PT90196B

PT90196B - Processo para a degradacao microbiana de tricloroetileno

Info

Publication number: PT90196B
Application number: PT90196A
Authority: PT
Inventors: Robert B Winter; Kwang-Mu Yen; Burt D Ensley
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1988-04-05
Filing date: 1989-04-04
Publication date: 1994-06-30
Also published as: AU626856B2; DK608989D0; IL89847A; FI100992B; JPH02503866A; CA1316860C; DK608989A; PT90196A; WO1989009827A1; NO179642B; AU3427589A; NO179642C; IL89847A0; NO894846L; DK175623B1; FI895787A0; EP0336718A2; US5079166A; KR0131772B1; KR900700611A

Description

PATENTE DE INVENÇÃO

N9 90.196

NOME: AMGEN INC., norte-americana, com sede em 1900 Oak Terrace Lane, Thousand Oaks, Califórnia 91320, EStados Unidos da América,

EPÍGRAFE ('Processo para a degradaçao microbiana de tricloroetileno

INVENTORES: Robert 3. Winter,

Kwang-Mu Yen,

Burt D. Ensley,

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4? da Convenção da União de Paris de 20 de Março de 1883.

U.S.A., em 05.04.88, sob o N<? 177,640, e em 19.10.83, sob ο N9 235.354AMGEN INC.

Processo para a degradação microbiana de tric1oroeti1eη o

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

I . Domínio da Invenção

A presente invenção diz respeito a um processo melhorado para a degradação microbiana do tric1 oroetiIeno por células KR-1 ( PmKR1 ) de Pseudomonas mendocina ou células KT2440 de Pseudomonas put ida contendo o plasmídeo pAUTI de PmKR1 ( Pp Y2101 ) ou por microrganismos construídos geneticamente que contêm os genes PmKR1 de to 1ueno-moηo oxigenase . Descobriu-se agora, inesperadamente, que o sistema enzimático tolueno-monooxigenase de PmKR1 é utilizável na degradação do tric1 oroeti1eηo. 0 isolamento e a clonagem dos segmentos de gene que codificam o sistema enzimático tolueno-monooxigenase de PmKR1 está descrito no pedido de patente de invenção norte-americana N9. de série 1 77 631, depositado em 5 de Abril de 1988, que aqui se incorpora como referência.

Em um aspecto, a presente invenção diz respeito a um processo para a degradação microbiana do tric1 oroeti1eno mediante tratamento de tric1 oroeti1eno com uma célula hospedeira de microrganismo. que contém um plasmídeo recombinante , contendo o plasmídeo recombínante genes PmKR1 de tolueno-monooxigenase. A célula hospedeira do microrganismo que contém o plasmídeo recombinante deve ser tratada com um indutor de genes de tolueno-monooxigenase para degradar o tric1 oroeti1eno . A presente invenção proporciona um novo processo para a degradação do tric1oroeti1eno , proporcionando microrganismos construídos geneticamente que apresentam níveis de actividade enzimática de tolueno-monooxigenase em determinadas condições de cultura de células e de ensaio, que ultrapassam os níveis expressos em células PmKR1 do tipo selvagem.

A presente invenção proporciona, assim, um meio mais eficiente de efectuar certas biodegradações relacionadas com este sistema enzimático, em particular a degradação do tric1 oroeti1eno. A invenção é aplicável 'a degradação de t r i c 1 or oe t i 1 eno existente sob a forma de um poluente ou de um contaminante em sistemas ambientais abertos ou fechados.

tric 1 oroeti1eno ( TCE ) é um dissolvente industrial largamente utilizado que existe frequentemente como um contaminante da água subterrânea, água potável e água residual. A água subterrânea é o reservatório principal dos desperdícios perigosos impropriamente tratados. Foram Identificados mais de 200 produtos químicos orgânicos e inorgânicos em vários fornecimentos de água subterrânea, contudo, de todos esses produtos químicos contaminantes identificados, a EPA verificou ser o TCE o contaminante químico mais frequentemente observado nos locais da National Priority List ( NPL ) nos Estados-Unidos.

A dimensão do problema da contaminação da água subterrânea é ainda exemplificado pelo facto de a água subterrânea suprir 25% de toda a água usada nos Estados Unidos. Os cálculos efectuado s pela The Conservation Eoundation ( Groundwater-5avinq the Unseen Resource, Novembro, 1985, p. 5) mostram que nos Estados Unidos a água subterrânea é origem de: (1) 35% de toda a água de distribuição camarária, (2) 50% de toda a água potável ( 97% nas áreas rurais), (3) 40% de toda a água utilizada na irrigação na agricultura e (4) 26% de toda a água utilizada na indústria ( com exclusão das centrais eléctricas). Assim, nunca é demais realçar a importância do desenvolvimento de técnicas ambientais eficazes para a degradação do TCE em produtos inócuos.

desenvolvimento de microrganismos construídos geneticamente que tenham elevadas capacidades para degradar contaminantes químicos específicos, tais como TCE, em produtos inócuos é uma estratégia importante no desenvolvimento de processos aceitáveis sob o ponto de vista económico e ambiental para a remoção de produtos químicos perigosos. 0 desenvolvimento e a utilização de células hospedeiras de microrganismo com plasmídeos recombinantes contendo genes de tolueno-monooxigenase de PmKR1 na presente invenção é o primeiro processo que utiliza esses microrganismos construídos geneticamente utilizável para o tratamento de resíduos químicos de TCE. 0 desenvolvimento e a utilização de células hospedeiras de microrganismos contendo os plamídeos recombinantes aqui descritos são particularmente vantajosos devido ao facto de os segmentos de gene específicos e bem caracterizados que codificam os genes de tolueno-monooxigenase de PmKR1 terem sido clonados e utilizados para construir os plamídeos recombinantes como se descreve no pedido de invenção norte-americana nS. de série 177 631, referida antes. São esses segmentos de gene colocados sob a regulação de certos promotores que conferem especificamente elevadas capacidades para degradar o TCE a certas células hospedeiras de microrganismos utilizadas na presente invenção. Este sistema permite facilmente a manipulação de genes isolados por clonagem em uma variedade de vectores de clonagem e expressão através de uma variedade de sistemas de promotores diferentes, de modo a aumentar e optimizar a actividade metabólica para degradar o TCE. Além disso, este sistema permite facilmente o estudo e a manipulação das enzimas e das proteínas específicas envolvidas na degradação do TCE. Como uma consequência da preparação de segmento de ADN contendo genes de tolueno-monooxigenase de PmKR1, da incorporação desses segmentos de ADN em vectores de plasmídeos apropriados e da transformação das células hospedeiras de microrganismo, expressam-se e podem isolar-se os produtos enzimáticos de tolueno-monooxigenase de PmKR1. Portanto, pode seguir-se uma via diferente para a degradação do TCE utilizando produtos enzimáticos isolados e purificados em vez de células hospedeiras de microrganismos transformadas. Deve entender5

que os produtos enzimáticos de tolueno-monooxigenase de PmKR1 podem ser usados directamente para degradar o TCE. Esses produtos enzimáticos podem ser libertados em ou aplicados a locais de resíduos químicos de TCE e podem ser utilizáveis no controlo da poluição, por exemplo, no tratamento de água residual industrial contaminada com TCE.

II. Descrição da técnica

Foram propostos muitos processos diferentes para tornar inócuos os resíduos tóxicos. Entre estes processos contam-se a incineração, a transformação química e a degradação microbiana. Dado que não envolve a utilização de reagentes guímicos gue possam eles próprios ser tóxicos e não resulta na produção de grandes guantidades de fumos nocivos, tais como os produzidos na incineração de resíduos tóxicos, a degradação microbiana de resíduos tóxicos, tornou-se um processo preferido para a rejeição de resíduos tóxicos.

A maior parte das degradações microbianas de produtos tóxicos baseam-se na descoberta de um microrganismo particular que metabolize o produto tóxico convertendo-o em produtos metabólicos inócuos, normalmente, no caso dos compostos orgânicos tóxicos, convertendo esses compostos em anidrido carbónico, água e sais. Descobrir microrganismos, em particular microrganismos construídos geneticamente, que possam converter eficaz e seguramente os resíduos tóxicos em produtos metabólicos inócuos é um processo altamente complexo que envolve muitas f ases t r ab a lhosa s e requer um significativo dispêndio de tempo. A maior parte dos esforços para isso foram concentrados na descoberta de microrganismos indígenas e no seu isolamento do solo ou da água contaminados .

Uma via consiste em obter uma amostra de solo ou de água e enriquecer a amostra com uma mistura de microrganismos ou isolar de uma mistura uma cultura purificada de um microrganismo com capacidade para degradar um ou mais dos compostos tóxicos. Vários estudos utilizando misturas de microrganismos que contêm bactérias utilizadoras de metano, obtidos por enriquecimento com metano de uma amostra de solo, mostraram que essas misturas têm a capacidade para degradar o TCE e outros etenos clorados:

Fogel et al., Appl. Environ. Microbiol. 51, 1986, 720-724; Wilson e Wilson, Appl. Environ. Microbiol. 49, 1985, 242-243. Embora estas culturas que utilizam metano contenham mais de um tipo de bactérias, foi proposto que as metanotrofes são responsáveis pela degradação do TCE. Fogel et al. (supra) referem uma velocidade da degradação de TCE de 0,03 nanomoles de TCE por minuto por miligrama de proteína celular.

