DE4142063A1

DE4142063A1 - Mittel gegen tce-kontaminationen, bakterien und verfahren dafuer sowie verwendung der bakterien

Info

Publication number: DE4142063A1
Application number: DE19914142063
Authority: DE
Inventors: Gerhard Gottschalk; Birgit Dabrock; Jutta Riedel; Joachim Bertram
Original assignee: WISSTRANS UMWELT GmbH
Current assignee: WISSTRANS UMWELT GmbH
Priority date: 1991-12-19
Filing date: 1991-12-19
Publication date: 1993-06-24
Also published as: WO1993012042A1

Description

Trichlorethan (TCE) wird in großem Umfang in der Metall- und der Glasindustrie zum Entfernen von Fett verwendet, wodurch es sich stellenweise im Grundwasser und im Boden angereichert hat, da es biologisch kaum abbaubar ist. TCE kann nach der folgenden Gleichung oxidiert werden:

CHCl = CCl₂ + H₂O + 1,5 O₂ → 2 CO₂ + 3 HCl

Aufgrund thermodynamischer Überlegungen ist es recht unwahrscheinlich, daß Organismen auf Basis der TCE-Oxidation wachsen können; daher ist es nicht überraschend, daß bisher nur von Co- Oxidation von TCE berichtet worden ist. Substrate, die in bestimmten Bakterienstämmen die Fähigkeit zur TCE-Oxidation induzieren, sind folgende:
Toluol (Nelson et al. 1987; Wackett & Gibson 1988; Winter et al. 1989; Shields et al. 1991);
Phenol (Folsom et al. 1990; Harker & Kim 1990);
Methan (Wilson & Wilson 1985; Fogel et al. 1986; Oldenhuis et al. 1989; Tsien et al. 1989; Henry & Grbic-Galic 1991);
Propan (Wackett et al. 1989)
Isopren (Ewers et al. 1990); und
Ammoniak (Arciero et al. 1989).

Das Wachstum von Gram-negativen stäbchenförmigen Bakterien auf Isopropylbenzol wurde von Omori et al. (1975) und von Eaton & Timmis (1986) berichtet. Der Weg, auf dem Isopropylbenzol abgebaut wird, wurde aus Studien an Mutanten abgeleitet, die mit den Transposon Tn5 erzeugt worden waren. Man identifizierte Zwischenprodukte, die sich in bestimmten Mutanten anhäuften, maß Enzymaktivitäten und schloß, daß Isopropylbenzol zu 3-Isopropylcatechol oxidiert wird, worauf eine meta-Spaltung und weitere Reaktionen folgen, die zur Bildung von 4-Hydroxy-2-oxovalerat und Isobutyrat führen (Eaton & Timmis 1984 und 1986). Jigami et al. (1975) schlugen die gleiche Route vor. In Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Route steht, daß der Stamm ipba (Eaton & Timmis 1986) und die der im folgenden noch zu erläuternden Erfindung zugrundeliegenden Stämme auf Isobutyrat wachsen.

Nach wie vor besteht ein Bedürfnis, ein Wachstumssubstrat zu finden, das allen damit wachsenden Bakterienstämmen die Fähigkeit zur Oxidation von TCE verleiht. Nur dann kann die Effektivität der TCE-Oxidation in Boden und Gewässern entscheidend verbessert werden. Von den bisher bekannten Substraten wird diese Forderung nicht erfüllt.

