NO179642B

NO179642B - Fremgangsmåte for mikrobiell nedbrytning av trikloretylen, samt anvendelse av fremgangsmåten til nedbrytning av TCE i kjemisk avfall

Info

Publication number: NO179642B
Application number: NO894846A
Authority: NO
Inventors: Robert B Winter; Kwang-Mu Yen; Burt D Ensley
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1988-04-05
Filing date: 1989-12-04
Publication date: 1996-08-12
Also published as: AU626856B2; DK608989D0; IL89847A; FI100992B; JPH02503866A; CA1316860C; DK608989A; PT90196A; WO1989009827A1; PT90196B; AU3427589A; NO179642C; IL89847A0; NO894846L; DK175623B1; FI895787A0; EP0336718A2; US5079166A; KR0131772B1; KR900700611A

Description

Bakgrunn

I. Oppfinnelsens område

Oppfinnelsen vedrører en forbedret fremgangsmåte for mikrobiell nedbrytning av triklorethylen ved hjelp av genetisk konstruerte mikroorganismer som inneholder toluenmonooxygenasegenene fra Pseudomonas mendocina KR-1 (PmKRl). Det er nå uventet funnet at PmKRl-toluenmonooxygenaseenzym-systemet er anvendbart ved nedbrytningen av triklorethylen. Videre vedrører oppfinnelsen en anvendelse av fremgangsmåten til nedbrytning av TCE i kjemisk avfall.

Ved ett aspekt vedrører således foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for mikrobiell nedbrytning av triklorethylen ved behandling av triklorethylen med en mikroorganismevertcelle inneholdende et rekombinant plasmid, idet det rekombinante plasmid inneholder PmKRl-toluenmonooxygenasegenene. Mikroorganismevertcellen som inneholder det rekombinante plasmid, må behandles med et induksjonsmiddel for toluenmonooxygenasegenene for å bryte ned triklorethylen. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny fremgangsmåte for mikrobiell nedbrytning av triklorethylen ved å tilveiebringe genetisk konstruerte mikroorganismer som utviser nivåer av toluenmono-oxygenaseenzymaktivitet under visse celledyrknings- og analysebetingelser som overskrider nivåer uttrykt i PmKRl-celler av villtype. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derfor en mer effektiv måte for utførelse av visse biologiske nedbrytninger som er avhengige av dette enzymsystem, særlig nedbrytningen av triklorethylen. Oppfinnelsen er anvendbar for nedbrytning av triklorethylen slik det kan være til stede som et forurensende middel eller en kontaminant i åpne eller lukkede miljøsystemer.

Triklorethylen (TCE) er et utstrakt brukt industrielt oppløsningsmiddel som ofte finnes som en kontaminant i grunnvann, drikkevann og avfallsvann. Grunnvann er hovedreser-voaret for ukorrekt behandlede, farlige avfallsstoffer. Mer enn 200 organiske og uorganiske kjemikalier er blitt identifisert i forskjellige grunnvannforekomster, blant alle slike identifiserte forurensende kjemikalier har imidlertid EPA identifisert TCE som den hyppigst observerte kjemiske kontaminant på steder i USA som står på den nasjonale priori-tetsliste (NPL).

Størrelsen på dette problemet med grunnvannforurens-ning eksemplifiseres ytterligere av det faktum at grunnvann gir 25% av alt vann som brukes i USA. Beregninger av The Conservation Foundation ("Groundwater - Saving the Unseen Resource", november 1985, på s. 5) viser at i USA er grunnvann kilden for: (1) 35% av alt kommunalt vann, (2) 50% av alt drikkevann (97% i landområder), (3) 40% av alt vann som brukes i landbruksvanning og (4) 26% av alt vann som brukes av industrien (bortsett fra elektrisitetsverk). Viktigheten av å utvikle miljømessig effektive teknikker for nedbrytningen av TCE til ufarlige stoffer kan således ikke over-vurderes .

Utvikling av genetisk konstruerte mikroorganismer som har utmerkede evner til å bryte ned bestemte kjemiske kontaminanter, slik som TCE, til ufarlige stoffer, er en viktig strategi ved utviklingen av kostnadseffektive og miljømessig sunne fremgangsmåter for opprenskning etter skadelig kjemisk arbeid. Utviklingen og bruken av mikroorganismevertceller med rekombinante plasmider som inneholder PmKRl-toluenmonooxygenasegener ifølge foreliggende oppfinnelse, er den første fremgangsmåte hvor det anvendes slike genetisk konstruerte mikroorganismer som kan anvendes til opprenskning av kjemisk avfall med TCE. Utviklingen og bruken av mikroorganismevertceller som inneholder de rekombinante plasmidene som her er beskrevet, er særlig fordelaktige fordi bestemte og godt karakteriserte gensegmenter som koder for PmKRl-toluenmonooxygenase, er blitt klonet og brukt til å konstruere de rekombinante plasmidene. Det er disse gensegmentene plassert under reguleringen av visse promoterer som spesifikt gir utmerkede evner til å bryte ned TCE til visse mikroorganismevertceller brukt ifølge oppfinnelsen. Dette systemet muliggjør lett manipulering av de isolerte genene ved å klone dem inn i flere forskjellige kloningsvektorer og ved ekspresjon via flere forskjellige promotersystemer, for å

øke og optimalisere metabolsk aktivitet for nedbrytning av TCE. I tillegg muliggjør dette systemet lett undersøkelsen og manipuleringen av de bestemte enzymene og proteinene som er involvert i TCE-nedbrytning. Som en følge av fremstillingen av DNA-segmenter som inneholder PmKRl-toluenmonooxygenasegener, inkorporeringen av slike DNA-segmenter i egnede plasmidvektorer og transformasjonen av mikroorganismevertceller, uttrykkes PmKRl-toluenmonooxygenaseenzymprodukter og kan isoleres. En annen fremgangsmåte for nedbrytningen av TCE kan således iverksettes ved å bruke isolerte og rensede enzymprodukter istedenfor de transformerte mikroorganismevertcellene. Det er meningen at PmKRl-toluenmonooxygenase-enzymproduktene skal kunne brukes direkte til å bryte ned TCE. Slike enzymprodukter vil kunne frigjøres i eller på-føres steder for TCE-holdig kjemisk avfall og vil kunne bli nyttig ved forurensningskontroll, f.eks. ved behandlingen av industrielt avfallsvann forurenset med TCE.

II. Beskrivelse av teknikken

Mange forskjellige fremgangsmåter er blitt foreslått for å gjøre giftig avfall ufarlig. Blant disse er forbrenn-ing, kjemisk omdannelse og mikrobiologisk nedbrytning. Ettersom mikrobiologisk nedbrytning av giftig avfall ikke omfatter bruken av kjemiske reagenser som selv kan være giftige, og ikke resulterer i fremstillingen av store mengder skadelig røyk, slik som frembrakt ved forbrenningen av giftig avfall, har den blitt en foretrukken fremgangsmåte for å bli kvitt giftig avfall.

De fleste mikrobiologiske nedbrytninger av giftige stoffer er basert på oppdagelse av en bestemt mikroorganisme som vil metabolisere det giftige materiale, omdanne det til ufarlige metabolske produkter og i tilfellet med giftige organiske forbindelser, vanligvis omdanne slike forbindelser til carbondioxyd, vann og salter. Å finne frem til mikroorganismer, særlig genetisk konstruerte mikroorganismer som effektivt og sikkert kan omdanne giftig avfall til ufarlige metabolske produkter, er en svært kompleks fremgangsmåte som omfatter mange besværlige trinn og krever et betydelig for-bruk av tid. De fleste anstrengelser har hittil blitt fokusert på å finne mikroorganismer opprinnelig hjemmehørende i og isolert fra forurenset jordbunn eller vann.

En fremgangsmåte er å erholde en jordbunn- eller vannprøve og anrike prøven med hensyn på en blanding av mikroorganismer eller isolere fra en blanding av renset kultur av en mikroorganisme med evne til å bryte ned én eller flere giftige forbindelser. Flere undersøkelser hvor det brukes blandinger av mikroorganismer som inneholder methanutnyttende bakterier, erholdt ved methananrikning av en jord-bunnprøve, har vist at slike blandinger har evne til å bryte ned TCE og andre klorerte ethener. Fogel et al., Appl. Environ. Microbiol. _51: 720-724 (1986); Wilson og Wilson, Appl. Environ. Microbiol. 4_9: 242-243 (1985) . Selv om disse methanutnyttende kulturer inneholder mer enn én type bak-terie, er det foreslått at methanotropene er ansvarlige for nedbrytningen av TCE. Fogel et al. (supra) rapporterer en hastighet for TCE-nedbrytning på 0,03 nanomol TCE pr. minutt pr. milligram celleprotein.

