PT90638B - Processo para melhorar a resposta imunitaria e de preparacao de analogos 7-desaza-7-oxa- e 7-desaza-7-tia- de derivados 8-substituidos de 9-(1'-beta-d-aldoglicosidil)guanina - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 90 638

REQUERENTE: SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION, norte-americana (Estado de Califórnia),com sede em 10666 North Torrey Pines Road, La Jolla , Califórnia 92037, Estados Unidos da América.

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA MELHORAR A RESPOSTA IMUNITÁ RIA E DE PREPARAÇÃO DE ANÁLOGOS 7-DESAZA-7-OXA- E 7-DESAZA-7-TIA- DE DERIVADOS 8-SUBS TITUÍDOS DE 9—(1'-BETA-D-ALDOGLICOSIDIL)GUA NINA .

INVENTORES:

Michael Goodman e Edward P.Gamson.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América, com o n^e.198.141 em 24 de Maio de 1988.

INPI. MOD. 113 RF 16732

268

EPG:11-SCRF 144.0

PATENTE NS. 90 638 tf ''

•'Processo para melhorar a resposta imunitá ria e de preparação de análogos 7-desaza-7-oxa- e 7-desaza-7-tia- de derivados 8-substituldos de 9-(1'-beta-D-aldogl icos_i dil)guanina para que

SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION, pretende obter privilégio de invenção em Portugal.

RESUMO presente invento refere-se a um processo para melhorar a resposta imunitária, caracterizado por compreender o contacto da leucócitos, num meio aquoso, com uma composição contendo uma quantidade diluente de um transportador fisiologicamente tolerável em associação com uma quantidade eficaz para resposta imunitá ria, de um ingrediente activo de derivado de análogo de guanosina cuja estrutura está de acordo com a da fórmula

onde

Z é 0 ou S ;

X é 0, S, Se ou NCN; e

R^ é um radical D-aldoglicosido ligado na posição beta, seleccionado entre o grupo consistindo de 1'-aldopentosidilo, 1'-aldo-hexosidilo, 1'-aldopentosidilo mono-desoxigenado e l'-aldo69 263

EPG:11-SCRF 144.0

-2-hexosidilo mono-desoxigenado e os seus derivados 0-substituIdos de alquilo de cadeia curta, alquilideno de cadeia curta, alcano_i lo de cadeia curta, benzilo e benzoilo e os sais de adição de b.a se não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis do referido derivado de análoqo de guanosina; e a manutenção do referido contacto por um período de tempo suficiente para as referidas células modularem a sua resposta.

invento refere-se também ao processo de preparação de análogos 7-desaza-7-oxa- e 7-desaza-7-tia- de derivados 8-substituldos de 9-(1'-beta-D-aldoglicosidil)guanina.

268

EPG:11-SCRF 144.0

-3MEMORIA DESCRITIVA

Campo da invenção presente inuento refere-se ao processo de preparação de compostos melhoradores da imuno-resposta (imuno-estimulantes) e mais particularmente, ao processo de preparação de deriuadas de guanina-nucleósido que estão substituídos nas posições 7 e 8 do anel de guanina, bem como ao processo de preparação de composições contendo esses derivados e a métodos que os utilizam.

Antecedentes da invenção

Um imuno-sistema animal compreende numerosos elementos que actuam separadamente e/ou em conjunto para contractuar, para elimi nar ou para neutralizar substâncias que são reconhecidas por esse sistema como estranhas ao animal hospedeiro. Geralmente, mas não necessariamente, a substância reconhecida como estranha pelo imuno-sistema tem uma origem exógena em relação ao hospedeiro. Exeni pios destas substâncias exógenas são as bactérias infecciosas e os sub-produtos da sua actividade celular, partículas de vírus e as suas proteínas, proteínas injectadas por picadas de insecto e similares. Em doenças auto-imunes, tais como a artrite reumató_i de, o imuno sistema do hospedeiro reconhece as proteínas produzidas no hospedeiro ou as proteínas auto-produzidas como estranhas.

Os intervenientes principais do imuno-sistema são os leucócitos que incluem os linfocitos de origem tímica (células T), os linfocitos produzidos na medula óssea (célula 8), os neutrófilos que inter alia produzem enzimas que produzem agentes oxidantes, tais como o peróxido de hidrogénio que têm efeitos cititóx_i cos nas bactérias e os macrofagos que apresentam a substância estranha ou antigénio às células T, bem como produzem uma proteína designada por interleucina-1 que auxilia a transformação das cél_u las T em células T auxiliares. 0 complemento, que é uma mistura complexa de proteínas que actua de uma forma ordenada em cascata na substância estranha desempenha também um papel importante nas imuno-respostas.

268

EPG;11-5CRF 144.0

-4As células B podem distinguir-se das células T, inter alia pela presença de imuno-globulinas nas suas superfícies de membrana. As imunoglobulinas actuam como anticorpos.

Existem cinco classes conhecidas de imunoglobulinas identificadas por IgA, IgD, IgE, IgG e IgM com base em cinco proteínas de cadeia pesada antigenicamente diferentes que em parte cons tituem a molécula de imunoglobulina. As células B compreendem também marcadores de célula que não são imunoglobulina, incluindo um receptor de complemento (CR), um receptor para a porção Ec da imunoglobulina (FCR), antigénios associados à região I (la), e um conjunto de antigénios de diferenciação (Lyb 1-7) que são identificados por todos os anti-soros e que estão correlacionados com vários aspectos da maturação e actiuação das células B. Estes marcadores são úteis na identificação fenotípica das células B.

Enquanto que as imunoglobulinas de células B actuam na substância estranha, ou antigénio, crê-se que as células T e, pa_r ticularmente, as células T auxiliares, são necessárias para estimular as células B a dividirem-se a diferenciarem-se em células segregando anticorpos para a imunidade humoral. As células T supressoras contribuem para a regulação da imunidade humoral, enquan to que as células T citotóxicas e os mediadores de células T de hipersensibilidade do tipo retardado, são os principais intervenientes da imunidade mediada por células.

As células T incluem antigénios designados por CD4 e CD8 que estão relacionados com as funçães de células T. Os precursores das células T auxiliares são do fenotipo CD4⁺ e CD8~. S3o es tas células que participam normalmente na activação e na regulação das células B.

E conhecido que as células T auxiliares auxiliam a activa. ção e a diferenciação das células B segregando imunoglobulina após as células B receberem uma primeira mensagem do agente antigénico activante. Contudo, o modo pelo qual as células T fornecem a segunda mensagem para a proliferação de células B (ou activação) e para a diferenciação é uma matéria controversa.

monofosfato de guanosina-3',5'-ciclico (cGMP) tem sido

268

EPG:11-SCRF 144.0

Λ /

-5implicado como sendo um agente natural que fornece a segunda mensagem requerida para a proliferação das células B. Tem-se verifi. cado que o monofosfato de 8-bromoguanosina-3',5'-ciclico (8-BrcGMP) é um mitogeno de linfócito intracelular, sintético, fraco.

A imuno-resposta pode ser modificada por supressão artifi ciai (imuno-supressão) ou por melhoria artificial (imuno-potencia^ ção ou imuno-estimulação). A imuno-supressão; i.e., uma menor resposta induzida artificialmente, pode ser conseguida por seis métodos gerais: (l) administração de antigénio, (2) administração de anti-soros ou de anticorpos específicos, (3) uso de outros reagentes biolégicos tais como anti-soro anti-linfocitos, (4) uso de drogas ou de hormonas, (5) radiação e (6) remoção cirúrgica do tecido linfoide. A imunopotenciação pode incluir a administração de um agente que provoque um aumento na velocidade à qual a imuno -resposta se desenvolve, um aumento na intensidade ou no nível da resposta, um prolongamento da resposta, ou o desenvolvimento de uma resposta a uma substância que, de outro modo, seria não imunj) génica.

Os agentes conhecidos que melhoram as imuno-respostas são geralmente designados por adjuvantes e podem ser colocados em duas categorias gerais: (l) os que conferem uma potenciação geral; i.e., substâncias que aumentam as imuno-respostas tanto celulares como humorais para uma grande variedade de antigénios e (2) os que conferem uma potenciação específica, i.e., substâncias que me lhoram as respostas específicas apenas para certos antigénios.

As substâncias que podem actuar como adjuvantes podem ser agrupadas nas categorias seguintes: (l) emulsões de água e óleo,

p.e., adjuvante de Freund, (2) polinucieótidos sintéticos, (3) hormonas, drogas e nucleótidos cíclicos, (4) endotoxinas, (5) li_n focinas e monocinas proteinaceas tais como as interleucinas.

factor de transferência, um extracto de leucócitos dialisável (DLE) obtido a partir de leucócitos periféricos humanos, é uma substância capaz de potenciar especificamente a imuno-resposta. Tem sido publicado que o factor de transferência exibe al. guma eficácia em pacientes com imunodeficiências e uma possível

268

EPG:11-SCRF 144.0

-6eficácia em pacientes cancerosos e em pacientes com imunodef iciê_n cias limitadas. Contudo, há ainda muito para aprender sobre esta substância particular.

Em algumas doenças e condiçSes fisiológicas tais como a SIDA, agatnaglobulinemias X-ligadas senescência e imuno-supressão induzida por drogas, a activação e a diferenciação de células B estão ausentes e/ou existem apenas a um nível reduzido, diminuindo deste modo a imuno-resposta do hospedeiro. Estas doenças e condiçães são representativas de estados imuno-suprimidos. Aqui, a melhoria da activação e da diferenciação, se se puder realizar, tende a minorar beneficamente a manifestação da doença e/ou a melhorar a condição do paciente.

Um estado imuno-potenciado pode ser ilustrado pela condição do organismo após a vacinação. Aqui, a imuno-resposta está já melhorada devido a uma resposta antigénica, mas pode ser beneficamente melhorada ainda mais por forma a obter-se um melhor grau e/ou uma maior duração da imunidade.

A Patente dos E.U.A. nS. 4 539 205 co-atribuída a Goodman e Weigle descreve a modulação de respostas celulares animais com derivados 8-substituídos da guanina ligados 9-1' a uma aldose com 5 ou 6 átomos de carbono na cadeia de aldose (anel). As modulaçães celulares que se descrevem nessa patente referem-se principalmente à imuno-modulação, tal como a adjuvanticidade, na produção de imuno-respostas primárias e secundárias. Descreve-se também a actividade contra certas condiçães neoplasticas, bem como a actividade de substituição de células T, uma actividade do tipo IL-1 em timocitos e a indução da libertação de enzimas lipossómicas de neutrófilos. Os substituintes na posição 8 dessas moléculas têm efeitos indutivos atractores de electróes em relação ao hidrogénio. Assim, são descritos como úteis os grupos halogéneo, mercapto ou o seu tautómero tioxo, acilmercapto, alquilsulfureto, nitro, ciano, ceto, halometilo e metilenoxialquilo e similares, enquanto que se verificou que os substituintes doadores de electrães, tais como um grupo amino, eram inactivos.

Adicionalmente, a patente dos E.U.A. nS. 4 643 992 co69 268

EPG:11-SCRF 144.0

-atribuída e o pedido de patente Europeia publicado n9. 83306791.1 descrevem também o uso de derivados de 8-hidroxiguanina (8-oxogua. nina), 7-metil-8-oxoguanina e 7metil-8-tioxoguanina na modulação de respostas celulares animais. Na patente dos E.U.A. ns.