Dazu wurden verschiedene Bakterienisolate aus Anreicherungen mit Isopropylbenzol (Cumol), Toluol und Phenol als Kohlenstoff- und Energiequellen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Oxidation von TCE getestet. Im Unterschied zu Toluol und Phenol waren alle auf Isopropylbenzol angereicherten Isolate in der Lage, TCE zu oxidieren. Zwei Isolate wurden für weitere Untersuchungen herangezogen, und zwar die Stämme JR1 und BD1, die als Pseudomonas spec. bzw. Rhodococcus erythropolis identifiziert wurden. Die TCE-Oxidation war von einer Freisetzung stöchiometrischer Chloridmengen begleitet. Die anfängliche TCE-Oxidationsrate stieg proportional zur Substrat-Konzentration von 25 auf 200 µM TCE. Als maximale anfängliche TCE-Abbauraten wurden im vorliegenden Zusammenhang 4 bis 5 nmol × min^-1 × mg Protein^-1 ermittelt. Der TCE-Abbau nahm im Verlauf der Zeit ab. Die beiden Isolate zeigten ein Temperaturoptimum für den TCE-Abbau im Bereich von 10 bis 20°C. Untersuchungen zur Substratspezifität zeigten ausgeprägte Unterschiede zwischen den beiden Isolaten. Zusätzlich zum TCE oxidierte R. erythropolis BD1 nur noch cis- und trans-Dichlorethen, während Pseudomonas spec. JR1 in der Lage war, auch noch 1,1-Dichlorethen, Vinylchlorid, Trichlorethan und 1,2-Dichlorethan zu oxidieren.

Das erfindungsgemäße Gram-positive Bakterium, das auf Isopropylbenzol isoliert wurde, wurde als Rhodococcus erythropolis-Stamm isoliert; ein anderer Stamm dieser Art wurde von Ewers et al. (1990) isoliert, der Isopren abbaut und gleichfalls TCE oxidiert. Der erfindungsgemäße Stamm wuchs jedoch überhaupt nicht auf Isopren.

Es gibt offensichtlich verschiedene Oxygenasen, die gegenüber TCE aktiv sind. So klonierten Winter et al. (1989) ein 20,5 kb großes Fragment von Pseudomonas mendocina in Escherichia coli und zeigten, daß der rekombinate E. coli-Stamm TCE abbauen konnte. Da das DNA-Fragment Gene enthielt, die den Toluol-Monooxygenase-Enzymkomplex kodieren, kann man annehmen, daß dieses Enzym, das ein einzelnes Sauerstoffatom in para-Stellung des Toluols unter Bildung von p-Cresol einfügt, auch TCE oxidiert. Die Toluol-Dioxygenase von Pseudomonas putida ist offensichtlich in der Lage, eine ähnliche Oxidation durchzuführen (Wackett & Gibson 1988), da ein rekombinanter E. coli-Stamm, der die genetische Information zur Synthese dieses Enzyms enthält, TCE oxidieren kann (Zylstra et al. 1989). Ein drittes System zu TCE-Abbau wurde von Shields et al. (1989) im Bakterium G4 entdeckt. Es enthält keine Toluol-Dioxygenase, hydroxyliert jedoch allmählich Toluol über o-Cresol zu 3-Methylcatechol. Shields et al. (1991) konnten zeigen, da die TCE-Oxidation direkt mit der Fähigkeit zur Monooxygenierung zusammenhängt, die für die Toluol-Hydroxylierung verantwortlich ist.

Im Rahmen der erfindungsgemäßen Untersuchungen konnte nicht festgestellt werden, welches Enzym der isolierten Stämme R. erythropolis BD1 und Pseudomonas spec. JR1 TCE-Oxidationsaktivität zeigt. Es könnte die Isopropylbenzol-Dioxygenase sein. Im Hinblick auf die Beziehung, die zwischen der Fähigkeit zum Wachstum auf Isopropylbenzol und zur Oxidation von TCE ermittelt wurde, könnte der voluminöse Isopropylrest in Nachbarschaft zu der zu oxidierenden Doppelbindung ein wichtiges Strukturelement für das Enzym sein. Dieses Element könnte durch die zwei Chloratome eines der Kohlenstoffatome von TCE imitiert werden.

Obere Grenzen für die TCE-Konzentration, bei der noch ein Abbau möglich ist, konnten nicht ermittelt werden. Es wurde lediglich festgestellt, daß bis zu einer Konzentration von 200 µM TCE die Ausgangsraten des TCE-Abbaus zunehmen, und daß die Zeit, nach der die Aktivität einschläft, konzentrationsunabhängig ist. Diese offensichtliche Inaktivierung der Zellen muß jedoch nicht das Ergebnis toxischer TCE-Effekte sein, da die Inaktivierung der Zellen mit Hilfe bestimmter Substrate überwunden werden kann. Diese Tatsache und das breite pH-Optimum, die maximale TCE-Abbauaktivität bei niedrigen Temperaturen und die unbeeinflußte TCE-Abbauaktivität bei R. erythropolis in Gegenwart von Bodensuspensionen sind vielversprechend, insbesondere im Hinblick auf eine Anwendung bei biologischen Dekontaminationen.

