JP2001501865A - ハロゲン化エテン類を除去する微生物学的方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ハロゲン化エテン類を除去する微生物学的方法であって、炭素源およびエネルギー源としてエテンで増殖しながらハロゲン化エテン類を分解する細菌種が、新たな生成のためおよびエネルギー供給のために炭素源およびエネルギー源としてエテンで前適応化されていると共に、除去されるハロゲン化エテン類と好気性バイオリアクター中において接触されることを特徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】 ハロゲン化エテン類を除去する微生物学的方法 ハロゲン化エテン類は、金属加工業および織物クリーニングにおいて特に脱脂 剤として過去において広く用いられた。その間に、健康に有害なこれらの物質は 、地下水中および土壌中の多くの場所で検出できるようになってきた。 汚染事故は、土壌空気の排出により、もしくは地下水帯水層を空気で取り除く ことにより主として処理されている。揮発成分を含んだ排気は、その後、活性炭 フィルター上を通過する。この過程において、汚染物質は、活性炭への吸着によ り排気流から除去される。使用済みの活性炭は、排気流を清浄化するために再生 および再使用することができる。活性炭の再生が非経済的である場合、例えば、 低レベルの汚染物質を伴った排気流の清浄化の場合、活性炭は吸着された汚染物 質と一緒に焼却される。 塩素化炭化水素を吸着した活性炭の焼却において、ポリ塩素化ダイオキシンが 生成しうる。従って、「ドイツ連邦大気汚染抑制法１７次規制」は、廃棄物の熱 処理に対する排気のダイオキシン制限値０．１ｎｇ／ｍ³を規定している。低濃 度の除去対象汚染物質のみが清浄化すべき排気流中に存在し、従って、吸着等温 線のゆえに活性炭の吸着量がごくわずかしかない場合、活性炭の再生は経済的で はない。清浄化すべき排気中の汚染物質濃度が低い場合、小さい吸着能力のため に大量の活性炭を要する。この活性炭の熱的処分は、土壌および地下水の修復の 場合、大きなコスト要因としてプロセスの経済的効率に相当な影響を及ぼす。 実際には、排気流は、高汚染物質濃度で活性炭フィルタを用いて、修 復の初期段階で清浄化されるのみであることが多い。修復プロセスにおいて、汚 染物質濃度がドイツ大気汚染抑制規制の法的に規定された制限値より下に低下し た場合、土壌空気の排出において通例であるように、排気は清浄化せずに大気に 放出される。土壌、地下水および土壌空気の汚染物質を大気中にこうして再分配 することは、環境上の理由から問題となる。 土壌および特に地下水は高度な保護物質である。従って、環境政策のために、 塩素化炭化水素の大気への再分配を引起こすことなく塩素化炭化水素汚染物質を 恒久的に修復する努力がなされている。しかし、土壌空気の排出からの低レベル で汚染された排気流の清浄化は非常にコストがかかる。低レベルで汚染された大 量の活性炭が発生し、それを経済的に再生することが不可能であると共に、高コ ストで熱的に処分しなければならないからである。 嫌気性条件下でテトラクロロエテン（ＰＣＥ）およびトリクロロエテン（ＴＣ Ｅ）により引起こされる汚染事故の場合、土壌の原地性微小植物の活性のために 、特に問題である塩化ビニル（ＶＣ）が生じる。第一に、塩化ビニルは発ガン性 、催奇形性であることが知られており、第二に、それは工業的に適切でない極め て少量においてのみ活性炭に吸着される。従って、比較的にＶＣ濃度が高い塩素 化炭化水素汚染事故は、現在の先行技術の記載された方法を用いて修復可能であ るとは考えられない。 これらの理由のために、汚染された土壌、地下水および土壌空気の清浄化のた めの安価な代替方法として生物学的方法が考えられている。１つの可能性は、例 えば、土壌中にメタンを注入してメタン酸化（メチロトロフィック）細菌をそこ で増殖および活性化させることである。 生分解速度は塩素置換基の数および酸素の有無に応じて決まる。