, m),

1,12 (3H, m), 1,05-0,90 (12H, m).

MS (FAB + VE): m/z 739 (M-HBr + H)⁺, 260, 232, 159.

585

SKB CASE 14415

-88Exemplo 34

Preparação de éster de metilo de (5S ,4R5)-5-(terc-butiloxicarbonil-serilalanilalanil)-amino-4-hidroxi-l-oxο-6-fenil-hexil-valil valina

Ester de metilo de (5S)-5-(t-butiloxicarbonilamino)-1,4-dioxo-6-fenil-hexil-valil valina

a) A uma solução do composto do Exemplo 12(b) (160 mg, 0,495 mmol) em THF (5 ml) a -408C sob árgon foi adicionado N-metilmorfolina (66 mg, 0,66 mmol), seguida por cloroformato de isobutilo (68 mg, 0,495 mmol). A mistura reaccional foi agitada durante 15 minutos, em seguida foi adicionada N-metilmorfolina (66 mg, 0,66 mmol), seguida por uma solução de cloridrato de éster de metilo de ualil valina (120 mg, 0,45 mmol) em THF (6 ml), gota a gota. A mistura foi agitada a -4Q2C durante 30 min, em seguida a 20SC durante 17 horas. A mistura reaccional foi então diluída com acetato de etilo: diclorometano 1:1 (100 ml), e lavada sucessi. vamente com HC1 a 5%, bicarbonato de sódio a 5% e cloreto de sódio aquoso saturado. Os extractos orgânicos foram secos (MgSO^), fechados e evaporados sob pressão reduzida até um óleo. A cromatografia flash sobre gel de sílica (clorofórmio:metanol 25:l) fo_r neceu o composta do titulo (160 mg; rendimento de 70%) como uma espuma branca.

RMN (CDCl^): 67,25 (5H, m), 6,34 (lH, d), 6,15 (lH, d), 5,24 (lH, d), 4,58 (2H, m), 4,31 (lH, dd), 3,78 (3H, s), 3,19 (lH, m), 2,95 (IH, m), 2,87 (2H, m), 2,52 (2H, t), 2,21 (2H, penteto),

1,43 (9H, s), 0,98 (12H, m).

MS (FAB⁺): m/z 534;

MS (FAB^-): m/z 532

X

Ester de metilo de (5S,4R5)-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina

b) A uma solução do composto do Exemplo 34(a) (160 mg, 3,0 mmol) em metanol a 09C foi adicionado boro-hidreto de sódio (5,7 mg, 1,5 x 10 mole) em fracções. Após 20 min, a mistura foi diluída com HC1 a 5% e extraída (3x) com diclorometano. Os extractos orgânicos foram secos com MgSO^, filtrados e evaporados

5Β5

S-KB CASE 14415

-89até flocos brancos. A cromatografia flash sobre gel de sílica (cl orofórmio:metanol 40:l) produziu o composto do título como fl_o cos brancos (112 mg, 70%).

RMN (CDCl-j/MeOD) : 07,15 (5H, m) ; 4,38 (lH, dd) ; 4,10 (lH, m) ;

3,63 (3H, s); 3,0 a 1,5 (BH, m); 1,28 (9H, s); 0,88 (12H, m).

Ester de metilo de (5S,4R5)-5-(terc-butiloxicarbonil-(0-fenilmetil)serilalanil-alanil)amino-4-hidroxi-1-oxo-6-fenil-hexil-vaiil valina

c) 0 péptido do Exemplo 34(b) (98 mg, 0,183 mmol) foi dissolvido em Scido trifluoroacêtico puro (3 ml) e agitado, à temperatura ambiente, durante duas horas. A solução foi então concentrada sob pressão reduzida, dissolvida em metanol, tratada com HC1 concentrado (3 gotas) e evaporada sob pressão reduzida originando 6B mg do cloridrato da amina tripeptídica como flocos brancos.

A uma solução de Boc-Ser(0Bz)-Ala-Ala (87,4 mg, 0,20 mmol) em THF (5 ml) a -4020 sob árgon, foi adicionada N-metil morfolina (25 ml, 0,27 mmol), seguida por cloroformato de isobutilo (27 mg, 0,20 mmol). A mistura foi agitada durante 15 minutos, em seguida foi adicionada l\!-metilmorfolina (25 ml, 0,27 mmol), seguida pelo cloridrato de 5-amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina (86 mg, 0,18 mmol) em THF (l ml), gota a gota. A mistura foi agi tada a -402C durante 30 minutos, em seguida a 2020 durante 17 horas. A mistura reaccional foi diluída com acetato de etilo:diclorometano 1:1 (100 ml), e lavada sucessivamente com HC1 a 5%, bicarbonato de sódio aquoso a 5%, cloreto de sódio aquoso saturado, e evaporada até um sólido branco. 0 sólido foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica (clorofórmio:metanol 20:l) produzindo o hexapéptido do título como cristais brancos (98 mg; rendimento de 63%).

RMN (CDC1₃/CD₃OD): 67,1 (5H, m), 6,95 (5H, m), 3,48 (3H, s),

1,29 (9H, s), 1,05 (6H, m), 4,2-1,5 (m) , 0,70 (l2H, m).

M5 (FAB⁺): m/z 855 ;

M5 (FAB^-): m/z 853

585

SKB CASE 14415

-90X

E-ster de metilo de (5S,4RS)-5-((terc-butoxicarbonil-serilalanilalanil)amino)-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina

d) A uma solução do composto do Exemplo 34(c) (31 mg,

36,2 mmol) em metanol:ácido acético 9:1, foi adicionado Pd a 10%/ /C (35 mg). A mistura foi agitada sob (l,013 x 10^ Pa) durante 6 horas. A mistura reaccional foi filtrada através de uma almofada de Celite® e o Celite® foi lavado sucessivamente com áci. do acético, metanol, e acetato de etilo. A solução combinada foi evaporada sob pressão reduzida, originando o composto do titulo como cristais brancos (21 mg; rendimento de 75%).

RMN (CDC1j/CDjOD): 5 7,14 (5H, m) , 4,33 (lH, m), 4,88 (4H, m),

3,60 (3H, s), 2,95 (lH, dd), 2,70 (lH, m), 2,35 (lH, m), 2,06 (2H, m), 1,72 (lH, m), 1,40 (9H, s), 1,22 (6H, m); 0,85 (12H, m)

MS (FAB⁺): m/z 765;

MS (FAB): m/z 764.

Exemplo 35

Preparação de éster de metilo de (4R5,5S)-5-(terc-butiloxicarbonil-serilalanilalanil)amino-4-hidróxi-1-oxo-6-(4-hidroxifenil)hexil-valil valina

X

Ester de metilo de (5S)-5-(terc-butiloxicarbonilamino)-l,4-dioxo-6-(4-benziloxifenil)hexil-valil valina

a) A uma solução do composto do Exemplo 13(c) (810 mg, 1,9 mmol) em THF (20 ml), a -40SC sob uma atmosfera de árgon, foi adicionada N-metilmorfolina (0,27 ml, 2,5 mmol), seguida por cloroformato de isobutilo (0,246 ml, 1,9 mmol). A mistura reaccional foi agitada durante 15 min, e mais N-metilmorfolina (0,27 ml,

2,5 mmol) foi adicionada seguida pelo sal cloridrato de éster de metilo de valil valina (459 mg, 1,7 mmol). A mistura resultante foi agitada a -40SC durante 30 min, em seguida deixada aquecer até à temperatura ambiente e agitada durante 17 h. A mistura reaccional foi diluída com acetato de etilo:CH2Cl2 1:1 e lavada sucessivamente com HCl a 5%, NaHCO^ aquoso a 5%, e NaCl aquoso sa turado. A solução foi seca (MgSO^), filtrada e evaporada sob pressão reduzida. 0 resíduo sólido foi purificado por cromatogra

585

SK9 CASE 14415

-91fia de coluna utilizando gel de sílica, eluindo com CHCl₃:MeOH 40:1, originando o composto do título (838 mg, 76%).

RMN (CDC1₃): 8 7,4 (5H, m) , 7,02 (4H, dd), 6,42 (lH, br d), 6,18 (lH, br d), 5,19 (lH, br d), 5,0 (2H, s), 4,51 (2H, m), 4,25 (lH, m), 3,70 (3H, s), 3,04 (lH, m) , 2,82 (3H, m) , 2,48 (2H, m), 2,15 (2H, m), 1,39 (9H, s), 0,91 (l2H, m).

X

Ester de metilo de (4R5,5S)-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-benziloxifenil)hexil-valil valina

b) A uma solução do composto do Exemplo 35(a) (144 mg, 0,225 mmole) em metanol a OSC, foi adicionado boro-hidreto de sódio (4,28 mg, 0,113 mmole), em fracções. Após 20 min., a mistura foi diluída com HC1 a 5% e extraída (3x) com diclorometano. Os extractos orgânicos foram secos (MgSO^), filtrados e evaporados até um sólido branco. 0 produto em bruto foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica (clorofórmio:metanol 20:l) produzindo o tripéptido como cristais brancos (118 mg; rendimento de 82%).

RMN (CDC1₃): δ 7,4 (5H, m), 7,02 (4H, dd), 6,40 (2H, m), 5,03 (2H, s), 4,54 (2H, m), 4,30 (lH, m), 3,70 (3H, s), 3,61 (2H, m) , 3,0 a 1,6 (11H, m), 1,38 (9H, s), 0,91 (12H, m).

X

Ester de metilo de (4RS,55)-5-(terc-butiloxicarbonil-(0-fenilmetil)serilalanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-benziloxifenil)hexil-valil valina

c) 0 tripéptido do Exemplo 35(b) (115 mg, 0,179 mmol) é tratado com ácido trifluoroacético e HC1, de acordo com o processo do Exemplo 34(c). 0 sal cloridrato resultante foi acoplado ao

Boc-Ser(Bzl)-Ala-Ala (83 mg, 0,19 mmol) utilizando a N-metilmorfo lina (50 mg, 0,51 mmol), e cloroformato de isobutilo (26 mg, 0,19 mmol). 0 hexapéptido do título foi obtido como cristais brancos (40 mg; rendimento de 25%).

RMN (CDC1₃/CD₃OD): 87,35 (lOH, m) , 6,91 (4H, dd), 4,95 (2H, d), 4,48 (2H, d), 4,37 (lH, d), 4,07 (4H, m), 3,62 (4H, s), 3,60 (lH, obsc m), 2,5 a 1,5 (3H, m), 1,38 (9H, s), 1,2 (6H, m), 0,80 (l2H, m).

585

SK3 CASE 14415

Ester de metilo de (4R5,55)-5-(terc-butoxicarbonil-serilalanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-hidroxi-fenil)hexil-valil valina

d) 0 composto do Exemplo 35(c) (39 mg, 40,6 mmol) foi desprotegido pelo processo de hidrogenólise do Exemplo 34(d). 0 composto do titulo foi obtido como cristais brancos (2,3 mg; reri dimento de 73%).

RMN (CDC1₃/CD₃OD): 5 6,79 (4H, m), 4,35 (1H, q), 4,2 a 3,B (5H, m), 3,67 (3H, s), 3,0 a 2,5 (2H, m), 2,5 a 1,5 (4H, m), 1,41 (9H, s), 1,20 (6H, m), 0,89 (l2H, m).

Exemplo 36

Preparação de éster de metilo de (3R,45)-4-(terc-butiloxicarbonil-serilalanilalanil)-amino-2,2-difluoro-3-hidroxi-l-oxo-5-fenilpentil-valil valina z

Ester de metilo de (3R,4S)-4-(benziloxicarbonil)amino-2,2-difluoro-3-hidroxi-5-fenilpentanoil-valil valina

a) Trietilamina (0,66 ml, 4,83 mmol) foi adicionada a uma solução do composto do Exemplo 14(b) (0,82 g; 2,20 mmol), hexafluorofos fato de benzotriazol-l-iloxi tris(dimetilaminofosfónio) 1,07 g, 2,41 mmol) e cloridrato de éster de metilo de valil valina (0,64 g, 2,41 mmol) em 75 ml de acetonitrilo seco. Após 4 horas de agitação, foi introduzida mais trietilamina pura (0,66 ml,

4,83 mmol) e a mistura reaccional foi agitada durante toda a noite. A solução foi diluída com acetato de etilo e lavada sucessivamente com HCl 2N, NaHC0₃ a 5% e H^O. Após secagem sobre MgSO^ e filtração, a solução foi concentrada in vacuo. A cromatografia flash, com CHC1₃:metanol 40:1 como eluente, forneceu o tripéptido do titula como um sólido flocoso branco (466 mg; rendimento de 36%).

RMN (CDC1₃): 8 7,34 (lOH, m), 6,93 (1H, br, 0=7,1 H_z), 6,75 (lH, br d, 0=8,9 Hz), 5,03 (2H, s), 4,87 (lH, m), 4,60 (lH, m), 4,38 (3H, m), 3,63 (3H, s), 3,07 (2H, m), 2,32 (lH, m), 2,14 (iH, m),

1,93 (1H, m), 0,98 (l2H, m)

MS: m/z 592

5Β5

SKB CASE 14415 (3R,45)-4 -amino-2,2-difluoro-3-hidroxi-l-oxo-93Ester de metilo de

-5-fenilpentil-valil valina, cloridrato

b) Uma solução do tripéptido do Exemplo 36(a) (466 mg, 0,79 mmol) em ácido acético glacial (40 ml) contendo Pd a 10%/C (450 mg), foi saturada com α gás H₂ e agitada durante toda a noite sob uma atmosfera de Após filtração através de uma almofa da de Celite®, a solução foi diluída com metanol e tratada com HC1 concentrado (100 y*l, 1,0. mmol). A concentração da solução in vacuo produziu o cloridrato do tripéptido em bruto como um sólido cristalino branco macio (390 mg, 100%).

Ester de metilo de (3R,4S)-4-(terc-butiloxicarbonil-(Q-benzil)serilalanilalanil)amino-2,2-difluoro-3-hidroxi-l-oxo-5-fenilpentil-valil valina

c) A uma solução de Boc-Ser(Bzl)-Ala-Ala (380 mg, 0,87 mmol) em N-metil morfolina (108 , 0,99 mmol) em THF seco (6 ml), a -4020, foi adicionado cloroformato de isobutilo (112 ml, 0,87 mmol), gota a gota. Após agitação durante 30 min, foi adicionada N-metil morfolina (112 ml, 0,87 mmol), seguida pela adição do com posto do Exemplo 36(b) como um sólido. A mistura reaccional foi agitada durante toda a noite, com aquecimento gradual até à temp.e ratura ambiente. A solução foi diluída com ^e l^av/ad^a suces sivamente com HC1 a 10%, NaHCO^ a 5% e f^O. A fracção orgânica foi seca sobre MgSD^, filtrada e concentrada i n vacuo. A croraato grafia flash, com CHCl₃:metanol 30:1 como eluente, forneceu o hexapéptido do título como um sólido amarelo claro (636 mg, 83%).

RMN (DMSO-dg): 68,31 (lH, brd; 0=7,1 Hz), 8,12 (lH, brd; 0=9,5 Hz), 7,98 (lH, brd; 0=6,5 Hz), 7,78 (2H, m), 7,31 (5H, m), 7,18 (5H, m), 6,99 (lH, brd; 0=7,1 Hz), 6,28 (lH, m), 4,48 (2H, s), 4,22 (4H, m), 3,62 (3H, s), 3,57 (lH, m), 2,98 (lH, _m), 2,71 (lH, m), 2,17 (2H, m), 1,41 (9H, s), 1,15 (3H, d; 0=6,5 Hz), 1,03 (3H, d; 0=7,1 Hz), 0,92 (12H, m).

MS (FAB +): m/Z=B77 (M+H⁺)

Ester de metilo de (3R,4S)-4-(terc-butiloxicarbonil-serilalanilalanil)amino-2,2-diflúoro-3-hidroxi-l-oxo-5-fenilpentil-valil-L-valina

585

SKB CASE 14415 /fi

Caí*

-94d) D hexapêptido protegido do Exemplo 36(c) (13 mg, 15 mmol) foi dissolvido em ácido acético:metanol 5:1 (6 ml). A esta solução, foi adicionado Pd a 10%/C (l5 mg) e a mistura foi satura da com o gás H^. Após agitação durante toda a noite sob uma atmos. fera de , a solução foi filtrada através de uma almofada de Celite® e concentrada in vacuo, fornecendo o produto do título como um sólido cristalino branco (ll,5 mg, 99%).

RMN (CDC1₃/CD₃OD): £>7,24 (5H, m), 4,18 (6H, m) , 3,77 (lH, m),

3,65 (3H, s), 3,52 (lH, m), 3,09 (lH, m), 2,87 (lH, m), 2,03 (3H, m), 1,39 (9H, s), 1,31 (3H, d, 0=5,94 Hz), 1,06 (3H, d,

0=6,6 Hz), 0,90 (12H, m)

MS: m/z 787

Exemplo 37

Preparação de éster de metilo de ( 3R ,45)-4-(serilalanilalanil)amino-2 , 2-difluoro-3-hidroxi-l-oxo-5-fenilpentil-valil valina, sal de ácido trifluoroacético

Duas gotas de TFA foram adicionadas ao hexapêptido protegido em N do Exemplo 36(d) (l,l mg, 1,4 mmol). Após 2 horas, uma corrente lenta de árgon foi passada sobre a mistura para evaporar o TFA em excesso. Foram adicionadas três gotas de éter dietílico e evaporadas, da mesma maneira, trés vezes. 0 resíduo foi seco in vacuo.

Exemplo 38

Preparação de éster de metilo de 4-(terc-butiloxicarbonil-seril3ΐ3ηίΐ3ΐ3ηίΐ)3ίηίηο-2,2-άίί1υοΓο-1,3^ίοχο-5^5ηί1ρ6ηίί1.-ν3ΐί1

V3lin3

Ester de metilo de 4-(terc-butiloxicarbonil-(0-benzil)seril3lanilalsnil)amino-2,2-difluoro-l,3-dioxo-5-fenilpentil-valil valina

a) Numa solução do c\ ,e(-difluoro álcool do Exemplo 37 (102 mg, 0,12 mmol) e de periodinano de Dess-Martin (247 mg, 0,58 mmol) em 2 ml de DMF seco, foi introduzido TFA puro (45 μΐ, 0,58 mmol), gota a gota. Após agitação durante 16 h, a solução foi d_i luída com Et20 e vertida sobre uma mistura de NaHClj aquoso saturado (20 ml) e tio-sulfato de sódio aquoso a 10% (7 ml). A mistu

585

SKB CAS.E 14415

ra foi agitada vigorosamente durante 1 hora e extraída com acetato de etilo. Os extractos combinados foram secos sobre MgSO^, filtrados e concentrados in vacuo. A cromatografia flash utilizando uma eluição de gradiente de 0-30% de metanol em clorofórmio produziu a o( ,o(-difluoro cetona do título como um sólido branco (70 mg, rendimento de 69%).

RMN (CDCl₃/CD₃0D): δ 7,27 (lOH, m), 4,50 (2H, s), 4,34 (6H, m) , 3,71 (3H, s), 3,66 (2H, m), 3,25 (lH, m), 2,99 (lH, m), 2,24 (2H, m), 1,42 (9H, s), 1,34 (3H, m) , 1,08 (3H, m), 0,92 (12H, m) .

MS (FAB +): m/z 875 (M+H⁺).

Ester de metilo de 4-(terc-butiloxicarbonil-serilalanilalanil)amino- 2 , 2-difluoro-1,3-dioxo-5-fenilpentil-valil valina

b) Uma solução do hexapéptido protegido do Exemplo 38(a) (15 mg, 17 mol) em ácido acático glacial (4 ml), contendo Pd a 10%/C (15 mg), foi saturada com o gás H₂ e agitada durante toda a noite sob uma atmosfera do gás H₂. A mistura foi filtrada através de uma almofada de Celite® e concentrada in vacuo. A cromatografia flash, utilizando uma eluição por gradiente de 0-50% de metanol em clorofórmio, forneceu o produto desbenzilado do titulo como um sólido cristalino branco (9 mg, 67%).

RMN (DMS0-d₆): 59,01 (lH, m) , 8,36 (2H, m) , 7,95 (2H, m) , 7,17 (5H, m), 6,68 (lH, m), 4,85 (lH, m), 4,18 (4H, m), 3,91 (lH, m),

3,58 (3H, s), 3,45 (2H, m), 3,08 (2H, m), 2,66 (lH, m), 2,00 (2H, m), 1,45 (9H, s), 1,11 (6H, m), 0,B8 (l2H, m).

MS (FAB +): m/z 785 (M+H⁺).

Exemplo 39

Preparação de Ac-Ser-Glπ-Asn-Tyr-Pro-Vai-Val-NH2

A resina-heptapéptido protegido 3oc-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada da forma usual, de acordo com o Exemplo 1. Após remoção do grupo Boc do terminal N com TFA a 50% em CH₂C1₂ e neutralização do sal de TFA resultante com DIEA a 7/3 em CH₂C1₂, o péptido ligado à resina foi acetilado com anidrido acético (2 ml) em CH₂C1₂ (30 ml) durante 30 minutos.

péptido foi clivado da resina com remoção dos grupos

585

SKB CASE 14415

protectores da cadeia lateral por tratamento com HF liquido anidro (10 ml), em presença de anisol (l ml), a Q9C durante 50 minutos. Após remoção do HF sob vácuo, a resina foi lavada com éter etílico e seca ao ar. A resina foi então extraída com 2 x 30 ml de HOAc a l/ú/HgO, seguido por 2x 30 ml de HOAc a lO/Z/iyO. Os extra£ tos combinados foram liofilizados produzindo 318 mg do péptido em bruto.

Uma alíquota de 130 mg do péptido em bruto foi purificada por filtração em gel numa coluna de 2,6 x 70 cm de SephadexG-15 utilizando HOAc a 1% como eluente. As fracçães apropriadas foram reunidas e 1iofilizadas, produzindo 120 mg do composto do titulo.

TLC: (n-Bu0H/H0A_c/H₂0 4:l:l) R_f=0,34; (n-Bu0H/Et0A_c/H0Ac/H₂0

1:1:1:1) R_f=0,66; HPLC k'=3,0 (Hamilton PRP-1, CH^CN/HgO/TFA a 0,1%, 10% a 40% de CH^CN, 15 minutos, gradiente linear, 1,5 ml/ /min. ) ;

FAB-MS: m/z B47,6 (M+H⁺).

Substituindo no processo acima o Boc-Ser(Bzl) por Boc-Thr(Bzl) produziu Ac-Thr-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH₂.

Exemplo 40

Preparação de Ac-Ser-Ala-Ala-Tyr-Pro-Val-Val-I\JH2

A resina-heptapéptido protegida Boc-5er(Bzl)-Ala-Ala-Tyr(BrZ )-Pro-l/al-Val-BHA foi preparada da forma usual. Após remoção do grupo Boc do terminal N com TFA a 50% em CH₂Cl₂, e neutra lização do sal de TFA resultante com DIEA a 7% em CH₂Cl₂, o pépt_i do ligado à resina foi acetilado com anidrido acético (2 ml) em CH₂Cl2 (30 ml) durante 30 minutos.

péptido foi clivado da resina com remoção dos grupos protectores da cadeia lateral por tratamento com HF líquido anidro (l0 ml) , em presença de anisol (l ml), a 09C durante 50 minutos. Após remoção do HF sob vácuo, a resina foi lavada com éter etílico e seca ao ar. A resina foi então extraída com 2x 30 ml de HOAc a 1%/H_O, seguido por 2x 30 ml de HOAc a 10%/H_o0. Os exZ z.

tractos combinados foram liofilizados produzindo 599 mg do péptido em bruto.

5Θ5

SKB CASE 14415 ·ο

-970 péptido em bruto foi purificado por distribuição em cori tracorrente utilizando o sistema n-BuOH/HOAc/H 0 4:1:5. As fracções apropriadas foram reunidas, evaporadas até à secura e o resí. duo foi liofilizado a partir de HDAc a 1%, produzindo 435 mg do péptido parcialmente purificado. Uma alíquota de 100 mg do pêptjL do parcialmente purificado foi adicionalmente purificada por filtração em gel numa coluna de 2,6 x 70 cm de Sephadex® C-15, utilizando HOAc a 1% com eluente. As fracções apropriadas foram rejj nidas e liofilizadas, produzindo 95 mg do composto do título pur_i ficado.

TLC: (n-Bu0H/H0A_c/H₂0 4:l:l) R_f=0,72; HPLC k’=2,8 (Hamilton

PRP-1, CH₃CN/H₂0/TEA a 0,1%, 5% a 40% de CH₃CN, 15 minutos, gradiente linear, 1,5 ml/min.);

FAB-ΜΞ: m/z 747 (K+H⁺).

Exemplo 41

Preparação de Ac-Ser-Gln-Asn-Tyr-D-Pro-Val-Val-NH₂

Uma mmole da resina-péptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Cln-Asn-Tyr (Bzl)-Ç)-Pro-Vai-Val-BHA foi preparada como acima. 0 pépt_i do foi clivado da resina por tratamento com 10 ml de HF/l ml de anisol, a 09C durante 50 min. Após remoção do HE sob vácuo, a resina fci lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3x 30 ml de HOAc glacial. Os extractos do HOAc foram combinados e liofilizados, produzindo 406 mg do péptido em bruto.

péptido em bruto foi purificado por distribuição em con tracorrente em nBu0H/H0Ac/H₂0 (4:1:5). As fracções apropriadas fo ram determinadas por TLC, reunidas e evaporadas até à secura, sen dc o resíduo liofilizado a partir ds HOAc a 1%, produzindo 260 mg do péptido purificado.

TLC: (n-8u0H-HCAc-H₂0 4:l:l) , R_f=0,15,· ( n-Su 0H-HOA _C-H₂ 0 1:1:1) ,

R_f=0,54; (n-Bu0H-Et0Ac-H0Ac-H₂0 1:1:1:1) , R_f=0,72 FAB-MS: m/z 847 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos (hidrólise em HCl/TEA 2:1 contendo 0,005% p/v de fenol a 1609C durante uma hora); Asp, 1,00; Ser, 0,75; Glu, 0,99; Pro, 0,99; Vai, 0,96; Tyr, 1,10

585

SKB CASE 14415

-98Exemplo 42

Preparação de Dns-Ssr-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ual-Ual-NH2

Meia mmole da resina-péptidilo protegida Dns-Ser(8zl)-G1n-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-V3l-BHA foi preparada como acima. 0 péptido foi clivado da resina por tratamento com 10 ml de HF/l ml de anisol, a 08C durante 50 minutos. Após remoção do HF sob vácuo, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 30 ml de HOAc a 10% seguida por 2x 30 ml de HOAc a 1%. Os extractos do HOAc foram combinados e liofilizados, produzindo 290 mg do péptido em bruto.

péptido em bruto (73 mg) foi purificado por filtração em gel em Sephadex® G-15, utilizando HOAc a 10% como eluente. As fracções apropriadas foram liofilizadas, produzindo 56 mg do pépt_i do purificado.

TLC: (n-Bu0H-H0A_C-H₂0 4:l:l), R_f=0,15

HPLC (Hamilton PRP-1, CH^CN/Hgθ/TFA a 0,1%, gradiente de 5-40% de CH^CN, 15 min), k' 3,32.

FAB-MS: tn/z 1038 (M+H) ⁺

Análise dos aminoácidos (hidrólise em HCl 6N a 1109C durante 24 horas): Asp, 1,00; Ser, 0,17; Clu, 1,00; Pro, 1,00; Uai,

1,38; Tyr, 1,78.

Exemplo 43

Preparação de Ac-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ual-Arg-NH2

Uma mole de resina-péptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Arg(Tos)-BHA foi preparada como acima. 0 péptido foi clivado da resina por tratamento com 10 ml de HF/l ml de anisol, a OSC durante 50 minutos. Após remoção do HF sob vácuo, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3x30 ml de HOAc glacial. 0s extractos do HOAc fcram combinados e liofilizados, produzindo 639 mg do péptido em bruto.

péptido em bruto foi purificado por distribuição em con tracorrente em nSuOH-HOAc-HgO (4:1:5), As fracções apropriadas foram determinadas por TLC, reunidas, evaporadas até à secura e o

585

SKB CASE 14415

-99reslduo foi liofilizado a partir de HOAc a 1%, produzindo 518 mg do péptido parcialmente purificado. Uma aliquota de 100 mg do péptido parcialmente purificado foi adicionalmente purificada por filtração em gel em Sephadex®) G-15 com HOAc a 1% com eluente. As fracções apropriadas foram reunidas e liofílizadas, produzindo 61,5 mg do péptido purificado.

TLC: (n-BuOH-piridina-HOAc-HgO 15:10:3:12), Rf=0,43;

(nBuOH-EtOAc-HOAc-HgO 1:1:1:1), R_f=0,34;

HPLC (Hamilton PRP-1, CH^CN/HgO/TFA a 0,1%, gradiente de 5-40% de CHjCN, 15 min), k' 1,94.

FAB-MS: m/z 904 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos (hidrólise em HC1 6N a 110SC durante 18 horas): Asp, 1,00; Ser, 0,98; Glu, 1,00; Pro, 0,88; Uai,

0,56; Tyr, 0,86; Arg, 0,67.

Exemplo 44

Preparação de Ac-Ser-Gln-Ala-Tyr-Pro-Ual-Ual-NHg

Meia mole de resina-péptidilo protegida Ac-5er(Bzl)-Gln-Ala-Tyr(BrZ)-Pro-Ual-Ual-BHA foi preparada como acima. 0 péptido foi clivado da resina por tratamento com 10 ml de HF/l ml de anisol, 1 hora a 0°C. A resina-péptido foi lavada com éter e o péptido foi extraído com ácido acético glacial. 0 extracto foi liofilizado, originando 220 mg, rendimento de 55%. 100 mg do péptido em bruto foram purificados por filtração em gel em Sephadex® G-15 utilizando HOAc a 1% como eluente, produzindo 85 mg. Gradiente da HPLC: 5% a 40%, TFA a 0,1% (CH^CN), linear, 15 min, k’=2,61

TLC: (B:A:W l:l:l) , R_f=0,67.

FAB-MS: m/z 804 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: (HC1:TFA 2:1, 0,005% p/v de fenol, 16 09 C 1 hora), Ser 0,89, Glu 1,00, Pro 1,04, Ala 1,00, Uai 1,75, Tyr 0,89. Conteúdo em péptido é de 98,94%.

Exemplo 45

Preparação de Ac-Ser-Ser-Asn-Tyr-Pro-Val-Ual-NHg

Meia mole da resina-péptido protegida Ac-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Asn-Tyr(0rZ)-Pro-Ual-Ual-8HA foi preparada como acima. 0 péptido foi clivado da resina por tratamento com 10 ml de HF/l ml de anisol, 1 hora a 09C. A resina-péptidilo foi lavada com éter

585

SKB CASE 14415

u*; ·

-100s?ú' «»' -1 e o péptido foi extraído com ácido acético glacial. 0 extracto foi liofilizado originando 283 mg, rendimento de 70%. 100 mg do péptido em bruto foram purificados por filtração em gel em Sephadex^H) utilizando HOAc a 1% como eluente, produzindo 78 mg.

Gradiente da HPLC: 5% a 40%, TFA a 0,1% (CH CN), linear, 15 min, k’=2,58

TLC: rf=0,70, B:A:W 1:1:1

FAB-MS: m/z 806 (M+H)+

Análise dos aminoácidos: (HC1:TFA 2:1, 0,005 p/v de fenol, 1605C, hora), Asp 1,00, Ser 1,59, Pro 0,90, Vai 1,91, Tyr 0,91.

Conteúdo em péptidos era de 80,6%.

Exemplo 46

Preparação de Ac-Ser-Arg-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH₂

Meia mmole da resina-péptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Arg-Asn-Tyr(Bzl)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada como acima. 0 péptido foi clivado da resina por tratamento com 10 ml de HF/l ml de anisol, 1 hora a OSC. A resina-péptidilo foi lavada com éter e o péptido foi extraído com ácido acético glacial. 0 extracto foi liofilizado originando 348,5 mg, rendimento de 80%. 100 mg do péptido em bruto foram purificados por filtração em gel em Sephadex® G -15, utilizando HOAc a 1% como eluente, produzindo 87 mg.

