DE4142063A1 - Mittel gegen tce-kontaminationen, bakterien und verfahren dafuer sowie verwendung der bakterien - Google Patents
Mittel gegen tce-kontaminationen, bakterien und verfahren dafuer sowie verwendung der bakterienInfo
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Description
Trichlorethan (TCE) wird in großem Umfang in der Metall- und der
Glasindustrie zum Entfernen von Fett verwendet, wodurch es sich
stellenweise im Grundwasser und im Boden angereichert hat, da es
biologisch kaum abbaubar ist. TCE kann nach der folgenden Gleichung
oxidiert werden:
CHCl = CCl₂ + H₂O + 1,5 O₂ → 2 CO₂ + 3 HCl
Aufgrund thermodynamischer Überlegungen ist es recht unwahrscheinlich,
daß Organismen auf Basis der TCE-Oxidation wachsen
können; daher ist es nicht überraschend, daß bisher nur von Co-
Oxidation von TCE berichtet worden ist. Substrate, die in bestimmten
Bakterienstämmen die Fähigkeit zur TCE-Oxidation induzieren,
sind folgende:
Toluol (Nelson et al. 1987; Wackett & Gibson 1988; Winter et al. 1989; Shields et al. 1991);
Phenol (Folsom et al. 1990; Harker & Kim 1990);
Methan (Wilson & Wilson 1985; Fogel et al. 1986; Oldenhuis et al. 1989; Tsien et al. 1989; Henry & Grbic-Galic 1991);
Propan (Wackett et al. 1989)
Isopren (Ewers et al. 1990); und
Ammoniak (Arciero et al. 1989).
Toluol (Nelson et al. 1987; Wackett & Gibson 1988; Winter et al. 1989; Shields et al. 1991);
Phenol (Folsom et al. 1990; Harker & Kim 1990);
Methan (Wilson & Wilson 1985; Fogel et al. 1986; Oldenhuis et al. 1989; Tsien et al. 1989; Henry & Grbic-Galic 1991);
Propan (Wackett et al. 1989)
Isopren (Ewers et al. 1990); und
Ammoniak (Arciero et al. 1989).
Das Wachstum von Gram-negativen stäbchenförmigen Bakterien auf
Isopropylbenzol wurde von Omori et al. (1975) und von Eaton &
Timmis (1986) berichtet. Der Weg, auf dem Isopropylbenzol abgebaut
wird, wurde aus Studien an Mutanten abgeleitet, die mit den
Transposon Tn5 erzeugt worden waren. Man identifizierte Zwischenprodukte,
die sich in bestimmten Mutanten anhäuften, maß
Enzymaktivitäten und schloß, daß Isopropylbenzol zu 3-Isopropylcatechol
oxidiert wird, worauf eine meta-Spaltung und weitere
Reaktionen folgen, die zur Bildung von 4-Hydroxy-2-oxovalerat
und Isobutyrat führen (Eaton & Timmis 1984 und 1986). Jigami et
al. (1975) schlugen die gleiche Route vor. In Übereinstimmung
mit der vorgeschlagenen Route steht, daß der Stamm ipba (Eaton &
Timmis 1986) und die der im folgenden noch zu erläuternden Erfindung
zugrundeliegenden Stämme auf Isobutyrat wachsen.
Nach wie vor besteht ein Bedürfnis, ein Wachstumssubstrat zu
finden, das allen damit wachsenden Bakterienstämmen die Fähigkeit
zur Oxidation von TCE verleiht. Nur dann kann die Effektivität
der TCE-Oxidation in Boden und Gewässern entscheidend
verbessert werden. Von den bisher bekannten Substraten wird
diese Forderung nicht erfüllt.
Dazu wurden verschiedene Bakterienisolate aus Anreicherungen mit
Isopropylbenzol (Cumol), Toluol und Phenol als Kohlenstoff- und
Energiequellen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Oxidation von
TCE getestet. Im Unterschied zu Toluol und Phenol waren alle auf
Isopropylbenzol angereicherten Isolate in der Lage, TCE zu oxidieren.
