DE68908982T2

DE68908982T2 - Mikrobiologische Kontrolle der Schwefelwasserstoffproduktion durch sulfatreduzierende Bakterien.

Info

Publication number: DE68908982T2
Application number: DE89111812T
Authority: DE
Inventors: Francis S Manning; Michael Joseph Mcinerney; Anne Denise Montgomery; Kerry Lyn Sublette; Marion Elmer Woolsey
Original assignee: Combustion Engineering Inc
Current assignee: ABB Environmental Services Inc
Priority date: 1988-07-19
Filing date: 1989-06-29
Publication date: 1994-03-24
Anticipated expiration: 2009-06-30
Also published as: US4879240A; CA1334946C; EP0354336A1; ES2045274T3; DE68908982D1; EP0354336B1

Description

Das Problem der Korrosion von Eisen und Stahl sowie Beton und Kalk ist weit verbreitet. Dadurch, daß Rohrstränge, Vorratstanks, Pumpen und andere korrosionsgeschädigte Systeme ersetzt bzw. instandgesetzt werden müssen, entstehen Regierungen sowie der Privatindustrie beträchtliche Kosten. Ob direkt oder indirekt, Korrosion wird meistens durch mikrobielle Vorgänge verursacht. Korrosion im allgemeinen und insbesondere mikrobielle Korrosion sind komplizierte Vorgänge, an denen selten, wenn überhaupt jemals, nur ein einziger Vorgang bzw. eine einzige Mikrobenart beteiligt ist.
Korrosion läßt sich als zerstörender Angriff auf Metalle durch einige chemische bzw. elektrochemische Vorgänge definieren. Bei Metallmassen besteht in wäßriger Lösung bzw. in feuchtem Milieu die Tendenz zur Iomisierung, wobei Elektronen (e&supmin;) abgegeben werden (Gleichung 1):
M -> Mn + ne&supmin; (1)
Der Teil der Metalloberfläche, an dem diese Reaktion stattfindet, wird als Anode bezeichnet. Korrosion findet statt, wenn Elektronen vom Metall entfernt werden, wodurch die Nettoionisierung des Metalls verstärkt wird. Bei den zwei hauptsächlich für die Entfernung von Elektronen verantwortlichen Vorgängen handelt es sich um einen Überschuß Wasserstoffionen (H&spplus;) (Gleichung 2):
2H&spplus; + 2e&supmin; -> 2H -> H&sub2; (2)
oder Sauerstoff (Gleichung 3):
H&sub2;O + 1/2O&sub2; + 2e&supmin; -> 2 (OH)&supmin; (3).
Teile der Metalloberfläche, an denen diese Reaktionen stattfinden, werden als Kathodenflächen bezeichnet. Für Korrosion in größerem Ausmaß müssen die Reaktionen an der Anode und Kathode im Gleichgewicht bleiben, und die elektrolytische Zelle muß längere Zeit arbeiten. Im Fall der mikrobiellen Korrosion wird angenommen, daß korrodierende Wirkungen auf einem bzw. mehreren der folgenden Vorgänge beruhen:
1) Direkte chemische Wirkung von Stoffwechselprodukten wie Schwefelsäure, anorganischen oder organischen Sulfiden sowie Chelatbildnern wie organischen Säuren;
2) Depolarisierung an der Kathode in Kombination mit anaerobem Wachstum;
3) Änderungen bezüglich Sauerstoffpotential, Salzkonzentration, pH usw., wodurch örtliche elektrochemische Zellen entstehen, und
4) Entfernung von Korrosionsinhibitoren (Nitrit- oder Aminoxidation) oder von Schutzanstrichen (Asphalt auf erdverlegten Rohrleitungen).
An diesen Vorgängen können verschiedene Mikrobenarten beteiligt sein, entweder einzeln oder als Bestandteile von Symbiosen.
