DE19627180A1

DE19627180A1 - Sulfid-oxidierende Bakterien und damit durchgeführtes Verfahren

Info

Publication number: DE19627180A1
Application number: DE19627180A
Authority: DE
Inventors: Gary E Jennemann; Diane Gevertz
Original assignee: Phillips Petroleum Co
Current assignee: Phillips Petroleum Co
Priority date: 1995-07-07
Filing date: 1996-07-05
Publication date: 1997-03-20
Anticipated expiration: 2016-07-06
Also published as: GB9614176D0; NO319148B1; CA2178137C; MX9602206A; NO962861D0; CA2178137A1; GB2303127A; NO962861L; US5789236A; US5686293A; GB2303127B; DE19627180C2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Bakterien, die zur Oxidation einer Sulfidverbindung oder zur wesentlichen Verringerung des Sulfidgehalts in Solen, Öl, Gas oder Kombinationen von zwei oder mehr davon imstande sind. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur wesentlichen Verringerung des Sulfidgehalts in Solen, Öl, Gas oder Kombinationen von zwei oder mehr davon.

Sulfide, insbesondere lösliche Sulfide (H₂S, HS⁻, S^2- oder Kombinationen davon), die häufig in Solen, z. B. Ölfeldsolen, als Folge der Aktivität von Sulfat-reduzierenden Bakterien (SRB) nachgewiesen werden, stellen die Industrie aufgrund ihrer Toxizität, ihres Geruchs, ihrer korrosiven Beschaffenheit und ihres Potentials zur Verstopfung von Bohrlöchern vor ernste Probleme. Gegenwärtige Behandlungstechniken für die Entfernung von Sulfid umfassen physikalische/chemische Methoden, wie Abstreifen mit Wasserdampf oder Abgas, Luftoxidation und Fällung. Eine mikrobielle Behandlung ist jedoch möglicherweise eine wirksamere und kostengünstigere Alternative zur Verringerung der Sulfidkonzentrationen.

Erdölreservoirs enthalten bestimmte mikrobielle Lebensgemeinschaften, die eine Reihe von physiologischen Typen von Bakterien umfassen. Gärungsbakterien, Kohlenwasserstoff-Oxidierer, Denitrifizierer, Methanogene und SRB sind alle aus Reservoirsolen isoliert worden. SRB sind aufgrund ihrer Fähigkeit, Sulfate zu Sulfiden zu reduzieren, von besonderer Bedeutung für die Erdölindustrie, da sie dabei eine schädliche Rolle bei der Verstopfung von Injektionsbohrlöchern, der Korrosion der Ausrüstung und dem Sauerwerden von Gas, Öl oder beiden spielen. Die Kosten der Ölproduktion werden aufgrund eines Ausfalls der Ausrüstung, zusätzlicher Ausrüstungen, die zur Entfernung von Sulfid erforderlich sind, des Bedarfs an Bioziden zur Bekämpfung des mikrobiellen Wachstums und an zusätzlichen Chemikalien, die zur Entfernung oder Verhinderung von Eisensulfidablagerungen benötigt werden, erheblich erhöht.

Die Sulfidbildung hängt im allgemeinen von einer Reihe von Nährstoffaktoren und physikalischen Faktoren, die das Wachstum von SRB z. B. in Ölreservoirs beeinflussen, ab. Konzentrationen an nutzbarem Kohlenstoff, Sulfat, Stickstoff und Phosphor beeinflussen ebenfalls das Wachstum von SRB und die Geschwindigkeit der Sulfatreduktion.

Weitere Bakterien können ebenfalls eine Rolle bei der Korrosion und dem Sauerwerden des Reservoirs spielen. Zum Beispiel sind zahlreiche Stämme von Shewenella putreficians aus Ölfeldsolen und ähnlichen Flüssigkeiten isoliert worden, die anaerob durch Reduktion von Schwefeloxyanionen, die von Sulfat verschieden sind, zu Schwefelwasserstoff wachsen können.

Traditionell werden in der Erdölindustrie Biozide, z. B. quaternäre Ammoniumverbindungen, Isothiazolon-Derivate, Glutaraldehyd, Formaldehyd, Acrolein oder Kombinationen von zwei oder mehr davon zur Bekämpfung der SRB verwendet. Der Erfolg dieses Ansatzes ist jedoch begrenzt, und zwar aufgrund der Neigung der Bakterien, Biofilme zu bilden, die vergleichsweise undurchlässig für Biozide sind.

Biologische Ansätze für die Bekämpfung von SRB sind als Alternative zu physikalischen/chemischen Behandlungen untersucht worden. Es ist berichtet worden, daß die Zugabe hoher Konzentrationen an Nitrat zu Anreicherungskulturen, die mit Sulfat und verschiedenen Elektronendonoren ergänzt wurden, zu einer Inhibition der biogenen Sulfidbildung für lange Zeitspannen führt.

Nitrat ist auch als Elektronenakzeptor für die anaerobe Sulfidoxidation verwendet worden. Die Nitrat-abhängige Sulfidoxidation durch endogene Bakterien in Wasser, das mit der Förderung von Öl, Gas oder beiden in Verbindung steht, ist in Laborstudien mit Gesteinskernen sowie in Feldtests gezeigt worden, wobei die Sulfidkonzentrationen um 40 bis 60% in Solen aus drei benachbarten Förderbohrlöchern 45 Tage nach der Injektion von Nitrat in die Formation absank. Die meisten Forschungsanstrengungen hinsichtlich der Biooxidation von Sulfid in Solen, Gasströmen und rohem Erdöl haben sich auf die Verwendung von exogenen Spezies von Thiobacillus konzentriert. In einem Feldversuch zur Aufarbeitung von sauer gefördertem Wasser oxidierte Thiobacillus denitrificans Stamm F Sulfid in wirksamer Weise aerob zu Sulfat, ungeachtet mehrerer Störungen des Systems.