Ved andre undersøkelser er det ikke blitt brukt blandinger av mikroorganismer, men rensede stammer isolert fra jordbunn eller vann. En slik fremgangsmåte er beskrevet i US patentskrift nr. 4.493.895 hvor det er krevet en fremgangsmåte for mikrobiell nedbrytning av forurensende, halogenerte, aromatiske forbindelser til ufarlige stoffer. Denne fremgangsmåten omfatter trinnene med (1) oppsamling av en prøve av stoff fra stedet forurenset med utålelige kjemikalier, (2) anrikning av mikroorganismene funnet levende i prøven, (3) separasjon av stammene av mikroorganismer som kan ha forskjellige metabolismer for de forskjellige kjemikalier i prøven fra stedet, fra hverandre, (4) rensing av stammene med evne til biologisk nedbrytning av kjemikaliene som man skal bli kvitt, (5) tilførsel av stammen til stedet for kontaminantene som man skal bli kvitt, og (6) overvåk-ning av fjerning av kontaminantene på stedet for anvendelsen.

I.US patentskrift nr. 4.477.570 er det beskrevet og krevet

de mikroorganismer som er brukt ved den ovenfor beskrevne, krevede fremgangsmåte ifølge US patentskrift nr. 4.493.895.

En annen fremgangsmåte er beskrevet i US patentskrift nr. 4.6 64.805 hvor det kreves en fremgangsmåte for dekonta-minering av miljøer med halogenerte organiske forbindelser ved bruk av (1) mikroorganismer som naturlig tilhører miljøet som skal dekontamineres, og som kan metabolisere, men ikke kan vokse på kontaminanten, (2) et inokulum av mikroorganismer som ikke er hjemmehørende i miljøet, men som metaboliserer kontaminanten hurtigere enn de hjemmehørende mikroorganismer, men som ikke kan vokse på det, og (3) en ikke-giftig analog av kontaminanten som tjener som et substrat for vekst av de opprinnelig hjemmehørende og ikke-opprinnelig hjemmehørende mikroorganismer. Man setter sin lit til mikroorganismer som allerede er til stede i miljøet, såkalt opprinnelig hjemmehørende mikroorganismer, for utførelse av nedbrytningen. Nedbrytningen fremmes ved hjelp av den ikke-opprinnelig hjemmehørende mikroorganisme.

Nok en annen fremgangsmåte beskrevet i US patentskrift nr. 4.511.657, omfatter en fremgangsmåte for behandling av utvaskinger fra landfylling med kjemisk avfall med aktivert slam inneholdende bakterier med evne til å metabolisere skadelige organiske forbindelser som er til stede i utvaskingene. Alle de ovenfor beskrevne fremgangsmåter omfatter bruken av mikroorganismer som er opprinnelig hjemme-hørende i eller isolert fra forurenset jordbunn eller utvaskinger. Nedbrytningsenzymene som trengs for at mikroorganismer skal bryte ned halogenerte organiske forbindelser,, kan kodes for av gener båret på plasmider. Et enkelt plasmid inneholder vanligvis gener som koder for enzymer i en enkel nedbrytende reaksjonsvei. Plasmider er blitt anvendt ved fremgangsmåter for den biologiske nedbrytning av visse klorerte aromatiske organiske forbindelser, slik som vist i

US patentskrift nr. 4.535.061 (som beskriver plasmid-assisterte formeringsfremgangsmåter for å frembringe rene og blandede kulturer av mikroorganismer med evne til dissimiler-ing av miljømessig standhaftige kjemiske forbindelser) og US patentskrift nr. 4.664.805 omtalt ovenfor.

Under anvendelse av plasmider fra mikroorganismer som bryter ned halogenerte aromatiske organiske forbindelser (A.T.C.C. 31939-31945) (mikroorganismer som ble beskrevet i US patentskrifter nr. 4.477.570 og 4.493.895), beskriver europeisk patentsøknad nr. 8511008.1 fremstillingen av hybrid-plasmider og transkonjugater inneholdende disse plasmider. Europeisk patentsøknad nr. 8511008.1 beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av en mikroorganisme med spesifisitet for biologisk nedbrytning av halogenerte organiske forbindelser som omfatter de følgende trinn: (1) adskilt dyrking og opprettholdelse av (a) en bredspektret mikroorganisme valgt fra gruppen ATCC 31945, ATCC 31941, ATCC 31942, ATCC 31940, ATCC 31943, ATCC 31944, ATCC 31939 og mutanter derav, og (b) en vektor med et bredt vertområde; (2) separat isolering av plasmid-DNA fra (a) og (b) ovenfor; (3) separat rensing av plasmid-DNA fra (a) og (b) ovenfor; (4) separat enzymatisk begrensning av den rensede DNA fra (a) og (b) ovenfor; (5) kombinering av produktene fra trinn (4) og enzymatisk ligering av de kombinerte produkter; (6) transformasjon av ligeringsproduktene inn i en mottakelig mikroorganisme, slik som E. coli eller arter av Pseudomonas; (7) utvelgelse av de transformanter som har den ønskede plasmid-DNA innføyet i vektoren; (8) konjugering av den utvalgte plasmid-DNA i en mottakelig vert valgt fra gruppen av Pseudomonas, Klebsiella, Rhizobium, Agrobacterium og Escherichia ved hjelp av et hjelper-plasmid; og (9) utvelgelse av de transkonjugater som har den ønskede plasmid-DNA.

Elleve transkonjugater ble beskrevet, og uventet ble de fleste transkonjugatene funnet å utnytte som sin eneste carbonkilde visse alifatiske halogenerte organiske forbindelser, nærmere bestemt tetraklorethylen, ethylendiklorid, methylkloroform og TCE, mens forløpermikroorganismene A.T.C.C. 31939-31945 benyttet bare et bredt spektrum av aromatiske organiske forbindelser som beskrevet i US patentskrift nr. 4.493.895. Den eneste analyse med hensyn på utnyttelse av disse alifatiske halogenerte organiske forbindelser var dyrking på medium inneholdende forbindelsen hvor veksten var en halv gang større enn gjennomsnittsveksten. Bortsett fra denne vekstanalyse er transkonjugatene fullstendig ukarak-teriserte. Særlig er ingenting beskrevet om utstrekningen av nedbrytning av disse alifatiske halogenerte organiske forbindelser ved hjelp av disse mikroorganismene, eller om egenskapene og toksisiteten til de metabolske produkter. Ingenting er antydet eller beskrevet med hensyn til hvilke gener, gensegmenter, enzymer, proteiner eller proteinprodukter som er involvert i transkonjugatenes evne til å metabolisere slike alifatiske halogenerte organiske forbindelser, inkludert TCE. Særlig er beskrivelsen i europeisk patentsøknad 851008.1 begrenset til utnyttelse av alifatiske halogenerte organiske forbindelser, inkludert TCE, ved hjelp av plasmider valgt fra gruppen av mikroorganismer betegnet som A.T.C.C. 31939-31945.

Med hensyn til TCE-metabolisme spesielt, er delvis nedbrytning av TCE ved hjelp av anaerobe organismer blitt rapportert, men metabolitter fra nedbrytningsprosessen omfatter vinylklorid og diklorethylen som er like skadelige som grunnvannkontaminanter. Kleopfer et al., Environ. Sei. Technol., 19:277-280 (1985); Parsons et al., J. Am. Water Works Assoc, 21:56~59 (1984); Vogel & McCarty, Appl. Environ. Microbiol., £9:1080-1083 (1985). En nyere rapport beskriver et naturlig forekommende bakterieisolat som har evne til å bryte ned TCE under aerobe betingelser. Nelson et al.,

Appl. Environ. Microbiol., _52:383-384 (1986); Nelson et al., Appl. Environ. Microbiol., 52:949-954 (1986). Mikroorgan-ismen betegnet stamme G4, krever fenol, toluen, o-cresol eller m-cresol for TCE-nedbrytning. Stamme G4, slik den er beskrevet, (1) benytter ikke TOL-reaksjonsveien for toluen-nedbrytning; (2) synes ikke å ha enzymet toluendioxygenase, det første enzym i TOD-reaksjonsveien for toluennedbrytning, og (3) utnytter ikke TMO-reaksjonsveien for toluennedbrytning. Nelson et al. beskriver ikke hvilke gener, gensegmenter, enzymer, proteiner eller proteinprodukter som er involvert i stamme G4's evne til å bryte ned TCE, eller hvorvidt de involverte gener er plasmid-kodet eller kromosomalt kodet. Genetisk konstruksjon av stamme G4 er ikke blitt rapportert. Senere har Nelson et al., Appl. Environ. Microbiol., .54:604-606 (1988) testet den TCE-nedbrytende evne til 6 mikro-organismes tammer som kan bryte ned nafthaien, bifenyl, fenol og toluen. Bare 2 av de testede stammer, Pseudomonas putida PpFl (PpFl) og Pseudomonas putida B5 (B5), brøt ned TCE.