Nachstehend wird die Erfindung mit Figuren noch näher erläutert.

Fig. 1: Zeitabhängigkeit und Beziehung zwischen TCE-Abbau und Chloridbildung durch mit Isopropylbenzol induzierte ruhende Zellen von Rhodococcus erythropolis BD1 und Pseudomonas spec. JR1. TCE-Verbrauch des Stammes BD1 (▲) und des Stammes JR1 (Δ); Chloridfreisetzung beim Stamm BD1 (⚫) und des Stammes JR1 (○). Proteinkonzentration 340 µg/ml beim Stamm BD1 und 310 µg/ml beim Stamm JR1.

Fig. 2: Einfluß erhöhter TCE-Konzentration auf seinen Abbau durch ruhende Zellen von Rhodococcus erythropolis BD1, die auf Isopropylbenzol gewachsen sind. Die Zellsuspensionen (400 µg Protein/ml) wurden mit 25 µM (Δ), 50 µM (⚫), 100 µM (▲) und 200 µM (○) TCE supplementiert; der TCE-Verbrauch wurde über die Zeit aufgezeichnet (A). Die anfänglichen TCE-Abbauraten wurden gegen die anfängliche TCE-Konzentration aufgezeichnet (B).

Fig. 3: Einfluß von pH (A) und Temperatur (B) auf die Fähigkeit zum TCE-Abbau von auf Isopropylbenzol aufgewachsenen Zellen von Rhodococcus erythropolis BD1 (▲) und Pseudomonas spec. JR1 (Δ). Die Zellsuspensionen (Stamm BD1: 400 µg Protein/ml, Stamm JR1 300 µg Protein/ml) wurden mit TCE 2,5 h lang inkubiert; danach wurde abgebautes TCE bestimmt. Die Ausgangs-TCE-Konzentration betrug 50 µM für Stamm BD1 und 75 µM für Stamm JR1.

Isopropylbenzol als Induzierungsmittel für den TCE-Abbau: Unter Einsatz von Bodenproben eines mit TCE-kontaminierten Bereichs und von nicht-kontaminierten Stellen wurden Anreicherungen mit den Substraten vorgenommen, die in Tabelle 1 angeführt sind. Diese Substrate wurden gewählt, da sie sämtlich Doppelbindungen aufweisen, die von mehr oder weniger voluminösen Resten flankiert sind, die die Struktur des TCE-Moleküls imitieren. Es wurde eine Anzahl von Stämmen isoliert und ihre Fähigkeit TCE abzubauen, getestet. Dazu inkubierte man Zellsuspensionen nach Wachstum auf den angeführten Substraten mit TCE 24 h lang. Aus Tabelle 1 läßt sich entnehmen, daß alle auf Isopropylbenzol isolierten Stämme TCE abbauen konnten, etwa 50% der Toluol-Verwerter TCE abbauen konnten, jedoch nur zwei Stämme unter neun, die auf Phenol wuchsen. Stämme, die mit Citronellol und Dipenten isoliert wurden, zeigten keine Fähigkeit zum Abbau von TCE. Daraus ergibt sich, daß Isopropylbenzol offensichtlich sehr geeignet ist, eine TCE-Oxidation spezifisch zu induzieren.