643 992 descrevem-se também outros resultados usando derivados de guanina descritos na patente dos E.U.A. nS. 4 539 205, bem como resultados similares usando derivados de guanina descritos pela primeira vez nessa patente.

Tem também sido publicados vários artigos e capítulos de livros por alguns dos presentes inventores e pelos seus colaboradores relativos ainda a outros efeitos dos compostos que se descrevem e reivindicam na patente dos E.U.A. nS . 4 643 992. Exemplos desses artigos publicados incluem Goodman, Proc. 5oc. Exp. Biol. Med. , 179:479 (1985); Goodman, 3. Immunol., 136: 3335 (1986); Goodman e Weigle em Purine Metabolism In Man, Part B, Nyhan e Thompson, eds., Plenum Press, Neiu York, pág. 451 e 443 (1986); Goodman e Weigle, 3. Immunol., 135:3284 (1985); Goodman, 3. I mmunol., 136:3335 (1986); Goodman, 3. Immunol., 137:3753 (1986); e Goodman e Hennen, Cell. Immunol., 102:395 (1986).

Breve sumário da Invenção presente invento refere-se ao processo de preparação dos compostos, de composições farmacêuticas compreendendo um desses compostos e a métodos que utilizam uma dessas composições. Os compostos são análogos de 7-desaza-7-oxa- ou 7-desaza-7-tia- de derivados 8-substituídos de guanina-9-(1'-beta-D-aldoglicosidil), derivados O-substituídos no aldoglicosidilo com alquilo de cadeia curta, alquilideno de cadeia curta, alcanoilo de cadeia curta, benzilo e benzoílo e os seus sais de adição de base não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis. Os compostos têm uma estrutura que corresponde à fórmula I seguinte:

X

268

EPG:11-SCRF 144.0 //

-8onde Z é oxigénio (0) ou enxofre (S); X é oxigénio (□), enxofre (S), selénio (Se) ou cianimino (NCIM) ; e R é um aldoglicósido ou um derivado que aqui depois se descreve, bem como os seus sais de adição de base, não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis.

As imuno-respostas animais são melhoradas pondo em contac; to os leucócitos, num meio aquoso, com uma composição contendo uma quantidade diluente de um transportador fisiologicamente tolerável misturada com uma quantidade eficaz de um composto da invenção. 0 contacto entre as células e a composição é mantido por um período de tempo suficiente para que os leucócitos postos em contacto manifestem uma melhoria da sua imuno-resposta.

A melhoria das imuno-respostas humorais especificas de imunogénio (antigénio), resultando em adjuvanticidade que confere uma secreção melhorada de anticorpos na presença de imunogénio, é um exemplo particular de uma imuno-resposta que pode ser melhorada de acordo com o presente invento.

Pode usar-se uma composição, melhoradora da imuno-resposta, do presente invento para provocar resultados diferentes, ainda que relacionados, dependendo, inter alia, do modo de administra ção, da dosagem e da população de células à qual é administrada.

ingrediente activo de derivado de análogo de guanosina está pre sente na composição misturada no transportador na forma de uma suspensão de derivado de análogo de guanosina sólido num transpo_r tador sólido ou líquido, ou na forma de um soluto dissolvido no transportador.

Pondo em contacto leucócitos, tais como linFocitos 8, com uma composição do presente invento e mantendo esse contacto duran te um período de tempo predeterminado, melhora-se a imuno-resposta desses leucócitos. Pode realizar-se a melhoria das respostas de linfócitos B (células B) tratando as células B com uma quantidade eficaz do imunogénio para formar células B preparadas com imunogénio, seguindo-se o contacto das células B com a composição melhoradora da imunoresposta e com uma quantidade eficaz adicional de imunogénio. As imuno-respostas de células B podem também ser moduladas pondo em contacto as células B com um imunogénio

268

EPG:11-SCRF 144.0

-9preparativo e com uma composição melhoradora da imuno-resposta da invenção seguido depois do contacto dessas cálulas com uma quant_i dade eficaz adicional do imunogánio sozinho ou com uma quantidade adicional de composição melhoradora da imuno-resposta. Adicional, mente, pode administrar-se uma composição melhorada imuno-resposta para o contacto com as células animais e, depois, seguindo-se, enquanto o derivado de análogo de guanosina está em contacto com as células animais; i.e., presente in vivo ou in vitro, uma ou mais doses imunizantes de um imunogénio. Estas melhorias de imuno-resposta incluem-se nos efeitos designados por adjuvanticidade;

i.e.; o derivado de análogo de guanosina actua como adjuvante para o imunogénio, e assim, constitui uma modulação específica de imunogénio ou de antigénio.

□s métodos do presente invento podem ser usados em células in vivo bem como in vitro para culturas de células. As composições podem ser administradas subcutânea, intravenosa ou intraperj. tonealmente, numa forma liquida ou peroralmente na forma de um comprimido ou cápsula, ou numa forma líquida tal como uma pasta, suspensão ou solução.

presente invento tem vários benefícios e vantagens.

Um beneficio do presente invento reside no facto de os seus compostos serem eficazes na obtenção de uma resposta melhora^ da para uma dada dose.

Uma vantagem da invenção consiste no facto de o uso de uma das suas composições poder constituir a segunda mensagem reque rida para a activação e diferenciação dos linfócitos B em resposta a uma primeira mensagem (antigénica).

Outro benefício da invenção consiste no facto de se poder efectuar uma imuno-resposta melhorada tanto na presença como na ausência de actividade de células T auxiliares. Assim, nota-se uma imuno-resposta melhorada tanto em sistemas dependentes de células T como em sistemas independentes de células T.

Outra vantagem da invenção reside no facto de se poderem melhorar e/ou minorar, pelo uso da invenção, condições particulares imunosuprimidas ou imuno-deficientes e manifestações de doença.

26Θ

EPG:11-SCRF 144.0

-10Ainda outros benefícios e vantagens da invenção serão ev_i dentes para os peritos na arte a partir da discussão que se segue.

Usam-se aqui descriçães antropomórficas tais como o encio e a recepção de mensagens por e para químicos e células, para pro pósitos descritivos como auxiliares para a compreensão dos fenóme nos observados.

Descrição detalhada da invenção

I. Introdução presente invento contempla um agente melhorador da imuno-resposta (imuno-estimulante) que estimula o imuno-sistema do animal hospedeiro ao qual é administrado, bem como estimula leuco eitos em culturas de células. A imuno-estimulação particularmente contemplada é predominantemente especifica de antigénio para o antigénio imunizante.

Ao estudar os efeitos de alguns derivados de guanosina mi togénicos conhecidos, p.e., o monofosfato de guanosina-3 ' , 5 '-cicl_i ca e o seu derivado de 8-bromo, verificou-se que uma nova classe de derivados de guanina-nucleósido de baixo peso molecular, quando presentes numa quantidade eficaz como ingrediente activo de uma composição contendo uma quantidade diluente de um ttransporta dor fisiologicamente tolerável, tinha efeitos notáveis na modulação de respostas de células de mamíferos. A melhoria das imuno-respostas humorais especificas de antigénio, que resultam numa adjuvanticidade potente, uma actividade do tipo factor de substituição de células T e uma actividade de imuno-reconstituição, são exemplos particulares de respostas celulares que se verificou serem moduladas. Esses compostos e os seus métodos de utilização estão descritos nas Patentes dos E.U.A. n9. 4 539 205 e n^Q.

643 992.

II. Ds compostos

Análogos 7-desaza-7-tia e 7-desaza-7-oxa de derivados de guanosina 8-substituidos

1. Análogos de guanosina

Um composto do presente invento é um derivado de um análo

268

EPG:11-SCRF 144.0

-ligo de guanina. A guanina é ela própria um derivado da purina que tem uma estrutura que corresponde à fórmula II, seguinte, onde os números indicam as posições do anel.

Um composto do presente inventa contém um átomo de oxigénio ou de enxofre (0 ou S) substituindo o azoto imino da posição 7 de uma guanina e deste modo pode ser designado por um análogo de guanina. Estes compostos podem também ser designados por 7-desaza-7-oxa- e 7-desaza-7-tiaguaninas, respectivamente.

Um composto do presente invento cobtém também um radical divalente (=0, =S, =Se ou =N-CN) substituindo o hidrogénio (h) na posição 8 da guanina e inclui também um aldoglicósido ligado na posição 9. Um análogo de guanina ligado 9,1'-beta a um grupo ribosilo pode ser designado por um derivado de análogo de guanosina.

A frase derivado de análogo de guanosina'· é aqui usada genericamente para incluir compostos que têm radicais aldoglicôsi. do em vez de radicais ribosilo, bem como os que contêm radicais ribosilo. A compostos específicos são dados os nomes apropriados.

2. A1doqlicós idos

A porção 9-aldoglicósido (R^) dos derivados de análogos de guanosina úteis é cíclica, contém 5 ou 6 átomos de carbono, e ê seleccionada entre o grupo consistindo de l*-aldopentosidilo, l'-al. do-hexosidilo , 1'-aldopentosidilo mono-desoxigenado e radicais 1'-aldo-hexosidilo mono-desoxigenado. Os aldoglicósidos úteis estão ligados à posição 9 do análogo de guanina, respectivamente e estão na configuração D. Os al dogl icósi dos estão isentos de carga eléç. trica aos valores de pH fisiológicos e estão deste modo isentos de substituintes carboxilo, fosfato e amónio quaternário.

260

EPG:11-SCRF 144.0

-12Exemplos de radicais 1'-aldopentosidilo são os radicais 1' de ribose, arabinose, lixose e xilose que são designados, respect_i vamente, por radicais 1'-ribofuranosidilo, 1'-arabinofuranosidilo, 1'-lixofuranosidilo e 1'-xilofuranosidilo, Exemplos de radicais 1'-aldo-hexodilo são os radicais 1' de glucose, galactose, manose, gulose, alose, altrose e ramnose que são designados, respectivamente, por radicais 1'-glucopiranosidilo, 1'-galactopiranosidilo,

1'-manopiranosidilo, 1'-gulopiranosidilo, 1’-alopiranosidilo, 1'-altropiranosidilo, 1'-ramnopiranosidilo. Um exemplo de um radical 1'-aldopentosidilo mono-desoxigenano é um radical da desoxir_i bose que é designado por radical 1'-(2'-desoxi)-ribofuranosidilo. Um exemplo de um radical 1'-aldo-hexosidilo mono-desoxigenado é um radical da desoxiglucose, designado por radical 1'-(2'-desoxi)glucopiranosidilo.

Os radicais aldoglicosidilo úteis podem ter um ou mais grupos hidroxilo esterificados com um radical alcanoilo de cadeia curta tal como formilo, acetilo, propionilo ou hexanoilo (radicais alcanoiloxilo de cadeia curta) e também com um radical benzoilo. Os radicais aldoglicosidilo são também úteis quando esterificados com radicais alquilo de cadeia curta, especialmente radicais metilo e etilo (alcoxilo de cadeia curta), radicais benzilo e radicais alquilideno de cadeia curta. Os 2'-desoxialdogl ic_o sidos são também úteis como ésteres e como éteres.