PpFl og B5 er toluen-nedbrytende stammer, en tredje toluen-nedbrytende stamme Pseudomonas putida mt-2 (Pp mt-2) brøt imidlertid ikke ned TCE. Det synes således som om ikke alle toluen-nedbrytende stammer er i stand til å bryte ned TCE.

Pp mt-2 som Nelson et al., supra, fant ikke kunne bryte ned TCE, inneholder pWWO-plasmidet, et plasmid som koder for enzymer i den toluen-nedbrytende reaksjonsvei kjent som TOL. PpFl, som Nelson et al., supra, fant kunne bryte ned TCE, er kjent for å inneholde enzymer i den toluen-nedbrytende reaksjonsvei kjent som TOD. Wackett og Gibson, Appl. Environ. Microbiol., 5_4:1703-1708 (1988), har også nylig vist at PpFl-celler har evne til å bryte ned TCE.

Under deres dyrknings- og analysebetingelser fant Wackett og Gibson, supra, at omtrent 50% - 60% av tilført TCE (20 )jM)

ble brutt ned. I motsetning til dette kunne ikke noen TCE-nedbrytning bli påvist ved høye TCE-konsentrasjoner (320 yM). Den høyeste TCE-nedbrytningshastighet som de observerte,

var 1,8 nanomol pr. minutt pr. milligram celleprotein.

Genene for TOD-reaksjonsveien til PpFl er kodet kromosomalt i motsetning til de plasmid-kodede TOL-reaksjonsvei-genene til Pp mt-2. Det er således ikke mulig å forutsi hvorvidt gener involvert i TCE-nedbrytning er kromosomalt kodet eller plasmid-kodet. Undersøkelser av Nelson et al., supra, og Wackett og Gibson, supra, med mutanter av PpFl som er defekte med hensyn på forskjellige komponenter i den TOD-toluen-nedbrytende reaksjonsvei, tyder på at evnen til PpFl når det gjelder å bryte ned TCE, er forbundet med toluen-dioxygenaseenzymaktivitet, som er det første enzym i den kromosomalt kodede TOD-reaksjonsvei. Undersøkelser av Nelson et al., supra, med Pp mt-2 viste at TCE-nedbrytende evne ikke er forbundet med noen enzymer i den plasmid-kodede TOL-reaksjonsvei.

Ingen av mikroorganismene som er blitt testet hittil med hensyn på TCE-nedbrytende evne, benytter den plasmid-kodede TMO-reaksjonsvei for toluen-nedbrytning. I tillegg har ingen mikroorganisme hittil blitt genetisk konstruert for å øke enzymaktivitet og TCE-nedbrytende evne. Bruken av hvilket som helst av de ovenfor beskrevne mikroorganisme-systemer for nedbrytning av TCE har dessuten flere til-knyttede problemer. Et første problem er at for å bryte ned TCE må en nedbrytende enzym-reaksjonsvei (f.eks. TOD-reaksjonsveien) induseres i mikroorganismene, og induksjons-midlene som må tilsettes den TCE-forurensede prøve, er hydrocarboner. Et annet problem er at ettersom TCE (et substrat for de induserte nedbrytende enzymer) selv ikke kan brukes av disse mikroorganismene som en carbonkilde for cellevekst, må celler tilveiebringes med et annet substrat (et cosubstrat) for vekst. Slike cosubstrater tilsatt til den TCE-forurensede prøve, er hydrocarboner, slik som toluen. Disse to problemene står i forbindelse med det praktiske problem at for å bryte ned TCE i en forurenset prøve, slik som et vannførende lag, er det ikke ønskelig å måtte tilsette hydrocarboner, slik som toluen (som induksjonsmiddel og/eller carbonkilde), ettersom hydrocarboner på samme måte som toluen selv er miljømessig giftige forbindelser. Et tredje problem som er nært beslektet med de to første, er at i de ovenfor beskrevne systemer hvor et hydrocarbon,

slik som toluen, virker som induksjonsmidlet til og sub-stratet for de nedbrytende reaksjonsveienzymer (enzymer som både metaboliserer hydrocarbonet og bryter ned TCE), er det en konkurranse mellom hydrocarbonet og TCE om det samme

enzymsystem. Under betingelser hvor hydrocarbonkonsentra-sjonen er mye større enn TCE-konsentrasjonen, vil hydrocarbonet konkurrere mer effektivt om enzymsystemet og for-sinke TCE-nedbrytning. Disse tre problemene illustrerer forskjellige aspekter ved det som kalles cosubstratproblemet som oppstår i de tidligere beskrevne induserbare enzymsystemer for TCE-nedbrytning.

Oppsummering av oppfinnelsen

Det er nå uventet funnet at PmKRl og genetisk konstruerte mikroorganismer som inneholder PmKRl-toluenmonooxygenasegener, har evnen til å bryte ned TCE. Følgelig er PmKRl og mikroorganismevertceller som inneholder PmKRl-toluenmonooxygenasegener, anvendbare ved fremgangsmåten for nedbrytning av TCE.

Foreliggende oppfinnelse omfatter således en ny fremgangsmåte for nedbrytning av TCE under anvendelse av disse mikroorganismene som inneholder PmKRl-toluenmonooxygenasegener. Særlig omfatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for nedbrytning av TCE under anvendelse av genetisk konstruerte mikroorganismer som er blitt utviklet, og som har utmerket evne til å bryte ned en bestemt kjemisk kontaminant, slik som TCE, til ufarlige materialer.

Et av formålene ved foreliggende oppfinnelse er følgelig å tilveiebringe en fremgangsmåte for nedbrytning av TCE uansett hvor det måtte fremkomme som en kontaminant eller et forurensende middel.

Et annet formål ved foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for den mikrobielle nedbrytning av TCE uansett hvor det måtte være ønskelig, f.eks.

som et middel for å renske opp lukkede og åpne vannmasser, uttømminger av avløpsvann fra industrien, offentlige, kommersielle eller industrielle installasjoner og fabrikker, eller forskjellige laboratorieoperasjoner, og i andre situa-sjoner hvor TCE kan bli akkumulert. Særlig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en forbedret fremgangsmåte for

nedbrytning av TCE under anvendelse av de genetisk konstruerte TCE-nedbrytende mikroorganismer ifølge foreliggende oppfinnelse når TCE er blitt fjernet fra forurensede vannmasser (f.eks. ved luft-stripping).

Et ytterligere formål ved oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for å bryte ned TCE lettvint, effektivt og forholdsvis økonomisk.

Nok et ytterligere formål ved oppfinnelsen er å tilveiebringe mikroorganismer som inneholder rekombinante plasmider med toluenmonooxygenasegener fra PmKRl som koder for enzymer som er i stand til å bryte ned TCE, idet en ikke-giftig cellemasse etterlates, hvor mikroorganismene er ikke-patogene for mennesker, dyr eller marin fauna og flora.

Nok et annet formål ved oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for nedbrytning av TCE hvor mikroorganismevertcellen som inneholder det rekombinante plasmid med toluenmonooxygenasegenene fra PmKRl, og som er i stand til å bryte ned TCE, kan tilføres direkte til stedet for TCE-forurensning.

Et ytterligere formål ved oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for å bryte ned TCE under anvendelse av genetisk konstruerte mikroorganismer med PmKRl-toluenmonooxygenasegener hvor genene er plassert under kontroll av forskjellige promoterer, og som resulterer i forøkt ekspresjon av toluenmonooxygenaseaktivitet og forøkt nedbrytning av TCE under bestemte celledyrknings- og analysebetingelser.

Et annet formål ved oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for nedbrytning av TCE under anvendelse av genetisk konstruerte mikroorganismer med PmKRl-toluenmonooxygenasegener hvor genene er plassert under kontroll av promotersystemer som ikke induseres av hydrocarboner, slik som toluen, for derved å løse cosubstratproblemet som tidligere beskrevne induserbare enzymsystemer for TCE-nedbrytning byr på. Fordeler ved bruken av genetisk konstruerte mikroorganismer ved foreliggende oppfinnelse omfatter således: elimineringen av et hydrocarbon, slik som toluen, som induksjonsmiddel; elimineringen av et hydrocarbon, slik som toluen, som cosubstrat for det nedbrytende enzymsystem; og elimineringen av konkurrerende hemming av TCE-nedbrytning ved hjelp av hydrocarboncosubstratet/induksjonsmidlet.

Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for mikrobiell nedbrytning av TCE, kjennetegnet ved at triklorethylen behandles med en mikroorganismevert valgt fra gruppen bestående av E. coil JM109, JM83, HB101 og FM5, hvor mikroorgan-ismeverten inneholder et rekombinant plasmid som er i stand til å uttrykke toluenmonooksygenasegener fra Pseudomonas mendocina KR-1, og ekspresjonen av de nevnte gener styres av et induksjonsmiddel. Videre tilveiebringer oppfinnelsen anvendelse av fremgangsmåten ifølge kravene 1-4 til nedbrytning av TCE i kjemisk avfall.

Fordelen ved foreliggende oppfinnelse i ett av dens aspekter er at det gjøres bruk av genetisk konstruerte mikroorganismer med godt karakteriserte, klonede gener med ekspresjon som er under kontroll av svært godt karakteriserte og lett regulerte promoterer, slik at disse genetisk konstruerte mikroorganismer har evne til effektivt å bryte ned TCE. I tillegg kan disse genetisk konstruerte mikroorganismer hurtig og billig dyrkes til svært høye celletettheter med den moderne fermentasjonsteknologi som »er blitt utviklet for stammer av E. coli, i motsetning til vanskeligheten med å dyrke naturlige isolater, slik som PmKRl-cellene. Dessuten kan disse genetisk konstruerte mikroorganismer opprett-holde TCE-nedbrytning i tidsrom på mer enn 12 timer i nærvær av lave konsentrasjoner av glucose. En ytterligere fordel ved å bruke disse rekombinante mikroorganismene er at de er i stand til å bryte ned TCE til svært lave nivåer i kraft av det faktum at metabolisme ikke lengre krever tilstedeværelsen av aromatiske hydrocarboner (slik som toluen) i mediet, slik det er påkrevet ved PmKRl-cellene.

De genetisk konstruerte mikroorganismer kan tilføres direkte til det TCE-holdige miljø som skal dekontamineres. Alternativt kan enzymprodukter av de klonede gener brukes til å bryte ned TCE istedenfor de genetisk konstruerte mikroorganismer på steder med TCE-holdig kjemisk avfall. Fremskyndelse av dekontaminasjonshastigheten skriver seg fra bruken av slike genetisk konstruerte mikroorganismer med induserbare gener for nedbrytningen av TCE.

Disse og andre formål og fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil fremgå klart for fagfolk innen teknikken fra en betraktning av den følgende nærmere beskrivelse og kravene.

Kort beskrivelse av tegningene

I de ledsagende tegninger er det tilveiebrakt

8 figurer som nedenfor vil bli nærmere beskrevet, og som illustrerer oppfinnelsen, hvor: Figur 1 er en grafisk fremstilling som viser bortfall av 10 yM (1,3 ppm) TCE tilsatt til celler testet med hensyn på TCE-nedbrytende evne som skyldes metabolismen av TCE ved hjelp av cellene til ikke-flyktig materiale som en funksjon av tiden. Testede celler var Pseudomonas mendocina KR-1 (PmKRl), Pseudomonas putida Fl (PpFl) og Pseudomonas putida Y2101 (Pp Y2101). Figur 2 er en grafisk fremstilling som viser effekten av å tilsette toluen på tidspunktet for TCE-tilsetning på bortfallet av 20 yM (2,6 ppm) TCE tilsatt til celler testet med hensyn på TCE-nedbrytende evne som skyldes metabolismen av TCE til ikke-flyktig materiale som en funksjon av tiden. Testede celler var: (1) PmKRl med og uten toluen tilsatt på tidspunktet for TCE-tilsetning, og (2) PmY4001. Figur 3 er en grafisk fremstilling som viser bortfall av 50 yM (6,5 ppm) TCE tilsatt til celler testet med hensyn på TCE-nedbrytende evne som skyldes metabolismen av TCE til ikke-flyktig materiale, som funksjon av tiden. Testede celler var: (1) E. coli HB101 inneholdende rekombinant plasmid pMY402 (HBl01/pMY402) under betingelser hvor cellene var blitt indusert med IPTG før og under analysen (kontrollceller ble ikke indusert med IPTG), og (2) E. coli FM5-celler inneholdende rekombinant plasmid pKY287

(FM5/pKY287) hvor cellene var blitt indusert med en økning

i temperatur (kontrollceller var FM5-celler inneholdende plasmidvektoren pCFMH46) . Figur 4 er en grafisk fremstilling som viser bortfallet av TCE som var tilsatt cellene i varierende konsentrasjoner, på grunn av metabolisme av TCE til ikke-flyktig materiale, som funksjon av tiden, ved hjelp av HBlOl-celler som inneholder pMY402 rekombinantplasmidet. Figur 5 er en grafisk fremstilling som viser en HPLC-14

elueringsprofil for C-metabolitter som er til stede i

14

cellemediet etter nedbrytning av C-TCE ved hjelp av PmKRl-celler (kontrollceller var PmY4001-celler).

Figur 6 er en lignende grafisk fremstilling som

14

figur 5, men hvor nedbrytningen av C-TCE skjedde ved hjelp av FM5/pKY287-celler (kontrollceller var FM5/pCFM 1146-celler).

Figur 7 er en grafisk fremstilling som viser bortfallet av 20 yM (2,6 ppm) TCE som var tilsatt til celler,

på grunn av metabolismen av TCE til ikke-flyktig materiale, som funksjon av tiden, for å sammenligne hastigheten ved og omfanget av TCE-nedbrytning ved hjelp av villtype PmKRl-celler og ved hjelp av HBlOl-celler som inneholder pMY402-rekombinantplasmidet (HB10l/pMY402).

Figur 8 er en lignende grafisk fremstilling som figur 7, men hvor 50 yM (6,5 ppm) TCE ble brukt istedenfor 20 yM (2,6 ppm) TCE som i figur 7. I tillegg omfatter den resultater med E. coli FM5-celler inneholdende rekombinant-plasmid pKY287 (FM5/pKY287) for å sammenligne hastigheten og omfanget av TCE-nedbrytning ved hjelp av villtype PmKRl-, HB101/pMY402- og FM5/pKY287-celler.

Nærmere beskrivelse av de foretrukne utførelsesformer

Som angitt ovenfor, er TCE et viktig industrielt oppløsningsmiddel og er funnet å være utbredt i vandig miljø. Omtrent 234.000 tonn TCE produseres årlig i verden

(U.S. Environmental Protection Agency, 1980, EPA 440/5-80-077). TCE er svært gjenstridig og kan være svært

vanskelig å fjerne når det først er til stede i miljøet.

For tiden er lite kjent om den mikrobielle metabolisme av TCE. Isolerte og klonede gener, slik som PmKRl-toluenmonooxygenasegenene som brukes ifølge foreliggende oppfinnelse, burde muliggjøre belysning av en nærmere forståelse av en unik type mikrobiell TCE-metabolisme. I tillegg kan de klonede genene manipuleres f.eks. ved å kombinere genene med forskjellige promoterer for å øke ekspresjon av enzymproduktene, for igjen å øke hastigheten og omfanget av nedbrytning av TCE. Som illustrert ved foreliggende oppfinnelse, kan bruken av visse promotersystemer under visse celledyrknings- og analysebetingelser øke ekspresjon av toluenmonooxygenasegen-produkter og kan resultere i fremskyndelse av hastigheten for TCE-nedbrytning ved hjelp av mikroorganismer som inneholder disse klonede gener.

Utvikling av genetisk konstruerte mikroorganismer

som har utmerket evne til å bryte ned bestemte kjemiske kontaminanter, slik som TCE, til ufarlige materialer, er én viktig strategi ved utviklingen av kostnadseffektive og miljømessig sunne metoder for opprensking av farlig kjemisk avfall. Utviklingen og bruken av mikroorganismevertceller med rekombinante plasmider som inneholder toluenmonooxygenasegener fra PmKRl ved foreliggende oppfinnelse, er en ny og nyttig fremgangsmåte som kan anvendes ved opprensking av TCE-holdig kjemisk avfall. Disse genetisk konstruerte mikroorganismevertceller er særlig anvendbare ved en forbedret fremgangsmåte for å bryte ned TCE når TCE er blitt fjernet fra forurensede vannmasser (f.eks. ved luft-stripping).

Disse genetisk konstruerte mikroorganismevertceller med PmKRl-toluenmonooxygenasegener er blitt fullstendig beskrevet i US patentsøknad nr. 177.631.