高塩素化炭化 水素、特にＰＣＥは、嫌気性条件下でのみ生分解されるが、低塩素化炭化水素は 、対照的に好気性条件下で主として生分解される。メタン酸化（メチロトロフィ ック）および芳香族分解細菌は、例えば、ＴＣＥを無機物化することが可能であ る。すなわち、ＴＣＥを二酸化炭素、水および塩素に転化する。初期の攻撃はオ キシゲナーゼにより行われる。しかし、オキシゲナーゼ反応は、細胞を損傷およ び失活させる高反応性のエポキシドを生成させる。この損傷は細胞タンパク質の アルキル化により引き起こされる。菌種シュードモナス−プチダＦ１（Pseudomo nas putida F1）は、例えば、ＴＣＥの転化により急速に失活される。オキシゲ ナーゼ活性は、２０分の過程において初期活性の２０％に低下する。 ＥＰ ０ ４４７ ８６２Ｂ１は、特に土壌空気からのハロゲン化エテン類お よび／またはハロゲン化ブタジエンで汚染されたガス流の生物学的浄化のための 方法を記載している。この方法において、高価な成長基質(補助基質)、例えば、 イソプレンおよび／またはブタジエンが用いられている。実際には、再生のため に用いられる細菌に比較的大量のイソプレンを供給しなければならないため、こ の方法は非常にコストがかかることが分かった。イソプレンは比較的容易に分解 可能な化合物であるため、脱ハロゲン化しない細菌による外部感染の危険性は極 めて高く、運転コストに相当な影響を及ぼす複雑な滅菌技術によってのみ、その 危険を回避することが可能である。 ＥＰＡ ０ ３３６ ７１８は、遺伝子的に変更された微生物を用いるトリク ロロエテンの微生物学的分解のための更なる方法を記載している。こうした方法 を汚染事故の修復のために用いる前に、特定の安全措置を講じる必要があると共 に、面倒な承認プロセスが必要である。更に、社 会的受け入れの問題も避けることはできない。 ＤＥ−Ａ ３ ３２６ ０５７は、排気の生物学的清浄化のための方法を記載 している。一塩素化および二塩素化アルカン、クロロベンゼンおよびクロロトル エンは、用いられた微生物により無機化されることが可能である。ハロゲン化エ テン類の分解は記載されていない。 いずれの方法もＰＣＥの分解には適さない。 これから出発して、本発明の目的は、ハロゲン化エテン類の微生物除去／排除 のための簡単で完全な分解が可能な方法を明示することである。 この目的は、請求項１を特性づける特徴により達成される。従属クレームは有 利な開発の所産を示している。 従って、本発明によれば、炭素源およびエネルギー源としてエテンを利用する と共に、同時に炭素としてハロゲン化エテン類、例えば、ｃＤＣＥを無機化する ことが可能な細菌を増殖させることが提案される。バイオリアクター中で、これ らの細菌には炭素源およびエネルギー源としてエテンが供給される。分解される ハロゲン化エテン類は、前適応化された微生物と共にバイオリアクターに通され る。そこで、クロロエテン類は完全に無機化される。補助基質エテンとハロゲン 化エテン類は、同時に分解されることが可能である。この方法は、シス−１，２ −ジクロロエテンおよび／または塩化ビニルに対して特に適し、それらを１００ ｍｇ／ｌまでの濃度に除去することが可能である。 本発明による方法を用いることにより、例えば、ＰＣＥおよびＶＣを含むあら ゆるハロゲン化エテン類で汚染されている地下水を清浄化することが可能になっ た。これは、低レベルで汚染された地下水および土壌の場合にも可能である。 好ましくは、本発明による方法は、その方法を嫌気段階と併用で用い るようにして実施される。第一段階として、この場合、嫌気性細菌および混合培 養菌がクロロエテン類を還元的に脱ハロゲン化することが可能である先行技術か らの公知の手段を利用する。この場合、ＰＣＥは段階的に塩化物を放出しながら 、ＴＣＥ、シス−ジクロロエテン(ｃＤＣＥ)、ＶＣおよびエテンに転化される。 最初の２つの脱ハロゲン化ステップは極めて効率的且つ速やかに進行するが、ｃ ＤＣＥおよび特にＶＣの脱ハロゲン化は工業的に適切でない速度で進行するので 、上述の嫌気性還元脱ハロゲン化を本発明による方法と併用する。 