FI100992B - Trikloorietyleenin mikrobinen hajotus - Google Patents
Trikloorietyleenin mikrobinen hajotus Download PDFInfo
- Publication number
- FI100992B FI100992B FI895787A FI895787A FI100992B FI 100992 B FI100992 B FI 100992B FI 895787 A FI895787 A FI 895787A FI 895787 A FI895787 A FI 895787A FI 100992 B FI100992 B FI 100992B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- tce
- cells
- toluene
- pmkr1
- degradation
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
- C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/78—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Pseudomonas
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/38—Pseudomonas
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Hydrology & Water Resources (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
100992
Trikloorietyleenin mikrobinen hajotus
Tausta I. Keksinnön ala 5 Tämä keksintö koskee parannettua menetelmää tri kloorietyleenin mikrobiseen hajottamiseen Pseudomonas mendocina KR-l:llä (PmKRl) tai PmKRl:stä peräisin olevan pAUTl-plasmidin sisältävällä Pseudomonas putida KT2440:lla (Pp Y2101) tai geneettisesti muokatuilla mikro-organis-10 meillä, jotka sisältävät PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasi-geenit. Nyt on odottamattomasti havaittu, että PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasientsyymijärjestelmä on käyttökelpoinen trikloorietyleenin hajotuksessa. PmKRl:n tolueeni-mono-oksygenaasientsyymijärjestelmää koodaavien geeniseg-15 menttien eristys ja kloonaus kuvataan US-patenttihakemuk-sessa sarjanumeroltaan 177 631, jätetty 5. huhtikuuta 1988, johon tässä viitataan.
Yhtenä puolena tämä keksintö koskee menetelmää, jolla hajotetaan mikrobisesti trikloorietyleeniä käsitte-20 lemällä trikloorietyleeniä rekombinanttiplasmidin sisältä vällä mikro-organismi-isäntäsolulla, rekombinanttiplasmidin sisältäessä PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasigeenit. Trikloorietyleenin hajottamiseksi täytyy rekombinanttiplasmidin sisältävä mikro-organismi-isäntäsolu käsitellä 25 tolueenimono-oksygenaasigeenien induktorilla. Tämä keksin tö antaa käyttöön uuden menetelmän trikloorietyleenin hajottamiseen antamalla käyttöön geneettisesti muokattuja mikro-organismeja, jotka tietyissä soluviljely- ja määri-tysolosuhteissa osoittavat sellaisia tolueenimono-oksyge-30 naasientsyymiaktiivisuuden tasoja, jotka ylittävät villi- .' tyypin PmKRl-soluissa ilmenevät tasot. Tämä keksintö antaa siten käyttöön tehokkaamman keinon panna toimeen tietyt tästä entsyymijärjestelmästä riippuvaiset biologiset hajotukset, erityisesti trikloorietyleenin hajotus. Keksintö 35 on sovelias trikloorietyleenin hajotukseen, koska sitä voi 2 100992 olla saasteena tai kontaminanttina avoimissa tai suljetuissa .ympäristösysteemeissä.
Trikloorietyleeniä (TCE) käytetään laajalti teollisuuden liuottimena, jota usein löydetään kontaminanttina 5 pohjavedestä, juomavedestä ja jätevedestä. Pohjavesi on sopimattomasti käsiteltyjen vaarallisten jätteiden pääva-rasto. Eri pohjavesivarastoista on tunnistettu yli 200 orgaanista ja epäorgaanista kemikaalia, kuitenkin kaikista tällaisista tunnistetuista kontaminoivista kemikaaleista 10 EPÄ on tunnistanut TCE:n useimmin havaituksi kemialliseksi kontaminantiksi National Priority Listin (NPL) paikoissa Yhdysvalloissa.
Pohjaveden kontaminaatio-ongelman merkitystä havainnollistaa edelleen se tosiseikka, että pohjavesi antaa 15 25% kaikesta Yhdysvalloissa käytettävästä vedestä. The
Conservation Foundationin laskelmat ("Grounwater - Saving the Unseen Resource", marraskuu 1985, sivulla 5) osoittavat, että Yhdysvalloissa pohjavesi on lähde: (1) 35 %:lle kaikesta kunnallisesta vedestä, (2) 50 %:lle kaikesta juo-20 mavedestä (97 %:lle maaseudun alueilla), (3) 40 %:lle kaikesta maanviljelyksen keinokastelussa käytettävästä vedestä ja (4) 26 %:lle kaikesta teollisuuden (pois lukien säh-kövoimalaitokset) käyttämästä vedestä. Ympäristön kannalta tehokkaiden tekniikoiden kehittämistä TCE:n hajottamiseen 25 vaarattomiksi aineiksi ei siten voi liikaa tähdentää.
Sellaisten geneettisesti muokattujen mikro-organismien kehittäminen, joilla on ensiluokkaisia kykyjä hajottaa täsmällisesti määriteltyjä kemiallisia kontaminantte-ja, kuten esimerkiksi TCE:tä, vaarattomiksi aineiksi, on 30 yksi tärkeä strategia kehitettäessä kustannuksiin nähden tehokkaita ja ympäristön kannalta järkeviä menetelmiä vaarallisten kemiallisten töiden jälkien puhdistamiseen. Sellaisten mikro-organismi-isäntäsolujen kehittäminen ja käyttö tässä keksinnössä, joissa on PmKRl:n tolueenimono-35 oksygenaasigeenit sisältäviä rekombinanttiplasmideja, on 3 100992 ensimmäinen menetelmä, jossa käytetään tällaisia geneettisesti muokattuja mikro-organismeja, jotka ovat käyttökelpoisia TCE-kemikaalijätteiden puhdistukseen. Tässä kuvattujen rekombinanttiplasmidit sisältävien mikro-organismi-5 isäntäsolujen kehittäminen ja käyttö on erityisen edullista, koska täsmällisesti määriteltyjä ja hyvin karakterisoituja geenisegmenttejä, joissa on koodattuna PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasigeenit, on kloonattu ja käytetty rekombinanttiplasmldien konstruointiin, kuten edellä vii-10 tatussa US-patenttihakemuksessa, sarjanumeroltaan 177 631, kuvataan. Nimenomaan nämä geenisegmentit tuottavat tiettyjen promoottoreiden säätelyn alaiseksi sijoitettuina tässä keksinnössä käytetyille tietyille mikro-organismi-isäntä-soluille ensiluokkaisia kykyjä hajottaa TCE:tä. Tämä sys-15 teemi sallii helposti eristettyjen geenien manipuloinnin kloonaamalla moninaisiin kloonausvektoreihin ja ekspres-soinnin lukuisten erilaisten promoottorisekvenssien avulla, niin että lisätään ja optimoidaan metabolista aktiivisuutta TCE:n hajottamiseksi. Lisäksi tämä systeemi sallii 20 helposti TCE:n hajotuksessa osallisena olevien spesifisten entsyymien ja proteiinien tutkimisen ja manipuloinnin. Seurauksena PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasigeenit sisältävien DNA-sekvenssien valmistamisesta, tällaisten DNA-segmenttien sisällyttämisestä sopiviin plasmidivekto-25 reihin ja mikro-organismi-isäntäsolujen transformaatiosta,
PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasientsyymituotteet ekspres-soidaan ja ne voidaan eristää. TCE:n hajotukseen voidaan siten ottaa erilainen lähestymistapa käyttämällä eristettyjä ja puhdistettuja entsyymituotteita pikemmin kuin 30 transformoituja mikro-organismi-isäntäsoluja. Mahdollisena otetaan lukuun, että PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasient-syymituotteita voitaisiin käyttää suoraan hajottamaan TCE:tä. Tällaisia entsyymituotteita voitaisiin vapauttaa tai levittää paikkoihin, joissa on TCE-kemikaalijätettä, 35 ja ne voisivat olla hyödyllisiä saastumisen kontrolloin- 4 100992 nissa, esimerkiksi TCE:llä kontaminoituneen teollisuuden j äteveden käsittelyssä.
ZI. Kuvaus tekniikan tasosta
Monia erilaisia menetelmiä on ehdotettu myrkyllis-5 ten jätteiden saattamiseen vaarattomiksi. Näiden joukossa ovat polttaminen tuhkaksi, kemiallinen transformaatio ja mikrobiologinen hajotus. Koska mikrobiologinen myrkyllisten jätteiden hajotus ei pidä sisällään sellaisten kemiallisten reagenssien käyttöä, jotka itsessään voisivat olla 10 myrkyllisiä, ja koska se ei johda siihen, että tuotetaan suuria määriä haitallisia kaasuja, sellaisia kuin tuotetaan myrkyllisten jätteiden tuhkaksi polttamisessa, siitä on tullut edullinen menetelmä myrkyllisten jätteiden hävittämiseen.
15 Useimmat myrkyllisten aineiden mikrobiologiset ha jotukset perustuvat siihen, että löydetään erityinen mikro-organismi, joka metaboloi myrkyllisen aineen muuntaen sen vaarattomiksi metaboliatuotteiksi, tavallisesti - myrkyllisten orgaanisten yhdisteiden tapauksessa -20 muuntamalla tällaiset yhdisteet hiilidioksidiksi, vedeksi ja suoloiksi. Mikro-organismien hankkiminen, erityisesti sellaisten mikro-organismien geneettinen muokkaaminen, jotka voivat tehokkaasti ja turvallisesti muuntaa myrkylliset jätteet vaarattomiksi metaboliatuotteiksi, on hyvin 25 monimutkainen menettely, joka käsittää monia vaivalloisia vaiheita ja joka vaatii merkittävää ajan käyttöä. Useimmat yritykset ovat toistaiseksi kohdistuneet sellaisten mikro-organismien hankkimiseen, jotka ovat peräisin kontaminoituneesta maasta tai vedestä ja jotka eristetään siitä.
30 Yksi lähestymistapa on hankkia käyttöön maa- tai vesinäyte ja rikastaa näytteestä mikro-organismien seos tai eristää seoksesta puhdistettu mikro-organismiviljelmä, jolla on kyky hajottaa yhtä tai useampaa mykyllistä yhdistettä. Useat tutkimukset käyttämällä metaania hyväkseen 35 käyttäviä bakteereita sisältäviä mikro-organismien seok- 5 100992 siä, jotka on saatu maanäytteen metaanirikastuksella, ovat osoittaneet, että tällaisilla seoksilla on kyky hajottaa TCE:tä ja muita kloorattuja eteenejä. Fogel ym., Appi. Environ. Microbiol. 51: 720 - 724 (1986); Wilson ja 5 Wilson, Appi. Environ. Microbiol. 49: 242 - 243 (1985). Vaikka nämä metaania hyväkseen käyttävät viljelmät sisältävät useampaa kuin yhtä bakteerityyppiä, oletetaan, että metanotrofit ovat vastuussa TCE:n hajotuksesta. Fogel ym. (supra) raportoivat TCE-hajotusnopeuden 0,03 nanomoolia 10 TCE:tä minuutissa solun protelinimilligrammaa kohti.
Toisissa tutkimuksissa ei ole käytetty mikro-organismien seoksia vaan maasta tai vedestä eristettyjä puhdistettuja kantoja. Yksi tällainen lähestymistapa kuvataan US-patentissa 4 493 895, jossa esitetään patenttivaatimus 15 menetelmälle, jossa mikrobisesti hajotetaan kontaminoivia halogenoituja aromaattisia yhdisteitä vaarattomiksi aineiksi. Tämä menetelmä koostuu vaiheista, joissa (1) kerätään materiaalinäyte vahingollisten kemikaalien kontami-noimasta paikasta; (2) rikastetaan mikro-organismit, joi-20 den havaitaan elävän näytteessä; (3) erotetaan toisistaan ne mikro-organismien kannat, jotka kykenevät metaboloimaan eri tavoin paikasta saadusta näytteessä olevat eri kemikaalit; (4) puhdistetaan ne kannat, jotka ovat kykeneviä biologisesti hajottamaan hävitettävät kemikaalit; (5) le-25 vitetään kanta hävitettävien kontaminanttien paikkaan; ja (6) tarkkaillaan kontaminanttien poistumista levityspai-kasta. US-patentti 4 477 570 kuvaa ja vaatii patenttia mikro-organismeille, joita käytetään edellä kuvatussa US-patentin 4 493 895 mukaisessa menetelmässä, jolle on vaa-30 dittu patenttia.