Det er også ment at enzymproduktene av toluenmonooxygenasegenene kan brukes til å bryte ned TCE istedenfor å bruke mikroorganismevertcellene som inneholder rekombinante plasmider med toluenmonooxygenasegener til å bryte ned TCE. Enzymproduktene kan tilføres direkte til steder med TCE-holdig kjemisk avfall.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte som kan brukes til å bryte ned TCE på hvilke som helst steder det måtte fremkomme som en kontaminant eller et forurensende middel. Med fremgangsmåten blir det således mulig å renske opp og bryte ned TCE på steder med TCE-holdig kjemisk avfall funnet i vann eller jordbunn.

Eksemplene nedenfor er kun gjengitt som illustrerende for foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

Bakteriestammer og - dyrkning

Bakteriestammene angitt nedenunder, er beskrevet i

US patentsøknad nr. 177.631. Særlig er konstruksjonen av

og egenskapene til de genetisk konstruerte mikroorganismevertceller som omfatter plasmider, vektorer, gener og gensegmenter, beskrevet i den ovenfor angitte søknad. De følg-ende bakteriestammer ble dyrket over natten ved 30°C i PAS-medium (Chakrabarty et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 20:1137-1140, 1973) supplert med de følgende dyrkningssubstrater og induksjonsmidler: PmKRl, toluen (tilført som damp) for dyrkning og induksjon av toluen-nedbrytende enzymer, eller 0,2% glucose for dyrkning; Pseudomonas putida Fl (PpFl), toluen (tilført som damp) for dyrkning og induksjon av toluen-nedbrytende enzymer, eller 0,2% glucose for dyrkning; Pseudomonas putida KT2440 (KT2440), 0,2% L-glutamat for dyrkning; Pseudomonas putida KT2440 inneholdende plasmid pND50 (KT2440/pND50), 2,5 mM p-cresol (fortynnet 1000 ganger fra en konsentrert standardoppløsning i dimethylformamid) for dyrkning og induksjon av p-cresol-nedbrytende enzymer; Pseudomonas putida KT2440 inneholdende plasmid pAUT 1 (KT2440/pAUTl), toluen (tilført som damp) for dyrkning og induksjon av toluen-nedbrytende enzymer; Pseudomonas mendocina Y4001 (PmY400l), 2,5 mM p-cresol for dyrkning og induksjon

av p-cresol-nedbrytende enzymer; E. coli stamme HB101 inneholdende rekombinante plasmider pKY277, pMY402 eller plasmidvektor pMMB66EH (hhv. HBl01/pKY277, HBl01/pMY402 og

HBlOl/pMMB6 6EH), 0,2% L-glutamat eller 0,2% glucose, 0,2% casaminosyrer og 2 ug/ml vitamin Bl for dyrkning, 250 yg/ml ampicillin for plasmidopprettholdelse og 1 mM isopropyl-8-D-thiogalactosid (IPTG) for induksjon av toluenmonooxygenasesyntese; KT2440 inneholdende rekombinant plasmid pMY402 (KT2440/pMY402), 0,2% L-glutamat for dyrkning, 1 mg/ml ampicillin for plasmidopprettholdelse og 5 mM IPTG for induksjon av toluenmonooxygenasesyntese; E. coli FM5 inneholdende rekombinant plasmid pKY287 eller plasmidvektor pCFM1146

(hhv. FM5/pKY287 og FM5/pCFM1146), 0,2% glucose og 0,05% gjærekstrakt for dyrkning, 50 ug/ml kanamycin for plasmidopprettholdelse og for FM5/pKY287 en temperaturendring i kulturen til 42°C i 2 timer og så tilbakevending til 30°C i 2 timer for induksjon av toluenmonooxygenasesyntese. Celler ble dyrket til minst en 0D5^Q som er lik med 0,5, som svarer til ca. 3 x 10<8> CFU/ml.

I tillegg til de ovenfor angitte stammer ble flere nyisolerte stammer betegnet El, E2, E4, E5, E7 og E9 som utnytter ethylbenzen eller toluen som carbonkilde for vekst, dyrket og testet med hensyn på TCE-nedbrytende evne. Ethylbenzen-utnyttende stammer ble isolert på følgende måte.

Syv prøver (nummerert 1-7) ble erholdt fra "LaBrea Tarpit" og ni prøver (nummerert 1-9) fra "Thousand Oaks Sewage Treatment Plant". En aliquot av 1 ml fra hver prøve ble inokulert i 50 ml PAS-medium supplert med ethylbenzen til-ført som damp fra 0,2 ml ethylbenzen, og kulturene ble dyrket ved 25°C i 5 dager. Kulturer nummerert 1, 4, 5 og 9 fra "Thousand Oaks Sewage Treatment Plant" og kulturer nummerert 2 og 7 fra "LaBrea Tarpit" ble dyrket til metning (ingen vekst ble erholdt fra andre kulturer). En aliquot av 1 ml ble tatt fra kulturene 1, 2, 4, 5, 7 og 9, og hver aliquot ble inokulert med 50 ml PAS-medium supplert med ethylbenzen tilført som damp som beskrevet ovenfor. Disse 50 ml kulturer fikk vokse over natten ved 25°C. En prøve fra hver kultur ble strøket ut på en PAS-ethylbenzen-plate to ganger for enkle kolonier. De rensede kolonier fra hver prøve ble betegnet El, E2, E4, E5, E7 og E9. Disse naturlige bairterie-isolater som utnytter ethylbenzen, ble også funnet å vokse på toluen og ble dyrket over natten ved 30°C i PAS-medium supplert med de følgende dyrkningssubstrater og induksjonsmidler: 0,2% L-glutamat for dyrkning, 1 mM toluen for induksjon av toluen-nedbrytende enzymer. Celler ble dyrket som beskrevet for andre stammer angitt ovenfor, inntil minst OD550 lik med 0,5.

Eksempel 2

Radioaktivitetanalyse med hensyn på TCE- nedbrytning

Dette eksemplet beskriver en radioaktivitetanalyse

som måler fremkomsten av ikke-flyktige metabolitter av TCE. Bakteriestammer brukt i denne analyse, ble dyrket som i eksempel 1. Om nødvendig, ble cellene fortynnet med PAS-medium til en ODj- cr) på 0,5 for analysen. Til 4 ml cellesuspensjon

14

i en 50 ml serumampulle ble det tilsatt TCE (1,2- C, 72 mCi pr. mmol) til 5 yM sluttkonsentrasjon. Oppløsningen av 14 C-TCE ble fremstilt ved a blande radioaktiv og ikke-radioaktiv TCE, hvorved man fikk en 5 mM oppløsning i dimethylformamid ved ca. 1 x 10 tellinger pr. minutt pr. yl. Fire yl oppløsning ble tilsatt til hver 4 ml cellesuspensjon, serum-ampullen ble lukket med en teflonbelagt gummiskillevegg og et metall-krympelokk, vortex-behandlet og inkubert med rysting ved 30°C. Ved tid null og ved 30 minutters mellomrom deretter ble ca. 100 yl av cellesuspensjonen tatt ut ved å bruke en nål og sprøyte, og 20 yl av denne ble flekket ut på et lite avsnitt av en Whatman silicagel-tynnskiktkromatografi-plate, lufttørket i 15 minutter og tellet i en Beckman LS-100 scintillasjonsteller under anvendelse av "Biofluor" flytende scintillasjonsvæske. For tabell 1 ble data erholdt etter lufttørking omdannet til nanomol av TCE metabolisert til ikke-flyktig materiale ved å bruke 200 tellinger pr. minutt pr. picomol som den spesifikke aktivitet til den tilførte 14

C-TCE.

14

Tabell 1 oppsummerer omfanget av C-TCE-omdannelse til ikke-flyktig materiale i løpet av 2 timer som funksjon av induksjonsmiddel til stede under dyrkning over natten. I

14

disse forsøkene ble ca. 0,4 nanomol C-TCE ikke fordampet; dette utgjør en bakgrunn på ca. 2% av det tilførte <14>C-TCE.