Die Oxidation von Sulfiden zu Sulfaten scheint nicht die Lösung zu sein, da Sulfate durch SRB erneut zu Sulfiden reduziert werden können, wobei die vorstehend erläuterten Probleme auftreten. Es besteht also ein wachsender Bedarf an der Entwicklung einer bakteriellen Kultur, die Sulfid oder Anteile davon zu elementarem Schwefel oxidieren kann, und an der Entwicklung eines Verfahrens zur Oxidation eines Sulfids oder zur Verringerung des Sulfidgehalts in einem wesentlichen Maße in Fluiden, wie Solen, Öl, Gas oder Kombinationen von zwei oder mehr davon. Die Entwicklung einer derartigen bakteriellen Kultur oder eines Verfahrens oder beider würde auch wesentlich zu einem besseren Verständnis der Anwendungsmöglichkeiten, Beschränkungen oder Kombinationen davon bei der biologischen Behandlung von Sole, Öl, Gas oder Kombinationen von zwei oder mehr davon beitragen.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine bakterielle Kultur oder ein Bakterium bereitzustellen, die/das imstande ist, in Fluiden, wie Solen, Öl, Gas oder Kombinationen von zwei oder mehr davon, ein Sulfid in einem wesentlichen Maße zu oxidieren oder den Sulfidgehalt in einem wesentlichen Maße zu verringern. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur wesentlichen Oxidation eines Sulfids oder zur wesentlichen Verringerung des Sulfidgehalts in Fluiden, wie Solen, Öl, Gas oder Kombinationen von zwei oder mehr davon, bereitzustellen. Weitere Aufgaben und Merkmale sind klarer ersichtlich, wenn die Erfindung nachstehend ausführlicher offenbart wird.

Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird eine bakterielle Kultur bereitgestellt, die zur wesentlichen Oxidation von Sulfid oder zur wesentlichen Verringerung des Sulfidgehalts in einem Fluid imstande ist.

Gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur wesentlichen Oxidation eines Sulfids oder zur wesentlichen Verringerung des Sulfidgehalts in einem Fluid bereitgestellt, das das Kontaktieren des Fluids mit einer Zusammensetzung, die eine bakterielle Kultur enthält, die zur Oxidation von Sulfid in einem Fluid imstande ist, umfaßt.

Fig. 1 erläutert die Sulfidoxidation durch Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472) in einer filtrierten Sole, die exogen zugegebenes Kaliumnitrat und Natriumphosphat (monobasisch) enthält. Fig. 2 zeigt die Sulfidoxidation durch Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472) in CSB/DTA-Medium. Fig. 3 erläutert die synergistische Wirkung der Kombination von Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472), Kaliumnitrat und Natriumphosphat (monobasisch) in einer geförderten Sole bei der Sulfidoxidation.

Der Ausdruck "Sulfid" bezieht sich hier allgemein, sofern nichts anderes angegeben ist, auf anorganische Sulfide, organische Sulfide oder Kombinationen von zwei oder mehr davon, die eine Struktureinheit -S_n- im Sulfidmolekül enthalten, wobei n eine Zahl von 1 bis etwa 10, vorzugsweise von 1 bis etwa 5 und insbesondere von 1 bis 3 ist. Die Sulfidverbindungen können löslich, unlöslich, im wesentlichen löslich oder im wesentlichen unlöslich in wäßrigen Medien, nicht-wäßrigen Medien oder Kombinationen davon sein. Lösliche Sulfide, wie sie vorstehend genannt wurden, können H₂S, HS⁻, S^2- oder Kombinationen von zwei oder mehr davon sein.

Beispiele für Sulfidverbindungen, die in wesentlichem Maße oxidiert oder entfernt werden können, umfassen, ohne Beschränkung hierauf, Schwefelwasserstoff, Dimethylsulfid, Dimethyldisulfid, Diethylsulfid, Diethyldisulfid, Natriumsulfid, Natriumhydrogensulfid, Kaliumhydrogensulfid, Kaliumsulfid, Eisensulfid und Kombinationen von zwei oder mehr davon.

Erfindungsgemäß bezeichnet der Ausdruck "Fluid" eine Flüssigkeit, ein Gas oder Kombinationen davon. Beispiele für Fluide, die sich für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignen, umfassen, ohne Beschränkung hierauf, Solen, Öl, Gas oder Kombinationen von zwei oder mehr davon. Der Ausdruck "Sole" oder "Solen" bezieht sich hier, sofern nichts anderes angegeben ist, auf Wasser, eine Lösung, eine Suspension oder Kombinationen von zwei oder mehr davon. Im allgemeinen enthält eine Lösung lösliche Substanzen, z. B. Salze. Eine Suspension kann ebenfalls gelöste, teilweise gelöste oder ungelöste Substanzen, wie Salze, enthalten. Beispiele für Salze umfassen, ohne Beschränkung hierauf, Metallsalze, z. B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Calciumbromid, Magnesiumchlorid, Magnesiumbromid, Natriumbicarbonat, Natriumsulfat, Ammoniumchlorid, Natriumsulfid, Natriumhydrogensulfid, Kaliumhydrogensulfid, Kaliumsulfid, Eisensulfid und Kombinationen von zwei oder mehr davon. Im allgemeinen kann der Gesamtgehalt an Salzen in einer Lösung oder Suspension stark variieren, z. B. von etwa 0,5 Gew.-% bis zu einem recht hohen Wert von etwa 50 Gew.-%. Die gegenwärtig bevorzugte Sole ist eine geförderte Sole, die gelegentlich auch als Ölfeldsole oder gefördertes Wasser oder Erdölsole oder Reservoirsole bezeichnet wird, und es handelt es sich um eine Sole, die gemeinsam mit Öl oder Gas oder beiden gefördert wird. Eine geförderte Sole ist im allgemeinen mit einer gewissen Menge an Öl oder Gas oder beiden verunreinigt.