Gradiente da HPLC: 5% a 40%, TFA a 0,1% (CH-.CN), linear, 15 min, k'=2,64

TLC: (B:A:W l:l:l) , R_f=0,60

FAB-MS: m/z 875 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: HCl/TFA/Fenol, Asp 1,00, Ser 0,80, Pro 0,83 Vai 1,85, Tyr 0,94, Arg 0,97. Conteúdo em péptidos era de 101,3%.

Exemplo 47

Preparação de Ac-Ser-Lys-Asn-Tyr-Pro-Val-NH₂

Meia mmole da resina-péptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Lys-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada como acima. 0 péptido foi clivado da resina por tratamento com 10 ml de HF/l ml de anisol, 1 hora a DSC. A resina páptidilo foi lavada com éter e o péptido foi extraído com ácido acético glacial. 0 extracto foi liofilizado originando 343,79 mg, rendimento da 81%.

100 mg do péptido em bruto foram purificados por filtração em gel em Sephadex® G-15, utilizando HOAc a 1% como eluente, pro duzindo 87 mg.

Gradiente da HPLC: 5% a 40%, TFA a 0,1% (CH,CN), linear, 15 min, k'=2,47

TLC: (B:A:W l:l:l) , R =0,60

FAB-MS: m/z 847 (M+H/ ^r

Análise dos aminoácidos: (HC1:TFA 2:1, 0,005½ p/v da fenol, 160°C.

hora), Asp 1,00, Ser 0,81, Pro 0,95, Vai 1,87, Tyr 1,00, Lys

535

SKB CA.SE 14415

-1010,84. Conteúdo em péptido era de 92,3%.

C'

Exemplo 48

Preparação de Ac-Ser-Glu-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-Nt^

Meia mmole da resina péptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Ual-Ual-BHA foi preparada como acima. 0 péptido foi clivado da resina com 10 ml de HF/l ml de anisol, 1 hora a OSC. A resina-pêptidilo foi lavada com éter e o péptido foi extraído com ácido acético glacial. 0 extracto foi liofiliza^ do originando 286,22 mg, rendimento de 67%.

100 mg do péptido em bruto foram purificados por filtração em gel em Sephadex® G-15 utilizando HOAc a 1% como eluente, produzindo 77 mg.

TLC: (B:A:W l:l:l), R_f=0,38

Gradiente da HPLC: 5% a 40%, TFA a 0,1% (CH^CN), linear, 15 min, k'=2,72

FAB-MS: m/z 848 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: HCl/TFA/Fenol, Asp 1,06, Ser 0,84, Glu 1,00, Pro 0,88, Ala 1,00, Uai 1,85, Tyr 1,00. Conteúdo em péptidos era de 94,3%.

Exemplo 49

Preparação de Ac-Ser-Ala-Asn-Tyr-Pro-Ual-Ual-NH2

Meia mmole da resina-péptidilo protegido Ac-Ser(Bzl)-Ala-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Ual-Val-8HA foi preparada como acima. 0 péptido foi clivado da resina com 10 ml de HF/l ml de anisol, 1 hora a OSC. A resina-péptidilo foi lavada com éter e o péptido foi extraído com ácido acético glacial. 0 extracto foi liofilizado or_i ginando 330 mg, rendimento de 84%.

100 mg do péptido em bruto foram purificados por filtração em gel em Sephadex® G-15 utilizando HOAc a 1% como eluente, produzindo 86 mg.

TLC: (B:A:W l:l:l), R_f=0,70

Gradiente da HPLC: 5% a 40%, TFA a 0,1% (CH^CN), linear, 15 min, k'=2,62

585

SKB CASE 14415 _ít. . ..·.....- - ··..>>

9» C:

-102FAB-MS: m/z 790 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: HCl/TFA/Fenol, Asp 1,00, Ser 0,81, Pro 0,94, Ala 1,00, Vai 1,87, Tyr 0,76. Conteúdo em péptidos era de 72,77%.

Exemplo 50

Preparação de Ac-Ser-Gln-5er-Tyr-Pro-Val-Val-NH2

Meia mmole da resina-péptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Gln-Ξer(8zl)-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada como acima, □ péptido foi clivado da resina com 10 ml de HF/l ml de anisol, 1 hora a 09C. A resina-péptidilo foi lavada com éter e o péptido foi extraído com ácido acético glacial. 0 extracto foi liofiliza_ do originando 285 mg, rendimento de 70%. 100 mg do péptido em bruto foram purificados por filtração em gel em Sephadex® G-15 utilizando HOAc a 1% como eluente, produzindo 87 mg.

TLC: (B:A:W l:l:l), R_f=0,68

Gradiente da HPLC: 5% a 40%, TFA a 0,1% (CH^Cfj), linear, 15 min, k'=2,51

FAB-MS: m/z Θ20 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: HCl/TFA/Fenol, Ser 1,60, Glu 1,00, Pro 0,91, Vai 1,83, Tyr 0,94. Conteúdo em péptidos era de 84%.

Exemplo 51

Preparação de Ac-Ser-Gln-Arg-Tyr-Pro-Val-Val-h^

Meia mmole da resina-péptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Gln-Arg-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada como acima. 0 péptido foi clivado da resina com 10 ml de HF/l ml de anisol, 1 hora a 0°C. A resina-péptidilo foi lavada com éter e o péptido foi extraído com ácido acético glacial. 0 extracto foi liofilizado originando 380,54 mg, rendimento de 86%. 10D mg do péptido em bruto foram purificados por filtração em gel em Sephadex® G-15 utilizando HOAc a 1% como eluente, produzindo 89 mg.

TLC: (B:A:W l:l:l) , R_f=0,66

Gradiente da HPLC: 5/° a 40_zo, TFA a 0,1% (CH^CN), linear, 15 min, k'=2,58

585

SKB CASE 14415 >>

-103FAB-MS: m/z 889 (M+H) ⁺

Análise dos aminoácidos: HCl/TFA/Fenol, Ser 0,80, Glu 1,00, Pro 1,00, Vai 1,38, Arg 1,01, Tyr 0,81. Conteúdo em péptidos era de 85,33%.

Exemplo 52

Preparação de Ac-Ser-Gln-Lys-Tyr-Pro-Val-Val-NHq

Meia mmole da resina-péptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Cln-Lys(Clz)-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada como acima, 0 péptido fli clivado da resina com 10 ml de HF/l ml de anisol, 1 hora a 05C. A resina-péptiàilD foi lavada com éter e o péptido foi extraído com ácido acético glacial. 0 extracto foi liofilizado originando 322 mg, rendimento de 77,32%. 100 mg do péptido em bruto foram purificados por filtração em gel em Sephadex® G-15 utilizando HOAc a 1% como eluente, originando 85 mg.

TLC: (B:A:W l:l:l) , R_f=0,69

Gradiente da HPLC: 5% a 40%, TFA a 0,1% (CH^CN), linear, 15 min, k’=2,48

FAB-MS: m/z 861 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: HCl/TFA/Fenol, Ser 0,79, Glu 1,00, Pro 0,94, Vai 1,85, Tyr 0,96, Lys 0,90, Conteúdo em péptido é de 71,26%

Exemplo 53

Preparação de Ac-Ser-Cln-Asp-Tyr-Pro-Val-Val-IMH2

Meia mmole da resina-péptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Cln-Asp(DBzl)-Tyr(8rZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada como acima. 0 péptido foi clivado da resina com 10 ml de HF/l ml de anisol, 1 hora a 0°C. A res ina-páptidilo foi lavada com éter e o péptido fci extraído com ácido acético glacial. 0 extracto foi liofiliza, do originando 340 mg, rendimento de 80%. 100 mg do péptido em bruto foram purificados por filtração em gel, em Sephadex® G-15 utilizando HOAc a 1% como eluente, produzindo 84 mg.

TLC: (B:A:W l:l:l), R_f=0,73

Gradiente da HPLC: 5% a 40%, TFA a 0,1% (CH^CN), linear, 15 min, k'=2,63

FAB-MS: m/z 848 (iM+H) ⁺

585

S.KB CASE 14415

-104Análise dos aminoácidos: HCl/TFA/Fenol, Asp 1,02, Ser 0,79,

Glu 1,00, Pro 0,97, Vai 1,86, Tyr 0,82. Conteúdo em péptidos é de 79,13%.

Exemplo 54

Preparação de Ac-Asp-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val NH2

Meia mmole da resina-péptidilo protegida Ac-Asp(OBzl)-Gln-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada como acima. 0 péptido foi clivado e desprotegido utilizando 10 ml de HF anidro com 10% de anisol a OSC durante 1 hora. 0 HF foi removido, in vacuo a OSC e a resina foi lavada com éter dietilico. 0 péptido foi extraído com ácido acético glacial e liofilizado originando 288 mg (65,9%). 0 péptido foi purificado por distribuição em contracorrente em 1-butanol-ácido acético-água (4:1:5 v/v/v). 0s tubos foram analisados por cromatografia em camada fina (TLC) e as fracções apropriadas foram reunidas, evapotadas e liofilizadas a partir de HOAc 0,2 Ν, produzindo 234 mg (81,2%).

TLC: (B:E:A:W 1:1:1:1) R_f=0,77; (B:P:A:W 15:10:3:12) R_f=0,5ó.

FAB MS: m/z 875 (M+H) ⁺

HPLC: 4,5 mm X 25 cm Altex Ultrasphere 5 m ODS, detecção com UV a 220 nra, água-acetonitrilo-TFA a 0,1%, gradiente de 5 a 40% de acetonitrilo durante 15 min., k' - 3,71

HPLC isocrática: 85:15 água-acetonitrilo- TFA a 0,1%, k'=4,77 Análise dos aminoácidos: (hidrólise a 160SC durante 1 h em HCl/ /TFA 2:1 contendo 0,005% p/v de fenol) Asp 2,05, Glu 1,00, Pro 1,03, Vai 1,94, Tyr 0,84

Exemplo 55

Preparação de Ac-His-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-V3I-NH2

Meia mmole da resina-péptidilo protegida Ac-His(Tos)-Gln-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-3HA foi preparada como acima. 0 péptido foi clivado e desprotegido utilizando 10 ml de HF anidro com IO/ο de anisol, a OSC durante 1 h. 0 HF foi removido, in vacuo a 09C, e a resina foi lavada com éter dietilico. 0 péptido foi extraído com ácido acético glacial e liofilizado originando 311 mg (69,4%). 0 péptido foi parcialmente purificado por distribuição

585

SKB CASE 14415

-105em ccntracorrente em 1-butanol-ácido acético-água (4:1:5 v/v/v). Os tubos foram analisados por cromatografia de camada fina (TLC) e as fracções apropriadas foram reunidas, evaporadas e liofilizadas a partir de HOAc 0,2 N, produzindo 200 mg (65,3%). A purificação final foi obtida submetendo 87 mg a filtração em gel em SephadexG-15 utilizando HOAc 0,2 N como eluente, produzindo 48 mg (55,2%).

TLC (B:P:A:W 15:10:3:12) R_f=0,51; (B:A:W l:l:l) R_f=0,71.

HPLC: 4,5 mm X 25 cm Altex Ultrasphere 5 m ODS, detecção com UV a 220 nm, água-acetonitrilo- TFA a 0,1%, gradiente de 5 a 40% de acetonitrilo durante 15 min., k'=4,94

HPLC isocrática: 85:15 água-acetonitrilo- TFA a 0,1%, k'=3,76 FAB MS: m/z 897 (M+H) ⁺

Análise dos aminoácidos: (hidrólise a 1609C durante 1 h em HCl/ /TFA 2:1 contendo 0,005% p/v de fenol) Asp 1,03, Glu 1,00, Pro 1,13, Vai 2,00, Tyr 1,97, His 1,28.

Exemplo 56

Preparação de Ser-Cln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH2

Meia mmole da resina-pêptidilo protegida Boc-Ser(Bzl)-G1n-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada como acima, 0 pêptido foi clivado e desprotegido utilizando 10 ml de HF anidro com 10%, de anisol, a OSC durante 1 h. 0 HF foi removido, in vacuo a DSC, e a resina foi lavada com éter dietilico. 0 pêptido foi extraído com ácido acético glacial s liofilizado originando 225 mg (55,9%). 0 pêptido foi purificado por distribuição em cori tracorrente em 1-butanol-ácido acético-água (4:1:5 v/v/v). 0s tu. bos foram analisados por cromatografia de camada fina (TLC) e as fracções apropriadas foram reunidas, evaporadas e liofilizadas a partir de HOAc 0,2 N, produzindo 138 mg (83,5)().

TLC: (B:E:A:U l:l:l:l) R_f=0,68; (3:P:A:W 15:10:3:12) R =0,54.

HPLC: 4,5 mm X 25 cm Altex Ultrasphere 5 m ODS, detecção com UV a 220 nm, água-acetonitrilo- TFA a 0,1%, gradiente de 5 a 40% de acetonitrilo durante 15 min., k'=4,89

HPLC isocrática: 85:15 água-acetonitrilo- TFA a 0,1%, k’=2,78

585

SKB CASE 14415

-106FAB MS: m/z 8 05,6 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: (hidrólise a 16 09 C durante 1 h em HCl/ /TFA 2:1 contendo 0,005% p/v de fenol) Asp 1,03, Ser 0,78, Glu 1,00, Pro 0,88, Vai 1,93, Tyr 0,66.

Substituindo por ácido 3-benziloxi-propanôico a Boc-Ser( Bzl) na sequência acima produz a 3-hidroxipropionilglutaminilasparaginiltirosilpropilvalil valinamida, a qual á um péptido des-amino.

Substituindo por Boc-D-Ser(Bzl) a Boc-Ser(Bzl) na sequência de reacçães acima,produz D-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-nh .

Exemplo 57

Preparação de Ac-Ser-Glπ-Gly-Tyr-Pro-Val-Val-Nl·^

Meia mmole da resina-péptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-G1n-Gly-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada como acima. 0 péptido foi clivado e desprotegido utilizando 10 ml de HF anidro com 10% de anisol, a 02C durante 1 hora. 0 HF foi removido, in vacuo a 02C e a resina foi lavada com éter dietilico. 0 péptido foi ex traído com ácido acético glacial e liofilizado originando 200 mg (50,6%). 0 péptido foi purificado por distribuição em contracorrente em 1-butanol-ácido acético-égua (4:1:5 v/v/v). 0s tubos fo ram analisados por cromatografia em camada fina (TLC) e as fracç3es apropriadas foram reunidas, evaporadas e liofilizadas a partir de HOAc 0,2 N, produzindo 145 mg (72,5%).

TLC: (B:E:A:W l:l:l:l) R_f=0,63; (B:A:W 4:l:l) R =0,40.

HPLC: 4,5 mm X 25 cm Altex Ultrasphere 5 m ODS, detecção com UV a 220 nm, água-acetonitrilo- TFA a 0,1%, gradiente de 5 a 40% de acetonitrilo durante 15 min, k'=4,56

HPLC isocrática: 85:15 água-acetonitrilo- TFA a 0,1%, k'=3,46 FAB MS: m/z 790 (M+H) ⁺

Análise dos aminoácidos: (hidrólise a 1609C durante 1 h em HCl/ /TFA 2:1 contendo 0,005% p/v de fenol) Ser 0,71, Glu 0,97, Gly 1,00, Pre 1,02, Vai 1,70, Tyr 0,76.

585

S.KB CASE 14415

C'

-107Exemplo 58

Preparação ds Ala-Ser-Gln-Asπ-Tyr-Pro-Val-Val-NH2

Meia mmole da resina-péptidilo protegida Boc-Ala-Ser(Bzl)-G1 n-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Vai-Val-BHA foi preparada como acima. 0 oêptido foi clivado e desprotegido utilizando 10 ml de HF anidro com 10% de anisol, a 02C durante 1 h. 0 HF foi removido, in vacuo a 03C, e a resina foi lavada com éter dietílico. 0 péptido foi extraído com ácido acético glacial e liofilizado originando 245 mg (56,0%). 0 péptido foi purificado por distribuição em contracorrente em 1-butanol-ácido acético-água (4:1:5 v/v/v). Os tubos foram analisados por cromatografia em camada fina (TLC) e as fraç; çães apropriadas foram reunidas, evaporadas e liofilizadas a partir de HOAc 0,2 N, produzindo 1B5 mg (75,5%).

TLC: (B:E:A:W 1:1:1:1) R_f=0,64; (B:P:A:W 15:10:3:12) R_f=0,60

HPLC: 4,5 mm X 25 cm Altex Ultrasphere 5 m ODS, detecção com UV a 220 nm, água-acetonitrilo- TFA a 0,1%, gradiente de 5 a 40% de acetonitrilo durante 15 min, k'=3,B6

HPLC isocrática: 85:15 água-acetonitrilo- TFA a 0,1%, k'=2,71 FAB MS: m/z 876 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: (hidrólise a 160SC durante 1 h em HCl/ /TFA 2:1 contendo 0,005% p/v de fenol) Asp 1,00, Ser 0,69, Glu 0,98, Pro 0,95, Ala 0,99, Vai 1,91, Tyr 0,94.

Exemplo 59

Preparação de Ac-Ser-Gln-Asn-(4’NQ2)Phe-Pro-Vai-Val-NH2

Meia mmole da resina-péptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Gln-Asn-(4'NQ₂)Phe-Pro-Val-Val-BHA foi preparada como acima. 0 pépti do foi clivado da resina com 15 ml de HF/l ml de anisol, 1 hora a □ SC. A resina-péptidilo foi lavada com éter e o péptido foi extraído com ácido acético glacial. 0 extracto foi liofilizado ori ginando 701,8 mg, rendimento de 80%. 10C mg do péptido em bruta foram purificados por filtração em gel em Sephadex® G-15, utilizando HOAc a 1% como eluente, produzindo 68 mg. Uma alíguota de 35 mg foi adicionalmente purificada por HPLC preparativa (PRP-1 semi prep, 18% de TFA a 0,1% (CH^CN), 6 ml/min) produzindo 22 mg.

585

SKB CASE 14415

-108TLC: (8:A:W l:l:l), R_f=0,54

Gradiente da HPLC: 5% a 40%, TFA a 0,1% (CH^CN), linear, 15 min, k’=3,18

FAB-M5: m/z 876 (M+H) ⁺

Análise dos aminoácidos: (hidrólise a 160SC durante 1 h em HCl/ TFA 2:1 contendo 0,005% p/v de fenol) Asp 1,01, Ser 0,Bl, Glu 1,00, Pro 0,90, Vai 2,00, nitroPhe 0,91. Conteúdo em péptidos é de 103,67%.

Exemplo 60

Preparação de Dns-Arq-Ala-5er-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-0H

Meia mmole da resina-péptidilo protegida Boc-Arg(Tos)-Ala-5er(Bzl)-Gln-Asπ-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val- resina de Merrifield foi preparada como acima. Após remoção do grupo Boc com TFA a 50%/ /CH2CI2 e neutralização com DIEA a 7%/CH2Cl2» o péptido foi dansi. lado por adição de 3 equiv. de cloreto de dansilo em DMF e reacção durante uma hora. 0 péptido dansilo foi clivado da resina por tratamento com 10 ml de HF/l ml de anisol, a OeC durante 50 min. Após remoção do HF sob vácuo, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc glacial. Os extractos do HGAc foram combinados e 1iofilizados, produzindo 321 mg do péptido em bruto.

Uma aliquota de 100 mq do péptido em bruto foi purificada

reunidas e liofilizadas, produzindo 74,6 mg do péptido do título.

TLC: (8:A:W l:l:l) R_f=0,84

HPLC: (Hamilton PRP-1, CH^CI\i/H2 θ/TFA a 0,1%, gradiente de 5-40% de CH-jCN, 15 min), k'=3,61.

FAB-M3: m/z 1266 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: (hidrólise em HCl/TFA 2:1 contendo 0,005% p/υ de fenol a 160S durante uma hora): Asp, 1,00; Ser, 0,31;

Glu, 0,91; Pro, 0,99; Ala, 0,96; Vai, 1,96; Tyr, 1,19; Arg,

0,85.

585

SKB CASE 14415 .-JTXÍÀ-109Exemplo 61

Preparação de A c-S er-Gl n-As n-Tyr-Pro-l/al-Val-Gl n-A s n-NH2

Uma mmole da resina-péptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Gln-Asπ-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-Gln-Asn-BHA foi preparada como acima.

péptido foi clivado da resina por tratamento com 10 ml de HF/l ml de anisol, a 0°C durante 50 min. Após remoção do HF sob vácuo, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc glacial. Os extractos do HOAc foram combinados e liofilizados originando 862,3 mg do péptido em bruto.

péptido em bruto foi purificado por distribuição em con tracorrente em nBuOH-HOAc-Hg0 (4:1:5). As fracções apropriadas foram determinadas por TLC, reunidas, evaporadas até à secura e o resíduo foi liofilizado a partir de HOAc a 1%, produzindo 712,9 mg do péptido do título.

TLC: (B:A:W l:l:l) R_f=0,61

HPLC: (Hamilton PRP-1, CH^CN/HgO/TFA a 0,1%, gradiente de 5-40% de CH^CN, 15 min), k'=2,17.

FAB-MS: m/z 1089 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: (hidrólise em HCl/TFA 2:1 contendo 0,005% p/v de fenol a 160QC durante uma hora): Asp, 1,81; Ser, 0,97; Glu, 2,00; Pro, 0,88; Vai, 1,23; Tyr, 1,81.

Exemplo 62

Preparação de Ac-Ala-Thr-Leu-Asn-Phe-Pro-Ile-Ser-Pro-Ile-Glu-NH2

Uma mmole da resina-péptidilo protegida Ac-Ala-Thr(Bzl)-Leu-Asn-Phe-Pro-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Ile-Glu(08zl)-SHA foi preparada como acima. 0 péptido foi clivado da resina por tratamento com 10 ml de HF/l ml de anisol, a 030 durante 50 min. Após remoção do HF sob vácuo, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 1% e 3 x 30 ml de H0A_c a 50%. Os extractos de HOAc foram combinados, diluídos com água e liofiliza dos, originando 862,3 mg do péptido em bruto.

péptido em bruto foi purificado por distribuição em con tracorrente em nBuOH-H0Ac-Hg0 (4:1:5). As fracções apropriadas

585

SKB CASE 14415

-110foram determinadas por TLC, reunidas, evaporadas até ã secura e o resíduo foi liofilizado a partir de HOAc a 1%. 0 péptido foi adi.

cionalmente purificado por filtração em gel numa coluna de 2,6x70 cm de Sephadex G-15, utilizando HOAc a 1% como eluente. As fracções apropriadas foram recolhidas e liofílizadas. Uma alíquo ta de 100 mg do péptido foi adicionalmente purificada por HPLC pre parativa numa coluna Hamilton PRP-1 utilizando CH^CN/HgO/TFA a 0,1%, gradiente de 20-40% de CH^CN, 15 min. As fracções apropria das foram reunidas, evaporadas até à secura e liofílizadas a partir de HOAc glacial, produzindo 22,6 mg do péptido do título.

HPLC: (Hamilton PRP-1, CH^CN/Hgθ/TFA a 0,1%, gradiente de 5-40% de CH^CIM, 15 min), k’=2,94.

FAB-MS: m/z 1241 (M+H) ⁺ . EXEMPLO 63

Preparação de Ac-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-NH2

Uma mmole da resina-péptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-BHA foi preparada como acima. 0 péptido foi clivado da resina por tratamento com 10 ml de HF/l ml de anisai, a 09C durante 50 min. Após remoção do HF sob vácuo, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 1% e 3 x 30 ml de HOAc a 10%. 0s extractos de HOAc foram combinados e liofilizados originando 144,7 mg do péptido em bruto.

péptido em bruto foi purificado por distribuição em cori tracorrente em nBuOH-HOAc-Hg0 (4:1:5). As fracções apropriadas foram determinadas por TLC, reunidas, evaporadas até â secura, e o resíduo foi liofilizado a partir de HOAc a 1%, produzindo 150 mg do péptido. 0 péptido foi adicionalmente purificado por filtração em gel numa coluna de 2,6 x 70 cm de Sephadex® G-15 utilizando HOAc a 1% como eluente. As fracções apropriadas foram reunidas e liofilizadas, produzindo 101,3 mg do péptido do título. TLC: (B:A:W 4:l:l) R_f=0,65

HPLC: (Hamilton PRP-1, CH^CN/H θ/TFA a 0,1%, gradiente de 5-40% de CH^CM, 15 min), k’=2,08.

FAB-MS: m/z 748 (M+H)⁺

585

SKB CASE 14415

-111Análise dos aminoácidos: (hidrólise em HCl/TFA 2:1 contendo 0,005% p/v de fenol a 1609C durante uma hora): Asp, 1,00; Ser, 0,55; Glu, 0,98; Pro, 1,19; Vai, 0,95; Tyr, 0,99.

Exemplo 64

Preparação de Ac-5er-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-Arg-NH2

Meia mmole da resina-péptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-Arg(Tos)-BHA foi preparada como acima.

péptido foi clivado da resina por tratamento com 10 ml de HF/l ml de anisol, a 090 durante 50 min. Após remoção do HF sob vácuo, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc glacial. 0s extractos do HOAc foram combinados e liofilizados originando 329 mg do péptido em bruto.

péptido em bruto foi purificado por distribuição em con tracorrente em nBuOH-HOAc-H₂0 (4:1:5). As fracçSes apropriadas foram determinadas por TLC, reunidas, evaporadas até à secura e o resíduo foi liofilizado a partir da HOAc a 1%, produzindo 79 mg do péptido dD título.

TLC: (B:E:A:W 1:1:1:1) R_f=0,46

HPLC: (Altex Ultrasphere C18, CH^CN/H θ/TFA a 0,1%, gradiente de

5-40% de CH^CN, 15 min), k'=3,71.

FAB-MS: m/z 100 3 (M+H) ⁺

Análise dos aminoácidos: (hidrólise em HCl/TFA 2:1 contendo 0,005% p/v de fenol a 1609C durante 1 hora): Asp, 1,00; Ser, 0,73; Glu, 0,93; Pro, 0,98; Vai, 1,84; Tyr, 1,08; Arg, 0,99.

Exemplo 65

Preparação de Ac-Ala-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH2

Meia mmole da resina-péptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Gln-As n-Ty r( BrZ )-Pro-Val-Val-A rg(Tos )-3HA foi preparada como aci. ma. 0 péptido foi clivado da resina por tratamento com 10 ml de HF/l ml de anisol, a Oec durante 50 min. Após remoção do HF sob vácuo, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc glacial. 0s extractos do HOAc foram combinados e liofilizados originando 275 mg do péptido em bruto.

5Θ5

SKB CASE 14415

-1120 péptido em bruto foi purificado por distribuição em cojn tracorrente em n6u0H-H0Ac-H_o0 (4:1:5). As fracçoes apropriadas foram determinadas por TLC, reunidas, evaporadas até à secura, e o resíduo liofilizado a partir de HOAc a 1%, produzindo 235 mg do péptido do título.

TLC: (B:E:A:W l:l:l:l) R_f=0,69

HPLC: (Altex Ultrasphere C1B, CH₃C!\l/H2θ/TFA a 0,1%, gradiente de

5-40% de CH₃CN, 15 min), k'=4,48.

FAB-MS: m/z 831 (M+H) ⁺

Análise dos aminoácidos: (hidrólise em HCl/TFA 2:1 contendo 0,005% p/v de fenol a 1609C durante 1 hora): Asp, 1,00; Ala, 0,99; Glu, 0,98; Pro, 0,95; Vai, 1,97; Tyr, 1,85.

Exemplo 66

Preparação de Ala-Ala-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH2

Meia mmole da resina-péptidilo protegida Boc-Ala-Ala-Gln-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Vai-Val-BHA foi preparada como acima. 0 péptido foi clivado da resina por tratamento com 10 ml de HF/l ml de anisol, a 090 durante 50 min. Após remoção do HF sob vácuo, a ra sina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc glacial. 0s extractos de HOAc foram combinados e liofilizados originando 265 mg do péptido em bruto.

Uma aiíquota de 75 mg do péptido em bruto foi purificada por filtração em gel numa coluna de 2,6 x 70 cm de Sephadex© G-15 utilizando HOAc a 1% como eluente. As fracçoes apropriadas foram reunidas e 1iofilizadas, produzindo 50 mg do péptido do título. TLC: (B:A:W l:l:l) R_f=0,54

HPLC: (Altex Ultrasphere 019, CH^CPj/H^ θ/TFA a 0,1%, gradiente de

5-40% de CH-CN, 15 min), k'=4,67.

FAB-MS: m/z 947 (M+H) ⁺

Análise dos aminoácidos: (hidrólise em HCl/TFA 2:1 contendo 0,005% p/v de fenol a 160SC durante 1 hora): Asp, 1,00; Ser, 0,61; Ala, 1,52; Glu, 0,99%; Pro, 0,B6%; Vai, 1,90; Tyr,

0,98.

585

SKB CASE 14415

-113Exemolo 67

Preparação de Ac-Cys-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-Nl·^

Meia mmole da resina-péptidilo protegida Ac-Cys(MSz)-Gln-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada como acima. □ péptido foi clivado da resina por tratamento com 10 ml de HF/l ml de anisol, a 090 durante 50 min. Após remoção do HF sob vácuo, a re sina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc glacial. Os extractos do HOAc foram combinados e liofilizados originando 292 mg do péptido em bruto.

péptido em bruto foi purificado por distribuição em cori tracorrente em nBuDH-H0Ac-H₂0 (4:1:5). As fracçães apropriadas foram determinadas por TLC, reunidas, evaporadas até à secura e o residuo foi liofilizado a partir de HOAc a 1%, produzindo 1B8 mg do péptido do titulo.

TLC: (B:E:A:W 1:1:1:1) R_f=0,67

HPLC: (Altex Ultrasphere C1B, CH₃CN/H₂θ/TFA a 0,1%, gradiente de

5-40% de CH CN, 15 min), k' = 3,7.

FAB-MS: m/z 863 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos (oxidação com ácido perfórmico a 09C durante 4 horas seguida por hidrólise em HCl/TFA 2:1 contendo 0,005/ p/v de fenol a 16 0a C durante 1 hora): Cys-SO^H, 0,98; Asp, 1,03; Glu, 1,00; Pro, 1,13; Vai, 1,94; Tyr, 1,78.

Exemplo 6B

Preparação de Ac-Ser-Gln-Asn-Tyr-Δ 3-Pro-Val-Val-NH2

Meia mmole da resina-péptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Tyr(BrZ)-Δ 3-Prc-Val-Val-BHA foi preparada como acima. 0 péptido foi clivado da resina por tratamento com 10 ml de HF/l ml de anisol, a 0°C durante 50 min. Após remoção do HF sob vácuo, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 4 x 20 ml de HOAc glacial. 0s extractos do HOAc foram combinados e liofili. zados originando 250 mg do péptido em bruto.

Uma aliquota de 100 mg do péptido em bruto foi purificada por filtração em gel numa coluna de 2,6 x 70 cm de Sephadex® G-15

585

SKB CASE 14415

utilizando HOA c 0,2 N como eluente. As fracções apropriadas foram reunidas e liofilizadas, produzindo 41 mg do péptido do títu lo.

HPLC: (Altex Ultrasphere C18, CHCN/H O/TFA a 0,1%, gradiente de

10-40% de CH^CN, 30 min), k’=3,00.

FAB-MS: m/z 803 (f-1+H) ⁺

Análise dos aminoácidos: (hidrólise em HCl/TFA 2:1 contendo 0,005% p/v de fenol a 1609C durante 1 hora): Asp, 1,00; Ser, 0,66; Glu, 0,95; Vai, 1,88; Tyr, 0,95.

Exemplo 69

Preparação de Ac-Ser-Gly-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH2

A resina-péptidilo protegida Boc-Ser(Bzl)-Cly-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada da forma usual numa escala de 0,5 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF líquido anidro a 090 durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. Os extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados origina_n do 167 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto foi dissolvido em HOAc a 1% e purificado numa coluna de 2,6 x 70 cm de Sephadex© e liofilizadas, produzindo 138 mg do produto purificada.