Tabelle 1

Beziehung zwischen der Substratart zur Anreicherung und der Fähigkeit zum TCE-Abbau

Charakterisierung eines Gram-positiven und eines Gram-negativen Isopropylbenzol-Verwerters: Unter 27 Isolaten wurden zwei zur Charakterisierung und zum weiteren Studium herausgegriffen. Beide Stämme, und zwar Stamm BD1 und Stamm JR1, wurden von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM, Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland) identifiziert, und zwar der erste Stamm als Rhodococcus erythropolis. Für den zweiten Stamm wurde eine enge Beziehung zu Pseudomonas fluorescens, P. aureofaciens und P. chlororaphis festgestellt, wobei jedoch keine Fluoreszens festgestellt wurde, so daß dieser Stamm hier als Pseudomonas spec. JR1 bezeichnet wird. Es interessierte nun festzustellen, bei welchen Substraten die Fähigkeit zum TCE-Abbau induziert werden konnte. Beide Organismen sind in der Lage, auf einer Anzahl aromatischer Verbindungen zu wachsen, jedoch bauten nur die auf Isopropylbenzol oder Toluol gewachsenen Zellen TCE ab (Tabelle 2). Isobutyrat, ein Zwischenprodukt beim Isopropylbenzol-Abbau (Eaton & Timmis 1984 und 1986) gestattete ein Wachstum beider Isolate, dennoch wurde kein TCE-Abbau induziert. Es konnte kein Wachstum auf p-Cumol, Cuminsäure, Zimtalkohol, Zimtsäure, Diphenten, Geraniol, Citronellol und Anisöl festgestellt werden. Es ist erwähnenswert, daß der erfindungsgemäße Stamm von R. erythropolis nicht auf Isopren wächst, das nach Ewers et al. (1990) eine Aktivität zum TCE-Abbau beim bekannten R. erythropolis-Stamm induzierte.

Tabelle 2

Substrate zum Wachstum der Stämme JR1 und BD1 und ihre Fähigkeit, einen TCE-Abbau zu induzieren

Bildung stöchiometrischer Chloridmengen aus TCE: es war wichtig zu zeigen, daß TCE vollständig enthalogeniert wurde; daher wurde die Abnahme der TCE-Konzentration in Abhängigkeit von der Zeit und ferner die Chloridfreisetzung in das Medium verfolgt. Aus dem Versuch, der mit Fig. 1 für Pseudomonas spec. JR 1 und R. erythropolis BD1 dargestellt ist, ergibt sich, daß pro abgebautes mol TCE 3 mol Chlorid in das Medium freigesetzt wurden. Die TCE-Abbaurate nahm mit der Zeit ab; innerhalb der ersten 20 min betrug sie 1,14 nmol × min^-1 × mg^-1 Protein beim Stamm BD1 und 0,84 nmol × min^-1 × mg^-1 Protein beim Stamm JR1.

Ferner wurde untersucht, ob sich Zwischenprodukte des TCE-Abbaus in gewissem Maß im Kulturmedium anreicherten. Das war jedoch nicht der Fall; weder wurden Vinylchlorid noch Dichlorethene in nachweisbaren Mengen ermittelt.

Substrat Spezifität: Es wurde untersucht, welche chlorierten Verbindungen von den Isolaten zusätzlich zu TCE abgebaut werden konnten. Die in Tabelle 3 zusammengestellten Daten zeigen, daß cis-1,2-Dichlorethen und auch trans-1,2-Dichlorethen leicht von beiden Stämmen metabolisiert werden konnten. Während Stamm BD1 auf Trichlor- und 1,2-Dichlorethene beschränkt zu sein scheint, zeigt Stamm JR1 eine signifikante katabolische Aktivität gegenüber anderen getesteten chlorierten Verbindungen, wobei Perchlorethen ausgenommen ist.

Tabelle 3

Abbau von chlorierten Aliphaten durch Zellen von Rhodococcus erythropolis BD1 und Pseudomonas spec. JR1, die durch Isopropylbenzol induziert sind

Einfluß erhöhter TCE-Konzentration: Die bisher berichteten Versuche wurden mit TCE in einer Konzentration von 50 µM durchgeführt. Bei weiteren Versuchen wurde TCE in einer Konzentration von 200 µM getestet. Wie man Fig. 2 entnehmen kann, resultierten erhöhte Ausgangs-TCE-Konzentrationen in erhöhten Anfangsraten des TCE-Abbaus; es wurde eine lineare Abhängigkeit beobachtet (Fig. 2B). TCE einer Konzentration von 200 µM wurde leicht abgebaut, wobei jedoch die Aktivität der Zellsuspensionen nach etwa 2 h unabhängig von der Ausgangs-TCE-Konzentration abnahm und der Abbauvorgang langsamer wurde. Die abgebauten TCE-Mengen nach den ersten 2 h betrugen:
84 µM ausgehend von 200 µM TCE
51 µM ausgehend von 100 µM TCE
29 µM ausgehend von 50 µM TCE
18 µM ausgehend von 25 µM TCE.