Gemäß der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine bakterielle Kultur bereitgestellt, die ein Sulfid-oxidierendes Bakterium umfaßt oder im wesentlichen daraus besteht oder daraus besteht und die zur Oxidation von Sulfidverbindungen in einem Sulfid enthaltenden Fluid imstande ist. Das Oxidationsprodukt des Sulfids oder von Anteilen davon umfaßt erfindungsgemäß im allgemeinen elementaren Schwefel. Der Ausdruck "Anteil" wird hier verwendet, um beliebige Bruchteile des Sulfids zu bezeichnen. Das Bakterium ist eine Campylobacter-ähnliche Spezies.

Bakterien, von denen bekannt ist, daß sie eine Sulfidverbindung oxidieren, bilden im allgemeinen eine Sulfatverbindung. Derartige Bakterien, z. B. Thiobacilli, oxidieren im allgemeinen eine Sulfidverbindung nicht zu elementarem Schwefel. Die in der vorliegenden Anmeldung offenbarten Bakterien oxidieren jedoch eine Sulfidverbindung oder Anteile davon zu elementarem Schwefel, insbesondere in Mischkulturen, wobei das Problem der Bildung von Sulfat, das wiederum durch SRB zu einer Sulfidverbindung reduziert wird, beseitigt wird. Die Oxidation eines Sulfids zu elementarem Schwefel ist in der Tat überraschend.

Diese neuen Bakterien wurden durch Anreicherung einer geförderten Sole isoliert, die von Solen erhalten wurde, die aus einem Freiwasser-Vorabscheider an der Coleville Unit, Coleville, Saskatchewan, Canada, entnommen wurden. Die Anreicherung ergab zwei Stämme von Bakterien, denen die Laborbezeichnungen CVO und FWKO B gegeben wurden und denen die Hinterlegungsnummern NRRL B-21472 bzw. NRRL B-21473 zugeordnet wurden.

Die Bezeichnungen NRRL B-21472 und NRRL B-21473 spiegeln die Tatsache wider, daß die bakteriellen Kulturen CVO und FWKO B bei einer offiziellen Hinterlegungsstelle, nämlich dem United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604, USA, hinterlegt wurden. Die Hinterlegungen erfolgten gemäß dem Budapester Vertrag und der Praxis des United States Patent and Trademark Office, so daß alle Beschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit der Stämme für die Öffentlichkeit unwiderruflich bei Erteilung eines Patents auf diese Anmeldung wegfallen, deren Gegenstand diese wichtigen neuen Stämme sind. Die Stämme werden also der Öffentlichkeit für die Verwendung entsprechend der vorliegenden Erfindung zur Verfügung stehen.

In der nachstehenden Tabelle I sind die Konzentrationen verschiedener Elemente, die im angereicherten Medium zur Züchtung der neuen Stämme von Campylobacter sp., der Stämme NRRL B-21472 und NRRL B-21473, verwendet wurden, angegeben. Die Konzentration ist in jedem Fall ausgedrückt als das Element, wobei jedoch darauf hinzuweisen ist, daß die Gesamtmenge oder ein Teil jeweils in Form eines löslichen Ions vorliegen kann, wobei z. B. P in einer gebundenen Form, wie Phosphat, vorhanden ist.

Tabelle I

Gewicht des Elements pro Liter Medium

Es ist günstig, Schwefel in der Form von Sulfat einzusetzen. Einige der erforderlichen Metalle werden vorteilhafterweise in Form eines Sulfats zugegeben. Auf diese Weise wird die minimale Konzentration an Schwefel normalerweise überschritten. Vorzugsweise werden Magnesium, Calcium, Eisen, Zink, Kupfer, Mangan und Cobalt in Form eines Sulfats oder in Form einer Verbindung, die in situ in ein Sulfat umgewandelt wird, eingesetzt. Vorzugsweise werden Molybdän und Bor in löslicher Form eingesetzt, z. B. als Molybdat bzw. Borat. Kalium wird vorzugsweise als Sulfat oder Phosphat oder in Form einer Verbindung, die in situ in ein Sulfat oder Phosphat umgewandelt wird, eingesetzt. Phosphor wird vorzugsweise in Form von Phosphorsäure oder in Form eines Phosphats (monobasisch) oder eines Phosphats (dibasisch), z. B. als Kalium- oder Ammoniumsalz, oder als eine Verbindung, die in situ in ein derartiges Salz umgewandelt wird, eingesetzt. Stickstoff ist zwar für die Bildung von Zellmasse erforderlich; es sind jedoch keine erforderlichen minimalen Konzentrationen vorstehend angegeben, da derartige minimale Werte ohne weiteres abhängig von der gewünschten Zellmasse verfügbar sein können und da eine Stickstoff enthaltende Verbindung als Mittel zum Wachstum von Zellmasse verwendet wird.