HPLC: k' = 4,17 (ueckman Ultrasphere® ODS , CH. CN a 5%/TFA 3 0,1% a CH^CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min)

Γ··.3 ( F A B) : m/z 776 ( M+ H)⁺

Análise dos aminoácidos: Asp 1,00, Gly 1,03, Pro 0,90, Vai 1,38, Tyr 0,30, Ser 0,68.

Exemplo 70

Preparação de 2-asp3raqinilamino-5-feniI-prapil-prclilv3lil· valinamida

A resina-péptidilo protegida Boc-Asn-(2-amino-3-fenilpropil)-Val-Val-BHA foi preparada da forma usual, numa escala de 0,5 mmol, utilizando 0 composta do Exemplo 2(d) e 0 processo do Exemplo 15. 0 péptido foi desprotegido e removida da resina por tratamento com HF anidro (10 ml), em presença de anisol (l ml), a 09

585

SKB CASE 14415

-115durante uma hora. Após remoção do HE sob vácuo, a resina foi lei vada com éter etílico, seca ao ar e em seguida extraída com 2 x 30 ml de HOAc glacial. Os extractos do HOAc foram combinados e liofilizados, originando 139,6 mg do péptido em bruto. 0 pépt_i do foi purificado por filtração em gel em Sephadex G-15 utilizando HOAc a 1% como eluente. As fracções apropriadas foram combinadas, produzindo 81,1 mg do péptido purificado, pico único por HPLC.

HPLC: (Hamilton PRP-1, 5-40% de CH^CN/TFA a 0,1%, 15 min.) k’=2,47

FAB-MS: m/z 560,5 (M+H)⁺.

Exemplo 71

Preparação de éster de metilo de (45,5S) 5-amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-hidroxifenil)hexil-valil valina, cloridrato z

Ester de metilo de (45,5S) 5-(terc-butiloxicarbonil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-benziloxifenil-hexil-valil valina

a) A uma solução do composto do Exemplo 35(a) (l,08 g,

1.70 mmol) em MeOH, a 090, foi adicionado boro-hidreto de sódio (32 mg, 0,85 mmol) em fracções. Após 30, a reacção estava concluída tal como indicado pela TLC, foi diluída com HCl aquoso a 5% e extraída, três vezes, com CH^Cl^. 0s extractos orgânicos combinados foram secos (MgSO^), filtrados e evaporados sob pressão reduzida originando uma mistura de isómeros, como um sólido branco (l,05 g, 97%). Os isómeros foram eluídos através de uma coluna de sílica de HPLC de 2,54 x 25 cm com CH₂Cl2:MeOH 40:1 a um fluxo de 20 ml/min. 0 isómero desejado (4S), que eluiu em pr_i meiro lugar aos 14,5 min, foi recolhido e evaporado, originando o composto do título como um sólida branco (295 mg, 34%).

RMN (CDC1₃): δγ,43 (5H, m), 7,02 (4H, dd), 6,40 (lH, d), 6,32 (IH, d), 5,04 (2H, s), 4,50 (2H, m), 4,26 (2H, m), 3,70 (3H, s),

2.71 (2H, m), 2,43 (2H, m), 2,11 (2H, m), 1,39 (9H, s), 0,91 (12H, m).

MS (FAB): m/z 642,4 (M+H)⁺.

585

SKB CASE 14415 //

-116Ester de metilo de (4S,55) 5-amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-benziloxifenil)hexil-valil valina, cloridrato

b) 0 composto do Exemplo 7l(a) (295 mg, 0,46 mmol) foi dissolvido em ácido trifluoroacético puro (l ml) e agitado durante 3 min. A solução foi evaporada sob pressão reduzida, dissolvi, da em MeOH, tratada com HC1 concentrado (3 gotas) e evaporada sob pressão reduzida, originando o composto do título como um sólido branco.

Exemplo 72

Preparação de éster de metilo de (4S,55) 5-(alanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-hidroxifenil)hexil-valil valina, sal do ácido acético

X

Ester de metilo de (45,5S)-5-(carbobenziloxialanilalanil)amino-6-(4-benziloxi)fenil-4-hidroxi-(l-oxo)hexil-valil valina

a) Uma solução de carbobenziloxialanilalanina (56 mg, 0,19 mmol) em THF foi arrefecida até -405C sob uma atmosfera de árgon. A esta solução foi adicionada N-metilmorfolina (28 ml, 0,251 mmol), seguida por cloroformato de isobutilo (25 mg, 0,19 mmol). A mistura reaccional foi agitada durante 15 min e mais N-metil morfolina (28 ml, 0,251 mmol) foi adicionada, seguida pelo composto do Exemplo 7l(b) (100 mg, 0,173 mmol). A mistura resultante foi agitada durante 30 min a -409C, aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante 16 h. A mistura foi diluída com acetato de etilo^H Cl^ 1:1, e lavada sucessivamente com HC1 aquo so a 5%, NaHCO^ aquoso a 5% e NaCl saturado. A solução foi seca (MgSO ), filtrada e evaporada sob pressão reduzida. 0 resíduo sjó lido foi eluído através de uma coluna de gel de sílica de HPLC de 1 x 25 cm com CHC1₃:MeOH:H^0 95:5:0,5 originando o composto do título como um sólido branco (96 mg, 77%)

RMN (CO₃OD/CDC1₃): δ 7,15 (lOH, m), 6,80 (4H, dd), 4,90 (2H, s),

4,81 (2H, s), 3,90 <2H, q), 3,75 (lH, m), 3,51 (3H, s), 3,36 (lH, m), 2,59 (2H, m), 2,11 (2H, m), 1,88 (3H, m), 1,48 (2H, m), 1,10 (8H, m), 0,76 (12H, d).

MS (FAB): m/z 313,3 (M+H)⁺.

585

SKB CASE 14415

-117Ester de metilo de (45,5S) 5-(alanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-hidroxifenil)hexil-valil valina, sal do ácido acético

b) A uma solução do composto do Exemplo 72(a) (90 mg, 0,11 mmol) em ácido acético foi adicionado paládio a 10% em carbo no activado (90 mg). 0 gás hidrogénio foi borbulhado por meio de um balão de vidro através da solução, durante 60 min, sendo, em seguida, a mistura sob agitação mantida sob uma atmosfera de hidrogénio, durante 14 h. A suspensão foi filtrada através de uma almofada de Celite R e evaporada sob pressão reduzida originando o composto do titulo como um sólido branco (74 mg, 98%)

RMN (CD₃OD/CDC1₃): 8 7,06 (lH, d), 6,78 (4H, dd), 4,29 (lH, d),

4,16 (1H, tn), 4,03 (lH, d), 3,60 (3H, s), 2,62 (2H, m) , 1,85 (7H, br m) , 1,57 (2H, m), 1,16 (6H, m), 0,80 (12H, d).

MS(FAB): m/z 594,4 (M+H)⁺.

Exemplo 73

Preparação de éster de metilo de (45,5S)-5-alanilamino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-hidroxifenil)-hexil-valil valina, sal de ácido acético

Ester de metilo de (45,55) 5-(carbobenziloxialanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-benziloxifenil)hexil-valil valina

a) Utilizando o processo do Exemplo 72(b), substituindo por carbobenziloxialanina (34 mg, 0,15 mmol) a carbobenziloxialanil alanina, e utilizando N-metilmorfolina (44 ml, 0,40 mmol; ad_i cionada em duas porções iguais), cloroformato de isobutilo (20 ml, 0,15 mmol) e o composto do Exemplo 7l(b) (79 mg, 0,137 mmol), foi preparado o composto do título. 0 produto em bruto foi purificado por cromatografia de coluna utilizando gel de silica, elui_n do com MeOH:CHCl- 5:95, para originar o composto do título como um sólido branco (60 mg, 82%).

RMN (CD₃OD/CDC1₃): δ 7,13 (lDH, m), 6,81 (4H, dd), 4,92 (2H, s), 4,70 (2H, s), 4,21 (lH, m), 3,96 (2H, d), 3,76 (lH, m), 3,55 (3H, s), 3,34 (lH, m), 2,61 (2H, m), 2,12 (2H, m), 1,89 (3H, m), 1,48 (2H, m), 1,04 (4H, d), 0,71 (l2H, d).

MS (FAB): m/z 747,3 (M+H)⁺.

505

5Κ3 CASE 14415

-118z

Ester de metilo de (45,55)-5-alanilamino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-hidroxifenil)hexil-valil valina, sal de ácido acético

b) 0 composto do título foi produzido por um processo idêntico ao do Exemplo 72(b), substituindo pelo composto do ExejTi pio 73(a) (60 mg) o composto do Exemplo 72(a), originando o composto do título como um sólido branco (52 mg, 100%).

RMN (CD₃OD/CDC1₃): $8,19 (lH, d), 7,95 (lH, d), 7,70 (lH, d),

6,78 (4H, dd), 4,15 (2H, m), 3,95 (lH, m), 3,73 (lH, q), 3,58 (3H, s), 3,43 (IH, tn), 2,66 (2H, m) , 2,21 (2H, t), 1,90 (3H, m) , 1,53 (2H, q), 1,36 (3H, d), 1,17 (2H, br) , 0,93 (2H, tn), 0,78 (12H, d).

MS (FAB): m/z 523,2 (M+H)⁺.

Exemplo 74

Preparação de éster de metilo de (4S,5S) 5-(terc-butiloxicarbonilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-hidróxifenil)hexil-valil valina composto do título foi preparado por um processo idêntj. co ao do Exemplo 72(a), substituindo por t-butiloxicarbonilalanina (52 mg, 0,275 mmol) a carbobenziloxialanil alanina, e util iza_n do o composto do Exemplo 7l(b) (144 mg, 0,25 mmol), N-metil morfo lina (79 ml, 0,724 mmol; em duas porções) e cloroformato de isobutilo (36 ml, 0,275 mmol). 0 produto em bruto foi purificado por eluição através de uma coluna de gel de sílica com Me0H:CH₂Cl₂1:25 até um sólido branco (55 mg, 55%). Uma porção deste produto (12,5 mg, 0,0172 mmol) foi agitada em ácido acético CDm paládio a 10% em carbono activado (10 mg). 0 gás hidrogénio foi borbulhado através da solução, por meio de um balão de vidro, durante 60 min sendo, em seguida, a mistura mantida sob uma pressão de hidrogénio positiva durante 14 h. A suspensão foi filtrada através de uma almofada de Celite e evaporada sob pressão reduzida, originando o composto do título como um sólido branco (7,5 mg, 70%).

RMN (CD^OD/CDCl^): ^6,72 (4H, dd), 4,23 (lH, d), 3,65-3,92 (3H,

m), 3,54 (3H, s), 3,38 (2H, m), 2,60 (2H, m), 1,62-2,20 (5H, m),

1,49 (3H, m), 1,26 (9H, s), 1,04 (5H, m), 0,77 (l2H, d).

MS (FAB): m/z 623,3 (M+H)⁺.

585

SKB CASE 14415 í', /*r«

-119Exemplo 75

Preparação de éster de metilo de (4S,5S) 5-( Q^-alanil)alanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-hidroxifenil)hexil-valil valina, cloridrato

Éster de metilo de (4S,5S) 5-((carbobenziloxi-p-alanil)alanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-hidróxifenil)hexil-valil valina

a) A uma solução de carbobenziloxi-y3-alanina (23 mg, 0,105 mmol), e hidroxibenzotriazol (26 mg, 0,19 mmol) em DMF (D,B ml), foi adicionada diciclo-hexilcarbodiimida (22 mg, 0,105 mmol) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 20 min. A esta solução foi adicionada N-metilmorfolina (32 ml, 0,29 mmol) e o composto do Exemplo 73(b) (50 mg, 0,0956 mmol). A solução foi deixada sob agitação ã temperatura ambiente durante 6 dias e foi, em seguida, diluída com CHCl^ e lavada sucessivamente com HCl a 10%, NaHCO^ aquoso a 5% e H^O. A camada orgânica foi seca (MgSO^), filtrada e evaporada sob pressão reduzida até um sólido branco (44 mg). 0 produto foi eluído através de uma coluna de sílica de HPLC de 2,54 x 25 cm com MeOHíCHCl^ 6:96 originando o composto do título como um sólido branco (12 mg, 20%).

RMN (CD₃OD/CDC1₃): £>7,51 (lH, d), 7,30 (lH, d), 7,18 (5H, br s),

6,94 (1H, d), 6,69 (4H, dd), 4,90 (2H, s), 4,19 (lH, m), 3,82 (lH, m), 3,56 (3H, s), 3,42 (lH, m), 3,18 (3H, m), 2,59 (2H, m), 2,15 (4H, m), 1,90 (2H, m), 1,49 (2H, m), 1,08 (3H, d), 0,80 (12H, d).

MS (FAB): m/z 728,3 (M+H)⁺.

z

Ester de metilo de (45,5S) 5-((_Í/3-alanil)alanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-hidroxifenil)hexil-valil valina, cloridrato

b) A uma solução do composto do Exemplo 75(a) (ll mg,

0,015 mmol) em MeOH, foi adicionado paládio a 10, , em carbono act_i vado (5 mg). 0 gás hidrogénio fci borbulhado através da solução, por meio de um balão de vidro, durante 1 h, e, em seguida, a mistura sob agitação foi mantida sob hidrogénio (1,013x10^ Pa) dura_n te 14 h. A suspensão foi filtrada através de uma almofada de Celite® , e foram adicionadas diversas gotas de HCl concentrado. A solução foi evaporada sob pressão reduzida originando 0 composto

585

SKB CASE 14415

4' do titulo como um sólido branco (10 mg, 95%).

RMN (CD^OD/CDCip : £>7,60 (lH, d), 6,59 (4H, dd), 4,06 (lH, t) , 3,89 (2H, m), 3,66 (lH, m), 3,44 ( 3H, s), 3,27 (lH, m), 2,72 (2H, m), 2,41 (5H, m), 1,98 (2H, t), 1,79 (3H, m), 1,32 (2H, m), 1,07 (lH, m), 0,94 (3H, d), 0,67 (12H, d).

Exemplo 76

Preparação de éster de metilo de (4S,55) 5-amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina, cloridrato

X

Ester de metilo de (45,55)-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina

a) A uma solução do composto do Exemplo 34(a) (4,59 g,

8,61 mmol) em MeOH (150 ml), a 09C, foi adicionado boro-hidreto de sódio (0,33 g, 8,7 mmol). A mistura resultante foi deixada aquecer até à temperatura ambiente e foi agitada durante 30 min.

A mistura foi vertida em HCl a 5% (500 ml) e extraída com CH2CI2 (3 x 100 ml). 0s extractos orgânicos combinados foram secos (MgSO^), filtrados e evaporados sob pressão reduzida, originando uma mistura de estereoisómeros. 0 residuo foi dissolvido em MeOH a 2%tlHCl^ (70 ml), filtrado e purificado em lotes por HPLC utilizando uma coluna de sílica de 5,08 x 25 cm e eluindo com MeOH a 2%/CHCl^. 0 isómero desejado (4S) eluiu primeiro, foi recolhido e evaporado sob pressão reduzida, originando o composto do título (l,23 g, rendimento de 27%).

RMN (CDC1 ): δ 7,27 (5H, m), 6,94 (lH, d), 6,76 (lH, d), 5,10 (lH, d), 4,51 (IH, dd), 4,36 (lH, br t), 3,74 (3H, s), 3,70-3,50 (3H, m), 2,89 (2H, d), 2,40 (2H, m), 2,24-2,00 (2H, m), 1,95-1,65 (2H, m), 1,38 (9H, s), 0,91 (l2H, m).

MS (FAB): m/z 536,2 (M+H)⁺.

Ester de metilo de (45,55) 5-amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina, cloridrato

b) 0 péptido do Exemplo 76(a) (l,0 g, 1,87 mmol) foi tra tado com ácido trifluoroacético (5 ml), e a mistura resultante foi agitada durante 10 min. Foi adicionado metanol (25 ml), se69 585

SKB CASE 14415 .· -é. **

-121guido por HCl conc, (0,20 ml). 0 solvente foi evaporado sob pres. são reduzida; foi adicionado Et₂0 ao residuo e reevaporado, produzindo o composto do titulo como um pá branco o qual foi utiliza, do sem purificação ulterior.

RMN (CD₃OD): δ 7,30 (5H, m) , 4,26 (2H, m), 3,69 (3H, s), 3,60 (lH, m), 3,34 (lH, m), 3,07 (lH, dd), 2,88 (lH, dd), 2,40 (2H, m), 2,08 (2H, m), 1,80 (2H, m), 0,94 (l2H, m) .

MS (FAB): m/z 436,2 (M+H)⁺.

Exemplo 77

Preparação de (4S,55) 5-(alanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina, sal de ácido acético do éster de metilo z

Ester de metilo de (4S,55) 5-(carbobenziloxialanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina

a) A uma solução de carbobenziloxialanina (413 mg, 1,85 mmol) em THF anidro (5 ml) a -40SC sob uma atmosfera de árgon foi adicionada N-metil morfolina (0,24 ml, 2,2 mmol), seguida por cl.o roformato de isobutilo (0,240 ml, 1,85 mmol). Após agitação durante 20 minutos, foi adicionada mais N-metilmorfolina (0,24 ml,

2,2 mmol), seguida por uma solução do composto do Exemplo 76(b) (0,83 g, 1,76 mmol) em THF (10 ml). A mistura resultante foi de_i xada aquecer até à temperatura ambiente e agitada durante toda a noite. A mistura reaccional foi dissolvida em EtOAc, e lavada sjj cessivamente com HCl a 10%, NaHC0₃ aquoso a 5% e H₂0, e, em segu_i da, seca (MgSO ). A filtração e a remoção do solvente in vacuo originaram um sólido branco, o qual foi purificado por cromatogra fia flash eluindo com um gradiente de solvente ds 4 a 10% de MeOH/ /CHC1₃ (0,975 g, rendimento de 86%).

RMN (CD₃0D): δ 7,34 (5H, m) , 7,23 (5H, m) , 5,09 (2H, s), 4,32 (1H, d), 4,19 (1H, d), 4,09 (2H, m), 3,71 (3H, s), 3,60 (lH, m),

2,85 (2H, m), 2,30 (2H, m), 2,10 (2H, m), 1,70 (2H, m), 1,23 (3H, d), 0,94 (12H, m) .

MS(FAB): m/z 641,3 (M+H)⁺.

585

SKB CASE 14415

-122(4S,5S) 5-(alanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina, sal do ácido acético da éster de metilo

b) A uma solução do composto do Exemplo 77(a) (969 mg,

1,51 mmol) em Me0H:H0Ac 1:1 (15 ml) foi adicionado paládio a 10% em carbono activado (100 mg). 0 gás hidrogénio foi introduzido na mistura, a qual foi, em seguida, mantida sob uma atmosfera de hidrogénio durante 18 h. A mistura reaccional foi filtrada atra-

originando o composto do título como um sólido branco (0,84 g, rendimento de 98%).

RMN (CD^OD): S 7,25 (5H, m), 4,32 (lH, d), 4,21 (lH, d), 4,10 (lH, br t), 3,77 (lH, q aparente), 3,71 (3H, s), 3,60 (lH, br t),

2,96 (lH, dd), 2,83 (lH, dd), 2,35 (2H, t), 2,08 (2H, m), 1,96 (3H, s), 1,70 (2H, m), 1,44 (3H, d), 0,95 (l2H, d).

MS (FAB): m/z 507,2 (M+H)⁺.

Exemplo 78

Preparação de éster de metilo de (4S,55) 5-(alanilalanil) amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina

Ester de metilo de (45,5S) 5-(carbobenziloxialanilai anil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina

a) A uma solução de carbobenzilcxialanina (337 mg, 1,51 mmol) e N-metil morfolina (0,198 ml, 1,80 mmol) em THF anidrc (1C ml), a -4030 sob uma atmosfera de árgon, foi adicionado cloroformato de isobutilo (0,196 ml, 1,51 mmol) durante um período da 10 min. Apás agitação durante mais 20 min, mais N-metil morfolina (0,198 ml, 1,30 mmol) foi adicionada seguida por uma scluçãc do composta do Exemplo 77(b) (0,84 g, 1,48 mmol) em THF (20 ml). Foi adicionada dimetilformamida (10 ml) s o banho de temperatura fria foi removido brevemente para facilitar a agitação. A mistura reaç cional foi re-arrefecida para -4030, deixada aquecer gradualmente até à temperatura ambiente e agitada durante toda a noite. A mis. tura reaccional foi dissolvida em MeDHA a 10%/CHCl^ (500 ml) e la. vada sucessivamente com H_Q0 (200 ml), HCl a 10% (200 ml) e H^O (200 ml). 0 extracto orgânico foi evaporado sob pressão reduzida

5Β5

SKB CASE 14415

-123e o resíduo foi dissolvido em CHCl^:MeOH: 80: 20:2 (22 ml). A solução foi purificada, em três porções, por cromatografia flash, eluindo com CHCl^:MeOH:H₂0 90:10:1, originando o produto em bruto com um sólido branco-sujo (950 mg). Este material foi dissolvido em MeOH a 5%/CHCl^ (75 ml), filtrado e adicionalmente purificado em fracções de 8 ml cada por HPLC utilizando uma coluna de sílica de 1 x 25 cm eluindo com MeOH a 5%/CHCl^, originando o composto do título como um sólido branco (721 mg, rendimento de 68%).

RMN (CD₃OD/CDC1₃): S 7,35 (5H, m), 7,22 (5H, m), 5,12 (2H, d), 4,36 (1H, d), 4,29 (lH, q), 4,16 (2H, m), 4,05 (lH, m), 3,73 (3H, s), 3,57 (1H, m), 2,92 (lH, dd), 2,BI (lH, dd), 2,32 (2H, m),

2,09 (2H, m), 1,72 (2H, m), 1,36 (3H, d), 1,27 (3H, d), 0,94 (l2H 2 d em sobreposição).

MS (FAB): m/z 712,4 (M+H)⁺.

z

Ester de metilo de (4S,5S) 5-(alanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina

b) A uma solução do composto do Exemplo 7B(a) (715 mg, 1,01 mmol) em MeOH (45 ml) foi adicionado paládio a 10% em carbono activado (100 mg). 0 gás hidrogénio fci introduzido na mistura reaccional a qual foi, em seguida, mantida sob uma atmosfera de hidrogénio durante 48 h. A mistura foi filtrada, e o solvente foi removido in vacuo, originando o composto do título como um s_ó lido branco (599 mg, rendimento de 100%).

RMN (CD₃0D): S 7,24 (5H, m), 4,32 (2H, m), 4,21 (lH, d), 4,03 (1H, br t), 3,94 (lH, q), 3,71 (3H, s), 3,59 (1H, br t), 2,86 (2H, 2 dd em sobreposição), 2,31 (2H, t), 2,07 (2H, m) , 1,68 (2H, m) , 1,52 (3H, d), 1,32 (3H, d), 0,94 (12H, d em sobreposição).

MS (FAB): m/z 573,3 (M+H)⁺.

Exemplo 79

Preparação de éster de metilo de (4S,5S) 5-(alanllalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-ciclo-hexil-hexil-valil valina

A uma solução do composto do Exemplo 78(b) (5,4 mg, 9,4 mmol) em MeOH (5 ml) foi adicionado PtO- (10 mg), e a mistura re^z 5 sultante foi agitada num hidrogenador de Parr a 4,14 x 10 Pa de

585

SKB CASE 14415

-124H2 durante 2 d. A mistura foi filtrada e 0 solvente foi removido in vacuO) originando o composto do título como um sólido branco (3,4 mg, rendimento de 62%).

RMN (CD^OD): & 4,42-4,15 (3H, m) , 3,97 (2H, m), 3,71 (3H, s),

3,52 (lH, m) , 2,35 (2H, t), 2,10 (2H, m), 1,85 (lH, br d), 1,80-1,15 (21H, m) , 1,65 (l2H, m).

MS (FAB): m/z 584,4 (M+H)⁺.

Exemplo 80

Preparação de éster de metilo de (45,55) 5-(serilalanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina, sal do ácido acético z

Ester de metilo de (4S,55) 5-(carbobenziloxi-(0-fenilmetil)serilalanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina

a) A uma solução de carbobenziloxi-(0-benzil)serina (311 mg, 0,945 mmol) e N-metil morfolina (130 ml, 1,20 mmol) em THF (20 ml, a -409C, foi adicionado cloroformato de isobutilo (123 ml, 0,945 mmol) durante um período de 10 min. Após agitação durante mais 30 min, foi adicionado 0 composto do Exemplo 78(b) (520 mg, 0,900 mmol) em DMF a 20%/THF (25 ml). A mistura resultante foi deixada aquecer lentamente até à temperatura ambiente e foi agitada durante 20 h. A mistura foi diluída com CHCl^ (150 ml) e lavada com H20 (2x). 0 extracto orgânico foi evaporado sob pressão reduzida. 0 resíduo sólido (870 mg) foi purificado por cromatografia flash, eluindo com MeOH a 10%/CHCl^, originando material o qual era ainda ligeiramente impuro (640 mg). 0 produto foi dissolvido em MeOH a 4%/CHCl (20 ml), filtrado e adicionalmante purificado por HPLC, em 6 fracçoes, utilizando uma coluna de silica de 2,54 :< 25 cm eluindo com MeOH a 4/0/CH2CI2 para ori oi nar 0 composto do título como um sólido branco (414 mg, rendimento de 52%).

RMN (CD₃OD/CDC1₃): S 7,10 (lOH, m), 7,01 (5H, m), 4,94 (2H, s),

4,35 (2H, s), 4,25-3,30 (6H, m), 3,55 (2H, m), 3,52 (3H, s), 3,38 (IH, m), 2,73 (lH, dd), 2,63 (lH, dd), 2,10 (2H, m), 1,90 (2H, m),

1,57 (2H, m), 1,17 (3H, d), 0,93 (3H, d), 0,73 (l2H, d em sobrep_o

585

SK3 CASE 14415

-125sição).

MS (FAB): m/z 859,4 (M+H)⁺.

^ster de metilo de (4S,5S) 5-/~(0-fenilmetil)serilalanilalanil_/~ amino-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina, sal de ácido acético

b) A uma mistura do composto do Exemplo 80(a) (409 mg, 0,461 mmol) em MeOH:HOAc 2:1 (15 ml), foi adicionado paládio a 10% em carbono activado (80 mg). 0 gás hidrogénio foi introduzido na ι' mistura reaccional, a qual foi, em seguida, mantida sob uma atmos. fera de hidrogénio durante 16 h. A mistura foi filtrada através de Celite® , e evaporada sob pressão reduzida, originando o composto do título como um sólido branco (353 mg, rendimento de 94%)

RMN (CDC1₃): S 7,31 (5H, m), 7,24 (5H, m), 4,58 (2H, s), 4,42-4,18 (4H, m), 4,05 (lH, m) , 3,94 (lH, m), 3,85-3,70 (2H, m), 3,70 (3H, s), 3,53 (lH, m), 2,91 (lH, dd), 2,81 (lH, dd), 2,30 (2H, m), 2,12 (2H, m), 1,98 (3H, s), 1,72 (2H, m), 1,37 (3H, d), 1,22 (3H, d), 0,94 (12H, m).

MS (FAB): m/z 755,3 (M+H)⁺.

Ester de metilo de (4S,55) 5-(serilalanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina, sal de ácido acético

c) A uma solução do composto do Exemplo 80(c) (353 mg, 0,46 mmol) em MeOH (20 ml) foi adicionado paládio a 10% em carbono activado (85 mg). 0 gás hidrogénio foi introduzido na mistura, a qual foi, em seguida, mantida sob uma atmosfera de hidrogénio durante 2 dias. Foi adicionado ácido acético (5 ml), seguido por mais Pd a 10%/C (150 mg). Após agitação durante mais 4 dias sob uma atmosfera de hidrogénio, a mistura reaccional foi filtrada através de Celite® , e o solvente foi evaporado sob pressão r ed_u zida, originando o composto do título (273 mg, rendimento de 38%).

RMN (C0₃00): 6 7,23 (5H, m), 4,43-4,18 (4H, m), 4,05 (lH, br t),

3,85 (2H, m), 3,70 (3H, s), 3,59 (2H, m) , 2,92 (lH, dd), 2,30 (lH, dd), 2,30 (2H, m), 2,07 (2H, m), 1,96 (3H, s), 1,71 (2H, m) , 1,40 (3H, d), 1,25 (3H, d), 0,94 (l2H, m).

MS (FA8): m/z 66 5,3 (M+ H)⁺.

585

SKB CASE 14415

-126Exemplo 81

Preparação de éster de metilo de (45,5S) 5-/~(D-seril)alanilalanil_7amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina z

Ester de metilo de (4S,55) 5-((carbobenziloxi-D-seril)alanilaianil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina

a) A uma solução de carbobenziloxi-D-serina (8,4 mg, 35 mmol) e hidroxibenzotriazol (9,5 mg, 78 mmol) em DMF (8 gotas, foi adicionada diciclo-hexilcarbodiimida (7,2 mg, 35 mmol), e a mistura resultante foi agitada durante 20 min. Foi adicionado o composto do Exemplo 78(b) (20 mg, 35 mmol), seguido por mais DMF (7 gotas), e a mistura foi agitada durante 2 dias. A mistura foi diluída com MeOH a 10/o/CHCl^ e lavada sucessivamente com HCl a 10%, NaHC0₃ aquoso a 5% e H₂0. 0 solvente foi removido in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia flash, eluindo com MeOH a 10%/CHCl^, para originar o composto do título (4,2 mg, rendimento de 14%).

RMN (CDC1₃)CD₃OD): 8 7,26 (5H, s), 7,17 (5H, m), 5,11 (lH, d),

4,96 (lH, d), 4,35-4,10 (5H, m), 3,96 (lH, m), 3,83 (lH, dd),

3,72 (lH, dd), 3,64 (3H, s), 3,47 (lH, m), 2,87 (lH, dd), 2,72 (lH, dd), 2,34-1,95 (4H, m), 1,70 (2H, m), 1,34 (3H, d), 1,24 (3H, d), 0,87 (12H, d).

MS (FAB): m/z 799,5 (M+H)⁺.

z

Ester de metilo de (4S,55) 5-((D-seril)alanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina

b) A uma solução do composto da Exemplo 8l(a) (3,9 mg,

4,9 mmol) em MeOH (2 ml), foi adicionado paládio a 10% em carbono activado (2 mg). 0 gás hidrogénio foi introduzido na mistura reaccional, a qual foi, em seguida, mantida sob uma atmosfera de hidrogénio durante 2 d. A mistura foi filtrada através de Celite® e evaporada sob pressão reduzida, originando o composto do título como um sólido branco (3,4 mg, rendimento de 93%).

RMN (CD₃0D): 8 7,22 (5H, m), 4,25 (4H, m), 4,05 (lH, m) , 3,82 (2H, m), 3,69 (3H, s), 3,55 (lH, m), 2,90 (lH, dd), 2,78 (lH, dd),

2,29 (2H, br t), 2,05 (2H, m), 1,69 (2H, m) , 1,37 (3H, d), 1,25

585

SKB CASE 14415

-127(3H, d), 0,92 (12H, d em sobreposição). MS (FAB): m/z 665,4 (M+H)⁺.

Exemplo 82

Preparação de éster de benzilo de (4R5,5S) 5-amino-6-(4-benziloxi)fenil-4-hidroxi-l-oxo-hexil-valil valina, cloridrato z

Ester de benzilo de (5S) 6-(4-benziloxi)fenil-5-(t-butiloxicarbonil)amino-(l,4-dioxo)hexil-valil valina

a) A uma soluçSo do composto do Exemplo 13(c) (43 mg,

0,10 mmol) em THF, a -402C sob uma atmosfera de árgon, foi adici_o nada N-metil morfolina (16 ml, 0,14 mmol), seguida por clarofórma to de isobutilo (l3 ml, 0,10 mmol). Após agitação durante 15 min, foi adicionada mais N-metil morfolina (16 ml, 0,14 mmol), seguida por cloridrato de éster de benzilo de valil valina (51 mg, 0,15 mmol). A mistura resultante foi deixada aquecer atê à temperatura ambiente e agitada durante toda a noite. A mistura reaccional foi diluida com HC1 a 5% e extraída com CHCl^ (3x). Os extractos orgânicos combinados foram evaporados e o resíduo foi purificado por cromatografia flash eluindo com MeOH:CHCl^ 1:25, originando o composto do título como um sólido branco (62 mg, rendimento de 100%).