In einem anaerobem Milieu wird Korrosion meistens auf das Wachstum von dissimilierenden sulfatreduzierenden Bakterien (SRB) zurückgeführt. Diese Bakteriengruppe ist vermutlich für 50% aller Korrosionsfälle verantwortlich. Charakteristisch für durch sulfatreduzierende Bakterien verursachte Stahlkorrosion ist Grübchenkorrosion, wobei die Grübchen offen sind und weiche schwarze Korrosionsprodukte in der Form von Eisensulfiden enthalten. Wird das Eisensulfid entfernt, so ist das darunterliegende Metal blank. Grübchenkorrosion wird auch bei Aluminium- und Kupferlegierungen beschrieben. Bei Gußeisen findet Graphitisation statt. Das Eisen wird gelöst und entfernt, und das Graphitskelett des Rohrs bleibt scheinbar nicht angegriffen zurück. Vor 25 Jahren verursachte die unterirdische Korrosion von Gas- oder Wasserleitungen aus Eisen oder Stahl Schäden in der Höhe von ungefähr einer halben bis zwei Milliarden Dollar pro Jahr. Heutzutage sind diese Kosten beträchtlich höher.
Ist kein Sauerstoff zur Entfernung von Elektronen von der Metalloberfläche verfügbar, so ist, wie oben erwähnt, eine andere Reaktion an der Kathode erforderlich, damit Korrosion auftritt. 1934 wurde von von Wolyogen Kuhr und van der Vlugt (Water, 18, 147) vermutet, daß sulfatreduzierende Bakterien einen direkten Beitrag zur Korrosion von Eisen dadurch leisten, daß sie den Wasserstoff, der an den Kathodenflächen des Metalls zur Reduktion von Sulfat zu Sulfid zur Verfügung steht, entfernen und verbrauchen. Es wurde vorgeschlagen, daß die Kathodendepolarisation folgendermaßen abläuft:
Anodenreaktion Fe -> Fe&spplus;² + 2e&supmin;
H&sub2;O -> H&spplus; + OH&supmin;
Kathodenreaktion 2H&spplus; + 2e&supmin; -> H&sub2;
Kathodendepolarisation SO&sub4;&supmin;² + 4H&sub2; S&supmin;² + 4H&sub2;O
Die Bildung von anorganischem Sulfid bei der Kathodendepolarisationsreaktion ist als solche beim Problem der mikrobiell verursachten Korrosion von höchster Bedeutung. Sulfatreduzierende Bakterien sind der Hauptgrund für die Entstehung von Schwefelwasserstoff in der Biosphäre. Schwefelwasserstoff ist hochgiftig und stellt in einem wäßrigen Milieu ein relativ starkes chemisches Korrosionsmittel dar. Seit diese Theorie der Kathodendepolarisation aufgestellt wurde, beschäftigten sich die meisten Arbeiten auf dem Gebiet der mikrobiellen Korrosion mit Beweisen hierfür. Siehe z. B. Booth & Tiller, Trans. Faraday Soc., 56, 1689 (1960) und 58, 2510 (1962); Booth et al, Congr. Intern. Corros. Marine Salissures, 363, CREO Paris (1964); Booth et al, Chem. Ind., 49, 2084 (1967); King & Miller, Nature, 233, 491 (1971); Iverson, Nature, 217, 1265 (1968); Iverson, Underaround Corrosion (Ed. Escalante), s. 33-52, Tech. Pub. 741, ASTM (a981).
Bei den sulfatreduzierenden Bakterien handelt es sich um eine taxonomisch uneinheitliche Gruppe. Mitte der Sechziger Jahre waren lediglich zwei Gattungen bekannt, nämlich Desulfovibrio und Desulfotomaculum. Von diesen Gattungen ist Desulfovibrio am besten untersucht. Die Desulfovibrio-Arten sind üblicherweise mesophil, relativ einfach zu isolieren und keine Sporenbildner. Die meisten Desulfovibrio-Arten enthalten Cytochrome des c-Typs und das chromatophor Desulfoviridin. Desulfotomaculum-Arten sind entweder mesophil oder thermophil. Die häufig vorkommende thermophile Art Desulfotomaculum nigrificans wurde ursprünglich als Clostridium nigrificans bezeichnet. Sporenbildung ist auf die Gattung Desulfotomaculum beschränkt, für die sie charakteristisch ist. Fünf neue sulfatreduzierende Gattungen (Desulfobacter, Desulfobulbus, Desulfococcus, Desulfonema und Desulfosarcina), die sich nicht nur morphologisch, sondern auch vom Ernährungsstandpunkt aus unterscheiden, wurden in den letzten Jahren von Widdel und Pfenning (Arch. Microbiol., 131, 360, 1982) beschrieben.
