DE19709453C2 - Verwendung von Bakterienstämmen die aus Proben angereichert wurden, die sowohl Ethen als auch Chlorethen ausgesetzt waren zum Abbau von halogeniertem Ethen - Google Patents

Description

Halogenierte Ethene fanden in der Vergangenheit unter anderem als Entfettungsmittel in der metallverarbei­ tenden Industrie und bei der Textilreinigung weitver­ breitete Anwendung. Inzwischen sind diese gesund­ heitsgefährdenden Stoffe vielerorts in Grundwasser und Boden nachweisbar.

Die Behandlung von Schadensfällen erfolgt vorwiegend durch Bodenluftansaugung bzw. durch Strippen des Grundwasserleiters mit Luft. Die mit flüchtigen Kom­ ponenten beladene Abluft wird anschließend über Ak­ tivkohlefilter geleitet. Dabei werden die Schadstoffe durch Adsorption an die Aktivkohle aus dem Abluft­ strom entfernt. Die beladene Aktivkohle kann regene­ riert und erneut zur Reinigung der Abluftströme ein­ gesetzt werden. Ist eine Regeneration der Aktivkohle nicht wirtschaftlich, wie im Falle der Reinigung niedrig beladener Abluftströme, wird die Aktivkohle zusammen mit den adsorbierten Schadstoffen verbrannt.

Bei der Verbrennung von CKW-beladener Aktivkohle kön­ nen polychlorierte Dioxine entstehen. Die "17. Ver­ ordnung zum Bundesimmisionsschutzgesetz" schreibt da­ her für die thermische Abfallbehandlung einen Dioxin- Grenzwert von 0,1 ng/m³ Abluft vor. Die Regeneration von Aktivkohle ist dann unwirtschaftlich, wenn in dem zu reinigenden Abluftstrom nur geringe Konzentratio­ nen an den zu entfernenden Schadstoffen vorhanden sind und deshalb die Aktivkohle aufgrund der Adsorp­ tionsisothermen nur gering beladen wird. Bei geringen Schadstoffkonzentrationen in der zu reinigenden Ab­ luft sind aufgrund des niedrigen Beladungsspielraumes große Mengen an Aktivkohle erforderlich. Die thermische Entsorgung dieser Aktivkohle beeinflußt im Falle einer Boden- und Grundwassersanierung als wesentlicher Kostenfaktor erheblich die Wirtschaft­ lichkeit des Verfahrens.

In der Praxis wird oft der Abluftstrom nur in der Anfangsphase der Sanierung bei hohen Schadstoffkon­ zentrationen mit Aktivkohlefiltern gereinigt. Sinkt die Schadstoffkonzentration im Laufe des Sanierungs­ verfahrens unter die gesetzlich vorgeschriebenen Grenzwerte der TA Luft, wie dies bei der Bodenluft­ absaugung üblich ist, so wird die Abluft ungereinigt an die Atmosphäre abgegeben. Diese Umverteilung der Schadstoffe von Boden, Grundwasser und Bodenluft in die Atmosphäre ist aus ökologischen Gründen fragwür­ dig.

Boden und vor allem Grundwasser sind hohe Schutzgü­ ter. Aus umweltpolitischen Erwägungen ist man daher bestrebt, CKW-Schadstoffe enthaltende Gebiete dauer­ haft zu sanieren, ohne eine Umverteilung der CKW in die Atmosphäre zu bewirken. Die Reinigung niedrig beladener Abluftströme aus der Bodenluftabsaugung ist jedoch sehr kostenintensiv, da große Mengen niedrig­ beladener Aktivkohle anfallen, die nicht wirtschaft­ lich regeneriert werden können und unter hohen Kosten thermisch entsorgt werden müssen.

Unter anaeroben Bedingungen entsteht bei durch Tetra­ chlorethen (PCE) und Trichlorethen (TCE) verurachten Schadensfällen infolge der Aktivität der autochthonen Mikroflora des Bodens Vinylchlorid (VC), welches ein besonderes Problem darstellt. Zum einen ist es be­ kanntermaßen karzinogen und teratogen, zum anderen adsorbiert es nur in äußerst geringen technisch nicht relevanten Mengen an Aktivkohle. CKW-Schadensfälle mit höheren VC-Konzentrationen gelten daher als mit den beschriebenen Methoden nach dem derzeitigen Stand der Technik nicht sanierbar.