Outros estudos não utilizaram misturas de microrganismos mas estirpes purificadas isoladas de solo ou água. Uma dessas vias está descrita na patente de invenção norte-americana NS.

493 895, na qual se reivindica um processo para a degradação microbiana de compostos aromáticos halogenados contaminantes

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para se obterem produtos inócuos. Este processo compreende as fases de (1) recolha de uma amostra do produto de um local contaminado com produtos químicos nocivos; (2) enriquecimento dos microrganismos vivos contidos na amostra; (3) separação das estirpes de microrganismos capazes de ter diferentes metabolismos para os vários produtos guímicos da amostra, de um local para o outro; (4) purificação das estirpes gue são capazes de biodegradar os produtos guímicos a rejeitar; (5) aplicação da estirpe ao local onde se depositam os contaminantes; e (6) controlo da remoção dos contaminantes no local da aplicação. A patente de invenção norte-americana N2. 4 477 570 descreve e reivindica os microrganismos utilizados no processo referido antes e reivindicado na patente de invenção norte-americana N2. 4 493 895.

Uma outra via é descrita na patente de invenção norte-americana N2. 4 664 805, na qual se reivindica um processo para a descontaminação de ambientes por compostos orgânicos halogenados, utilizando (1) microrganismos indígenas de ambientes a descontaminar, os quais podem metabolizar mas não desenvolver-se no contaminante; (2) um inoculo de microrganismos não indígenas do ambiente que metabolizam o contaminante mais rapidamente que o microrganismo indígena, mas não se pode desenvolver nele; e (3) um análogo não tóxico do contaminante que serve como um substrato para o desenvolvimento dos microrganismos indígenas e não indígenas. Deposita-se a confiança nos microrganismos já existentes no ambiente, os chamados microrganismos indígenas, para efectuar ι

χ a degradação. A degradação é reforçada pelos micorganismos não indígenas.

Ainda uma outra via descrita na patente de invenção norte-americana NS . 4 51 1 657 compreende um processo para o tratamento de lixiviados de terraplanagens, contendo resíduos químicos, com lamas activadas que contêm bactérias capazes de metabolizar produtos orgânicos nocivos presentes nos lixiviados. Todas as técnicas descritas antes envolvem a utilização de microrganismos que são indígenas ou isolados do solo contaminado ou de lixiviados.

As enzimas degradadoras necessárias para os microrganismos degradarem os compostos orgânicos halogenados podem ser codificadas por genes oriundos de plasmídeos. Um plasmídeo individual contém geralmente genes que codificam enzimas de acordo com um ciclo de degradação único. Os plasmídeos foram utilizados em métodos para a biodegradação de certos compostos orgânicos aromáticos clorados, tal como se ilustra na patente de invenção norte-americana NS.

535 061 ( a qual descreve processos de reprodução assistida por plasmídeos para gerar culturas puras e mistas de microrganismos capazes de dissimilar compostos químicos persistentes no meio ambiente) e pela patente de invenção norte-americana NS.

664 805 discutida antes.

pedido de patente de invenção europeia NS. 8511008.1 descreve a preparação de plasmídeos híbridos e transconjugados contendo esses plasmídeos, os quais são provenientes de microrganismos que degradam compostos orgânicos aromáticos halogenados

(A.T.C.C. 31 939-31 945 ) (estes microrganismos foram descritos nas patentes de invenção norte-americanas NS. 4 477 570 e NS. 4.493 895) 0 pedido de patente de invenção NS. 8511008.1 descreve um processo para a produção de um microrganismo que tem especificidade para biodegradar compostos orgânicos halogenados compreende as fases de : (1) cultivar separadamente e manter (a) um largo espectro de microrganismos escolhidos do grupo de ATCC 31945, ATCC 31941, ATCC 31942, ATCC 31940, ATCC 31943, ATCC 31944, ATCC 31939, e os respectivos mutantes e (b) um vector de um largo intervalo de hospedeiros; (2) isolar à parte o ADN do plasmídeo de (a) e (b) referidos antes; (3) purificar à parte o ADN do plasmídeo de (a) e (b) referidos antes; (4) efectuar separadamente a restrição enzímática do ADN purificado proveniente de (a) e (b) referidos antes; (5) combinar os produtos da fase (4) e ligar enzímaticamente os produtos combinados; (6) transformação dos produtos da ligação em um microrganismo receptor tal como E_. coli ou espécies de Pseudomonas; (7) escolha dos transformantes que têm o ADN do plasmídeo pretendido inserido no vector; (8) conjugação do ADN do plasmídeo em um hospedeiro receptor escolhido do grupo de Pseudomonas, Klebsiella, Rhizobium, Agrobacterium, Escherichia com o auxílio de um plasmídeo auxiliar; e (9) escolha dos transconjugantes que têm o ADN do plasmídeo pretendido.

Foram descritos onze transconjugados e, inesperadamente, descobriu-se que a maioria dos transconjugados utiliza como sua única fonte de carbono certos compostos orgânicos halogenados alifáticos, específicamente, tetrac1 oroeti1eno, dicloreto de etileno, metilc1 orofórmio e TCE, enquanto os microrganismos progenitores A.T.C.C. 31939-31945 utilizam apenas um largo espectro de compostos orgânicos aromáticos, tal como se descreve na patente de invenção norte-americana NS. 4 493 895. A única tentativa para a utilização destes compostos orgânicos halogenados alifáticos consistiu no desenvolvimento em meio contendo o composto tendo o desenvolvimento sido 50% maior que o desenvolvimento médio. Com excepçao deste ensaio de desenvolvimento, os transconjugados são completamente não caracterizados. Em particular, nada se descreve acerca da extensão da degradação destes compostos orgânicos halogenados alifáticos por estes microrganismos ou acerca da natureza e toxicidade dos produtos metabólicos. Nada se diz ou descreve em relação aos genes, segmentos de genes, enzimas, proteínas ou produtos proteicos envolvidos na capacidade dos transconjugados para metabolisar esses compostos orgânicos halogenados alifáticos, incluindo o TCE. Em particular, os ensinamentos do pedido de invenção europeia NS. 851008.1 limitam-se à utilização dos compostos orgânicos halogenados alifáticos, incluindo o TCE, por plasmídeos escolhidos do grupo de microrganismos designados como A.T.C.C. 31939-31945.

Em relação ao metabolismo do TCE especificamente, foi referida a degradação parcial do TCE por organismos anaeróbios, mas os metabolismos do processo de degradação incluem cloreto de vinilo e dic1oroeti1eno que são igualmente contaminantes indese1 1

jáveis das águas subterrâneas. Kleopfer et al., Environ. Sei.

T e c h η o 1. , 1 9, 1 985, 277-280; Parsons et al., J. Am. Water Works Assoe. , 7 6, 1 984, 56-59; Vogel & McCarty, Appl. Environ Microbiol . , 4_9, 1985, 1 080-1 083.

Um trabalho recente descreve um isolado bacteriano que ocorre na Natureza, o qual é capaz de degradar o TCE sob condições aeróbias. Nelson et al., Appl. Environ Microbiol., 52, 1986, 383-384; Nelson et al., Appl. Environ. Microbiol., 53, 1 986, 949-954. 0 microrganismo designado Estirpe G4 requer fenol, tolueno, £-cresol ou rn-cresol para a degradação do TCE. Tal como caracterizada, a Estirpe G4 (1) não utiliza o esquema TOL para a degradação do tolueno; (2) Não parece ter a enzima tolueno-dioxigenase, a primeira enzima no esquema TOD para a degradação do tolueno e (3) não utiliza o esquema TMO para a degradação do tolueno. Estes três esquemas de degradação do tolueno (TOL, TOD, TMO) são resumidos no pedido de patente de invenção norte-americana n9. de série 177 631. Nelson et al. não explica nem descreve que genes, segmentos de genes, enzimas, proteínas ou produtos proteicos estão envolvidos na capacidade da Estirpe G4 para degradar o TCE nem se os genes envolvidos são codificados por plasmídeo ou codificados por via cromossómica. A engenharia genética da Estirpe G4 não foi referida.

Mais recentemente, Nelson et al. Appl. Environ. Microbiol.

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54, 1988, 604-606, testaram a capacidade de degradação de TCE de 6 estirpes de microrganismos capazes de degradar naftaleno, bifenilo, fenol e tolueno. Apenas duas das estirpes testadas,

PpE1 de Pseudomonas p u t i da (PpF1) e 85 de Pseudomonas putida (B5), degradaram o TCF. PpF1 e B5 são estirpes que degradam o tolueno; no entanto, uma terceira estirpe que degrada o tolueno, mt-2 de Pseudomonas putida (Pp mt-2), não degrada o TCE. Portanto parece que nem todas as estirpes que degradam o tolueno são capazes de degradar o TCE.

A Pp mt-2, que Nelson et al., supra, descobriram não degradar o TCE contém o plasmideo pWWO , o qual codifica para as enzimas do esquema de degradação do tolueno conhecido por TOL. A PpE1 que Nelson et al., supra, descobriram não degradar o TCE, é conhecida como contendo enzimas do esquema de degradação do tolueno designado por TOD. Wackett e Gibson, Appl.Environ. Μ ίο r o b i o 1 . , 54 , 1988, 1 703-1 708, mostraram também recentemente que as células PpE1 têm a capacidade para degradar o TCE. Nestas condições de cultura e de ensaio, Wackett e Gibson, supra, descobriram que aproximadamente 50% a 60% do TCE inicial (20y£M) era degradado. Pelo contrário, para concentrações elevadas de TCE (32 O^/^4, M) não se detectava a degradação do TCE. A maior velocidade de degradação do TCE que estes autores observaram foi de 1,8 nanomoles por minuto por miligrama de proteína celular.