. Toinen lähestymistapa kuvataan US-patentissa 4 664 805, jossa vaaditaan patenttia menetelmälle, jolla poistetaan ympäristöistä kontaminoivia halogenoituja orgaanisia yhdisteitä käyttämällä (1) dekontaminoitavasta 35 ympäristöstä peräisin olevia mikro-organismeja, jotka voi- 6 100992 vat metaboloida kontaminantin mutta eivät pysty sillä kasvamaan; (2) ymppiä mikro-organismeista, jotka eivät ole peräisin ympäristöstä ja jotka metaboloivat kontaminantin nopeammin kuin ympäristöstä peräisin olevat mikro-organis-5 mit mutta jotka eivät pysty sillä kasvamaan; ja (3) kontaminantin myrkytöntä analogia, joka toimii kasvusubstraat-tina alkuperäisille ja ei-alkuperäisille mikro-organismeille. Hajotuksen aikaan saamiseksi luotetaan ympäristössä jo läsnä oleviin mikro-organismeihin, niin kutsuttuihin 10 alkuperäisiin mikro-organismeihin. Hajotusta tehostetaan ei-alkuperäisillä mikro-organismeilla.
Vielä yksi lähestymistapa, joka kuvataan US-paten-tissa 4 511 657, käsittää menetelmän kemikaalijätetäyteinään huuhtoutumien käsittelemiseksi aktiivilietteellä, 15 joka sisältää huuhtoutumissa läsnä olevia vahingollisia orgaanisia yhdisteitä metaboloimaan pystyviä bakteereita. Kaikki edellä kuvatut lähestymistavat pitävät sisällään sellaisten mikro-organismien käytön, jotka ovat peräisin tai eristettyjä kontaminoituneista maasta tai huuhtoutu-20 mistä. Hajottavia entsyymejä, jotka mikro-organismit tarvitsevat halogenoitujen orgaanisten yhdisteiden hajottamiseen, voivat koodata plasmideissa olevat geenit. Yksi plasmidi sisältää tavallisesti yhden hajotusreitin entsyymejä koodaavat geenit. Plasmideja on käytetty menetelmis-25 sä, joilla hajotetaan biologisesti tiettyjä kloorattuja aromaattisia orgaanisia yhdisteitä, kuten US-patentti 4 535 061 (joka kuvaa plasmidiavusteisia jalostusmenetelmiä sellaisten mikro-organismien puhdas- ja seosviljelmien luomiseksi, jotka ovat kykeneviä dissimiloimaan ympäris-30 tössä pysyviä kemiallisia yhdisteitä) ja edellä tarkasteltu US-patentti 4 664 805 havainnollistavat.
Käyttämällä plasmideja mikro-organismeista, jotka hajottavat halogenoituja aromaattisia orgaanisia yhdisteitä (A.T.C.C. 31939-31945) (jotka mikro-organismit kuvat-35 tiin US-patenteissa 4 477 570 ja 4 493 895), EP-patentti- 7 100992 hakemus 8511008.1 paljastaa hybridiplasmidien ja näitä plasmideja sisältävien transkonjugaattien valmistuksen. EP-patenttihakemus 8511008.1 opettaa menetelmän halogenoi-tujen orgaanisten yhdisteiden biologiseen hajottamiseen 5 spesifisen mikro-organismin tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa (1) erikseen viljellään ja ylläpidetään (a) laajan kirjon mikro-organismia, joka on valikoitu ryhmästä, johon kuuluvat ATCC 31945, ATCC 31941, ATCC 31942, ATCC 31940, ATCC 31943, ATCC 31944, ATCC 31939 10 ja näiden mutantit, ja (b) laajan isäntäalueen vektoria; (2) erikseen eristetään plasmidi-DNA edellä olevasta (а) :sta ja (b):stä; (3) erikseen puhdistetaan plasmidi-DNA edellä olevasta (a):sta ja (b):stä; (4) erikseen pilkotaan restriktioentsyymillä puhdistettu DNA edellä olevasta 15 (a):sta ja (b):stä; (5) yhdistetään vaiheen (4) tuotteet ja liitetään yhdistetyt tuotteet entsymaattisesti yhteen; (б) transformoidaan liittämisen tuotteet vastaanottavaan mikro-organismiin, sellaiseen kuin E. coliin tai Pseudomonas-laj iin; (7) valikoidaan ne transformantit, 20 joilla on haluttu plasmidi-DNA insertoituna vektoriin; (8) konjugoidaan valikoitu plasmidi-DNA auttajaplasmidin avulla vastaanottavaan isäntään, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat Pseudomonas, Klebsiella, Rhizobium, Agrobacterium, Escherichia; ja (9) valikoidaan ne trans-25 konjugaatit, joilla on haluttu plasmidi-DNA.
Yksitoista transkon jugaatt ia paljastettiin ja odottamattomasi! havaittiin suurimman osan transkonjugaateista käyttävän hyväkseen ainoana hiililähteenään tiettyjä ali-faattisia halogenoituja orgaanisia yhdisteitä, täsmälli-30 sesti sanottuna tetrakloorietyleeniä, etyleenidikloridia, .· metyylikloroformia ja TCE:tä, kun taas kantamikro-organis- mit A.T.C.C. 31939-31945 käyttivät hyväkseen ainoastaan laajaa kirjoa aromaattisia orgaanisia yhdisteitä, kuten US-patentissa 4 493 895 paljastetaan. Ainoa määritys näi-35 den allfaattisten halogenoltujen orgaanisten yhdisteiden 8 100992 hyväksikäytölle oli kasvu yhdistettä sisältävällä elatus-aineella, jossa kasvu oli puolet suurempi kuin keskimääräinen kasvu. Tätä kasvumääritystä lukuun ottamatta trans-konjugaatit ovat täydellisesti karakterisoimattomia. Eri-5 tyisesti mitään ei paljasteta näiden mikro-organismien aiheuttaman näiden alifaattisten halogenoitujen orgaanisten yhdisteiden hajoamisen määrästä tai metaboliatuotteiden luonteesta ja myrkyllisyydestä. Mitään ei opeteta tai paljasteta koskien sitä, mitkä geenit, geenisegmentit, 10 entsyymit, proteiinit tai proteiinituotteet ovat osallisina transkonjugaattien kyvyssä metaboloida tällaisia ali-faattisia halogenoituja orgaanisia yhdisteitä, mukaan lukien TCE:tä. Erityisesti EP-patenttihakemuksen 851008.1 opetus rajoitetaan alifaattisten halogenoitujen orgaanis-15 ten yhdisteiden, mukaan lukien TCE:n, hyväksikäyttöön plasmideilla, jotka on valittu ryhmästä mikro-organismeja, joille on annettu nimet A.T.C.C. 31939-31945.
Mitä tulee nimenomaisesti TCE-metaboliaan, TCE:n osittainen hajotus anaerobisilla organismeilla on rapor-20 toitu, mutta hajotustapahtuman metaboliitteihin kuuluvat vinyylikloridi ja dikloorietyleeni, jotka ovat samalla tavalla haitallisia pohjaveden kontaminantteina. Kleopfer ym., Environ. Sei. Technol., 19:277 - 280 (1985); Parsons ym., J. Am. Water Works Assoc., 76:56 - 59 (1984); Vogel & 25 McCarty, Appi. Environ. Microbiol., 49:1080 - 1083 (1985).
Tuore raportti kuvaa luonnossa esiintyvän bakteeri-isolaa-tin, joka on kykenevä hajottamaan TCE:tä aerobisissa olosuhteissa. Nelson ym., Appi. Environ. Microbiol., 52:383 -384 (1986); Nelson ym., Appi. Environ. Microbiol., 30 53:949 - 954 (1986). Mikro-organismi, jolle on annettu nimi Strain G4, vaatii TCE:n hajotukseen fenolia, toluee-nia, o-kresolia tai m-kresolia. Kuten on karakterisoitu, Strain G4 (1) ei käytä tolueenin hajotukseen TOL-reittiä; (2) sillä ei näytä olevan tolueenidioksygenaasientsyymiä, 35 tolueenin hajotuksen TOD-reitin ensimmäistä entsyymiä, ja 9 100992 (3) se ei käytä tolueenin hajotukseen TMO-reittiä. Näistä kolmesta tolueenin hajotusreitistä (TOL, TOD, TMO) esitetään yhteenveto US-patenttihakemuksessa, sarjanumeroltaan 177 631. Nelson ym. eivät opeta tai paljasta, mitkä gee-5 nit, geenisegmentit, entsyymit, proteiinit tai proteiinituotteet ovat osallisina Strain G4 -kannan kyvyssä hajottaa TCE:tä, eivätkä myöskään sitä, ovatko osallisena olevat geenit koodattuina plasmidissa vai koodattuina kromosomissa. Strain G4 -kannan geneettistä muokkausta ei ole 10 raportoitu.
Vielä vähemmän aikaa sitten Nelson ym., Appi. Environ. Microbiol., 54: 604 - 606 (1988), ovat testanneet kuuden sellaisen mikro-organismikannan kyvyn hajottaa TCE:tä, jotka pystyvät hajottamaan naftaleenia, bifenyy-15 liä, fenolia ja tolueenia. Testatuista kannoista ainoas taan 2, Pseudomonas putida PpFl (PpFl) ja Pseudomonas putida B5 (B5), hajotti TCE:tä. PpFl ja B5 ovat tolueenia hajottavia kantoja, kolmas tolueenia hajottava kanta, Pseudomonas putida mt-2 (Pp mt-2), ei kuitenkaan hajotta-20 nut TCErtä. Näyttää siis siltä, etteivät kaikki tolueenia hajottavat kannat ole kykeneviä hajottamaan TCE:tä.
Pp mt-2, josta Nelson ym., supra, havaitsivat, ettei se pystynyt hajottamaan TCE:tä, sisältää kaksi pWWO-plasmidia, joka plasmidi koodaa nimellä TOL tunnetun 25 tolueenin hajotusreitin entsyymejä. PpFl:n, jonka Nelson ym., supra, havaitsivat voivan hajottaa TCE:tä, tiedetään sisältävän nimellä TOD tunnetun tolueenin hajotusreitin entsyymejä. Hackett ja Gibson, Appi. Environ. Microbiol., 54:1703 - 1708 (1988), ovat myös äskettäin osoittaneet, 30 että PpFl-soluilla on kyky hajottaa TCE:tä. Wackett ja . Gibson, supra, havaitsivat, että syötetystä TCE:stä (20 μΜ) hajotettiin heidän viljely- ja määritysolosuhteis-sa noin 50 % - 60 %. Korkeissa TCE-konsentraatioissa (320 μΜ) ei vastakohtana voitu havaita mitään TCE:n hajo-35 tusta. Korkein heidän havaitsemansa TCE:n hajotuksen no- 10 100992 peus oli 1,8 nanomoolia minuutissa solun proteiinimilli-grammaa kohti.
PpFl:n TOD-reitin geenit ovat koodattuna kromosomissa, vastakohtana Pp mt-2:n plasmidissa koodattuna ole-5 ville TOL-reitin geeneille. Niinpä ei ole mahdollista päätellä, ovatko TCE:n hajotuksessa osallisena olevat geenit koodattuina kromosomissa vai koodattuina plasmidissa. Nelsonin ym:iden, supra, sekä Wackettin ja Gibsonin, supra, tutkimukset PpFl:n mutanteilla, jotka ovat vajaukio sellisia tolueenin hajotusreitin TOD eri komponenttien osalta, viittaavat siihen, että PpFl:n kyky hajottaa TCE:tä on yhteydessä tolueenidioksygenaasientsyymin aktiivisuuteen, joka on ensimmäinen entsyymi kromosomissa koodattuna olevassa TOD-reitissä. Nelsonin ymriden, supra, 15 tutkimukset Pp mt-2:lla osoittivat, että kyky hajottaa TCE:tä ei ole yhteydessä mihinkään plasmidissa koodattuna olevan TOL-reitin entsyymeihin.
Mikään niistä mikro-organismeista, joiden kyky hajottaa TCE:tä toistaiseksi on testattu, ei käytä hyväkseen 20 tolueenin hajotukseen plasmidissa koodattuna olevaa TMO-reittiä. Lisäksi mitään mikro-organismia ei vielä ole geneettisesti muokattu entsyymiaktiivisuuden ja TCE-hajo-tuskyvyn lisäämiseksi. Edelleen minkä tahansa edellä kuvatun mikro-organismisysteemin käyttöön TCE:n hajottamiseksi 25 liittyy useita ongelmia. Ensimmäinen ongelma on se, että TCE:n hajottamiseksi täytyy mikro-organismeissa indusoida hajotusentsyymien reitti (esimerkiksi TOD-reitti), ja ne induktorit, jotka täytyy lisätä TCE:n kontaminoimaan näytteeseen, ovat hiilivetyjä. Toinen ongelma on se, että kos-30 ka nämä mikro-organismit eivät voi käyttää TCE:tä (indusoitujen hajotusentsyymien substraatti) itseään hiililäh-teenä kasvuun, soluille täytyy kasvua varten antaa käyttöön toista substraattia (kosubstraatti). Tällaiset TCE:n kontaminoimaan näytteeseen lisätyt kosubstraatit ovat hii-35 livetyjä, kuten esimerkiksi tolueenia. Nämä kaksi ongelmaa 11 100992 liittyvät siihen käytännölliseen ongelmaan, että TCE:n hajottamiseksi sellaisesta näytteestä kuin esimerkiksi vesipitoisesta kerroksesta ei ole toivottavaa, että täytyy lisätä hiilivetyjä, kuten esimerkiksi tolueenia (indukto-5 riksi ja/tai hlililähteeksl), koska hiilivedyt, kuten to-lueeni, ovat itse ympäristömyrkky-yhdisteitä. Kolmas ongelma, joka liittyy läheisesti kahteen ensimmäiseen, on se, että edellä kuvatuissa systeemeissä, joissa sellainen hiilivety kuin esimerkiksi tolueeni toimii hajotusreitin 10 entsyymien (jotka entsyymit sekä metabololvat hiilivedyn että hajottavat TCE:n) induktorina ja substraattina, hiilivedyn ja TCE:n välillä on kilpailu samasta entsyymisys-teemistä. Olosuhteissa, joissa hiilivetykonsentraatio on suuresti ylimääräinen TCE-konsentraatioon nähden, hiilive-15 ty kilpailee tehokkaammin entsyymisysteemistä ja viivästyttää TCE:n hajotusta. Nämä kolme ongelmaa havainnollistavat eri näkökohtia siitä, mitä kutsutaan kosubstraatti-ongelmaksi, joka ilmenee aiemmin kuvatuissa indusoituvien entsyymien systeemeissä TCE:n hajottamiseksi.