Os radicais aldoglicosidilo adequados têm a fórmula

onde n é um ou zero, de modo que quando n é zero, o grupo ^CHR^ está ausente e o aldoglicosido é um radical aldopentosidilo, enquanto que, quando n é um, o aldoglicosido é um radical aldo-he xosidilo ;

R2 é hidrogénio, hidroxilo, alcoxilo de cadeia curta, tal

263

EPG:11-SCRF 144.0

-13como metoxilo, etoxilo e similares, benziloxilo, alcanoiloxilo de cadeia curta, tal como formiloxilo, acetoxilo e similares ou benzoxilo.

R-j quando presente, bem como os radicais R^ e R^, s2o todos preferivelmente o mesmo. Estes radicais podem ser hidroxilo, um éter de alquilo de cadeia curta (alcoxilo de cadeia curta) tal como metoxilo e etoxilo, um éter de benzilo (benziloxilo), um radical alcanoilo de cadeia curta (alcanoiloxilo de cadeia curta) tal como formiloxilo, acetoxilo ou um éster de benzoato (benzoxilo). Quando R₂ é diferente de hidrogénio, prefere-se que R₂ = R^ (quando presentes) = R^=R^. Assim, um O-substituinte, quando pre^ sente num oxigénio está preferivelmente presente em todos os oxigénios substituintes no anel, disponíveis.

Numa outra concretização, quando n = 0 (R-j está ausente) e R? e R4 estão numa configuração cis, tal como na ribose e podem formar juntos um radical alquilidenodioxilo de cadeia curta. Um radical alquilidenodioxilo de cadeia curta é um cetal ou um acetal que se forma, respectivamente, a partir de uma cetona ou de um aldeído de alquilo de cadeia curta (C^-C^). Um radical alquilidenodioxilo de cadeia curta, particularmente preferido, forma-se a partir da acetona e é designado por isopropiiidenodioxilo. Quando R₂ e R^ formam juntos um radical alquilidenodioxilo, R <- é preferivelmente hidroxilo, alcanoiloxilo de cadeia curta ou benzoxilo.

Tal como é aqui utilizada, a designação de cadeia curta em conjunção com alcoxilo de cadeia curta, alquilo de cadeia curta, alcanoiloxilo de cadeia curta ou alcanoilo de cadeia curta, refere-se a um derivado da alquilo Ds radicais alcoxilo de cadeia curta incluem metóxilo, etoxilo, iso-propoxilo, ciclopentoxiio, hexiloxilo e similares, enquanto que os radicais alcanoiloxilo incluem, formiloxilo, acetoxilo, propioniloxilo, bjj tanoiloxilo, ciclopentanoiloxilo, hexanoiloxilo e similares.

Não se pretende que as ligaçóes da fórmula anterior tenham qualquer configuração estereo-específica particular, excepto para a posição 1' para a qual se indica 0 anómero beta e é contemplada

266

EPG:11-SCRF 144.0

-14a forma D do aldoglicósido.

Na prática preferida, o radical al dogl icos idil o é selecci. onado entre o grupo consistindo dos radicais 1'-ribofuranosidilo, '-glucopiranosidilo e 1'-(2’-desoxi)ribofuranosidilo. Assim, preferivelmente, quando n é zero e F^, R^ θ R^ são todos hidroxilo, R^ está ausente e o radical aldogl icosidilo é seleccionado e_n tre o grupo consistindo de 1'-ribofuranosididlo; quando n é zero, R2 é hidrogénio e R^ e R^ são hidroxilo, R^ está ausente e 0 rad_i cal aldoglicosidilo é o 2’-desoxi-l'-ribofuranosidilo5 e quando n ê 1 e ^2 ⁼ R3 ⁼ Rq = R5 ~ hidroxilo, 0 1'-glucopiranosidilo é um radical aldoglicosidilo.

Tal como anteriormente se referiu, o aldoglicosido está ligado pela sua posição 1' à posição 9 de um derivado de análogo de guanosina. Quando é designado por derivado de análogo de guanosina, essa ligação pode ser designada por ligação 9-1'. Prefere-se aqui 0 anómero beta do aldoglicosido se bem que as misturas dos anómeros alfa e beta sejam também úteis.

3. Exemplos de agentes melhoradores da imuno-resposta

Mostram-se seguidamente as fórmulas de exemplos de agentes melhoradores de imuno-resposta da invenção que são úteis numa composição e num método do presente invento, onde X, Z e R^ têm o significado que se indica na tabela 1, seguindo as fórmulas estru turais.

Tabela 1

Z_ __X ^R1

0

1'-ribofuranosidilo 1’-lixofuranosidilo 1'-glucopiranosidilo

268

EPG:11-SCRF 144.0

S

S s

s s

s s

s s

s s

s s

s

Ξ s

s s

Se Se S e S e S e S e S e S e

NCPJ

NCN

NCN

-151'-(2-desoxi)ribofuranosidilo 1'-gulopiranosidilo 1'-alopiranosidilo 1'-xilofuranosidilo 1'-(2', 3',4',6'- tetra-0-metil)gulopiranosidilo 1'-ribofuranosidilo 1’-alopiranosidilo l*-(2',3',5'-tri-D-benzoil)galoct£ piranos idilo

1'-manopirosidilo

1'-ribofuranosidilo

1'-(2',3',4',6’-tetra-O-benzil)altropiranosidilo

1'-ribofuranosidilo

1'-lixofuranosidilo

1'-glucopiranosidilo

1'-(2'-desoxi)ribofuranosidilo 1'-gulopiranosidilo 1'-alopiranosidilo 1 '-xilofuranosidilo 1 ' - (2 ' ,3' ,4 ' ,6 '-tetra-0-metil)gul_o piranosidilo 1 '-ribofuranosidilo 1 '-alopiranosidilo 1'-(2 ' ,3',5'-tri-0-benzoil)galocto piranos idilo ' -(2 ' ,3'-isopropilidenil)ribofura nosidilo '-(2 ' , 3'-isopropilidenil)ribofura nosidilo substituinte na posição 8 dos derivados de análogos 7-desaza-7-oxa- e 7-desaza-7-tiaguanosina é preferivelmente oxo, enquanto que se prefere um derivado de análogo de 7-desaza-7-oxaguanosina em relação a um derivado de análogo 7-desaza-7-tiaguano sina.

268

EPG:11-SCRF 144.0

-16Compostos particularmente preferidos incluem, 7-desaza-7-oxa-8-oxoguanosina ou 7-desaza-7-cxa-8-oxo-9-(l’ - beta-D-ribo fura nosidil)guanina; 7-desaza-7-oxa-8-oxo-9-(l'-beta-D-2'-desoxiribo furanosidil)guanina; 7-desaza-7-oxa-8-oxo-9-(1'-beta-D-glucopira nosidil)guanina ; 7-desaza-7-tia-8-oxoguanosina ou 7-desaza-7-tia-8-oxo-9-(l'-beta-D-ribofuranosidil)guanina; 7-desaza-7-tia-8-oxo-9-(1'-beta-D-2'-desoxiribofuranosidil)guanina; e 7-desaza-7-tia-8-oxo-9-(l'-beta-D-glucopiranosidil)guanina.

Um derivado de análogo de guanosina útil está substancial, mente isento de carga iónica aos valores de pH fisiológicos; i.e., de cerca de pH 7,0 a cerca de pH 7,5, excepto para as cargas ióni cas que possam ser conferidas pelo átomo de azoto do anel, na posição 1, relativamente ácido. Assim, uma molécula útil está isen ta de grupos contendo ácido ou base que não estão presentes na guanosina. Essa ausência de grupos ácidos e básicos estende-se do radical R^, e através de toda a molécula de guanosina.

Os derivados de análogos de guanosina são ácidos e como tal podem formar sais de adição de base. Estes sais são úteis na obtenção de estabilidade de armazenamento e não conferem uma carga iónica adicionada a um derivado de análogo de guanosina usado num método da invenção em virtude do efeito tamponizante dos sistemas sanguíneo e linfático do hospedeiro ou do tampão de um meio de cultura.

No presente invento, são úteis os sais de adição de base, não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis, dos derivados de anál.o gos de guanosina, e podem ser obtidos por tratamento do agente melhorador da imuno-resposta com uma base apropriada, num solvente adequado, tal como água ou um álcool de alquilo de cadeia curta tal como metanol ou etanol. Exemplos de bases inorgânicas incluem, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amónio e similares. Exemplos de bases orgânicas incluem, tris(hi droximetil)aminometano (TRIS), ácido 4-(2-hidroxietil)-l-piperazino-etanossulfónico (HEPES) e bases similares. Inversamente, a forma de sal de adição de base pode ser convertida na forma de guanosina livre por tratamento com ácido.

268

EPG:11-SCRF 144.0

-174. Sínteses

Os derivados substituídos de análogos de guanosina úteis no presente invento são facilmente preparados por procedimentos análogos aos publicados na literatura química. Na secção Materiais e Métodos são aqui depois apresentados exemplos de sínteses.

Estas reacções exemplares seguem o percurso dos Esquemas reaccionais I e II que a seguir se apresentam. E de notar que nesses esquemas utilizam-se estruturas abreviadas para uma maior clareza da apresentação. Porém essas estruturas abreviadas são bem conhecidas dos peritos na arte da síntese orgânica.

Adicionalmente, a reacção de fecho do anel de 5-membros para formar um derivado 8-oxo ou 8-tioxo é apresentada para o derivado oxo mostrando-se entre parêntesis o reagente para formar o substituinte tioxo. Assim que se mostra o anel de 5-membros fechado, o átomo de enxofre, S, que pode ocupar, alternativamente, a posição 8, está indicada entre parêntesis.

Por outro lado, os compostos cuja síntese não é especificamente discutida, na secção Materiais e Métodos, ou estão comercialmente disponíveis ou a sua síntese pode ser encontrada em uma ou mais publicações.

Esquema I

COOCH_V / ³

B r — C + 0 H 0 N a l\ ^{3 x}CQ0CH₃

CH^O

COOCH' CQ0CH₃

NH + NH—C ² \

NH,

NaOCH

HC1 --->

CH OH, Δ

0CH₃

OH

26Θ

8PG:11-SCRF 144.0 z**

-18P0C1,

-2->

Piridina

Cl

269

FPG:11-SCRF 144.0

och₃

268

EPG:11—SCRF 144.0

COOCH.

CH-20Esquema II

COOCH-, Ç^H:

/ 3 I

Br—C + HSCH_OCH_O—Si— CH.

k₂co₃ / \

H COOCH.

H- C- SCH₂CH₂- Si- CH^ z

+ NH„ - C ~ ² \

CH.

NH

NH»

NaOCH.

HCl

CHjOH

COOCH.

CHP0C1

Piridina

sch₂ch₂

Cl

CH.

Si- CH.

CH.

SCH_OCH„-Si-CH 2 2 ί

OH

1B

CH.

CH.

268

EPG:11-SCRF 144.0

II

EtOCCl ou

NaOH

-21(EtOCCl)

II s

X X

268

EPG:11-SCRF 144.0

A = aquecimento ao refluxo; t-butil = ter-butil;

o = isopropilidenodioxilo; o

Et = etilo;

EtOH = etanol;

THF = tetra-hidrofurano; n9u = butilo normal

Os derivados de 8-selenoxo e de 8-cianoimino são preparados a partir dos derivados 8-tioxo correspondentes. Aqui, alquila-se primeiro o composto de 8-tioxo com iodeto de metilo e faz-se depois reagir o sal de tiónio assim formado, com seleneto de sódio ou com cianamida e hidreto de sódio para formar os derivados 8-selenoxo ou 8-cianimino respectivos.