Os genes para o esquema TOD de PpE1 são codificados por

3 via cromossómica, em contraste com os genes de Pp mt-2 do esquema TOL que são codificados por plasmideo. Portanto, não é possível prever se os genes envolvidos na degradação do TCE são codificados por via cromossómica ou por plasmideo. Estudos efectuados por Nelson et al., s u p r a , e Wackett e Gibson, supra , com mutantes de PpF1 defectivo para vários componentes no esquema de degradação de tolueno TOD sugerem que a capacidade de PpF 1 para degradar o TCE está associada à actividade enzimática de to 1ueno-dioxigenase , que é a primeira enzima no esquema TOD que codifica por via cromossómica. Os estudos de Nelson et al., supra , com Pp mt-2 mostraram que a capacidade de degradação do TCE não está associada a quaisquer enzimas do esquema TOL que codifica por plasmideo.

Nenhum dos microrganismos testados até agora para a capacidade de degradação do TCE utiliza o esquema THO que codifica por plasmideo para a degradação do tolueno. Além disso, nenhum microrganismo foi até agora construído geneticamente para aumentar a actividade enzimática e a capacidade de degradação do TCE. Também, a utilização de quaisquer dos sistemas de microrganismos descritos antes para degradar o TCE apresenta vários problemas associados. Um primeiro problema consiste em que para degradar o TCE deve induzir-se um esquema enzimático de degradação ( por exemplo, o esquema TOD ) nos microrganismos e os indutores que devem ser adicionados à amostra contaminada por TCE são hidrocarbonetos. Um segundo problema é que, uma vez que o TCE (um substrato para enzimas de degradação induzida) em si mesmo não pode ser utilizado por estes microrganismos como fonte de carbono para o desenvolvimento celular, devem fornecer-se células provenientes de um outro substrato ( um co-substrato ) para o desenvolvimento. Estes co-substratos adicionados à amostra contaminada por TCE são hidrocarbonetos tais como tolueno. Estes dois problemas estão relacionados com o problema prático, de com vista à degradação do TCE em uma amostra contaminada tal como um aguífero, não ser desejável adicionar hidrocarbonetos tal como tolueno ( como indutor e/ou fonte de carbono ) porque os hidrocarbonetos tais como o tolueno são eles próprios compostos tóxicos sob o ponto de vista ambiental. Um terceiro problema estreitamente relacionado com os dois primeiros é o de que nos sistemas descritos antes, em que um hidrocarboneto tal como o tolueno actua como o indutor e substrato para as enzimas do esquema de degradação ( em que estas enzimas metabolizam o hidrocarboneto e degradam o TCE ), existe uma competição entre o hidrocarboneto e o TCE para o mesmo sistema enzimático. Em condições em que a concentração de hidrocarboneto esteja em grande excesso em relação à concentração do TCE, o hidrocarboneto deverá competir mais eficazmente para o sistema enzimático e retardar a degradação do TCE. Estes três problemas ilustram vários aspectos do que é designado o problema do co-substrato que ocorre nos sistemas enzimáticos induzíveis descritos antes para a degradação do TCE.

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SUMARIO DA INVENÇAO

Descobriu-se agora inesperadamente que o PmKR1 e os microrganismos construídos geneticamente que contém genes de tolueno-monooxigenase de PmKRI têm a capacidade de degradar o TCE. Por conseguinte, PmKRI e as células hospedeiras de microrganismos que contêm genes de to lueno-monooxigenase de PmKRI são utilizáveis em um processo para a degradação do TCE.

A presente invenção abrange assim um novo processo para a degradação do TCE, utilizando estes microrganismos que contêm genes de tolueno-nonooxígenase de PmKRI. Em particular, a presente invenção compreende um processo para a degradação do TCE que utiliza microrganismos construídos geneticamente, que foram desenvolvidos e que têm capacidades elevadas para degradar um contaminante químico específico, tal como o TCE, com formação de produtos inócuos.

Deste modo, um dos objectos da presente invenção é proporcionar um processo para a degradação do TCE onde quer que este apareça como contaminante ou poluente.

Um outro objecto da presente invenção é proporcionar um processo para a degradação microbiana do TCE onde for necessário, por exemplo, como meio de limpeza de águas em recipientes e ao ar livre, descargas de efluentes industriais, instalações e fábricas governamentais comerciais ou industriais ou várias operações laboratoriais e em outras situações em que o TCE se

6 .X possa ter acumulado. Em particular, a presente invenção proporciona um processo aperfeiçoado para a degradação do TCE, mediante a utilização de microrganismos que degradam o TCE, construídos geneticamente, de acordo com a presente invenção, após o TCE ser removido de águas contaminadas ( por exemplo, por arrastamento por ar ) .

Um outro objecto da presente invenção é proporcionar um processo para a degradação fácil, eficiente e relativamente económica do TCE.

Ainda um objecto da invenção é proporcionar microrganismos que contenham plasmideos recombinantes com genes de tolueno-monooxigenase provenientes de enzimas que codificam PmKR1 capazes de degradar o TCE, dando origem a uma massa celular não tóxica, sendo estes microrganismos não patogénicos para os seres humanos, animais ou fauna e flora marinhas.

Ainda um outro objecto da presente invenção é proporcionar um processo para a degradação do TCE em que a célula hospedeira do microrganismo que contém o plasmideo recombinante com os genes de to 1ueno-monooxigenase de PmKR1 e capaz de degradar o TCE possa ser aplicado directamente ao local da contaminação do TCE.

Ainda um outro objecto da invenção é proporcionar um processo para a degradação do TCE utilizando microrganismos construídos geneticamente com genes de to 1ueno-moηooxigenase de PmKR1

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nos quais os genes estão colocados sob o controlo de vários promotores e resulta numa expressão reforçada da actividade de tolueno-monooxigenase e degradação reforçada do TCE sob certas condições de cultura celular e de ensaio.

Um outro objecto da invenção é proporcionar um processo para a degradação do TCE mediante a utilização de microrganismos construídos geneticamente com genes de tolueno-monooxigenase de PmKR1 nos quais os genes estão colocados estão sob controlo de sistemas promotores que não são induzidos por hidrocarbonetos , tais como o tolueno, resolvendo ao mesmo tempo o problema do co-substrato apresentado pelos sistemas enzimáticos induzíveis descritos antes para a degradação do TCE. As vantagens da utilização de microrganismos construídos geneticamente de acordo com a presente invenção incluem portanto: a eliminação de um hidrocarboneto tal como o tolueno como indutor; a eliminação de um hidrocarboneto tal como o tolueno como co-substrato para o sistema enzimático de degradação; e a eliminação da inibição competitiva da degradação de TCE pelo hidrocarboneto co-substrato/indu tor .

A invenção proporciona um processo para a degradação microbiana do TCE que compreende tratar-se TCE com células PmKR1 ou células PpY21O1 que contêm um plasmideo pAUTI de PmKR1 ou uma célula hospedeira de microrganismo contendo um plasmideo recombinante. 0 plasmideo recombinante contém genes de tolueno-monooxi1 8

genase isolados de PmKR1. Os genes codificam as enzimas proteínas do esquema TMO para a degradação do tolueno. De acordo com o processo, as células de PmKR1 ou as células ΡρY2101 ou as células hospedeiras de microrganismo com um plasmídeo recombinante são tratadas com um indutor dos genes de tolueno-monooxigenase.

Uma vantagem da presente invenção em um dos seus aspectos consiste na utilização de microrganismos construídos geneticamente, com genes cionados bem caracterizados, cuja expressão é efectuada sob controlo de promotores bem caracterizados e facilmente regulados, tais como os microrganismos, de tal modo que estes microrganismos construídos geneticamente têm a capacidade de degradar eficazmente o TCE. Além disso, estes microrganismos construídos geneticamente podem ser desenvolvidos rápida e economicamente até densidades celulares muito altas com a moderna tecnologia de fermentação, desenvolvida para as estirpes de _E. coli, em contraste com a dificuldade de desenvolvimento dos isolados naturais tais como as células PmKR1. Também, estes microrganismos construídos geneticamente podem manter, na presença de baixas concentrações de glucose, a degradação do TCE por períodos superiores a 12 horas. Uma outra vantagem da utilização destes microrganismos recombinantes é a de que eles são capazes de degradar o TCE até níveis extremamente baixos, devido ao facto de que o metabolismo já não requerer a presença de hidrocarbonetos aromáticos (tal como o tolueno) no meio, tal como era re19 querido pelas células PmKR1.

Os microrganismos construídos geneticamente podem ser aplicados directamente ao ambiente que contém TCE e que se pretende descontaminar. Em alternativa, podem utilizar-se produtos enzimáticos de genes clonados para degradar o TCE, em vez de microrganismos construídos geneticamente, em locais de resíduos químicos de TCE. A aceleração da velocidade de descontaminação resulta da utilização desses microrganismos construídos geneticamente com genes induzíveis para a degradação do TCE.