20 Yhteenveto keksinnöstä
Nyt on odottamatta havaittu, että PmKRl:llä ja geneettisesti muokatuilla mikro-organismeilla, jotka sisältävät PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasigeenit, on kyky hajottaa TCE:tä. Niin muodoin PmKRl ja mikro-organismi-isän-25 täsolut, jotka sisältävät PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasigeenit, ovat käyttökelpoisia menetelmässä TCE:n hajottamiseksi .
Tämä keksintö käsittää siten uuden menetelmän TCE:n hajottamiseksi, jossa käytetään hyväksi näitä mikro-orga-30 nismeja, jotka sisältävät PmKRl:n tolueenimono-oksygenaa-. sigeenit. Erityisesti tämä keksintö käsittää menetelmän TCE:n hajottamiseksi käyttämällä geneettisesti muokattuja mikro-organismeja, jotka on kehitetty ja joilla on ensiluokkainen kyky hajottaa sellaista täsmällisesti määritel 12 100992 tyä kemiallista kontaminanttia kuin esimerkiksi TCE:tä vaarattomiksi aineiksi.
Niinpä tämän keksinnön yksi päämäärä on antaa käyttöön menetelmä TCE:n hajottamiseen mistä tahansa, missä se 5 voi esiintyä kontaminanttina tai saasteena.
Toinen tämän keksinnön päämäärä on antaa käyttöön menetelmä TCE:n mikrobiseen hajottamiseen mistä vain halutaan, esimerkiksi keinona puhdistaa suljettuja ja avoimia vesiä, teollisuuden viemärlpäästöjä, valtiollisia, kaupal-10 lisiä tai teollisuuden laitoksia ja tehtaita tai erilaisia laboratoriotoimintoja, sekä muissa tapauksissa, joissa TCE:tä saattaa kerääntyä. Erityisesti tämä keksintö antaa käyttöön parannetun menetelmän TCE:n hajottamiseksi käyttämällä tämän keksinnön mukaisia geneettisesti muokattuja 15 TCE:tä hajottavia mikro-organismeja, kun TCE on poistettu kontaminoituneista vesistä (esimerkiksi ilmastuksella).
Keksinnön lisäpäämääränä on antaa käyttöön menetelmä TCE:n hajottamiseen kätevästi, tehokkaasti ja suhteellisen taloudellisesti.
20 Vielä yksi keksinnön päämäärä on antaa käyttöön mikro-organismeja, jotka sisältävät rekombinanttiplasmide-ja, joissa on PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasigeenit, jotka koodaavat entsyymejä, jotka kykenevät hajottamaan TCE:tä jättäen jäljelle myrkyttömän solumassan, näiden 25 mikro-organismien ollessa ei-patogeenisiä ihmisille, eläimille tai meren eläimistölle ja kasvistolle.
Vielä yksi keksinnön päämäärä on antaa käyttöön menetelmä TCE:n hajottamiseen, jossa mikro-organismi-isän-täsolu, joka sisältää rekombinanttiplasmidin, jossa on 30 PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasigeenit, ja joka on kykene-vä hajottamaan TCE:tä, voidaan levittää suoraan TCE-konta- * minaation paikkaan.
Keksinnön lisäpäämäärä on antaa käyttöön menetelmä TCE:n hajottamiseksi käyttämällä geneettisesti muokattuja 35 mikro-organismeja, joissa on PmKRl:n tolueenimono-oksyge- 13 100992 naasigeenit ja joissa geenit on sijoitettu erilaisten pro-moottoreiden säätelyn alaiseksi, minkä tuloksena saadaan tolueenlmono-oksygenaasiaktlivlsuuden tehostunut Ilmeneminen ja tehostunut TCE:n hajotus tietyissä soluviljely- ja 5 määritysolosuhtelssa.
Vielä yksi keksinnön päämäärä on antaa käyttöön menetelmä TCE:n hajottamiseksi käyttämällä geneettisesti muokattuja mikro-organismeja, joissa on PmKRl:n tolueeni-mono-oksygenaasigeenit ja joissa geenit on sijoitettu sello laisten promoottorisysteemien säätelyn alaiseksi, jotka eivät indusoidu hiilivedyillä, kuten esimerkiksi toluee-nilla, joka menetelmä siten ratkaisee kosubstraattlongeinaan, jonka aiemmin kuvatut indusoituvat entsyymisysteemit TCE:n hajottamiseksi ovat tuoneet esille. Geneettisesti 15 muokattujen mikro-organismien käytöstä tässä keksinnössä saataviin etuihin kuuluvat siten: hiilivedyn, sellaisen kuin tolueenin, eliminointi induktorina; hiilivedyn, sellaisen kuin tolueenin, eliminointi kosubstraattina hajo-tusentsyymisysteemille; ja sen eliminointi, että TCE:n 20 hajotus inhiboituu kompetitiivisesti hiilivety-kosubstraa-tilla/induktorilla.
Keksintö antaa käyttöön menetelmän TCE:n mikrobi-seksi hajottamiseksi, joka menetelmä käsittää TCE:n käsittelyn PmKRl-soluilla tai PmKRl:stä peräisin olevan pAUTl-25 plasmidin sisältävillä PpY2l01-soluilla tai rekombinantti-plasmidin sisältävällä mikro-organismi-lsäntäsolulla. Re-kombinanttiplasmidi sisältää PmKRl :stä eristetyt tolueeni-mono-oksygenaasigeenit. Geenit koodaavat tolueenin hajotuksen TMO-reitin entsyymejä ja proteiineja. Menetelmän 30 mukaisesti PmKRl-solut tai PpY2101-solut tai mikro-orga-nismi-isäntäsolut, joissa on rekombinanttiplasmidi, käsitellään tolueenimono-oksygenaasigeenien induktorilla.
Yksi tämän keksinnön etu yhdessä sen puolista on se, että käytetään hyödyksi geneettisesti muokattuja mik-35 ro-organismeja, joissa on hyvin karakterisoidut geenit, 14 100992 joiden ekspressio on erittäin hyvin karakterisoitujen ja helposti säädeltyjen promoottoreiden kontrollin alaisuudessa, niin että näillä geneettisesti muokatuilla mikro-organismeilla on kyky hajottaa tehokkaasti TCE:ä. Lisäksi 5 nämä geneettisesti muokatut mikro-organismit voidaan nopeasti ja halvalla kasvattaa hyvin korkeisiin solutiheyk-siin modernilla fermentaatioteknologialla, joka on kehitetty E. coli -kannoille, vastakohtana vaikeudelle kasvattaa sellaisia luonnon isolaatteja kuin esimerkiksi PmKRl-10 soluja. Nämä geneettisesti muokatut mikro-organismit voivat edelleen pitää yllä, alhaisten glukoosikonsentraatioi-den läsnäollessa, TCE-hajotusta yli 12 tunnin jaksoja. Lisäetu näiden rekombinanttimikro-organismien käytöstä on se, että ne ovat kykeneviä hajottamaan TCE:n äärimmäisen 15 alhaisille tasoille sen tosiasian nojalla, että metabolia ei enää vaadi aromaattisten hiilivetyjen (kuten esimerkiksi tolueenin) läsnäoloa elatusaineessa, kuten PmKRl-solut vaativat.
Geneettisesti muokatut mikro-organismit voidaan 20 levittää suoraan dekontaminoitavaan TCE:tä sisältävään ympäristöön. Paikoissa, joissa on TCE-kemikaalijätettä, voidaan TCE:n hajottamiseksi vaihtoehtoisesti käyttää kloonattujen geenien entsyymituotteita pikemmin kuin geneettisesti muokattuja mikro-organismeja. Dekontaminaatio-25 nopeuden kiihtyminen johtuu tällaisten geneettisesti muo kattujen mikro-organismien käytöstä, joissa on indusoituvat geenit TCE:n hajottamiseen.
Nämä ja muut tämän keksinnön päämäärät ja edut ilmenevät ammattimiehille seuraavien yksityiskohtaisen ku-30 vauksen ja patenttivaatimusten tarkastelusta.
Piirustusten lyhyt kuvaus
Kun puheeksi otetaan mukana seuraavat piirustukset, esitetään 8 kuviota, jotka tässä jäljessä kuvataan yksityiskohtaisesti ja jotka havainnollistavat tätä keksintöä, 35 joista kuvioista: 15 100992
Kuvio 1 on graafinen esitys, joka esittää ajan funktiona TCE-hajotuskyvyn suhteen testattavien solujen joukkoon lisätyn 10 μΜ (1,3 miljoonasosaa) TCE:n häviämisen johtuen solujen aiheuttamasta TCE:n metaboliasta haih-5 tumattomaksi aineeksi. Testatut solut olivat Pseudomonas mendoclna KR-1 (PmKRl), Pseudomonas putlda F1 (PpFl) ja Pseudomonas putlda Y2101 (Pp Y2101).
Kuvio 2 on graafinen esitys, joka esittää ajan funktiona TCE-lisäyksen hetkellä tehdyn tolueenln lisäyk-10 sen vaikutuksen TCE-hajotuskykyvyn suhteen testattavien solujen joukkoon lisätyn 20 μΜ (2,6 miljoonasosaa) TCE:n häviämiseen johtuen TCE:n metaboliasta halhtumattomaksi aineeksi. Testatut solut olivat: (1) PmKRl TCE-lisäyksen hetkellä lisätyn tolueenln kanssa ja ilman tolueenln 11-15 säystä; ja (2) PmY4001.
Kuvio 3 on graafinen esitys, joka esittää ajan funktiona TCE-hajotuskyvyn suhteen testattavien solujen joukkoon lisätyn 50 μΜ (6,5 miljoonasosaa) TCE:n häviämisen johtuen TCE:n metaboliasta halhtumattomaksi aineeksi.
20 Testatut solut olivat: (1) Rekombinanttiplasmidin pMY402 sisältävä E. co 11 HB101 (HB101/pMY402) olosuhteissa, joissa solut oli indusoitu lPTG:llä ennen määritystä ja sen aikana (kontrollisoluja ei indusoitu IPTG:llä); ja (2) rekombinanttiplasmidin pKY287 sisältävät E. coll FM5 -so-, 25 lut (FM5/pKY287), jossa tapauksessa solut oli indusoitu lämpötilan nostolla (kontrollisolut olivat plasmidivek-torin pCFMH46 sisältäviä FM5-soluja).
Kuvio 4 on graafinen esitys, joka esittää ajan funktiona rekombinanttiplasmidin pMY402 sisältävien 30 HBlOl-solujen aiheuttaman vaihtelevina konsentraatioina *» solujen joukkoon lisätyn TCE:n häviämisen johtuen TCE:n metaboliasta halhtumattomaksi aineeksi.
Kuvio 5 on graafinen esitys, joka esittää HPLC-eluutioprofiilin 14C-metaboliiteista, jotka ovat läsnä 35 solujen elatusaineessa sen jälkeen kun PmKRl-solut ovat 16 100992 hajottaneet 14C-TCE:n (kontrollisolut olivat PmY4001-soluja) .
Kuvio 6 on samanlainen graafinen esitys kuin kuvio 5, mutta 14C-TCE:n hajotus oli siinä FM5/pKY287-soluilla 5 (kontrollisolut olivat FM5/pCFM 1146 -soluja).
Kuvio 7 on graafinen esitys, joka esittää ajan funktiona solujen joukkoon lisätyn 20 μΜ (2,6 miljoonasosaa) TCE:n häviämisen johtuen TCE:n metaboliasta haih-tumattomaksi aineeksi, verratakseen TCE-hajotuksen nopeut-10 ta ja määrää villityypin PmKRl-soluilla ja pMY402-re-kombinanttiplasmidin sisältävillä HBlOl-soluilla (HB101/pMY402).