III. Composiçães

Uma composição do presente invento compreende uma quantidade diluente de um transportador fisiologicamente tolerável (tajn bém aqui designado por veículo ou diluente) misturada com uma quantidade eficaz imuno-potenciante (melhoradora da imuno-resposta ou imuno-estimulante) de um derivado de análogo de guanosina, ou de um seu sal, da invenção, tal como anteriormente se descreveu

268

EPG:11-SCRF 144.0

-23Uma composição para administração in vivo é tipicamente apresentada, para administração oral ou parenteral, na forma de composições de unidades de dosagem usuais. 0 termo unidade de dosagem e os seus equivalentes gramaticais, tal como são aqui uti lizados, referem-se a unidades fisicamente discretas adequadas cjq mo doses unitárias para pacientes humanos e para outros mamíferos, cada unidade contendo uma quantidade eficaz predeterminada do ingrediente activo de derivado de análogo de guanosina, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o transportador fisiologicamente tolerável requerido, p.e., um dilu ente ou um veículo. As especificações para as novas formas de unidades de dosagem do presente invento são ditadas por e estão directamente dependentes (a) das características do ingrediente activo de derivado de guanosina e do efeito terapêutico particular que se pretende obter, e (b) das limitações inerentes à arte de preparação de composições de um tal ingrediente activo para uso terapêutico in vitro, bem como in vivo em humanos e em outros animais.

Exemplos de formas adequadas de unidades de dosagem de acordo com a invenção incluem, comprimidos, cápsulas, pilulas, p.a cotes de pó, grânulos, bolachas e similares, múltiplos segregados de quaisquer dos anteriores, bem como soluções, emulsões e susperi soes líquidas. As composições líquidas podem.ser administradas das formas usuais, por exemplo, subcutaneamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, peroralmente ou de modo similar.

A quantidade de ingrediente activo que é administrada in vivo com quantidade imuno-estimulante eficaz depende da idade e do peso do paciente da condição particular que está a ser tradada, da frequência da administração, e da via de administração. A gama de dose total diária pode ser de cerca de 0,01 a cerca de 2D0 miligramas por kilograma de peso de corpo, mais preferivelmente, de cerca de 0,1 a cerca de 25 miligramas por kilograma de peso de corpo, e, muito preferivelmente, de cerca de 1 a cerca de 15 milj. gramas por kilograma de peso de corpo. A dose para um humano adulto está compreendida entre cerca de 5 a cerca de 1400 miligra mas por dia, administradas quer como uma dose única quer divididas

268

EPG:11-SCRF 144.0

-24em 3 ou 4 doses. As dosagens veterinárias correspondem as dosagens humanas sendo administradas em proporção com o peso e com a velocidade metabólica do animal, quando comparado com humanos adu_l tos.

Será de notar pelos peritos na arte que as concentrações úteis in vivo podem variar de espécie animal para espécie animal. Os investigadores peritos sabem também que as concentrações apropriadas podem ser facilmente determinadas.

As concentrações para o contacto in vitro com células ani mais variam de cerca de 1x10 molar a cerca de 3x10 molar para 6 7 concentrações de células de cerca de 10 -10 células por mililitro. Mais preferivelmente, a concentração á de cerca de 1x10 molar a cerca de 1x10 molar. A concentração de pico, i.e., a concentração com a qual se obtém a maior adjuvanticidade, para um dado nucleósido de análogo de guanina, pode variar quando se estu da em sistemas de linfócitos humanos e murinos.

Uma composição pode ser um sólido ou um líquido. 0s trans portadores fisiologicamente toleráveis são bem conhecidos na arte. Exemplos de transportadores líquidos incluem soluções aquosas estéreis que não contêm quaisquer materiais além do ingrediente activo de derivado de guanosina e de água, ou que contém um tampão tal como fosfato de sódio ao valor de pH fisiológico, solução salina fisiológica ou ambos, por exemplo solução salina tamponizada com fosfato. Ainda mais, os transportadores aquosos podemconter mais do que um sal tampão, bem como sais tais como cloretos de s_ó dio e potássio, dextrose e outros solutos. 0s últimos transporta dores são exemplificados por Injecção de Ringer, Injecção de Dextrose, Injecção de Dextrose e Cloreto de sódio e Injecção de Ringer Lactada.

As composições líquidas podem também conter fases liquidas para além de e com exclusão da água. Exemplos destas fases aquosas incluem, glicerina, óleos vegetais, tais como óleo de semente de algodão, óleo de sésamo e emulsões de água-óleo.

Exemplos de transportadores sólidos incluem os materiais normalmente usados no fabrico de pilulas ou comprimidos e incluem

268

EPG:11-SCRE 144.0

-25amido de milho, lactose, fosfato de dicálcio, espessantes tais como goma de tragacanto e metilcelulose U.S.P., S1O2 finamente d_i vidida, polivinilpirrolido na, estearato de magnésio e similares. Adicionalmente, 0 transportador sólido pode incluir polimeros bio degradáveis e não diodegradáveis, transportadores de polipéptido, transportadores de afinidade tais como o AFFI-GEL 601 (resina de baronato de fenilo disponível nos BIO-RAD Laboratories, Richmond, Califórnia, E.U.A.), lipossomas e polímeros sintéticos, tal como é conhecido na arte. Podem também estar presentes, nas composiçBes sólidas e líquidas, anti-oxidantes, tais como o metilparabeno e 0 propilparabeno, bem como adocicantes tais como açúcar de cana ou de beterraba, sacarina de sódio, ciclamato de sódio e o adocicante de éster de metilo do dipéptido ácido aspártico-fenilalanina, vendido com a designação comercial de NUTRASWEET (aspartamo) pela G.D. Searle Co.

IV. Método de imuno-estimulação

E também contemplado um método para melhorar a imuno-resposta de leucócitos. Preferivelmente, a imuno-resposta é uma res posta específica de antigénio. De acordo com este método, pãem-se em contacto os leucócitos, por exemplo, preparaçães de linfocitos, células B, células T, neutrófilos e macrofagos, separadamente ou em combinação, num meio aquoso, com uma composição, tal como anteriormente se descreve, contendo uma quantidade eficaz imuno-estimulante de um derivado de análogo de guanosina tal como anteriormente se descreveu.

método pode ser praticado in vivo, em humanos, em animais de laboratório, tais como ratinhos ratazanas e cobaias, em animais domésticos tais como porcos, cavalos, bovinos, cães e gatos. 0 método pode também ser praticado in vitro em culturas de células tais como em cultura de hibridoma para a produção de anti_ corpos monoclonais.

Os leucócitos são postos em contacto num meio aquoso ind_e pendentemente de a composição de derivado de análogo de quanosina ser ou não, elá própria, um sólido ou um líquido, ou de 0 líquido da composição ser, ou não, aquoso. Para 0 método in vivo, o meio

268

EPG:11-SCRE 144.0

-26aquoso é fornecido, pelo menos em parte, pela água do sangue ou do linfo. Para os métodos in vitro, o meio aquoso é fornecido p_e lo menos em parte, pelo meio de cultura usado.

contacto entre a composição e os leucócitos é mantido por um período de tempo suficiente para que as células postas em contacto manifestem a melhoria da sua imuno-resposta. A imuno-es timulação pode manifestar-se, na proliferação celular, na secreção aumentada de anticorpos, na actividade melhorada das células T auxiliares, na produção aumentada de citocina das células T e de macrofagos, na secreção de enzima de neutrófilos, etc..

Uma resposta, específica de antigénio, de células B, é um resultado usual e preferido da imuno-melhoria. Imuno-melhorias adicionais, específicas de antigénio, ilustrativas, que podem ser conseguidas usando um método da invenção incluem, a proliferação melhorada de células T, a reconstituição in vitro da imuno-respos_ ta primária em células 8 imuno-deficientes, actividade de substituição de células T em células B e uma melhoria in vivo da produção de anticorpos, actividade melhorada de células T auxiliares, e uma secreção aumentada de citocina.

Para uso in vivo, o contacto entre os leucócitos e uma composição é mantido, tipicamente, por um período de tempo suficj. ente para que o animal elimine o derivado de análogo de guanosina do seu organismo, por metabolismo, excreção ou por ambos os processos. Esse período de tempo pode ser mais prolongado do que o requerido para que a imuno-estimulação se manifeste. 0 contacto com uma dose unitária individual é mantido, tipicamente, por um período de tempo de horas a cerca de uma semana ou mais, depende_n do, para um dado composto, do transportador ou do veículo usado.

contacto contínuo pode ser vantajoso para um animal hospedeiro imuno-deficiente.

contacto in vitro pode ser mantido por um período de tempo suficiente para que uma das imuno-estimulaçães anteriormente descritas se manifeste, tal como é determinado por técnicas de ensaio convencionais tais como o ensaio de formação de placas para células B. Estes tempos de contacto variam tipicamente de cer

268

EPG:11-SCRF 144.D

-27ca de um a cerca de sete dias, e mais usualmente, de cerca de 2 a cerca de 6 dias.

V. T ratamentos

A. Ad.juvanticidade in vitro contacto de células animais produtoras de anticorpos com uma composição útil no presente invento fornece um efeito adjjj vante à resposta de anticorpo primária ao SEBC e a outros imunoqé nios, quando avaliada in vitro. Tipicamente, misturam-se a compo sição moduladora da imuno-resposta e a quantidade eficaz de imuno génio (globulos vermelhos de ovino; SRBC) para o contacto com as células se dar substancial mente, simultaneamente. As designações antigénio e imunogénio são usadas indistintamente.

Na concentração óptima, uma composição contendo uma quant_i dade eficaz de um derivada de análogo de guanosina útil aumente a resposta ao SRBC pelo menos cerca de 2 a 6 vezes. 0 efeito é dependente da dose. A melhoria da resposta de anticorpo não pode ser tida em conta pelos efeitos aditivos da resposta especifica ao SRBC e da resposta policlonal ao derivado de análogo de guanosina.

efeito adjuvante das composições contendo um derivado de análogo de guanosina útil é exercido em células experimentadas com imunogénio (preparadas) bem como em células primitivas. Ambas as respostas são melhoradas pelo contacto das células com composições contendo uma quantidade eficaz de derivado de análogo de gua nosina. Este efeito de adjuvante é dependente da concentração de imunogénio adicionado à cultura. Assim, as respostas primária IgM, bem como as secundárias IgM e IgG, ao imunogénio (antigénio) são aumentadas pelo contacto das células B com uma composição con tendo uma quantidade eficaz de um derivado de análogo de guanosina como ingrediente activo, e mantendo esse contacto tal como aqui se discutiu.

Enquanto que se observa que as imuno-respostas, i.e., as respostas de linfocitos B ou células B, são melhoradas para todas as doses de imunogénio imunologicamente eficazes, o grau de melhjç ria é usualmente superior para concentrações de imunogénio óptimas

268

EPC:11-SCRF 144.□

-28ou próximas do óptimo. Adicionalmente, a adjuvanticidade dos derivados de análogo de guanosino é sinergistica com o imunogénio e

Λ não é apenas devida a soma das respostas independentes específicas de imunogénio e policlonais (não específicas).