Zwei Isolate wurden für weitere Untersuchungen herangezogen,
und zwar die Stämme JR1 und BD1, die als Pseudomonas
spec. bzw. Rhodococcus erythropolis identifiziert wurden. Die
TCE-Oxidation war von einer Freisetzung stöchiometrischer
Chloridmengen begleitet. Die anfängliche TCE-Oxidationsrate
stieg proportional zur Substrat-Konzentration von 25 auf 200 µM
TCE. Als maximale anfängliche TCE-Abbauraten wurden im vorliegenden
Zusammenhang 4 bis 5 nmol × min-1 × mg Protein-1 ermittelt.
Der TCE-Abbau nahm im Verlauf der Zeit ab. Die beiden Isolate
zeigten ein Temperaturoptimum für den TCE-Abbau im Bereich
von 10 bis 20°C. Untersuchungen zur Substratspezifität zeigten
ausgeprägte Unterschiede zwischen den beiden Isolaten. Zusätzlich
zum TCE oxidierte R. erythropolis BD1 nur noch cis- und
trans-Dichlorethen, während Pseudomonas spec. JR1 in der Lage
war, auch noch 1,1-Dichlorethen, Vinylchlorid, Trichlorethan und
1,2-Dichlorethan zu oxidieren.
Das erfindungsgemäße Gram-positive Bakterium, das auf Isopropylbenzol
isoliert wurde, wurde als Rhodococcus erythropolis-Stamm
isoliert; ein anderer Stamm dieser Art wurde von Ewers et al.
(1990) isoliert, der Isopren abbaut und gleichfalls TCE oxidiert.
Der erfindungsgemäße Stamm wuchs jedoch überhaupt nicht
auf Isopren.
Es gibt offensichtlich verschiedene Oxygenasen, die gegenüber
TCE aktiv sind. So klonierten Winter et al. (1989) ein 20,5 kb
großes Fragment von Pseudomonas mendocina in Escherichia coli
und zeigten, daß der rekombinate E. coli-Stamm TCE abbauen
konnte. Da das DNA-Fragment Gene enthielt, die den Toluol-Monooxygenase-Enzymkomplex
kodieren, kann man annehmen, daß dieses
Enzym, das ein einzelnes Sauerstoffatom in para-Stellung des Toluols
unter Bildung von p-Cresol einfügt, auch TCE oxidiert. Die
Toluol-Dioxygenase von Pseudomonas putida ist offensichtlich in
der Lage, eine ähnliche Oxidation durchzuführen (Wackett & Gibson
1988), da ein rekombinanter E. coli-Stamm, der die genetische
Information zur Synthese dieses Enzyms enthält, TCE oxidieren
kann (Zylstra et al. 1989). Ein drittes System zu TCE-Abbau
wurde von Shields et al. (1989) im Bakterium G4 entdeckt. Es
enthält keine Toluol-Dioxygenase, hydroxyliert jedoch allmählich
Toluol über o-Cresol zu 3-Methylcatechol. Shields et al. (1991)
konnten zeigen, da die TCE-Oxidation direkt mit der Fähigkeit
zur Monooxygenierung zusammenhängt, die für die Toluol-Hydroxylierung
verantwortlich ist.
Im Rahmen der erfindungsgemäßen Untersuchungen konnte nicht
festgestellt werden, welches Enzym der isolierten Stämme R. erythropolis
BD1 und Pseudomonas spec. JR1 TCE-Oxidationsaktivität
zeigt. Es könnte die Isopropylbenzol-Dioxygenase sein. Im Hinblick
auf die Beziehung, die zwischen der Fähigkeit zum Wachstum
auf Isopropylbenzol und zur Oxidation von TCE ermittelt wurde,
könnte der voluminöse Isopropylrest in Nachbarschaft zu der zu
oxidierenden Doppelbindung ein wichtiges Strukturelement für das
Enzym sein. Dieses Element könnte durch die zwei Chloratome
eines der Kohlenstoffatome von TCE imitiert werden.
Obere Grenzen für die TCE-Konzentration, bei der noch ein Abbau
möglich ist, konnten nicht ermittelt werden. Es wurde lediglich
festgestellt, daß bis zu einer Konzentration von 200 µM TCE die
Ausgangsraten des TCE-Abbaus zunehmen, und daß die Zeit, nach
der die Aktivität einschläft, konzentrationsunabhängig ist.