Kuvio 8 on samalainen graafinenesitys kuin Kuvio 7, mutta siinä käytettiin 50 μΜ (6,5 miljoonasosaa) TCErtä 15 sen sijasta, että käytetään 20 μΜ (2,6 miljoonasosaa) TCE:tä kuten Kuviossa 7. Lisäksi se pitää sisällään tulokset rekombinanttiplasmidin pKY287 sisältävillä E. coli FM5 -soluilla (FM5/pKY287), verratakseen TCE-hajotuksen nopeutta ja määrää villityypin PmKRl -soluilla, 20 HB101/PMY402- ja FM5/pKY287-soluilla.
Edullisten toteutusmuotojen yksityiskohtainen kuvaus
Kuten edellä on mainittu, TCE on tärkeä teollinen liuotin ja sen on havaittu olevan laajalti levinnyt vesiympäristöön. Maailmanlaajuisesti tuotetaan vuosittain noin 25 234000 tonnia TCE:tä (U.S. Environmental Protection
Agency, 1980, EPÄ 440/5-80-077). TCE on hyvin kestävää ja se voi olla äärimmäisen vaikea poistaa kerran ympäristössä ollessaan. Tällä hetekellä tiedetään vähän TCE:n mikrobi-sesta metaboliasta. Eristettyjen ja kloonattujen geenien, 30 sellaisten kuin tässä keksinnössä käytettyjen PmKRl:n to- . lueenimono-oksygenaasigeenien, pitäisi sallia ainut laatuisen mikrobisen TCE-metaboliatyypin yksityiskohtaisen tuntemuksen selvittäminen. Lisäksi kloonattuja geenejä voidaan manipuloida, esimerkiksi yhdistämällä geenit eri-35 laisten promoottoreiden kanssa, entsyymituotteiden 17 100992 ekspression lisäämiseksi ja siten TCE:n hajotuksen nopeuden ja määrän lisäämiseksi. Kuten tässä keksinnössä havainnollistetaan, tiettyjen promoottorisysteemlen käyttö tietyissä soluvlljely- ja määritysolosuhtelssa saattaa 5 lisätä tolueenlmono-oksygenaaslgeenltuotteiden ekspressio ta ja saattaa johtaa nämä kloonatut geenit sisältävien mikro-organismien aiheuttaman TCE- hajotuksen nopeuden ki ihtymiseen.
Sellaisten geneettisesti muokattujen mikro-organls-10 mien kehittäminen, joilla on ensiluokkaisia kykyjä hajottaa sellaisia täsmällisesti määriteltyjä kemiallisia kon-taminantteja kuin esimerkiksi TCE:tä vaarattomiksi aineiksi, on yksi tärkeä strategia kehitettäessä kustannuksiin nähden tehokkaita ja ympäristön kannalta järkeviä menetel-15 miä vaarallisten kemikaalijätteiden puhdistukseen. Toluee- nimono-oksygenaasigeenit PmKRl:stä sisältäviä rekombinant-tiplasmideja sisältävien mikro-organismi-isäntäsolujen kehittäminen ja käyttö tässä keksinnössä on uusi ja hyödyllinen menetelmä, jota voidaan soveltaa TCE-kemikaali-20 jätteen puhdistamiseen. Erityisesti nämä geneettisesti muokatut mikro-organismi-isäntäsolut ovat käyttökelpoisia parannetussa menetelmässä TCE:n hajottamiseksi, kun TCE on poistettu kontaminoituneista vesistä (esimerkiksi ilmastuksella). Nämä geneettisesti muokatut mikro-organismi-25 isäntäsolut, joissa on PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasi- geenit, on kuvattu täysin US-patenttihakemuksessa sarjanumeroltaan 177 631, joka on sisällytetty viitteeksi kokonaisuudessaan .
Mahdollisena otetaan myös lukuun, että tolueenimo-30 no-oksygenaasigeenien entsyymituotteita voidaan käyttää TCE:n hajottamiseen, pikemmin kuin käyttämällä TCE:n hajottamiseen mikro-organismi-isäntäsoluja, jotka sisältävät rekombinanttiplasmideja, joissa on tolueenimono-oksygenaa-sigeenit. Entsyymituotteet voidaan levittää suoraan TCE-35 kemikaalijätteen paikkaan.
18 100992 Tämä keksintö antaa käyttöön menetelmän, jota voidaan käyttää TCE:n hajottamiseen missä tahansa palkassa se esiintyykin kontaminanttlna tai saasteena. Menetelmän avulla käy siten mahdolliseksi puhdistaa ja hajottaa TCE 5 vedestä ja maasta löydetyissä TCE-kemikaalijätepalkoissa.
Seuraavat esimerkit esitetään ainoastaan tätä keksintöä havainnollistavina, eikä niitä pidä tulkita rajoittaviksi .
Esimerkki 1 10 Bakteerikannat ja viljely
Alla luetellut bakteerikannat kuvataan US-patentti-hakemuksessa sarjanumeroltaan 177 631, joka on sisällytetty viitteeksi. Erityisesti edellä viitatussa hakemuksessa kuvataan geneettisesti muokattujen mikro-organismi-isäntä-15 solujen konstruointi ja ominaispiirteet, pitäen sisällään plasmidit, vektorit, geenit ja geenisegmentit. Seuraavia bakteerikantoja kasvatettiin yön yli 30°C:ssa PAS-elatus-aineessa (Chakrabarty ym., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.
70: 1137 - 1140, 1973), johon oli lisätty seuraavat kasvu-20 substraatit ja induktorit: PmKRl, tolueeni (annettuna höyrynä) kasvua ja tolueenia hajottavien entsyymien induktiota varten tai 0,2 % glukoosi kasvua varten; Pseudomonas putida F1 (PpFl), tolueeni (annettuna höytynä) kasvua j a tolueenia hajottavien entsyymien induktiota varten tai 0,2 25 % glukoosi kasvua varten; Pseudomonas putida KT2440 (KT2440), 0,2 % L-glutamaatti kasvua varten; plasmidin pND50 sisältävä Pseudomonas putida KT2440 (KT2440/pND50), 2,5 mM p-kresoli (laimennettuna 1000-kertaisesti konsentroidusta kantaliuoksesta dimetyyliformamidissa) kasvua ja 30 p-kresolia hajottavien entsyymien induktiota varten; .·* plasmidin pAUT 1 sisältävä Pseudomonas putida KT2440 (KT2440/pAUTl), tolueeni (annettuna höyrynä) kasvua ja tolueenia hajottavien entsyymien induktiota varten; Pseudomonas mendocina Y4001 (PmY4001), 2,5 mM p-kresoli 35 kasvua ja p-kresolia hajottavien entsyymien induktiota 19 100992 varten; coll -kanta HB101, joka sisältää rekombinantti-plasmldln pKY277, pMY402 tai plasmidivektorin pMMB66EH (vastaavasti HB101/pKY277, HB101/pMY402, HB101/pMMB66EH), 0,2 % L-glutamaattl tai 0,2 % glukoosi, 0,2 % kasaminohap-5 poja ja 2 pg/ml vitamiini Bl:tä kasvua varten, 250 pg/ml amplslllllnlä plasmldln ylläpitoa varten ja 1 mM isopro-pyyli-B-D-tiogalaktosidi (IPTG) tolueenlmono-oksygenaasln synteesin Induktiota varten; rekomblnanttiplasmidln pMY402 sisältävä KT2440 (KT2440/PMY402), 0,2 % L-glutamaattl kas-10 vua varten, 1 mg/ml amplslllllnlä plasmldln ylläpitoa varten ja 5 mM IPTG tolueenlmono-oksygenaasln synteesin induktiota varten; rekomblnanttiplasmidln pKY287 tai plasmi-divektorin pCFM1146 sisältävä E. coll FM5 (vastaavasti FM5/pKY287 ja FM5/pCFM1146), 0,2 % glukoosi ja 0,05 % hii-15 vauute kasvua varten, 50 pg/ml kanamysiiniä plasmldln ylläpitoa varten, ja FM5/pKY287:lie viljelylämpötilan muutos 42°C:een 2 tunniksi ja sitten palautus 30°C:een 2 tunniksi tolueenlmono-oksygenaasln synteesin induktiota varten.
Solut kasvatettiin vähintään OD550-arvoon 0,5, mikä vastaa 20 noin 3 x 10® CFU:a/ml.
Edellä lueteltujen kantojen lisäksi kasvatettiin ja testattiin TCE:n hajotuskyvyn suhteen useita äskettäin eristettyjä kantoja, joita nimitetään El:ksi, E2:ksi, E4:ksi, E5:ksi, E7:ksi ja E9:ksi ja jotka käyttävät kasvua 25 varten hiililähteenä hyväkseen etyylibentseeniä tai tolu-eenia. Etyylibentseeniä käyttävät kannat eristettiin seuraavasti. Seitsemän näytettä (numeroitu 1-7) saatiin LaBrea Tarpitista ja yhdeksän näytettä (numeroitu 1-9) Thousand Oaks Sewage Treatment Plant -jätevedenpuhdistus-30 laitoksesta. Kustakin näytteestä siirrostettiin 1 ml:n erä .* 50 ml:aan PAS-elatusainetta, johon oli lisätty etyylibent- seeniä annettuna höyrynä 0,2 ml:sta etyylibentseeniä, ja viljelmiä kasvatettiin 25eC:ssa 5 päivää. Thousand Oaks Sewage Treatment Plant -jätevedenpuhdistuslaitoksesta pe-35 räisin olevat viljelmät, joille oli annettu numerot 1, 4, 20 100992 5 ja 9, sekä LaBrea Tarpitista peräisin olevat viljelmät, joille oli annettu numerot 2 ja 7, kasvatettiin kyllästys-tiheyteen (muista viljelmistä ei saatu kasvua). Viljelmistä 1, 2, 4, 5, 7 ja 9 otettiin 1 ml:n näyte ja kukin siir-5 rostettiin 50 ml:aan PAS-elatusainetta, johon oli lisätty etyylibentseeniä, joka annettiin höytynä kuten edellä on kuvattu. Näiden 50 ml:n viljelmien annettiin kasvaa yön yli 25°C:ssa. Kustakin viljelmästä siveltiin näyte kahdesti PAS-etyylibentseeni-maljalle yksittäispesäkkeiden saa-10 miseksi. Kustakin näytteestä peräisin olevat puhdistetut pesäkkeet nimettiin El:ksi, E2:ksi, E4:ksi, E5:ksi, E7:ksi ja E9:ksi. Näiden luonnon bakteeri-isolaattien, jotka käyttävät etyylibentseeniä, havaittiin kasvavan myös tolu-eenilla ja niitä kasvatettiin yön yli 30°C:ssa PAS-elatus-15 aineessa, johon oli lisätty seuraavia kasvusubstraatteja ja induktoreita: 0,2 % L-glutamaatti kasvua varten, 1 mM tolueeni tolueenia hajottavien entsyymien induktiota varten. Solut kasvatettiin, kuten edellä luetelluille muille kannoille on kuvattu, vähintään OD550-arvoon 0,5.
20 Esimerkki 2 TCE:n hajotuksen radioaktiivisuusmääritys Tämä esimerkki paljastaa radioaktiivisuusmäärityk-sen, jolla mitataan TCE:n haihtumattomien aineenvaihdunta-tuotteiden ilmaantumista. Tässä määrityksessä käytettyjä 25 bakteerikantoja kasvatettiin kuten esimerkissä 1. Mikäli tarpeellista, solut laimennettiin määritystä varten PAS-elatusaineella OD550-arvoon 0,5. 4 ml:aan solususpensio-ta 50 ml:n seerumipullossa lisättiin TCE:tä (1,2-14C, 72 mCi millimoolia kohti, New England Nuclear, Boston, 30 Massachusetts) loppukonsentraatioon 5 μΜ. 14C-TCE-liuos ' valmistettiin sekoittamalla radioaktiivista ja ei-radioak- tiivista TCE:tä siten että saatiin 5 mM liuos dimetyyli-formamidissa, jossa oli noin 1 x 106 laskutapahtumaa minuutissa (counts per minute) pl:aa kohti. Neljä μΐ liuosta 35 lisättiin kuhunkin 4 ml:n solususpensioon, seerumiputki 21 100992 suljettiin teflonpeitteisellä kumiseptum!11a ja metalli-reunakorkilla, sekoitettiin vortex-laitteella ja inkuboi-tiin ravistellen 30°C:ssa. Hetkellä nolla ja 30 minuutin väliajoin tämän jälkeen otettiin neulaa ja ruiskua käyt-5 täen 100 μΐ solususpensiota ja tästä siirrettiin 20 μΐ pienelle kappaleelle Whatmanin piihappogeeliohutkerroskro-matografialevyä (Whatman, Clifton, New Jersey), ilmakui-vattiin 15 minuuttia, ja laskettiin Beckman LS-100 -tuike-laskurissa (Beckman Instruments, Inc., Palo Aito, Kalifor-10 nia) käyttämällä Biofluor (New England Nuclear) -nestetui-kenestettä. Taulukkoa 1 varten ilmakuivauksen jälkeen saadut tulokset muunnettiin nanomooleiksi TCE:tä, joka oli metaboloitu haihtumattomaksi materiaaliksi, käyttämällä syötetyn 14C-TCE:n spesifisenä aktiivisuutena 200 laskuta-15 pahtumaa minuutissa pikomoolia kohti.