Als kostengünstige Alternative zur Reinigung von kon­ taminiertem Boden, Grundwasser und Bodenluft bieten sich aus diesen Gründen biologische Verfahren an. Eine Möglichkeit besteht beispielsweise darin, Methan in das Erdreich zu injizieren, um dort Methan oxidie­ rende (methylotrophe) Bakterien anzureichern und zu aktivieren.

Die biologische Abbaurate ist abhängig von der Anzahl der Chlorsubstituenten und der An- bzw. Abwesenheit von Sauerstoff. Hochchlorierte CKW, insbesondere PCE, werden ausschließlich unter anaeroben Bedingungen, niedrig chlorierte CKW dagegen vorwiegend unter aeroben Bedingungen biologisch abgebaut. Methan oxi­ dierende (methylotrophe) und Aromaten abbauende Bak­ terien sind beispielsweise in der Lage, TCE zu mine­ ralisieren, also zu Kohlendioxid, Wasser und Chlorid umzuwandeln. Der Intitialangriff erfolgt durch eine Oxygenase. Durch die Oxygenase-Reaktion wird jedoch ein hochreaktives Epoxid gebildet, das die Zelle schädigt und desaktiviert. Die Schädigung erfolgt durch Alkylierung von Zellproteinen. Der Stamm Pseu­ domonas Putida F1 wird beispielsweise sehr schnell durch den TCE-Umsatz desaktiviert. Die Oxygenaseakti­ vität verringert sich innerhalb von 20 Minuten auf 2% der Anfangsaktivität.

In der EP 0 447 862 B2 wird ein Verfahren zur biolo­ gischen Reinigung von mit halogenierten Ethenen und/oder halogenierten Butadienen kontaminierten Gas­ strömen, insbesondere aus der Bodenluft, beschrieben. Bei diesem Verfahren werden teure Wachstumssubstrate (Auxiliarsubstrate) wie Isopren und/oder Butadien eingesetzt. In der Praxis erwies sich dieses Verfah­ ren als kostenintensiv, da die eingesetzten Bakterien zur Regeneration mit größeren Mengen Isopren versorgt werden müssen. Da es sich bei Isopren um eine relativ leicht abbaubare Verbindung handelt, ist das Risiko einer Fremdverkeimung durch nicht dehalogenierende Bakterien sehr hoch und kann nur durch aufwendige steriltechnische Maßnahmen vermieden werden, die sich erheblich auf die Betriebskosten auswirken.

In der EP 0 336 718 A2 wird ein weiteres Verfahren zum mikrobiologischen Abbau von Trichlorethen mit Hilfe gentechnisch veränderter Mikroorganismen be­ schrieben. Vor Einsatz eines solchen Verfahrens zur Sanierung von Schadensfällen sind besondere Sicher­ heitsmaßnahmen zu treffen und langwierige Genehmi­ gungsverfahren erforderlich. Außerdem sind Probleme bei der Akzeptanz durch die Bevölkerung nicht auszu­ schließen.

Die DE-A 33 26 057 beschreibt ein Verfahren zur bio­ logischen Reinigung der Abluft. Durch die eingesetz­ ten Mikroorganismen können ein- und zweifach chlo­ rierte Alkane, Chlorbenzol und Chlortoluol minerali­ siert werden. Ein Abbau von halogenierten Ethenen ist nicht beschrieben.

Keiner der beschriebenen Bakterienstämme ist geeig­ net, PCE abzubauen.

Ausgehend hiervon ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Bakterienstämme zu finden, die zum Abbau von halogenierten Ethenen geeignet sind.

Die Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. Die Unteransprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen auf.

Erfindungsgemäß wird somit vorgeschlagen, Bakterien­ stämme zu verwenden, die aus Proben angereichert wurden, die Ethen als auch Chlorethen ausgesetzt waren. In einem Bioreaktor werden diese Bakterien mit Ethen als Kohlenstoff und Energiequelle versorgt. Die abzubauenden halogenierten Ethene werden in den Bioreaktor mit den präadaptierten Mikroorganismen geleitet. Dort werden die Chlorethene vollständig mineralisiert. Das Auxiliarsubstrat Ethen und haloge­ nierte Ethene können simultan abgebaut werden. Beson­ ders geeignet sind die Bakterien für cis-1,2-Di­ chlorethen und/oder Vinylchlorid, das in Konzentra­ tionen von bis zu 100 mg/l gereinigt werden kann.

Mit Hilfe dieser Bakterienstämme ist es möglich geworden, z. B. Grundwasser zu reinigen, das mit allen halogenierten Ethenen einschließlich PCE und VC kon­ taminiert ist. Dies ist auch bei gering belastetem Grundwasser und Erdreich möglich.