RMN (CDCl-j): 8 7,34 (lOH, m) , 7,07 (2H, d), 6,89 (2H, d), 6,52 (IH, d), 6,31 (IH, d), 5,2 (lH, m), 5,16 (2H, dd), 5,02 (2H, s), 4,59 (IH, dd), 4,49 (lH, dd), 4,30 (lH, dd), 3,08 (lH, dd), 2,84 (3H, m), 2,46 (2H, m), 2,13 (2H, m), 1,06 (lH, br s), 1,39 (9H, s), 0,91 (12H, m).

Ester de benzilo de (4RS,5S) 6-(4-benziloxi)fenil-5-(t-butiloxicarbonil)amino-4-hidroxi-l-oxo-hexil-valil valina

b) A uma solução do composto do Exemplo 82(a) (61 mg,

0,10 mmol) em MeOHÍCHgClg 5:1 (6 ml) foi adicionado boro-hidreto de sódio (5 mg, 0,13 mmol) e a mistura resultante foi agitada durante 20 min. A mistura reaccional foi diluída com HC1 aquoso a 5% e extraída, diversas vezes, com CHgClg. 0s extractos orgânicos combinados foram secos (MgSO^), filtrados e evaporados sob pressão reduzida, originando o composto do título como um sólido

585

SKB CASE 14415

¢-128branco (61 mg, rendimento de 100%).

RMN (CDC1₃/CD₃OD): 0 7,35 (lDH, m), 7,12 (2H, d), 6,90 (2H, d),

5,17 (2H, dd), 5,02 (2H, s), 4,47 (lH, m) , 4,17 (lH, t aparente),

3,68 (IH, m), 3,53 (lH, m), 2,96-2,55 (2H, m), 2,36 (2H, m), 2,19 (lH, m), 2,10-1,81 (2H, m), 1,70 (lH, m), 1,35 (9H, 2 singuletos), 0,91 (12H, m).

MS (FAB): m/z 718,5 (M+H)⁺.

Ester de benzilo de (4RS,5S) 5-amino-6-(4-benziloxi)fenil-4-hidroxi-l-oxo-hexil-valil valina, cloridrato

c) A uma mistura do composto do Exemplo 82(b) (60 mg, mmol) em (2 ml), foi adicionado ácido trifluoroacético (0,5 ml), e a solução resultante foi agitada durante 2 h. Foi adicionado, metanol, seguido por HC1 concentrado (2 gotas), e a so lução foi evaporada sob pressão reduzida. 0 resíduo foi triturado com Et₂0, originando o composto do título como um sólido branco (56 mg, rendimento de 100%).

RMN (CD^OD): ê 7,36 (lOH, m), 7,20 (2H, d), 6,97 (2H, d), 5,15 (2H, m), 5,07 (2H, s), 4,34 (lH, m), 4,21 (lH, m), 3,84-3,53 (lH, m), 3,44-3,20 (lH, m), 2,97 (lH, m), 2,80 (lH, m), 2,44 (2H, m), 2,15 (lH, m), 2,02 (lH, m), 1,94-1,62 (2H, m), 0,94 (12H, m).

z

Ester de benzilo de (4RS,55) 5-amino-6-(4-hidroxi)fenil-4-hidroxi-1-oxo-hexil-valil valina, cloridrato

c) 0 composto do Exemplo 82(c) (50 mg) foi dissolvido em ácido acético e agitado com paládio a 10% em carbono activado (50 mg). 0 gás hidrogénio foi borbulhado através da solução durante 2 h, e a reacção foi agitada durante 20 h sob uma atmosfera de hi drogénio. A suspensão foi filtrada através de uma almofada de C_e lite® e evaporada sob pressão reduzida, originando o composto do título.

Exemplo 83

Preparação de (4R5,5S) 5-(serilalanilalanil)amino-6-(4-hidroxi)fenil-4-hidroxi-l-oxo-hexil-valil valina, cloridrato z

Ester de benzilo de (4RS,5S) 5-/~(t-butiloxicarbonil-(0-fenilme69 585

SKB CASE 14415

-129til) ser ilal anilai anil )-ami nç7-6- (4-benziloxi) feni1-4-hidroxi-1-oxo-hexil-valil valina

a) A uma solução de t-butiloxicarbonil-(0-benzil)serilalanil alanina (46,8 mg, 107 mmol) em THF (l ml), a -40SC sob uma atmosfera de árgon, foi adicionada N-metil morfolina (16,5 ml,

150 mmol), seguida por cloroformato de isobutilo (13,8 ml, 107 mmol). Após agitação durante 15 min, foi adicionada mais N-metil morfolina (16,5 ml, 150 mmol), seguida por uma solução do composto do Exemplo 82(c) (56 mg, 97 mmol) em THF (0,75 ml). A mistura resultante foi deixada aquecer até à temperatura ambiente e agita da durante toda a noite. A mistura reaccional foi diluída com HCl a 5% e extraída, diversas vezes, com CH₂C1₂. 0s extractos o_r gânicos combinados foram evaporados sob pressão reduzida, e o resíduo sólido foi purificado por cromatografia flash, eluindo com MeOH:CHCl₃ 1:9, originando o composto do título (79,5 mg, rendi. mento de 87%).

RMN (CDC1₃/CD₃OD): 6 7,32 (l5H, m), 7,14 (2H, m), 6,84 (2H, m), 5,16 (2H, dd), 5,00 (2H, d), 4,56-4,40 (2H, 2d), 4,21-3,53 (9H, m), 3,10-2,65 (2H, m), 2,48-2,28 (2H, m), 2,25-2,0 (2H, m), 1,96-1,68 (2H, m) , 1,50 (9H), 1,39 (3H,d'sem sobreposição), 1,17 (3H, 2d's), 0,96 (12H, m).

MS (FAB): m/z 1037,4 (M+H)⁺.

(4R5,55) 5-(t-butiloxicarbonilserilalanilalanil)amino-6-(4-hidroxi) feni 1-4- hidroxi- 1-ox o-hex il-v alil valina

b) A uma solução do composto do Exemplo B3(a) (79 mg, 76 mmol), preparada acima, em MeOH:HOAc 3:1 (5 ml), foi adicionado paládio a 10% em carbono activado (45 mg). Foi introduzido hidro génio na mistura, a qual foi então mantida sob 1,013 χ 10⁵ Pa de

H„ durante 24 h. A mistura reaccional foi filtrada através de uma ^Z (β) almofada de Celite^ e o solvente foi removido sob pressão reduzi, da. 0 resíduo foi purificado por cromatografia flash eluindo com um gradiente de CHCl^MeOHíHgOíHCO^ de 90:10:1:1 a 80:20:2:1, p_a ra originar o composto do título com um sólido branco (37,5 mg, rendimento de 64%).

585

SKB CASE 14415

' ·

-130- ' ·RMN (CD^OD): S7,03 (2H, m), 6,66 (2H, m), 4,4-4,05 (5H, tn) , 4,03-3,50 (4H, m) , 3,06-2,54 (2H, m) , 2,38 (2H, m), 2,14 (2H, m),

1,96-1,62 (2H, tn), 1,48 (9H), 1,38 (3H, tn) , 1,22 (3H, 2d's), 0,96 (12H, d).

MS(FAB): m/z 767,3 (M+H)⁺.

(4RS,55) 5-(serilalanilalanil)amino-6-(4-hidroxi)fenil-4-hidroxi-1-oxo-hexil-valil valina, cloridrato

c) 0 composto do Exemplo 83(b) (5,9 mg, 7,7 mmol) foi tratado com ácido trifluoroacético (0,25 ml), e a solução resultante foi agitada durante 90 min. Foi adicionado metanol, seguido por HC1 concentrado (l gota) e a mistura foi evaporada sob pressão reduzida. 0 resíduo foi triturado com Et20, originando o composto do titulo como um pó branco.

RMN (CD₃DD): <> 7,03 (2H, m), 6,68 (2H, ιη), 4,42-4,17 (5H, m) ,

3,92 (4H, m), 3,04-2,54 (2H, m), 2,33 (2H, m), 2,22-1,97 (2H, m), 1,95-1,55 (2H, m), 1,35 (3H, d em sobreposição), 1,26 (3H, d em sobreposição), 0,98 (12H, m).

MS (FAB): m/z 667,4 (M+H)⁺.

Exemplo 84

Preparação de (4RS,5S) 5-(t-butiloxicarbonilserilalanilalanil)amino-4-hidroxi-6-(4-hidroxi)fenil-l-oxo-hexil-valil amida (55) 6-(4-benziloxi)fenil-5-(t-butiloxicarbonil)amino-l,4-dioxo-hexil-valil amida

a) A uma solução do composto do Exemplo 13(c) (25 mg,

58,5 yUmol) em THF, a -409C sob uma atmosfera de árgon, foi adiciç» nada N-metil morfolina (9,9 y<L, 90 y^mol), seguida por cloroformato de isobutilo (7,6 ml, 58,5 mmol). Após agitação durante 15 min, foi adicionada valinamida (14 mg, 120 mmol) e a mistura resultante foi deixada aquecer até à temperatura ambiente e agitada durante toda a noite. A mistura reaccional foi diluída com HC1 a 5% e extraída, três vezes, com CHC1₃. 0 solvente foi removido in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia flash eluindo com. MeOH: CHC1₃ 1:9, para originar o composto do titulo como um s.6 lido amarelo (23,5 mg, rendimento de 75%).

5Θ5

SKB CASE 14415 zZ z

'

- Λ

-131RMN (CD₃OD/CDC1₃): 6 7,36 (5H, m) , 7,12 (2H, d), 6,91 (2H, d),

5,05 (2H, s), 4,33 (lH, m), 4,22 (lH, m) , 3,07 (lH, dd), 2,83 (3H, m), 2,52 (2H, t), 2,13 (lH,septeto ), 1,39 (9H, s), 0,97 (6H, d em sobreposição).

(4R5,55) 6-(4-benziloxi)fenil-5-(t-butiloxicarbonil)amino-4-hidroxi-l-oxo-hexil-valil amida

b) A uma solução do composto do Exemplo B4(a) (23 mg, 44 mmol), preparada acima, em CI^C^íMeOH 1:4 (2,5 ml) foi adicionado NaBH^ (3 mg, 80 mmol). Após agitação durante 15 min, a mistura foi diluída com HCI a 5% e extraída, diversas vezes, com CH2CI2 Os extractos orgânicos combinados foram lavados com H₂0 e secos (MgSO^). A filtração e a remoção do solvente in vacuo fornecerem o composto do titulo como um sólido branco (23 mg, rendimento de 100%).

RMN (CD₃OD/CDC1₃): S 7,36 (5H, m), 7,13 (2H, d), 6,90 (2H, d),

5,04 (2H, s), 4,20 (lH, t aparente), 3,67 (lH, m), 3,53 (lH, m), 3,02-2,30 (4H, m), 2,10 (lH, m) , 2,02-1,61 (2H, m), 1,35 (9H, 2 singuletos), 0,97 (6H, d em sobreposição).

MS (FAB): m/z 52B,3 (M+H)⁺.

(4RS,55)-6-(4-benziloxi)fenil-5-amino-4-hidroxi-l-oxo-hexil-valil amida, cloridrato

c) 0 composto do Exemplo 84(b) (22 mg, 42 mmol) foi dissolvido em ácido trifluoroacético puro (0,1 ml). Após 1 h, foi adicionado metanol, seguido por HCI conc. (2 gotas). A remoção do solvente in vacuo originou 0 composto do titulo como um sólido higroscópico (22 mg).

RMN (CD₃0D): δ 7,35 (5H, m), 7,20 (2H, 2 dupletos), 6,98 (2H, 2 dupletos), 5,07 (2H, s), 4,21 (lH, m), 3,83-3,53 (lH, m), 3,47-3,21 (IH, _m), 2,98 (lH, m), 2,81 (lH, m), 2,43 (2H, m) , 2,09 (IH, m) , 1,98-1,62 (2H, m), 0,98 (6H, m) .

(4R5,5S ) 5-(t-butiloxicarbonil-(0-fenilmetil)serilalanilalanil)amino-6-(4-benziloxi)fenil-4-hidroxi-l-oxo-hexil-valil amida

d) A uma solução de t-butiloxicarbonil-(0-fenilmetil)serilalanil alanina (20 mg, 46 mmol) em THF (l ml), a -40SC sob

585

SKB CASE 14415

-132uma atmosfera de árgon, foi adicionada N-metil morfolina (8,2 ml, 75 mmol), seguida por cloroformato de isobutilo (6,0 ml, 46 mmol). A mistura resultante foi agitada durante 15 min, e foi adicionada mais N-metil morfolina (8,2 ml, 75 mmol), seguida por uma solução do composto do Exemplo 84(c) (22 mg) em THF (0,8 ml). A mistura resultante foi deixada aquecer até à temperatura ambiente e agita, da durante toda a noite. A mistura reaccional, a qual solidificou durante a noite, foi dissolvida em CHCl^iMeOH 1:1 e lavada com HCl a 5%. 0 extracto orgânico foi evaporado sob pressão redjj zida. 0 resíduo (51 mg) foi dissolvido em CHCl^:MeOH:ácido acéti co 9:1:0,5 (2 ml),aplicado a uma coluna de sílica flash de 15,24 x 15 mm e eluído com CHCl^:MeOH 9:1, originando um sólido amarelo (19,5 mg). A HPLC analítica (sílica; fase móvel CH₂C1₂: :MeOH 9:1; detector 275 nm) indicou uma proporção de 2:1 dos diastereómeros do hidroxi na posição 4. A purificação adicional foi realizada por cromatografia flash em silica utilizando CHCl^: :Me0H:H₂0 80:20:2, para produzir o composto do titulo (13,8 mg, rendimento de 39%) como um sólido branco.

RMN (CD₃0D/CDCl₃/DMS0-d₆): 87,32 (10H, m) , 7,12 (2H, m), 6,82 (2H, m), 5,00 (2H, s), 4,19 (5H, m) , 4,00 (lH, m), 3,68 (5H, m) ,

3,10-2,60 (2H, m), 2,42 (2H, m), 2,13 (lH, m), 1,99-1,63 (2H, m),

1,50 (9H, s), 1,37 (3H, d em sobreposição), 1,12 (3H, d), 0,95 (6H, m).

MS (FAB): m/z 847,5 (M+H)⁺.

(4RS ,55) 5-(t-butiloxicarbonilserilalanilaianil)amino-4-hidroxi-6-(4-hidroxi)fenil-l-oxo-hexil-valil amida

e) A uma solução do composto do Exemplo 84(d) (13,8 mg, 16,3 mmol), preparado cima, em MeOH (5 ml) foi adicionado paládio a 10% em carbono activado (7 mg). 0 gás hidrogénio foi borbulado na mistura resultante a qual foi, em seguida, mantida a 1,013x10^ Pa de H₂ durante 24 h. A filtração e a evaporação do solvente sob pressão reduzida forneceram o composto do título como um sólido branco (10,7 mg, rendimento de 99%).

RMN (CD^OD): 8 7,05 (2H, 2 dupletos), 6,64 (2H, 2 dupletos),

4,18 (5H, m), 3,95 (lH, m), 3,88-3,67 (3H, m), 3,60 (lH, m),

5Θ5

SKB CASE 14415

-1333,09-2,53 (2H, m), 2,37 (2H, m), 1,47 (9H, 2s), 1,38 (3H, pletos), 0,95 (6H, m).

MS (FAB): m/z 667,2 (M+H)⁺.

m), 2,11 (1H, m), 2,00-1,65 (2H, d em sobreposição), 1,21 (3H, 2 duExemplo 85

Preparação de éster de metilo de (lR,2R)-2-(((l5,25)-l-hidroxi-2-amino-3-ciclo-hexil)propil)ciclopentanocarbonil-valil valina, cloridrato z

Ester de metilo de (lR,2R) 2-(((lS,25)-l-hidroxi-2-t-butiloxicarbonilamino-3-fenil)propil)-ciclopentanocarbonil-valil valina

a) Utilizando o processo do Exemplo 27(a), o composto do Exemplo 6(b) (54 mg, 150 ^mol) reagiu com N-hidroxibenzotriazol (40 mg, 300 j^unol) , DCC (33 mg, 170 ^unol), N-metil morfolina (40 ^ul, 380 ^mol) e cloridrato de éster de metilo de valil valina (80 mg, 300yjnol), para originar o composto do titulo.

Éster de metilo de (lR,2R) 2-(((lS,25)-l-hidroxi-2-t-butiloxicarbonilamino-3-ciclo-hexil)propil)-ciclopentanocarbonil-valil valina

b) Uma solução do composto do Exemplo B5(a) (10 mg, 17,4 mmol) em MeOH (3 ml) foi agitada com PtO (10 mg) num hidrogena5 ^Z dor de Parr a 4,14 x 10 Pa . Após 26 h, a mistura foi filtrada através de uma almofada de Celite® e evaporada sob pressão reduzi da. 0 resíduo foi purificado por cromatografia flash eluindo com CHCl₃:MeOH 25:1, para originar o composto do titulo (9 mg, rendimento de B9%).

RMN (CDC1₃): <06,5B (lH, d), 6,44 (lH, d), 4,68 (lH, d), 4,51 (lH, dd), 4,23 (1H, br t), 3,74 (3H, s), 3,60 (lH, m), 3,47 (lH, m),

2,68 (1H, br t), 2,39-2,02 (4H, m), 2,0-1,5 (12H, m), 1,45 (9H, s), 1,40-1,08 (6H, m), 0,94 (12H, m).

z

Ester de metilo de (lR ,2R)-2-(((15,25)-l-hidroxi-2-amino-3-ciclo-hexil)propil)ciclopentanocarbonil-valil valina, cloridrato

c) 0 composto do Exemplo 85(b) (9 mg, 15,5 mmol) foi dis solvido em ácido trifluoroacético puro, e agitado durante diversos min. A solução foi evaporada sob pressão reduzida, o resíduo

585

SKB CASE 14415 foi dissolvido em MeOH, e tratado com HCl concentrado. A remoção do solvente in vacuo originou o composto do titulo.

Exemplo 86

Preparação de éster de metilo de (lR,2R) 2-(((lS,25)-l-hidroxi-2(serilalanilalanil)amino-3-ciclo-hexil)propil)ciclopentanocarbonil-valil valina, cloridrato

Éster de metilo de (lR,2R) 2-(((lS,2S)-l-hidroxi-2-(t-butiloxicarbonil^ 0- fenil me til) serilal anil alanil )amino-3-ciclo-hexil)propil)ciclopentanocarbonil-valil valina

a) A uma solução de t-butiloxicarbonil-(0-benzil)serilalanil alanina (6,6 mg, 15 mmol) em THF (0,5 ml), a -409C sob uma atmosfera de árgon, foi adicionada N-metil morfolina (2,2 ml, 20 mmol), seguida por cloroformato de isobutilo (2,0 ml, 15 mmol). A mistura resultante foi agitada durante 15 minutos, e mais N-metil morfolina (2,2 ml, 20 mmol) foi adicionada, seguida por uma solução do composto do Exemplo 85(c) (15 mmol) em THF (0,5 ml). A mis^ tura resultante foi deixada aquecer até à temperatura ambiente, e foi agitada durante toda a noite. A mistura foi dividida entre EtOAc e HCl diluído. 0 extracto orgânico foi lavado com NaHCO^ aquoso, NaCl aquoso saturado, e seco (MgSD^). A filtração e a re moção do solvente in vacuo originou um sólido branco (l2 mg). 0 produto foi purificado por cromatografia flash eluindo com CHCl^: :MeOH 25:1, para originar o composto do título como um vidro inco lor (6,2 mg, rendimento de 46%),

RMN (CDC1₃): 87,35 (5H, m), 7,0-6,6 (5H, m), 5,49 (lH, br d), 4,54 (2H, s), 4,52-4,08 (5H, m), 3,99 (lH, br), 3,78 (2H, m),

3,72 (3H, s), 3,42 (lH, br t), 2,71 (lH, m), 2,20 (4H, m), 1,95-1,55 (12H, m) , 1,46 (9H, s), 1,40 (6H, d), 1,35-1,06 (6H, m), 0,94 (12H, m).

z

Ester de metilo de (lR,2R) 2-(((lS,25)-l-hidroxi-2-(t-butiloxicarbonil serilalanil-alanil)amino-3-cicl□-hexil)propil)ciclopentacarbonil-valil valina

b) A uma solução do composto do Exemplo 86(a) (6,2 mg, 6,9 mmol) em MeOH (l ml) foi adicionado paládio a 10% em carbono

585

SKB CASE 14415 e· '

-135- «/./ í activado (5 mg). 0 gás hidrogénio foi introduzido na mistura reaccional, a qual foi, em seguida, mantida sob 1,013 x 10^ Pa de H2 durante 6 h. A mistura foi filtrada através de uma almofada de Celite® e o solvente foi removido in vacuo, originando 0 composto do título como um vidro incolor (6 mg).

RMN (CDC1j/CD^OD): 8 4,43 (lH, d), 4,38-4,05 (4H, m), 3,85 (2H,

m) , 3,73 (3H, s), 3,62 (lH, m), 3,45 (lH, m), 2,68 (lH, m), 2,30-2,05 (4H, m), 1,9-1,55 (12H, m) , 1,46 (9H, s), 1,40 (6H, d em sei breposição), 1,35-1,10 (6H, m), 0,94 (l2H, m).

MS (FAB): m/z 811,5 (M+H)⁺.

X

Ester de metilo de (lR,2R) 2-(((lS,25)-l-hidroxi-2-(serilalanilalanil)amino-3-ciclo-hexil)propil)ciclopentanocarboni1-vali1 valina, cloridrato

c) 0 composto do Exemplo 86(b) (6 mg, 7 mmol) foi dissol. vido em algumas gotas de ácido trifluoroacético. Após agitação à temperatura ambiente durante 4D min, a solução foi eluida com MeOH e foi adicionada uma gota de HC1 conc./dioxano. A mistura resultante foi evaporada sob pressão reduzida originando o compos to do titulo.

RMN (CD^OD): 84,50-4,15 (4H, m), 3,93 (4H, m), 3,71 (3H, s),

3,45 (IH, t), 2,65 (lH, m), 2,29 (lH, m), 2,2-2,0 (3H, m), 1,93-1,53 (l2H, m), 1,5-1,1 (6H, m), 1,41 (3H, d), 1,35 (3H, d), 0,96 (12H, m).

MS (FAB): m/z 711,5 (M+H)⁺.

Exemplo 87

Preparação de (45,55 )-5-( metoxicarbonil-alanilai anil)amiηο-6-fenil-4-hidroxi-(l-oxo)hexil-valil valina z

Ester de benzilo de (5S)-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-6-fenil-(1,4-dioxo)hexil-valil valina

a) A uma solução de ácido (55)-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-4-oxo-6-fenil-hexanóico (16 mg, 0,500 mmol) e N-metil morfo lina (66 JaI , 0,60 mmol) em THF (4 ml) a -408C, foi adicionado cl.o roformato de isobutilo (65 βΧ, 0,50 mmol), durante um período de 5 minutos. Após agitação durante mais 5 min, mais N-metil morfo69 585

SKB CASE 14415

'

-136lina (66 y<l) foi adicionada, seguida por cloridrato de éster de benzilo de ualil valina (205 mg, 0,60 mmol) em DMF (l,5 ml). A mistura resultante foi deixada aquecer lentamente até à temperatjj ra ambiente e foi agitada durante 15 h. A mistura foi diluída com CHClj e lavada com HCl a 10% e, em seguida, H^O. 0 extracto orgânico foi evaporado sob pressão reduzida, e o resíduo foi purificado por cromatografia flash (CHCl^:MeOH 25:l), originando o composto do título como um sólido branco (253 mg, rendimento de 85%).

Ester de benzilo de (45,55)-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-4-hidroxi-6-fenil-(1-oxo)hexil-vaiil valina

b) 0 produto do Exemplo 87(a) (253 mg, 0,415 mmol) foi dissolvido em 5 ral de MeOH, e foi adicionado NaBH^ (17 mg, 0,45 mmol). Após 20 min de agitação, a mistura foi diluída com HCl a 5% e extraída com CH2CI2. 0 solvente foi removido e o resíduo foi purificado por HPLC em sílica eluindo com MeOH a 2% em CH^Cl^ para fornecer 0 composta do titulo (75,6 mg), o qual eluiu primej. ro, seguido por o diastereómero (4R) correspondente (135 mg).

Cloridrato de éster de benzilo de (45,5S)-5-amino-4-hidroxi-6-fenil-(1 -oxo)hexil-valil valina

c) 0 produto TFA (0,5 ml). Após 5 HCl conc. (50 jjJL ) . A rada com éter e seca, do Exemplo 87(b) (75 mg) foi dissolvido em min, foi adicionado MeOH (2 ml) seguido por solução foi concentrada até uma goma, tritu para originar um pó branco (70 mg).

Ester de benzilo de (45,5S)-5-(metoxicarbonil-alanilalanil)amino-4-hidroxi-6-fenil-(l-oxp)hexil-valil valina

d) A uma solução de metoxicarbonilalanil alanina (29,7 mg, 0,136 mmol) e N-metilmorfolina (17 Jíl, 0,15 mmol) em THF (2 ml), a -40SC, foi adicionado cloroformato de isobutilo (17,6 yd., 0,136 mmol), durante um período de 5 min. Após agitação, durante 15 min adicionais, foi adicionada mais N-metil morfolina (l7jdL), seguida por uma solução de cloridrato de éster de benzilo de (4S,5S)-5-amino-4-hidroxi-6-fenil-(l-oxo)hexil-valil valina (68 mg, 0,124 mmol) em THF:DMF 2:1 (l,5 ml). A mistura resultante

585

SKB CASE 14415

-137foi deixada aquecer lentamente até à temperatura ambiente e foi agitada durante 15 h. A mistura foi diluída com CHCl^íMeOH 9:1, e lavada com HCl a 10% seguido por H₂0. 0 extracto orgânico foi evaporado sob pressão reduzida, originando o composto do titulo como um sólido branco (95 mg).

TLC (CHCl₃:Me0h 9:l): R_f =0,5.

RMN (CD₃OD/CDC1₃): 07,4-7,25 (lOH, m), 5,17 (2H, dd), 4,45 (lH,

Obsc.), 4,30 (1H, m), 4,18-4,00 (3H, m), 3,69 (3H, s), 3,56 (lH, m), 2,88 (2H, ddd), 2,32 (2H, m), 2,19 (1H, m) , 2,03 (lH, m),

1,72 (2H, m), 1,34 (3H, d), 1,28 (3H, d), 0,91 (l2H, d em sobreposição) .

MS (FAB): m/z 712,4 (M+H)⁺.

(45,55)-5-(metoxicarbonil-alanilalanil)amiηο-6-fenil-4-hidroxi-(l-oxo)hexil-valil valina

e) A uma mistura do produto do Exemplo 87(d) (85 mg, 0,12 mmol) em MeOH (5 ml), foi adicionado paládio a 10% em carbono acti vado (13 mg). 0 gás hidrogénio foi introduzido na mistura reacci onal, a qual foi então mantida sob uma atmosfera de hidrogénio du. rante 3,5 h. A mistura foi filtrada através de Celite® e evaporada sob pressão reduzida, originando o composto do titulo como um sólido branco (70,5 mg, rendimento de 95%).

RMN (CD₃0D): £ 7,23 (5H, m), 4,37-4,00 (5H, m), 3,66 (3H, s),

3,58 (1H, m), 2,88 (2H, ddd), 2,32 (2H, m), 2,18 (lH, m), 2,06 (1H, m), 1,73 (2H, m) , 1,32 (3H, d), 1,26 (3H, d), 0,95 (l2H, m). MS (FAB): m/z 622,3 (M+H)⁺.

Exemplo 88

Preparação de (45,5S)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-(l-oxo)hexil-valil valinol

A uma solução do éster de metilo de (4S ,5S)-5-(carbobenziloxialanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-(1-oxo)hexil-valil valina foi adicionado LiBH^ em excesso (cerca de 5 mg). Após 10 min, a solução foi diluída com HCl a 5%, e extraída com CHC1₃: :Me0H 9:1. A camada orgânica foi lavada com água e concentrada.

585

SKB CASE 14415

residuo foi purificado por cromatografia flash (CHCl^íMeOH 9:l), originando o composto do titulo (l,9 mg) como um sólido branco.

RMN: (CD₃OD/CDC1₃): 0 7,2-7,0 (lOH, tn), 4,93 (2H, d), 4,1 (lH, obsc.), 4,00-3,80 (3H, m), 3,50-3,35 (4H, tn) , 2,68 (2H, ddd), 2,13 (2H, m), 1,92 (lH, m) , 1,69 (lH, m) , 1,54 (2H, tn), 1,16 (3H, d), 1,08 (3H, d), 0,75 (12H, m).

MS (FAB): m/z 684,3 (M+H)⁺.

Exemplo B9

Preparação de (45,55)-5-(4S,5S) 5-(carbobenziloxialanilalanil)-amino-4-hidroxi-6-fenil-(l-oxo)hexil-valina isobutilamida z

Ester de benzilo do ácido (5S)-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-4-οχο-6-f enil-hexanóico

a) A uma solução de ácido (5S)-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-4-oxo-6-fenil-hexanóico (l mmol) em acetonitrilo seco (10 ral), foi adicionado DBU (l mmol), seguido por brometo de benzilo (l,5 mmol) com agitação. Após 2 h, a mistura foi diluída com HCl a 5% e extraída com CHgClg. A camada orgânica foi concentrada, e o resíduo foi purificado por cromatografia flash (CHCl^), originando o éster (370 mg).

RMN (CDC1₃): δ 7,4-7,0 (10H, m), 5,10 (2H, s), 5,03 (lH, d),

4,51 (lH, q), 3,18-2,83 (2H, m), 2,73 (2H, m), 2,60 (2H, m) , 1,39 (9H, s).

MS (FAB): m/z 412 (M+H)⁺.

z

Ester de benzilo do ácido (45,5S)-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-4-(terc-butildimetilsiloxi)-6-fenil-hexanóico

b) 0 produto do Exemplo 89(a) foi reduzido com NaBH^ em MeOH pelo processo do Exemplo 87(b) (rendimento de 96-98%). A mistura de álcoois diastereomérica em bruto resultante foi dissol. uida em DMF a uma concentração de cerca de 2M, e foram adicionados imidazol (2,4 equiv.) e cloreto de terc-butildimetilsililo (l,2 equiv.). A mistura foi agitada durante 2 dias, em seguida foi diluída com água e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica foi seca (MgSO^) e concentrada. 0 residuo foi purifica69 585

SKB CASE 14415 //

-139do por cromatografia flash (hexano.EtOAc 5:l), seguida por HPLC (hexano:EtOAc 15:l), fornecendo o composto do titulo (rendimento de 25%), o qual eluiu primeiro, seguido pelo éster de benzilo (4R)-siloxi correspondente (rendimento de 70%).

isómero (4S):

RMN (CDC1₃): $7,4-7,12 (lOH, m), 5,08 (2H, s), 4,67 (lH, d),

3,85 (IH, q), 3,68 (IH, m), 2,72 (2H, m), 2,36 (2H, m), 1,78 (2H, m), 1,41 (9H, s), 0,88 (9H, s), 0,10 (6H, d).

MS (FAB): m/z 529 (M+H)⁺.

z

Acido (45,55)-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-4-(terc-butildimetil siloxi)-6-fenil-hexanóico

c) A hidrogenólise do produto do Exemplo 89(c), pelo pro. cesso do Exemplo 87(e), forneceu o composto do título (rendimento de 99%), como uma espuma quebradiça.

RMN (CDC1₃): & 7,35-7,10 (5H, m), 4,69 (2H, br d), 3,88 (lH, q), 3,70 (IH, m), 2,72 (2H, m), 2,31 (2H, m), 1,78 (2H, m), 1,30 (9H, s), 0,89 (9H, s), 0,10 (6H, d).

MS (FAB): m/z 438,2 (M+H)⁺.