Estes e outros objectos e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes para os especialistas na matéria a partir da descrição e reivindicações que se apresentam a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Com referência aos desenhos anexos apresentam-se 8 figuras, que se descreverão em pormenor, e que ilustram a presente invenção:

A FIG. 1 é um gráfico que representa o desaparecimento de 1Oyz,M (1,3 ppm) de TCE adicionado a células ensaiadas para a capacidade de degradação de TCE, devido ao metabolismo do TCE pelas células em produto não volátil em função do tempo. As células ensaiadas foram KR-1 de Pseudomonas mendocina (PmKR1), E1 de Pseudomonas putida (PpF1) e Y2101 de Pseudomonas putida (Pp21O1)

A FIG. 2 é um gráfico que representa o efeito de se adicionar tolueno simultaneamente com a adição de TCE sobre o desaparecimento de 20^μ·Μ (2,6 ppm) de TCE adicionado a células ensaiadas em relação 'a capacidade de degradação do TCE, devida ao metabolismo do TCE em produto não volátil em função do tempo. As células ensaiadas foram: (1) PmKR1 com e sem adição de tolueno ao mesmo tempo que a adição de TCE; e (2) PmYAOOI.

A FIG. 3 é um gráfico que representa o desaparecimento de 50 (6,5 ppm) de TCE adicionado a células ensaiadas em relação à capacidade de degradação do TCE devida ao metabolismo do TCE em produto não volátil em função do tempo. As células ensaiadas foram: (1) HB101 de E^. coli contendo plasmideo recombinante pMYA02 (HB101/pMY402) em condições tais que as células foram induzidas com IPTG antes e durante o ensaio ( as células de controlo não foram induzidas com IPTG ); e (2) células FM5 de EA coli que contêm o plasmideo recombinante pKY287 (FM5/pKY287 ) em que as células foram induzidas por um aumento de temperatura (as células de controlo foram células FM5 que continham o vector plasmídeo pCFM1146) .

A FIG. A é um gráfico que representa o desaparecimento do TCE adicionado a células em várias concentrações devido ao metabolismo do TCE em produto não volátel em função do tempo, por células HB101 que contêm o plasmideo recombinante pMYA02.

A FIG. 5 é um gráfico que representa o perfil da eluição de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) de metabolitos marcados com ^C presente no meio celular depois de degradação de ^C-TCE por células PmKR1 ( as células de controlo foram células PmY4001 ) .

A FIG. 6 é um gráfico semelhante à FIG. 5 mas em que a 1 4 degradação de C-TCE foi efectuada por células EM5/pKY287 (as células de controlo foram células FM5/pCEM 1146).

A FIG. 7 é um gráfico que representa o desaparecimento de 20 M (2,6 ppm) de TCE adicionado a células, devido ao metabolismo do TCE em produto não volátil em função do tempo, de modo a comparar a velocidade e a extensão da degradação do TCE pelas células PmKRI de tipo selvagem e por células HB101 que contêm o plasmideo recombinante pMY402 (HB101/pMY402 ) .

A FIG. 8 é um gráfico semelhante á FIG. 7 mas em que se utiliza 50 ^/4M (6,5 ppm) de TCE em vez de 20 M (2,6 ppm). Além disso, esta figura inclui os resultados obtidos com células EM5 de £. coli que contêm o plasmideo recombinante pKY287 (EM5/pKY287), de modo a comparar a velocidade e a extensão da degradação do TCE pelas células PmKRI, HB101/pMY402 e EM5/pKY287 de tipo selvagem.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS

Tal como se referiu antes, o TCE é um importante dissol./ vente industrial e verificou-se estar largamente distribuído no meio ambiente aquático. Anualmente produzem-se aproximadamente 234 000 toneladas de TCE em todo o mundo (U.S. Environmenta 1 Protection Agency, 1 980 , EPA 440/5-80-077). 0 TCE é muito persistente e pode ser extremamente difícil de remover uma vez presente no ambiente. Actualmente pouco se sabe acerca do metabolismo microbiano do TCE. Os genes isolados e clonados tais como genes de tolueno-monooxigenase de PmKR1 usados na presente invenção deverão permitir a elucidação de uma compreensão pormenorizada de um único tipo de metabolismo microbiano do TCE. Além disso, os genes clonados podem ser manipulados, por exemplo, combinando os genes com diferentes promotores, para aumentar a expressão dos produtos enzimáticos, de modo a aumentar a velocidade e a extensão da degradação do TCE. Tal como se ilustra na presente invenção, a utilização de certos sistemas promotores em certas condições de cultura celular e de ensaio pode aumentar a expressão dos produtos genéticos de tolueno-monooxigenase e pode resultar na aceleração da velocidade da degradação do TCE pelos microrganismos que contêm esses genes clonados.

desenvolvimento de microrganismos construídos geneticamente que apresentam capacidades elevadas para degradar contaminantes químicos específicos, tais como TCE, para se obterem produtos inócuos, é uma estratégia importante no desenvolvimento de métodos económicos e apropriados sob o ponto de vista ambiental para eliminação de resíduos de produtos químicos perigosos.

desenvolvimento e a utilização de células hospedeiras de microrganismos com plasmídeos recombinantes que contêm genes de tolueno-monooxigenase de PmKRI, de acordo com a presente invenção, é um processo novo e útil que pode ser aplicado a eliminação de resíduos químicos do TCE. Em particular, estas células hospedeiras de microrganismos construídos geneticamente são utilizáveis num processo aperfeiçoado para degradar o TCE após este ser removido de águas contaminadas ( por exemplo, por arrastamento por ar ). Estas células hospedeiras de microrganismos construídas geneticamente com genes de tolueno-monooxigenase de PmKRI foram completamente descritas no pedido de patente de invenção norte-americana NS. de série 177 631 que aqui se inclui na totalidade como referência.

Deve entender-se também que os produtos enzimáticos dos genes de tolueno-monooxigenase podem ser utilizados para degradar o TCE, em vez de se utilizar células hospedeiras de microrganismos que contêm plasmídeos recombinantes com genes de tolueno-monooxigenase para degradar o TCE. Os produtos enzimáticos podem ser aplicados directamente aos locais com resíduos químicos de TCE.

A presente invenção proporciona um processo que pode ser utilizado para degradar o TCE em quaisquer locais em que este constitua um contaminante ou poluente. Portanto, com o processo, torna-se possível limpar e degradar o TCE em locais com resíduos ι

«St químicos de TCE situados na água ou no solo.

Os exemplos seguintes são apresentados a título ilustrativo da presente invenção, não tendo carácter limitativo.

EXEMPLO 1

Estirpes bacterianas e desenvolvimento

As estirpes bacterianas indicadas a seguir estão descritas no pedido de patente de invenção norte-americana N9. de série 177 631, que aqui se inclui como referência. Em particular, a construção e as características das células hospedeiras de microrganismos que incluem plasmídeos, vectores, genes e segmentos de genes estão descritos no referido pedido de patente de invenção. As seguintes estirpes bacterianas foram desenvolvidas durante uma noite a 30° C em meio PA5 (Chakabarty et al., Proc. Natl. Acad. Scl. U.S.A. 70, 1973, 1137-1140) enriquecido com os seguintes substratos de desenvolvimento e indutores: Pm«R1, tolueno ( fornecido no estado vapor) para o desenvolvimento e a indução de enzimas degradadoras do tolueno ou glucose a 0,2% para desenvolvimento; F1 de Pseudomonas pu t i da (PpF1 ) , tolueno (fornecido no estado de vapor) para desenvolvimento e indução de enzimas degradadoras de tolueno ou glucose a 0,2% para desenvolvimento; KT2440 de Pseudomonas putida (KT2440), L-glutamato a 0,2% para desenvolvimento; KT2440 de Pseudomonas putida que contém o plasmídeo pND50 (KT2440/pND50) , p-cresol 2,5 mM (diluído ί ’

1000 vezes a partir de uma solução de reserva concentrada de dimetilformamida) para desenvolvimento e indução de enzimas degradadoras do p-cresol; KT2440 de Pseudomonas pu t i da que contêm o plasmídeo pAUT 1 (KT2440/pAUT1) , tolueno (fornecido no estado vapor) para desenvolvimento e indução de enzimas degradadoras de tolueno; Y4001 de Pseudomonas mendocina (PmY4001), p-cresol

2,5 mM para desenvolvimento e indução de enzimas degradadoras de p-cresol; a estirpe HB101 de E.. coli que contém os plasmídeos recombinantes pKY277, pMY402 ou o vector do plasmídeo pMMB66EH (HB101/pKY277, HB101/pMY402, HB101/pMMB66EH, respectivamente), L-glutamato a 0,2% ou glucose a 0,2%, ácidos casamínicos a 0,2% e 2yxg/ ml de vitamina B1 para desenvolvimento, 250)Ug/ ml de ampicilina para manutenção do plasmídeo, e isopropi1-(¼-D-1ioga1actosido 1 mM (IPTG) para indução da síntese de tolueno-monooxigenase; KT2440 contendo plasmídeo recombinante pMY402 (KT2440/ pMY402), L-glutamato a 0,2% para desenvolvimento, 1 mg/ml de ampicilina para manutenção de plasmídeo e IPTG 5 mM para indução da síntese de tolueno-monooxigenase; EM5 de £. coli contendo o plasmídeo recombinante pKY287 ou o vector do plasmídeo pCEM1146 (EM5/pKY287 e FM5/pCEM1146, respectivamente), glucose a 0,2 % e extracto de levedura 0,05% para desenvolvimento, 50yxg/m 1 de canamicina para manutenção do plasmídeo e para EM5/pKY287 um aumento da temperatura de cultura para 42° C durante duas horas, seguido de retorno á temperatura de 30°C durante duas horas para indução da síntese de tolueno-monooxigenase. Desenvolveram-se as células até pelo menos, uma igual a 0,5, o que corresg ponde a cerca de 5 x 10 CFU/ml.