Die maximale anfängliche Abbaurate betrug 5,0 nmol × min^-1 × mg Protein^-1 bei Stamm BD1 bei einer TCE-Ausgangskonzentration von 200 µM. Bei Stamm JR1 wurden entsprechende Ergebnisse erhalten; ausgehend von 200 µM wurde eine maximale TCE-Abbaurate von 4,0 nmol × min^-1 × mg Protein^-1 erzielt.

Bestimmung von Parametern, die für die Verwendung der isolierten Stämme bei biologischer Dekontamination von Bedeutung sind: für Stamm BD1 war ein breiter optimaler pH-Bereich von 5,5 bis 8,0 charakteristisch; demgegenüber zeigte Stamm JR1 eine maximale TCE-Abbauaktivität in einem mehr alkalischen pH-Bereich um 8,5 (Fig. 3A).

Der Einfluß der Temperatur wurde in einem Versuch getestet, bei dem die Zellsuspensionen mit TCE bei Temperaturen inkubiert worden waren, die im Bereich von 10 bis 40°C variierten. Die in Fig. 3B zusammengestellten Daten zeigen, daß beide Stämme ihre Höchstaktivität bei etwa 20°C besaßen, jedoch auch bei etwa 10 °C recht aktiv waren. Höhere Temperaturen von beispielsweise etwa 30 und etwa 40°C führten zu einer ausgeprägten Inhibierung des Abbauvermögens. Beide Stämme wuchsen bei Temperaturen im Bereich von 4 bis 30°C, wobei bei etwa 37°C und höheren Temperaturen überhaupt kein Wachstum festgestellt werden konnte.

Beispiel

Isolation von Stämmen und Wachstumsbedingungen: Das Mineralmedium (M1), das zur Isolation und für Abbauversuche verwendet wurde, bestand aus den folgenden Komponenten pro Liter: 1 g KNO₃; 0,82 g MgSO₄ × 7 H₂O; 0,58 g Na₂HPO₄ × 2 H₂O; 1 ml Spurenelementlösung (Tschech & Pfennig 1984); 1 ml Vitaminlösung (Claus et al. 1983); der End-pH-Wert des Mediums wurde auf 7,0 mit 1 M H₂SO₄ eingestellt. Für feste Medien wurden 1,5% Bacto- Agar (Difco, Detroit, USA)) zugegeben. Zur Anreicherung von TCE- abbauenden Stämmen wurden Boden- und Wasserproben von der Bille (einem Fluß bei Hamburg, Bundesrepublik Deutschland), dem Freihafen Hamburg und ein mit Toluol und TCE kontaminierter Boden aus der Umgebung von Northeim (Bundesrepublik Deutschland) zu dem Medium M1 zugegeben, das 2 mM der im Text genannten Substrate enthielt. Die Inkubation wurde auf einem Rotationsschüttler (130 U/min) bei 15 und 30°C durchgeführt. Das Bakterienwachstum war im allgemeinen 3 bis 14 Tage nach dem Beginn derartiger Kulturen sichtbar. Nach zwei Übertragungen wurden reine Isolate dadurch erhalten, daß man Aliquots der Mischkulturen auf festes Medium M1 gab, das das Substrat enthielt, das zur Anreicherung eingesetzt wurde; drei aufeinanderfolgende Vereinzelungen folgten. Zum Wachstum auf festen Medien auf Kosten flüchtiger aromatischer Verbindungen, wie Isopropylbenzol, Toluol und Phenol, wurden 20 bis 60 µl des jeweils angegebenen Substrats auf Filterscheiben gegeben (Durchmesser 6 mm), die auf den Deckel von Petrischalen plaziert wurden. Die Schalen wurden mit der Oberseite nach unten in verschlossenen gasdichten Töpfen inkubiert.