Die Unterschiede bezüglich der Stoffwechselkapazität der dissimilatorischen sulfatreduzierenden Bakterien in der Gegenwart von Sulfat sind sowohl zwischen den Gattungen als auch innerhalb gewisser Gattungen, wie z. B. Desulfovibrio, beträchtlich. Es wurde nachgewiesen, daß Desulfurikanten als Elektronendonator verschiedenste kohlenstoffhältige Verbindungen verwerten, darunter Alkohole, organische Säuren wie Laktat, Pyruvat und Benzoat, sowie Fettsäuren von Formiat bis Stearat. Viele Desulfovibrio-Arten, wie z. B. D. desulfuricans, D. gigas und D. sapovorans sowie Desulfotomaculum nigrificans, bauen Laktat und Pyruvat zum Acetat ab und reduzieren Sulfat zu Sulfid. Andere Arten endoxidieren langkettige Fettsäuren sowie aromatische Säuren zu CO&sub2;. Auch Wasserstoff wird als Elektronendonator von vielen Arten verwendet, und diese Bakterien können an interspezifischen Wasserstofftransferreaktionen dadurch teilnehmen, daß sie das von den Gärern produzierte H&sub2; verwerten. Einige Desulfurikanten können nicht nur H&sub2; verwerten, sondern auch H&sub2; aus organischen Molekülen freisetzen.
Desulfurikanten kommen in Schlamm, Teichen, Abwasser, Süß- und Salzwasser, grundwasserführenden Schichten, Erdöllagerstätten sowie im Pansen von Schafen und Rindern und im Darm von Insekten vor. Diese Organismen gedeihen in verschmutzten Seen und Kanälen. Bei den thermophilen Desulfurikanten handelt es sich üblicherweise um Stämme der Art Desulfotomaculum nigrificans, die in tief im Erdinneren liegenden, geothermisch erwärmten grundwasserführenden Schichten vorkommen. Desulfurikanten können auch in der wäßrigen Phase von Öl- bzw. Erdöllagersystemen wachsen. Da viele Öllagerstätten hohe Sulfatkonzentrationen aufweisen, ist die Sulfidproduktion durch sulfatreduzierende Bakterien wirtschaftlich für die Ölindustrie äußerst wichtig. Es scheint, daß sulfatreduzierende Bakterien indigen in Erdöllagerstätten vorkommen, obwohl über diese Hypothese noch keine Einigkeit besteht (siehe Nazina, Geomicrobiol. J., 4, 103, 1985). Bei der sekundären Erdölförderung werden diese Organismen leicht durch Wasser in Bohrlöcher eingetragen, und es wurde berichtet, daß sie ölführenden Sand mit einer Geschwindigkeit von 0,6 bis 12 m pro Jahr durchdringen können. Es wurde auch berichtet, daß Sulfovibrio desulfuricans und T. denitrificans gleichzeitig in einem sulfathaltigen Medium vorkommen (Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXIX, S. 759-761 (1987), Hrsg. J. Wiley & Sons, Inc.).
Derzeit lassen die meisten Versuchsergebnisse darauf schließen, daß Desulfurikanten nicht Kohlenwasserstoffe oxidieren, aber dies ist noch nicht vollständig geklärt. In neueren Untersuchungen wurde gezeigt, daß in Tiefen, in denen rasche Sulfatreduktion stattfindet, Methan anaerob oxidiert wird, was darauf schließen läßt, daß diese beiden Vorgänge gekoppelt sind.
Das Wachstum von sulfatreduzierenden Bakterien in Ölfeld-Wassersystemen kann der betreffenden Industrie erhebliche Kosten verursachen. Es ist bekannt, daß das Wachstum von sulfatreduzierenden Bakterien die Korrosion von Rohrsträngen, Verrohrungen, Vorratstanks, Pumpen usw. fördert, Einpreßsonden verstopft und möglicherweise Polymere (Polyacrylamid und Xanthangummen) sowie Tenside zersetzt. Beinahe jedes Gebiet der Ölförderung ist betroffen.