22 100992
Taulukko 1 TCE:n hajotus
Nanomoolia 14C-TCE:ä muunnettu haihtumat- 5 tomaksi materiaaliksi
Kanta Induktori 2 tunnissa
PpFl ei mitään 0,4 tolueeni 1,1 - 2,0 10
PmKRl ei mitään 0,4 tolueeni 5,1 - 6,5
PmY4001 p-kresoli 0,4 15
PpY2101 ei mitään 0,4 tolueeni 3,8 - 5,1
PpY2119 p-kresoli 0,4 20
PpY2118 ei mitään 0,4 IPTG 0,7 - 1,1 HB101/pKY277 ei mitään 0,4 25 IPTG 1,6 HB101/pMY402 ei mitään 0,3, 0,5 6 tunnin kuluttua 30 IPTG 3,3 - 3,5, 4,7 • ‘ 6 tunnin kuluttua
Taulukossa 1 on yhteenveto tasosta, jolla 14C-TCE:n muuntuu 35 haihtumattomaksi materiaaliksi 2 tunnissa sen vaikutukses- 23 100992 ta, että yön yli -kasvun aikana on läsnä induktori. Näissä kokeissa noin 0,4 nanomoolia 14C-TCE:tä ei haihdutettu; tämä merkitsee taustaa, joka on noin 2 % syötetystä 14C-TCE:stä.
5 Esimerkki 3 TCE:n hajotuksen kaasukroaatografiamääritys Tämä esimerkki paljastaa kaasukromatografiamääri-tyksen, jolla mitataan haihtuvan TCE:n häviämistä. Tässä määrityksessä käytetyt bakteerikannat kasvatettiin kuten 10 esimerkissä 1 on kuvattu. Yön yli -viljelmät laimennettiin (mikäli tarpeellista) määritystä varten OD550-arvoon 0,5 PAS-elatusaineella ja 4 ml soluviljelmää lisätiin seerumi-putkiin. TCE (Aldrich, (Milwaukee, Wisconsin), spektrofo-tometrinen puhtaus) laimennettiin N,N'-dimetyyliformami-15 diin (DMF) (Aldrich, spektrofotometrinen puhtaus) pitoisuuteen 10 mM tai 20 mM ja 4 μΐ lisättiin solususpensioon, jotta saatiin loppukonsentraatio 10 μΜ (1,3 miljoonasosaa) (kuvio 1) tai 20 μΜ (2,6 miljoonasosaa) (kuvio 2). Putket suljettiin, sekoitettiin vortex-laitteella, ja 10 μΐ kaa-20 sufaasia otettiin kaasunpitävää ruiskua käyttämällä kuvissa ilmoitettuina ajankohtina. Kaasufaasinäytteet analysoitiin Hewlett-Packard 5890A -kaasukromatografilia, joka oli varustettu 25 m; n 5 % fenyylimetyylisilikonikolonnilla (Hewlett-Packard, Palo Aito, Kalifornia) ja 63Ni-elektro-25 ninsieppausdetektorilla. Injektorin, uunin ja detektorin lämpötilat olivat vastaavasti 1201, 100® ja 300°. Kantaja-kaasu oli helium ja lisäkaasu oli 95 % argon-5 % metaani. Huippujen pinta-alat laskettiin Hewlett-Packard 3392A -integraattorilla. Tulokset on esitetty kuvissa 1, 2 ja 3 30 jäljellä olevan TCE:n prosentuaalisena osuutena eri aiko-/ jen kuluttua sen lisäämisestä solususpensioon. Läsnä ole- van TCE:n määrä hetkellä nolla katsotaan olevan 100 %.
Kuvio 1 esittää TCE:n hajotusnopeuden 10 μΜ (1,3 miljoonasosaa) TCE:ssä PmKRlrlle, KT2440/pAUTl:lie ja 35 PpFl:lle. Hajotus on nopeaa 1-2 tunnin aikana TCE:n li- 24 100992 säyksen jälkeen ja hidastuu myöhemmin. PmKRl osoittaa korkeinta aktiivisuutta kolmesta testatusta kannasta.
Kuvio 2 esittää tolueenia sisältävässä PAS-elatus-aineessa esikasvatettujen PmKRl-solujen aiheuttaman TCE-5 hajotuksen kiihtymisen, kun tolueenia on läsnä TCE-lisäyk-sen hetkellä. PmKRl hajottaa yli 90 % alunperin pitoisuudessa 20 μΜ (2,6 miljoonasosaa) läsnäolevasta TCE:stä, kun läsnä on tolueenia höyrynä; PmKRl hajottaa TCE:stä vain noin 50 %, kun tolueenia el ole läsnä TCE-lisäyksen het-10 kellä.
Kuvio 3 esittää HB101/pMY402-solujen ja FM5/pKY287-solujen aiheuttaman 20 μΜ (2,6 miljoonasosaa) TCE:n hajotuksen nopeuden. Yli 95 % TCE:stä hajotetaan 4 tunnin kuluessa.
15 Esimerkki 4
Luonnon bakteeri-isolaattien TCE-hajotus
Etyylibentseeniä (ja tolueenia) hyväkseen käyttävät kannat, jotka eristettiin ja kasvatettiin kuten esimerkissä 1 on kuvattu, testattiin niiden kyvyn suhteen hajottaa 20 TCE:tä. TCE-tasot määritettiin kaasukromatografialla esimerkin 3 mukaisesti. TCE:tä lisättiin pitoisuuteen 20 μΜ (2,6 miljoonasosaa). Tulokset on esitetty taulukossa 2. Villityypin PmKRl-soluihin verrattuna jäljelle jäävän TCE:n prosentuuaalinen osuus 18 tunnin hajotusjakson jäl-25 keen oli 6-14 kertaa suurempi kuin villityypin PmKRl-so-luilla, osoittaen, että nämä kannat olivat villityypin PmKRl-soluja tehottomampia kyvyssään hajottaa TCE:tä. 1 25 100992
Taulukko 2
Luonnon bakteeri-isolaattien TCE-hajotus % TCE:ä jäljellä
Kanta 18 tunnin jälkeen 5
PmKRl 4
PmY4001 84
PpFl 49
El 48 10 E2 39 E4 56 E5 el testattu E7 38 E9 24 15 TCE-tasot määritettiin kaasukromatografialla esimerkin 3 mukaisesti. TCE lisättynä pitoisuuteen 20 μΜ (2,6 miljoonasosaa). Tässä kokeessa El-, E2-, E4-, E5-, E7- ja E9-solut kasvatettiin hiililähteenä tolueeni, vaikka nämä 20 solut alunperin valikoitiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla kasvamaan etyylibentseenillä.
Esimerkki 5
Korkeampien TCE-konsentraatioiden vaikutus Tämä esimerkki paljastaa kasvavien TCE-konsentraa-25 tioiden hajotuksen tämän keksinnön mukaisilla rekombinant-tisoluilla. Tässä määrityksessä bakteerisolut kasvatettiin kuten esimerkissä 1, paitsi että kasvuelatusaineessa kasa-minohapot ja vitamiini B1 korvattiin 0,5 % hiivauutteella (Difco, Detroit, Michigan). Määritys oli esimerkissä 3 30 kuvattu TCE-hajotuksen kaasukromatografiamääritys. Kuva 4 osoittaa vaihtelevina konsentraatioina solujen joukkoon lisätyn TCE:n häviämisen kaasufaasista, johtuen TCE:n metaboliasta haihtumattomaksi materiaaliksi, ajan funktiona HBlOl-soluilla, jotka sisältävät pMY402-rekombinanttiplas-35 midin (pMMB66EH-plasmidivektori, jossa on PmKRl:n toluee- 26 100992 nimono-oksygenaasigeenit). Avoimet renkaat osoittavat 20 μΜ (2,6 miljoonasosaa) TCE:n metabolian; suljetut neliöt osoittavat 50 μΜ (6,5 miljoonasosaa) TCErn metabolian; avoimet kolmiot osoittavat 125 μΜ (16 miljoonasosaa) TCE:n 5 metabolian; täytetyt kolmiot osoittavat 310 μΜ (41 miljoo nasosaa) TCE:n metabolian; ja avoimet neliöt osoittavat 780 μΜ (100 miljoonasosaa) TCE:n metabolian. Kontrollit tehtiin kullekin TCE-konsentraatiolle käyttämällä pMY402-plasmidin sisältäviä HBlOl-soluja ilman induktori IPTG:n 10 läsnäoloa tai pMMB66EH-plasmidivektorin sisältäviä HB101- soluja.
Kuvio 4 osoittaa, että pMY402:n sisältävä, IPTGillä indusoitu HB101 metaboloi TCE:stä lähes 100 % aina lähes 20 miljoonasosan TCE-konsentraatioihin saakka 6 tunnissa 15 tai vähemmässä ajassa. 48 miljoonasosan TCE-konsentraa-tiossa metaboloidaan 8 tunnissa 75 %. Lisäksi kuvio 4 osoittaa, että kasvaneissa TCE-konsentraatioissa TCE-hajo-tuksen nopeudet ovat kasvaneet.
Esimerkki 6 20 TCE-hajotuksen kinetiikka
PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasigeenituotteiden aiheuttaman TCE-hajotuksen kinetiikan tutkimiseksi kasvatettiin PmKRl- ja PmY4001-soluja kuten esimerkissä 1. Näitä kokeita varten kasvatettiin lisäksi FM5/pKY287- ja FM5/-25 pCFM1146-soluja seuraavasti: soluymppi lisättiin L-liha-liemeen ja viljelmää inkuboitiin 30°C:ssa kunnes solut saavuttivat OD550-arvon 0,5, sitten lämpötila muutettiin 42°C:ksi 1,5 tunniksi entsyymi-induktion ja -synteesin mahdollistamiseksi, palautettiin sitten jatkokasvua varten 30 30°C:seen 4-6 tunniksi. Soluviljelmät sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen PAS-elatusaineeseen tai 0,2 % glukoosia sisältävään PAS-elatusaineeseen.
TCE-hajotuksen kinetiikan määrittämiseksi soluviljelmät laimennettiin 0,1 M KP04:llä, pH 7,5, alla taulukos-35 sa 3 ilmoitettuun OD550-arvoon. Erä laimennettuja soluja 27 100992 säästettiin alla kuvatun kaltaisiin proteiinimäärityksiin. TCE-hajotus määritettiin kaasukromatografialla suurin piirtein yhtäpitävästi esimerkissä 3 kuvatun menettelyn kanssa, paitsi että seerumiputkissa tehtiin 10 ml:n 5 (4 ml:n sijasta) solureaktiot ja että solujen joukkoon lisättiin 5-10 μΐ TCE:tä DMF:ssä alla taulukossa 3 ilmoitettuihin loppukonsentraatioihin. Solureaktioita inkuboi-tiin ravistellen 30°C:ssa ja hetkellä 0 sekä eri aikojen kuluttua TCE-lisäyksen jälkeen otettiin 10 μΐ kaasufaasia 10 ja sen TCE-konsentraatio analysoitiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. TCE-hajotuksen alkunopeudet laskettiin reaktion ensimmäisten 20 - 30 minuutin aikana hajonneen TCE:n määrästä ja ilmoitetaan alla taulukossa 3 nanomoo-leina minuutissa proteiinimilligrammaa kohti. Useimmat 15 kinetiikkakokeet tehtiin käyttämällä FM5/pKY287-soluja, useita kokeita tehtiin kuitenkin käyttämällä PmKRl-soluja, jotta rekombinanttisoluja käyttämällä saatuja nopeuksia voidaan verrata villityypin soluja käyttämällä saatuihin nopeuksiin. FM5/pCFM1146-soluja käytettiin kontrollisolui-20 na FM5/pKY287-soluille ja PmY4001-soluja käytettiin kont-rollisoluina PmKRl-soluilie, jotta voitiin mitata TCE:n mahdollinen häviäminen johtuen sen vuotamisesta putkesta tai johtuen sen adsorptiosta soluihin. Kokeet osoittivat, että häviäminen kontrolliputkista oli tavallisesti vähem-25 män kuin 5 % 1 tunnin inkubaation jälkeen 30°C:ssa.