(4S,5S)-5-(carbobenziloxialanilalanil)amino-4-(terc-butildimetilsiloxi)-6-fenil-(l-oxo)hexil-valina isobutilamida

d) 0 produto do Exemplo 89(c) foi acoplado com cloridrato de valina isobutilamida pelo processo do Exemplo 87(a), originando a (45,5S)-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-4-(terc-butildimetilsiloxi)-6-fenil-hexanoil-valina isobutilamida em bruto (rendimento de 80%), a qual foi directamente convertida no cloridrato correspondente pelo processo do Exemplo 87(c). 0 cloridrato em bruto foi, por sua vez, acoplado à carbobenziloxialanina pelo pro cesso em 1-passo, seguido por cromatografia flash (CHCl₃:MeOH 20:l), originando o composto do título (rendimento de 60%) como um sólido branco.

RMN (CDC1₃): $7,45-7,10 (lOH, m) , 6,38 (lH, m), 5,08 (2H, m), 4,21 (2H, m), 3,70 (lH, m), 2,73 (2H, m), 2,33 (lH, m), 2,12 (2H, m), 1,25 (4H, m), 0,91 (22H, m), 0,10 (6H, d).

MS (FAB): m/z 697,3 (M+H)⁺.

585

SKB CASE 14415

-14D(4S,5S)-5-(çarbobenziloxialanilalanil)amino-4-hidroxi-6-fenil-(l-oxo)hexil-vaiina isobutilamida

e) Ao produto do Exemplo 89 (d) em THF foi adicionado brometo de tetrabutilamónio (5 equiv.). Após agitação durante 14 h, a mistura foi diluída com água e extraída com diclorometano. A remoção do solvente originou o composto do título como um sólido branco.

RMN (CDC1 )CD₃0D): 07,28-7,05 (lOH, m), 4,96 (2H, s), 4,02-3,76 (4H, m), 3,47 (lH, m) , 2,9-2,60 (4H, m), 2,13 (2H, m), 1,82 (lH, q), 1,55 (3H, m), 1,09 (4H, d), 0,70 (12H, d).

MS (FAB): m/z 583,3 (M+H)⁺.

Exemplo 90

Preparação de éster de metilo do ácido (4RS ,55)-5-((terc-butiloxicarbonil)isoleucil)amino-7-metil-4-hidroxi-1-oxo-octil-leucil-aspârtico z

Acido (55)-5-(terc-butiloxicarbonil)amiηο-7-meti1-4-oxo-octanóico

a) 0 composto do título foi preparado pelo processo dos Exemplos 12(a,b), excepto pela utilização de Boc-leucina N-metoxi-N-metil amida em vez de Boc-fenilalanina N-metoxi-N-metil amida.

RMN (CDC1₃): 5)5,0 (lH, d), 4,35 (lH, m) , 3,5 (lH, s), 2,8 (2H, m), 2,6 (3H, t), 1,5 (9H, s), 0,90 (8H, d).

z

Ester de metilo do ácido (55 )-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-7-metil-(1,4)-dioxo-octil-leucil-(O-benzil)aspártico

b) 0 composto da titulo foi preparado pelo processo de acoplamento do Exemplo 34(a), utilizando o produto do Exemplo 90(a) e cloridrato de éster de metilo de ácido leucil-(0-benzil)-aspártico.

z

Ester de metilo do ácido (4RS,55)-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-7-metil-4-hidroxi-l-oxo-octil-leucil-(0-benzil)aspártico

c) 0 produto do Exemplo 90(b) foi reduzido com NaBH₃CN em excesso em ácido acético · (2 dias), originando o composto do título como uma mistura 1:1 dos diastereómeros 4R e 4S, após tra69 585

SKB CASE 14415 í··

-141balho aquoso e cromatografia flash.

RMN (CDCl-j): 8 7,35 (5H, s), 7,05 (lH, d), 6,15 (lH, m) , 5,15 (2H, s), 4,85 (2H, m) , 4,55 (1H, d), 4,4 (lH, m) , 3,65 (3H, s), 2,9 (2H, m) , 2,4 (2H, t), 1,5 (9H, s), 0,90 (12H, m).

MS (FAB): 622,3 (M+H)⁺.

z

Ester de metilo do ácido (4RS,55)-5-((terc-butiloxicarbonil)isoleucil)amino-7-metil-4-hidroxi-l-oxo-octil-leucil-(0-benzil)aspártico

d) 0 composto do titulo foi preparado a partir do produto do Exemplo 90(c) pelos processos dos Exemplos 76(b) e 77(a), excepto pela substituição por Boc-isoleucina em lugar da Cbz-alanina.

RMN (CDC1₃): 87,4 (5H, s), 7,0 (lH, d), 6,3 (0,5H, d), 6,2 (0,5H,

d), 5,15 (2H, s), 5,05 (2H, m), 4,9 (lH, m), 4,5 (lH, m), 3,7 (3H, d), 3,0 (2H, m), 2,45 (3H, m), 1,5 (15H, s), 1,3 (l5H, s), 0,90 (19H, m).

MS (FAB): 735,5 (M+H)⁺.

z

Ester de metilo do ácido (4RS,55)-5-((terc-butiloxicarbonil)isoleucil)amino-7-metil-4-hidroxi-l-oxo-octil-leucil-aspârtico

e) 0 composto do titulo foi preparado a partir do produto do Exemplo 90(d) pelo processo do Exemplo 77(b).

RMN: δ 4,55 (lH, t), 4,35 (lH, m), 3,8 (2H, m) , 3,65 (3H, s),

3,45 (1H, m), 2,7 (lH, m), 2,5 (lH, m), 2,3 (2H, m), 1,4 (9H, s),

1,2 (6H, s), 0,90 (15H, m).

MS (FAB): 667,4 (M+Na)⁺; 643,4 (M-H)“.

Exemplo 91

Preparação de (4R,5S) e (45,5R)-carbobenziloxi-alanil-(3-hidrpxi-5-amino-6-fenil)hexanoil-valil-(4-aminometil)piridina

Boc-yalil-(4-aminometil)piridina

a) Boc-L-valina (5,0 g, 23 mmol) foi dissolvida em 100 ml de CH Cl em conjunto com 4-amino-metilpiridina (2,5 g, 23 mmol). Foi adicionada diciclo-hexilcarbodiimida (4,75 g, 23 mmol) e a reacção foi deixada sob agitação durante toda a noite. A mis.

585

SKB CASE 14415

-142tura reaccional foi filtrada, lavada com IMaHCO^ 1 N (3 x 50 ml), água (l x 50 ml) e seca sobre Na₂S0^. 0 solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi triturado com hexano filtrado e cristalizado. 0 produto parcialmente purificado foi purificado pela sua passagem sobre um leito de gel de sílica em acetato de etilo. A evaporação do solvente originou 3,64 g do produto cq mo um sólido branco.

RMN (CDCl^): S 0,83 (d), 0,90 (6H, d), 1,30 (9H, s), 3,8-4,0 (lH, dd), 4,38 (2H, d), 5,2 (lH, d), 7,1 (d), 8,5 (4H, d).

(5S)-carbobenziloxi-alanil-(4-oxo-5-amino-6-fenil)hexanoil-valil-(4-aminometil)piridina

b) Boc-L-valil-(4-aminoraetil)piridina (2,0 g) foi tratada com HC1 4 N/di oxano, à temperatura ambiente durante 30 min, eva porado até à secura e o residuo dissolvido em água, filtrado e liofilizado, originando o sal dicloridrato de L-valil-(4-aminometil)piridina.

sal dicloridrato de L-valil-(4-aminometil)piridina (0,16 g, 0,5 mmol) e ácido Boc-4-oxo-5(S)-amino-6-fenil-hexanóico foram dissolvidos em 10 ml de DMF; A isto foi adicionado hexafluorofos fato de benzotriazol-l-iloxitris(dimetilamino)fosfónio (0,322 g, 0,75 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (0,101 g, 0,75 mmol) e diisopropiletilamina (0,097 g, 0,75 mmol) e a mistura reaccional foi agitada durante toda a noite à temperatura ambiente. Mais hexafluorofos fato de benzotriazol-l-iloxitris(dimetilamino)fos fόπιο (0,332 g, 0,75 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (0,101 g, 0,75 mmol) e diisopropiletilamina (0,097 g, 0,75 mmol) foram adicionados e a reacção foi deixada prosseguir durante mais 24 horas â temperatura ambiente. Após evaporação do solvente, a mistura reaccional foi dissolvida em acetato de etilo, lavada com K₂CD₃ a 10%, NaHSO^ saturado e água, seca sobre Na^SO^ e concentrada até um óleo. A purificação em gel de sílica utilizando metanol a 5%/ /cl oreto de metileno originou 99 mg de (45) Boc-(3-oxo-4-amino-5-fenil)hexanoil-valil-(4-aminometil)piridina.

A (5S) Boc-(4-oxo-5-amino-6-feni1)hexanoil-valil-(4-amino metil)piridina, precedente, foi tratada com HC1 4 N/dioxano à tem

585

SKB CASE 14415

-143peratura ambiente durante 30 min, evaporada até a secura e o resJL duo foi dissolvido em água, filtrado e liofilizado, originando 70 mg do sal dicloridrato de (55)(3-oxo-5-amino-6-fenil)hexanoil-valil-(4-aminometil)piridina.

sal dicloridrato de (5Ξ)(3-oxo-5-amino-6-fenil)hexanoil-valil-(4-aminometil)piridina (67 mg, 0,15 mmol) foi dissolvido em DMF em conjunto com carbobenziloxi-L-alanina (51 mg, 0,23 mmol), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfόπιο (102 mg, 0,23 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (31 mg, 0,23 mmol) e diisopropiletilamina (30 mg, 0,23 mmol) e a reacção foi agitada à temperatura ambiente durante toda a noite. A mistura reaccional foi evaporada, dissolvida em acetonitrilo e purificada por HPLC preparativa num Beckman Ultrasphere® ODS utilizando um gradiente de 10% de acetonitrilo-água-TFA a 0,1% a 50% de acetonitri lo-água-TFA a 0,1%, durante 30 min a 4 ml/min. As fracçSes apropriadas foram reunidas, evaporadas até à secura e liofilizadas a partir de ácido acético a 1%, originando 29 mg do produto desejado.

FAB-MS m/z 616,2 (M+H)⁺, 614,2 (Μ-H)^-.

(3R,4S) e (3S,4R)-carbobenziloxi-alanil-(3-hidroxi-4-amino-5-fenil ) hexano il-val il-( 4- amino me til) pi ridina

c) (4S) carbobenziloxi-alanil-(3-oxo-4-amino-5-fenil)hexanoil-valil-(4-aminometil)-piridina (14) (20 mg, 0,33 mmol) foi dissolvida em 5 ml de metanol e boro-hidreto de sódio (l,4 mg,

0,036 mmol) foi adicionado. Após 30 minutos à temperatura ambiente, 1 mg adicional de boro-hidreto de sódio foi adicionado e a reacção foi deixada prosseguir durante mais 30 minutos à temperatura ambiente. 0 solvente foi removido por evaporação e o resíduo dissolvido em ácido acético e liofilizado. A mistura de álcoois diastereomérica foi separada por HPLC preparativa num Beckman Ultrasphere® ODS utilizando 28,5% de acetonitrilo-71,5% de água-TFA a 0,1%. As fracções apropriadas foram reunidas, evaporadas até à secura e liofilizadas a partir de ácido acético a 1%, originando 7 mg do isómero A e 6 mg do isómero B.

585

SKB CASE 14415

-144^sómero A:

FAB-MS m/z 618,5 (M+H)⁺, 616,4

HPLC: k* = 9,6 (Beckman Ultrasphere® ODS utilizando um gradiente de 10% de acetonitrilo-água-TFA a 0,1% a 50% de acetonitrilo-água-TFA a 0,1% durante 30 min).

Isómero B:

FAB-MS m/z 618,5 (M+H)⁺, 616,4 (M-H)~.

HPLC: k’ = 9,9 (Beckman Ultrasphere® ODS utilizando um gradiente de 10% de acetonitrilo-água-TFA a 0,1% a 50% de acetonitrilo-água-TFA a 0,1% durante 30 min).

Exemplo 92

Preparação de (3S)-Boc-valil-4-metil-3-aroinopentano-2-ona

Boc-L-valina N,0-dimetilamida

a) Cloridrato de dimetil-hidroxilamina (3,91 g, 40 mmol) foi dissolvido em 25 ml de CH2CI2 e arrefecido até 02C. Foi adicionada trietilamina (4,14 g, 40 mmol) originando uma suspensão espessa, a qual foi deixada aquecer até à temperatura ambiente.

Foi dissolvida Boc-L-valina (8,68 g, 40 mmol) em 50 ml de THF e 180 ml de CH2CI2, e arrefecida até -20SC. Foi adicionada N-metilpiperidina (4,88 ml, 40 mmol), seguida por cloroformato de eti, lo (4,34 g, 40 mmol). Após 5 minutos, a solução de dimetil-hidro xilamina foi adicionada e a reacção foi deixada aquecer até à tem peratura ambiente. Após 3 horas, a mistura reaccional foi lavada com HC1 1 N (2 x 100 ml), NaOH 1 N (2 x 100 ml), seca sobre NajSO^ e evaporada até um óleo incolor, o qual foi utilizado sem purificação posterior.

3(5)-4-metil-3-t-butiloxicarbonilaminopentano-2-ona

b) Boc-L-valina N,0-dimetilamida (2,6 g, 10 mmol) foi dissolvida em 30 ml de éter dietílico e adicionada, gota a gota, a 17 ml de uma solução 3 M de brometo de metilmagnôsio em éter dietílico (51 mmol). A mistura reaccional foi agitada durante 3 horas à temperatura ambiente e, em seguida, vertida em água gelada, acidificada até pH 2 com HC1 1 N e extraída com acetato de eti. lo (3 x 50 ml). 0s extractos foram secos sobre Na2S0^ e concentra

585

SKB CASE 14415

-145dos até um óleo incolor, o qual foi purificado por cromatografia em gel de sílica, utilizando metanol a 2%/CHgClg, para originar

1,74 g do produto desejado.

RMN (CDC1₃): í>0,82 (3H, d), 1,05 (3H, d), 1,45 (9H, s), 2,2 (3H, s) 4,3 (IH, m), 5,25 (lH, br d).

(3S)-Boc-valil-4-metil-3-aminopentano-2-ona

c) 4-Metil-3(S)-t-butiloxicarbonilaminopentano-2-ona é agitada com HC1 4 N/dioxano, à temperatura ambiente durante 30 min, concentrada sob alto vãcuo e, em seguida, evaporada de CH^Clg, diversas vezes, para remover o HCl residual. 0 sal cloridrato re sultante é dissolvido em CHgClg e neutralizado com um equivalente de trietilamina. Boc-L-valina (um equiv.) e diciclo-hexilcarbod_i imida (um equiv.) são adicionadas e a reacção é agitada à tempera tura ambiente durante toda a noite. A mistura reaccional é filtrada, lavada com NagCO^ 1 N, seca sobre Na^SO^ e concentrada, produzindo o dipéptido em bruto, o qual ó então purificado por cromatografia em gel de sílica.

(4S,55)-benziloxicarbonilalanil-alanil-(6-fenil-5-amino-4-hidroxi-hexanoil)-yalil-(4-metil-3(5)-aminopentano-2-ona)

d) 0 composto do Exemplo 92(c) é tratado com HCl 4 N/diq xano, à temperatura ambiente durante 38 min, concentrado sob alto vácuo e evaporado de CHgClg, diversas vezes, para remover o HCl residual, produzindo a (35) valil-4-metil-3-aminopentano-2-ona, cloridrato. Substituindo, por este composto, a valina isobutilamida no processo do Exemplo 89, obteve-se o composto do título.

Exemplo 93

Preparação de ácido (5S) Boc-5-amino-6-fenil-trans-hex-3-enóico ácido monometil trans-3-hexenéico

a) Diazald® (21,4 g, 100 mmol) foi dissolvido em éter e adicionado, gota a gota, a uma solução de KOH (5 g), água (8 ml) e éter (25 ml), a 65SC. 0 diazometano resultante foi destilado directamente numa solução de ácido β -trans-hidromucónico (10 g, mmol). A solução foi evaporada e o resíduo purificado por cro

585

SKB CASE 14415

-146matografia Flash ern gel de sílica utilizando ácido acético a 23/ /clorofórmio, para originar 1,24 g do produto desejado.

RMN (CDC1₃): 810,85 (lH, s), 5,75 (2H, m), 3,6Θ (3H, s), 3,23 (4H, m).

6-(2-oxo-4-(fenilmetil)-3-oxazolidinil)-trans-hex-3-enoato de (45)-metilo

b) 0 ácido monometil trans-3-hexenóico (l,24 g, 7,8 mol) foi dissolvido em 50 ml de THF em conjunto com trietilamina (l,42 ml, 10,2 mmol) e foi arrefecido até -789C. Cloreto de pivaloil (l,06 ml, 8,6 mmol) foi adicionado, a reacção foi agitada durante 15 min a -78SC, e deixada aquecer até 0°C durante 45 min.

(S)-Benziloxazolidinona (2,5 g, 14,1 mmol) foi dissolvida era 30 ml de THF e arrefecida até -789C sob árgon. Foi adicionado butillitio (5,6 ml de 2,5 M em hexano), lentamente, e a mistura foi agitada durante 5 min. 0 anidrido misto precedente foi arrefecido até -789C e a oxazolidinona litiada foi adicionada por meio de uma cânula. A reacção foi agitada, a -789C, durante 15 min e, em seguida, deixada aquecer até à temperatura ambiente durante 1,5 hora. A reacção foi rapidamente extinguida com 100 ml de NaHSO^

M e o THF foi removido sob pressão reduzida. 0 resíduo aquoso foi extraído com CH₂C1₂ θ os extractos combinados foram lavados com NaHSO^ 0,25 M, secos sobre MgSO^ e evaporados até à secura. 0 produto em bruto foi purificado por cromatografia flash em gel de sílica em acetato de etilo a 30%/hexano, originando 1,40 g do pro duto desejado.

RMN (CDC1₃): é> 7,3 (5H, m) , 5,8 (2H, m) , 4,7 (lH, m), 4,2 (2H, d),

3,62 (3H, s), 3,1 (6H, m).

FAB-MS, m/z 318 (M+H)⁺.

6-(2-oxo-4-(fenilmetil)-3-oxazolidinil)-5-(fenilmetil)-trans-hex-3-enoato de (4S,55)-metil□

c) A oxazolidinona do Exemplo 93(b) (3,9 mmol) foi dissolvida em 50 ml de THF, e arrefecida até -782C. Foi adicionado hexametildi-silazeto de potássio (7,8 ml de 0,5 M em THF, 3,9 mmol), e a mistura foi agitada a -789C durante 15 min. Bromito

585

SKB CASE 14415

-147de benzilo (0,93 ml, 7,8 mmol) foi adicionado, e a mistura foi deixada aquecer até à temperatura ambiente e agitada durante toda a noite. A mistura reaccional foi concentrada, e o resíduo purificado por cromatografia de gravidade em gel de sílica, utilizando acetato de etilo a 20%/hexano, para produzir 0,38 g do produto desejado (e 0,09 g do isómero 5(R)

RMN (CDClj): 8 7,27 (lOH, m), 7,0 (2H, ra), 5,73 (2H, m), 4,75 (3H, m) 4,05 (2H, m), 3,60 (3H, s), 3,0 (7H, m).

FAB-MS: m/z 408 (M+H)⁺.

5-(fenilmetil)-trans-hex-3-enoato de (5S)-monometilo

d) A oxazolidinona alquilada do Exemplo 93(c) (0,38 g, 0,93 mmol) foi dissolvida em 13,9 ml de THF e 4,6 ml de água, e foi arrefecida até OSC. Foi adicionado peróxido de hidrogénio (0,63 ml de solução a 30%), seguido por hidróxido de litio (78,1 mg, 2 equiv.). Apés agitação a OSC durante 30 min, a reacção foi rapidamente extinguida pela adição de 4,5 ml de Na₂S0₃ 1,5 M. 0 THF foi removido sob pressão reduzida, e o pH da solução aquosa foi ajustado para pH 10 com NaHCO^, e lavada com acetato de etilo e éter. 0 pH foi então baixado para 1 com HCl 1 M e extraído com acetato de etilo. 0s extractos foram combinados, secos sobre Na₂S0^ e evaporados, originando o produto em bruto. A purificação por cromatografia flash em gel de sílica, utilizando ácido acè tico a 2%:clorofórmio, originou 50 mg do produto desejado.

RMN (CDC1₃): è 9,43 (lH, s), 7,25 (5H, m), 5,64 (2H, m), 3,65 (3H, s), 3,05 (5H, m).

(55)-monometil 5-(fenilmetil)-trans-hex-3-enamida

e) 0 ácido carboxílico do Exemplo 93(d) (50 mg, 0,2 mmol) foi dissolvido em 3 ml de tolueno e arrefecido até -5SC. Foi adi. cionada trietilamina (28 ml, 0,2 mmol), seguida por cloroformato de etilo (16 ml, 0,2 mmol). Após agitação durante uma hora a -5QC foi borbulhada amónia na solução, a qual foi então deixada aquecer até à temperatura ambiente e agitada durante 2 dias. A solução foi evaporada e o resíduo dissolvido em acetato de etilo, lavado com NaHCO^ 0,5 M e seco sobre MgSO^. A evaporação do solvente ori. ginou 50 mg do produto desejado.

585

SKB CASE 14415 c

fi

-148RMN (CDC1₃): £> 7,25 (5H, m), 5,84 (2H, m) , 3,68 (3H, s), 3,0 (5H, m).

5-amino-6-fenil-trans-hex-3-enoato ds (5S)-metilo

f) A carboxamida do Exemplo 93(e) foi dissolvida em acetonitrilo-água (4:l), e I,I-bis(trifluoroacetoxi)iodosobenzeno (l,5 equiv.) foi adicionado, e a reacção foi agitada à temperatura ambiente até estar completa. A mistura reaccional foi acidifi. cada até pH 2 com HC1 1 N e lavada com éter. 0 pH da soluçSo aquosa foi então ajustado para 10 com NaOH 1 N, e o produto foi extraído com acetato de etilo. Os extractos foram secos sobre Na2S0^ e evaporados, originando o produto desejado.

5-t-butiloxicarbonilamino-6-fenil-trans-hex-3-enoato de (5S)-metilo

g) 0 composto do Exemplo 93(f) foi dissolvido em DMF em conjunto com trietilamina (3 equiv.). Foi adicionado dicarbonato de di-t-butilo (3 equiv.) e a reacção foi deixada prosseguir à temperatura ambiente durante toda a noite. 0 solvente foi remo vido sob pressão reduzida e o produto foi purificado por cromatografia flash em gel de silica.

ácido (5S)-Boc-5-amino-6-fenil-trans-hex-3-Bn6ico

h) 0 composto do Exemplo 93(g) foi dissolvido em dioxano:NaOH 1 N 1:1 (l equiv. de NaOH) e agitado à temperatura ambieri te até a reacção estar completa. A solução foi acidificada com HC1 1 N e extraída com acetato de etilo para produzir o produto desejado.

Exemplo 94

Preparação de (55)-alanil-alanil-(5-amiηο-6-fenil-trans-hex-3-enoil)-vaiil-valinamida

A resina peptidilo protegida (55) Boc-Ala-Ala-(5-amino-6-fenil-trans-hex-3-enoil)-Val-Val-BHA foi preparada de acordo com o processo usual do Exemplo 1. A resina peptidilo é clivada e desprotegida por tratamento com 10 ml de HF liquido anidro/l ml de anisol, a OSC durante 1 hora. Após remoção do HF sob vácuo, a re sina foi lavada com éter dietílico, seca ao ar e extraída com

585

SKB CASE 14415

-149que foi liofilizado para em bruto foi purificado utilizando ácido acético x 50 ml de ácido acético glacial, duzir o péptido em bruto. 0 produto filtração em gel em Sephadex® G-15 so a 10% como eluente.

propor aquo

Exemplo 95

Preparação de Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH2

A resina peptidilo protegida Boc-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-l/al-Val-BHA foi preparada da maneira usual, numa escala de 0,5 mmol.

péptido foi clivado da resina com HF liquido anidro, a DSC durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. Os extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, produzindo 145 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto (100 mg) foi dissolvido em HOAc a 1% e purificado numa coluna de Sephadex^ G-15 de 2,6x70 cm. As fracções apropriadas foram reunidas e liofilizadas, produzindo 84,4 mg do produto purificado.

HPLC: k» = 2,95 (Hamilton PRP- 1® , CH-jCN a 5%/TFA a 0,1% a

CHjCN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min).

MS (FAB): m/z 590 (M+H)⁺.

Exemplo 96

Preparação de Ala-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH2

A resina peptidilo protegida Boc-Ala-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada da forma usual, numa escala de 0,5 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF líquido anidro, a OSC durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. Os extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, originando 136,6 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto .foi dissolv_i fi vv do em HOAc a 1% e purificado numa coluna de Sephadex^ G-15 de

2,6 x 70 cm. As fracções apropriadas foram reunidas e liofilizadas, produzindo 116,7 mg do produto purificado.

HPLC: k’ = 2,47 (Hamilton PRP-i®, CH₃CN a 5%/TFA a 0,1% a

CH₃CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min).

585

SKB CASE 14415 ,· Z-—eeçw-150MS (ΓΑΒ): m/z 661 (M+H)⁺.

Exemplo 97

Preparação de Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val

A resina peptidilo protegida Boc-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-resina de Merrifield foi preparada da maneira usual, numa escala de 0,5 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF liquido anidro, a OSC durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. Os extractos de HOAc foram diluídos com água e liofilizados, originando 248,8 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto foi dissolvido em HOAc a 1% e purificado numa coluna de Sephadex® G-15 de 2,6 x 70 cm. As fracções apropriadas foram reunidas e liofilizadas, para produzir 58,8 mg do produto purificado.

HPLC: k* = 2,86 (Hamilton PRP-1® , CH^CN a 10%/TFA a 0,1% a

CH CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min).

MS (FAB): m/z 806 (M+H)⁺

Exemplo 98

Preparação de Ser-Gln-Asn-Cha-Pro-Val-Val-I\IH2

A resina peptidilo protegida Boc-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Cha-Pro-Val-Val-BHA foi preparada da maneira usual, numa escala de 0,5 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF líquido anidro, a OSC durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. Os extractos de HOAc foram diluídos com água e 1iofilizados, originando 316 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto (100 mg) foi dissolvido em HOAc a 1% e purificado numa coluna de Sephadex® G-15 de 2,6 x 70 cm. As fracções apropriadas foram reunidas e liofilizadas, para produzir 88,1 mg do produto purificado.

HPLC: k' = 3,31 (Hamilton PRP-1® , CH₃CN a 5%/TFA a 0,1% a

CH₃CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min)

MS (FAB): m/z 795 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: Asp 1,00, Ser 0,72, Glu 1,02, Pro 0,97, Vai 2,01.

5Β5

SKB CASE 14415

-151Exemplo 99

Preparação de Ac-Ser-Gln-Asn—Cha-Pro-Val-Val-NH2

A resina peptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Cha-Pro-Val-Val-BHA foi preparada da forma usual, numa escala de 0,5 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF líquido anidro, a 0°C durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. Os extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, originando 280 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto (100 mg) foi dissolvido em HOAc a 1% e purificado numa coluna de Sephadex® G-15 de 2,6 x 70 cm. As fracçães apropriadas, foram reunidas e liofilizadas produzindo 74,1 mg do produto purificado.

HPLC: k' = 3,27 (Hamilton PRP-1® , CH₃CN a 5%/TFA a 0,1% a

CH₃CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min)

MS (FAB): m/z 837 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: Asp 1,00, Ser 0,75, Glu 0,99, Pro 0,96, Vai 1,90.

Exemplo 100

Preparação de Ac-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-I\IH2

A resina peptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-G1n-Asn-Tyr(Bzl) -Pro-Val-BHA foi preparada da forma usual numa escala de 1,0 mmol 0 péptido foi clivado da resina com HF líquido anidro, a 03C durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. 0s extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, originando 145 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto (130 mg) foi dissolvido em HOAc a 1% e purificado numa coluna de Sephadex® G-15 de

2,6 x 70 cm. As fracçães apropriadas foram reunidas e liofilizadas, produzindo 101 mg do produto purificado.

MS (FAB): m/z 748,7 (M+H)⁺

HPLC: k' = 2,08 (Hamilton PRP-1®, CH CN a 5%/TFA a 0,1% a

CH₃CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min).

Análise dos aminoácidos: Asp 1,00, Ser 0,55, Glu 0,98, Pro 1,19, Vai 0,95, Tyr 0,99.

585

SKB CASE 14415

-152Exemplo 101

Preparação de Ac-Asp-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Arg-NH2

A resina peptidilo protegida Ac-Asp(OBzl)-Gln-Asn-Tyr(BrZ) -Pro-Val-Arg(Tos)-BHA foi preparada da forma usual numa escala de 0,5 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF liquido anidro, a OSC durante 1 hora. Apôs remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. Os extractos do HOAc foram diluidos com água e liofilizados, originando 404 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto (100 mg) foi dissolvido em HOAc a 1% e purificado numa coluna de Sephadex®

G-15 de 2,6 x 70 cm. As fracçães apropriadas foram reunidas e liofilizadas, produzindo 84,2 mg do produto parcialmente purifica do. 0 péptido parcialmente purificado foi adicionalmente purificado por HPLC preparativa (Hamilton PRP-1®, CH^CN a 11%/TFA a 0,1%) para produzir 78,8 mg do produto purificado.

HPLC: k' = 2,04 (Hamilton PRP-1^R , CH CN a 5%/TFA a 0,1% a

CH₃CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min)

MS (FAB): m/z 932 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: Asp 1,88, Glu 0,90, Pro 0,76, Vai 1,00, Tyr 0,33, Arg 1,01.

Exemplo 102

Preparação de Asp-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH2

A resina peptidilo protegida, Boc-Asp(OBzl)-Gln-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada da forma usual numa escala de 1,0 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF líquido anidro, a 09C durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. Os extractos do HOAc foram diluídos com-água e liofilizados, originando 671 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto (100 mg) foi dissolvido em HOAc a 1% e purificado numa coluna de Sephadex®

G-15 de 2,6 x 70 cm. As fracçães apropriadas foram reunidas e liofilizadas, produzindo 74,5 mg do produto purificado.

HPLC: k' = 2,44 (Hamilton PRP-1®, CH CN a 5%/TFA a 0,1% a

CH₃CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min)

585

SKB C,ASE 14415

-153MS (FAB): m/z 833 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: Asp 2,00, Glu 0,98, Pro 0,96, Vai 2,04, Tyr 0,34.

Exemplo 103

Preparação de Ac-Ala-Ala-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH2

A resina peptidilo protegida Ac-Ala-Ala-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada da forma usual numa escala de 0,5 mmol. 0 pêptido foi clivado da resina com HF liquido anidro, a OSC durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. Os extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, originando o produto em bruto.

Exemplo 104

Preparação de Ac-Ala-Gln-Gly-Tyr-Pro-Val-Val-NH2

A resina peptidilo protegida Ac-Ala-Gln-Gly-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada da forma usual numa escala de 0,5 mmol. 0 pêptido foi clivado da resina com HF líquido anidro, a OSC durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. 0s extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, originando 275 mg do produto em bruto. 0 pêptido em bruto foi purificado por distribuição em contracorrente utilizando o sistema n-BuOH-HOAc-HgO 4:1:5, produzindo 235 mg do produto purificado.

HPLC: k' = 4,48 (Beckman Ultrasphere® ODS, CH^CN a 5%/TFA a 0,1% a CH^CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min)

MS (FAB): m/z B31 (M+H) ⁺

Análise dos aminoácidos: Asp 1,02, Glu 1,00, Pro 0,97, Vai 1,23, Tyr 0,87, Ala 1,04.

Exemplo 105

Preparação de D-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH2

A resina peptidilo protegida Boc-D-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada da forma usual numa escala de

585

SKB CASE 14415

-1540,5 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF liquido anidro, a OSC durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HQAc a 10%. Os extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, originando 271 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto (98 mg) foi dissolvido em HOAc a 10% e purificado numa coluna de Sepha dex®

G-15 de 2,6 x 70 cm. As fracções apropriadas foram reunidas e liofilizadas, produzindo 73 mg do produto purificado.