Além das estirpes indicadas antes, desenvolveram-se e ensaiaram-se em relação à capacidade de degradação do TCE várias estirpes isoladas designadas E1, E2, E4, E5, E7 e E9 que utilizam etilbenzeno ou tolueno como fonte de carbono para o desenvolvimento. As estirpes que utilizam o etilbenzeno foram isoladas do modo indicado a seguir. Obtiveram-se sete amostras (numeradas de 1 a 7) em LaBrea Tarpit e nove amostras (numeradas de 1 a 9) em Thousand Oaks Sewage Treatment Plant. Inoculou-se uma alíquota de 1 ml de cada amostra em 50 ml de meio PAS suplementado com etilbenzeno fornecido sob a forma de vapor a partir de 0,2 ml de etilbenzeno e desenvolveram-se as culturas a 25°C durante 5 dias. As culturas com os números 1, 4, 5 _e 9 Thousand Oaks

Sewage Treatment Plant e as culturas com os números 2 e 7 de LaBrea Tarpit foram desenvolvidas até à saturação (não se obteve desenvolvimento a partir das outras culturas). Tomou-se uma alíquota de 1 ml das culturas 1, 2, 4, 5, 7, e 9 e inoculou-se cada uma delas com 50 ml de meio PAS enriquecido com etilbenzeno fornecido sob a forma de vapor como se descreveu antes. Desenvolveram-se estas culturas de 50 ml durante uma noite a 25°C. Espalhou-se uma amostra de cada cultura sobre uma placa de PAS-etilbenzeno duas vezes para colónias individuais. Verificou-se também que estes isolados bacterianos naturais que utilizam o etilbenzeno se desenvolvem em tolueno e desenv01veram-se durante {

uma noite a 30°C em meio PAS enriquecido com os seguintes substratos de desenvolvimento e indutores: L-glutamato a 0,2% para desenvolvimento, tolueno 1 mM para indução das enzimas degradadoras de tolueno. Desenνo 1veram-se as células do modo descrito para as outras estirpes indicadas antes, até se obter uma DO^^g igual a, pelo menos, 0,5.

EXEMPLO 2

Ensaio de Radioactivida de para a degradação do TCE

Este exemplo descreve um ensaio de ra dioactividade em que se determina o aparecimento de metabolitos não voláteis do TCE.

As estirpes bacterianas utilizadas neste ensaio foram desenvolvidas tal como se descreve no Exemplo 1. Se necessário, diluem-se as células com meio PAS até uma DO^g de 0,5 para o ensaio. A ml de suspensão celular num frasco de soro de 50 ml juntou-se ,14

TCE (1.2- C, 72mCi por mmole, New England Nuclear, Boston, Massachusetts) até se obter uma concentração final de 5 yw,M. A solu14 ção de C-TCE foi preparada misturando TCE radioactivo e não radioactivo para se obter uma solução 5 mM em dimetilformamida a cerca de 1 x 10^ contagens (counts) por minuto e poryltl . Juntou-se 4yttl de solução a cada 4 ml de suspensão celular, rolhou-se o frasco de soro com uma rolha de borracha revestida de teflon e uma tampa metálica de bordo revirado, agitou-se e incubou-se, sacudindo, à temperatura de 30°C. No instante zero e depois com intervalos de 30 minutos recolheu-se cerca de 100JiA de suspensão celular utilizando uma agulha e uma seringa e espalharam-se 20yzl desta amostra numa placa de cromatografia em camada fina sobre gel de sílica de Whatman (Whatman, Clifton, New Jersey), seca ao ar durante 15 minutos e efectuou-se a contagem num contador de cintilação Beckman LS-100 (Beckman Instruments, Inc., Paio Alto, Califórnia) utilizando um fluído de cintilação líquida Biofluor (New England Nuclear). Para o Quadro 1, os dados obtidos após secagem ao ar foram convertidos em nanomoles de TCE metabolizado em produto não volátil, utilizando 200 contagens por minuto por picomole como actividade específica de entrada de ¹⁴C-TCE.

QUADRO 1

Degradação do TCE

Nanomoles de ^C-TCE convertido em produto não volátil em 2 horas

Estirpe

Indutor

PpE1	nenhum	0,4
	tolueno	1,1-2,0
PmKR1	nenhum	0,4
	tolueno	5,1-6,5
PmY4001	p-cresol	0,4
Ρ ρ Y 2 1 0 1	nenhum	0,4
	tolueno	3,8-5,1
PpY21 19	p-cresol	0,4
PpY21 18	nenhum	0,4
	IPTG	0,7-1,1

Nanomomas de ^C-TCE convertido em produto não vo-

Estirpe	Indutor	látil em 2 horas
HB101/pKY277	nenhum	0,4
	IPTG	1,6
HB101/pMY402	nenhum	0,3, 0,5 após 6 horas
	IPTG	3,3-3,5, 4,7 após 6

ho r as

No Quadro 1 apresentam-se os resultados da extensão da 1 4 converção de C-TCE em produto não volátil durante 2 horas em função do indutor presente durante o desenvolvimento de uma noite. Nestas experiências, cerca de 0,4 nanomoles de ^C-TCE ficaram por volatilizar; Isto representa uma base de cerca de 2% do ^C-TCE de entrada.

EXEMPLO 3

Ensaio de cromatografia em fase gasosa para a degradação do TCE.

Este exemplo descreve um ensaio de cromatografia em fase gasosa em que se determina o desaparecimento do TCE volátil. As estirpes bacterianas utilizadas neste ensaio foram desenvolvidas como se descreveu no Exemplo 1. Sempre que necessário, diluiram-se as culturas de uma noite até uma DO^^g de 0,5 em meio PAS para o ensaio e juntou-se 4 ml de cultura celular a frascos de soro. Diluiu-se TCE (Aldrich, Mi 1 waukee ,Wisconsin, do grau espectrofométrico) em N , N '-dimeti1formamida (DMF) (Aldrich, grau espectro30

{ fotométrico) 'as concentrações de 10 mM ou 20 mM e juntou-se 4jA 'a suspensão celular para se obter uma concentração final de TCE de 10 y/íM (1,3 ppm) (Figura 1) ou 20ytM (2,6 ppm) (Figura 2). Rolharam-se os frascos, agitou-se e recolheu-se 10 ^/ól de fase gasosa utilizando uma seringa para gás nos tempos indicados nas figuras. As amostras de fase gasosa foram analisadas num cromatógrafo de fase gasosa Hewlett-Packard 5890A equipado com uma coluna de fenilmetil-silicone a 5% de 25 metors (Hewlett-Packard, Paio Alto, Califórnia) e um detector de captura electrónica de

6^Ni. As temperaturas do injector, da estufa e do detector foram, respectivamente, de 120°C, 100°C e 300°C. 0 gás vector era hélio e utilizou-se como gás de adição uma mistura de 95% de árgon e 5% de metano. Calcularam-se as áreas dos máximos com auxílio de um integrador 3392A da Hewlett-Packard. Os dados apresentam-se nas figuras 1, 2 e 3 como a percentagem de TCE que resta ao fim de vários tempos após a adição à suspensão celular. A quajn tidade de TCE presente no instante zero foi considerada como 100%

A figura 1 representa a velocidade de degradação de TCE a 10 Já M (1,3 ppm) de TCE para PmKRI, KT2440/pAUT1 e PpF1. A degradação é rápida 1 a 2 horas depois da adição do TCE e torna-se mais lenta a partir dessa altura. PmKRI apresenta a actividade mais elevada das três estirpes ensaiadas.

A figura 2 representa o estímulo da degradação células PmKRI pré-desenvo 1vidas em meio PAS contendo o tolueno está presente no instante da adição do TCE do TCE por tolueno quando

PmKRI deverá

degradar mais de 9 0?ó do TCE inicialmente presente a 20JLl·] (2,6 ppm) quando o tolueno está presente sob a forma de vapor; só aproximadamente 50% do TCE é degradado por PmKR1 quando o tolueno não está presente no instante da adição de TCE.

A figra 3 representa a velocidade de degradação do TCE para 20^UzM (2,6 ppm) por células HB101/pMY402 e células EM5/pKY287. Mais de 95?ó do TCE é degradado ao fim de 4 horas.

EXEMPLO 4

Degradação do TCE por isolados bacterianos naturais

As estirpes que utilizam etilbenzeno (e tolueno) isoladas e desenvolvidas como se descreveu no Exemplo 1 foram ensaiadas em relação á sua capacidade para degradar TCE. Ensaiaram-se concentrações de TCE por cromatografia em fase gasosa, de acordo com a técnica descrita no Exemplo 3. Adicionou-se TCE a 20yx,M (2,6 ppm). Os resultados apresentam-se no Quadro 2. Numa comparação com células PmKR1 do tipo selvagem, a percentagem de TCE remanescente após um período de degradação de 18 horas foi 6 a 14 vezes maior que para as células PmKR1 do tipo selvagem, indicando que estas estirpes eram substancialmente menos eficazes que as células PmKR1 do tipo selvagem quanto à sua capacidade para degradar o TCE .