Obwohl die erste Untersuchung über mikrobeninduzierte Korrosion in Rohrleitungen ungefähr 1923 durchgeführt wurde, so unterschätzt man in gewissen Kreisen noch immer die Wichtigkeit von Mikroorganismen als Hauptgrund für Korrosion im Ölfeld. Skeptiker sollten sich den folgenden Fall ansehen. Eine der großen Erdölgesellschaften, die eine Bohrinsel im Fernen Osten betrieb, legte eine 60-Meilen lange Unterseepipeline von 23 Zoll Durchmesser, um Förderprodukte zu Lageranlagen auf dem Festland zu transportieren. Das Rohöl enthielt unter 1% Wasser. Die Förderleistung bedingte eine Laminarströmung im Rohr, und das mitgeschleppte Wasser setzte sich am Boden der Leitung ab. Den Technikern war nicht bekannt, daß sich in der Wasserschicht beträchtliches mikrobielles Wachstum entwickelte, und nach einiger Zeit wurde festgestellt, daß die Pipeline undicht war. Durch eine Überprüfung der Pipeline stellte man fest, daß sich an ihrer Unterseite alle 3-4 Fuß Löcher befanden. Nach nur vier Betriebsjahren mußte praktisch die ganze Pipeline ersetzt werden. Als die Pipeline neu in Betrieb genommen wurde, wurde ein Programm zur Überwachung und Bekämpfung des mikrobiellen Wachstums in Angriff genommen. Die neue Pipeline ist nun zehn Jahre ohne irgendwelche Anzeichen von Korrosion in Betrieb.
Es existiert eine große Zahl solcher Fallbeispiele von mikrobieller Korrosion, Pfropfenbildung und aufgrund der Unwirksamkeit von Flußmitteln zum Scheitern verurteilten größeren Ölförderprogrammen, die allesamt Schäden in Milliardenhöhe verursachten und die einem eine Warnung sein sollten. Ein Ölfeld-Wassersystem kann zwar unmöglich unter sterilen Bedingungen betrieben werden, die genannte Fallstudie zeigt jedoch sehr deutlich, daß das Wachstum von Mikroorganismen in diesen Systemen minimiert werden muß.
Die Bekämpfung mikrobieller Korrosion in der Erdölförderung umfaßt im allgemeinen physikalische bzw. mechanische Maßnahmen sowie chemische Maßnahmen. Zu den physikalischen Verfahren gehören:
1) Verwendung von Einpreßwasser geeigneten Ursprungs, um die Eindringung von sulfatreduzierenden Bakterien zu minimieren;
2) das gelegentliche Reinigen von Wasserrohren durch Bürsten oder Kratzen, sowie Spülen mit einem Schwall von Tensiden und Lösungsmitteln;
3) Vermeidung von Zumischung von Wasser unterschiedlicher Herkunft, da Zumischungen die Wachstumsbedingungen für sulfatreduzierende Bakterien verbessern können; und
4) die Vermeidung von Totpunkten und eine Verkürzung der Zeit für Wasserbewegungen.
Obwohl physikalische Methoden einen wirksamen Beitrag zur Bekämpfung von sulfatreduzierenden Bakterien leisten können, so wird doch die wirksamste Bekämpfung von mikrobieller Aktivität in einem Ölfeld-Wassersystem durch chemische Maßnahmen (Biozide) erreicht. Bei der Auswahl eines Biozids bzw. mehrerer Biozide für eine Behandlungssituation werden verschiedene Aspekte in Betracht gezogen. Erstens muß das gewählte Biozid bzw. müssen die gewählten Biozide unter den im System und vorzugsweise auch im Tank vorherrschenden Bedingungen gegen die Bakterien im Wassersystem wirksam sein. Zweitens muß das Biozid im System persistent sein; d.h. es muß unter Beibehaltung seiner Wirksamkeit weit von der Einbringstelle entfernte Punkte erreichen können. Das Einpreßwasser stellt ein komplexes chemisches Milieu dar. Das Biozid muß in diesem Milieu chemisch stabil sein. Weiterhin muß das Biozid mit chemischen Behandlungsmitteln, wie z. B. Korrosionshemmstoffen, Kesselsteinverhütungsmitteln, Sauerstoffängern usw. kompatibel sein. Zu guter Letzt muß das Biozid auch preiswert sein.
Organische Biozide, wie z.B. Glutaraldehyd, weisen im allgemeinen in Ölfeld-Wassersystemen eine hohe Persistenz auf. Die Wirksamkeit eines organischen Biozids hängt jedoch von der Wasserchemie und -mikrobiologie des Anwendungssystems ab. Ein Biozid mag zum Beispiel in einem Ölfeld sulfatreduzierende Bakterien sehr gut bekämpfen, jedoch in einem anderen völlig unwirksam sein.