HPLC: k’ = 4,45 (Beckman Ultrasphere® ODS, CH^CN a 5%/TFA a

0,1% a CH^CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min)

MS (FAB): ra/z 805 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: Asp 1,00, Glu 0,99, Pro 1,11, Vai 1,89, Tyr 0,57, Ser 0,68.

Exemplo 106

Preparação de Ac-D-Ser-Gly-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH2

A resina peptidilo protegida Ac-D-Ser(Bzl)-Gly-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada da forma usual numa escala de

0,5 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF líquido anidro, a OSC durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraida com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. 0s extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, originando 248 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto (93 mg) foi dissolvido em HOAc a 10% e purificado numa coluna de Sephadex¹

G-15 de 2,6 x 70 cm. As fracções apropriadas foram reunidas e liofilizadas, produzindo 75 mg do produto purificado.

HPLC: k' = 4,16 (Beckman UltrasphereQl) ODS, CH^CN a 5%/TFA a 0,1% a CH^CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min)

MS (FAB): m/z 847 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: Asp 1,00, Ser 0,67, Glu 0,99, Pro 0,93, Vai 2,00, Tyr 0,30.

Exemplo 107

Preparação de Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ala-Val-NH2

A resina peptidilo protegida Boc-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Tyr(BrZ)

505

SKB CASE 14415

-155Pro-Ala-Val-BHA foi preparada da forma usual numa escala de 0,5 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF líquido anidro, a 0°C durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. Os extractos do HOAc foram diluídos com égua e 1 iof il izados, originari do 202 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto (102 mg) foi dissolvido em HOAc a 1% e purificado numa coluna de Sephadex^ G-15 de 2,6 x 70 cm. As fracçSes apropriadas foram reunidas e liofilizadas, produzindo 74 mg do produto purificado.

HPLC: k’ = 3,96 (Beckman Ultrasphere® ODS, CH^CN a 5%/TFA a

0,1% a CH^CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min)

MS (FAB): m/z 777 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: Asp 1,05, Ser 0,91, Glu 1,00, Ala 1,02, Pro 0,66, Vai 1,09, Tyr 0,61.

Exemplo 108

Preparação de Ac-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Gly-Val-NH2

A resina peptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Tyr(SrZ) -Pro-Gly-Val-BHA foi preparada da forma usual numa escala de 0,5 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF líquido anidro, a 03C durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. Ds extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, originando 153 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto (100 mg) foi dissolvido em HOAc a 10% e purificado numa coluna de Sephadex® G-15 de 2,6 x 70 cm. As fracçSes apropriadas foram reunidas e liofilizadas, produzindo 76 mg do produto purificado.

HPLC: k' = 3,87 (Beckman Ultrasphere® ODS, CH^CN a 5%/TFA a

0,1% a CH-jCN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min)

MS (FAB): m/z 805 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: Asp 1,00, Ser 0,84, Glu 0,95, Gly 1,00, Pro 0,97, Vai 1,06, Tyr 0,77.

Exemplo 109

Preparação de Ac-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-Arg-NHo

585

SKB CASE 14415 fl .·<

-156A resina peptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-Arg(Tos)-BHA foi preparada da forma usual numa escala de 0,5 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF liquido anidro, a 09C durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. Os extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, originando 329 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto foi purificado por distribuição em contracorrente no sistema de n-Bu0H-H0Ac-H₂0 4:1:5. As fracçães apropriadas foram reunidas e liofilizadas, produzindo 172 mg do produto purificado.

MS (FAB): m/z 1003 (M+H)⁺

HPLC: k* = 3,71 (Beckman Ultrasphere® C , CH CN a 5%/TFA a lo >

0,1% a CH^CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min).

Análise dos aminoácidos: Asp 1,00, Ser 0,73, Glu 0,98, Pro 0,98, Vai 1,84, Tyr 1,01, Arg 0,99.

Exemplo 110

Preparação de Ac-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Glu-Val-NH2

A resina peptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-G1n-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Glu(OBzl)-Val-BHA foi preparada da forma usual numa escala de 0,5 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF líquido anidro, a 09C durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lava da com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%.

Os extractos do HOAc foram diluídos com água e 1iofilizados, originando 1B4 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto (92 mg) foi dissolvido em HOAc a 10% e purificado numa coluna de Sephadex® G-15 de 2,6 x 70 cm. As fracçães apropriadas foram reunidas e liofilizadas, produzindo 64 mg do produto purificado.

HPLC: k’ = 3,83 (Beckman Ultrasphere® ODS, CH^CN a 5%/TFA a

0,1% a CH₃CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min)

MS (FAB): m/z 877 (M+H) ⁺

Análise dos aminoácidos: Asp 1,00, Ser 0,77, Glu 2,03, Pro 0,87, Vai 1,08, Tyr 1,01.

585

SKB CASE 14415

-157Exemplo 111

Preparação de Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Glu-Val-NH2

A resina péptidilo protegida Boc-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-Glu(OBzl)-Val-8HA foi preparada da forma usual numa escala de 0,5 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF líquido anidro, a OSC durante 1 hora. Apés remoção do HF, a resina foi lava da com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%.

Os extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, originando 216 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto (91 mg) foi dissolvido em HOAc a 10% e purificado numa coluna de Sephadex® G-15 de 2,6 x 70 cm. As fracçães apropriadas foram reunidas e liofilizadas, produzindo 67 mg do produto purificado.

HPLC: k' = 3,35 (Beckman Ultrasphere® ODS, CH^CN a 5%/TFA a

0,1% a CH₃CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min)

MS (FAB): m/z 835 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: Asp 0,97, Ser 0,90, Glu 2,03, Pro 1,00, Vai 0,84.

Exemplo 112

Preparação de Ac-Ser-Gln-Gly-Tyr-Pro-Lys-Val-NH2

A resina péptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Gln-Gly-Tyr(BrZ)~ -Pro-LysíCl^Z^Val-BHA foi preparada da forma usual numa escala de 0,5 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF liquido anidro, a OSC durante 1 hora. Apés remoção do HF, a resina foi lav.a da com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%.

0s extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, originando 280 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto foi purificado por distribuição em contracorrente utilizando o sistema n-BuOH-HOAc-H^0 4:1:5, produzindo 242 mg do produto purificado.

HPLC: k’ = 4,41 (Beckman Ultrasphere® ODS, CH₃CN a 5%/TFA a

0,1% a CH₃CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min)

MS (FAB): m/z 876 (M+H) ⁺

Análise dos aminoácidos: Asp 1,00, Ser 0,68, Glu 1,01, Pro 0,82, Vai 1,14, Tyr 1,06, Lys 1,00.

585

SKB CASE 14415

-158Exemplo 113

Preparação de Ac-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-NH2

A resina peptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Tyr(BrZ) -Pro-BHA foi preparada da forma usual numa escala de 1,0 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF liquido anidro, a OSC durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. Os extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, originando 400 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto (100 mg) foi dissolvido em HOAc a 1% e purificado numa coluna de Sepha dex® G-15 de 2,6 x 70 cm. As fracçães apropriadas foram reunidas e liofilizadas, prodjj zindo 92,8 mg do produto purificado.

MS (FAB): ra/z 649 (M+H)⁺

HPLC: k· = 1,57 (Hamilton PRP-1®, CH₃CN a 5%/TFA a 0,1% a CH₃CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min)

Análise dos aminoácidos: Asp 1,00, Ser 0,92, Glu 1,03, Pro 0,87, Tyr 0,95.

Exemplo 114

Preparação de Ac-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-Gln-Asn-NH2

A resina peptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Tyr(BrZ) -Pro-Val-Val-Gln-Asn-BHA foi preparada da forma usual numa escala de 1,0 mmol. 0 péptido foi clivado da resina, com HF líquido ani dro, a OsC durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lav.a da com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%.

0s extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, originando 862 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto foi purificado por distribuição em contracorrente no sistema de n-Bu0H-HOAc-H^O 4:1:5. As fracçães apropriadas foram reunidas e liofilizadas, originando 713 mg do produto purificado.

MS (FAB): m/z 1089 (M+H)⁺

HPLC: k’ = 2,17 (Hamilton PRP-1 , CH₃CN a 5%/TFA a 0,1% a

CH CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min)

Análise dos aminoácidos: Asp 1,81, Ser 0,97, Glu 2,00, Pro 0,88, Vai 1,81, Tyr 1,23.

5Θ5

SKB CASE 14415

-159Exemplo 115

Preparação de Ac-Ser-Gln-Asn-Phe-Pro-Val-Val-NH₂

A resina peptidilo protegida Ac-Ξer(Szl)-Gln-Asn-Phe-Pro-Val-Val-BHA foi preparada da forma usual numa escala de 1,0 mmol. 0 péptido foi clivada da resina com HF liquido anidro, a OaC durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. Os extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, originando 573 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto (30 mg) foi purificado por HPLC preparativa (Hamilton PRP-1® , CH^CN a 17%/TFA a 0,1%), originando 24,5 mg do produto purificado.

MS (FAB): m/z B31 (M+H)⁺

HPLC: k' = 3,02 (Hamilton PRP-1® , CH^CN a 5%/TFA _a 0,1% a

CH^CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min).

Análise dos aminoácidos: Asp 1,06, Ser 0,86, Glu 1,00, Pro 1,02, Vai 1,95, Phe 1,00.

Exemplo 116

Preparação de Boc-L-valina isopropilamida

Boc-L-valina (0,5 g, 2,3 mmol) foi dissolvida em 25 ml de DMF em conjunto com isopropilamina (0,39 ml, 4,6 mmol), hexafluorofosfato de benzotriazol-l-iloxitris(dimetilamino)-fosfónio (2,03 g, 4,6 mmol), l-hidroxibenzotriazol (0,62 g, 4,6 mmol) e diisopro piletilamina (l,2 ml, 6,9 mmol). A reacção foi agitada à tempera tura ambiente durante 2 horas, e, em seguida, foi evaporada até à secura. 0 resíduo foi dissolvido em acetato de etilo e lavado com NaHSO^ 1 N, NaHCO^ 1 N e água e, em seguida, seco sobre Na₂S0^ 0 solvente foi removido sob pressão reduzida, originando 0,53 g dc produto em bruto. 0 produto foi purificado por cromatografia flash em gel de sílica, utilizando MeOH a 25%/CHCl^, produzindo 358 mg do produto purificado.

MS (DCI), m/z 259 (M+H)⁺

RMN (CDCl^): £> 0,90 ppm, d, 0,98 ppm d, 6H; 1,16 ppm, d, 6H;

1,35 ppm, s, 9H; 4,1 ppm, dd, 1H; 5,25 ppm, d, 1H; 6,14 ppm, d, 1H.

5Β5

SKB CASE 14415

-160Exemplo 117

Preparação de Ac-Tyr-Pro-l/al-l/al-NHg

A resina peptidilo protegida Ac-Tyr(BrZ)-Pro-Val-Val-BHA foi preparada da forma usual, numa escala de 0,5 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF liquido anidro, a OSC durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e ex. traída com 3 x 30 ral de HOAc a 10%. Os extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, originando 98,7 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto foi dissolvido em HOAc a 1% e purifi. cado numa coluna de Sephadex® G-15 de 2,6 x 70 cm. As fracções apropriadas foram reunidas e liofilizadas, produzindo 78,5 mg do produto purificado.

HPLC: k· = 2,96 (Hamilton PRP-1® , CHjCN a 5%/TFA a 0,1% a

CH₃CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min).

MS (FAB): m/z 51B (M+H)⁺

Exemplo 118

Preparação de Ac-Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-NH2

A resina peptidilo protegida Ac-Arg(Tos)-Ala-Ser(Bzl)~ -Gln-Asn-Tyr(BrZ)-Pro-BHA foi preparada da forma usual numa escala de 1,0 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF líquido anidro, a OSC durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. Os extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, originando 621 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto foi pjj rificado por distribuição em contracorrente no sistema de n-BuOH-EtOAc-HOAc-HgO 2:2:1:5. As fracções apropriadas foram reunidas e liofilizadas, produzindo 549 mg do produto pareialmente purificado. Este péptido parcialmente purificado (100 mg) foi dissolv_i do em HOAc a 10% e purificado numa coluna de Sephadex® G-15 de

2,6 x 70 cm. As fracções apropriadas foram reunidas e liofilizadas, produzindo 94 mg do produto purificado.

MS (FAB): m/z 876 (M+H)⁺

HPLC: k' = 2,78 (Beckman Ultrasphere® C^_g, CH-jCN a 5%/TFA a 0,1%

5Β5

SKB CASE 14415

-161a CH₃CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min).

Análise dos aminoácidos: Asp 1,00, Ser 1,03, Glu 1,01, Pro 0,91, Ala 1,02, Arg 0,99, Tyr 0,94.

Exemplo 119

Preparação de Aç-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro

A resina peptidilo protegida Ac-Ser(Bzl)-Gln-Asn-Tyr(BrZ) -Pro-resina de Merrifield foi preparada da forma usual, numa esca la de 1,0 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF líquido anidro a OSC durante 1 hora. Apés remoção do HF, a resina foi la vada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. 0s extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, produzindo 458,5 mg do produto em bruto, o qual foi utilizado sem ca racterização posterior.

Exemplo 120

Preparação de Aç-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-HNiPr

Boc-Val isopropilamida 1034 (24,4 mg, 154 mmol) foi desprotegida por tratamento com TFA a 50%/CH^Cl^, durante 20 min à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi evaporada até à secura e o resíduo foi evaporado, seis vezes, a partir de CH₂C1₂ , tratado com diisopropilamina a 7%/CH₂Cl₂ e evaporado três vezes e em seguida, evaporado quatro vezes a partir de CH^Cl^ 0 resíduo foi dissolvido em 25 ml de DMF, em conjunto com o péptido 1035 (50 mg, 77 mmol), hexafluorofosfato de benzotriazol-l-iloxitros(dimetilamino)fosfónio (68 mg, 154 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (20,8 mg, 154 mmol) e diisopropiletilamina (40,2 ml, 231 mmol) e a reacção foi deixada prosseguir durante toda a noite à temperatu ra ambiente. A mistura reaccional foi evaporada até à secura e o resíduo foi dissolvido em MeOH e purificado por HPLC preparativa (Beckman Ultrasphere® ODS, CH₃CN a 5%/TFA a 0,1% a CH₃CN a 40%/ /TFA a 0,1%, 15 min), originando 41 mg do péptido purificado.

HPLC: k' = 4,97 (Beckman Ultrasphere® ODS, CH₃CN a 5%/TFA a 0,1 a CH₃CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min)

MS (FAB): m/z 790,5 (M+H)⁺

585

SKB CASE 14415

J

-162Análise dos aminoácidos: Asp 1,00, Ser 0,72, Glu 1,02, Pro 1,13, Vai 0,65, Tyr 0,83.

Exemplo 121

Preparação de Ac-Arg-Lys-Ile-Leu-Phe-Leu-Asp-Gly-Nl·^

A resina peptidilo protegida Boc-Arg(Tos)-Lys(Cl2Bzl)-Ile-Leu-Phe-Leu-Asp(OBzl)-Gly-BHA foi preparada da forma usual numa escala de 1,0 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HF líqui do anidro, a OSC durante 1 hora. Após remoção do HF, a resina foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. Os extractos do HOAc foram diluídos com água e liofilizados, originando 520 mg do produto em bruto. 0 péptido em bruto foi purificado por distribuição em contracorrente no sistema de n-Bu0H-H0Ac-H20 4:1:5. As fracçães apropriadas foram reunidas e liofilizadas, produzindo 440 mg do produto parcialmente purificado. 0 péptido parcialmente purificado (50 mg) foi adicionalmente purificado por HPLC preparativa (Hamilton PRP-1® , CH^CN a 23%/ /TFA a 0,1%) para produzir 37,5 mg do péptido purificado.

HPLC: k' = 3,81 (Hamilton PRP-1® , CH CN a 5%/TFA a 0,1% a

CH^CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min)

MS (FAB): m/z 1002 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: Asp 1,00, Gly 1,05, Ile 0,91, Leu 2,0B, Lys 0,94, Arg 1,07, Phe 1,29.

Exemplo 122

Preparação de Ac-Arg-Lys-Ile-Leu-(4'NO2)Phe-Leu-Asp-Gly-NH2

A resina peptidilo protegida Ac-Arg(Tos)-Lys(Cl2Z)-Ile-Leu-(4'NO2)Phe-Leu-Asp(OBzl)-Gly-BHA foi preparada da forma usual numa escala de 1,0 mmol. 0 péptido foi clivado da resina com HE liquido anidro, a OSC durante 1 hora. Após remoção do HF, a resj. na foi lavada com éter, seca ao ar e extraída com 3 x 30 ml de HOAc a 10%. 0s extractos do HOAc foram diluídos com água e liofi lizados, originando 980 mg do produto em bruto. 0 péptido em brjj to foi purificado por distribuição em contracorrente utilizando o sistema de n-BuOH-HOAC-H20 4:1:5, produzindo 853 mg do produto

585

SKB CASE 14415

Ϊ.

-163parcialmente purificado. 0 péptido parcialmente purificado (50 mg) foi adicionalmente purificado por HPLC preparativa (Hamilton PRP-1®, CH^CN a 23%/TFA a 0,1%) originando 43,4 mg do péptido purificado.

HPLC: k’ = 3,87 (Hamilton PRP-1®, CH₃CN a 5%/TFA a 0,1% a CH₃CN a 40%/TFA a 0,1%, 15 min)

MS (FAB): m/z 1047,7 (M+H)⁺

Análise dos aminoácidos: Asp 1,00, Gly 1,04, Ile 0,89, Leu 2,00, Arg 0,91, (4’N0₂)Phe 0,97, Lys 0,91.

Exemplo 123

Preparação de ácido (4S,55)-5-(terc-butildimetilsiloxi)-5-(terc-butiloxicarbonil)-amino-6-fenil-hexanéico (S)-terc-butiloxicarbonilfenilalanina N-metoxi-N-metil amida

a) 0 composto do titulo foi preparado seguindo o processo de Org. Syn., 67, 69 (1988), excepto pela utilização de Boc-(L)-Phe em lugar de Boc-(L)-Leu.

/~a_7365 = ⁺ 349 (^c 1» etanol).

Í6S).-5 -oxo-6-(terc-butiloxicarbonil)amiηο-7-fenil-hept-l-eno

b) Um frasco de 3 gargalos de 2 litros, seco à chama adaptado com um agitador mecânico, termómetro, condensador, borbu lhador de ar, e um funil de adição contendo 4-bromo-l-buteno puro (90,2 ml, D,BB9 mol), foi carregado com pó de Mg (32 g, 1,3 mol), e éter seco (600 ml). Uma fracção de 2 ml do bromobuteno foi ad_i cionada e a mistura sob agitação foi aquecida até 309C com um banho de água até que a reacção se iniciasse (cerca de 5 min). 0 restante do bromobutano foi então adicionado durante 1,5 hora, a uma velocidade tal que foi mantido um refluxo suave. A mistura foi aquecida até ao refluxo durante mais 30 min, sendo, em seguida, arrefecida até 59C. Uma solução do composto do Exemplo 123 (a) (54,0 g, 0,175 mol) em éter (130 ml) foi adicionada em fracções durante 15 min, com a temperatura da reacção mantida abaixo de 129C. Após 1 hora de agitação vigorosa a 59C, a mistura foi vertida cautelosamente em 500 ml de HC1 3 N frio (5-109C). As ca madas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com duas por

585

SKB CASE 14415

-164çães de 200 ml de éter. As camadas orgânicas combinadas foram la vadas com NaHCO^ a 5% e salmoura, em seguida foram secas sobre MgSO^, filtradas e concentradas por evaporação rotatória, originando o produto em bruto (49,4 g, 0,163 mol, rendimento de 93%) como um sólido branco, suficientemente puro para utilização na próxima reacção. Uma porção do produto foi purificada por croma tografia flash (sílica, acetato de etilo a 10% em hexano) para análise.

p.f.: 74-7590 = -36,89 (c 1, etanol).

ácido (55)-4-oxo-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-6-fenil-hexanóico

c) 0 composto do Exemplo 123(b) (45,0 g, 0,14B mol) foi rapidamente agitado com benzeno (550 ml), água (550 ml) e ácido acético (115 ml), a 39C. Foi adicionado brometo de tetrabutilamó nio (490 mg), seguido por KMnO^ (83 g). A mistura sob agitação foi deixada aquecer até à temperatura ambiente. Após 2,5 horas, mais KMnO^ (14 g) foi adicionado. Após 30 min adicionais, a mistura reaccional foi arrefecida até 590 e 500 ml de KHSO^ aquoso saturado foram adicionados. A mistura foi agitada durante 30 min e, em seguida, filtrada. As camadas foram separadas, a camada aquosa foi extraída com quatro porçães de 200 ml de acetato de etilo. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secas sobre MgSO^, filtradas e concentradas até um óleo. 0 óleo foi cristalizado a partir de 350 ml de hexano: acetato de et_i lo 6:1, originando o composto do título (33,3 g, rendimento de 70%) como um sólido branco.

Za_7_D = -36,19.

ácido (5S)-4-oxo-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-6-fenil-hexanóico, éster de benzilo

d) A uma solução agitada do composto do Exemplo 123(c) (33,2 g) em acetonitrilo (500 ml), a 490, foi adicionado diazabicicloundecano (15,7 g) , seguido por brometo de benzilo (26,0 g).

A mistura foi agitada com aquecimento até à temperatura ambiente durante 3 horas, em seguida foi concentrada até 70 ml por evapora ção rotatória. A mistura foi diluída com CF^C^, lavada com HCl

585

SKB CASE 14415

-1651 N, NaHCOj a 5%, e salmoura, seca sobre MgSO^ e concentrada até um sólido amarelo. 0 sólido foi triturado com éter:hexano 3:1, originando o composto do titulo (33,Og, rendimento de 78%). p.f.: 86-87,530

Γ^-Ja = -27,0= éster de benzilo do ácido (45,55)-4-(terc-butildimetilsiloxi)-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-6-fenil-hexanóico

e) Uma solução do composto do Exemplo 123(d) (28,0 g) em metanol (840 ml) foi arrefecida até 53C, e NaBH^ (l,30 g) foi adj. cionado, numa porção, com agitação. Após 30 min, foi adicionado ácido acético (10 ml) e a mistura foi concentrada por evaporação rotatória, em seguida, foi diluida com CH^Cl^ e lavada com água.

A camada orgânica foi seca (Na2S0^) e concentrada, fornecendo os álcoois diastereoméricos em bruto como um sólido branco (27,7 g, rendimento de 99%). Os álcoois em bruto foram dissolvidos em DMF (140 ml) em conjunto com imidazol (17,7 g) e cloreto de terc-butildimetilsililo (20,7 g). A mistura foi deixada repousar à temperatura ambiente durante 3 dias, em seguida foi diluida com 300 ml de HCI 1 N frio e extraída com seis porções de 100 ml de ^^2^^2* e^ractos prgânicos combinados foram lavados com x 100 ml de água, secos (Na2S0^) e concentrados sob vácuo, um aquecimento até 40QC, para fornecer um óleo (42 g). 0s dois isómeros foram separados por HPLC preparativa em quatro porções iguai em 2,5 kg de sílica Vydac HS (2,54 cm χ 1 m), utilizando hexano: :acetato de etilo 90:10 a 200 ml/ min, originando 9,0 g do compos to do titulo como um óleo.

HPLC: RT 9,18 min (isómero 45), 12,2 min (isómero 4R) (YMC silica A-003, 4,6 mm x 25 cm, detecção com UV a 254 nm, hexano:acetato de etilo 91:9, 1,0 ml/min), (4R):(4S) - 3:1.

Z~^a_7_D = -14,4 3 ácido (45,55)-4-(terc-butildimetilsiloxi)-5-(terc-butiloxicarbonil)-amino-6-fenil-hexanóico

f) 0 composto do Exemplo 123(e) (7,7 g) foi dissolvido em acetato de etilo (150 ml) com Pd a 5% em carbono (0,75 g) e foi agitado sob 1,72 χ 10⁵ Pa de H2 durante 4 horas. A mistura

585

SKB CASE 14415

-166foi Filtrada através de Celite® e concentrada sob vácuo, com aquecimento, para fornecer o composto do titulo como um vidro incolor (6,3 g, rendimento de 98%).

Z“a_7_D = -24,7°.

Exemplo 124

Preparaçao de (5S)-benziloxicarbonilalanil-alanil-(5-amino-6-fenil- trans-hex- 3-e noil ) -vai il- valinamida composto do Exemplo 94 foi dissolvido em DMF ao qual fç> rara adicionados 2 equiv. de trietilamina e 1,5 equiv, de N-(benz_i loxicarboniloxi)succinimida. A extensão da reacção foi monitorizada por HPLC e o produto foi purificado directamente a partir da mistura reaccional por HPLC preparativa, utilizando um sistema de acetonitrilo-água-ácido trifluoroacético a 0,1%, numa coluna de Hamilton PRP- 1® de polistireno.

Exemplo 125

Preparação de (5S)-benziloxicarbonilalanil-alanil-(5-amino-6-feni l-cis-3, 4- di-hidroxi- hexano il) -vai il-vali na mi da composto do Exemplo 124 foi dissolvido em THF em conjun to com N-óxido de N-metilmorfolina (3 equiv.). Tetróxido de ósmio (0,04 equiv. de uma solução a 2,5% em n-butanol) é adicionado e a reacção foi deixada prosseguir à temperatura ambiente. Quando a reacção se completou, a mistura reaccional foi repartida entre acetato de etilo e salmoura, a salmoura foi lavada back-uiashed com acetato de etilo, e as camadas do acetato de etilo combinadas foram lavadas com Na^SO^ a 10%, NaHSO^ 1 N, secas sobre e evaporadas para originar o produto em bruto como uma mistura de álcoois cis diastereoméricos. Os produtos foram purificados por HPLC preparativa, utilizando um sistema de acetonitri. lo-água-ácido trifluoroacético a 0,1%, numa coluna Hamilton PRP-1® de polistireno.

585

SKB CASE 14415 <_r

-167Exemplo 126

Preparação de (45,55)-alanilalanil-(6-fenil-5-amino-4-hidróxi-hexanoil)-valil-valina

A resina peptidilo protegida (4S,5S) Boc-Ala-Ala-(6-fenil -5-amino-4-t-butildimetil-sililoxi-hexanoil)-l/al-l/al-resina de Merrifield foi preparada de acordo com o processo usual. A resina peptidilo foi clivada e desprotegida por tratamento com 10 ml de HF líquido anidro/l ml de anisol, a Q8C durante 1 hora. Após remoção do HF sob vácuo, a resina foi lavada com éter dietílico, seca ao ar e extraída com 2 x 50 ml de ácido acético glacial, o qual foi liofilizado para produzir o péptido em bruto. 0 produto em bruto foi purificado por filtração em gel em Sephadex® G-15, utilizando ácido acético aquoso a 10% como eluente.

Exemplo 127

Preparação de (4S,5S)-benziloxicarbonilalanil-alanil-(6-fenil-5-amino-4-hidroxi-hexanoil)-valil-vaiina composto do Exemplo 126 foi dissolvido em DMF, ao qual foram adicionados 2 equiv. de trietilamina e 1,5 equiv, de N-(be_n ziloxicarbcniloxi)succinimida. A extensão da reacção foi monitorizada por HPLC e o produto foi purificado directamente a partir da mistura reaccional por HPLC preparativa, utilizando um sistema de acetonitrilo-água-ácido trifluoroacético a 0,1%, numa coluna Hamilton PRP- 1® de polistireno.

Exemplo 128

Preparação <le (4S,55)-benziloxicarbonilalanil-alanil-(6-fenil-5-amino-4-hidroxi-hexanoil)-yalil-valil-(5-aminopentil)amida mono-Boc-1,5-diaminopentano

a) Uma solução de 1,5-diaminopentano (14,0 ml, 120 mmol) em 70 ml de CH^Cl^ foi tratada com dicarbonato de di-t-butilo (7,24 g, 33,2 mmol), a 08C, e foi, em seguida, agitada durante to da a noite à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi diluída com 75 ml de CHCl^, lavada com carbonato de sódio aquoso a 5%, seca sobre MgSO^ e evaporada. 0 resíduo foi dissolvido num

585

SK3 CASE 14415

-168volume mínimo de HC1 1 N (10 ml) e lavado com éter dietilico. A camada aquosa foi então alcalinizada até pH 10 com NaOH 2 N e extraída com acetato de etilo. Os extractos foram combinados, secos sobre MgSO^ e evaporados para originar 1,6 g do produto desejado.

RMN (CDC1₃): S 1,43 (17 H, br. s), 2,53-2,83 (2 H, m), 2,90-3,10 (2H, m), 4,80-5,10 (lH br. s).

MS (CI): m/z 237 (M+Cl).

(4S,5S)-benziloxicarbonilalanil-alanil-(6-fenil-5-amino-4-hidroxi-hexanoil)-valil-valil-(5-aminopentil)amida

b) 0 composto do Exemplo 126 foi dissolvido em DMF com mono-Boc-1,5-diamino-pentano (3 equiv.), 1-hidroxibenzotriazol (l,5 equiv.) e diisopropilcarbodiimida (l,5 equiv.), β a reacção foi agitada à temperatura ambiente e monitorizada por HPLC. Quando a reacção se completou, a mistura reaccional foi evaporada até à secura e o residuo foi tratado com ácido trifluoroacético, a OSC durante 30 minutos. 0 ácido trifluoroacético foi removido sob pressão reduzida, e o residuo foi dissolvido em metanol e purificado por HPLC de fase invertida, utilizando um sistema de ace tonitrilo-água-ácido trifluoroacético a 0,1%, numa coluna Hamilton PRP- 1® de polistireno.

Exemplo 129

Preparação de (4S,5S)-benziloxicarbonilaianil-alanil-(6-fenil-5-amino-4-hidroxi-hexanoil)-valil-valil-(5-quanidinopentil)amida composto do Exemplo 128 foi dissolvido em água, e o pH foi ajustado para 10 com NaOH 3 N. Após arrefecimento até OSC, foi adicionada uma solução aquosa de sulfato de 0-metilisoureia ajustada para pH 10 com NaOH 3 N. A reacção foi monitorizada por HPLC e o pH foi continuamente ajustado para 10 com a adição de NaOH 3 N. Após conclusão da reacção, o pH foi diminuído para 4,5 pela adição de ácido acético a 1%, e o produto foi purificado por HPLC de fase invertida, utilizando um sistema de acetonitrilo-águja -ácido trifluoroacético a 0,1%, numa coluna Hamilton PRP-l® de polistireno.

585

SKB CASE .14415

-169Exemplo 130

Preparação de (4S ,55)-alanil-alanil-(6-fenil-5-amino-4-hidroxi-hexanoil)-valil-valinamida

A resina peptidilo protegida (4S,5S) Boc-Ala-Ala-(6-fenil-5-araino-4-t-butildimetil-sililoxi-hexanoil)-Ual-Ual-BHA foi preparada de acordo com o processo usual do Exemplo 1. A resina peptidilo foi clivada e desprotegida por tratamento com 10 ml de HF liquido anidro/l ml de anisol, a OSC durante 1 hora. Após remoção do HF sob vácuo, a resina foi lavada com éter dietílico, sq ca ao ar e extraída com 2 x 50 ml de ácido acético glacial, o qual foi liofilizado para produzir o péptido em bruto. 0 produto em bruto foi purificado por filtração em gel em Sephadex® G-15 utilizando ácido acético aquoso a 10% como eluente.

Exemplo 131

Preparação de (4S,5S)-alanil-(6-fenil-5-amino-4-hidroxi-hexanoil)-valil-valinamida

A resina peptidilo protegida (4S,5S) Boc-Ala-(6-fenil-5-amino-4-t-butildimetil-sililoxi-hexanoil)-Ual-Ual-BHA foi preparada de acordo com o processo usual. A resina peptidilo foi clivada e desprotegida por tratamento com ID ml de HF liquido anidro/ /1 ml de anisol, a OSC durante 1 hora. Após remoção do HF sob vjá cuo, a resina foi lavada com éter dietílico, seca ao ar e extraída com 2 X 50 ml de ácido acético glacial, o qual foi liofilizado para produzir o péptido em bruto. 0 produto em bruto foi purificado por filtração em gel em Sephadex® G-15, utilizando ácido acético aquoso a 10% como eluente.