Bevorzugt werden die Bakterienstämme so eingesetzt, daß sie in einer Kombination mit einer anaeroben Stufe angewendet werden. Als erste Stufe wird dabei die aus dem Stand der Technik bekannte Maßnahme aus­ genutzt, daß anaerobe Bakterien und Mischkulturen in der Lage sind Chlorethene reduktiv zu dehalogenieren. Dabei wird PCE unter Freisetzung von Chlorid schrittweise zu TCE, cis-Dichlorethen (cDCE), VC und Ethen umgewandelt. Da die beiden ersten Dehalogenie­ rungsschritte sehr effizient und schnell erfolgen, die Dehalogenierung von cDCE und insbesondere von VC jedoch in technisch nicht relevanten Raten, wird die vorstehend beschriebene anaerobe reduktive Dehaloge­ nierung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kombi­ niert.

Ferner ist es mit Hilfe der Bakterien möglich gewor­ den, sowohl mit halogenierten Ethenen kontaminiertes Grundwasser als auch Boden und Bodenluft in situ zu reinigen. Die In-situ-Reinigung des kontaminierten Bodens kann erfolgen, indem das Grundwasser nach der Behandlung im Bioreaktor mit geeigneten Energie- und Kohlenstoffquellen, z. B. molekularem Wasserstoff, Kohlenhydraten, Alkoholen oder organischen Säuren, versetzt und in den Boden infiltriert wird. Damit wird ein anaerobes Milieu geschaffen und anaerobe, reduktiv dehalogenierende, autochthone Mikroflora aktiviert. Durch einen hydraulischen Kreislauf werden die hochchlorierten Ethene PCE und TCE im Boden zu cDCE dehalogeniert. Das Grundwasser wird abgepumpt und beispielsweise über der Geländeroberkante in Bioreaktoren behandelt. Die in der Bodenluft befind­ lichen Chlorethene lösen sich im reinfiltrierten Grundwasser. Verbliebene Reste der Chlorkohlen­ wasserstoffe können abgebaut werden, indem die Boden­ luft zur Belüftung des aeroben Bioreaktors verwendet wird.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß Ethen abbau­ ende Bakterien in der Lage sein können, halogenierte Ethene abzubauen. Die beispielsweise von Habets-Crüt­ zen et al. (1984) aus der Arbeitsgruppe von de Bont früher in Appl. Microbiol. Biotechnol. (1984) 20: 245-250 beschriebenen Ethen abbauenden Bakterienstäm­ me erreichten für Ethen-Abbauraten von 9 bis 50 nmol/.mg_Protein. Hou et al. (1983) beschreiben in Appl. Environ. Microbiol. Juli 1983, S. 171-177 eine Oxidation von Ethen durch Bakterien, die auf Propan gezüchtet wurden. Hier wurden 1,2 bis 43 nmol/min.mg_Protein gemessen. Auch Ewers (Disserta­ tion von Jens Ewers, 1991, Universität Stuttgart) konnte Ethen abbauende Bakterienkulturen anreichern, machte jedoch keine Aussagen über die Abbauraten. Er untersuchte die Ethen abbauenden Kulturen auch auf Verwertung von Chlorethenen und Chloridfreisetzung, konnte jedoch nicht von positiven Ergebnissen berich­ ten. Auch in Hou et al. (1983), Heyer (Zeitschrift für Allg. Mikrobiologie 16, 8 (1976) S. 633-637) und den Schriften aus der Arbeitsgruppe von deBont finden sich keine Hinweise auf einen Abbau von oder eine Chloridfreisetzung aus chlorierten Ethenen durch Ethen verwertende Bakterien.

Die Bakterienkulturen bauen Ethen in Raten bis zu 60 nmol/min.mg_Protein ab und sind in der Lage, halo­ genierte Ethene, wie z. B. cDCE, vollständig zu mine­ ralisieren und dabei auch extrem hohe Konzentrationen dieser toxischen Verbindungen zu tolerieren. Die hohe Resistenz gegenüber halogenierten Ethenen beruht da­ rauf, daß die beim oxidativen Abbau primär gebildeten Epoxide durch die Ethen verwertenden Bakterienstämme sehr wirksam entgiftet werden.