Eksempel 3

Gasskromatografianalyse for TCE- nedbrytning

Dette eksemplet beskriver en gasskromatografianalyse som måler bortfall av flyktig TCE. Bakteriestammer brukt i denne analyse, ble dyrket som beskrevet i eksempel 1. Kulturer dyrket over natten, ble fortynnet (om nødvendig) til en 0D,-^0 på 0,5 i PAS-medium for analysen, og 4 ml cellekultur ble tilsatt til serumampuller. TCE (spektrofotometrisk finhetsgrad) ble fortynnet i N,N<*->dimethylformamid (DMF) (spektrofotometrisk finhetsgrad) til 10 mM eller 20 mM, og 4 yl tilsatt til cellesuspensjon, hvorved man fikk en slutt-TCE-konsentrasjon på 10 yM (1,3 ppm) (figur 1) eller 20 <y>M (2,6 ppm) (figur 2). Ampuller ble lukket, vortex-behandlet, og 10 yl av gassfasen ble fjernet ved å bruke en gasstett sprøyte på tidspunktene angitt i figurene. Gass-faseprøver ble analysert på en Hewlett-Packard 5890A gass-kromatograf utstyrt med en 25 meter 5% fenylmethylsilikon-kolonne og en 6 3Ni-elektronoppfangerdetektor. Injektor-, ovn- og detektortemperaturene var hhv. 120, 100 og 300°C. Bærergassen var helium, og tilsetningsgassen var 95% argon/5% methan. Topparealer ble beregnet ved hjelp av en Hewlett-Packard 3392A integrator. Data er gjengitt i figurene 1, 2 og 3 som prosenten av TCE som blir tilbake på forskjellige tidspunkter etter tilsetning til cellesuspensjonen. Mengden av TCE til stede ved tid null, er satt til å være 100%.

Figur 1 viser hastigheten av TCE-nedbrytning ved

10 yM (1,3 ppm) TCE for PmKRl, KT2440/pAUTl og PpFl. Nedbrytning skjer hurtig 1-2 timer etter TCE-tilsetning og avtar på senere tidspunkter. PmKRl utviser den høyeste aktivitet av de tre testede stammer. Figur 2 viser stimulering av TCE-nedbrytning ved hjelp av PmKRl-celler fordyrket i PAS-medium inneholdende toluen, når toluen er til stede på tidspunktet for TCE-tilsetning. PmKRl vil bryte ned mer enn 90% av opprinnelig tilstedeværende TCE ved 20 yM (2,6 ppm) når toluen er til stede som damp; bare omtrent 50% TCE brytes ned ved hjelp av PmKRl når toluen ikke er til stede på tidspunktet for TCE-tilsetning .

Figur 3 viser hastigheten for TCE-nedbrytning ved

20 yM (2,6 ppm) ved hjelp av HB101/pMY402-celler og FM5/pKY287-celler. Mer enn 95% av TCE er brutt ned etter

4 timer.

Eksempel 4

TCE- nedbrytning ved hjelp av naturlige bakterieisolater

Ethylbenzen- (og toluen-) utnyttende stammer isolert og dyrket som beskrevet i eksempel 1, ble analysert med hensyn på evne til å bryte ned TCE. TCE-nivåer ble analysert ved hjelp av gasskromatografi ifølge eksempel 3. TCE ble tilsatt til 20 yM (2,6 ppm). Resultatene er vist i tabell 2. Når det sammenlignes med villtype PmKRl-celler, var prosenten av TCE som var tilbake etter en 18-timers nedbrytningsperiode, 6-14 ganger større enn for villtype-PmKRl-celler, noe som tyder på at disse stammene var vesentlig mindre effektive enn villtype-PmKRl-celler med hensyn til evne til å bryte ned

TCE.

TCE-nivåer analysert ved hjelp av gasskromatografi ifølge eksempel 3. TCE tilsatt til 20 yM (2,6 ppm). I dette forsøk ble El-, E2-, E4-, E5-, E7- og E9-cellene dyrket på toluen som carbonkilde selv om disse cellene, som beskrevet i eksempel 1, opprinnelig ble utvalgt for dyrkning på ethylbenzen.

Eksempel 5

Effekt av høyere TCE- konsentrasjoner

Dette eksemplet beskriver nedbrytningen av økende TCE-konsentrasjoner ved hjelp av rekombinante celler ifølge foreliggende oppfinnelse. Bakterieceller .i denne analyse ble dyrket som i eksempel 1, bortsett fra at 0,5% gjærekstrakt erstattet casaminosyrer og vitamin Bl i dyrkningsmediet. Analysen var gasskromatografianalysen for TCE-nedbrytning beskrevet i eksempel 3. Figur 4 viser bortfallet av TCE tilsatt til cellene i varierende konsentrasjoner fra gassfasen på grunn av metabolismen av TCE til ikke-flyktig materiale som funksjon av tiden, ved hjelp av HBlOl-celler som inneholder pMY402-rekombinantplasmidet (pMMB66EH-plasmidvektor med PmKRl-toluenmonooxygenasegener). De åpne ringer viser metabolismen av 20 uM (2,6 ppm) TCE, de igjenfylte firkanter viser metabolismen av 50 uM (6,5 ppm) TCE, de åpne trekanter viser metabolismen av 125 uM (16 ppm) TCE, de igjenfylte trekanter viser metabolismen av 310 uM (41 ppm) TCE, og de åpne firkanter viser metabolismen av 780 uM (100 ppm) TCE. Kon-troller ble utført for hver TCE-konsentrasjon under anvendelse av HBlOl-celler som inneholder pMY402-plasmid i fravær av induksjons-IPTG- eller -HBlOl-cellene som inneholder pMMB66EH-plasmidvektoren.

Figur 4 viser at HB101 inneholdende pMY402 indusert med IPTG, metaboliserer nesten 100% av TCE ved konsentrasjoner av TCE opp til nesten 20 ppm i løpet av 6 timer eller mindre. Ved 48 ppm TCE metaboliseres 75% i løpet av 8 timer. I tillegg viser figur 4 at økte hastigheter for TCE-nedbrytning oppstår ved økte konsentrasjoner av TCE.

Eksempel 6

TCE- nedbrytninqskinetikk

For å undersøke TCE-nedbrytningskinetikken ved hjelp av PmKRl-toluenmonooxygenasegenproduktene, ble PmKRl- og PmY4001-celler dyrket som i eksempel 1. For disse forsøkene ble i tillegg FM5/pKY287- og FM5/pCFM1146-celler dyrket på følgende måte: et inokulum av celler ble tilsatt til L-næringsvæske, og kulturen ble inkubert ved 30°C inntil cellene nådde en OD55Q på 0,5, så ble temperaturen endret til 42°C i 1,5 time for å muliggjøre enzyminduksjon og syntese, og så endret tilbake til 30°C i 4-6 timer for fortsatt vekst. Cellekulturene ble sentrifugert og på nytt oppslemmet i PAS-medium eller PAS-medium inneholdende 0,2% glucose.

For å bestemme TCE-nedbrytningskinetikken ble cellekulturene fortynnet med 0,1 M KPO^, pH 7,5, til en OD55Q som angitt i tabell 3 nedenfor. En del av de fortynnede celler ble spart for proteinanalyser som beskrevet nedenfor. TCE-nedbrytning ble analysert ved hjelp av gasskromatografi hovedsakelig i overensstemmelse med fremgangsmåten beskrevet i eksempel 3, bortsett fra at reaksjoner med 10 ml (istedenfor 4 ml) cellekultur ble utført i serumampuller, og 5-10 yl TCE

i DMF ble tilsatt til cellene ved sluttkonsentrasjonene angitt i tabell 3 nedenfor. Cellekulturene ble inkubert ved å ryste ved 30°C og på tidspunkt 0 og til forskjellige tider etter TCE-tilsetning, 10 yl gassfase ble tatt ut og analysert med hensyn på TCE-konsentrasjon som beskrevet i eksempel 3. Starthastigheter for TCE-nedbrytning ble beregnet ut fra mengden av TCE brutt ned under de første 20-30 minutter av reaksjonen, og er rapportert som nanomol pr. minutt pr. mg protein i tabell 3 nedenfor. De fleste kinetikkforsøk ble utført ved å bruke FM5/pKY287-celler, flere forsøk ble imidlertid utført under anvendelse av PmKRl-celler for å sammenligne hastighetene ved bruk av rekombinante celler med hastighetene ved bruk av villtypeceller. FM5/pCFMll46-celler ble brukt som kontrollceller for FM5/pKY287-celler, og PmY4001-celler ble brukt som kontrollceller for PmKRl-celler for å måle eventuelt tap av- TCE på grunn av utsiving fra ampullen eller på grunn av adsorpsjon til celler. Forsøkene viste at tap fra kontrollampuller vanligvis var mindre enn 5% etter en 1-times inkubasjon ved 30°C.

Totalt celleprotein kan analyseres ved hjelp av flere fremgangsmåter, inkludert fremgangsmåten til Bradford, Anal. Biochem. 22:248-254 (1976), kommersielt tilgjengelig som "Bio-Rad Protein Assay" (katalog nr. 500-0006). For å lyse celler og blottlegge celleprotein for reaksjon i protein-analysefremgangsmåten, ble natriumhydroxyd tilsatt til celle-suspensjoner inntil 0,1 N sluttkonsentrasjon, etterfulgt av inkubasjon ved 100°C i 30 minutter før analysefremgangsmåten. Bovint plasmaalbumin, behandlet med NaOH og varme som nettopp beskrevet, ble brukt som en proteinstandard i ana-lysef remgangsmåten. Hastighetene for TCE-nedbrytning ved hjelp av FM5/pKY287-celler ved forskjellige celletettheter (0D5^0 på 0,05 - 1,00) og forskjellige TCE-konsentrasjoner (1-40 UM, 0,13 - 5,2 ppm) er rapportert i tabell 3.