Im allgemeinen können beliebige anorganische oder organische Stickstoff enthaltende Verbindungen als Stickstoffquelle verwendet werden. Die gegenwärtig bevorzugte Stickstoffquelle sind anorganische, Stickstoff enthaltende Verbindungen, wie z. B. Ammoniumsalze, Metallnitratsalze oder Kombinationen von zwei oder mehr davon. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen umfassen, ohne Beschränkung hierauf, Ammoniak, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat, Kaliumnitrat, Magnesiumnitrat und Kombinationen von zwei oder mehr davon. Beliebige organische Verbindungen, die im allgemeinen eingesetzt werden, um das Wachstum der Mikroorganismen zu unterstützen, können als Kohlenstoff- oder Energiequelle oder beides verwendet werden. Die gegenwärtig bevorzugte Kohlenstoff- oder Energiequelle ist ein Acetat. Weitere Elemente, wie Natrium, Selen und Iod, können im Züchtungsmedium ebenfalls vorhanden sein.

Die erfindungsgemäßen Bakterien können in einem beliebigen geeigneten Gefäß in Abwesenheit von Sauerstoff gezüchtet werden. Die Wachstumstemperatur kann in einem gewissen Maße variieren, sie liegt im allgemeinen jedoch im Bereich von etwa 10°C bis etwa 40°C, vorzugsweise etwa 10°C bis etwa 35°C und insbesondere 20°C bis 35°C. Die Bakterien können unter einer Reihe von Drücken im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 15 Atmosphären (atm), vorzugsweise etwa 0,5 bis etwa 10 atm und insbesondere 0,9 bis 5 atm wachsen. Der pH-Wert des Züchtungsmediums kann von etwa 5 bis etwa 8,5, vorzugsweise etwa 6 bis etwa 8,5 und insbesondere 7 bis 8 variieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch kontinuierlich durchgeführt werden. Zum Beispiel kann das Kontaktieren eines Fluids mit der bakteriellen Kultur erfolgen, indem kontinuierliche gerührte Tankreaktoren, Reaktoren, die in Reihe verbunden sind, Kolbenstrom-Reaktoren, gepackte Kolonnen oder Türme oder andere kontinuierliche Ströme angewandt werden, die ohne weiteres im Bereich der Fähigkeiten des Fachmanns liegen.

Der Stamm CVO ist ein gram-negatives Stäbchen mit einem Durchmesser von 0,4 µm und einer Länge von 0,5 bis 2,0 µm, das unter Standardkulturbedingungen nicht beweglich ist, und das nicht sporenbildend ist. Der Stamm wächst anaerob, wobei kein Wachstum unter mikroaerophilen Bedingungen beobachtet wird. Der Stamm FWKO B ist ein gram-negatives Stäbchen mit einem Durchmesser von 0,4 µm und einer Länge von 2,0 bis 4,0 µm; er ist beweglich und nicht sporenbildend. Dieser Stamm ist wahrscheinlich mikroaerophil (aufgrund des Wachstums in Gradientenmedien mit Sulfid und Sauerstoff), und er wächst auch anaerob. Diese beiden Stämme CVO (NRRL B-21472) und FWKO B (NRRL B-21473) sind in der nachstehenden Tabelle II weiter charakterisiert.

Tabelle II

Mediena, die auf das Wachatum von CVO und FWKO B untersucht wurden

a Die verwendeten Medien waren, sofern in der Tabelle nichts anderes angegeben ist, flüssige Medien.
^b + bedeutet sichtbares Wachstum, mindestens zwei Tage nach der Animpfung (anfängliche Zelldichte etwa 10⁷ Zellen/ml).
- bedeutet keine Zunahme der Trübung mindestens zwei Tage nach der Animpfung (anfängliche Zelldichte etwa 10⁷ Zellen/ml).
^c Vergl. ATCC-Katalog (S-8-Medium für Thiobacilli).
^d Vergl. ATCC (American Type Culture Collection-)Katalog (Thiomicrospira denitrificans-Medium).
^e Vergl. DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Deutschland-)Katalog (Medium 121).
^f Vergl. DIFCO-Manual, DIFCO Laboratories, Detroit, Michigan.
^g Modifiziertes Gradientenmedium (Agar) wurde mit 0,5% NaCl hergestellt und modifiziert nach D. C. Nelson, 1992, The genus Beggiotoa. In: The Procaryotes. A Handbook on the Biology of Bacteria: Ecophysiology, Isolation, Identification, Applications, zweite Auflage, Bd. III, A. Balows, H. G. Truper, M. Dworkin, W. Harder und K.-H. Scheifer, Herausgeber: Springer Verlag, New York, 2638-2657.
^h Vergl. DSM-Katalog (Medium 541).

Der Stamm CVO wurde weiter durch Sequenzieren des 16S-rRNA-Gens von CVO-Zellen nach PCR-Amplifikation von gereinigter chromosomaler DNA identifiziert. Ein 550 Basenpaare umfassendes Fragment von DNA aus dem Stamm CVO, das der Region 350 bis 900 des E. coli-16S-rRNA-Gens entsprach, wurde amplifiziert, kloniert und sequenziert. Ein Vergleich dieser Sequenz mit den Sequenzen in der GenBank- Datenbank zeigte, daß der Stamm CVO am stärksten einem Campylobacter-artigen Organismus ähnelte. Auf der Basis dieser Information wurde eine 16S-rRNA-gerichtete Oligonucleotidsonde für eine einzigartige Region, die in der 16S-rRNA-Sequenz des Stamms CVO vorhanden war, konstruiert. Oligonucleotidsonden wiesen eine Länge im Bereich von 16 bis 21 Basen auf.