Para respostas de mamória, as células B são preparadas por tratamento com uma quantidade eficaz, preparadora, de um imunogénio tal como é bem conhecido. Esse tratamento de preparação pode realizar-se na presença ou na ausência de uma composição mo duladora da imuno-resposta. Quando postas em contacto na presença de uma tal composição, o tratamento das células 8 com uma quajn tidade preparadora de imunogénio ê, preferivelmente, substancialmente simultâneo, i.e., em cerca de 12 horas, com o contacto das células com uma composição útil do presente invento. Mais preferivelmente, o imunogénio é incluído na composição melhoradora da imuno-resposta, a não ser que o seu efeito seja impedido por estar incluído na composição, por exemplo, por desnaturação.

Resumindo, pode obter-se assim uma imuno-resposta melhora^ da pondo em contacto células 8 substancialmente, simultaneamente com uma quantidade eficaz, preparadora, de imunogénio e com uma composição melhoradora da imuno-resposta útil no presente invento, seguindo-se, após se obter uma imuno-resposta primária, um contacto adicional das células preparadas com uma quantidade eficaz adicional de imunogénio (antigénio) sozinho ou substancialmen te, simultaneamente com uma quantidade adicional de uma composição melhoradora da imuno-resposta.

Pensa-se que as composições, úteis no presente invento, contendo o derivado de análogo de guanosina, melhoram a imuno-res posta humoral primária actuando directamente na célula 0 ou na c_é lula apresentadora de imunogénio. Assim, o uso destes derivados melhora a resposta de anticorpos dirigida contra antigénios independentes de células T, i.e., respostas que envolvem células B e células apresentadoras de imunogénio. Adicionalmente, as compos_i ções contendo um derivado de análogo de guanosina podem substituir a necessidade de células B por células T auxiliares, tal come aqui depois se discute, e, deste modo, exercem o seu efeito

268

EPG:11-SCRF 144.□

-29adjuvante em culturas iniciadas na ausência de células T funcionais intactas. Uma substituição das células T por actividade de células T auxiliares contida em sobrenadantes de culturas mistas de linfócitos (MLC) não diminui a capacidade de um derivado de análogo de guanosina em aumentar a resposta de anticorpo.

Adicionalmente, a sinergia observada entre o sinal de células T solúveis contido em sobrenadante de MLC e a composição contendo o derivado de análogo de guanosina, indica que o sinal fornecido por cada um é qualitativamente distinto. Esta sinergia é observada para uma gama de concentrações de sobrenadante, indicando que o derivado de análogo de guanosina não está fornecendo simplesmente mais do mesmo sinal que as células T fornecem. P_o de observar-se um grau de sinergia comparável quando estas culturas de células B são suplementadas com células T em vez de com s_o brenadantes do tipo das células T (que são de facto derivados de células T), e são postas em contacta, na presença de imunogénio, com uma composição contendo derivado de análogo de guanosina útil no presente invento.

Os efeitos, mediados por células T, de adjuvanticidade dos derivados de análogos guanosina não são governados pela obser. vação de independência de células T para essa adjuvanticidade, i. e. , a existência de uma faceta independente de células T não é di. rigida para a existência de uma fase dependente de células T. As. sim, pode observar-se uma melhoria mais substancial com uma compo sição contendo o derivado de análogo de guanosina sob condições de estimulação com doses baixas de antigénios T-dependentes e T-inde. pendentes do tipo 2 (situações dependentes de células T), do que com antigénios T-independentes do tipo 1 (mais completamente ind_e pendentes de células Τ), o que sugere a presença de um componente dependente de células T. Além disso, pensa-se que os derivadas de análogos de guanosina actuam (quer directamente, quer indirectamente) nos precursores de células T auxiliares em aumentar a ca pacidade de uma população destas células em apoios (i.e., auxiliar) uma resposta de anticorpo ao imunogénio.

268

EPG:11-SCRF 144.0

-508. Melhoria da imuno-resposta in vivo

Os efeitos imuno-potenciantes na resposta primária de anticorpo (células B) ao SRBC in vivo são observados quando se põe em contacto uma composição líquida, contendo um derivado de análo. go de guanosina, útil no presente invento, com células animais, por exemplo, por injecção da composição em ratinhos CBA/CaO cerca de trinta minutos após a injecção do imunogénio de SRBC, i.e., substancial mente, simultaneamente. Os animais toleram dosagens relativamente elevadas, p.e., de cerca de 2,5 miligramas por animal (cerca de um décimo de grama por kilograma).

Observa-se a dependência da dose de imunogénio nos ratinhos anteriores, na presença ou na ausência de adjuvante. Observa-se um nível de resposta muito mais elevado em animais injectados i.p. com um derivado de análogo de guanosina, quando comparada com a de animais injectados i.p. com solução salina normal (MS) usados como controlo. Enquanto que existe uma melhoria na imunoresposta para todos os níveis úteis (eficazes) de injecção com imunogénio, tipicamente, a melhoria torna-se maior à medida que a resposta subjacente aumenta.

A melhoria in vivo das respostas celulares animais, tal como na imunização primária que anteriormente se descreveu, pode também realizar-se tal como anteriormente se descreveu em relação à modulação in vitro de imuno-respostas secundárias de células 3.

Os ratinhos CBA/CaO são imunizados intraperitonealmente (i.p.) usando um conjugado (TNP-BSA) preparado por reacção do áci. do 2,4,6-trinitrobenzenossul f ónico (TNBS) com albumina de soro b_o vino (B5A) num tampão de cacodilato 0,28 molar, a pH 6,9. Cada animal recebe uma injecção intraperitoneal contendo 50 microgramas (yng) do conjugado imunizante. Um grupo de ratinhos recebe d_e pois (nos cerca de 50 minutos seguintes) outra injecção i.p. que contém um derivado de análogo de guanosina da invenção quer em éleo de semente de sésamo a 100 por cento, quer na forma de uma composição contendo 2 por cento em volume de óleo de sésamo sonicado com solução salina. Cada animal recebe 0,2 ml do derivado de análogo de guanosina a partir de cada uma das composições cuja

268

EPG:11-5CRF 144.0

-31concentração em derivado de análogo de guanosina é de 5 mg/ml. Um terceiro grupo de ratinhos recebe a imunização mas não a composição da invenção e serve como controlo. Determina-se depois a secreção de anticorpos anti-TNS-BSA de cada grupo, durante um perí_o do de cerca de 30 dias usando técnicas de ensaio de imuno-sorbente ligado a enzima (ELISA) convencionais, usando TNP-BSA como antigénio.

Os resultados deste estudo indicam que os animais que recebem um derivado de análogo de guanosina da invenção exibem títju los melhorados de anticorpos anti-TNP-BSA quando comparados com os títulos de animais que não recebem o derivado de análogo de guanosina.

C. Actividade de substituição de células T

Pode usar-se uma composição do presente invento para subs tituir as células T na resposta de anticorpos a antigénios dependentes de células T. Aqui, cultivam-se células B murinas, geradas in vitro por tratamento com anti-thy 1,2 monoclonal mais complemento, com ou sem SRBC como antigénio, na presença de composiçães contendo concentraçães incrementáis de derivado de análogo de guanosina.

Sob estas condiçães as culturas de células B isoladas res pondem Fracamente a antigénios dependentes de células T a não ser que suplementadas com um derivado de análogo de guanosina da invenção. A resposta melhorada pelo derivado de análogo de guanos_i na é dependente da dose bem com dependente do antigénio. Assim, o contacto das células B, in vitro, com uma composição do presente invento fornece a essas células postas em contacto, um sinal do tipo das células T.

D. Reconstituição in vitro da imuno-resposta humoral primária

Os ratinhos CBA/N possuem uma imunodeficiência de células B primária ligada ao cromossoma-X (X-ligada), e deste modo podem constituir um modelo murino da imuno-deficiência ligada ao sexo. Pensa-se que a estirpe CBA/N é deficiente na actividade funcional de uma subpopulação de linfócitos B maduros compreendendo os

26Θ

EPC:11-SCRF 144.0

-32antigénios Lyb 3/5/7. Uêr, Huber et al., 0. Exp. Med., 145:1 (1977); Ahmed et al., 0. Exp. Med. , 145:101 (1977); e Subbara, 0. Immunol., 122:2279 (1979).

Preparam-se culturas de células de baço de ratinhos CBft/N homozigoticos, machos e fêmeas e de ratinhos macho heterozigoticos em relação ao gene CBA/ν, designado por gene xid (o ratinho macho compreende o cromossoma X), tal como se descreve na secção Materiais e Métodos. Adicionam-se às culturas 0,1 mililitro de uma suspensão de SRBC a 0,1 por cento (v/v) sozinho ou a suspensão de SRBC com quantidades incrementais de um derivado de análogo de guanosina da invenção, usando 5x10 células/ml. Determinam -se as culturas formando placas anti-SRBC directo, por cultura, apés 4 dias de cultura.

Usando uma preparação similar de células de baço de ratinhos CBA/CaO imuno-competentes verifica-se que para um nível de concentração de derivado de análogo de guanosina de zero, não existe qualquer resposta para as células CBA/PJ, quando comparada com uma resposta de PFC/cultura positiva para as células CBA/CaO imuno-competentes.

Para concentrações de derivado de análogo de guanosina de cerca de 10 ^-10“^ molar, tanto as células CBA/CaO imiino-compe tentes, como as células CBA/|\J original mente imuno-incompetentes, são capazes de produzir números significativos de PFC/cultura. As_ sim, o contacto de esplenocitos imunodeficientes X-ligados, com uma composição do presente invento pode reconstituir a imuno-resposta humoral primária ao SRBC dessas células que de outro modo seria imuno-deficientes.

A imuno-deficiência em ratinhos e em outros animais pode resultar da idade avançada ou senescência bem como de defeito genético como anteriormente se discutiu. Assim, animais que eram imuno-competentes quando jovens ou adultos podem tornar-se imuno-deficientes a medida que atingem uma idade avançada. Este é o caso da estirpe de ratinhos CBA/CaJ consanguíneos.

Um outro estudo da reconstituição de uma resposta de ant_i corpo humoral primária ao SRBC realiza-sé usando células de baço

268

EPG:11-SCRE 144.0

-33de ratinhos CBA/CaO senescentes, com 156 semanas de idade, que se tornaram imuno-deficientes com a idade. Comparam-se as respostas in vitro dessas células de baço ao SR8C, num ensaio de formação de placas, com respostas similares de células de outro grupo de ratinhos CBA/CaO adultos, 8 semanas de idade, saudáveis. Esta comparação realiza-se como se descreveu anteriormente, usando de novo uma composição contendo um derivado de análogo de guanosina da invenção para o contacto com as células de baço.

Os PFC/cultura para os controlos de ratinhos adultos saudáveis, contendo 8RBC mas não derivado de análogo de guanosina, são várias vezes o número formado na ausência tanto do SRBC como do derivado de análogo de guanosina. Os PFC/cultura para os controlos para os ratinhos senescentes são aproximadamente iguais p.a ra ambos os controlos e são elevados quando comparados com os de adultos saudáveis. Pensa-se que essas respostas relativamente elevadas e similares reflictam o processo que culmina na formação de clones auto-produtores de anticorpos.