Ved forsøk med PmKRl-céller som var blitt indusert med toluen, var hastighetene for TCE-nedbrytning ved en 0°55q på 0,50 og ved en TCE-konsentrasjon på 5,0 uM og 20,0 UM,

hhv. 1,3 og 2,4 nmol/min/mg protein. Ved en 0D55<q> på <1,>0 og en TCE-konsentrasjon på 5,0 UM var hastigheten for TCE-nedbrytning ved hjelp av PmKRl-celler 2,7 nmol/min/mg protein. Disse resultatene indikerte at hastigheten for TCE-nedbrytning til villtype PmKRl-celler er minst sammenlignbar, og vanligvis er noe høyere enn, hastigheten til de rekombinante celler. Resultatene i tabell 3 viser også at de rekombinante FM5/pKY287-celler effektivt kan bryte ned TCE ved lav celletetthet (OD550 på 0,05 - 0,10) og ved lave TCE-konsentrasjoner (1 yM - 2,5 yM). Selv ved lave celletettheter kan

således disse cellene brukes ved en effektiv fremgangsmåte for TCE-nedbrytning.

Eksempel 7

14

Metabolisme av C- TCE

For å spore metabolismen av "^C-TCE ved hjelp av PmKRl-toluenmonooxygenasegenproduktene ble PmKRl-celler, PmY400l-celler og HBlOl-celler inneholdende pMY402, dyrket som i eksempel 1 og inkubert som beskrevet i avsnitt 1 i eksempel 2. Inkubasjon varte i 16-18 timer ved 30°C. Omdannelse av <14>C-TCE til <14>C02, <14>C i cellemasse og <14>C i dyrkningsmedium ble målt som beskrevet i Nelson et al., Appl. Environ. Micro. 5_3:949-954 (1987) og Spain og Nishino, Appl. Environ. Micro. 53_: 1010-1019 (1987).

I korte trekk ble mediet, etter inkubasjonsperioden, surgjort med 100 ul 2 N svovelsyre. <14>C02 ble blåst ut fra vannfasen ved å føre en luftledning inn i ampullen og boble luft i et tidsrom på 1 - 2 timer mens luften som inneholdt 14

C02 ble frigjort og styrt gjennom en annen ledning inn i

et rør inneholdende 5 ml IN natriumhydroxyd. Radioaktiviteten i 0,5 ml av natriumhydroxydoppløsningen ble bestemt,

og prosenten av <14>C som C0„ i prøven på 5 ml ble beregnet. Etter fjerning av 14C02 som nettopp beskrevet, ble en 1 ml aliquot av cellesuspensjonen fjernet og radioaktiviteten i cellesuspensjonen bestemt. Den gjenværende suspensjon av medium og celler ble fjernet fra ampullen, sentrifugert for å pelletere cellene, og supernatanten ble sendt gjennom et 0,2 u filter. Radioaktiviteten i en 50 ul aliquot av fil-

14

tratet ble bestemt, og prosenten av Ci mediet ble beregnet. Forskjellen mellom radioaktiviteten i cellesuspensjonen og filtratet ble fastsatt til å være radioaktiviteten som er

14

til stede i cellemassen. Alternativt ville C i cellemassen kunne telles direkte ved på nytt å oppslemme cellepelleten og telle en aliquot av de resuspenderte celler. Resultatene fra et representativt forsøk under anvendelse av PmKRl-, pmY4001- og HBl01/pMY402-celler er oppsummert i tabell 4.

I andre forsøk ble PmKRl-, PmY4001-, FM5/pKY287- og FM5/pCFM1146-celler dyrket som i eksempel 1, og så inkubert 14 14 med C-TCE. Reaksjonen med C-TCE ble utført som beskrevet ovenfor, bortsett fra at: (i) 14C02 ble blåst ut fra vannfasen og fanget opp i 20 ml 1 N natriumhydroxyd, og (ii) 1,2 ml 1 M BaCl9 ble tilsatt til 5 ml av de 20 ml natriumhydroxydoppløsning for å utfelle 14C0~. Den resul-terende utfelling ble analysert med hensyn på 14C sammen med en aliquot av supernatanten. Resultatene er oppsummert i 14 tabell 5. Nesten all C som var til stede i 1 N natrium-hydroxydoppløsningen, ble utfelt ved hjelp av BaCl-, noe som 14 14 bekrefter at den tilstedeværende C var CO^•

For nærmere å analysere hvilke metabolitter som var til stede i cellemediet, ble hver cellemediumfraksjon i tabell 5 behandlet på følgende måte. Tre dråper 45% KOH ble

14

tilsatt til de 10 ml cellemedium inneholdende C-merkede, vannoppløselige metabolitter for å bringe pH i oppløsningen til 11-12. Denne oppløsning ble lyofilisert i 16 - 18 timer til et sluttvolum på 0,4 - 0,6 ml med en 60 - 70% gjenvinn-14

ing av C-merket materiale. Det konsentrerte materiale ble analysert ved hjelp av høytrykksvæskekromatografi (HPLC) under anvendelse av en "Aminex" ioneutelukkelsekolonne og 0,01 N EjSO. som elueringsmiddel. Fraksjoner av 0,6 ml ble

14

samlet opp, og C i 0,2 ml av hver fraksjon ble bestemt som

14

vist i figurene 5 og 6. Identifikasjon av de C-merkede produkter ble bestemt ved å sammenligne HPLC-elueringstider med elueringstidene til umerkede standarder, som vist i figurene 5 og 6. De anvendte standarder var: monokloreddik-syre, dikloreddiksyre, glyoxylsyre og maursyre.

14

En oppsummering av de C-holdige metabolske produkter fra TCE-nedbrytning ved hjelp av PmKRl-celler (figur 5) og FM5/pKY287-celler (figur 6) er presentert i tabell 6.

Av det totale <14>C-TCE tilsatt til PmKRl- eller FM5/pKY287-14 cellene (legg merke til at omtrent 30-40% av det totale C ble funnet i cellemediumfraksjonen), ble ca. 3 - 5% av det

14

totale C identifisert som en klorert forbindelse, diklor-

14

eddiksyre. Resten av C-radioaktiviteten ble gjenvunnet som CC>2 (ca. 30 - 45%) , ufarlige cellebestanddeler i cellemassen (ca. 18 - 35%) eller i overveiende grad ikke-klorerte, vann-oppløselige bestanddeler.

Eksempel 8

Deklorering av TCE

Dette eksemplet beskriver en analyse som måler fri-givelsen av kloridioner fra TCE ved hjelp av PmKRl-celler eller mikroorganismevertceller som inneholder et rekombinant plasmid med PmKRl-toluenmonooxygenasegener.

PmKRl- og FM5/pKY287-celler ble dyrket og beskrevet

i eksempel 1. Etter celledyrkning ble bakteriekulturer sentrifugert ved 5.000 rpm i 5 minutter, dyrkningsmedium ble fjernet og pelleterte celler på nytt oppslemmet i 15 ml 0,1 M kaliumfosfat, pH 7,0, sentrifugert på nytt og på nytt oppslemmet i 15 ml 0,1 M kaliumfosfat, pH 7,0. Celler ble fortynnet i den samme buffer til OD,-^ lik med 0,8 og et sluttvolum på 10 ml. Til PmKRl-cellesuspensjonen ble det tilsatt toluen inntil 1 mM sluttkonsentrasjon. Til FM5/pKY287-cellesuspensjonen ble tilsatt glucose inntil 0,2% sluttkonsentrasjon og kanamycin inntil 50 ug/ml sluttkonsentrasjon. Ampuller ble gjenkapslet og TCE tilsatt ved hjelp av sprøyte til en sluttkonsentrasjon på 40 yM (5,2 ppm). Inkubasjon skjedde ved 30°C i 5 - 18 timer, og omfanget av TCE-nedbrytning ble bestemt ved hjelp av gasskromatografi.

Etter at den tilstedeværende TCE var brutt ned, ble celler sentrifugert i 5 minutter og supernatanter sendt gjennom et 0,2 yM filter. Kloridion-konsentrasjoner i supernatanter ble bestemt på et "Orion" EA 9 20 ionemeter, under anvendelse av en modell 94-17B kloridelektrode og en modell 90-02 referanseelektrode, begge fra Orion. En kali-breringskurve fra 20 yM KC1 til 200 yM KC1 i 0,1 M kalium-fosf at, pH 7,0, ble opprettet ved å tilsette aliquoter av KC1 til en bakgrunnskontrollprøve (PmKRl- eller FM5/pKY287-celler i 0,1 M KP04 uten noe TCE tilsatt). Kloridion-konsentras joner i prøver inneholdende TCE, ble bestemt fra

denne kurve.