Tests auf die Spezifität von 16S-rRNA-gerichteten Sonden wurden unter Verwendung ganzer Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden auf eine Nylonmembran in einer Konzentration von 5 × 10⁷/Feld getüpfelt und durch Wärmebehandlung nach dem Verfahren von Braun-Howland et al. lysiert (E. B. Braun- Howland, P. A. Vescio und S. A. Nierzwicki-Bauer, Use of a Simplified Cell Blot Technique and 16S rRNA-Directed Probes for Identification of Common Environmental Isolates, Appl. Environ. Mircobiol., Bd. 59 (1993), S. 3219-3224). Blots wurden zweimal mit IX SET-Puffer (0,15 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,02 M Tris; schließlicher pH-Wert: 7,8) mit einem Gehalt an 0,1% SDS vorgewaschen, über Nacht mit radioaktiv markierter Oligonucleotidsonde hybridisiert, mehrere Male mit SET-Puffer mit einem Gehalt an 0,1% SDS gewaschen und durch Autoradiographie visualisiert. Zellen von eng verwandten Gattungen (Thiobacillus denitrificans, Thiomicrospira denitrificans, Sulfurospirillum deleyianum, Arcobacter nitrofigilis, Campylobacter sp. DSM 806) sowie andere Isolierungen aus Sole wurden als negative Kontrollen verwendet. Außerdem wurden die Blots mit einer allgemeinen eubakteriellen Sonde (EUB) als positiver Kontrolle untersucht (vergl. Braun-Howland et al., a.a.O.).

Eine der untersuchten Sonden reagierte spezifisch mit dem Stamm CVO und Zellen, die aus einer Anreicherung von geförderter Sole erhalten wurden (bezeichnet als 59-20). Die Spezifität der Sonde wurde durch eine fehlende Hybridisierung mit anderen ähnlichen Spezies und Isolierungen gezeigt. Die Hybridisierung der Sonde an Zellen aus geförderter Sole zeigte das Vorhandensein ähnlicher Bakterien in dieser Probe. Die allgemeine eubakterielle Sonde EUB reagierte mit allen Proben, wie es zu erwarten war.

Eine zweite Campylobacter-artige Spezies, die als FWKO B (NRRL B-21473) bezeichnet wurde und ähnlich zu dem Stamm CVO, jedoch davon verschieden war, wie durch chromosomale Hybridisierungsstudien gezeigt wurde, wurde ebenfalls isoliert und gereinigt.

Auf der Basis der vorstehend erläuterten und gezeigten Informationen wird angenommen, daß beide Stämme CVO und FWKO B Stämme von Campylobacter-Spezies sind, und sie werden in der vorliegenden Anmeldung als Campylobacter-artige Spezies bezeichnet.

Gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren, das bei Anwendungen, wie der Oxidation von Sulfid in Fluiden, wie Solen, Öl oder Gas, angewandt werden kann, bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt das Kontaktieren eines Fluids mit einer bakteriellen Kultur, die ein Bakterium umfaßt oder im wesentlichen daraus besteht oder daraus besteht, das zur Oxidation von Sulfid imstande ist, wobei es sich um eine Campylobacter-Spezies handelt, oder das Verfahren besteht im wesentlichen darin oder es besteht darin. Der Umfang und weitere Beschreibungen der bakteriellen Kultur und des Fluids entsprechen denen, die für die erste Ausführungsform der Erfindung offenbart wurden.

Das Kontaktieren des Fluids mit der bakteriellen Kultur kann auf eine beliebige Weise durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt ist. Zum Beispiel kann die bakterielle Kultur, die die erforderlichen Wachstumselemente enthält, zu einem Fluid für eine ausreichende Zeitspanne, um eine Sulfidverbindung in wesentlichem Maße zu verringern, gegeben werden. Anschließend können die bakterielle Kultur oder das verbrauchte Wachstumsmedium oder beides von dem Fluid abgetrennt werden. Das Fluid mit dem verringertem Sulfidgehalt kann dann bei einer Reihe von Anwendungen eingesetzt werden. Da das Züchten eines Bakteriums und die Abtrennung eines Fluids von Bakterienzellmasse und verbrauchtem Wachstumsmedium dem Fachmann bekannt sind, wird auf die Beschreibung hier im Interesse der Kürze verzichtet.

Für einige Anwendungen, z. B. die sekundäre Erdölförderung, die die Injektion eines Fluids, wie Sole, in einer unterirdischen Formation umfaßt, brauchen die bakterielle Kultur und das verbrauchte Medium nicht von dem Fluid abgetrennt zu werden. Die bakterielle Kultur in einer Sole kann in eine Formation injiziert werden. Die Beschaffenheit der Formation ist im allgemeinen nicht wichtig, und die Injektion kann auf eine beliebige Weise, die dem Fachmann bekannt ist, z. B. durch Pumpen, ausgeführt werden.

Alternativ dazu kann ein Fluid, wie ein Sulfid enthaltendes Gas, zu einer bakteriellen Kultur, die das Wachstumsmedium enthält, gegeben werden. Die Zugabe eines gasförmigen Fluids zu einem wäßrigen Medium kann auf eine beliebige Weise durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt ist, z. B. indem das gasförmige Fluid in oder durch das wäßrige Medium geperlt wird.