更に、本発明による方法を用いることにより、ハロゲン化エテン類で汚染され た地下水だけでなく、土壌および土壌空気もｉｎ ｓｉｔｕ（その場）で清浄化 することが可能になった。汚染された土壌のｉｎ ｓｉｔｕ清浄化は、酸素分子 、炭水化物、アルコールまたは有機酸等の適するエネルギー源および炭素源をバ イオリアクタお中で処理後の地下水に添加し、その混合物を土壌に浸透させるこ とにより実施することができる。こうして嫌気性環境が作られると共に、好気性 還元脱ハロゲン化原地性微小植物が活性化される。水の循環のために、土壌中の 高塩素化エテン類、ＰＣＥおよびＴＣＥはｃＤＣＥへと脱ハロゲン化される。地 下水は、ポンプで汲み出され、例えば、地面上のバイオリアクター中で処理され る。土壌空気に存在するクロロエテン類は、清浄濾過により処理された地下水中 に溶解する。塩素化炭化水素の残留分は、土壌空気を用いて好気性バイオリアク ターに空気を供給することによって分解される。 驚くべきことに、エテン分解細菌がハロゲン化エテン類を分解可能であること が見出された。例えば、デ・ボント（ｄｅ Ｂｏｎｔ）作業グル ９８４)らにより以前に記載されたエテン分解細菌種は、エテンについ て９から５０ｎｍｏｌ／ｍｇ_{タンパク質}の分解速度を達成した。ハウ（Ｈｏｕ） (１９８３)らは、プロパンで増殖した細菌によるエテンの酸化を記載している。 この場合、１．２から４３ｎｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ_{タンパク質}が測定された。エ ワース（Ｅｗｅｒｓ）(１９９１)は、エテン分解細菌培養菌を増殖させたが、分 解速度について記載していない。更にエワースは、クロロエテン類の利用および 塩化物放出のためにエテン分解培養菌も研究したが、良い結果を報告することが できなかった。ハウ(１９８３)ら、ヘイヤー（Ｈｅｙｅｒ）(１９７６)において も、デ・ボント作業グループからの刊行物においても、エテン利用細菌による塩 素化エテン類の分解または塩素化エテン類からの塩化物放出を指示するものはな い。 本発明による方法に基づく細菌培養菌は、６０ｎｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ_{タンパ ク質} までの速度でエテンを分解し、ｃＤＣＥ等のハロゲン化エテン類を完全に無 機化することが可能であり、従って、これらの極めて高濃度の毒性化合物に耐え ることも可能である。ハロゲン化エテン類に対するこの高い耐性は、酸化分解に おいて主として形成されるエポキシドがエテン利用細菌種により極めて効果的に 無毒化されるという事実に基づいている。 分解シーケンスの第一のステップにおいて、基質エテンを利用することが可能 な微生物によるオキシゲナーゼ反応により、エテンはエチレンオキシドに酸化さ れる。滅菌目的にも用いられる非常に高い毒性化合物であるエチレンオキシドに よる細胞損傷を防止するために、これらの微生物はエチレンオキシドを無毒化す る非常に効果的なエポキシド開裂酵素系を形成するように誘導される。この酵素 系は、主たる酸化ステップにおけるクロロエテン類から由来するエポキシドを開 裂することも可能 である。こうして、前適応化された微生物は、高濃度のハロゲン化エテン類にさ えも耐えることが可能であり、それらを脱ハロゲン化することが可能である。 本発明による方法を実施するのに適する細菌は、エテンおよびクロロエテン類 の両方に露出された適切な場所からのサンプルを用いる当該技術分野における当 業者に対して公知の技術に従って、単独の炭素源およびエネルギー源としてエテ ンで増殖することにより得られる。こうして増殖された細菌培養菌は、以下の驚 くべき特性を有する。 ●ｃＤＣＥ等のハロゲン化エテン類に対する高い耐性。 ●ｃＤＣＥ等のハロゲン化エテン類に対する高い分解活性。 ●ハロゲン化エテン類と補助基質エテンを同時に分解することが可能。 ●補助基質としてのエテンに対する少ない必要量。 ●本発明による方法を用いる時、外部感染の影響をうけにくい。 適する細菌種の例は、ＰＳ５(タンパク質細菌のα−亜群の代表^*)、ＫＤ２０( コリネバクテリウム属新種)、ＫＬ１(ミクロバクテリウム属新種)、ＫＬ２(ミク ロバクテリウム属新種)、ＫＬ３、ＫＬ４(タンパク質細菌のα−亜群の代表^*)、 ＫＬ５または混合培養菌である。 ＊菌種ＫＬ４およびＰＳ５は、ブラウンシュバイク（Braunschweig）にあるドイ チェ・ザムルンク・フォン・ミクロオルガニズメン（Deutsche Sammlung von Mi kroorganismen GmbH）により、更により厳密に決定されることになっている。 ＥＰ ０ ４４７ ８６２ Ｂ１に記載されているイソプレン−および／また はブタジエン−分解細菌種による塩素化炭化水素分解は、適する炭素源およびエ ネルギー源の非存在下でのみ起きる。塩素化炭化水素分解の数時間後、徐々に起 きるエネルギー不足のために、細菌種の活性は低 下する。そこで、イソプレンおよび／またはブタジエンを追加することにより、 それらを再活性化しなければならない。それらとは異なり、本発明に基づく培養 細菌は、クロロエテンとエテンを同時に分解することが可能であるため、工学の 観点から複雑な再生サイクルが不要である。クロロエテン類の分解は、専門家お よび特許の刊行物に今まで記載されているすべての培養細菌の場合、各々に適す る補助基質を過剰に使用することが必要である。驚くべきことに、本発明に基づ くエテン分解細菌種は、クロロエテン類に関するエネルギー代謝と分解活性を維 持するために、ハロゲン化エテン類に比べて著しく少量の補助基質エテンしか必 要としない。従って、本発明による方法の場合、低濃度の補助基質を用いること ができ、その結果、経済的効率は向上する。微生物には気相を経てエテンが供給 される。濃度は非常に低い（２．３％（ｖ／ｖ）未満）ので、爆発性ガス混合物 が生じることはあり得ず、その結果、複雑な爆発防止処置は不要となる。 個々の増殖された培養細菌は、比較的長期間にわたってさえも、効果的な分解 に対する、すなわち、単独のエネルギー源および炭素源としてｃＤＣＥ等のハロ ゲン化エテン類を利用することに対する能力を有する。 本発明に基づくエテン分解細菌培養菌が外部感染の影響を受けないことが見出 された。エテンおよび／またはハロゲン化エテン類を酸化させる空気中の微生物 または水からの外部微生物は、ハロゲン化エテン類から極めて毒性の高いエチレ ンオキシドまたはエポキシド類を非特異的に生じさせ、それらは、非常に有効な エポキシド開裂酵素系の非存在下で激しい細胞損傷を引き起こす。従って、本発 明による方法においては、外部感染を避け、生分解プロセスを維持するための複 雑で非常にコストがかかる滅菌技術が不要である。 本発明による方法の更なる利点は、エテンが比較的安価な補助基質であること である。 本発明による方法を、実施例を参照しながら以下で更に詳細に説明する。 実施例１適切な微生物の増殖 適切な微生物の増殖のために、エテン−および塩素化炭化水素−製造産業の工 場排水処理プラントからの活性スラッジを接種材料として用いた。単独の炭素源 およびエネルギー源としてエテンを用いた。液体培養菌の増殖のために、ドーン （Ｄｏｒｎ）(１９７４)らが規定した無機塩類溶液を用いた。３から２０％（各 場合、気相中のｖ／ｖ）の濃度でエテンを添加した。バッフルおよび１００ｍｌ または５００ｍｌの公称容積を有する振盪フラスコ中で、培養を行った。公称容 積の１０％は無機質媒体であった。振盪フラスコは１３５ｒｐｍの回転振盪器上 に置き、温度は３０℃であった。光度計（ＤＵ５０、ベックマン(Beckmann Inst ruments Inc.)、イギリス）において、５４６ｎｍの波長で光学濃度を測定する ことにより細菌の増殖を測定した。無機質媒体を用いる寒天プレート（Ａｇａｒ Ｎｏ．１、オキソイド(Ｏｘｏｉｄ Ｌｔｄ.)、ロンドン、イギリス）上で細 菌を分離した。この場合、気相を経てエテンを添加した(１．９％ｖ／ｖ)。 