Zur Bestimmung von Reinheit und Einheitlichkeit der Stämme gehörten die folgenden Kriterien:
Morphologie und Farbe der Kolonie;
Morphologie und Beweglichkeit der Zellen (bestimmt unter dem Lichtmikroskop);
Optische Dichte (OD_600nm) und pH nach 24stündigem Wachstum; und Wachstum auf festem Komplexmedium (LB-Medium; vergl. Maniatis et al. 1982);
Falls reine Isolate in mindestens einer dieser Kriterien abwichen, wurden sie als verschiedene Stämme betrachtet.

Rhodococcus erythropolis BD1 wurde aus einer mit Toluol und TCE kontaminierten Bodenprobe durch Anreicherung mit Isopropylbenzol isoliert; mit demselben Substrat wurde Pseudomonas spec. JR1 aus einer Wasserprobe der Bille erhalten.

Für weitere Versuche ließ man die Stämme in gasdicht verschlossenen Erlenmeyer-Kolben wachsen, die zu 1/5 ihres Volumens mit dem Medium gefüllt waren. Die Kultivierung wurde bei 30°C auf einem Rotationsschüttler (130 rpm) durchgeführt.

TCE-Abbau Untersuchungen mit ruhenden Zellen (resting cells): Man ließ die Zellen auf den angegebenen Substraten (2 mM, sofern nichts anderes angegeben) 24 h lang wachsen. Sofern Isopropylbenzol als induzierendes Substrat diente, wurden die Kulturen bei einer Isopropylbenzol-Ausgangskonzentration von 2 mM inokuliert. Nach einem Wachstum von 10 und 22 h wurden sie mit einer weiteren Menge von 2 mM bzw. 1 mM Isopropylbenzol versorgt. Danach wurden sie geerntet, einmal gewaschen und erneut in einem Puffer (20 mM Natrium/Kalium-Phosphat mit 5 mM Magnesiumsulfat ergänzt) suspendiert. Der pH-Wert bei Versuchen mit Stamm BD1 war 7,0 und beim Stamm JR1 7,5. 10 ml der Zellsuspensionen (200 bis 400 µg Protein/ml sofern nichts anderes angegeben) wurden in 125-ml-Serumflaschen überführt, die durch mit Teflon ausgekleidete Miniert-Ventile verschlossen waren. TCE- Stammlösungen wurden in Dimethylformamid (DMF, 100 bzw. 200 mM) hergestellt; daraus gab man Aliquots zu, um die gewünschte TCE- Endkonzentration zu erhalten. Es wurden nicht mehr als 10 µl der Stammlösungen je 10 ml Zellsuspension zugegeben, um irgendwelche unerwünschten Nebeneffekte des DMF zu vermeiden. Die Flaschen wurden bei 30°C und 150 U/min geschüttelt.

Der TCE-Bioabbau wurde durch Gasphasen-Gaschromatographie (headspace gas chromatography) quantifiziert. Man zog 5 µl Gasphase mit einer 10 µl Hamilton-Spritze (Hamilton (Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland)) ab und analysierte mit einem Gaschromatographen (438 A), der mit einem Elektronenfallen-Detektor (electron capture detector) und einer fused Siliciumdioxyd-Capillarsäule versehen war (CP-Sil 8 CB; 50 m × 0,25 mm; Chrompack BV (Frankfurt, Bundesrepublik Deutschland)). Es wurden die folgenden Operationsbedingungen angewandt: Säulentemperatur 80°C; Injektortemperatur 200°C, Detektortemperatur 250°C. Trägergas und Aufbereitungsgas waren Stickstoff. Tägliche Eichkurven wurden mit drei verschiedenen Standards von 25 bis 100 µM erstellt. Alle Konzentrationen flüchtiger Substrate wurden so berechnet, als ob sie vollständig gelöst in wäßriger Phase vorlagen.