Bei der zweiten Ausführungsform der Erfindung kann es sich bei der erforderlichen Zeitspanne zum Kontaktieren eines Fluids mit einer bakteriellen Kultur um eine beliebige Zeitspanne handeln, solange diese ausreicht, die Oxidation eines Sulfids in dem Fluid zu bewirken. Die erforderliche Zeit kann auch von der Konzentration des Sulfids und der Bakterienzellen in dem Fluid abhängen, und sie kann einen recht kurzen Wert von etwa 30 Minuten bis zu einem recht langen Wert von etwa 1 Woche annehmen. Wenn z. B. die Konzentration der Impfkultur 10⁷ Zellen/ml beträgt und die Sulfidkonzentration im Fluid etwa 5 mM ist, dann beträgt die Zeit etwa 2 bis etwa 20 Stunden, um das Sulfid in wesentlichem Maße zu oxidieren.

Die nachstehenden Beispiele werden vorgelegt, um die vorliegende Erfindung zu erläutern, und sie sollen den Schutzumfang der Erfindung nicht ungebührlich beschränken. Die Wachstumstemperatur betrug, sofern nichts anderes angegeben ist, 30°C.

Beispiel I

Dieses Beispiel zeigt die biologisch vermittelte Sulfidoxidation unter Verwendung von Anreicherungskulturen aus Sole, die an der Coleville Unit, Saskatchewan, aufgefangen wurde.

Ölreservoirsole mit geringem Salzgehalt (0,71% gesamte gelöste Feststoffe) wurde in sterilen Flaschen unter strikt anaeroben Bedingungen aus einer Sandstein-Formation in Saskatchewan von Phillips Petroleum Co. aufgefangen. Diese Sole wurde von einem Öl/Wasser-Trennbehälter an einen Punkt vor der erneuten Injektion in das Reservoir aufgefangen (nachstehend als Injektionssole bezeichnet). Die Herstellung aller Medien und Kulturen unter Einschluß der Inkubationen erfolgte unter anaeroben Bedingungen. Die Hauptionen, die in der Sole vorhanden waren, waren Natrium (0,29%), Chlorid (0,41%), Bicarbonat (0,19%), Sulfat (0,026%) und Ammonium (0,001%), und der pH-Wert betrug 7,5. Diese Sole enthielt 3,3 mM lösliches Sulfid, wobei angenommen wird, daß dieses Sulfid biologisch aufgrund der mäßigen Reservoirtemperatur (30 bis 35°C) erzeugt wurde. Sulfid wurde kolorimetrisch unter Anwendung der Methylenblau-Methode bestimmt; vergl. auch L. K. Fogo und M. Popowski, Spectrophotometric Determination of Hydrogen Sulfide, Anal. Biochem., Bd. 21 (1949), S. 732-734. Da dieses Verfahren dem Fachmann bekannt ist, wird auf eine Beschreibung hier verzichtet.

Die Gesamtzahl der vorhandenen Bakterien wurde zu 0,5-1,0 × 10⁷ Zellen/ml durch direkte Zählung unter Verwendung von Acridin-Orange bestimmt. Gärende, denitrifizierende, Sulfat-reduzierende und sporenbildende Bakterien waren in der Sole alle vorhanden, wie durch Wachstum in Anreicherungskulturen und auf Agarplatten gezeigt wurde. SRB machten ungefähr 1% der mikrobiellen Population an dieser Stelle oder 10⁴-10⁵/ml unter Verwendung eines Lactatmediums, das vom American Petroleum Institute (API) formuliert wurde, aus. Die Bestimmungen wurden dreifach durchgeführt, wie es bei der Bestimmung der wahrscheinlichsten Zahl (MPN, "most probable number") angewandt wird. Aus Gründen der Einfachheit erfolgten Bestimmungen der Zahlen jedoch aus den Rohdaten anstelle der Durchführung einer MPN-Berechnung.

Es wurde festgestellt, daß eine Sulfidoxidation ohne weiteres stattfand, wenn Nitrat und Phosphat zu Soleanreicherungskulturen gegeben wurden. Nach Zugabe von 5 mM KNO₃ und 100 µM KH₂PO₄ wurde beispielsweise die Sulfidkonzentration von 3,3 mM auf einen nicht nachweisbaren Wert (< 0,1 mM) in 48 Stunden bei 30°C verringert. Im Gegensatz dazu gab es keine Änderung im Kontrollmedium, das kein Nitrat enthielt. Bei Zugabe von Phosphat und Nitrat gab es einen zehnfachen Anstieg der Zellzahl nach der direkten Zählung im Vergleich mit Kontrollen, was darauf hinweist, daß ein Wachstum stattfand. Ähnliche Geschwindigkeiten der Sulfidoxidation unter Verwendung von Solen von drei Förderbohrlöchern wurden ebenfalls beobachtet, was darauf hinweist, daß Sulfid-oxidierende Bakterien in der gesamten Formation verteilt sind.

Es wurde auch festgestellt, daß die Erhöhung der Konzentration an Nitrat bis zu 2,5 mM die Sulfidoxidation stimulierte, wobei an diesem Punkt die Sulfidkonzentration auf einen nicht nachweisbaren Wert verringert wurde. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Sulfidoxidation Nitrat-abhängig war.

Die Analysen von verbrauchten Anreicherungskulturen, die vorstehend beschrieben wurden, auf Sulfat, Sulfit und gesamten löslichen Schwefel zeigten, daß ein lösliches Schwefeloxidationsprodukt, wie Sulfat, sich nicht anreicherte. Während des Oxidationsprozesses trat jedoch ein gelblich-weißer Niederschlag in den Anreicherungsflaschen auf. Die Analyse dieses unlöslichen Materials durch Röntgenbeugung und Elektronendispersionsspektroskopie zeigte, daß es sich um ein Gemisch aus elementarem Schwefel und Calcit handelte. Die Nitratreduktion führte zur Bildung von Nitrit und Stickstoffgas. Es gab keinen Nettoanstieg an Ammoniak.