Na presença do SRBC observa-se uma resposta relacionada com a dose de derivado de análogo de guanosina. Essas resposta é observada tanto para as células de baço de adultos saudáveis imuno-competentes como para as células de baço senescentes, anterioj? mente imunodeficientes, mas agora com a resposta humoral primária reconstituída. Estes resultados ilustram pois que o contacto de células de baço senescentes imuno-deficientes com uma composição da invenção pode reconstituir esta imuno-resposta deficiente.

Tendo descrito genericamente o presente invento pode ter-se uma melhor compreensão por referência às sínteses e aos proce dimentos que aqui depois se apresentam com propósitos de ilustração.

VI. Materiais e Métodos

A . 5 í ntes es

Nas sínteses que a seguir se descrevem, os números dos compostos identificados por um número sublinhado correspondem aos compostos numerados de um modo similar que se mostram nos Esquemas

I e II. De novo, discutem-se aqui as sínteses daqueles compostos

26Θ

EPG:11-SCRE 144.D

-34que não estão comercial mente disponíveis ou que são intermediários chave na sequência reaccional. Ds peritos na arte serão capazes de preparar ou de adquirir os compostos restantes.

Preparações do Esquema I

Exemplo 1: preparação do composto 3

A uma solução de metóxido de sódio 2_ em metanol adiciona-se uma solução de _1 (l equivalente; eq.) em CH^OH a zero graus C sob 1^2. Após a adição, deixa-se a mistura aquecer até â temperatura ambiente (cerca de 22 graus C) e agita-se durante 2 horas. Remove-se a maior parte do metanol in vacuo, trata-se o resíduo com água, e extracta-se com diclorometano. Seca-se a fase orgân_i ca com e remove-se o solvente in vacuo por forma a obter-se o composto do título _3.

Exemplo 2: preparação do composto 5

Aquece-se uma mistura de _3 e de _4 (l,l eq.), metóxido de sódio (l,l eq.) e de metanol, ao refluxo sob azoto durante 16 horas. Após arrefecimento, remove-se a maior parte do metanol in vacuo e trata-se o resíduo com água fria. Filtrs-se o sólido bran co e lava-se com água fria por forma a obter-se o composto do título 5.

Exemplo 3: preparação do composto 6

A uma mistura de 5. piridina (20 eq. ) e acetonitrilo, adiciona-se POCl^ (5 ^eR·) ^{a zero} graus C sob N . Após a adição, aque ce-se a mistura ao refluxo durante duas horas. Arrefece-se a mis_ tura até à temperatura ambiente e remove-se o solvente in vacuo. Trata-se 0 resíduo com diclorometano e lava-se com NaHCO^ saturado, depois com água e seca-se então com Remove-se o solvente in vacuo obtendo-se 0 composto do título _6.

Exemplo 4: preparação do composto 8

Aquece-se uma mistura de 6. (l aq.), 7_ (l eq.), carbonato de potássio e etanol absoluto, ao refluxo sob azoto durante 16 ho ras. Arrefece-se a mistura até à temperatura ambiente e filtra-se. Concentra-se 0 filtrado in vacuo e purifica-se 0 resíduo por cromatografia em coluna de sílica gel por forma a obter-se o

263

EPG:11-SCRF 144.0

-35composto do título 8.,

Exemplo 5: preparação do composto 9

A uma solução de 8. (l eq.) em diclorometano adiciona-se iodeto de trimetilsililo (l eq.) a zero graus C sob , e agita-se a mistura resultante durante 3 horas. Adiciona-se a mistura a uma solução de bicarbonato de sódio. Separa-se a fase orgânica e seca-se com Na2S0^. Remove-se o solvente in vacuo e purifi. ca-se o resíduo por cromatografia em coluna de silica gel por forma a obter-se o composto do titulo _9.

Exemplo 6; preparação do composto 10

A uma mistura de 9_ (l eq.), carbonato de potássio (2,5 eq.) e tetra-hidrof urano adiciona-se uma solução de fosgénio em x_i leno (l eq.) tf ou tiofosgénio (puro) (l eq.)_7 a zero graus C sob azoto. Após a adição deixa-se a mistura aquecer atá à temperatura ambiente e agita-se durante cerca de 18 horas. Filtra-se a mistura e concentra-se o filtrado in vacuo. Purifica-se o resíduo por cromatografia em coluna de sílica gel obtendo-se o compcm to do título 10.

Exemplo 7; preparação do composto 11

A uma solução de 10 (l eq.) em dime til f ormamida (DMF) adi. ciona-se metóxido de sódio (l,l eq.) a zero qraus C sob Após a adição deixa-se a mistura aquecer atá à temperatura ambiente e agita-se durante 3 horas. Remove-se a maior parte do solvente in vacuo e purifica-se o resíduo por cromatografia em coluna de síl_i ca gel por forma a obter-se o composto do título ll.

Exemplo 8: preparação do composto 12

A uma solução de 11 (l eq.) em diclorometano adiciona-se iodeto de trimetilsililo (l eq.) a zero graus C, e agita-se a mis. tura resultante durante 2 horas. Adiciona-se a mistura a uma solução diluída de bicarbonato de sódio. Separa-se a fase orgânica e seca-se com Na2S0^. Remove-se o solvente in vacuo, e purifica-se o resíduo por cromatografia em coluna de silica gel, por forma a obter-se o composto do título 12.

268

EPG:11-5CRF 144.0

-36Exemplo 9: preparação do composto 13

Agita-se uma mistura de 12 (eq.), ácido' metanossulfúrico (quantidade catalítica) e tetra-hidrofurano-água (l:l; v/v) à temperatura ambiente sob azoto durante três dias. Remove-se a maior parte do solvente in vacuo, e purifica-se o resíduo por HPLC de fase inversa (coluna C18) obtenJo-se o composto do título 13.

Preparações do Esquema II

Exemplo 10: preparação do composto 16

A uma mistura de 15 (l eq.), K^CO^ (l,l eq.) e tetra-hidrofurano, adiciona-se uma solução de 14 em tetra-hidrofurano, à temperatura ambiente sob azoto. Agita-se a mistura resultante durante 2 horas. Remove-se a maior parte do solvente in vacuo e purifica-se o resíduo por cromatografia em coluna de sílica gel por forma a obter-se o composto do título 16.

Exemplo 11: preparação do composto 18 composto do título é preparado de um modo análogo ao que se descreve para a preparação do composto _5.

Exemplo 12: preparação do composto 19 composto do título é preparado de um modo análogo ao que se descreve para a preparação do composto _6.

Exemplo 13: preparação do composto 21 composto do título é preparado de um modo análogo ao que se descreve para a preparação do composto 10.

Exemplo 14: preparação do composto 22

A uma mistura de 21 (l eq.), pelotas de hidróxido de sódio e acetonitrilo, adiciona-se cloroformato de etilo (27) ou clorotioformato de etilo (27 ¹) / a zero graus C sob azoto. Após a adição deixa-se a mistura aquecer até à temperatura ambiente e agita-se durante 3 horas. Filtra-se a mistura resultante, e cori centra-se o filtrado in vacuo. Purifica-se o resíduo por cromatografia em coluna de sílica gel por forma a obter-se o composto do título 22.

268

EPG:11-SCRF 144.0

-37Exemplo 15: preparação do composto 23

A uma solução de 22 (l eq.) em tetra-hidrofurano adiciona-se uma solução de fluoreto de tetra-n-butilamónio (2,1 eq.) a zero graus C e agita-se a mistura resultante durante 3 horas. Remove-se a maior parte do solvente in vacuo e purifica-se o resíduo por cromatografia em coluna de silica gel por forma a obter-se o composto do título 23.

Exemplo 16: preparação do composto 24 composto do título é preparado de um modo similar ao que se descreve para a preparação do composto 11♦

Exemplo 17: preparação do composto 25 composto do título é preparado de um modo similar, ao que se descreve para a preparação do composto 12.

Exemplo 18: preparação do composto 26 composto do título é preparado de um modo similar ao que se descreve para a preparação do composto 13.

Exemplo 19: derivados de 5-desaza-7-oxa- ou 7-desaza-7-tia-8-selenoxoquanosina □s derivados de análogos 7-desaza-7-oxa- ou 7-desaza-7-tia-8-selenoxoguanosina são preparados a partir dos derivados 7-desaza-7-oxa- ou 7-desaza-7-tia-8-tioxo correspondentes, adequadamente protegidos, cujas preparaçães se discutiram anteriormente Assim, faz-se reagir a 7-desaza-7-oxa- ou 7-desaza-7-tia-8-tioxoguanosina, com um agente S-alquilante, tal como iodeto de metilo, num solvente tal como DMSO. Faz-se depois reagir o produto S-alquilado assim obtido, com seleneto de sódio para formar o derivado de 7-desaza-7-oxa- ou 7-desaza-7-tia-8-selenoxo. 0 produto de sejado pode depois ser obtido a partir da mistura reaccional por HPLC de fase inversa.

Exemplo 20: derivados de 7-desaza-7-oxa- ou 7-desaza-7-tia-8-cianoiminoguanosina

Para estes derivados utilizam-se, como materiais de part_i da, os derivados de 7-desaza-7-oxa- ou 7-desaza-7-tia-8-tioxogua69 268

EPG:11-5CRF 144.0

-33nosina correspondentes. Numa preparação típica adiciona-se iodeto de metilo /~42 milimole (mmole)_7 e 28 mmole do derivado de aná logo de 8-tioxoguanosina de partida dissolvido em dimetil sulfóxido (DMSO). A adição realiza-se à temperatura ambiente e sob azoto. Agita-se a mistura resultante durante cerca de três horas e depois arrefece-se até cerca de zero graus C. Adiciona-se cianamida (cerca de 57 mmole) seguida de hidreto de sódio (dispersão a 60% em óleo; 5 mmole). Deixa-se essa mistura reaccional aquecer até à temperatura ambiente e agita-se durante cerca de uma hora.

Adiciona-se depois a mistura reaccional a cerca de 1,5 l_i tro de éter etílico e agita-se durante cerca de 10 minutos. Decan ta-se a fase de éter, extracta-se o resíduo com mais 1,5 litro de éter etílico contendo adicionalmente cerca de 50 ml de ácido acético. Decanta-se de novo a fase de éter e dissolve-se o resíduo em água (cerca de 500 ml). Purifica-se o composto desejado, a partir da fase aquosa por HPLC de fase inversa (C-18).

Exemplo 21: derivados de alquilidenodioxilo de cadeia curta

A preparação de um derivada de alquilidenodioxilo de cadeia curta de um dos compostos anteriormente descritos, é exemplj. ficada pela síntese seguinte de um derivado de isopropilideno.

Agita-se uma mistura de 7-desaza-7-oxo-8-oxoguanosina (17 mmole), 2,2-dimetoxipropano (41 mmole), acetona (200 ml) e ácido sulfúrico concentrado (l0 gotas), sob azoto, à temperatura ambieri te durante um período de 52 horas. Arrefece-se a mistura até zero graus C e trata-se com hidróxido de amónio concentrado (5 ml). Remove-se a maior parte do líquido in vacuo e filtra-se o sólido resultante. Lava-se o sólido filtrado com água, acetona e depois com éter etílico e seca-se depois numa estufa de vácuo a 60 graus C obtendo-se o derivado desejado. Para os derivados 8-tioxo, 8-selenoxo e 8-cianoimino seguem-se procedimentos similares.