Solujen kokonaisproteiinimäärä voidaan määrittää useilla eri menetelmillä, mukaan lukien Bradfordin menetelmällä, Anal. Biochem. 72:248 - 254 (1976), kaupallisesti saatavana Bio-Rad Protein Assay'nä (Bio-Rad, Richmond, 30 Kalifornia, luettelon n:o 500 - 0006). Solujen rikkomiseksi ja solun proteiinien saamiseksi esille proteiinimääri-tysmenetelmän reaktiota varten, solususpensioon lisättiin natriumhydroksidia loppukonsentraatioon 0,1 N, mitä seurasi 30 minuutin inkubaatio 100eC:ssa ennen määritysmenette-35 lyä. Naudan plasman albumiinia, joka oli käsitelty 100992 2β
NaOHrlla ja lämmöllä kuten juuri kuvattiin, käytettiin määritysmenetelmässä proteiinistandardina. FM5/pKY287-solujen aiheuttaman TCE-hajotuksen nopeudet vaihtelevissa solutiheyksissä (OD$so-arvo 0,05 - 1,00) ja vaihtelevissa 5 TCE-konsentraatioissa (1-40 μΜ; 0,13 - 5,2 miljoonasosaa) raportoidaan taulukossa 3.
Taulukko 3 FM5/pKY287-solujen aiheuttaman TCE-hajotuksen kinetiikka (nanomoolia/min/mg proteiinia) 10
Alkuperäinen TCE-konsentraatio (μΜ) solutiheys (0P«M) 1 2^5 5^0 10,0 20,0 40,0 0,05 - 1,2 15 0,10 0,4 0,5 1,5 1,3 1,0 0,1 0,20 - - - - 1,4 - 0,50 - - 0,9 - 1,4 1,00 - - - - 0,2 - 20 Kokeissa PmKRl-soluilla, jotka oli indusoitu tolueenilla, TCE-haj otuksen nopeudet OD550-arvossa 0,50 ja TCE-konsentraatioissa 5,0 μΜ ja 20,0 μΜ olivat vastaavasti 1,3 ja 2,4 nanomool ia/min/mg proteiinia. 0DSS0-arvossa 1,0 ja TCE-konsentraatiossa 5 μΜ PmKRl-solujen aiheuttaman 25 TCE-hajotuksen nopeus oli 2,7 nanomoolia/min/mg proteiinia. Nämä tulokset osoittivat, että villityypin PmKRl-solujen TCE-hajotuksen nopeus on vähintään verrannollinen rekombinanttisolujen nopeuteen ja on tavallisesti sitä hieman korkeampi. Taulukon 3 tulokset osoittavat myös, 30 että FM5/pKY287-rekombinanttisolut voivat hajottaa TCErtä tehokkaasti alhaisessa solutiheydessä (OD550-arvo 0,05 -0,10) ja alhaisissa TCE-konsentraatioissa (1 μΜ - 2,5 μΜ). Näitä soluja voidaan siten käyttää jopa alhaisissa solutiheyksissä tehokkaassa TCE-hajotuksen menetelmässä.
29 100992
Esimerkki 7 14C-TCE:n metabolia
PmKRl :n tolueenimono-oksygenaasigeeni tuotteiden aiheuttaman 14C-TCE:n metabolian seuraamiseksi PmKRl-solu-5 ja, PmY4001-soluja sekä pMY402:n sisältäviä HBlOl-soluja kasvatettiin kuten esimerkissä 1 ja inkuboitiin kuten esimerkin 2 kappaleessa 1 on kuvattu. Inkubaatio oli 16 - 18 tuntia 30°C:ssa. 14C-TCE:n muuttuminen 14C02:ksi, solumas-sassa oleva 14C ja kasvatusliuoksessa oleva 14C mitattiin 10 kuten artikkeleissa Nelson yra., Appi. Environ. Micro. 53; 949 - 954 (1987), sekä Spain ja Nishino, Appi. Environ. Micro. 53: 1010 - 1019 (1987), on kuvattu.
Lyhyesti, inkubaatiojakson jälkeen elatusliuos tehtiin happamaksi 100 pl:lla 2 N rikkihappoa. 14C02 puhdistet-15 tiin ulos vesifaasista johtamalla astiaan ilmaletku ja puhaltamalla ilmaa 1-2 tunnin jakson ajan vapauttamalla ja johtamalla samalla 14C02:a sisältävä ilma toisen letkun läpi putkeen, joka sisälsi 5 ml 1 N natriumhydroksidia.
0,5 ml:ssa natriumhydroksidiliuosta oleva radioaktiivisuus 20 määritettiin ja 14C02:na oleva 14C:n prosentuaalinen osuus 5 ml:ssa näytettä laskettiin. Sen jälkeen kun 14C02 oli poistettu juuri kuvatulla tavalla, otettiin erilleen 1 ml:n näyte solususpensiota ja solususpension radioaktiivisuus määritettiin. Jäljellä oleva elatusaineen ja solujen sus-25 pensio poistettiin putkesta, sentrifugoitiin solujen saos-tamiseksi ja supernatantti saatettiin 0,2 μ:n suodattimen läpi. 50 μ1:η erästä suodosta määritettiin radioaktiivisuus ja elatusaineessa oleva 14C:n prosentuaalinen osuus laskettiin. Solususpensiossa ja suodoksessa olevan radio-30 aktiivisuuden ero tulkittiin solumassassa olevaksi radio-·. aktiivisuudeksi. Solumassassa oleva 14C voitaisiin vaihto ehtoisesti laskea suoraan suspendoimalla solusakka uudelleen ja laskemalla näyte uudelleen suspendoiduista soluista. Tyypillisen PmKRl-, PmY4001- ja HB101/pMY402-soluja 30 100992 käyttämällä tehdyn kokeen tuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa 4.
Taulukko 4 14C-TCE:n metabolia 5 % 14C:stä % 14C: stä % 14C:stä
Kanta CO,:na solumassassa elatusai- neessa P. mendocina KR-1 34 12 32 10 P. mendocina Y4001 15 9 HB101/pMY402 (+IPTG) 18 14 39 HB101/pMY402 (-IPTG) 4 4 13
Toisissa kokeissa PmKRl-, PmY4001-, FM5/pKY287- ja 15 FM5/pCFM1146-soluja kasvatettiin kuten esimerkissä 1 ja inkuboitiin sitten 14C-TCE:n kanssa. Reaktio 14C-TCE:n kanssa pantiin toimeen edellä kuvatulla tavalla, paitsi että (i) 14C02 puhdistettiin ulos vesifaasista ja pidätettiin 20 ml:aan 1 N natriumhydroksidia; ja (ii) 5 ml:aan 20 ml:n 20 natriumhydoksidiliuosta lisättiin 1,2 ml 1 M BaCl2:a 14C02:n saostamiseksi. Tuloksena olevasta sakasta analysoitiin 14C supernatantista otetun erän ohella. Tuloksista esitetään yhteenveto taulukossa 5. Melkein kaikki 1 N natriumhydrok-sidiliuoksessa läsnä oleva 14C saostui BaCl2:lla, osoittaen 25 todeksi, että läsnä oleva 14C oli 14C02:a.
31 100992
Taulukko 5
Taulukko 14C-TCE:n metabolia % 14C:stä % 14C:stä % 14C:stä
Kanta CO,:na solumassassa elatusai- 5 neessa P. mendocina KR-1 32 31 31 P. mendocina Y4001 <1 12 10 FM5/pKY287 45 18 39 FM5/pCFM1146 <1 12 15 Sen analysoimiseksi edelleen, mitä metaboliitteja solujen elatusaineessa oli läsnä, kukin taulukon 5 solujen elatusainefraktio käsiteltiin seuraavasti. 10 ml:aan 14C-leimattuja vesiliukoisia metaboliitteja sisältävää solujen elatusainetta lisättiin kolme tippaa 45 % KOH: a 20 liuoksen pH:n saamiseksi arvoon 11 - 12. Tätä liuosta lyo-filisoitiin 16 - 18 tuntia lopputilavuuteen 0,4 - 0,6 ml 14C-leimatun materiaalin 60 - 70 % takaisinsaannolla. Konsentroitu materiaali analysoitiin korkeapainenestekromato-grafiällä (HPLC) käyttämällä Aminex-ioniekskluusiopylvästä 25 (Bio-Rad) ja 0,01 N H2S04:a eluenttina. 0,6 ml:n fraktioita kerättiin ja 14C 0,2 ml:ssa kutakin fraktiota määritettiin, kuten kuvissa 5 ja 6 esitetään. 14C-leimattujen tuotteiden tunnistus määritettiin vertaamalla HPLC-eluutioaikoja lei-maamattomien standardien eluutioaikoihin, kuten kuvioissa 30 5 ja 6 esitetään. Käytetyt standardit olivat: monokloori- etikkahappo, dikloorietikkahappo, glyoksaalihappo ja muurahaishappo .
Yhteenveto PmKRl-solujen (kuva 5) ja FM5/pKY287-solujen (kuva 6) aiheuttaman TCE-hajotuksen 14C-metabolia-35 tuotteista esitetään taulukossa 6.
32 100992
Taulukko 6 TCE-hajotuksen tuotteiden analyysi solujen elatusaineesta % solujen elatusaineen 14C:stä 5 Yhdiste PnKRl FM5/pKY287
Dikloorietikkahappo 9 5
Glyoksaalihappo 64 71
Muurahaishappo 16 15 10 Tunnistamaton yhdiste 11 10
PmKRl- tai FM5/pKY287-solujen joukkoon lisätyn 14C-TCE:n kokonaismäärästä (huomaa, että noin 30-40% kokonais-14C:stä löydettiin solujen elastusainefraktiosta) noin 3 - 5 % ko-15 konais-14C:stä tunnistettiin klooratuksi yhdisteeksi, di-kloorietikkahapoksi. Loput 14C-radioaktiivisuudesta saatiin takaisin C02:na («30 - 45 %), vaarattomina solun aineosina solumassassa («18 - 35 %) tai pääasiallisesti klooraamat-tomina vesiliukoisina aineosina.
20 Esimerkki 8
Kloorin poisto TCEistä Tämä esimerkki paljastaa määrityksen, jolla mitataan PmKRl-solujen tai PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasi-geenit sisältävän rekombinanttiplasmidin sisältävien mik-25 ro-organismi-isäntäsolujen aiheuttamaa kloridi-ionien va pautumista TCE:stä.
PmKRl- ja FM5/pKY287-solut kasvatettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Solujen kasvun jälkeen bakteerivil-jelmiä sentrifugoitiin 5000 rpm:llä 5 minuuttia, kasvuela-30 tusaine heitettiin pois ja saostuneet solut suspendoitiin uudelleen 15 ml:aan 0,1 M kaliumfosfaattia, pH 7,0, sentrifugoitiin jälleen ja suspendoitiin uudelleen 15 ml:aan 0,1 M kaliumfosfaattia, pH 7,0. Solut laimennettiin samaan puskuriin OD550-arvoon 0,8 ja lopputilavuuteen 10 ml. PmKRl-35 solujen suspensioon lisättiin tolueenia loppukonsentraa- 33 100992 tioon 1 mM. FM5/pKY287-solujen suspensioon lisättiin glukoosia. loppukonsentraatioon 0,2 % ja kanamysiiniä loppu-konsentraatioon 50 pg/ml. Putket suljettiin ja TCE:tä lisättiin ruiskulla loppukonsentraatioon 40 μΜ (5,2 miljoo-5 nasosaa). Inkubaatio oli 5-18 tuntia 30°C:ssa ja TCE:n hajoamisen aste määritettiin kaasukromatografialla.
TCE:n hajottamisen jälkeen soluja sentrifugoitiin 5 minuuttia ja supematantit saatettiin 0,2 μ:n suodattimen läpi. Supernatanttien kloridi-ionikonsentraatiot 10 määritettiin Orion EA 920 -ionimittarilla käyttämällä mallin 94-17B kloridielektrodia ja mallin 90-02 vertailu-elektrodia, molemmat Orionilta. Kalibrointikäyrä 20 μΜ KCl:sta 200 μΜ KCl:iin 0,1 M kaliumfosfaatissa, pH 7,0, määrättiin lisäämällä KCl-eriä taustakontrollinäytteeseen 15 (PmKRl- tai FM5/pKY287-soluja 0,1 M KP04:ssä ilman mitään lisättyä TCE:tä). TCErtä sisältävien näytteiden kloridi-ionikonsentraatiot määritettiin tältä käyrältä.
Tulokset osoittivat, että indusoituja PmKRl-soluja käyttämällä vapautettiin 2,5 moolia kloridi-ioneja 20 TCE-moolia kohti ja pKY287:n sisältäviä indusoituja FM5-soluja käyttämällä vapautettiin 2,7 moolia kloridi-ioneja TCE-moolia kohti.