Diese offensichtliche Inaktivierung der Zellen muß jedoch nicht
das Ergebnis toxischer TCE-Effekte sein, da die Inaktivierung
der Zellen mit Hilfe bestimmter Substrate überwunden werden
kann. Diese Tatsache und das breite pH-Optimum, die maximale
TCE-Abbauaktivität bei niedrigen Temperaturen und die unbeeinflußte
TCE-Abbauaktivität bei R. erythropolis in Gegenwart von
Bodensuspensionen sind vielversprechend, insbesondere im Hinblick
auf eine Anwendung bei biologischen Dekontaminationen.
Nachstehend wird die Erfindung mit Figuren noch näher erläutert.
Fig. 1: Zeitabhängigkeit und Beziehung zwischen TCE-Abbau und
Chloridbildung durch mit Isopropylbenzol induzierte ruhende Zellen
von Rhodococcus erythropolis BD1 und Pseudomonas spec. JR1.
TCE-Verbrauch des Stammes BD1 (▲) und des Stammes JR1 (Δ);
Chloridfreisetzung beim Stamm BD1 (⚫) und des Stammes JR1
(○). Proteinkonzentration 340 µg/ml beim Stamm BD1 und 310
µg/ml beim Stamm JR1.
Fig. 2: Einfluß erhöhter TCE-Konzentration auf seinen Abbau
durch ruhende Zellen von Rhodococcus erythropolis BD1, die auf
Isopropylbenzol gewachsen sind. Die Zellsuspensionen (400 µg
Protein/ml) wurden mit 25 µM (Δ), 50 µM (⚫), 100 µM (▲) und
200 µM (○) TCE supplementiert; der TCE-Verbrauch wurde über
die Zeit aufgezeichnet (A). Die anfänglichen TCE-Abbauraten wurden
gegen die anfängliche TCE-Konzentration aufgezeichnet (B).
Fig. 3: Einfluß von pH (A) und Temperatur (B) auf die Fähigkeit
zum TCE-Abbau von auf Isopropylbenzol aufgewachsenen Zellen von
Rhodococcus erythropolis BD1 (▲) und Pseudomonas spec. JR1 (Δ).
Die Zellsuspensionen (Stamm BD1: 400 µg Protein/ml, Stamm JR1
300 µg Protein/ml) wurden mit TCE 2,5 h lang inkubiert; danach
wurde abgebautes TCE bestimmt. Die Ausgangs-TCE-Konzentration
betrug 50 µM für Stamm BD1 und 75 µM für Stamm JR1.
Isopropylbenzol als Induzierungsmittel für den TCE-Abbau: Unter
Einsatz von Bodenproben eines mit TCE-kontaminierten Bereichs
und von nicht-kontaminierten Stellen wurden Anreicherungen mit
den Substraten vorgenommen, die in Tabelle 1 angeführt sind.
Diese Substrate wurden gewählt, da sie sämtlich Doppelbindungen
aufweisen, die von mehr oder weniger voluminösen Resten flankiert
sind, die die Struktur des TCE-Moleküls imitieren. Es
wurde eine Anzahl von Stämmen isoliert und ihre Fähigkeit TCE
abzubauen, getestet. Dazu inkubierte man Zellsuspensionen nach
Wachstum auf den angeführten Substraten mit TCE 24 h lang. Aus
Tabelle 1 läßt sich entnehmen, daß alle auf Isopropylbenzol isolierten
Stämme TCE abbauen konnten, etwa 50% der Toluol-Verwerter
TCE abbauen konnten, jedoch nur zwei Stämme unter neun,
die auf Phenol wuchsen. Stämme, die mit Citronellol und Dipenten
isoliert wurden, zeigten keine Fähigkeit zum Abbau von TCE. Daraus
ergibt sich, daß Isopropylbenzol offensichtlich sehr geeignet
ist, eine TCE-Oxidation spezifisch zu induzieren.
Charakterisierung eines Gram-positiven und eines Gram-negativen
Isopropylbenzol-Verwerters: Unter 27 Isolaten wurden zwei zur
Charakterisierung und zum weiteren Studium herausgegriffen.