Exemplo 132

Preparação de (4S,5S)-benziloxicarbonilalanil-alanil-(6-fenil-5(S)-amino-4(S)-hldroxi-hexanoil)-valil-valinamida composto do Exemplo 130 foi dissolvido em DMF, ao qual foi adicionado 1 equiv. de trietilamina e 1,5 equiv, de N-(benziloxicarboniloxi)succinimida. A extensão da reacção foi monitorizada por HPLC, e o produto foi purificado directamente a partir da

585

SKB CASE 14415

Λ;

utilizando um sistema de a 0,1%, numa coluna de

-170mistura reaccional por HPLC preparativa, acetonitrilo-água-Scido trifluoroacético Hamilton PRP- 1® de polistireno.

Exemplo 133

Preparação de (45,5S)-alanilalanil-(6-fenil-5-amino-4-hidroxi-hexanoil)-valina

A resina peptidilo protegida (4S,5S) Boc-Ala-Ala-(6-fenil-5-amino-4-t-butildimetil-sililoxi-hexanoil)-Vai-resina de Merrifield foi preparada de acordo com o processo usual. A resina peptidilo foi clivada e desprotegida por tratamento com 10 ml de HF liquido anidro/l ml de anisol, a OSC durante 1 hora. Após remoção do HF sob vácuo, a resina foi lavada cora éter dietílico, se ca ao ar e extraída com 2 x 50 ml de ácido acético glacial, o qual foi liofilizado originando o péptido em bruto. 0 produto em bruto foi purificado por filtração em gel em Sephadex® G-15, utilizando ácido acético aquoso a 10% como eluente.

Exemplo 134

Preparação de (4S,55)-benziloxicarbonilalanilalanil-(6-fenil-5-amino-4-hidroxi-hexanoil)-valina composto do Exemplo 133 foi dissolvido em DMF ao qual foram adicionados 2 equiv. de trietilamina e 1,5 equiv. de N-(be_n ziloxicarboniloxi)succinimida. A extensão da reacção foi monitorizada por HPLC, e o produto foi purificado directamente a partir da mistura reaccional por HPLC preparativa utilizando um sistema de acetonitrilo-água-ácido trifluoroacético a 0,1%, numa coluna Hamilton PRP- 1® de polistireno.

Exemplo 135

Preparação de (45,5S)-benziloxicarbonilalanilalanil-(6-fenil-5-amino-4-hidroxi-hexanoil)-valil-(1-aminometil-2-metil)propilamida carbobenziloxi-L-valinol

a) L-valinol foi dissolvido em água contendo 1 equiv, de NaOH, e foi arrefecido até 52C num banho de gelo. Foram adiciona

585

SKB CASE ,14415

-171dos cloroformato de benzilo (1,1 equiv.) e NaOH 4 N (l,2 equiv.) alternadamente, em diversas porções. Quando a reacção se completou, a mistura reaccional foi extraída com acetato de etilo e os extractos foram combinados, secos sobre NagSO^ e concentrados. 0 produto em bruto foi purificado por cromatografia flash em gel de sílica.

1-ftaloilamino-2-carbobenziloxiamino-3-metilbutano

b) Carbobenziloxi-L-valinol foi dissolvido em THF, em conjunto com trifenilfosfina (l,l equiv. ) e ftalimida (l,l equiv.) e arrefecido até -52C num banho salino gelado. Foi adicionadqíliis^ propilazidodicarboxilato (l,l equiv.) e a reacção foi agitada durante 1 hora a -52C e deixada aquecer até à temperatura ambiente. Apús agitação durante toda a noite à temperatura ambiente, a mistura reaccional foi evaporada e o resíduo foi purificado por cromatografia flash, produzindo o composto desejado.

— t—bu t i 1 ox ic a rbo ni 1 ami no—2—c a rbob e nz il ox i am i no—3—me t il bu t a no

c) 1-F talonilamino-2-carbobenziloxiamino-3-metilbutano foi dissolvido em etanol e tratado, à temperatura ambiente, com hidrato de hidrazina (2 equiv.). Quando a reacção se completou por TLC, a mistura reaccional foi evaporada β o resíduo dissolvido em DMF. Foram adicionados dicarbonato de di-t-butilo (3 equiv.) e trietilamina (3 equiv.) e a reacção foi agitada à temperatura ambiente durante toda a noite. A mistura reaccional foi evaporada e o resíduo foi purificado por cromatografia flash em gel de silica, produzindo o composto desejado.

(4S,5S)-benzi1oxicarbonilalanil-alanil-(6-feni1-5-amino-4-hidroxi- hex anoil )- valil- ( 1-aminometil-2-metil)propilamida

d) l-t-Butiloxicarbonilamino-2-carbobenziloxiamino-3-metilbutano foi dissolvido em metanol e hidrogenado sobre paládio a 10% em carbono a 2,76 x 10⁵ Pa durante 1 hora. A mistura reaccional foi filtrada através de uma almofada de Celite^, evaporada até à secura para originar l-t-butiloxicarbonil-2-amino-3-metilbutano.

5Θ5

SXB CASE 14415

-172(45,5S)-benziloxicarbonilalanil-alanil-(6-feni1-5-amino-4-hidrόχι- hexanoil)-valil-(l-aminometil-2-metil)propilamida

e) 0 composto do Exemplo 134 foi dissolvido em DMF em conjunto com 1-t-butiloxicarbonil-2-amino-3-metilbutano (3 equiv.) 1-hidroxibenzotriazol (l,5 equiv.) e diisopropilcarbodiimida (l,5 equiv.) e a reacção foi agitada à temperatura ambiente e monitor_i zada por HPLC. Quando a reacção se completou, a mistura reaccional foi evaporada até à secura e o resíduo foi tratado com ácido trifluoroacético, a DSC durante 30 minutos. 0 ácido trif luoroacé^ tico foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em metanol e purificado por HPLC de fase invertida, utilizando um sistema de acetonitrilo-água-ácido trifluoroacético a 0,1%, numa coluna Hamilton PRP- 1® de polistireno.

Exemplo 136

Preparação de ácido (2R ,55)-2-(fenilmetil)-5-t-butiloxicarbonilamino-6-f enil-hex-3-enóico

2(5)-t-butiloxicarbonilamino-3-fenilpropanol

a) Boc-L-Fenilalanina foi dissolvida em THF contendo tri. etilamina (l equiv.) arrefecida até -5SC. Foi adicionado cloroformato de etilo (21 equiv.) em THF, gota a gota, durante 15 min, e a reacção foi agitada durante 30 min a -590. A mistura reaccijq nal foi filtrada e adicionada, gota a gota durante 30 min, a uma solução de boro-hidreto de sódio (2,5 equiv.) em água, a 0°C. A reacção foi deixada aquecer até à temperatura ambiente e foi agitada durante 2 horas. A mistura reaccional foi acidificada com HCl 1 N, a camada aquosa foi separada e lavada com éter. As cama das do éter e do THF foram combinadas, lavadas com NaOH a 10%, água, secas sobre Na^SO^ e concentradas, originando o composto do título.

(25)-1-( metilsulfonil)oxi-2-t-butiloxicarbonilamino-3-fenilpropano

b) 0 composto do Exemplo 136(a) foi dissolvido em ^CH2^Cl2 contendo trietilamina (l,5 equiv.), e foi arrefecido até -109C. A isto foi adicionado cloreto de metano-sulfonilo (l,l equiv.), durante 10 min. Após agitação durante 10 min e lOSC, a mistura reao

5Θ5

SKB CASE 14415

-173cional foi extraída com água gelada, HCl a L0% frio, NaHCO^ saturado, e salmoura, A camada orgânica foi seca sobre Na₂S0^ e concentrada, originando o composto do título.

(2S)-l-feniltio-2-t-butiloxicarbonilamino-3-fenilpropano

c) Tiofenol (4 equiv.) foi dissolvido numa mistura de THF e metanol. Foi adicionado metóxido de sódio (4 equiv.) e a reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 15 min. 0 com posto do Exemplo 136(b) (l equiv.) foi adicionado e a temperatura aumentada até 50SC durante 2,5 h. A mistura reaccional foi diluí da com NaOH a 10%, extraída com CH₂C1₂ e euapotada originando o composto do título.

(25)-!-(benzenosulfonil)-2-t-butiloxicarbonilamino-3-fenilpropano

d) 0 composto do Exemplo 136(c) foi dissolvido em CH₂C1₂, arrefecido até 09C e ácido m-cloroperbenzóico (3,5 equiv.) foi adicionado. A reacção foi deixada aquecer até à temperatura amb_i ente e agitada durante 1 hora. A mistura reaccional foi dividida entre CH₂C1₂ ^{e sa}^^urac'^{a com} NaHSO^, e a camada orgânica foi lavada com NaHCO^ 1 N, seca sobre Na₂5Q^ e evaporada, originando o composto do título.

(4R)-(2-oxo-4-(fenilmetil)-3-oxazolidinil)-5-metilpent-3-enoato

e) 0 composto do título foi preparado de acordo com o processo do Exemplo 93(b), substituindo por ácido 4-metilpent-3-enóico o ácido monometil trans-hex-3-enóico, e por (R)-benziloxazolidinona a (Ξ)-benziloxazolidinona.

(2R,4R)-(2-oxo-4-(fenilmetil)-3-oxazolidinil)-2-(fenilmetil)-5-metilpent-3-enoato

f) Utilizando o composto do Exemplo 136(e), o composto do título foi preparado de acordo com o processo do Exemplo 93(c). (2R) 2-(fenilmetil)-5-metilpent-3-en-l-ol

g) 0 composto do Exemplo 136(f) em THF foi arrefecido até -789C e tratado com LiAlH^ (l equiv.). Após agitação durante 30 min a -7B9C, a reacção foi deixada aquecer até OSC durante 1 hora. Após 30 min a 0°C, a mistura reaccional foi então novamen69 585

SKB CASE 14415 .X .·'

-174te arrefecida até -78SC, e foi adicionado 1 ml de acetato de etilo. A reacção foi rapidamente arrefecida com cloreto de amónio aquoso saturado a -78SC, deixada aquecer até à temperatura ambien te e diluída com água. A mistura reaccional foi extraída com éter e os extractos foram secos sobre NagSO^ e evaporados, produzindo o composto do titulo, o qual foi purificado por cromatografia flash em gel de sílica.

(2R)-l-(tetra-hidropiranil)oxi-2-(fenilmetil)-5-metil-3-penteno

h) 0 composto do Exemplo 136 (g) foi dissolvido em CHgClg / e foi adicionado di-hidropirano (l,5 equiv.) em conjunto com p-to lueno-sulfonato de piridínio (0,1 equiv.) e foi agitado à tempera tura ambiente durante 4 horas. A solução foi diluída com éter, lavada com água salgada, seca sobre NagSO^ e evaporada, produzindo o composto do titulo.

(2S)-2-(f enilmetil)-3-tetra-hidropiraniloxipropionaldeído

i) 0 composto do Exemplo 136(h) foi dissolvido em CHgClg, arrefecido até -7BSC e tratado com ozono até que uma cor azul pe_r sistisse. A reacção foi rapidamente arrefecida com sulfeto de d_i metilo, deixada aquecer até à temperatura ambiente e concentrada por evaporação, produzindo o composto do titulo, o qual foi util_i zado sem purificação posterior.

(2R,5S)-l-(tetra-hidropiranil)oxo-2-(fenilmetil)-5-t-butiloxicarbonilamino-6-fenil-hex-3-eno

j) Uma solução da sulfona do Exemplo 136(d) em THF foi arrefecida até -7B9C, foi tratada com metil-lítio (2 equiv. de uma solução 1,6 M em éter) durante 5 min, e agitada a -78SC durante 20 min. Num frasco separado, o aldeído do Exemplo 136(i) (2,75 equiv.) em THF foi arrefecido até -7890 e tratado com metóxido de diisobutilaluminio (2,25 equiv.) em THF (preparado pela adição de uma quantidade equimolar de metanol a hidreto de diisobutilalumí nio 1 M em THF). A solução do aldeido foi transferida para a sulfona dianiónica por meio de uma cânula, e agitada a -7BSC durante 30 min. A reacção foi rapidamente arrefecida pela adição de cloreto de amónio aquoso saturado e o produto foi extraído com éter, seco sobre MgSO^ e concentrado sob pressão redu69 585

SKB CASE 14415

-175zida.

A β-hidroxi-sulfona em bruto foi dissolvida em metanol e arrefecida até 09 C. Foi adicionado fosfato de hidrogénio diss 6d_i co (4 equiv.), seguido por amalgama de sódio a 5% (12 equiv.). Após agitação durante 4 horas a 09C, a reacção foi diluída com água e extraída com CI^C^» seca sobre MgSO^ e concentrada. 0 produto em bruto foi purificado por cromatografia flash em gel de sílica, originando o composto do titulo.

ácido (2R ,5S)-2-(fenilmetil)-5-t-butiloxicarbonilamino-6-fenil( -hex-3-enóico

k) D composto do Exemplo 136(j) foi dissolvido em acetona, arrefecido até 09C e tratado, gota a gota, com reagente de Co nes (3 equiv.). Após agitação durante 3 horas, a mistura reaccio nal foi diluída com água e extraída com éter. Os extractos etére os foram lavados com NaOH a 5% e as lavagens aquosas foram combinadas, acidificadas até pH 2 com HCl a 10% e extraídas com éter. Os extractos do éter foram secos sobre Na₂S0^ e evaporados, oriqi nando o composto do titulo.

Exemplo 137

Preparação de (2R,55)-alanilalanil-(2-(fenilmetil)-5-amino-6-feni 1-trans-hex-3-enoil)-vaiil-v alinamida

A resina-pêptidUo protegida (2R,5S) Boc-Ala-Ala-(2-(fenilmetil)-5-amino-6-fenil-trans-hex-3-enoil)-Val-Val-BHA foi prepara da de acordo com o processo usual do Exemplo 1. A resina peptidj. lo foi clivada e desprotegida por tratamento com 10 ml de HF liquido anidro/l ml de anisol, a 09C durante 1 hora. Após remoção do HF sob vácuo, a resina foi lavada com éter dietílico, seca ao ar e extraída com 2 x 50 ml de ácido acético glacial, o qual foi liofilizado para originar 0 péptido em bruto. 0 produto em bruto foi purificado por filtração em gel em Sephadex® G-15, utilizando ácido acético aquoso a 10% como eluente, produzindo 0 composto do título.

585

SKB CASE 14415 ,x/

-176Exemplo 138

Preparação de (2R,5S)-benziloxicarbonilalanilalanil-(2-(fenilmetil)-5-amino-6-fenil-trans-hex-3-enoil)-valil-valinamida

D composto do Exemplo 137 foi dissolvido em DMF, ao qual foram adicionados 2 equiv. de trietilamina e 1,5 equiv. de N-(be_n ziloxicarboniloxi)succinimida. A extensão da reacção foi monitorizada por HPLC e o produto foi purificado directamente a partir da mistura reaccional por HPLC preparativa, utilizando um sistema de acetonitrilo-água-ácido trifluoroacêtico a 0,1% numa coluna Hamilton PRP- 1® de polistireno.

Exemplo 139

Preparação de ãcido (6S)-6-(terc-butiloxicarbonil)amino-7-fenil-5-oxo-heptanóico

Utilizando o processo do Exemplo 12, excepto substituindo por 5-bromo-l-penteno o 4-bromo-l-buteno, foi preparado o composto do título.

Utilizando os processos detalhados aqui descritos nos Exemplos 19, 34, 76, 77, 78, 88 e 135, foram preparados os compos. tos específicos seguintes:

a) éster de metilo de (55,6S)-6-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-7-fenil-5-hidroxi-(l-oxo)heptil-valil valina;

b) éster de metilo de (5S,6S)-6-(carbobenziloxi-alanil)amino-7-feni1-5-hidroxi-(1-oxo)heptil-valil valina;

c) (5S,6S)-6-(carbobenziloxi-alanilalanil)amin0-7-fenil-5-hidroxi-(1-oxo)heptil-valil valinamida;

d) (5S,6S)-6~(carbobenziloxi-alanil)amino-7-fenil-5-hidroxi-(l-oxo)heptil-valil valinamida;

e) (5S,6S)-6-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-7-fenil-5-hidroxi-(1-oxo)heptil-valil valinol;

f) (5Ξ,65)-6-( carbobenziloxi-alanil)amino-7-fenil-5-hidroxi-(l-oxo)heptil-valil valinol;

g) (5S,6S)-6-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-7-fenil69 585

SKB CASE 14415

-177-5-hidroxi-(l-oxo)heptil-valil valino-((S)-l-amino-3-metilbutil-2-)amida; e

h) (5S,6S)-6-(carbobenziloxi-alanil)amino-7-Fenil-5-hidrox i-(l-oxo)heptil-valil valino-((S)-l-amino-3-metilbutil-2-)amida.

Exemplo 140

Utilizando o processo do Exemplo 151 para preparar o ácido (2R , 5S)-2-meti1-5-(terc-butiloxicarbonil)amiηο-6-fenil-4-oxo-hexanóico e empregando os processos detalhados aqui descritos nos Exemplos 19, 34, 76, 77, 78, 88 e 135, foram preparados os compostos específicos seguintes:

a) éster de metilo de (2R ,4S ,5S)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amiπο-6-fenil-4-hidroxi-2-metil-(1-oxo)hexil-valil valina ;

b) (2R ,4S ,5S)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-2-metil-(1-oxo)hexil-valil valinamida;

c) (2R,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-2-metil-(l-oxo)hexil-valil valinamida;

d) (2R,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-6-feni1-4-hidroxi-2-metil-(l-oxo)hexil-valil valinol;

e) (2R,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-2-metil-(l-oxo)hexil-valil valinol;

f) (2R,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-2-metil-(l-oxo)hexil-valil valino-((S)-l-amino-3-metilbutil-2-)amida;

g) (2R,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanil)amino-6-fenil-4-hidroxi—2-metil-(l-cxo)hexil-valil valino-((5)-l-amino-3-metilbutil-2-)amida;

h) (2R ,4S ,5S)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-2-metil-(1-oxo)hexil-valil valina; e

i) (2R,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-2-metil-(1-oxo)hexil-valil valina.

585

5KB CASE 14415

Exemplo 141

Preparação de ácido (2R,55)-2-benzil-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-6-fenil-4-oxo-hexanéico

Utilizando o processo do Exemplo 151, excepto pela utilivez de zação de 3-bromo-2-fenilmetil-l-benziloxipropano em / 3-bromo-2-metil-l-benziloxipropano, foi preparado o composto do titulo.

Utilizando ácido (2R,5S)-2-benzil-5-(terc-butiloxicarbonil )amino-6-fenil-4-oxo-hexanóico e empregando os processos detalhados aqui descritos nos Exemplos 19, 34, 76, 77, 78, 88 e 135, ( foram preparados os compostos específicos seguintes:

a) éster de metilo de (2R,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-2-benzil-(1-oxo)hexil-valil valina ;

b) éster de metilo de (2R,4S, 5S)-5-(carbobenziloxi-alanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-2-benzil-(l-oxo)hexil-valil valina ;

c) (2R,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-2-benzil-(l-oxo)hexil-valil valinamida;

d) (2R,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-2-benzil-(l-oxo)hexil-valil valinamida;

e) (2R,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-2-benzil-(l-oxo)hexil-valil valinol;

f) (2R,4S,55)-5-(carbobenziloxi-alanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-2-benzil-(l-oxo)hexil-valil valinol;

g) (2R,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-2-benzil-(l-oxo)hexil-valil valino-( (S)-l-amino-3-metilbutil-2-)amida;

h) (2R,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-2-benzil-(l-oxo)hexil-valil valino-((S)-1-amino-3-metilbutil-2-)amida;

i) (2R,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-2-benzil-(l-oxo)hexil-valil valina; e

j) (2R,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-2-benzil-(l-oxo)hexil-valil valina.

585

SKB CASE 14415

-179Exemplo 142

Preparação de ácido (3R5,55)-3-isobutil-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-6-fenil-4-oxo-hexanóico

4-hidroxi-6-metil-hept-l-eno

a) A uma solução de isobutiraldeído (l,D g, 11,6 mmol) em THF anidro (30 ml), a OSC, foi adicionado brometo de alilmagné sio (12,2 mmol). Após a adição, a reacção foi deixada aquecer até à temperatura ambiente e foi agitada durante mais 2 h. A reacção foi rapidamente arrefecida ao ser vertida numa mistura, sob agitação, de HCl a 5% e éter dietilico. A camada orgânica foi separada, lavada com água e salmoura e seca sobre MgSD^. A filtração e a evaporação do solvente produziram o composto do título.

4-bromo-6-metil-hept-l-eno

b) 0 composto do Exemplo 142(a) (0,6 g, 0,625 mmol) foi dissolvido em (25 ml) e tratado com cloreto de mesilo (0,72 g, 0,625 mmol) e trietilamina (0,63 g, 0,625 mmol), em cloreto de metileno. Após agitação durante 3 h à temperatura ambieri te, a reacção foi vertida em HCl a 5% frio e éter dietilico.

exame minucioso extractivo padrão forneceu o mesilato em bruto. 0 mesilato em bruto foi tratado com um excesso de LiBr (3 equiv.) em DMF seco, a 1209C durante 6 h. A reacção foi arrefecida e a mistura reaccional foi diluída com água. 0 exame minjj cioso extractivo padrão com pentano produziu 0 composto do título, o qual foi purificado por destilação.

ácido (3RS,55)-3-isobuti1-5-(terc-butiloxicarbonil)amin0-6-fenil-4-oxo-hexanóico

c) Utilizando o processo do Exemplo 12, excepto substituindo por 4-bromo-6-metil-hept-l-eno 0 4-bromo-l-buteno, produziu-se 0 composto do título.

Utilizando os processos detalhados aqui descritos nos Exemplos 19, 34, 76, 77 e 7B, foram preparados os compostos específicos seguintes:

585

SKB CASE 14415

-18 0al) éster de metilo de (3SR,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-6-f enil-4-hidroxi-3-isobutil-(1-oxo)hexil-valil valina;

bl) éster de metilo de (3SR,4S,5Ξ)-5-(carbobenziloxi-alanil)amino-6-feni1-4-hidroxi-3-isobutil-(1-oxo)hexil-valil valina ;

cl) (3SR,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-3-isobutil-(1-oxo)hexil-valil valinamida; e dl) (3SR,4S ,5S)-5-(carbobenziloxi-alanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-3-isobutil-(1-oxo)hexil-valil valinamida.

Exemplo 143

Preparação de ácido (3R5,5S)-3-metil-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-6-fenil-4-oxo-hexanôico

Utilizando o processo do Exemplo 142, excepto substituindo por acetaldeído o isobutiraldeido, foi preparado o coni posto do título.

Utilizando os processos detalhados aqui descritos nos Exemplos 19, 34, 76, 77 e 78, foram preparados os compostos específicos seguintes:

a) éster de metilo ds (3SR,4S,55)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-3-metil-(l-oxo)hexil-valil ual_i na;

b) éster de metilo de (3SR,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-3-metil-(1-oxo)hexil-valil valina;

c) (3SR,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-3-metil-(1-oxo)hexil-valil valinamida; e

d) (3SR,45,5S)-5-(carbobenziloxi-alanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-3-metil-(l-oxo)hBxil-valil valinamida.

Exemplo 144

Preparação de ácido (3RS,55)-3-benzil-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-6-fenil-4-oxo-hexanôico

Utilizando o processo do Exemplo 142, excepto subs69 585

SKB CASE 14415

-181tituindo por fenilacetaldeído o isobutiraldeldo, foi preparado o composto do título.

Utilizando os processos detalhados aqui descritos nos Exemplos 19, 34, 76, 77 e 78 foram preparados os compostos espec_í ficos seguintes:

a) éster de metilo de (3SR ,4S,55)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-3-benzil-(l-oxo)hexil-valil valina ;

b) éster de metilo de (3SR,45,5S)-5-(carbobenziloxi-alanil) a mi no-6- fenil-4- hid rox i- 3- benz il-( l-oxo) hexil- valil valina;

c) (3SR ,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanilaianil)amino-6-fenil-4-hidroxi-3-benzil-(l-oxo)hexil-valil valinamida; e

d) (3SR,4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-3-benzil-(l-oxo)hexil-valil valinamida.

Exemplo 145

Preparação de ácido (5S)-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-5-fenil-4-oxo-pentan6ico

Utilizando o processo do Exemplo 12, excepto substituindo por Boc-fenilglicina a Boc-fenilalanina, foi preparado o composto do título.

Utilizando os processos detalhados aqui descritos nos Exemplos 34, 76, 77 e 78, foram preparados os compostos específicos seguintes:

a) éster de metilo de (5S,4S)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-5-fenil-4-hidroxi-(l-oxo)pentil-valil valina; e

b) éster de metilo de (5S,4S)-5-(carbobenziloxi-alanil)amino-5-fenil-4-hidroxi-(l-oxo)pentil-valil valina.

Exemplo 146

Preparação de ácido (55)-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-7-fenil-4-oxo-heptanéico

Utilizando o processa do Exemplo 12, excepto substi69 585

SKB CASE 14415

7' Á -gT«

-182tuindo por Boc-homofenilalanina a Boc-fenilalanina, foi preparado o composta do titulo.

a) éster de metilo de (45,55)-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-7-fenil-4-hidroxi-(l-oxo)heptil-valil valina; e

b) éster de metilo de (4S,5S)-5-(carbobenziloxi-alanil)amino-7-fenil-4-hidroxi-(1-oxo)heptil-valil valina.

Exemplo 147

Preparação de (55)-5(carbobenziloxialanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valina, isobutil amida (55)-5-(terc-butiloxi)amino-l,4-dioxo-6-fenil-hexil-valina, isobutilamida

a) Uma solução do composto do Exemplo 12(b) (l,D mmol) e NMM (l,2 mmol) em THF (5 ml), a -40SC, foi tratada, gota a gota, com cloroformato de isobutirilo (l,0 mmol). Após 15 min, foi adi. cionada uma solução de L-valina isobutilamida (1,2 mmol) em DMF (2 ml). A mistura foi agitada com aquecimento até à temperatura ambiente durante toda a noite, sendo, em seguida, vertida em HC1 aquoso a 4% e extraída com CHCl^. A camada orgânica foi lavada com NaHCO^ a 5%, em seguida com H₂0, e concentrada, produzindo o composta do título.

(55)-5-(terc -butiloxicarbonil)-4-hidroxi-l-oxc-6-fenil-hexil-valina, isobutil amida

b) 0 produto do Exemplo 147(a) foi reduzido com NaBH^ (l equiv. ) em metanol. Foi adicionado HC1 diluído e o produto foi isolado por extracção com CHCl^. HPLC preparativa em sílica, utilizando um sistema de CH₂C1₂/CH₃OH, produziu o composto do título, em conjunto com o seu epímero hidroxi.

(55)-5 -amino-4-hidroxi-l-cxo-6-fenil-hexil-valina, isobutil amida

c) 0 produto do Exemplo 147(b) foi dissolvido num volume mínimo de TFA puro. Após 5 min, foi adicionado metanol, seguido

585

SKB CASE 14415

-183por 1 equivalente de HC1 concentrado. Os solventes foram removidos in vacuo, produzindo o composto do título.

(5S)-5-(carbobenziloxialanil)amino-4-hidroxi-l-ox0-6-fenil-hexil-valina, isobutil amida

d) Uma solução de Cbz-alanina (0,50 mmol) e NMM (0,60 mmol) em THF (5 ml), a -40SC, foi tratada, gota a gota, com cloro formato de isobutirilo (D,50 mmol). Após 15 minutos, foi adicionado mais NMM (0,60 mmol), seguido por uma solução do produto do Exemplo 147(c) (0,60 mmol) em DMF (2 ml). A mistura foi deixada aquecer até à temperatura ambiente, com agitação, durante toda a noite. Foi adicionado HC1 a 5% e o produto foi isolado por extraç. ção com CHClj.

Exemplo 148

Preparação de (5S)-5-(carbobenziloxialanilalanil)amiηο-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil valina, isobutilamida composto do titulo foi preparado tal como descrito no Exemplo 147(d), excepto por ter sido utilizada Cbz-alanilalanina (0,50 mmol) em lugar da Cbz-alanina.

Exemplo 149

Preparação de 5-(miristil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil valina, isobutil amida

A uma solução do produto do Exemplo 147(c) (0,10 mmol) em piridina (2 ml), foi adicionado anidrido miristico (0,12 mmol). Após 12 horas, a solução foi diluída com HC1 a 10% e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica foi lavada com NaHCO^ a 5% e F^O, sendo, em seguida, concentrada para originar o composto do título.

Exemplo 150

Preparação de 5-(estearil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil valina, isobutil amida composto do titulo foi preparado tal como no Exemplo 149, excepto substituindo por anidrido esteárico o anidrido miristico.

585

SKB CASE 14415

. «· .''St-.-».·***'·

-164Exemplo 151

Preparação de 5-(carbobenziloxialanil)amino-4-hidróxi-2-metil-1-οχο-6-fenil-hexilvalil valina, éster de metilo

5-(terc-butiloxicarbonil)amino-4-oxo-2-metil-6-fenil-l-benziloxi hexano

a) 0 composto do titulo foi preparado tal como no proces. so do Exemplo 12(a), excepto que em vez de 4-bromo-l-buteno foi utilizado o 3-bromo-2-raetil-l-benziloxi-propano (0. Med, Chem.

30, 374 (1987)).

5-(terc-butiloxicarbonil)amino-4-oxo-2-metil-l-hidroxi-6-fenil hexano

b) 0 composto do titulo foi preparado por hidrogenôlise do produto do Exemplo 15l(a) utilizando o processo do Exemplo B6(b).

ácido 5-(terc-butiloxicarbonil)amino-4-oxo-2-metil-6-fenil-hexanéico

c) A uma mistura do produto do Exemplo 15l(b) e benzeno/ /l^O/AcOH 5:1:1 foi adicionado (n-Bu)^NBr (0,01 equiv.). Foi ad£ cionado KMnO^ (3,5 eq.) e a mistura foi agitada durante 2 horas, sendo, em seguida, adicionado bi-sulfeto de sódio aquoso saturado. Após vários minutos, a mistura foi acidificada até pH 1-2 com KHSO^ aquoso saturado, sendo, em seguida, extraída com EtOAc. A camada orgânica foi concentrada e o resíduo foi purificado por cromatografia em silica (acetato de etilo/hexano/HOAc), produzindo o composto do título.

5-(carbobenziloxi alanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexilvalil valina, éster de metilo

d) 0 composto do Exemplo 15l(c) foi acoplado a éster de metilo de valil valina utilizando o método do Exemplo 35(a) excepto substituindo pelo composto do Exemplo 15l(c) o ácido

5-(terc-butiloxicarbonil)amino-4-oxo-6-(4-benziloxi-fenil)hexanóico. A cetona foi reduzida com NaBH^ utilizando o processo do Exemplo 84(b). 0 grupo amino foi desprotegido pelo processo do

585 _?

SKB CASE 14415 >..' :, Tr

-185Exemplo 35(c), e acoplado à Cbz-alanina pelo processo do Exemplo 72(a), para produzir o composto do titulo.

Exemplo 152

Preparação de 7-metil-5-(carbobenziloxialanil)aminc-3,4-di-hidroxi-2-fenilmetil-l-oxo-octil valina, isobutilamida ácido 7-metil-4,5-0,(terc-butiloxicarbonil)-N-isopropilideno-3-hidroxi-2-fenilmetil-octanóico, éster de benzilo

a) Uma solução de 2,2-dimetil-3-(terc-butiloxi carbonil)-4-isopropil-5-formil-l,3-oxazolidina (l,D mmol) (3. Med. Chem.