ί

X__

Quadro 2

Degradação de TCE por isolados bacterianos naturais

	% de TCE remanescente
Estirpe	ao fim de 18 horas
PmKR1	4
PmY4001	84
PpE1	49
E1	48
E2	39
E4	56
E5	Não ensaiado
E7	38
E9	24

Ensaiaram-se concentrações de TCE por cromatografia em fase gasosa de acordo com o exemplo 3. Adicionou-se TCE a uma concentração de 20yUM (2,6 ppm). Nesta experiência, desenvolveram-se células E1, E2, E4, E5, E7 e E9 em tolueno como fonte de carbono embora tal como se descreve no Exemplo 1, estas células fossem originalmente escolhidas para desenvolvimento em etilbenzeno.

EXEMPLO 5

Efeito das concentrações de TCE mais elevadas

Este exemplo descreve a degradação de concentrações cres33

centes de TCE por células recombinantes, de acordo com a presente invenção. Neste ensaio desenvolveram-se células bacterianas tal como se descreve no Exemplo 1, com a diferença de se utilizar extracto de levedura a 0,5% (Difco, Detroit, Michigan) em vez de ácidos casamínicos e vitamina Bl no meio de desenvolvimento.

Efectuou-se o ensaio de cromatografia em fase gasosa para a degradação do TCE, tal como se descreveu no Exemplo 3. A figura 4 representa o desaparecimento do TCE adicionado a células a concentrações variáveis, de uma fase gasosa devido ao metabolismo do TCE com obtenção de produto não volátil, em função do tempo, por células HB101 contendo o plasmideo recombinante pMY402 {vector do plasmideo pMMB66EH com genes de tolueno-monooxigenase de PmXRl). Os círculos em branco representam o metabolismo de TCE 20 yaM (2,6 ppm); os quadrados a cheio representam o metabolismo do TCE 50yjM (6,5 ppm); os triângulos em branco representam o metabolismo do TCE 125 jM (6 ppm); os triângulos a cheio representam o metabolismo do TCE 310 ^iM (41 ppm); e os quadrados em branco representam o metabolismo do TCE 780 ^iM (100 ppm). Efectuaram-se controlos para cada concentração de TCE utilizando células HB101 que continham o plasmideo pMY402, na ausência de indutor IPTG ou células HB101 contendo o vector do plasmideo PMMB66EH

A figura 4 mostra que as células HB101 que contém o plasmídeo pMY402 induzido com IPTG metabolizam quase 100% do TCE em concentrações de TCE até cerca de 20 ppm em 6 horas ou menos.

Para 48 ppm de TCE, 75% é metabolizado em 8 horas. Além disso, a figura 4 mostra que se verificam velocidades crescentes da degradação do TCE quando aumenta a concentração de TCE.

EXEMPLO 6

Cinética da degradação do TCE

Com o objectivo de estudar a cinética da degradação do TCE pelos produtos genéticos de to 1ueno-monooxigenase de PmR1, desenvolveram-se células PmKR1 e PmY4001 de acordo com a técnica descrita no Exemplo 1. Além disso, para estas experiências desenvolveram-se do modo indicado a seguir células EM5/pKY287 e células EM5/pCEM1146: juntou-se um inoculo de células a um caldo L e incubou-se a cultura a 30°C até as células atingirem uma DO^^q de 0,5, depois do que se elevou a temperatura para 42°C durante

1,5 horas, para permitir a indução enzimática e a síntese, e depois baixou-se a temperatura para 30°C durante 4 a 6 horas, para continuar o desenvolvimento. Centrifugaram-se as culturas celulares e voltou-se a suspender em meio PAS ou meio PAS contendo glucose a 0,2 .

Com vista à determinação da cinética da degradação do TCE díluiram-se as culturas celulares com KPO^ 0,1 M, pH 7,5 até uma θ^550 θ indicada no Quadro 3, a seguir. Conservou-se uma parte das células diluídas para ensaios proteicos do modo indicado a seguir. Ensaiou-se a degradação do TCE por cromatografia em fase gasosa substancialmente do modo indicado no Exemplo 3, com a diferença de as reacções celulares serem efectuadas em volumes de 10 ml ( em vez de 4 ml) nos frascos de soro, e de se adicionarem 5 a 101 de TCE em dimetilformamida às concentrações finais indicadas no Quadro 3 a seguir.

Incubaram-se as reações celulares com agitação à temperatura de 30°C e, no instante zero e a vários tempos depois da adição do TCE, retiraram-se amostras de 10^1 de fase gasosa e analisou-se a concentração de TCE do modo indicado no Exemplo 3.

As velocidades iniciais da degradação do TCE foram calculadas a partir da quantidade de TCE degradado durante os 20 a 30 minutos iniciais da reação e eχprimiram-se como nanomoles por minuto por mg de proteína no Quadro 3 a seguir. A maioria das experiências cinéticas foram efectuadas utilizando células EM5/pKY287, no entanto efectuaram-se várias experiências utilizando células PmKRI, com o objectivo de comparar as velocidades quando se utilizavam células recombinantes com as velocidades quando se utilizavam células do tipo selvagem. Utilizaram-se células EM5/pCEM1146 como células de controlo para células EM5/pKY287, e utilizaram-se células PmY4001 como células de controlo para as células PmKRI, com o objectivo de determinar quaisquer perdas de TCE devido a derrame do frasco ou devidas à adsorção nas células. As experiências mostraram que as perdas nos frascos de controlo eram usualmente inferiores a 5% após 1 hora de incubação a 30°C.

A proteína celular total pode ser ensaiada por uma variedade de técnicas que incluem o método de Bradford, Anal. Biochem.,

2, 1 976, 248-254, disponível no comércio com a designação de Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Richmond, Califórnia, NS. de catálogo 500-0006). Para efectuar a lise das células e expor a proteína celular para a reacção na técnica do ensaio da proteína, juntou-se hidróxido de sódio à suspensão celular até uma concentração final de 0,1 N, depois do que se incubou a 100° C durante 30 minutos antes da técnica de ensaio. Utilizou-se albumina de plasma de bovino, tratada com hidróxido de sódio e aquecida do modo descrito, como um padrão de proteína na técnica de ensaio.

As velocidades de degradação de TCE pelas células EM5/pKY287 para várias densidades celulares (ϋΟ^θ de 0,05 a 1,00) e para várias concentrações de TCE (1 a 400,13 a 5,2 ppm) indicam-se no Quadro 3.

Quadro 3

Densidade celular inicial

Cinética da Degradação do TCE por células EM5/pKY287 (nmo1es/min/mg proteína)

Concentração de TCE ( R M)

2,5

5,0

10,0

20,0

40,0

0,05 0,10 0,20 0,50 1 ,00

0,4 0,5

1,5

1,3

0,9

1,2 1,0 1,4 1 ,4 0,2

0,1

Em experiências com células PmKR1 que foram induzidas com tolueno, as velocidades de degradação do TCE para uma DO^q de 0,50 e para as concentrações de TCE de 5,0^w-M e 20,0^M foram 1,3 e 2,4 nmo1es/min/mg de proteína, respectivamente. Para uma DO^ç-g de 1,0 e a uma concentração de TCE de 5yiM , a velocidade de degradação do TCE pelas células PmKR1 foi de 2,7 nmoles/min/mg de proteína. Estes resultados indicam que a velocidade de degradação do TCE por células Pm«R1 de tipo selvagem é pelo menos comparável e é em geral ligeiramente maior que a velocidade das células recombinantes . Os resultados apresentados no Quadro 3 também demonstram que as células recombinantes EM5/pKY287 podem efectiυamente degradar 0 TCE para uma densidade celular baixa (DO^ç-q de 0,05 a 0,10) e a concentrações de TCE baixas ( 1 ^M a 2,5yíM). Portanto, mesmo para baixas densidades celulares, estas células podem ser utilizadas num processo eficaz para a degradação do TCE.

EXEMPLO 7

4

Metabolismo do C-TCE

Com 0 objectivo de estudar 0 metabolismo do ^C-TCE pelos produtos genéticos de tolueno-monooxigenase de PmKR1, desenvolveram-se células PmKR1, células PmY4001 e células HB101 que continham pMY402, do modo indicado no Exemplo 1 e incubaram-se tal como se descreve no parágrafo 1 do Exemplo 2. Efectuou-se a incubação durante 16 a 18 horas a 30° C. A conversão do ^C-TCE

1414 14 em COg, C em massa celular e C em meio de desenvolvimento

ί foi determinada do modo descrito por Nelson et al., Appl. Environ. Micro. 53, 1 987, 949-954 e Spain e Nishino, Appl. Environ. Micro.

, 1 987, 1010-101 9.

Pouco depois do período de incubação, acidificou-se o meio com 100 Π/l de ácido sulfúrico 2N. Purgou-se o

00^ da fase aquosa introduzindo uma linha de ar no frasco e fazendo borbulhar o ar durante 1 a 2 horas, ao mesmo tempo que o ar libertado que continha o passava através de outra linha para um tubo que continha 5 ml de hidróxido de sódio 1N. Determinou-se a radioactividade em 0,5 ml de solução de hidróxido de sódio e calculou-se 1 4 a percentagem de C sob a forma de anidrido carbonico numa amostra de 5 ml. Após a remoção do ^00^ do modo descrito antes, recolheu-se uma alíquota de 1 ml de suspensão celular e determinou-se a radioactivida de da suspensão celular. A suspensão restante do meio e células foi removida do frasco centrifugada até à obtenção de um aglomerado de células e passou-se o sobrenadante através de um filtro de 0, ²Z . Determinou-se a radioactividade de uma alíquota de 50^Lcl do filtrado e calculou-se a percentagem 1 4 de C no meio. A diferença entre a radioactividade na suspensão celular e no filtrado foi tomada como a radioactivida de presente 1 4 na massa celular. Em alternativa, o C na massa celular poderia ser determinado directamente efectuando uma nova suspensão do agregado celular e determinando uma alíquota das células em suspensão. Os resultados de uma experiência representativa utilizando células PmKR1, PmY4001 e HB101/pMY402 apresentam-se no

9

Quadro 4 .