Beide Stämme, und zwar Stamm BD1 und Stamm JR1, wurden von der
Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM,
Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland) identifiziert, und
zwar der erste Stamm als Rhodococcus erythropolis. Für den zweiten
Stamm wurde eine enge Beziehung zu Pseudomonas fluorescens,
P. aureofaciens und P. chlororaphis festgestellt, wobei jedoch
keine Fluoreszens festgestellt wurde, so daß dieser Stamm hier
als Pseudomonas spec. JR1 bezeichnet wird. Es interessierte nun
festzustellen, bei welchen Substraten die Fähigkeit zum TCE-Abbau
induziert werden konnte. Beide Organismen sind in der Lage,
auf einer Anzahl aromatischer Verbindungen zu wachsen, jedoch
bauten nur die auf Isopropylbenzol oder Toluol gewachsenen Zellen
TCE ab (Tabelle 2). Isobutyrat, ein Zwischenprodukt beim
Isopropylbenzol-Abbau (Eaton & Timmis 1984 und 1986) gestattete
ein Wachstum beider Isolate, dennoch wurde kein TCE-Abbau induziert.
Es konnte kein Wachstum auf p-Cumol, Cuminsäure, Zimtalkohol,
Zimtsäure, Diphenten, Geraniol, Citronellol und Anisöl
festgestellt werden. Es ist erwähnenswert, daß der erfindungsgemäße
Stamm von R. erythropolis nicht auf Isopren wächst, das
nach Ewers et al. (1990) eine Aktivität zum TCE-Abbau beim bekannten
R. erythropolis-Stamm induzierte.
Bildung stöchiometrischer Chloridmengen aus TCE: es war wichtig
zu zeigen, daß TCE vollständig enthalogeniert wurde; daher wurde
die Abnahme der TCE-Konzentration in Abhängigkeit von der Zeit
und ferner die Chloridfreisetzung in das Medium verfolgt. Aus
dem Versuch, der mit Fig. 1 für Pseudomonas spec. JR 1 und R.
erythropolis BD1 dargestellt ist, ergibt sich, daß pro abgebautes
mol TCE 3 mol Chlorid in das Medium freigesetzt wurden. Die
TCE-Abbaurate nahm mit der Zeit ab; innerhalb der ersten 20 min
betrug sie 1,14 nmol × min-1 × mg-1 Protein beim Stamm BD1 und
0,84 nmol × min-1 × mg-1 Protein beim Stamm JR1.
Ferner wurde untersucht, ob sich Zwischenprodukte des TCE-Abbaus
in gewissem Maß im Kulturmedium anreicherten. Das war jedoch
nicht der Fall; weder wurden Vinylchlorid noch Dichlorethene in
nachweisbaren Mengen ermittelt.
Substrat Spezifität: Es wurde untersucht, welche chlorierten
Verbindungen von den Isolaten zusätzlich zu TCE abgebaut werden
konnten. Die in Tabelle 3 zusammengestellten Daten zeigen, daß
cis-1,2-Dichlorethen und auch trans-1,2-Dichlorethen leicht von
beiden Stämmen metabolisiert werden konnten. Während Stamm BD1
auf Trichlor- und 1,2-Dichlorethene beschränkt zu sein scheint,
zeigt Stamm JR1 eine signifikante katabolische Aktivität gegenüber
anderen getesteten chlorierten Verbindungen, wobei Perchlorethen
ausgenommen ist.
Einfluß erhöhter TCE-Konzentration: Die bisher berichteten Versuche
wurden mit TCE in einer Konzentration von 50 µM durchgeführt.
Bei weiteren Versuchen wurde TCE in einer Konzentration
von 200 µM getestet. Wie man Fig. 2 entnehmen kann, resultierten
erhöhte Ausgangs-TCE-Konzentrationen in erhöhten Anfangsraten
des TCE-Abbaus; es wurde eine lineare Abhängigkeit beobachtet
(Fig. 2B). TCE einer Konzentration von 200 µM wurde leicht abgebaut,
wobei jedoch die Aktivität der Zellsuspensionen nach
etwa 2 h unabhängig von der Ausgangs-TCE-Konzentration abnahm
und der Abbauvorgang langsamer wurde. Die abgebauten TCE-Mengen
nach den ersten 2 h betrugen:
84 µM ausgehend von 200 µM TCE
51 µM ausgehend von 100 µM TCE
29 µM ausgehend von 50 µM TCE
18 µM ausgehend von 25 µM TCE.
84 µM ausgehend von 200 µM TCE
51 µM ausgehend von 100 µM TCE
29 µM ausgehend von 50 µM TCE
18 µM ausgehend von 25 µM TCE.