Vinylchlorid und andere chlorierte flüchtige Verbindungen wurden durch GC-MS-Analyse bestimmt (Perkin-Elmer, Modell 8500 (Überlingen, Bundesrepublik Deutschland)).

Bei den TCE-Bioabbauversuchen konnten niemals andere flüchtige chlorierte Verbindungen durch GC-Analysen ermittelt werden.

Zur Bestimmung der Fähigkeit zum TCE-Abbau bei verschiedenen pH- Werten wurden verschiedene Puffersysteme verwendet; 30 mM Natrium/Calium-Phosphatpuffer im Bereich von pH 5,5 bis 8,0 und 12,5 mM Natrium-Boratpuffer im Bereich von pH 7,5 bis 9,5.

Die Temperaturabhängigkeit der Fähigkeit zum TCE-Abbau wurde bei pH 7,0 für Rhodococcus erythropolis BD1 und pH 7,5 für Pseudomonas spec. JR1 ermittelt.

Chlorid- und Proteinbestimmung: Freisetzung von Chlorid wurde in Kulturüberständen mit einer Ionen-sensitiven Kombinationselektrode bestimmt (Modell 9617 von Orion Research Inc. (Cambridge, USA)). Man gab 100 µl des Ionenstärke-Einstellmittels (1M KNO₃) zu 10 ml Calibrierstandard und den Überständen vor der jeweiligen Messung. Calibrierkurven wurden mit 10 bis 500 µM Chlorid erstellt.

Zellprotein wurde nach der Methode von Schmidt et al. (1963) bestimmt, wobei Rinderserum Albumin als Proteinstandard verwendet wurde. Für den Gram-positiven Stamm BD1 war eine Modifikation erforderlich, um die Zellen zu lysieren. Die Zellpellets wurden nur in Lösung A (4M NaOH) statt in Lösung A plus Wasser gekocht, wobei Wasser nach dem Abkühlen zugegeben wurde.

Chemikalien: Isopropylbenzol und alle chlorierten Verbindungen mit Ausnahme von TCE wurden von Aldrich Chemie (Steinheim, Bundesrepublik Deutschland) bezogen. TCE, Isobutyrat und Dipenten wurden von Fluka (Neu-Ulm, Bundesrepublik Deutschland) bezogen. Toluol und Phenol wurden von Merck (Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland) bezogen; Citronellol wurde von Sigma Chemicals (Deisenhofen, Bundesrepublik Deutschland) bezogen. Alle organischen Lösungsmittel und anorganischen Chemikalien waren von höchster im Handel erhältlicher Reinheit.

Literature

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Claims

1. Mittel zur biologischen Bekämpfung von TCE-Kontaminationen, gekennzeichnet durch Cumol (Isopropylbenzol).

2. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet zusätzlich durch Trichlorethen (TCE) abbauende Bakterien.

3. TCE-abbauende und auf Cumol-kultivierbare Bakterien, dadurch gewinnbar, daß man von natürlichen Böden oder Gewässern isolierte Bakterien in Gegenwart von Cumol heranzieht und gewinnt.

4. Verfahren zur Bekämpfung von TCE-Kontaminationen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mittel vorsieht, das Cumol als Substrat für TCE-abbauende Bakterien enthält oder daraus besteht, und diese Bakterien TCE, das in damit kontaminierten Böden oder Gewässern vorliegt, abbauen läßt, wobei die Bakterien im Mittel und/oder im Boden bzw. Gewässer vorliegen.

5. Verwendung der Bakterien gemäß Anspruch 3 zur biologischen Bekämpfung von TCE-Kontaminationen.

6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bakterien in Form einer Suspension zur Dekontaminierung von mit TCE kontaminierten Wasserströmen einsetzt.

7. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bakterien in auf einem Träger immobilisierter Form zur Dekontaminierung von mit TCE kontaminierten Wasserströmen verwendet.

8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger Aktivkohle, Glasteilchen, wie Sinterglas, oder Kunststoffteilchen, wie Polyurethanteilchen, verwendet.