Ethen wird von den Mikroorganismen, die zur Verwer­ tung dieses Substrats befähigt sind, im ersten Schritt der Abbausequenz durch eine Oxygenase-Reak­ tion zu Ethylenoxid oxidiert. Um eine Zellschädigung durch diese hochtoxische Verbindung, die auch zu Ste­ rilisationszwecken eingesetzt wird, zu verhindern, sind diese Mikroorganismen auf ein hocheffizientes epoxidspaltendes Enzymsystem angewiesen, das Ethylen­ oxid entgiftet. Dieses Enzymsystem ist auch in der Lage, die beim primären Oxidationsschritt aus Chlor­ ethenen entstandenen Epoxide zu spalten. Auf diese Weise können präadaptierte Mikroorganismen selbst hohe Konzentrationen von halogenierten Ethenen tole­ rieren und dehalogenieren.

Geeignete Bakterien erhält man durch Anreicherung mit Ethen als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle gemäß den Fachleuten bekannten Techniken mit Proben aus geeigneten Standorten, die sowohl Ethen als auch Chlorethenen ausgesetzt waren. Bakterienkulturen, die auf diese Weise angereichert wurden, weisen folgende überraschende Eigenschaften auf:

• - hohe Toleranz gegenüber halogenierten Ethenen, wie z. B. cDCE,
• - hohe Abbauaktivität gegenüber halogenierten Ethenen, wie z. B. cDCE,
• - Fähigkeit zum simultanen Abbau von halogenierten Ethenen und dem Auxiliarsubstrat Ethen,
• - geringer Bedarf an Ethen als Auxiliarsubstrat,
• - geringe Anfälligkeit für Fremdverkeimung bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Der CKW-Abbau durch die in EP 0 447 862 B1 beschrie­ benen Isopren und/oder Butadien abbauenden Bakterien­ stämme erfolgt nur in Abwesenheit geeigneter Kohlen­ stoff- und Energiequellen. Nach einigen Stunden des CKW-Abbaus läßt ihre Aktivität durch den allmählich auftretenden Energiemangel nach, so daß sie durch Zugabe von Isopren und/oder Butadien reaktiviert wer­ den müssen. Im Gegensatz dazu sind die der Erfindung zugrunde liegenden Bakterienkulturen in der Lage, Chlorethen und Ethen simultan abzubauen, so daß sich verfahrenstechnich aufwendige Regenerationszyklen erübrigen. Der Abbau von Chlorethenen erfordert bei allen bisher in der Fach- und Patentliteratur be­ schriebenen Bakterienkulturen den Einsatz des jewei­ ligen geeigneten Auxiliarsubstrats im Überschuß. Überraschenderweise benötigen die der Erfindung zu­ grunde liegenden Ethen abbauenden Bakterienstämme le­ diglich eine - verglichen mit den halogenierten Ethe­ nen - signifikant geringere Menge des Auxiliarsub­ strats Ethen, um den Energiestoffwechsel und die Ab­ bauaktivität gegenüber Chlorethenen aufrechtzuerhal­ ten. Mit den Bakterien können geringe Konzentrationen des Auxiliarsubstrats eingesetzt werden, wodurch sich die Wirtschaftlichkeit erhöht. Die Versorgung der Mikroorganismen mit Ethen erfolgt über die Gasphase. Die Konzentrationen sind so niedrig (unter 2,3% (v/v)), daß kein explosives Gasgemisch entstehen kann, wodurch aufwendige Explosionsschutzmaßnahmen hinfällig werden.

Einzelne angereicherte Bakterienkulturen sind sogar über längere Zeiträume zum produktiven Abbau, also zur Verwertung von halogenierten Ethenen, wie z. B. cDCE, als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle, be­ fähigt.

Es zeigte sich, daß die der Erfindung zugrunde lie­ genden Ethen abbauenden Bakterienkulturen gegenüber Fremdverkeimung unempfindlich sind. Luftkeime oder Fremdkeime aus dem Wasser, die Ethen und/oder haloge­ nierte Ethene unspezifisch oxidieren, bilden das hochtoxische Ethylenoxid oder Epoxide aus den halo­ genierten Ethenen, was ohne hocheffiziente epoxid­ spaltende Enzymsysteme zu schweren Zellschädigungen führt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sind also aufwendige und kostenintensive steriltechnische Maß­ nahmen zur Vermeidung einer Fremdverkeimung und zur Aufrechterhaltung des biologischen Abbauprozesses nicht notwendig.

Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß es sich bei Ethen um ein vergleichsweise preiswertes Auxiliarsub­ strat handelt.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausfüh­ rungsbeispielen näher erläutert:

Beispiel 1 Anreicherung von geeigneten Mikroorganismen

Zur Anreicherung geeigneter Bakterien wurde Belebt­ schlamm aus der Betriebskläranlage eines Ethen und CKW produzierenden Industrieunternehmens als Inokulum eingesetzt. Als einzige Kohlenstoff- und Energie­ quelle wurde Ethen verwendet. Zur Anzucht der Flüs­ sigkulturen wurde die von Dorn, Hellwig, Reineke, Knackmuss (1974): Isolation and Characterization of a 3-Chlorobenzoate Degrading Pseudomonad. (Arch. Microbiol. 99: 62-70) angegebene Mineralsalzlösung verwendet. Ethen wurde in den Konzentrationen zwischen 3% und 20% (jeweils v/v in der Gasphase) zugegeben. Die Inkubation erfolgte in Schüttelkolben mit Schikanen und einem Nennvolumen von 100 ml bzw. 500 ml, in denen sich 10% des Nennvolumens an Mineralmedium befanden, bei 30°C auf einen Rotationsschüttler bei 135 Upm. Das bakterielle Wachstum wurde durch Messung der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 546 nm in einem Photometer bestimmt. Die Isolierung der Bakterien erfolgte auf Agarplatten mit Mineralmedium. Ethen wurde hierbei über die Gasphase (1,9% v/v) zudosiert.

Beispiel 2 Suche (Screening) nach dehalogenierenden Mikroorganismen

Die Dehalogenierungsaktivität der angereicherten Bak­ terien wurde über die entstehende Chloridmenge be­ stimmt. Hierzu wurde der Chloridtest Weightman, Weightman, Slater (1985): Toxic effects of Chlorinated and Brominated Alkanoic Acids an Pseudomonas putida PP3: Selection at High Frequencies of Mutations in Genes Encoding Dehalogenases. (Appl. Environ. Microbiol. 49: 1494-1501) für auf Platten gezüchtete Zellen bzw. ein von Ewers (1991) (Dissertation von Jens Ewers, 1991, Universität Stuttgart) modifizierter Test nach Weightman et al. (1985): Toxic effects of Chlorinated and Brominated Alkanoic Acids on Pseudomonas putida PP3: Selection at High Frequencies of Mutations in Genes Encoding Dehalogenases. (Appl. Environ. Microbiol. 49: 1494- 1501) für Flüssigkulturen verwendet. Es wurde jeweils 1 mM cDCE bei diesem Test eingesetzt. Die Kulturen mit hohem Abbaupotential wurden am Silberniederschlag erkannt.

Fig. 1 zeigt das Wachstum einer Mischkultur auf 250 µM Ethen in Gegenwart von 800 µM cis-1,2- Dichlorethen in einer absatzweisen (Batch)-Kultur. Die Konzentrationen beziehen sich auf die Flüssig­ phase. Die Anzucht erfolgte in einem Schüttelkolben mit Schikanen und einem Nennvolumen von 500 ml. Die zu untersuchenden Proben wurden mit einer gasdichten Spritze durch ein Septum aus dem Gasraum des Kolbens entnommen. Die Detektion von Ethen und cDCE erfolgte mit Hilfe eines Gaschromatographen (Injektor-, Detek­ tor- und Ofentemperatur 250°C, 200°C und 170°C, Flammenionisationsdetektor (FID), Plora PLOT U®-Säule (25 m × 0,53 mm) mit He (30 kPa Säulenvordruck) als Trägergas). Die optische Dichte wurde bei 546 nm bestimmt. Cis-1,2-Dichlorethen wird am Ende der exponentialen Phase und während der stationären Phase abgebaut.

Claims (6)

1. Verwendung von Bakerienstämmen, die aus Proben angereichert sind, welche sowohl Ethen als auch Chlorethenen ausgesetzt waren, zum simultanen und/oder konsekutiven Abbau von halogenierten Ethenen in einem aeroben Bioreaktor unter Verwendung von Ethen zur Präadaption sowie als Kohlenstoff- und Energiequelle.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei Ethen über die Gasphase mit der Zuluft in einer Konzentration von unter 2,3% (v/v) in den Bioreaktor eingeführt wird.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei halogenierte Ethene enthaltendes Wasser gereinigt wird.

4. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei man mit halogenierten Ethenen kontami­ nierte Luft zur Begasung des Bioreaktors ein­ setzt.

5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei man mit halogenierten Ethenen kontami­ nierte Bodenluft einsetzt.

6. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei vor der Reinigungsstufe im aeroben Bio­ reaktor eine anaerobe Stufe zur reduktiven Dehalogenierung der halogenierten Ethene durchgeführt wird.