Exemplo 22: 7-desaza-7-oxa- ou 7-desaza-7-tia-3-oxo-2¹,3¹-0-isopropilideno-5'-benzoilquanosina

Agita-se uma mistura contendo um derivado de isopropilid.e no, tal como se descreve no Exemplo 21 (3 mmole), trietilamina (3 ml), cloreto de benzoilo (3 mmole) e diclorometano (100 ml) à tem

268

EPG:11-SCRF 144.0

-39peratura ambiente por um periodo de 16 horas. Adiciona-se depois a mistura a água, separa-se a fase de diclorometano e extracta-se ainda a fase aquosa com diclorometano (2x150 ml).

Combinam-se as fases de diclorometano, secam-se com NaSO^ e remove-se o solvente in vacuo. Purifica-se o resíduo por croma tografia em coluna de sílica gel.

Os derivados de 5'-acetilo são preparados substituindo o cloreto de benzoilo por anidrido acético. Os derivados de 8-tioxo, 8-selenoxo e 8-cianimina são preparados de um modo similar.

Exemplo 23: 7-desaza-7-oxa- ou 7-desaza-7-tia-8-tioxo-2¹,3¹,5¹-triacetilquanosina

Esta preparação é exemplar dos procedimentos de acilação para a porção aldoglicosidilo da molécula p.e. tal como um anel ribosilo. Aqui, adiciona-se 4-N ,l\l-dimetilaminopiridina (l0 mg) a uma mistura da 7-desaza-7-oxa- ou 7-desaza-7-tia-8-tioxoguanosina (3 mmole), trietilamina (2 ml), anidrido acético (15 mmole; alternativamente podem usar-se cloretos de acilo de cadeia curta ou cloreto de benzoilo para preparar os derivados de tri-acilo de c_a deia curta ou de tribenzoilo correspondentes) e diclorometano (50 ml). Agita-se a mistura reaccionak resultante sob durante 16 horas à temperatura ambiente.

Adiciona-se depois mais diclorometano (50 ml) e lava-se a solução com HCl IN, salmoura e, depois, com água. Seca-se depois a solução com Na^SO^. Remove-se o solvente in vacuo, e purifica-se o resíduo por cromatografia de coluna em sílica gel.

Para os derivados 8-oxo, 8-selenoxo e 8-cianimino seguem-se procedimentos similares.

B. Exemplos de composiçães para administração

Descrevem-se, seguidamente, exemplos de composiçães sólidas e líquidas para administração dos compostos do presente inven to usando cinco dos derivados de guanina-nucleósido mais preferidos como exemplos de ingredientes activos.

268

EPG:11-SCRF 144.0

-40Comprimidos

Os comprimidos são preparados a partir dos ingredientes seguintes:

Partes em peso

7-desaza-7-oxa-8-oxoguanosina 2,5 lactose em pó 34,5 SÍO2 finamente dividida 5,6 polivinilpirrolidona 0,6 estearato de magnésio 0,4

80,0

Mistura-se exaustivamente o derivado de análogo de guanosina com a lactose com 25,0 partes em peso do amido de milho e com 4,0 partes em peso da SiO^. Humidifica-se depois a mistura resultante, uniformemente, com uma solução etanólica a 5% de poli vinilpirrolidona. Faz-se depois passar a massa húmida através de um peneiro com malha de um milímetro para produzir um granulado. Seca-se o granulado produzido durante cerca de 24 horas a 60SC nu ma câmara de secagem. Faz-se passar o granulado seco de novo através de um peneiro com malha de um milímetro. Misturam-se 70,0 partes do granulado obtido, num misturador adequado, com uma mistura consistindo na restante SiO^, no restante amido de milho e em todo o estearato de magnésio, mistura esta que já se tinha feito passar, previamente, através de um peneiro com malha de um milímetro. Prensa-se depois a mistura assim obtida em comprimidos pesando cada um 800 miligramas e contendo 25 miligramas de d_e rivado de análogo de granosina.

Cápsulas de amido conteúdo das cápsulas é preparado a partir dos ingredientes seguintes:

268

EPG:11-SCRF 144.0 /£ -41Partes em psso

7-desaza-7-oxa-8-oxo-9-(l’-beta-D-2'-desoxirribofuranosidilo)guanosina 10,0 lactose 450,0 amido de milho 540,0

1020,0

Mistura-se gradualmente o derivado de análogo de guanosina com a lactose. Quando toda a lactose tiver sido misturada, mis. tura-se a mistura obtida com o amido de milho. Usa-se depois a mistura resultante para encher cápsulas compreendendo 10 g da mis. tura. Cada cápsula contém 1,0 miligrama do derivado de análogo de guanosina.

Comprimidos

A partir dos tipos e das quantidades de ingredientes seguintes prepara-se um lote de 10 000 comprimido contendo, cada um, 50 miligramas de 7-desaza-7-oxa-8-oxo-9-(l'-beta-D-glucopiranosidil)guanosina.

7-desaza-7-oxo-8-oxo-9-(l'-beta-

-D-glucopiranosidil)guanosina	500 gramas
fosfato de dicálcio	1000 gramas
metilcelulose, ll.S.P. (15 cps)	75 gramas
talco	150 gramas
amido de milho	250 gramas
estearato de magnésio	25 qramas

2000 gramas

Misturaram-se bem o derivado de análogo de guanosina e o Fosfato de dicalcio, granulam-se com uma solução a 7,5 por cento de metilcelulose em água, faz-se passar a mistura através de um peneiro n^s. 8 (U.S. Standard Sieve Series) e seca-se cuidadosamente. Fazem-se passar os grânulos secos através de um peneiro n2. 12 (U.S. Standard Sieve Series) misturam-se com o talco, o amido e o estearato de magnésio e prensa-se a mistura em comprimidos .

268

EPG:11-SCRF 144.0 /7..

-42Composição in.iectável

Prepara-se uma composição injectável adequada para injecção subcutânea ou intracavitária e contendo 50 miligramas de 7-d.e saza-7-tia-O-oxoguanosina em cada mililitro de ingrediente, a par tir dos tipos e quantidades de ingredientes seguintes:

7-desaza-7-tia-8-oxoguanosina 5 gramas solução salina fisiológica 9Θ mililitros óleo de sésamo 2 mililitros

Misturam-se o derivado de análoga de guanosina e a solução salina e sonica-se a mistura por um período de tempo suficie_n te para se obter uma dispersão substancialmente homogénea. Mistu ra-se depois o óleo de sésamo e homogeniza-se similarmente a nova mistura por forma a obter-se uma emulsão. Após a emulsionação, injectam-se cinco a quinze por cento do volume final desta preparação estéril, subcutaneamente ou intraperitonealmente, uma vez por semana para melhorar a imunidade humoral.

Composição aquosa para uso oral

Prepara-se uma composição aquosa para uso oral, contendo cada 5 mililitros (l colher de chá) 25 miligramas de 7-desaza-7-tia-8-oxo-9-(1'-beta-D-2'-desoxirribofuranosidil)guanina, a partir dos ingredientes seguintes:

7-desaza-7-tia-8-oxo-9-(l'-beta-D-2

-desoxirribofuranosidil)guanina	5,0	gramas
metilparabena, U.S.P.	0,75	gramas
propilparabeno, U.S.P.	0,25	gramas
sacarina de sódio	1,25	gramas
ciclamato de sódio	0,25	gramas
glicerina	300	mililitros
pó de tragacanto	1,0	gramas
sabor de óleo de laranja	1,0	gramas
corante laranja E.D. e C.	0,75	gramas
água desionizada, q.s. para	1000	mililitros

268

EPG:11-SCRF 144.0

-43C. Métodos

Culturas de linfocitos. 0 meio de cultura contendo soro e preparado para conter, por 100 mililitros, o seguinte: 91,9 m_i lilitros de RPMI 1640 (Fiou Laboratories, Inc., Rockville, MD, E.U.A.), 0,1 mililitros de 100 x glutamina, 1,0 mililitro de 100 x piruvato de sódio, 1,0 mililitro de 50 x aminoácidos não essenciais, 1,0 militro de água contendo 10^ unidades de penicil_i na G e 10^ microgramas de estreptomicina e 5,0 mililitros de um lote subportador de soro de vitelo fetal (FCS). Misturam-se estes ingredientes até se ter uma homogeneidade aparente. Preparam -se suspensBes de células de baço e subpopulaçBes enriquecidas com células 3 esplénicas tal como se descreve em Goodman et al., 3. Immunol., 121:1905 (1978).

Para avaliar a imuno-resposta humoral primária aos eritro 6 7 eitos de ovino (SRBC) cultivam-se 5 x 10 a 10 células de baço murinas em 1,0 mililitro de meio contendo 5% de FCS, durante 4 ou 5 dias na presença de imunogénio. Incubam-se as células em placas de cultura (Costar, Cambridge, MA, E.U.A.) a 37SC numa atmosfera humidificada de 10/S de ^{em ar} usando caixas de cultura de tecidos (CBS Scientific, Del Mar, CA, E.U.A.) que são agitadas a uma frequência de 7 ciclos por minuto. 0s SRBC em fase líquida estão disponíveis no Colorado Serum Co., Denver C0, E.U.A.,

Preparam-se linfocitos de sangue periférico humano (PBL) a partir de sangue venoso heparinizado normal, por centrifugação de gradiente de densidade Ficoll-diatrizoato. Os PBL são desprjg vidos de células T supressoras compreendendo o receptor de hist_a mina do tipo 2 fazendo-os aderir às superfícies de caixas de petri de plástico revestidas com albumina de soro de coeiho-histamina (Cell-ect nS. 2 kit; Ssragen, Boston, MA, E.U.A.) e recupe rando as células não aderentes, por lavagem tal como se descreve em Wysocki e Sato, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75:2844 (1978) e foi modificado por Cavagnaro e Osband, Biotechniques, Baneiro/Fe. vereiro:30 (1983).

meio de cultura de tecidos utilizado nestes estudos é preparado como se segue: cem mililitros (ml) contém 87,9 ml de

268

EPG:11-SCRF 144.0

-44RPMI 1640 (FIouj Laboratories, Rockville, MD, E.U.A.), 0,1 ml de 100 x glutamina, 1,0 ml de tampão HEPES 1,0 M (Microbiological Associates, Betheseda, MD, EUA) 1,0 ml de água contendo 10^ U de penicilina G e 10^ microgramas de estreptomicina e 10 ml de pias, ma autologo fresco desactivado por calor. Para avaliar a imuno-resposta humoral primária ao SRBC, cultivam-se células linfoides com uma densidade de 2 x lO^/ml num volume de 1,0 ml contendo, co mo antigénio, 5 x 10^ SRBC’s (Colorado Serum Co., Denver, C0, E. U.A.) conjuntamente com IL-2 (uma preparação parcialmente purificada de IL-2 humana que está isenta de actividade de interferon gama e que é obtida na Electro-Nucleonics, Inc., Silver Spring, MD, E.U.A.) e o derivado de análogo de guanosina.