30, 976 (1967)) em THF (2 ml) foi adicionada a uma solução a -783 de 1,1 mmol de benzil-3-fenilpropionato de lítio (preparado a par. tir de diisopropilamida de lítio (l,l mmol) e de benzil-3-fenilpropionato (1,1 mmol)). A mistura foi agitada a -789 durante 1 hora, sendo, em seguida, deixada aquecer até à temperatura ambier» te e diluída com tampão fosfato de pH 7. A mistura foi extraída com clorofórmio, a camada orgânica foi concentrada, e o resíduo foi purificado por cromatografia flash, produzindo o composto do titulo como uma mistura de isómeros, ácido 7-metil-5-(terc-butiloxicarbonil)amino-5,4-dioxiisopropilidino-2-fenilmetil-octanáico, éster de benzilo

b) Uma solução do produto do Exemplo 152(a) (0,5 mmol) em CH2CI2 (l0 ml) foi agitada com ácido canforsulfónico (0,1 mmol), durante toda a noite. Foi adicionado NaHCO^ sólido em excesso com acetano (10 ml), a mistura foi agitada vigorosamente durante 1 hç> ra e filtrada através de Celite. A concentração e a cromatografia flash produziram o composto do título.

ácido 7-metil-5(terc-butiloxicarbonil)amino-3,4-dioxiisopropilideno-2-fenilmetil-octanóico

c) Uma solução do produto do Exemplo 152(b) (0,2 mmol) em metanol (5 ml) foi agitada com Pd a 10% em carbono activado (20 mg), durante 8 horas sob 1,013 x 10 Pa de H2. A mistura foi filtrada através de Celite e concentrada, produzindo o composto do título.

585

SKB CASE 14415

-1867-metil-5(terc-butiloxiamino)-3,4-dioxi-isopropilidino-2-fenilmetil-l-axo-octil valina, isobutil amida

d) 0 composto do titulo foi preparado pelo processo do Exemplo 87(a), excepto substituindo pelo produto do Exemplo 152(c) o ácido 5-(terc-butiloxicarbonil)amino-4-oxo-6-fenil hexanóico e eliminando a lavagem com HC1 a 5% no exame minucioso.

7-metil-5-amino-3,4-di-hidroxi-2-fenilmetil-l-oxo-octil valina, isobutil amida, cloridrato

e) 0 composto do titulo foi preparado a partir do produto do Exemplo 152(d) pelo processo do Exemplo 147(c).

7-metil-5-(carbobenziloxialanil)amino-3,4-di-hidroxi-2-fenilmetil-l-oxo-octil valina, isobutil amida

f) 0 composto do titulo foi preparado pelo processo do Exemplo 147(d), excepto ' substituindo pelo produto do Exemplo 152(e).

Exemplo 153

Preparação de (45,55)-5-(alanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-hidroxifenil)-hexil-valil valinol (45.55) -5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-benziloxifenil)-hexil-valil valina

a) 0 composto do Exemplo 72(a) (l mmol) foi dissolvido em metanol (lO ml) e hidróxido de potássio (l,5 mmol) em foi adicionado gota a gota. A reacção foi monitorizada por cromatografia de camada fina até a hidrólise do éster estar completa. A reacção foi neutralizada com HC1 a 5%, o metanol foi evaporada sob pressão reduzida e o residuo foi dissolvido em CHCl^. □ extracto orgânico foi lavado com HC1 a 5% e água e seco sobre MgSD^. A filtração e a evaporação do solvente forneceram o composto do título.

(45.55) -5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-benziloxifenil)-hexil-valil valinol

b) Uma solução do composto do Exemplo 153(a) (D,5 mmol) foi dissolvida em Cf^C^ (5 ml) sob uma atmosfera de Ar e arrefe69 585

SKB CASE 14415 «r

-187cida até OSC. Foi adicionado metil sulfeto de borano (0,55 mmol), gota a gota. A reacção foi agitada 5 horas a 5SC e 2 horas à temperatura ambiente. Foi adicionado metanol (3 ml), seguido por ácido acético (2 ml) e a solução foi agitada à temperatura ambiejo te durante mais 2 horas. Os solventes foram evaporados sob pressão reduzida, o residuo foi dissolvido em CHCl^ e lavado sucessivamente com HCl a 5%, H^O e NaHCO^ a 5%. 0 extracto orgânico foi seco sobre MgSO^, filtrado e o solvente foi evaporado, produzindo o composto do título.

(4S,55)-5-(alanilaianil)amino-4-hidroxi-1-oxo-6-(4-hidroxifenil)-hexil-valil valinol

c) A uma solução do composto do Exemplo 153(b) (0,2 mmol) em ácido acético, foi adicionado paládio a 10% (150 mg) em carbono activado. Foi borbulhado hidrogénio através da mistura durante 60 min e a reacção foi agitada sob uma atmosfera de hidrogénio durante 20 horas. A suspensão foi filtrada através de Celite® e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida, produzindo o com posto do título.

Exemplo 154

Preparação de 4-metil-3-/~5-(alanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-hidroxifenil)-hexil-valil 7amino-pentano-2-ona

4-metil-3-/^-5-(carbobenziloxi-alanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-benziloxifenil)-hexil-valil_Tamino-pentano-2-ona

a) 0 composto do Exemplo 153(a) (0,2 mmol) foi dissolvido em cloreto de metileno (4 ml), a OSC, e cloreto de oxalilo (0,25 mmol) foi adicionada seguido por 1 gota de DMF. Após agitação durante 0,5 horas a OSC e 0,5 horas à temperatura ambiente, uma solução de cloreto de metileno foi adicionada, gota a gota, a uma solução de um excesso de diazometano (>4 mmol) numa mistura de Et^O e THF. Após agitação a 109C durante 1 hora, foi adiciona do ácido acético até que a evolução do azoto cessasse. Os solven tes foram evaporados, o resíduo foi dissolvido em CHCl^, lavado com água e seco sobre MgSO^. A filtração e a evaporação do solvente produziu o composto do título.

5Θ5

SKB CASE 14415

-1884-metil-3-/^-5-(alanilalanil)amino-4-hidroxi-1-oxo-6-(4-hidroxifenil )-hexil-valil_7amino-pentano-2-ona

b) A uma solução do composto do Exemplo 154(a) (0,1 mmol) em ácido acético, foi adicionado paládio a 10% (80 mg) em carbono activado. Foi borbulhado hidrogénio através da mistura durante 60 min e a reacção foi agitada sob uma atmosfera de hidrogénio durante 20 horas. A suspensão foi filtrada através de Celite® e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida para produzir o cojn posto do titulo.

Exemplo 155

Preparação de Ac-Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH2

Utilizando o processo do Exemplo 1, excepto · - substituindo por Boc-Phe o Boc-Tyr(BrZ), foi preparado o composto do titulo.

Exemplo 156

Utilizando o processo do Exemplo 5B, excepto substituindo por Boc-His(Tos), Boc-Val, Boc-Ile, Boc-Lys(Clz), Boc-Ser(Bzl), Boc-D-Arg(Tos) ou Boc-Met a Boc-Ala, produziram-se os seguintes péptidos:

His-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH₂; Val-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH₂ ; Ile-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH₂; Lys-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH₂; D-Arg-Ser-Gln-Asn-T yr-Pro-l/al-Val-NH^ >* Ser-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH^ ; e Met-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val-NH₂.

Exemplo 157

Utilizando o processo do Exemplo 39, excepto por se iniciar a sequência com Boc-Ala-BHA, Boc-Gly-BHA, Boc-Ile-BHA, Boc-Leu-BHA ou Boc-Met-BHA, produziram-se os seguintes péptidos:

585

SKB CASE 14415

Λ-’~

-189Ac-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Ala-Nl·^ 5

Ac-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-l/al-Gly-Nl·^;

Ac-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Ile-Nl·^;

Ac-Ser-Gln-Asn-T yr-Pro-Val-Leu-Nl·^ j e

Ac-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Met-NH^.

Exemplo 158

Utilizando o processo do Exemplo 39, excepto ^: ' substituindo por Boc-Ala, Boc-Gly, Boc-Ile, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu ou Boc-Met a Boc-l/al no segundo resíduo do péptido, produziram-se os seguintes péptidos:

Ac-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ala-l/al-NH^ > Ac-Ser-Gln-Asn-T yr-Pro-Gly-Val-IML^ 5 Ac-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-l/al-Nl·^ > Ac-Ser-Gln-Asn-T yr-Pro-Arg-Val-NH^5 Ac-Ser-Gln-Asn-T yr-Pro-Leu-l/al-Nl·^; e Ac-Ser-Gln-Asn-T yr-Pro-Met-Val-Nl·^.

Exemplo 159

Utilizando o processo do Exemplo 40, excepto substituindo por Boc-His(Tos), Boc-Val, Boc-Ile, Boc-Leu, Boc-Thr(Bzl) ou Boc-Gln a Boc-Ala no quinto residuo do péptido, produziram-se os seguintes péptidos:

Ac-Ser-Ala-His-Tyr-Pro-Val-l/al-Nh^j Ac-Ser-Ala-l/al-Tyr-Pro-Val-Val-NH^j Ac-Ser-Ala-Leu-Tyr-Pro-l/al-l/al-NH^ >

Ac-Ser-Ala-Thr-T yr-Pro-l/al-Val-Nl·^; e Ac-Ser-Ala-Gln-Tyr-Pro-l/al-l/al-Nl·^.

Exemplo 160

Preparação de (5S,4RS)-5-(terc-butoxicarbonilserilalanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina composto do Exemplo 34(d) (50 mg, 6,5 x 10~^ mole) foi dissolvido em metanol (5 ml) e água (l ml) contendo carbonato de potássio foi adicionada, gota a gota. Após agitação durante 6 ho ras à temperatura ambiente, a mistura reaccional foi diluída com

505

SKB CASE 14415

-19Dacetato de etilo e água. 0 pH foi ajustado para 3,0 com HCl dil., e a camada aquosa foi separada. A camada orgânica foi lavada com água (lx) e seca sobre MgSO^. A filtração e a evaporação do acetato de etilo produziram o composto do titulo.

Exemplo 161

Preparação de ( 5S ,4RS )-5-/( terc-butoxicarbonil-serilalanilalanil)-amino_/-4-hidroxi-1-oxo-6-fenil-hexil-valil valina-dietilamida composto do Exemplo 160 (60 mg, 7,B x 10 mole) foi dissolvido em THF anidro (4 ml), a -40SC sob uma atmosfera de árgon e foi adicionada N-metil morfolina (10,2 mg, 1,01 x 10”^ mole), seguida por cloroformato de isobutirilo (ll mg, 7,B x 10^-^ mole). Após agitação durante 15 min, foi adicionada dietilamina (ll mg, 1,56 x 10 mole). Após agitação durante mais 30 min a -40SC, a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente.

A reacção foi diluida com acetato de etilo e lavada sucessivamejj te com HCl a 5%, bicarbonato de sódio a 5% e áalmoura. 0 extracto orgânico foi seco sobre MgSO^, filtrado e evaporado in vacuo, para produzir o composto do titulo.

Utilizando o mesmo processo, excepto substituindo por n-butilamina a dietilamina, foi produzida a (55,4RS)-5-/~(ter£ -butoxicarbonil-serilalanilalanil) ami no_7~ 4- hid rox i-1-oxo-6- fenil. -hexil-valil valina-butilamida.

Exemplo 162

Preparação de (5S,4RS)-5-/~(terc-butoxicarbonil-serilalanilalanil)amino_7-4-hidrox i-1-oxo-6-fenil-hexil vaiina-isobutilamida éster de metilo de (5S,4RS)-5-/~(terc-butoxicarbonil-serilalanilalanil ) a mi no__7-4-hid rox i-1-oxo-6-fenil-hexil valina

a) Utilizando o processo do Exemplo 34, excepto substituindo por éster de metilo de valina o éster de metilo de valil valina, foi produzido o composto do titulo.

585

SKB CASE 14415

-191(55 ,4RS )-5-/^-(terc-butoxicarbonil-serilalanilalanil) amino__7-4-hidroxi-1-oxo-6-fenil-hexil valina

b) Utilizando o processo do Exemplo 160, excepto substituindo pelo péptido do Exemplo 162(a), foi produzido o ácido carboxílico do titulo.

(5S,4RS)-5_/~(terc-butoxicarbonil-serilalanilalanil)amino_7-4-hidroxi-1-oxo-6-fenil-hexil vaiina-isobutilamida

c) Utilizando o péptido do Exemplo 162(b) e o processo do Exemplo 161, excepto . substituindo por isobutilamina a dietilamina, foi produzido o composto do titulo.

Exemplo 163

Composição para unidade de dosagem lipossémica

Fosfatidilcolina (l,4 g) e fosfatidilglicerol (0,6 g) são dissolvidos em 300 ml de metanol a 20% no solvente clorofórmio e são evaporados até à secura. A solução do péptido (30 mg em 200 ml de solução salina tamponada com fosfato) é adicionada à pelicjj la fosfolipídica seca, a qual é deixada equilibrar à temperatura ambiente durante 1-2 horas. A dispersão lipossómica formada é então submetida a turbilhonamento para assegurar uma mistura uniforme. A suspensão resultante é extrusada, cinco vezes, através de um filtro de policarbonato de 0,2 , para produzir uma distribuição de tamanhos uniforme. Se necessário, a suspensão pode ser dialisada ou ultracentrifugada para remover o péptido não-encapsjj lado.

Exemplo 164

Composição para unidade de dosagem lipossómica

Num béquer, colesterol (49 mg) e ácido oleico (0,358 g) são aquecidos até 65SC durante 20-30 min. Mantendo a temperatura, fosfolípidos (l g) são adicionados lentamente, assegurando o hume^ decimento completo pelo ácido oleico. Uma solução de arginina (0,22 g em 3,37 g de água) a 40°C é adicionada em pequenas alíquo tas e meticulosamente misturada na pasta. A mistura é mantida a

585

SKB CASE 14415

-192409C. Após equilibrio durante uma semana, o péptido (150 mg) é meticulosamente misturado no gel. 0 pH é ajustado até 7,0 com z

ácido acético, se necessário. E adicionada solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4), em pequenas alíquotas, com turbilhonamento, para atingir uma concentração de 200 mg de gel lipossómico por ml. Os lipossomas formam-se espontaneamente. Este processo produz 5 g de suspensão lipossómica. Uma unidade de dosagem padrão é de 1 g de suspensão lipossómica.

Exemplo 165

Composição para unidade de dosaqem parentérica

Uma preparação que contém 25 mg do péptido de acordo com este invento é preparada como se segue.

mg do péptido são dissolvidos em 15 ml de água destil£ da. A solução é filtrada, sob condições estéreis, para uma ampola multi-dose de 25 ml e liofilizada. Para injecção intravenosa ou intramuscular, o pó é reconstituído pela adição de 20 ml de dextrose a 5% em água (D5W). Esta solução também é apropriada pja ra utilização noutros métodos de administração. Tais como adição a uma garrafa ou saco para infusão Et/, gota a gota.

Exemplo 166

Composição para unidade de dosaqem oral

Uma cápsula para administração oral é preparada por mistjj ra e trituração de 35 mg do péptido com 75 mg de lactose e 5 mg de estearato de magnésio. 0 pó resultante foi peneirado e coloca do dentro de cápsulas de gelatina dura.

A descrição acima descreve completamente como fazer e ut_i lizar este invento. Este invento, contudo, não está limitado às concretizações precisas aqui descritas, mas abrange todas as mod_i ficações dentro do âmbito das reivindicações que se seguem.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 - Processo para a preparação de um composto de fórmula A-B-(Q)_a-(C)_b-(D)_c-M-(w)_d-(X)₀-Y-Z (I) e dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em que,

A é BocNH, CbzNH, H, R’R”N, R’’C0NR' ou DnsNH, ou se a, b e c são 0 e Y é uma ligação covalente, então A ê H, Boc, Cbz, R” ou RCO;

B é um ou mais aminoácidos D ou L, β -Ala ou é uma ligação covalente;

C e D são iguais ou diferentes e são Glx, Asx, Ala, β -Ala, Arg, Gly, Ile, Leu, Lys, Ser, Thr, Vai, Met ou His;

Q é um aminoácido D ou L, e é Ser, Thr, Asp, His, Cys,

Arg ou Ala;

W é Pro ou Á 3-desidro-Pro;

X é Ala, Gly, Ile, Leu, Vai, Met, Lys, Glx ou Asx;

Y é um ou mais aminoácidos D ou L, ou ô uma ligação covalente;

Z é C0₂R, CONR’R, COR', CH₂0H, CH₂NR'R ou H, ou se .d e e_ são 0 e Y ô uma ligação covalente, Z é DR ou NR'R;

.a, Jj, ç, .d e e_ são cada um, independentemente uns dos outros, 0 ou 1, desde que _ç e J3 não sejam simultaneamente 0;

M é Cha, Phe(4'R ) ou -NHCHR.R.-;

a 12 em que:

é, independentemente, AlqC^ (CH₂)_nSAlqC^ ( CH₂ ) _n ^DAlP^Ci_5 > (CH₂)_ncicloalquilo C₃__? ou (^-^2m^6^H4^_Ra ’

R_a é halogéneo, OR', N0₂, NH₂ ou H;

^R2 ^{é (CH}2⁾n“’ CHR₃(CH₂)_mC0-, 00(^)^0-, CHR₃CHR₃, ( CH₂ ) _mC0-,

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SKB CASE 14415

-194CHR₃CHR₃,CHR₁(CH₂)_mC0-, CHR^HR^CHR ’ ( CH₂) ^CO-, CHR₃CHR ’ CHR^ ( CH₂ ) ^CO

CDCR.CHR'(CH_) CO-, COCF_CR·R(CH_) CO-, COCF_(CH„) CO-,

1 2 m 2 Z m ZZm

CH=CR«CHR(CH₂) CO-, COCH=CR ' (CH^CO-,

CH₂S(0)_pCHR*(CH₂)_mC0-, CH₂NR'CHR(CH₂)^CO-,

P=O(OR')(CH_n) CO-, z m

R₃ θ R^, são, cada um deles independentemente, OH, H ou

NH₂;

R₄ é OH, H, NH₂ ou =0;

m é, independentemente, 0, 1, 2 ou 3; n é, independentemente, 1 ou 2,

R ' é H ou AlqC^ ;

R é H ou AlqC _o;

i-io

R é H, AlqC^ cicloalquilo C₃ (CH₂)_n^6^5’ (CH₂)_nC₅H₄N, (CH₂)_n0H, (CH₂)_nNH₂, ou (CH₂)_pNHC(NH)NH₂;

caracterizado por compreender, (a) acoplar os resíduos de aminoácidos apropriados, (b) remover facuitativamente quaisquer grupos protectores, e (c) modificar facuitativamente o terminal amino ou carboxilo do pêptido.
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por B ser um ou dois aminoácidos D ou L escolhidos a partir do grupo constituído por Ala, Gly, Vai, Ile, Leu, Met, His, Lys, Arg, Glx, Asx, Cys, Ser e Thr, ou ser uma ligação covalente, e Y ser um

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SKB CASE 14415

-195a três aminoácidos D ou L escolhidos a partir do grupo constituído por Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Vai, Arg, Lys, Thr, Ser, Cys, Glx e Asx ou ser uma ligação covalente.
3 - Processo para a preparação de um composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por Q ser um aminoácido D ou L escolhido a partir do grupo constituído por Ser, Thr, Asp e His e D ser escolhido a partir do grupo constituído por Glx, Asx, Ser, Ala, β -Ala, Ile, Leu, Vai e Met.
4 - Processo para a preparação de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por d ser 0 θ M ser -NHCHR^R₂·
5 - Processo para a preparação de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por R^ ser CH_C_ZH -R , CH C H ou AlqC , e R_ ser CHR CHR (CH„) CO-, 2 o Q 3 2 ο X χ 1 — > 2 2 2 m

CHR,CHR,,CHR.CO-, CHR,CHR.CHR’CO-, CHR,(CH_n) CO-, CO(CH„) CO-,

3 3’ 1 3 1 3 2 m 2 m ’

C0CR₁CHR’(CH₂)_mC0-, CHR₃CF₂(CH₂)_mC0-, -C0CF₂(0Η_?) CO-,

-P=P(OR’)(CH_) CO-,

2 m
6 - Processo para a preparação de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por Y ser um aminoácido escolhido a partir do grupo constituído por Ala,

Gly, Ile, Met, Asx, Arg e Vai ou ser uma ligação covalente e C e

D serem escolhidos a partir do grupo constituído por Glx, Asx e Ala.
7 - Processo para a preparação de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por R₂ser CH(0H)CH₂CH₂C0-.
8 - Processo para a preparação de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por B ser uma ligação covalente e a ser 0.

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SKB CASE 14415

-1969 - Processo para a preparação de um composto de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por b ser 0.
10 - Processo para a preparação de um composto de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por ou c ou e ser 0.
11 - Processo para a preparação de um composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto preparado ser:

2-(acetil-serilglutaminilasparaginil)amino-3-feniIpropilprolilvalil valinamida;

2-(serilglutaminilasparaginil)amino-3-f enilpropilprolilua lil valinamida;

4-(acetil-serilglutaminilasparaginil)amino-3-hidroxi-1-oxo-5-fenilpentilprolilvalil valinamida;

4-(acetil-serilglutaminilasparaginil)amino-3-hidroxi-l-oxo-5-fenilpentilvalil valinamida;

4- (seril-glutaminilasparaginil)amino-3(S)-hidroxi-l-oxo-5-fenilpentilvalil valinamida;

5- (carbobenziloxi-alanilalanil)amino-6-fenil-4-hidroxi-(l-oxo)hexil-valil valinol;

carbobenziloxi-alanil-(3-hidroxi-5-amino-6-fenil)hexano11 -valil-(4-aminometil)piridina; ou

5-(carbobenziloxialanilalanil)amino-4-hidroxi-6-fenil-(1-oxo)hexil-valina isobutilamida;

e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
12 - Processo para a preparação de um composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto preparado ser:

éster metílico de 2- (2-(terc-butoxicarbonil-serilalanilalanil)amino-1-oxo-3-feniIpropil)ciclopentilcarbonilvalil valina;

éster metílico de 2-(2-(serilalanilalanil)amino-l-oxo-3-fenilpropil)ciclopentilcarbonilvalilvalina;

éster metílico 2-(2-(terc-butoxicarbonil-serilalanilalanil)amino-1-hidroxi-3-fenilpropil)ciclopentilcarbonilvalil valina;

69 5Θ5

SKB CASE 14415

-197- -''Δ éster metílico de 2-(l-hidroxi-3-fenil-2-(serilalanilalanil)aminopropil)ciclopentilcarbonilvalilvalina;

éster metílico de 2-((l-metoxi-l-(2-fenil-l-(terc-butiloxicarbonilserilalanilalanil)amino)etil)fosfinil)ciclopentilcarbonil-valilvalina;

éster metílico de 2-( (l-hidroxi-l-(2-fenil-l-(serilalanil. alanil)amino)etil)fosfinil)ciclopentilcarbonil-valil valina;

éster metílico de 5-(terc-butoxicarbonil-serilalanilalanil)amino-4-hidroxi-1-oxo-6-fenil-hexil-valil valina;

éster metílico de 5-(terc-butoxicarbonil-serilalanilalanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-hidroxi-fenil)hexil-valil valina;

éster metílico de 4-(terc-butoxicarbonil-serilalanilalanil)amino-2,2-difluoro-3-hidroxi-l-oxo-5-fenilpentil-valil valina ;

éster metílico de 4-(serilalanilalanil)amino-2,2-difluoro -3-hidroxi-1-oxo-5-fenilpentil-valil valina;

éster metílico de 4-(serilalanilalanil)amino-2,2-difluoro -1,3-diox 0-5-f enilpentil-val il valina

5-(t-butiloxicarbonilserilalanilalanil)amino-4-hidroxi-6-(4-hidroxi)feni1-1-oxo-hexil-valil amida;

éster metílico de 5-((carbobenziloxi-D-seril)alanilalanil) amino-4-hidroxi-1-ox0-6-fenil-hexil-valil valina;

éster metílico de 5-( (D-seril)alanilalanil)amino-4-hidrox_i -1-oxo-6-fenil-hexil-valil valina;

5-(t-butiloxicarbonilserilalanilalanil)amino-6-(4-hidroxi) fenil-4-hidroxi-l-oxo-hexil-valil valina ;

5-(serilaianilalanil)amino-6-(4-hidroxi)feni1-4-hidroxi-1-oxo-hexil-valil valina;

éster metílico de 2-((l-hidroxi-2-(serilalanilalanil)amino- 3-ciclo-hexil)propil)ciclopentanocarbonil-vaiil valina;

éster metílico de (4S,5S) 5-(carbobenziloxialanil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina;

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SKB CASE 14415 ~ d·· /

-198éster metilico de (4S,5S) 5-(alanil)amino-4-hidroxi-l-oxo -6-fenil-hexil-valil valina;

éster metilico de (4S,5S) 5-(terc-butiloxicarbonilalanil) amino-4-hidroxi-1-oxo-6-(4-hidróxifenil)hexil-valil valina;

éster metilico de (4S,5S) 5-alanilamino-4-hidroxi-l-oxo-6-(4-hidroxifenil)-hexil-valil valina;

éster metilico de (4S,5S) 5-(alanilalanil)amino-4-hidrox_i -1-oxo-6-(4-hidróxifenil)hexil-υalil valina;

éster metilico de (4S,5S) 5-/~(^carbobenziloxi-/3-alanil)alanil_7amino-4-hidroxi-1-oxo-6-(4-hidróxifenil)hexil-valil valina ;

éster metilico de (4S,5S) 5-/^_(|3-alanil)alanil_7^aí^I>ino-4-hidroxi-l-ox0-6-(4-hidroxifenil)hexil-valil valina;

éster metilico de (4S,5S) 5-(alanilalanil) amino-4-hidroxi. -1-ox0-6-cic1o-hexil-hexil-valil valina;

éster metilico de (45,5S) 5-(carbobenziloxialanilalanil)amino-4-hidroxi-1-oxo-6-fenil-hexil-valil valina ;

éster metilico de (4S,5S) 5-(alanilalanil)amino-4-hidroxi. -l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina;

éster benzilico de (4RS,5S) 5-amino-6-(4-hidroxi)fenil-4-hidroxi-l-oxo-hexil-valil valina;

éster metilico de (lR,2R) 2-(((lS,2S)-l-hidroxi-2-amino-3-ciclo-hexil)propil)ciclopentanocarbonil-valil valina;

éster metilico de (4S,5S) 5-amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina;

éster metilico de (4S,5S) 5-(terc-butiloxicarbonil)amino-4-hidroxi-l-oxo-6-fenil-hexil-valil valina;

éster metilico de (4S,5S) 5-(metoxicarbonil-alanilalanil) amino-6-fenil-4-hidroxi-(l-oxo)hexil-valil valina; ou éster metilico de ácido (4RS,5S) 5-((terc-butiloxicarbonil)isoleucil)amino-7-metil-4-hidroxi-l-oxo-octil-1eucil-aspártico ;

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SKB CASE 14415

Z?

-199ou suas carboxamidas;

e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
13 - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender a mistura de um composto preparado de acordo com qualquer uma das reivindicaçBes 4-11 com um veiculo farmaceuticamente aceitável.
14 - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender a mistura de um composto preparado de acordo com qualquer uma das reivindicaçães 4-11, azi. dotimidina e um veículo farmaceuticamente aceitável.
15 - Processo para a preparação de um composto de fórmula:

em que:

R_Ã é AlqC₁__3> - ( CH₂ ) _nSAlqC₁_₅ , - ( CH₂ ) ^AlgC^ ,

-(CH„) cicloalquiloC, _ ou -(CH_O) C.H.-R ;

2 n 3-7 ' 2 m 6 4 a

R é halogéneo, NO , OH, OAlqC , NH ou H;

R₅ é H;

Rg é CH^CO, AlqC^ Dns, Cbz ou Boc, au quando tomados em conjunto R^ e Rg são ftalimida;

m é, independentemente, 0, 1, 2 ou 3; n é, independentemente, 0 ou 1;

— indica uma ligação ou simples ou dupla;

X é H, halogéneo, OH, OAlqC^ NHR’R ou OCOAlqC^ e

R' e R são H ou AlqC^ caracterizado por compreender,

a) a reacção de um composto de fórmula

69 585

5KB CASE 14415

-200- com um éster de prolina,Δ 3-Pro ou 2-carboxipiperidina, sob condições redutoras; e facultativamente seguida por:

b) conversão do éster num ácido carboxílico, éster ou amida; e

c) conversão do ácido num éster, amida, anidrido ou haljs to de acilo.
16 - Processo para a preparação de um composto de fórmula:

em que:

é ^fllqC^_₃, -(CH₂)_nDAlqC_1-5, -(CH₂)_ncicloalquilo C^ ?

ou (CH ) C H -R ;

2 m 6 4 a

R₄ é DH, NH₂, H ou =0;

R_g é halogéneo, N0₂, OH, OAlqC^ , NH₂ ou H; m é, independentemente, 0, 1, 2 ou 3; n é 0 ou 1;

R₅ é H;

R^ é CH^CO, AlqC^ Dns, Cbz ou Boc, ou quando tomados em conjunto R^ e R^ são ftalimido;

X é H, halogéneo, OH, OAlqC^ l\IHR'R ou OCOAlqC^ e

R¹ e R sao H ou AlqC^_₃, caracterizado por compreender,

69 585

SKB CASE 14415 's

-201a) a oxidação a um ácido ceto-carboxílico, de um composto de Fórmula:

em que Rg é OH ou =0;

e, em seguida, em qualquer ordem:

b) redução ou aminação redutiva opcionais do grupo ceto; e

c) conversão opcional do ácido carboxilico num éster, ami da, aldeído, anidrido ou haleto de acilo.
17 - Processo para a preparação de um composto de fórmula:

em que:

é AlqC_JL_₅, -(CH₂)_r|DAlqC₁_₅ , - (CH₂) _ncicloalquilo C^ _? ou -(CH.,) C.H.-R ;

' 2 m 6 4 a

Rj ' é H, AlqCj-_ç-, - ( CH₂ ) _n0AlqC^_₃ , - (CH₂ ) ^cicl oalquiloC^ ?

ou -(CH ) C.H.-R ;

2 m 6 4 a

R₄ é DH, NH₂, H ou =0;

R_g é halogéneo, N0₂, OH, OAlqC^ , NH₂ ou H; m é, independentemente, 0, 1, 2 ou 3; n é, independentemente, 0 ou 1;

R_ é H; 9

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SKB CASE 14415

-202R é CH^CO, AlqC , Dns, Cbz ou Boc, ou quando tomados em conjunto, R^ e R^ são ftalimido;

X é H, halogéneo, OH, OAlqC^ NHR'R ou OCOAlqC^ e

R' e R são H, ou AlqC^ desde que R^ não seja isobutilo; caracterizado por compreender,

a) a oxidação a um ácido carboxílico, de um composto de fórmula:

em que Rg é OH ou =0;

e, em seguida, em qualquer ordem:

b) redução ou aminação redutiva opcionais do grupo ceto;

c) conversão opcional do ácido carboxílico num éster, ami. da, aldeído, anidrido ou haleto de acilo.
18 - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterí. zado por R^’ ser H, R^ ser ΟΗ₂Ο^Η^-Η₃ e R^ ser OH ou =0.
19 - Processo para a preparação de um composto de fórmula:

em que:

R₁ é AlqC_i_₅, -(CH₂)_nOAlqC₁_₅, -(CH₂)_ncicloalquilo C^ ?

ou -(CH ) C H.-R ;

2 m 6 4 a

R_g é halogéneo, N0₂, OH, OAlqC^ NH₂ ou H; mé 0, 1, 2 ou 3; n é, independentemente, 0 ou 1;

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SKB CASE 14415

-203Rg é CH^CO, AlqC^ Dns, Cbz ou Boc, ou quando tomados em conjunto R^ e Rg são ftalimido;

X é H, halogéneo, OH, 0AlqC^_₃» NHR'R ou OCOAlqC^ ; e R* e R” são H ou AlqC^_^;

caracterizado por compreender,

a) a oxidação a um ácido carboxílico, de um composto de fórmula:

e, em seguida:

b) hidrólise opcional do fosfinato de alquilo ao ácido fosfinico; e

c) conversão opcional do ácido carboxílico num éster, ami da, aldeído, anidrido ou haleto de acilo.