Esimerkki 9 TCE:n hajotuskyky ja tolueenimono-oksygenaasiaktii- 25 visuus A. Tolueenimono-oksygenaasimääritys korkeissa solu-tiheyksissä ja korrelaatio TCE:n hajotuksen kanssa Näitä määrityksiä varten solut kasvatettiin kylläs-tystiheyteen 0,4 % glutamaattia sisältävässä PAS-elatusai-30 neessa tai L-lihaliemessä. FM5-solut kasvatettiin kuiten kin kuten esimerkissä 6 kuvataan, paitsi että soluja indusoitiin 42°C:ssa 3 tuntia ja sitten ne palautettiin 30°C:een 2 tunniksi. Solut suspendoitiin uudelleen sopivaan tilavuuteen samaa elatusainetta OD660-arvoon 3,0. Erä 35 soluja käytettiin solujen kokona!sproteiinimäärän määrit- 34 100992 tämiseen esimerkissä 6 kuvatulla tavalla. 0,5 ml:n erä soluja sekoitettiin yhteen 4 pmoolin kanssa p-kresolia, joka oli 10 pl:ssa, ja 15 nmoolin kanssa radioaktiivista tolueenia (tolueeni-rengas-l4C, Sigma Chemical Co., 5 56,3 mCi/nmooli), joka oli 5 piissä, ja seosta sekoitet tiin 20 minuuttia huoneen lämpötilassa sekoittaen sitä silloin tällöin vortex-laitteella. Inkubaation jälkeen 20 μΐ seosta laitettiin pienelle ohutkerroskromatografia-levyn palalle ja levyä ilmakuivattiin kaksikymmentä mi-10 nuuttia. Filtterille jäävä haihtumaton radioaktiivisuus määritettiin nestetuikelaskurissa ja käytettiin sen laskemiseen, mikä on tolueenin hajotustuotteen määrä levyllä ja mikä on tolueenimono-oksygenaasin spesifinen aktiivisuus.
Taulukko 7 esittää yhteenvedon edellä kuvatun mää-15 rityksen tuloksista korkeassa solutiheydessä useille eri kannoille, joiden TCE:n hajotuskyky myös testattiin. Taulukko 7 osoittaa myös TCE:n hajotuskyvyn korrelaation tolueenimono-oksygenaasin (TMO) aktiivisuuden kanssa. Erityisesti taulukko 7 osoittaam että korkean solutiheyden 20 olosuhteissa pMY402:n sisältävät HB101-solut ja pKY287:n sisältävät FM5-solut osoittavat PmKRl:n tolueenimono-oksy-genaasientsyymin aktiivisuuden tasoa, joka on noin 2-4 kertaa korkeampi kuin villityypin PmKRl-solujen taso. Nämä samat kaksi geneettisesti muokattua isäntäsolua osoittavat 25 ensiluokkaista kykyä hajottaa TCE:tä, mistä on todisteena villityypin PmKRl-soluihin verrattuna pidempiaikainen ha-jotusnopeus ja lisääntynyt hajotuksen määrä korkeissa TCE-konsentraatioissa. Tämä on havinnollistettu kuvissa 7 ja 8 1PTG:llä indusoiduille pMY402:n sisältäville HB101-30 soluille (avoimet renkaat) vertailtuna villityypin PmKTl- soluihin (avoimet kolmiot) ja osoitettu lisäksi kuviossa 8 FM5/pKY287-soluille (täytetyt neliöt). Kasvanut entsyymi-aktiivisuus edellä kuvatuissa olosuhteissa korreloi siten lisääntyneeseen kykyyn hajottaa TCE:tä, kuten kuvio 8 ja 35 taulukko 7 havainnollistavat.
35 100992
Taulukko 7 TCE:n hajotus ja tolueeniaono-oksygenaasin aktiivisuus korkeissa solutiheyksissä TMO-aktii- 5 visuuden TCE:n PLASMIDI INDUKTORI ISÄNTÄ yksiköt1 Vektori hajotus pAUTl tolueeni PmKRl 0,130 - + 10 pAUTl ei mitään PmKRl 0,010
pMY402 ei mitään E. coli 0,005 pMMB66EH
HB101 pMY402 IPTG E. coli 0,200 pMMB66EH + 15 HB101 pKY287 lämpötila E. coli 0,500 pCFM1146 + FM5 PCFM1146 lämpötila E. coli 0,005 FM5 20 pMMB66EH IPTG E. coli 0,005 HB101
Yksi TMO-aktiivisuuden yksikkö ilmaistaan 1 nmoolina 14C-tolueenia muuntuneena haihtumattomaksi mate-25 riaaliksi minuutissa koko solujen proteiinimilligrammaa kohti.
Niiden taulukossa 7 lueteltujen plasmidien lisäksi, jotka sisältävät PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasin geenit, TCE:n hajotukseen voisivat olla sopivia muut nämä geenit 30 sisältävät plasmidit, mukaan lukien pKY277, pKY280, PKY281, PKY282, pMY401, pMY404 kuten US-patenttihakemuk-sessa sarjanumeroltaan 177,631 (jätetty 5. huhtikuuta, 1988, ja johon viitataan) kuvataan.
36 100992 B. Tolueenimono-oksygenaasimääritys alemmissa solu-tiheyksissä ja korrelaatio TCE:n hajotuksen kanssa Solut kasvatettiin esimerkissä 6 kuvatulla tavalla. Soluviljelmät sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen 5 PAS-elatusaineeseen tai 0,2 % glukoosia sisältävään PAS-elatusaineeseen OD550-arvoon 0,5. Tolueenimono-oksygenaasi-määritys tehtiin edellä osassa A kuvatulla tavalla, paitsi että inkubaatioaika 14C-tolueenin kanssa oli 5 minuuttia, ei 20 minuuttia.
10 Taulukko 8 esittää yhteenvedon edellä kuvatun mää rityksen tuloksista alemmilla solutiheyksillä kannoilla, joiden kyky hajottaa TCE:tä myös testattiin. Taulukko 8 osoittaa myös TCE-hajotuskyvyn korrelaation tolueenimono-oksygenaasin (TMO) aktiivisuuden kanssa. Vastakohtana tu-15 loksille, jotka saatiin korkeissa solutiheyksissä kuten taulukossa 7 esitetään, taulukko 8 osoittaa, että alemman solutiheyden olosuhteissa pMY402:n sisältävät HBlOl-solut ja pKY287:n sisältävät FM5-solut osoittavat tolueenimono-oksygenaasientsyymiaktiivisuuden tasoa, joka on alempi 20 kuin villityypin PmKRl-solujen taso.
37 100992
Taulukko 8 TCE:n hajotus ja tolueenimono-oksygenaasin aktiivisuus alemmissa solutlheyksissä 5 TMO-aktii- visuuden TCE:n PLASMIDI 1NDUKTORI ISÄNTÄ yksiköt1 vektori hajotus pAUTl tolueeni PmKRl 8,35 - + pAUTl ei mitään PmKRl 0,08 10
pMY402 ei mitään E. coli 0,01 pMMB66EH
HB101 pMY402 IPTG E. coli 0,72 pMMB66EH + HB101 15 pKY287 lämpötila E. coli 1,29 pCFM1146 + FM5 pKY287 ei mitään E. coli 0,12 pCFM1146 FM5 PCFM1146 lämpötila E. coli 0,05 20 FM5 PMMB66EH IPTG E. coli <0,01 HB101
Yksi TMO-aktiivisuuden yksikkö ilmaistaan 1 25 nanomoolina 14C-tolueenia muunnettuna haihtumattomaksi materiaaliksi minuutissa koko solujen proteiinimilligrammaa kohti.
Muokkaamalla geneettisesti PmKRl-tolueenimono-ok-sygenaasigeenejä siten että ne sijoitetaan erilaisten pro-30 moottoreiden säätelyn alaiseksi on saavutettu kasvaneita PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasigeenituotteiden ekspres-siotasoja yhdessä samanaikaisen TCE:n hajotuskyvyn kasvun kanssa.
Olosuhteissa, joissa PmKRl-soluja inkuboidaan 35 TCE:hen verrattuna ainakin 40-kertaisen tolueeniylimäärän 38 100992 kanssa, on havaittu useiden tuntien viivevaihe ennen kuin PmKRl-solut alkavat hajottaa TCE:tä (kuvio 7, avoimet kolmiot). Tämä johtuu siitä, että tolueeni ja TCE ovat kosubstraatteja PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasille ja 5 molemmat kilpailevat saatavilla olevista PmKRl:n tolueeni-mono-oksygenaasientsyymeistä. Tämän vuoksi kun tolueenia ja TCE:tä on läsnä samanaikaisesti ja tolueenia on TCE:hen verrattuna ylimääräkonsentraatio, PmKRl-solut alkavat hajottaa TCE:tä vasta sen jälkeen kun tolueenin konsent-10 raatio on alentunut merkittävästi. Tätä samaa viivevaihet-ta ei havaita, kun PmKRl-solut ensin indusoidaan toluee-nilla ja tolueeni poistetaan sitten ennen TCE:n lisäämistä (kuvio 2). Kloonamalla PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasi-geenit ja sijoittamalla ne sellaisten promoottoreiden sää-15 telyn alaisiksi, jotka eivät indusoidu tolueenilla, on eliminoitu juuri kuvattu kosubstraattiongelma.
On odotettavaa, että monet muut promoottorisystee-mit, muut kuin tässä kuvatut tolueenilla indusoituvat, IPTG:llä indusoituvat ja lämpötilalla indusoituvat pro-20 moottorit, ovat soveliaita lisääntyneeseen tolueenimono-oksygenaasin ekspressioon ja siten kasvaneeseen TCE:n hajotukseen. Edelleen on odotettavaa, että monet muut plas-midivektoreiden ja mikro-organismi-isäntäsolujen tyypit ovat sopivia PmKRl:n tolueenimono-oksygenaasin ekspressoi-25 miseen ja TCE:n hajotukseen, sinänsä edellä kuvattujen havainnollistavien toteutusmuotojen ei tulisi rajoittaa keksintöä. Sen sijaan keksintöä tulee arvostella seuraa-vien patenttivaatimusten perusteella.
<
Claims (8)
1. Menetelmä trikloorietyleenin mikrobiseksi hajottamiseksi, tunnettu siitä, että triklooriety- 5 leeniä käsitellään mikro-organismi-isäntäsolulla, joka on E. coli JM109, JM83, HB101 tai FM5, joka sisältää rekombinanttiplasmidin pKY277, pKY280, pKY281 tai pKY282, joka sisältää Pseudomonas mendocina KR-l:n tolueenimono-oksygenaasigeenejä, ja rekombinanttiplasmidin sisältävä 10 mikro-organismi-isäntäsolu on käsitelty tolueenimono-oks-ygenaasigeenien induktorilla, joka on tolueeni.
2. Menetelmä trikloorietyleenin mikrobiseksi hajottamiseksi, tunnettu siitä, että triklooriety-leeniä käsitellään mikro-organismi-isäntäsolulla, joka on
15 E. coli JM109, JM83, HB101 tai FM5, joka sisältää rekombinanttiplasmidin pMY402, pMY405, pMY401 tai pMY404, joka sisältää Pseudomonas mendocina KR-l:n tolueenimono-oksygenaasigeenejä, ja rekombinanttiplasmidin sisältävä mikro-organismi-isäntäsolu on käsitelty tolueenimono-oks-20 ygenaasigeenien induktorilla, joka on isopropyyli-ft-D- tiogalaktopyranosidi.
3. Menetelmä trikloorietyleenin mikrobiseksi hajottamiseksi, tunnettu siitä, että triklooriety- : leeniä käsitellään mikro-organismi-isäntäsolulla, joka on
25 E. coli JM109, JM83, HB101 tai FM5, joka sisältää rekombinanttiplasmidin pKY287, joka sisältää Pseudomonas mendocina KR-l:n tolueenimono-oksygenaasigeenejä, ja rekombinanttiplasmidin sisältävä mikro-organismi-isäntäsolu on käsitelty tolueenimono-oksygenaasigeenien induktorilla, 30 joka on lämpötilanmuutos 42 °C:een.
4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsitellään trikloorietyleenikemikaalijätettä sisältävää pohjavettä.
5. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen 35 menetelmä, tunnettu siitä, että käsitellään trikloorietyleenikemikaalijätettä sisältävää juomavettä. 40 100992
6. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsitellään trikloorietyleenikemikaalijätettä sisältävää jätevettä.
7. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen 5 menetelmä, tunnettu siitä, että käsitellään trikloorietyleenikemikaalijätettä sisältävää täytemaata.
8. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsitellään trikloorietyleenikemikaalijätettä sisältävää maata. 41 100992
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US17764088A | 1988-04-05 | 1988-04-05 | |
| US17764088 | 1988-04-05 | ||
| US07/235,354 US5079166A (en) | 1988-04-05 | 1988-10-19 | Microbial degradation of trichloroethylene |
| US23535488 | 1988-10-19 | ||
| PCT/US1989/001419 WO1989009827A1 (en) | 1988-04-05 | 1989-04-04 | Microbial degradation of trichloroethylene |
| US8901419 | 1989-04-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI895787A0 FI895787A0 (fi) | 1989-12-04 |
| FI100992B true FI100992B (fi) | 1998-03-31 |
Family
ID=26873499
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI895787A FI100992B (fi) | 1988-04-05 | 1989-12-04 | Trikloorietyleenin mikrobinen hajotus |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5079166A (fi) |
| EP (1) | EP0336718A3 (fi) |
| JP (1) | JPH02503866A (fi) |
| KR (1) | KR0131772B1 (fi) |
| CA (1) | CA1316860C (fi) |
| DK (1) | DK175623B1 (fi) |
| FI (1) | FI100992B (fi) |
| IL (1) | IL89847A (fi) |
| NO (1) | NO179642C (fi) |
| PT (1) | PT90196B (fi) |
| WO (1) | WO1989009827A1 (fi) |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4009109A1 (de) * | 1990-03-21 | 1991-09-26 | Fraunhofer Ges Forschung | Verfahren zur mikrobiologischen reinigung von mit halogenierten ethenen und/oder mit halogenierten butadienen kontaminierten abluftstroemen |
| US5487834A (en) * | 1993-02-09 | 1996-01-30 | The Regents Of The University Of California | Methods for microbial filtration of fluids |
| US5397473A (en) * | 1993-08-27 | 1995-03-14 | Cornell Research Foundation, Inc. | Biological treatment method for water |
| US5512479A (en) * | 1993-10-14 | 1996-04-30 | Envirogen, Inc. | Method of degrading volatile organochlorides and remediation thereof |
| US5612204A (en) * | 1994-07-08 | 1997-03-18 | Japan Energy Corporation | Biological degradative treatment of chlorine substituted ethylene |
| US5641679A (en) * | 1994-12-16 | 1997-06-24 | Cytec Technology Corporation | Methods for bio-remediation |
| AU4425396A (en) * | 1994-12-16 | 1996-07-03 | Cytec Technology Corp. | Method for obtaining microorganisms which degrade organic compound(s) |
| US5585272A (en) * | 1994-12-16 | 1996-12-17 | Cytec Technology Corporation | Solid phase system for aerobic degradation |
| US5633164A (en) * | 1994-12-16 | 1997-05-27 | Cytec Technology Corporaton | Methods for fluid phase biodegradation |
| US5688685A (en) * | 1994-12-16 | 1997-11-18 | Cytec Technology Corporation | System and methods for biodegradation of compounds |
| US6004772A (en) * | 1995-02-28 | 1999-12-21 | Canon Kabushiki Kaisha | Oxygenase expressing microorganism strain JM1 (FERM BP-5352) for degrading organic compounds without an inducer |
| US5688660A (en) * | 1995-03-15 | 1997-11-18 | Colgate-Palmolive Company | Method for determining product biodegradability |
| US6242244B1 (en) | 1996-02-28 | 2001-06-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Microbial system for formaldehyde sensing and remediation |
| US5747328A (en) * | 1996-02-28 | 1998-05-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Microbial system for formaldehyde sensing and remediation |
| JP3083077B2 (ja) * | 1996-04-11 | 2000-09-04 | キヤノン株式会社 | 有機化合物の生分解方法及び環境修復方法 |
| JP3323746B2 (ja) * | 1996-08-01 | 2002-09-09 | キヤノン株式会社 | 新規微生物、有機化合物の生分解方法及び環境修復方法 |
| JP3347596B2 (ja) * | 1996-08-01 | 2002-11-20 | キヤノン株式会社 | 新規微生物、芳香族化合物及び／或いは有機塩素化合物の生分解方法、及び媒体の浄化方法 |
| US6171844B1 (en) | 1996-08-19 | 2001-01-09 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Microorganism and method for environmental purification using the same |
| US5958757A (en) * | 1996-09-13 | 1999-09-28 | Envirogen, Inc. | Biological conversion of organic compounds |
| DK0930929T3 (da) * | 1996-10-07 | 2001-10-08 | Fraunhofer Ges Forschung | Mikrobiologisk fremgangsmåde til fjernelse af halogenerede ethener |
| DE19709453C2 (de) * | 1996-10-07 | 2000-07-13 | Fraunhofer Ges Forschung | Verwendung von Bakterienstämmen die aus Proben angereichert wurden, die sowohl Ethen als auch Chlorethen ausgesetzt waren zum Abbau von halogeniertem Ethen |
| DE19710010A1 (de) * | 1997-03-12 | 1998-09-17 | Solvay Deutschland | Verfahren zur biologischen Behandlung von Grund- oder Prozeßabwässern zur Entfernung von halogenierten, ungesättigten Kohlenwasserstoffen |
| US6830899B1 (en) | 1997-06-13 | 2004-12-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the production of para-hydroxybenzoate in Pseudomonas mendocina |
| DE19730653A1 (de) * | 1997-07-17 | 1999-01-21 | Forschungszentrum Fuer Medizin | Verfahren zum mikrobiologischen Abbau halogenierter aliphatischer und aromatischer Kohlenwasserstoffe in kontaminierten Medien |
| US5994120A (en) * | 1998-02-13 | 1999-11-30 | Infectech, Inc. | Method of bioremediating an organic hazardous substance |
| US6864074B2 (en) | 1998-10-30 | 2005-03-08 | Canon Kabushiki Kaisha | Dna fragment carrying toluene monooxygenase gene, recombinant plasmid, transformed microorganism, method for degrading chlorinated aliphatic hydrocarbon compounds and aromatic compounds, and method for environmental remediation |
| US6472191B1 (en) | 1998-12-03 | 2002-10-29 | Canon Kabushiki Kaisha | Dna fragment carrying toluene monooxygenase gene, recombinant plasmid, transformed microorganism, method for degrading chlorinated aliphatic hydrocarbon compounds and aromatic compounds, and method for environmental remediation |
| US6586229B1 (en) * | 2000-06-01 | 2003-07-01 | North Carolina State University | Method for the production of ρ-Hydroxybenzoate in species of pseudomonas and agrobacterium |
| CA2418155A1 (en) * | 2000-07-18 | 2002-01-24 | National Research Council Of Canada | Cloning, sequencing and expression of a comamonas cyclopentanone 1,2-monooxygenase-encoding gene in escherichia coli |
| JP4313680B2 (ja) * | 2002-02-26 | 2009-08-12 | メルシャン株式会社 | ベンゼン資化性ロドコッカス属細菌及びそれにより調製されるプラスミド |
| KR100934600B1 (ko) * | 2005-04-21 | 2009-12-31 | 이비덴 가부시키가이샤 | 유기물 함유 폐액의 처리 방법 |
| US8658411B2 (en) * | 2005-04-21 | 2014-02-25 | Ibiden Co., Ltd. | Method of treating wastewater containing organic compound |
| US8277657B2 (en) * | 2008-08-08 | 2012-10-02 | University Of Massachusetts | Systems and methods for microbial reductive dechlorination of environmental contaminants |
| CN108070544B (zh) * | 2017-12-29 | 2021-04-09 | 佛山市碧沃丰生物科技股份有限公司 | 门多萨假单胞菌及其培养基、发酵方法和应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4477570A (en) * | 1981-09-24 | 1984-10-16 | Occidental Chemical Corporation | Microbial degradation of obnoxious organic wastes into innocucous materials |
| US4520103A (en) * | 1982-10-27 | 1985-05-28 | Amgen | Microbial production of indigo |
| CA1262339A (en) * | 1984-08-14 | 1989-10-17 | Stanley A. Sojka | Cloning the halo-organic biodegradable gene |
| US4959315A (en) * | 1987-04-30 | 1990-09-25 | The United States Of America As Represented By The Administrator Of The Environmental Protection Agency | Biodegradation of chloroethylene compounds |
-
1988
- 1988-10-19 US US07/235,354 patent/US5079166A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-04-03 CA CA000595483A patent/CA1316860C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-04 JP JP1504759A patent/JPH02503866A/ja active Pending
- 1989-04-04 KR KR1019890702298A patent/KR0131772B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1989-04-04 EP EP19890303328 patent/EP0336718A3/en not_active Ceased
- 1989-04-04 PT PT90196A patent/PT90196B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-04-04 WO PCT/US1989/001419 patent/WO1989009827A1/en not_active Ceased
- 1989-04-04 IL IL8984789A patent/IL89847A/en unknown
- 1989-12-04 FI FI895787A patent/FI100992B/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-12-04 NO NO894846A patent/NO179642C/no not_active IP Right Cessation
- 1989-12-04 DK DK198906089A patent/DK175623B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3427589A (en) | 1989-11-03 |
| JPH02503866A (ja) | 1990-11-15 |
| FI895787A0 (fi) | 1989-12-04 |
| WO1989009827A1 (en) | 1989-10-19 |
| NO894846D0 (no) | 1989-12-04 |
| DK175623B1 (da) | 2004-12-27 |
| AU626856B2 (en) | 1992-08-13 |
| NO179642C (no) | 1996-11-20 |
| US5079166A (en) | 1992-01-07 |
| EP0336718A2 (en) | 1989-10-11 |
| EP0336718A3 (en) | 1991-04-24 |
| NO894846L (no) | 1989-12-04 |
| CA1316860C (en) | 1993-04-27 |
| IL89847A0 (en) | 1989-12-15 |
| PT90196B (pt) | 1994-06-30 |
| PT90196A (pt) | 1989-11-10 |
| DK608989D0 (da) | 1989-12-04 |
| KR900700611A (ko) | 1990-08-16 |
| DK608989A (da) | 1990-02-02 |
| IL89847A (en) | 1994-10-21 |
| NO179642B (no) | 1996-08-12 |
| KR0131772B1 (ko) | 1998-04-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI100992B (fi) | Trikloorietyleenin mikrobinen hajotus | |
| Morris et al. | Establishment of polychlorinated biphenyl-degrading enrichment culture with predominantly meta dechlorination | |
| Brim et al. | Deinococcus radiodurans engineered for complete toluene degradation facilitates Cr (VI) reduction | |
| US4493895A (en) | Microbial degradation of obnoxious organic wastes into innocuous materials | |
| Zhang et al. | Aerobic degradation of bisphenol A by Achromobacter xylosoxidans strain B-16 isolated from compost leachate of municipal solid waste | |
| US4477570A (en) | Microbial degradation of obnoxious organic wastes into innocucous materials | |
| US5316940A (en) | Constitutive soluble methane monooxygenase mutants of methanotrophic bacteria such as Methylosinus trichosporium A.T.C.C. 55314 | |
| Ahring et al. | Introduction of a de novo bioremediation ability, aryl reductive dechlorination, into anaerobic granular sludge by inoculation of sludge with Desulfomonile tiedjei | |
| Focht et al. | Growth kinetics of Pseudomonas alcaligenes C-0 relative to inoculation and 3-chlorobenzoate metabolism in soil | |
| EP0958070A1 (en) | Biodegradation of the gasoline oxygenates | |
| US9029127B2 (en) | Method of degrading TBP using a photosynthetic bacterial strain | |
| US6537797B1 (en) | Compositions and methods useful in bioremediation of polychlorinated biphenyls | |
| Broholm et al. | Different abilities of eight mixed cultures of methane-oxidizing bacteria to degrade TCE | |
| US5681739A (en) | Method for in situ or ex situ bioremediation of hexavalent chromium contaminated soils and/or groundwater | |
| Berne et al. | Tributyl phosphate degradation by Serratia odorifera | |
| Armenante et al. | Effect of pH on the anaerobic dechlorination of chlorophenols in a defined medium | |
| Cui et al. | Simultaneous removal of Cr (VI) and phenol in consortium culture of Bacillus sp. and Pseudomonas putida Migula (CCTCC AB92019) | |
| US5958757A (en) | Biological conversion of organic compounds | |
| Novak et al. | Phototrophic utilization of taurine by the purple nonsulfur bacteria Rhodopseudomonas palustris and Rhodobacter sphaeroides | |
| US6303366B1 (en) | Biodegradation of the gasoline oxygenates | |
| AU626856C (en) | Microbial degradation of trichloroethylene | |
| Mavoungou et al. | Microbial dehalogenation of 4, 4′-dichlorobiphenyl under anaerobic conditions | |
| Hartmans | Microbial degradation of vinyl chloride | |
| Bisaillon et al. | Microbiological study of the carboxylation of phenols by methanogenic fermentation: a summary | |
| Deniz et al. | Effects of oxygen on biodegradation of benzoate and 3-chlorobenzoate in a denitrifying chemostat |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: AMGEN INC. |
|
| MA | Patent expired |