Beispiel II

Dieses Beispiel erläutert die Zählung und Identifizierung von Sulfid-oxidierenden Bakterien. Dieses Beispiel zeigt auch die Oxidation von Sulfid in Solen und synthetischen Medien unter Verwendung der erfindungsgemäßen Bakterien.

Nitrat-reduzierende, Sulfid-oxidierende Bakterien wurden gemäß MPN gezählt, wie es in Beispiel I beschrieben wurde, und zwar unter Ausnutzung der Oxidation des Redoxindikators Resazurin als Wachstumsindikator. Die Verwendung des Indikators Resazurin ist ein dem Fachmann bekanntes Verfahren. Ungefähr 10⁴ Sulfid-oxidierende Bakterien/ml waren in Proben der Injektionssole und Proben aus 3 Förderbohrlöchern vorhanden. Das Plattieren der Anreicherungskulturen von Injektionssole auf 295 Agar-Medium (vergl. Fußnote a, Tabelle II) führte zur Reinigung von mehreren Kolonietypen von Bakterien. Eine der erhaltenen Isolierungen, nämlich CVO (NRRL B-21472), war ein gram negatives Stäbchen, das zur Oxidation von Sulfid imstande war, wenn es in Filter-sterilisierte Sole, die mit Nitrat und Phosphat angereichert war, überimpft wurde (vergl. Fig. 1). Filter-sterilisierte Sole war Coleville-Sole, die aus dem Freiwasser-Vorabscheider aufgefangen und durch einen Celluloseacetat-Filter von 0,2 µm zur Entfernung von bakteriellen Zellen filtriert worden war. Die Überimpfung erfolgte mit 2 ml einer Kultur, die etwa 10⁷ Zellen/ml enthielt.

Fig. 1 zeigt die Oxidation von Sulfid durch den Stamm CVO in filtrierter Sole, die mit 5 mM KNO₃ und 100 µM Natriumphosphat (NaH₂PO₄) angereichert war. Ohne das Vorhandensein von CVO-Zellen (-CVO, Fig. 1) gab es eine geringe oder keine Sulfidoxidation. In Gegenwart von Zellen des Stamms CVO (+CVO, Fig. 1) trat eine Sulfidoxidation jedoch rasch auf. Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn synthetisches Medium CSB/DTA anstelle von filtrierter Sole verwendet wurde (Fig. 2). Die Zusammensetzung des Mediums CSB/DTA ist Tabelle III angegeben. Die in Fig. 1 und Fig. 2 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Bakterien die Oxidation von Sulfid sowohl in Ölfeldsole als auch in synthetischen Medien katalysieren.

CSB/DTA-Medium
CSB-Grundlage (in g/l)
NaCl\|7,0
MgSO₄·7H₂O	0,68
CaCl₂·2H₂O	0,24
NH₄Cl	0,02
NaHCO₃	1,90
Zugabe von DTA-Lösung @	ND-Stammlösung	50 ml
(NH₄)₂SO₄	0,13
KNO₃	1,0
KH₂PO₄	0,027
Natriumacetat	0,68
Resazurin (0,1%)	1 ml
1 M NaS·9H₂O-Stammlösung	5 ml
Einstellung des pH-Werts auf 7,5; Einführung eines Anteils in eine Coy-Kammer und Sterilisation @	ND-Stammlösung (in g/l) @	Nitriloessigsäure	2,0
Mikronährstofflösung	10 ml
FeCl₃-Lösung (0,29 g/l)	20 ml
CaSO₄·2H₂O	1,2
MgSO₄·7H₂O	2,0
NaCl	0,16
Na₂HPO₄	1,4
KH₂PO₄	0,72
Mikronährstofflösung @	destilliertes Wasser	1000 ml
H₂SO₄ (konz.)	0,5 ml
MnSO₄·H₂O	2,28 g
ZnSO₄·7H₂O	0,50 g
H₃BO₃ 0,50 g @	CuSO₄·5H₂O	0,025 g
Na₂MoO₄·2H₂O	0,025 g
CoCl₂·6H₂O	0,045 g

Fig. 3 zeigt die Verstärkung der Sulfidoxidation durch Zugabe von CVO-Zellen zu natürlicher geförderter Sole. Der Ansatz wurde wie folgt durchgeführt. Anreicherungen mit unfiltrierter geförderter Sole mit der Zusammensetzung, wie sie für die CSB-Grundlage angegeben ist (die ersten 5 Zeilen von Tabelle III), und mit einem Gehalt an 4,4 mM löslichem Sulfid wurden durch Zugabe von 50 ml Sole, 5 mM KNO₃ und 100 µM NaH₂PO₄ zu Serumflaschen hergestellt. In einem Fall wurde die Sole mit 2 ml (etwa 10⁷ Zellen/ml) einer Kultur des Stamms CVO, die über Nacht gezüchtet worden war, angereichert. Die Zugabe des Stamms CVO verkleinerte die Verzögerungszeit erheblich und verringerte die Zeit, die zur vollständigen Oxidation des Sulfids erforderlich war, von mehr als etwa 34 Stunden auf weniger als etwa 12 Stunden.

Beispiel III

Dieses Beispiel erläutert die Sulfidoxidationsgeschwindigkeit der erfindungsgemäßen Campylobacter-artigen Spezies.