実施例２脱ハロゲン化微生物のスクリーニング 増殖した細菌の脱ハロゲン化活性を、生成した塩化物の量によって測定した。 この目的のために、プレート上で培養された細胞に関するウェイトマン（Ｗｅｉ ｇｈｔｍａｎ）(１９８５)らの塩化物試験またはエワ ーズ（１９９１）により修正されたウェイトマン（１９８５）らによる試験を用 いた。この試験において、各場合に１ｍＭのｃＤＣＥを用いた。高い分解能力を 有する培養菌を銀の沈殿物により認識した。 図１は、バッチ培養における８００μＭのシス−１，２−ジクロロエテンの存 在下における２５０μＭのエテンでの混合培養菌の増殖を示している。濃度は液 相に関連している。バッフルおよび５００ｍｌの公称容積を有する振盪フラスコ 中で、培養を行った。気密シリンジを用い、隔壁を通して被検サンプルをフラス コの気体空間から採取した。ガスクロマトグラフ（注入器温度、検出器温度およ びオーブン温度は各々２５０℃、２００℃および１７０℃であり、ＦＩＤ、キャ リアガスとしてＨｅ（入口圧力３０ｋＰａ）を用いるＰｌｏｒａ ＰＬＯＴ Ｕ カラム(２５ｍ×０．５３ｍｍ)）を用いてエテンおよびｃＤＣＥを検出した。光 学濃度を５４６ｎｍで測定した。シス−１，２−ジクロロエテンは、対数期の終 わりにおいて且つ定常期中に分解されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/20 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＣＮ，ＪＰ，Ｕ Ｓ (72)発明者 クナックムス ハンス―ヨアヒム ドイツ連邦共和国 レオンベルク Ｄ― 71229 ハイメルディンゲル シュトラー セ 60

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ハロゲン化エテン類を除去する微生物学的方法であって、炭素源およびエ ネルギー源としてエテンで増殖しながらハロゲン化エテン類を分解する細菌種が 、新たな生成のためおよびエネルギー供給のために炭素源およびエネルギー源と してエテンで前適応化されていると共に、除去される前記ハロゲン化エテン類と 好気性バイオリアクター中において接触されることを特徴とする方法。 ２． 前記好気性バイオリアクター中で同時におよび／または連続してエテンお よびハロゲン化エテン類と前記細菌を接触させることを特徴とする請求項１に記 載の方法。 ３． ２．３％（ｖ／ｖ）未満の濃度において供給空気と共に気相を経て炭素源 および／またはエネルギー源としてエテンを前記バイオリアクター中に導入する ことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。 ４． ハロゲン化エテン類を含んでなる清浄化される水と前記細菌種とを、前記 バイオリアクター中で接触させることを特徴とする請求項１から３のうち少なく とも一つに記載の方法。 ５． 汚染された地下水を清浄化することを特徴とする請求項４に記載の方法。 ６． 前記バイオリアクターにガスを導入するために、ハロゲン化エテン類で汚 染された空気を用いることを特徴とする請求項１から３のうち少なくとも一つに 記載の方法。 ７． ハロゲン化エテン汚染の土壌空気を用いることを特徴とする請求項６に記 載の方法。 ８． 前記好気性バイオリアクター中での清浄化段階の前に、前記ハロ ゲン化エテン類の還元脱ハロゲン化のための嫌気性段階を実施することを特徴と する請求項１から７のうち少なくとも一つに記載の方法。 ９． 細菌種ＰＳ５、ＫＤ２０、ＫＬ１、ＫＬ２、ＫＬ３、ＫＬ４、Ｋ１５また はそれらの混合培養菌を利用することを特徴とする請求項１から８のうち少なく とも一つに記載の方法。 １０． シス−１，２−ジクロロエテン含有および／または塩化ビニル含有の水 および／または空気を清浄化することを特徴とする請求項１から９のうち少なく とも一つに記載の方法。 １１． １００ｍｇ／ｌまでの濃度のシス−１，２−ジクロロエテンおよび／ま たは塩化ビニルを除去することを特徴とする請求項１０に記載の方法。