Die maximale anfängliche Abbaurate betrug 5,0 nmol × min-1 × mg
Protein-1 bei Stamm BD1 bei einer TCE-Ausgangskonzentration von
200 µM. Bei Stamm JR1 wurden entsprechende Ergebnisse erhalten;
ausgehend von 200 µM wurde eine maximale TCE-Abbaurate von 4,0
nmol × min-1 × mg Protein-1 erzielt.
Bestimmung von Parametern, die für die Verwendung der isolierten
Stämme bei biologischer Dekontamination von Bedeutung sind: für
Stamm BD1 war ein breiter optimaler pH-Bereich von 5,5 bis 8,0
charakteristisch; demgegenüber zeigte Stamm JR1 eine maximale
TCE-Abbauaktivität in einem mehr alkalischen pH-Bereich um 8,5
(Fig. 3A).
Der Einfluß der Temperatur wurde in einem Versuch getestet, bei
dem die Zellsuspensionen mit TCE bei Temperaturen inkubiert worden
waren, die im Bereich von 10 bis 40°C variierten. Die in
Fig. 3B zusammengestellten Daten zeigen, daß beide Stämme ihre
Höchstaktivität bei etwa 20°C besaßen, jedoch auch bei etwa 10
°C recht aktiv waren. Höhere Temperaturen von beispielsweise
etwa 30 und etwa 40°C führten zu einer ausgeprägten Inhibierung
des Abbauvermögens. Beide Stämme wuchsen bei Temperaturen im Bereich
von 4 bis 30°C, wobei bei etwa 37°C und höheren Temperaturen
überhaupt kein Wachstum festgestellt werden konnte.
Isolation von Stämmen und Wachstumsbedingungen: Das Mineralmedium
(M1), das zur Isolation und für Abbauversuche verwendet
wurde, bestand aus den folgenden Komponenten pro Liter: 1 g
KNO₃; 0,82 g MgSO₄ × 7 H₂O; 0,58 g Na₂HPO₄ × 2 H₂O; 1 ml Spurenelementlösung
(Tschech & Pfennig 1984); 1 ml Vitaminlösung
(Claus et al. 1983); der End-pH-Wert des Mediums wurde auf 7,0
mit 1 M H₂SO₄ eingestellt. Für feste Medien wurden 1,5% Bacto-
Agar (Difco, Detroit, USA)) zugegeben. Zur Anreicherung von TCE-
abbauenden Stämmen wurden Boden- und Wasserproben von der Bille
(einem Fluß bei Hamburg, Bundesrepublik Deutschland), dem Freihafen
Hamburg und ein mit Toluol und TCE kontaminierter Boden
aus der Umgebung von Northeim (Bundesrepublik Deutschland) zu
dem Medium M1 zugegeben, das 2 mM der im Text genannten Substrate
enthielt. Die Inkubation wurde auf einem Rotationsschüttler
(130 U/min) bei 15 und 30°C durchgeführt. Das
Bakterienwachstum war im allgemeinen 3 bis 14 Tage nach dem Beginn
derartiger Kulturen sichtbar. Nach zwei Übertragungen wurden
reine Isolate dadurch erhalten, daß man Aliquots der Mischkulturen
auf festes Medium M1 gab, das das Substrat enthielt,
das zur Anreicherung eingesetzt wurde; drei aufeinanderfolgende
Vereinzelungen folgten. Zum Wachstum auf festen Medien auf Kosten
flüchtiger aromatischer Verbindungen, wie Isopropylbenzol,
Toluol und Phenol, wurden 20 bis 60 µl des jeweils angegebenen
Substrats auf Filterscheiben gegeben (Durchmesser 6 mm), die auf
den Deckel von Petrischalen plaziert wurden. Die Schalen wurden
mit der Oberseite nach unten in verschlossenen gasdichten Töpfen
inkubiert.
Zur Bestimmung von Reinheit und Einheitlichkeit der Stämme gehörten
die folgenden Kriterien:
Morphologie und Farbe der Kolonie;
Morphologie und Beweglichkeit der Zellen (bestimmt unter dem Lichtmikroskop);
Optische Dichte (OD600nm) und pH nach 24stündigem Wachstum; und Wachstum auf festem Komplexmedium (LB-Medium; vergl. Maniatis et al. 1982);
Falls reine Isolate in mindestens einer dieser Kriterien abwichen, wurden sie als verschiedene Stämme betrachtet.