QUADRO 4

4

Metabolismo de C-TCE

Estirpe o , 1 4 „ o, 1 4 „ % Ccomo % Cria

C0„ massa celular %¹⁴c no Meio

KR-1 de P. mendocina

Y4001 de P. mendocina

HB101/pMY402 (+IPTG)

HB101/pMY402 (-IPTG)

Noutras experiências, desenvolveram-se células de PmKR1,

PmY4001, EM5/pKY287 e EM5/pCEM1146 do modo descrito no Exemplo e depois incubaram-se com ^C-TCE. Efectuou-se a reacção com 1 4 o C-TCE do modo descrito antes com a diferença de: (i) purgou1 4.

-se o ção de hidróxido de sódio 1 N; e (ii) adicionou-se 1,2 ml de

CO^ da fase aquosa e recolheu-se em 20 ml de uma solusolução de cloreto de bário a 5 ml da solução de 20 ml de hidró1 4 xido de sodio para precipitar CO2· Analisou-se 0 precipitado resultante em relação ao numa alíquota do sobrenadante. Os resultados apresentam-se no Quadro 5. Quase todo o presente na solução de hidróxido de sódio 1 N foi precipitado pelo cloreto de bário, confirmando que o presente estava sob a forma

de ¹ ^CO^·

QUADRO 5

4

Metabolismo de C-TCE

Estirpe	oJ4 /0 L como C0_Q	oJ4_c '° ^{L ra} 11 massa celular	o/1 4 p .0 L Meio
KR-1 de P.mendocina	32	31	31
Y4001 de P. mendocina	< 1	1	2
EM5/pKY287	45	1 8	39
FM5/pCEM1146	< 1	1	2

Com vista a analisar ainda os metabolitos que estavam presentes no meio celular tratou-se cada fracção do meio celular indicada no Quadro 5 do modo seguinte. Juntou-se três gotas de hidróxido de potássio a 45% a 10 ml de meio celular que continha metabolitos solúveis em águas marcadas com , para se levar o pH da solução a 11 a 12. Liofi1izou-se esta solução durante a 18 horas até um volume final de 0,4 a 0,6 ml com uma recu1 4 peração de 60 a 70% do material marcado com C.

material concentrado foi analisado por crornatografia líquida de alta pressão (HPLC), utilizando uma coluna de exclusão iónica Aminex (Bio-Rad) e utilizando como eluente H^SO^

0,01 N. Recolheram-se fracções de 0,6 ml e determiηou-se o ^C em 0,2 ml de cada fracção, tal como se representa nas Figuras 5 e 6.

- 41 Efectuou-se a identificação dos produtos marcados com C comparando os tempos de eluição de HPLC com os tempos de eluição dos padrões não marcados, tal como se representa nas Figuras 5 e 6. Os padrões utilizados foram: o ácido monocloroacético , áci do dic1 oroacético , ácido glioxílico e o ácido fórmico.

No Quadro 6 apresenta-se um resumo dos produtos metabóli1 4 cos marcados com C provenientes da degradação do TCE por celu las PmKR1 (Figura 5) e células EM5/pKY287 (Figura 6).

QUADRO 6

Análise do meio celular em relação aos produtos da degradação do TCE

Composto	1 4 % C no Meio Celular
PmKR1	FM5/pKY287
Acido Dic1oroacético	9	5
Acido Glioxílico	64	71
Acido Fórmico	1 6	1 5
Composto não identificado	1 1	1 0
Do ^c-TCE total adicionado	às células P m K R 1 ou EM5/pKY287 (d
notar que aproximadamente 30	a 40%	1 4 do C total foi detectado
na fracção do meio celular),	cerca	de 3 a 5% do ¹⁴C total foi

ident i ficado sob a roacético. A parte forma de restante um composto clorado, o ácido da r adi oac t i v i da de do ^C foi diclorecu4 2-

f ί ' perada sob a forma de COg (- 30 a 40%), constituintes celulares inócuos na massa celular (- 18 a 35%) ou componentes solúveis em água predominantemente não clorados.

EXEMPLO 8

Descloração do TCE

Este exemplo descreve um ensaio em que se determina a libertação de iões cloreto do TCE por células PmKRI ou células hospedeiras de microrganismos que contêm um plasmideo recombinante com genes de tolueno-monooxigenase de PmKRI.

As células de PmKRI e EM5/pKY287 foram desenvolvidas do modo descrito no Exemplo 1. Depois do desenvolvimento celular centrifugaram-se as culturas bacterianas a 5 000 rpm durante 5 minutos, rejeitou-se o meio de desenvolvimento e voltou-se a efectuar uma suspensão do agregado celular ou das células agregadas em 15 ml de fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,0, centrifugou-se de novo e efectuou-se nova suspensão em 15 ml em fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,0. Diluiram-se as células no mesmo tampão até uma DO^^g igual a 0,8 e um volume final de 10 ml. A suspensão de células PmKRI juntou-se tolueno até uma concentração final de 1 mM. A suspensão de células EM5/pKY287 juntou-se glucose até uma concentração final de 0,2% e canamicina até uma con centração final de 50y/jg/ml. Rolharam-se os frascos e juntou-se TCE por meio de uma seringa até uma concentração final de 40yU.M (5,2 ppm). Efectuou-se a incubação a 30°C durante 5 a 18 horas

3 e determinou-se a extensão da degradação do TCE por meio de cromatografia em fase gasosa.

Após a degradação do TCE centrifugaram-se as células durante 5 minutos e passaram-se os sobrenadantes através de um filtro de 0,2Ji . Determinaram-se as concentrações de ião cloreto nos sobrenadantes por meio de um medidor iónico EA 920 Orion, utilizando um eléctrodo de cloreto do modelo 94-17B e um electrodo de referência do modelo 90-02, ambos da Orion. Determinou-se uma curva de calibração com cloreto de potássio 20uM a 200 aM em fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,0, adicionando alíquotas de cloreto de potássio a uma amostra de controlo de fundo (células PmKR1 ou EM5/pKY287 em K P 0 0,1 M sem qualquer adição de TCE). As concentrações de ião cloreto em amostras que continham TCE foram determinadas a partir desta curva.

Os resultados mostraram que se libertavam 2,5 moles de ião cloreto por mole de TCE utilizando células PmKRI induzidas e se libertavam 2,7 moles de ião cloreto por mole de TCE utilizando células EM5 induzidas que continham pKY287.

EXEMPLO 9

Capacidade de degradação do TCE e actividade de to 1ueno-monooxigenase

A. Ensaio de to 1ueno-monooxigena se para densidades celulares elevadas e correlação com a degradação do TCE.

4Α

ί

Para estes ensaios, desenvolveram-se células em meio PAS que continha glutamato a 0,4% ou em caldo L até à saturação. Contudo, as células FM5 foram desenvolvidas do modo descrito no Exemplo 6 com a diferença de que se induziram as células a 42°C durante 3 horas depois do que se baixou a temperatura para 30°C durante 2 horas. Efectuou-se nova suspensão das células num volume apropriado do mesmo meio até uma D0,._n de 3,0. Utilizou-se uma aliquota de células para determinação da proteína celular total do modo descrito no Exemplo 6. Misturou-se uma aliquota de 0,5 ml de células com 4 itmoles de p-cresol em 10 u-1 e 15 ήπιοι yrr

I Jí-Í

les de	tolueno	radioactivo	(tolueno-	anel- C,	Sigma Chemical	Co .
56,3 mCi/nmole	) em 5^tl e	incubou-se	a mistura	à temperatura	am-
b i e n t e	durante	20 minutos,	agi tando	de vez em	quando. Depois	da

incubação, espalhou-se 20da mistura numa pequena parte de uma placa de cromatografia em camada fina e secou-se a placa ao ar durante 20 minutos. Determinou-se a ra dioactivida de não volátil remanescente por meio de um contador de cintilação em fase líquida e utilizou-se este valor para calcular a quantidade de produto da degradação de tolueno na placa e a actividade específica do tolueno-monooxigenase .

No Quadro 7 apresentam-se os resultados do ensaio descrito antes para uma densidade celular elevada e para uma variedade de estirpes que foram também ensaiadas em relação à capacidade de degradação do TCE. No Quadro 7 apresenta-se também a correlação da capacidade de degradação do TCE com a actividade do tolueno

Α 5

-monοοχigeηase (TMO). Em particular, o Quadro 7 mostra que em condições elevadas de densidade celular as células HB1O1 que contêm pMYA02 e as células FM 5 que contêm pKY287 apresentam níveis de actividade enzimática de tolueno-monooxigenase de PmKR1 aproximadamente 2 a A vezes mais elevadas do que as células PmKR1 do tipo selvagem. Estas duas mesmas células hospedeiras construídas geneticamente apresentam capacidades elevadas para degradar o TCE tal como é evidenciado por uma velocidade de degradação mantida durante mais tempo e uma maior quantidade de degradação para concentrações mais altas de TCE em relação às células PmKR1 de tipo selvagem. Isto é ilustrado nas Figuras 7 e 8 para as células HB1O1 que contêm pMYA02 induzido com IPTG (círculos em branco) em comparação com células PmKR1 do tipo selvagem (triângulos em branco) e indicados também na Figura 8 para as células EM5/pKY287 (quadrados a cheio). A actividade enzimática aumentada nas condições descritas antes correlaciona-se, portanto, com a capacidade aumentada para degradar o TCE, tal como se ilustra na Figura 8 e no Quadro 7.