Resultatene viste at 2,5 mol kloridion ble frigjort pr. mol TCE under anvendelse av induserte PmKRl-celler, og 2,7 mol kloridion ble frigjort pr. mol TCE under anvendelse av induserte FM5-celler inneholdende pKY287.

Eksempel 9

TCE- nedbrytende evne og toluenmonooxygenaseaktivitet

A. Toluenmonooxygenaseanalyse ved høye celletettheter og korrelasjon med TCE- nedbrytning

Til disse analysene ble celler dyrket i PAS-medium inneholdende 0,4% glutamat eller i L-næringsvæske inntil metning. FM5-cellene ble imidlertid dyrket som beskrevet i eksempel 6, bortsett fra at cellene ble indusert ved 42°C i 3 timer, og så ble temperaturen på nytt nedsatt til 30°C i 2 timer. Cellene ble på nytt oppslemmet i et passende volum av det samme medium inntil en 0Dgg0 på 3,0. En aliquot av cellene ble brukt til bestemmelse av totalt celleprotein som beskrevet i eksempel 6. En aliquot av 0,5 ml celler ble blandet med 4 umol p-cresol i 10 yl, og 15 nmol radioaktivt toluen (toluen-ring- 14C, 56,3 mCi/nmol) i 5 yl, og blandingen ble inkubert ved værelsetemperatur med vortex-behandling av og til i 20 minutter. Etter inkubasjon ble 20 yl av blandingen flekket ut på et lite stykke av en tynnskiktkromato-grafiplate, og platen ble lufttørket i 20 minutter. Den ikke-flyktige radioaktivitet som ble tilbake på filteret, ble sendt i en væskescintillasjonsteller og ble brukt til å beregne mengden av toluen-nedbrytningprodukt på platen og den spesifikke aktivitet til toluenmonooxygenase.

Tabell 7 oppsummerer resultatene fra den ovenfor beskrevne analyse ved høy celletetthet for flere forskjellige stammer som også ble testet med hensyn på TCE-nedbrytende evne. Tabell 7 angir også korrelasjonen mellom TCE-nedbrytende evne og toluenmonooxygenaseaktivitet (TMO-aktivitet). Tabell 7 viser særlig at under betingelser med høy celletetthet oppviser HBlOl-cellene som inneholder pMY402, og FM5-cellene som inneholder pKY287, nivåer av PmKRl-toluen-monooxygenaseenzymaktivitet som er omtrent 2-4 ganger høyere enn aktiviteten til villtype-PmKRl-celler. Disse samme to genetisk konstruerte vertceller utviser utmerkede evner til å bryte ned TCE, noe som fremgår av en mer lang-varig nedbrytningshastighet og en økt nedbrytningsmengde med høyere TCE-konsentrasjoner i forhold til villtype-PmKRl-celler. Dette er illustrert i figurene 7 og 8 for HBlOl-celler inneholdende pMY402 indusert med IPTG (åpne ringer) sammenlignet med villtype-PmKRl-celler (åpne trekanter), og i tillegg vist i figur 8 for FM5/pKY287-celler (lukkede firkanter). Økt enzymaktivitet under de ovenfor beskrevne betingelser korrelerer således med økt evne til å bryte ned TCE, slik som vist ved hjelp av figur 8 og tabell 7.

I tillegg til de plasmidene som er angitt i tabell 7 og som inneholder PmKRl-toluenmonooxygenasegener, ville andre plasmider som inneholder disse genene, inkludert pKY277, pKY280, pKY2 81, pKY282, pMY401 og pMY404, som beskrevet i US patentsøknad nr. 177.631, være egnet for TCE-nedbrytning.

B. Toluenmonooxygenaseanalyse ved lavere celletettheter og korrelasjon med TCE- nedbrytning

Celler ble dyrket som beskrevet i eksempel 6. Cellekulturene ble sentrifugert og på nytt oppslemmet i PAS-medium eller PAS-medium inneholdende 0,2% glucose til en 0D,-,-0 på 0,5. Toluenmonooxygenaseanalysen ble utført som beskrevet i del A ovenfor, bortsett fra at inkubasjonstiden

14

med C-toluenet var 5 minutter og ikke 20 minutter.

Tabell 8 oppsummerer resultatene av den ovenfor beskrevne analyse ved lavere celletettheter for stammer som også ble testet med hensyn på TCE-nedbrytende evne. Tabell 8 angir også korrelasjonen mellom TCE-nedbrytende evne og toluenmonooxygenaseaktivitet (TMO-aktivitet). I motsetning til de oppnådde resultater ved høyere celletettheter som vist i tabell 7, viser tabell 8 at under betingelser med lavere celletetthet utviser HBlOl-cellene som inneholder pMY402, og FM5-cellene som inneholder pKY287, nivåer av PmKRl-toluenmono-oxygenaseenzymaktivitet som er lavere enn nivåene til villtype PmKRl-celler.

Ved å konstruere PmKRl-toluenmonooxygenasegenene gentisk slik at de plasseres under kontroll av forskjellige promoterer, er økte ekspresjonsnivåer for PmKRl-toluenmono-oxygenasegenprodukter blitt oppnådd med en ledsagende økning i TCE-nedbrytende evne.

Under betingelser hvor PmKRl-celler inkuberes med minst et 40-gangers overskudd av toluen i forhold til TCE, er en forsinkelsestid på flere timer blitt observert før PmKRl-cellene begynner å bryte ned TCE (figur 7, åpne trekanter) . Dette skyldes at toluen og TCE er cosubstrater for PmKRl-toluenmonooxygenase, og at begge er i konkurranse med hensyn på de tilgjengelige PmKRl-toluenmonooxygenaseenzymer. Når toluen og TCE samtidig er til stede og toluen er til stede i overskuddskonsentrasjoner sammenlignet med TCE, vil PmKRl-celler derfor begynne å bryte ned TCE bare etter at toluenkonsentrasjonen er blitt betydelig redusert. Denne samme forsinkelsesperiode ses ikke når PmKRl-celler først induseres med toluen, og toluenet så fjernes før tilsetning av TCE (figur 2). Ved å klone PmKRl-toluenmonooxygenasegenene og plassere dem under kontroll av promoterer som ikke induseres av toluen, er det nylig beskrevne cosubstrat-problem blitt fjernet.

Det forventes at mange andre promotersystemer enn

de tolueninduserbare, IPTG-induserbare og temperatur-induserbare promoterer som her er beskrevet, vil være for-målstjenlige for økt toluenmonooxygenaseekspresjon og derved økt TCE-nedbrytning. Videre forventes det at mange andre typer plasmidvektorer og mikroorganismevertceller vil være egnet for PmKRl-toluenmonooxygenaseekspresjon og TCE-nedbrytning.

Claims

1. Fremgangsmåte for mikrobiell nedbrytning av triklorethylen, karakterisert ved at triklorethylen behandles med en mikroorganismevert valgt fra gruppen bestående av E. coli JM109, JM83, HB101 og FM5, hvor mikroorganisme-verten inneholder et rekombinant plasmid som er i stand til å uttrykke toluenmonooksygenasegener fra Pseudomonas mendocina KR-1, og ekspresjonen av de nevnte gener styres av et induksjonsmiddel.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det rekombinante plasmid er valgt fra gruppen bestående av pKY277, pKY280, pKY281 og pKY282, og induksjonsmidlet er toluen.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det rekombinante plasmid er valgt fra gruppen bestående av pMY402, pMY405, pMY401 og pMY404, og induksjonsmidlet er isopropyl-p-D-tio-galaktopyranosid.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det rekombinante plasmid er pKY287 og induksjonsmidlet er en temperaturendring opptil 42 °C.

5. Anvendelse av fremgangsmåten ifølge kravene 1-4 til nedbrytning av TCE i kjemisk avfall.

6. Anvendelse ifølge krav 5 hvor det kjemiske avfall er til stede i grunnvann.

7. Anvendelse ifølge krav 5 hvor det kjemiske avfall er til stede i drikkevann.

8. Anvendelse ifølge krav 5 hvor det kjemiske avfall er til stede i avløpsvann.

9. Anvendelse ifølge krav 5 hvor det kjemiske avfall er til stede i en landfylling.

10. Anvendelse ifølge krav 5 hvor det kjemiske avfall er til stede i jordbunn.