Die Ansätze wurden mit Freiwasser-Vorabscheider-Sole (FWKO, "free-water knockout") durchgeführt, wie es in Beispiel II beschrieben wurde. Die dreifach angesetzte Sole wurde Filter-sterilisiert und mit 5 mM KNO₃ und 100 µM NaH₂PO₄ angereichert (die Stammlösungen dieser Bestandteile wurden getrennt sterilisiert). Jeder in der nachstehenden Tabelle IV gezeigte Ansatz wurde mit Kulturen, die etwa 10⁷ Zellen/ml enthielten, angeimpft, wie es in Tabelle IV angegeben ist. Sulfid wurde gemessen, wie es in Beispiel I beschrieben wurde.

Tabelle IV

Sulfidkonzentrationen (mM)

Die in Tabelle IV angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die Sulfidkonzentrationen in der filtrierten Sole als Kontrolle nach 14 Stunden im wesentlichen unverändert waren. Die Ergebnisse zeigen auch, daß die Geschwindigkeiten und die Verzögerungszeiten der Sulfidoxidation für die beiden Stämme CVO und FWKO B sowie für unfiltrierte Soleanreicherung (letzte Spalte, Tabelle IV) ähnlich waren.

Die in Tabelle IV gezeigten Zellzahlen für die Kulturen nach 24 Stunden Inkubation wurden durch direkte mikroskopische Zählung unter Verwendung von Acridin-Orange bestimmt. Die in der vorstehenden Tabelle IV angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die endgültigen Zellzahlen mit Ausnahme der filtrierten Sole als Kontrolle ungefähr gleich waren.

Die in den vorstehenden Beispielen angegebenen Ergebnisse zeigen klar, daß die vorliegende Erfindung gut geeignet ist, um die Aufgaben zu lösen und die Ziele und Vorteile, die genannt wurden und die inhärent sind, zu erreichen. Vom Fachmann können zwar Modifikationen vorgenommen werden, die jedoch unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, wie er durch Beschreibung und die Ansprüche definiert wird, fallen.

Claims

1. Bakterielle Kultur, die zur Oxidation eines Sulfids oder von Anteilen davon zu elementarem Schwefel in einem Fluid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Solen, Öl, Gas und Kombinationen von zwei oder mehr davon besteht, imstande ist.

2. Bakterielle Kultur nach Anspruch 1, die Campylobacter-Spezies umfaßt.

3. Bakterielle Kultur nach Anspruch 2, wobei die Campylobacter-Spezies aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472), Campylobacter sp. FWKO B (NRRL B-21473) und Kombinationen davon besteht.

4. Bakterielle Kultur nach Anspruch 2, wobei es sich bei der Campylobacter-Spezies um Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472) handelt.

5. Biologisch reine Kultur des Stamms Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472).

6. Biologisch reine Kultur des Stamms Campylobacter sp. FWKO B (NRRL B-21473).

7. Bakterielle Kultur, die zur Reduktion eines Nitrats und zur Oxidation eines Sulfids in einem Fluid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Solen, Öl, Gas und Kombinationen von zwei oder mehr davon besteht, imstande ist.

8. Bakterielle Kultur nach Anspruch 7, die Campylobacter-Spezies umfaßt.

9. Bakterielle Kultur nach Anspruch 8, wobei die Campylobacter-Spezies aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472), Campylobacter sp. FWKO B (NRRL B-21473) und Kombinationen davon besteht.

10. Bakterielle Kultur nach Anspruch 8, wobei es sich bei der Campylobacter-Spezies um Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472) handelt.

11. Verfahren zur Oxidation einer Sulfidverbindung in einem wesentlichem Maße in einem Fluid, wobei das Verfahren das Kontaktieren des Fluids mit einer bakteriellen Kultur, die zur Oxidation eines Sulfids imstande ist, umfaßt, wobei das Fluid unter Solen, Öl, Gas und Kombinationen von zwei oder mehr davon ausgewählt ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei es sich bei der Sole um eine geförderte Sole handelt.

13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die bakterielle Kultur eine Campylobacter-Spezies umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Campylobacter-Spezies aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472) und Campylobacter sp. FWKO B (NRRL B-21473) besteht.

15. Verfahren nach Anspruch 11, wobei es sich bei der Campylobacter-Spezies um Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472) handelt.

16. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die bakterielle Kultur eine Campylobacter-Spezies umfaßt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Campylobacter-Spezies aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472) Campylobacter sp. FWKO B (NRRL B-21473) besteht.

18. Verfahren nach Anspruch 13, wobei es sich bei der Campylobacter-Spezies um Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472) handelt.

19. Verfahren zur Oxidation einer Sulfidverbindung im wesentlichen Maße in einem Fluid, wobei das Verfahren das Kontaktieren des Fluids mit einer bakteriellen Kultur, die zur Reduktion eines Nitrat s und zur Oxidation eines Sulfids imstande ist, umfaßt, wobei das Fluid ein Nitrat umfaßt und aus Solen, Öl, Gas und Kombinationen von zwei oder mehr davon ausgewählt ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei es sich bei der Sole um eine geförderte Sole handelt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei es sich bei der Sole um eine geförderte Sole handelt.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die bakterielle Kultur eine Campylobacter-Spezies umfaßt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Campylobacter-Spezies aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472) und Campylobacter sp. FWKO B (NRRL B-21473) besteht.

24. Verfahren nach Anspruch 22, wobei es sich bei der Campylobacter-Spezies um Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472) handelt.

25. Verfahren zur Oxidation eines Sulfids in einer geförderten Sole, umfassend das Kontaktieren der Sole mit einer bakteriellen Kultur, die Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472) umfaßt, wobei die Sole ein Nitrat umfaßt.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei es sich bei dem Sulfid um Schwefelwasserstoff handelt.