/

QUADRO 7

Degradação do TCE e actividade de To 1ueno-monooxigenase para densidades celulares elevadas unidades de Degra-

PLASMIDEO	INDUTOR	HOSPEDEIRO	actividade de TMO *	Vector	tcE θ °
pAUTI	Tolueno	PmKR1	0,130	-	+
pAUTI	Nenhum	PmKR1	0,010	-	-
pMY4O2	Nenhum	E. coli HB1O1	0,005	pMMB66EH	-
pMY402	IPTG	E. coli	0,200	pMMB66EH	-h
		HB101
pKY287	calor	E. coli	0,500	pCFM1146	+
		FM5
pCEM1146	calor	E. coli	0,005	-	-
		EM5
pMMB66EH	IPTG	E. coli	0,005	-	-
		HB101
	* Uma	unidade de actividade de	TMO

exprime-se como 1 nmole de tolueno marcado com I 4

C convertido em produto não volátil por minuto, por miligrama de proteína celular total

Além dos plasmideos indicados no Quadro 7, que contêm genes de to 1ueη o-moηooxigenase de PmKR1, são apropriados para a degradação do TCE outros plasmideos que contêm estes genes, incluindo pKY277, pKY280, pKY281, pKY282, pMY401, pMY404 tal como

Ν9 .

se descreve no pedido de patente de invenção norte-americana de série 177 631, (depositado em 5 de Abril de 1988 e aqui incorporado como referência).

B. Ensaio do tolueno-monooxigenase para densidades celulares mais baixas e correlação com a degradação do TCE.

Desenvolveram-se células do modo descrito no Exemplo 6.

Centrifugaram-se as culturas celulares, efectuou-se nova suspensão em meio PAS que continha glucose a 0,2% até uma DG^g de 0,5. Efectuou-se o ensaio de tolueno-monooxigenase do modo descrito antes na parte A, com a diferença de o tempo de incubação com 1 4

C-tolueno ser de 5 minutos e não de 20 minutos.

No Quadro 8 resumem-se os resultados do ensaio descrito antes para densidades celulares mais baixas para as estirpes que foram também ensaiadas em relação á capacidade de degradação do TCE. 0 Quadro 8 indica também a correlação da capacidade de degradação do TCE com a actividade de tolueno-monooxigenase (TMO). Em contraste com os resultados obtidos para densidades celulares mais elevadas tal como se mostra no Quadro 7, o Quadro 8 mostra que em condições de densidade celular mais baixa, as células HB101 que contêm pMY402 e as células FM5 que contêm p«Y287 apresentam níveis de actividade enzimática de tolueno-monooxigenase de PmKR1 menores do que as células PmKR1 do tipo selvagem.

/

-/

QUADRO 8

Degradação do TCE e Actividade de

To 1ueηo-monooxigenase a densidades celulares baixas

PLASMIDEO	INDUTOR	HOSPEDEIRO	Unidade actividade * de TMO	Vector	Degradação de TCE
pAUTI	Tolueno	PmKR1	8.35		+
pAUTI	Nenhum	PmKR1	0.08	-	-
pMY402	Nenhum	E . coli HB1 01	0.01	pMMB66EH	-
pMY402	IPTG	E . coli HB101	0.72	pMMB66EH	+
pKY287	calor	E . coli FM 5	1 .29	pCEM1146
pKY287	Nenhum	E . coli EM5	0.12	pCEM1146	-
pCEM1146	Calor	E . coli EM5	0.05	-	-
pMMB66EH	IPTG	E . coli HB 1 01	<0.01	—	-
* Uma	unidade de	actividade	de TMO exprime-se	como

nmole de tolueno marcado com C convertida em produto não volátil por minuto por miligrama de proteína celular total.

Construindo geneticamente os genes de to 1ueno-monooxige nase de PmKR1 de modo a colocá-los sob o controlo de vários /

promotores, conseguiram-se níveis crescentes de expressão dos produtos genéticos de to 1ueno-monooxigenase de PmKRl com um concomitante aumento na capacidade de degradação do TCE.

Nas condições em que se incubaram as células PmKRl com, pelo menos, um excesso de 40 vezes de tolueno em relação ao TCE, observou-se um lapso de tempo de várias horas antes de as células PmKR1 começarem a degradar o TCE (Figura 7, triângulos a branco). Isto deve-se ao facto de o tolueno e o TCE serem co-substractos para a tolueno-monooxigenase de PmKR1 e ambos competirem com as enzimas de to 1ueno-monooxigenase de PmKRl disponíveis. Deste modo, quando o tolueno e o TCE estão simultaneamente presentes e o tolueno está presente em concentrações em excesso em relação ao TCE, as células PmKRl iniciam a degradação do TCE somente após a concentração de tolueno ser consideravelmente reduzida. Este mesmo lapso de tempo não se observou quando as células PmKRl foram primeiro induzidas com tolueno e em seguida se eliminou o tolueno antes da adição do TCE (Figura 2). Efectuando a clonagem dos genes de to 1ueηo-monooxigenase de PmKRl e colocando-os sob o controlo dos promotores não induzidos por tolueno, eliminou-se o problema do co-substrato descrito antes.

E de esperar que muitos outros sistemas promotores para além dos promotores induzíveis por tolueno, induzíveis por IPTG e induzíveis pelo calor descritos aqui sejam apropriados para

aumentar a expressão de tolueno-monooxigenase e portanto aumentar a degradação do TCE. Além disso, espera-se que muitos outros tipos de vectores plasmídeos e células hospedeiras de microrganismos sejam apropriados para a expressão de tolueno-monooxigenase de PmKRI e a degradação do TCE. Portanto, a presente invenção não deverá ser limitada pelas realizações exemplificativas descritas antes. A invenção será definida pelas reivindicações que se apresentam a seguir.

Claims

1.- Processo para a degradação microbiana de tricloroetileno, caracterizado pelo facto de se tratar tricloroetileno com células KR-1 de Pseudomonas mendocina previamente tratadas com um indutor de genes de tolueno monooxigenase.

2.- Processo para a degradação microbiana de tricloroetileno, caracterizado pelo facto de se tratar tricloroetileno com células Y2101 de Pseudomonas putida previamente tratadas com um indutor de genes de tolueno monooxigenase.

3.- Processo para a degradação microbiana de tricloroetileno, caracterizado pelo facto de se tratar tricloroetileno com uma célula hospedeira de um microrganismo que contém um plasmideo recombinante, em que o plasmideo recombinante contém genes de tolueno monooxigenase de células KR-1 de Pseudomonas mendocina e a célula hospedeira do microrganismo que contém o plasmideo recombinante foi previamente tratada ccm um indutor de genes de tolueno monooxigenase.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o plasmideo recombinante compreender pKY277, pKY28O, pKY281 ou pKY282 e de o indutor ser o tolueno.

5. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o plasmideo recombinante ser pMY4O2, pMY4O5, pMY4Ol ou pMY4O4 e de o indutor ser isopropil- p -D-tiogalactopira nosido.

6. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o plasmideo recombinante ser pKY287 e de o indutor ser o calor.

7. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a célula hospedeira do microrganismo ser JM1O9, JM83, HB1O1 ou FM5 de E. coli.

8. - Processo para a degradação microbiana de resíduos químicos de tricloroetileno, caracterizado pelo facto de se aplicar num local contaminado por tricloroetileno uma célula hospedeira

-53( ~ de um microrganismo que contém um plasmideo recombinante, em que o plasmideo recombinante contém genes de tolueno monooxigenase de células KR-1 de Pseudomonas mendocina capazes de degradar o tricloroetileno na presença de um indutor dos genes de tolueno monooxigenase e de se controlar a degradação da contaminação de tricloroetileno no local da aplicação.

9.- Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o local da contaminação de tricloroetileno a degradar ser ãgua de superfície, água potável ou água residual que contém resíduo químico de tricloroetileno.

10.- Processo de acordo com a .reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o local da contaminação de tricloroetileno a degradar ser uma terraplanagem ou um lixiviado removido de uma terraplanagem que contém resíduo químico de tricloroetileno.

11.- Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o local da contaminação de tricloroetileno a degradar ser solo que contém resíduo químico de tricloroetileno.

12,- Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o plasmideo recombinante compreender pKY277, pKY28O, pKY281 ou pKY282 e de o indutor ser o tolueno.

13.(

-54(13. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o plasmideo recombinante ser pMY4O2, pMY4O5, pMY4Ol ou pMY4O4 e de o indutor ser isopropil-p-D-tiogalactopiranosido.

14. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o plasmideo recombinante ser pKY287 e de o indutor ser o calor.

15. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de a célula hospedeira de microrganismo compreender JM109, JM83, HB1O1 ou FM5 de E.coli,