Ensaio de células formando placas (PFC). As PFC segrega_n do anticorpos contra o SRBC são determinadas após 4 ou 5 dias de cultura isando uma modificação do ensaio de placa hemolítica de Oerne e Nordin, Science, 140:405 (1963). Cultivam-se as células em meio completo antes da formação das placas; colocam-se em pia cas de agarose padrão de baixo M (Bio-Rad Laboratories, Richmond CA, E.U.A.) e incubam-se em complemento de cobaia com SRBC absorvido, durante uma hora após 1,5 hora de incubação sem complemento

Actividade de substituição de células T. Cultivam-se 5 x 10^ células B de ratinho CBA/CaO viáveis. Estas células são geradas tratando sequencialmente células de baço, primeiro, com complemento fixando anticorpos monoclonais dirigidos contra os a_n tigénios thy 1,2 de células T e em segundo lugar, com complemento para lisar quaisquer células T presentes (Neu/ England Nuclear, Boston, MA, E.U.A.). Cultivam-se depois as células assim tratadas, com ou sem 0,1 ml de 0,1 por cento (v/v) de SRBC, como imuno génio, em meio contendo soro e contendo adicional mente quantidades incrementais de um derivado de análogo de guanosina compreen-4 didas entre 0 e 10 molar. Determinam-se os PFC directos contra o SRBC 4 dias depois.

Ratinhos. 0s ratinhos CBA/CaO, 8-16 semanas de idade, são adquiridos no Oackson Laboratory, Bar Harbor, ME, E.U.A.. Um núcleo de ratinhos CBA/N é fornecido pela Animal Production

Section, National Institutes of Health, Bethesda, MD, E.U.A. To69 268

EPG:11-SCRF 144.D

-45dos os ratinhos são mantidos com pelotas Wayne Lab Blox F6 (Allied Mills, Inc., Chicago IL, E.U.A.) e com água clorada acidificada com HC1 até um valor ds pH de 3,0.

Preparações de células. Preparam-se suspensões de células do baço e do timus tal como se descreve em Goodman et al.,

0. I mrounol. , 121:1905 (1978). As populações enriquecidas com cê. g lulas B são preparadas tratando 10 células de baço com uma diluição 1:1000 de anticorpo monoclonal anti-thy 1,2 (New England Nuclear, Boston, MA, E.U.A.) durante 30 minutos a 4SC. Centrifugam-se as células tratadas a 280 x g durante 10 minutos removem-se os anticorpos e ressuspendem-se as células numa diluição 1:6 de RBC de CBA-absorvido em complemento de cobaia a 379C durante 45 minutos. Lavam-se depois as células e cultivam-se como anteriormente se descreveu.

I n.j ecções. Injectam-se os ratinhos i.p. com uma solução contendo 50^g de TNP-BSA. Nos cerca de 30 minutos seguintes, após a injecção imunizante, dois grupos de seis ratinhos, cada, recebem também injecções de 0,2 ml i.p. de um derivado de análogo de guanosina de invenção em óleo-de sésamo a 100 por cento ou em 2 por cento (v/v) de óleo de sésamo sonicado com solução salina normal, estando o derivado de análogo de guanosina presente numa quantidade de 5 mg/ml. Um terceiro grupo de seis ratinhos recebe a imunização mas não o derivado de análogo de guanosina. Os titu los de anticorpos anti-TNP-BSA são depois determinados usando técnicas convencionais.

C presente invento foi descrito em relação a concretizações preferidas. Será óbvio para o peritos na arte que podem fazer-se modificações e/ou variações de matéria que se descreve sem altsrar o espirito da invenção aqui apresentada.

268

EPG:11-SCRF 144.0

Claims (12)

1. RFIVINDICAÇÕES

   1 - Processo para melhorar a resposta imunitária, caracterizado por compreender o contacto de leucócitos, num meio aquoso, com uma composição contendo uma quantidade diluente de um transportador fisiologicamente tolerável em associação com uma quantidade eficaz para resposta imunitária, de um ingrediente acti. vo de derivado de análogo de guanosina cuja estrutura está de acor do com a da fórmula onde

   Z é 0 ou S ;

   XéO, S,SeouNCN; e

   R^ é um radical D-aldoglicosido ligado na posição beta, seleccionado entre o grupo consistindo de 1'-aldopentosidilo, 1'-aldo-hexosidilo, 1 '-aldopentosidilo mono-desoxigenado e l'-aldo-hexosidilo mono-desoxigenado e os seus derivados O-substituídos de alquilo inferior, alquilideno inferior, alcanoilo inferior, benzilo e benzoilo e os sais de adição de base não toxicas farmaceuticamente aceitáveis do referido derivado de análogo de guanosina; e a manutenção do referido contacto por um período de tempo suficiente para as referidas células modularem a sua resposta.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por ser seleccionado entre o grupo consistindo dos radicais 1 '-ribofuranosidilo, 1 ¹ -(2 '-desoxi)ribofuranosidilo e l'-glucopiranosidilo.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza.

   69 268

   EPG:11-SCRF 144.0

   -47do por a estrutura do referido radical de aldoglicosidilo estar de acordo com a fórmula onde n é zero ou um;

   R^, R-j, R^ e R^ são seleccionados entre o grupo consistir^ do de hidrogénio, hidroxilo, alcoxilo inferior, benziloxilo, alquilidenodioxilo inferior, alcanoiloxilo inferior e benzoxilo.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriz£ do por os referidos leucócitos serem linfócitos.
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza^ do por o referido derivado de análogo de guanina ser uma 7-desaza^ -7-tia-8-oxo-9,l'-beta-D-aldoglicosidilguanina.
6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por o referido derivado de análoga de guanina ser uma 7-desaza -7-oxa-8-tio-9,lbeta-D-aldoglicosidilguanina.
7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por o referido derivado de análogo de guanina ser uma 7-desaz.a -7-tia-8-tio-9,l'-beta-D-aldoglicosidilguanina.
8. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por o referido derivado de análogo de guanina ser uma 7-desaza, -7-oxo-8-oxo-9,l'-beta-D-aldoglicosidilguanina.
9. 9 - Processo de preparação de um análogo de guanosina com estrutura de acordo com a fórmula

   X

   69 268

   EPG:11-SCRE 144.0

   -48onde

   Z á 0 ou S ;

   X é 0, S , Se ou l\l C N; e

   R é um radical D-aldoglicosido, ligado na posição beta, seleccionado entre o grupo consistindo de 1'-aldopentosidilo, 1’-aldo-hexosidilo, 1’-aldopentosidilo mono-desoxigenado e l'-aido-hexosidilo mono-desoxigenado e os seus derivados 0-substituídos de alquilo inferior, alquilideno inferior, alcanoílo inferior, benzilo e benzoilo, e os sais de adição de base não tóxicos farma ceuticamente aceitáveis do referido derivado de análogo de guanosina, compreendendo os passos de:

   a) reagir um composto cuja estrutura corresponde à fórmu la:

   □ H

   NH na qual quaisquer grupos hidroxilo do referido R^ estão protegidos da reacção com grupos bloqueantes removíveis, com CXC^, em que X é 0, ou S, para formar um primeiro composto produto cuja estrutura corresponde à fórmula:

   b) isolar o referido primeiro composto produto;

   c) reagir o referido primeiro composto produto isolado com metóxido de sódio, para formar um segundo composto produto;

   69 268

   EPG:11-SCRE 144.0 r

   -Wd) isolar o referido segundo composto produto;

   e) reagir o referido segundo composto produto isolado com iodeto de trimetilsililo para formar um terceiro composto pro duto;

   f) isolar o referido terceiro composto produto;

   g) remover os referidos grupos bloqueantes removíveis p£ ra formar um quarto composto produto cuja estrutura corresponde à fórmula:

   h) isolar o referido quarto composto produto; ou a¹) reagir um composto cuja estrutura corresponde à fórmula:

   CHCH.

   na qual quaisquer grupos hidroxilo do referido R^ estSo protegidos da reacç3o com grupos bloqueantes removíveis, com ^H^OCXCl, em que X é S ou 0, para formar um primeiro composto produto cuja estrutura corresponde à fórmula:

   CHCH.

   X

   69 268

   EPG:11-SCRF 144.0

   -50b¹) c¹) isolar o referido primeiro composto produto;

   reagir o referido primeiro composto produto isolado com fluoreto de tetra-n-butilamónio, para formar um segundo composto, produto; cuja estrutura corresponde à fórmula d¹) isolar o referido segundo composto produto;

   e¹) reagir o referido segundo composto produto isolado com metóxido de sódio para formar um terceiro composto produto;

   f¹) isolar o referido terceiro composto produto;

   g¹) reagir o referido terceiro composto produto com iodeto de trimetilsililo para formar um quarto composto produto;

   h¹) isolar o referido quarto composto produto;

   remover os referidos grupos bloqueantes removíveis para formar um quinto composto produto cuja estrutura corresponde à fórmula:

   ii· isolar o referido quinta composto produto; ou reagir os compostos produto isolados dos passos h) um b ) isolar o referido composto tiónio alquilado;

   ou f¹) em que X é S, com um agente de alquilação para formar composto tiónio alquilado;

   ii

   69 268

   EPG:11-5CRF 144.0

   -51c¹¹) reagir □ referido composto tiónio alquilado isolado com seleneto de sódio, para formar um composto, 3-selenoxo; e d¹¹) isolar o referido composto 3-selenoxo; ou a¹¹¹) reagir o referido composto tiónico alquilado isol_a do com cianamida e hidreto de sódio para formar um composto 8-ci_a nimino; e b¹¹¹) isolar o referido composto 8-selenoxo; ou a^lu) reagir o produto dos passos h), f¹), d¹¹) ou b¹¹¹) com um reagente de 0-alquilação ou 0-acilação para formar um composto produto derivado de alquilo inferior, alquilideno inferior alcanoilo inferior, benzilo ou benzoílo O-substituidos;

   b^lv) isolar o composto produto do passo a^lu);

   a^u) reagir o produto dos passos h), j¹), d¹¹), b¹¹¹) ou b^1V) com um sal de adição de base não tóxico, farmaceuticamente aceitável; e b^U) isolar o referido sal.
10. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por R·^ ser seleccionado entre o grupo consistindo dos radicais 1'-ribofuranosidilo, 12’-desoxi)ribofuranosidilo e 1'-glucopiranosidilo.
11. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a estrutura do referido radical aldoglicosidilo corresponder à fórmula

    69 268

    EPG:11-SCRE 144.0

    -52onde π é zero ou um;

    R , R^, R^ e R^ são seleccionados entre o grupo consisti_n do de hidrogénio, hidroxilo, alcoxilo inferior, benziloxilo, alquil idenodioxilo inferior, alcanoiloxilo inferior e benzoxilo.
12. 12 - Processo de acorda com a reivindicação 9, caracterizado por o referido derivado de análogo de guanosina ser seleccio nado entre o grupo consistindo de 7-desaza-7-οχa-8-οχo-9-(1'-beta -D-ribofuranosidil)guanina, 7-desaza-7-oxa-8-oxo-9-(l'-beta-D-2'-desoxirribofuranosidil)guanina, 7-desaza-7-oxa-8-oxo-9-(1'-beta-D-glucopiranosidil)guanina, 7-desaza-7-tia-8-oxo-9-(l’-beta-D-ribofuranosidil)guanina, 7-tia-8-oxo-9-(l '-beta-D-2 '-desoxirrib_o furanosidil)guanina e 7-tia-8-oxo-9-(l'-beta-D-glucopiranosidil)guanina.