Morphologie und Farbe der Kolonie;
Morphologie und Beweglichkeit der Zellen (bestimmt unter dem Lichtmikroskop);
Optische Dichte (OD600nm) und pH nach 24stündigem Wachstum; und Wachstum auf festem Komplexmedium (LB-Medium; vergl. Maniatis et al. 1982);
Falls reine Isolate in mindestens einer dieser Kriterien abwichen, wurden sie als verschiedene Stämme betrachtet.
Rhodococcus erythropolis BD1 wurde aus einer mit Toluol und TCE
kontaminierten Bodenprobe durch Anreicherung mit Isopropylbenzol
isoliert; mit demselben Substrat wurde Pseudomonas spec. JR1
aus einer Wasserprobe der Bille erhalten.
Für weitere Versuche ließ man die Stämme in gasdicht verschlossenen
Erlenmeyer-Kolben wachsen, die zu 1/5 ihres Volumens mit
dem Medium gefüllt waren. Die Kultivierung wurde bei 30°C auf
einem Rotationsschüttler (130 rpm) durchgeführt.
TCE-Abbau Untersuchungen mit ruhenden Zellen (resting cells):
Man ließ die Zellen auf den angegebenen Substraten (2 mM, sofern
nichts anderes angegeben) 24 h lang wachsen. Sofern Isopropylbenzol
als induzierendes Substrat diente, wurden die Kulturen
bei einer Isopropylbenzol-Ausgangskonzentration von 2 mM
inokuliert. Nach einem Wachstum von 10 und 22 h wurden sie mit
einer weiteren Menge von 2 mM bzw. 1 mM Isopropylbenzol versorgt.
Danach wurden sie geerntet, einmal gewaschen und erneut
in einem Puffer (20 mM Natrium/Kalium-Phosphat mit 5 mM Magnesiumsulfat
ergänzt) suspendiert. Der pH-Wert bei Versuchen mit
Stamm BD1 war 7,0 und beim Stamm JR1 7,5. 10 ml der Zellsuspensionen
(200 bis 400 µg Protein/ml sofern nichts anderes angegeben)
wurden in 125-ml-Serumflaschen überführt, die durch mit Teflon
ausgekleidete Miniert-Ventile verschlossen waren. TCE-
Stammlösungen wurden in Dimethylformamid (DMF, 100 bzw. 200 mM)
hergestellt; daraus gab man Aliquots zu, um die gewünschte TCE-
Endkonzentration zu erhalten. Es wurden nicht mehr als 10 µl der
Stammlösungen je 10 ml Zellsuspension zugegeben, um irgendwelche
unerwünschten Nebeneffekte des DMF zu vermeiden. Die Flaschen
wurden bei 30°C und 150 U/min geschüttelt.
Der TCE-Bioabbau wurde durch Gasphasen-Gaschromatographie (headspace
gas chromatography) quantifiziert. Man zog 5 µl Gasphase
mit einer 10 µl Hamilton-Spritze (Hamilton (Darmstadt, Bundesrepublik
Deutschland)) ab und analysierte mit einem Gaschromatographen
(438 A), der mit einem Elektronenfallen-Detektor (electron
capture detector) und einer fused Siliciumdioxyd-Capillarsäule
versehen war (CP-Sil 8 CB; 50 m × 0,25 mm; Chrompack BV
(Frankfurt, Bundesrepublik Deutschland)). Es wurden die folgenden
Operationsbedingungen angewandt: Säulentemperatur 80°C; Injektortemperatur
200°C, Detektortemperatur 250°C. Trägergas
und Aufbereitungsgas waren Stickstoff. Tägliche Eichkurven wurden
mit drei verschiedenen Standards von 25 bis 100 µM erstellt.
Alle Konzentrationen flüchtiger Substrate wurden so berechnet,
als ob sie vollständig gelöst in wäßriger Phase vorlagen.
Vinylchlorid und andere chlorierte flüchtige Verbindungen wurden
durch GC-MS-Analyse bestimmt (Perkin-Elmer, Modell 8500 (Überlingen,
Bundesrepublik Deutschland)).
Bei den TCE-Bioabbauversuchen konnten niemals andere flüchtige
chlorierte Verbindungen durch GC-Analysen ermittelt werden.
Zur Bestimmung der Fähigkeit zum TCE-Abbau bei verschiedenen pH-
Werten wurden verschiedene Puffersysteme verwendet; 30 mM Natrium/Calium-Phosphatpuffer
im Bereich von pH 5,5 bis 8,0 und
12,5 mM Natrium-Boratpuffer im Bereich von pH 7,5 bis 9,5.
Die Temperaturabhängigkeit der Fähigkeit zum TCE-Abbau wurde bei
pH 7,0 für Rhodococcus erythropolis BD1 und pH 7,5 für Pseudomonas
spec. JR1 ermittelt.
Chlorid- und Proteinbestimmung: Freisetzung von Chlorid wurde in
Kulturüberständen mit einer Ionen-sensitiven Kombinationselektrode
bestimmt (Modell 9617 von Orion Research Inc. (Cambridge,
USA)). Man gab 100 µl des Ionenstärke-Einstellmittels (1M KNO₃)
zu 10 ml Calibrierstandard und den Überständen vor der jeweiligen
Messung. Calibrierkurven wurden mit 10 bis 500 µM Chlorid
erstellt.
Zellprotein wurde nach der Methode von Schmidt et al. (1963) bestimmt,
wobei Rinderserum Albumin als Proteinstandard verwendet
wurde. Für den Gram-positiven Stamm BD1 war eine Modifikation
erforderlich, um die Zellen zu lysieren. Die Zellpellets wurden
nur in Lösung A (4M NaOH) statt in Lösung A plus Wasser gekocht,
wobei Wasser nach dem Abkühlen zugegeben wurde.
Chemikalien: Isopropylbenzol und alle chlorierten Verbindungen
mit Ausnahme von TCE wurden von Aldrich Chemie (Steinheim, Bundesrepublik
Deutschland) bezogen. TCE, Isobutyrat und Dipenten
wurden von Fluka (Neu-Ulm, Bundesrepublik Deutschland) bezogen.
Toluol und Phenol wurden von Merck (Darmstadt, Bundesrepublik
Deutschland) bezogen; Citronellol wurde von Sigma Chemicals (Deisenhofen,
Bundesrepublik Deutschland) bezogen. Alle organischen
Lösungsmittel und anorganischen Chemikalien waren von höchster
im Handel erhältlicher Reinheit.
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Claims (8)
1. Mittel zur biologischen Bekämpfung von TCE-Kontaminationen,
gekennzeichnet durch Cumol (Isopropylbenzol).
2. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet zusätzlich durch
Trichlorethen (TCE) abbauende Bakterien.
3. TCE-abbauende und auf Cumol-kultivierbare Bakterien, dadurch
gewinnbar, daß man von natürlichen Böden oder Gewässern isolierte
Bakterien in Gegenwart von Cumol heranzieht und gewinnt.
4. Verfahren zur Bekämpfung von TCE-Kontaminationen, dadurch gekennzeichnet,
daß man ein Mittel vorsieht, das Cumol als Substrat
für TCE-abbauende Bakterien enthält oder daraus besteht,
und diese Bakterien TCE, das in damit kontaminierten
Böden oder Gewässern vorliegt, abbauen läßt, wobei die Bakterien
im Mittel und/oder im Boden bzw. Gewässer vorliegen.
5. Verwendung der Bakterien gemäß Anspruch 3 zur biologischen
Bekämpfung von TCE-Kontaminationen.
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man
die Bakterien in Form einer Suspension zur Dekontaminierung
von mit TCE kontaminierten Wasserströmen einsetzt.
7. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man
die Bakterien in auf einem Träger immobilisierter Form zur
Dekontaminierung von mit TCE kontaminierten Wasserströmen
verwendet.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man
als Träger Aktivkohle, Glasteilchen, wie Sinterglas, oder
Kunststoffteilchen, wie Polyurethanteilchen, verwendet.
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- 1991-12-19 DE DE19914142063 patent/DE4142063A1/de not_active Withdrawn
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1992
- 1992-12-18 WO PCT/EP1992/002948 patent/WO1993012042A1/de active Application Filing
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WO1993012042A1 (de) | 1993-06-24 |
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