Bei den Desulfurikanten handelt es sich um sessile Bakterien, d. h. sie heften sich gerne an einer festen Oberfläche an. In einem Ölfeld-Wassersystem findet man Desulfurikanten im allgemeinen zusammen mit schleimbildenden Bakterien in dünnen Schichten, die aus einer Biopolymer-Grundmasse bestehen, in die Bakterien eingebettet sind. Das Innere dieser dünnen Schichten ist anaerob und für das Wachstum von sulfatreduzierenden Bakterien äußerst günstig, obwohl die Umgebung aerob ist. Damit ein Biozid gegen sessile Bakterien wirksam ist, muß es in die dünne biogene Schicht, die diese Bakterien schützt, eindringen und von ihr absorbiert werden können. Das heißt, daß zur Bekämpfung von Bakterien, die in eine dünne biogene Schicht eingebettet sind, wesentlich höhere Konzentrationen eines teueren Biozids erforderlich sind als zur Bekämpfung von planktonartigen oder freischwebenden Zellen der gleichen Art.
Die physikalische und chemische Bekämpfung des Wachstums von sulfatreduzierenden Bakterien stellt bei jedem Ölförderungsprogramm sowie bei anderen Programmen, wo die Entstehung von H&sub2;S unerwünscht ist, einen beträchtlichen und kontinuierlichen finanziellen Aufwand dar. Wirksamere Verfahren zur Bekämpfung von sulfatreduzierenden Bakterien und der Entstehung und Ansammlung von biogenem Schwefelwasserstoff sind erforderlich.

KURZFASSUNG

Bei der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur mikrobiellen Bekämpfung der H&sub2;S-Produktion mit dem Bakterium Thiobacillus denitrificans beschrieben. Die Erfindung beinhaltet die Verwendung von Mutantenstämmen von Thiobacillus denitrificans, die eine höhere Toleranz gegenüber löslichem Sulfid (S&supmin;², HS&supmin;, H&sub2;S) aufweisen und die auch eine höhere Toleranz gegenüber einem gegen sulfatreduzierende Bakterien wirksamen Biozid als der Wildtyp-Organismus aufweisen können, in einem Verfahren, in dem mit sulfatreduzierenden Bakterien infizierte Milieus mit den oben genannten Mutantenstämmen von T. denitrificans mit oder ohne gleichzeitiger Behandlung mit Glutaraldehyd behandelt werden, um die Nettobildung von Sulfid (S&supmin;²), Bisulfid (HS&supmin;) oder Schwefelwasserstoff (H&sub2;S) zu verhindern. Weiterhin werden bei der Erfindung Mutantenstämme von T. denitrificans verwendet, um von sulfatreduzierenden Bakterien produziertes Sulfid zu Sulfat zu oxidieren, wodurch die Nettobildung von Sulfid verringert bzw. verhindert wird. Die vorliegende Erfindung beinhaltet ebenfalls die Möglichkeit, die mikrobielle Bekämpfung der Sulfidproduktion mittels T. denitrificans mit der Hemmung von sulfatreduzierenden Bakterien mit dem Biozid Glutaraldehyd zu kombinieren. Die Erfindung kann insbesondere zur Bekämpfung der Sulfidproduktion in einem Wassereinpreßrohr bei der sekundären Förderung von Erdöl angewandt werden, jedoch auch zur Bekämpfung der Sulfidproduktion in anderen Situationen, wie z. B. der Behandlung von Abfallstoffen, die sulfatreduzierende Bakterien enthalten.

KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Bei Abb. 1 bis 4 handelt es sich um grafische Darstellungen, die die Wirkung von Sulfid auf das Wachstum von Wildtypstämmen und sulfidtoleranten Stämmen von T. denitrificans veranschaulichen.

GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Thiobacillus denitrificans ist ein streng autotropher und fakultativer Anaerobier, der von Baalsrud und Baalsrud zum ersten Mal genau beschrieben wurde (Arch. Mikrobiol. 20, 34, 1954). Unter anaeroben Bedingungen kann Nitrat als Elektronenendakzeptor verwendet werden, wobei das Nitrat zu elementarem Stickstoff reduziert wird. Es wurde nachgewiesen, daß Wildtyp T. denitrificans leicht aerob oder anaerob auf Schwefelwasserstoff als Energiequelle unter sulfidlimitierenden Bedingungen kultiviert werden kann. Unter diesen Bedingungen wird Schwefelwasserstoff zu Sulfat endoxidiert. Schwefelwasserstoff ist jedoch ein Hemmsubstrat, bei dem bei Sulfidkonzentrationen über 100-200uM eine Wachstumshemmung beobachtet wird. Bei ungefähr 1000uM tritt ein vollständiger Wachstumsstillstand ein. In Tabelle 1 ist die Stöchiometrie der aeroben und anaeroben Oxidation von H&sub2;S durch T. denitrificans sowohl für einen diskontinuierlich betriebenen Bioreaktor als auch für einen kontinuierlich betriebenen Rührkesselbioreaktor (CSTR) bei verschiedenen Verdünnungsstufen zusammengefaßt (D=q/v, wobei q der Volumendurchsatz an Nährstoff und v das Kulturvolumen bedeuten). Es wurde bestimmt, daß die maximale Biooxidationskapazität der T. denitrificans- Biomasse für die Oxidation von H&sub2;S unter anaeroben Bedingungen 5-8 mMol/hr-g Biomasse und unter aeroben Bedingungen 15-21 mMol/hr-g Biomasse beträgt. Eine Drucktoleranz von T. denitrificans bis 1800 psig (12,5 MPa) sowie eine relative Unempfindlichkeit gegen Druck/Entspannungszyklen wurde ebenfalls nachgewiesen.
Sulfid- und biozidresistente Stämme von Thiobacillus denitrificans zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung wurden durch Anreicherung aus Wildtyp-T. denitrificans-Kulturen (ATCC 23642) isoliert. Zuerst wurden verschiedene im Handel erhältliche Biozide gescreened, um eine vorhandene Resistenz von Wildtyp-T. denitrificans gegen kleine Biozidmengen (1-5 ppm) zu identifizieren. Eine Resistenz gegenüber geringen Mengen wurde lediglich bei Bioziden beobachtet, die Glutaraldehyd als Wirkstoff enthielten, wie z. B. die Biozide B-648 und B-649 von der Arco Chemical Co.. Stämme, die in Thiosulfatmedium bei einer Anfangskonzentration von 40 ppm Glutaraldehyd wachstumsfähig waren, wurden durch wiederholte Subkultivierung von resistenten Kulturen bei steigenden Biozidkonzentrationen nach üblichen Subkultivierungsverfahren erhalten.
Prüfungen zeigen, daß eine Behandlung des Wildtyps mit 7 12 ppm Glytaraldehyd einen 100%igen Verlust an Lebensfähigkeit zur Folge hat. Ein Vergleich zeigt, daß die glutaraldehydresistenten Stämme in der Gegenwart von Glutaraldehyd bei Konzentrationen wachsen können, die für den Wildtyp letal sind. Obwohl die glutaraldehydresistenten Stämme im Thiosulfatmedium bei Anfangskonzentrationen von bis zu 40 ppm Glutaraldehyd wachstumsfähig waren, ist vermutlich das eigentliche Niveau, auf dem Wachstum stattfindet, niedriger. Üblicherweise werden jedoch Glutaraldehydkonzentrationen von lediglich 7-12 ppm zur Bekämpfung des Wachstums von sulfatreduzierenden Bakterien verwendet. TABELLE 1 STÖCHIOMETRIE DER OXIDATION VON H&sub2;S DURCH THIOBACILLUS DENITRIFICANS a Bioreaktor-Typ Elektronen-Akzeptor Biomasse/H&sub2;S (g/Mol) diskontinuierlich a Durchschnitt aus drei oder mehreren Bestimmungen, wenn nicht anders angegeben. b Durchschnitt aus zwei Bestimmungen.
Um sowohl Glutaraldehyd- als auch Sulfidtoleranz in einem Stamm zu kombinieren, wurden glutaraldehydresistente Stämme wiederholt in der Gegenwart von steigenden Sulfidkonzentrationen (bis zu 1000uM) in Thiosulfatmedium mittels konventioneller Subkultivierungsmethoden subkultiviert. Es entwickelten sich rasch Doppelmutantenstämme, die eine hohe Sulfidtoleranz und hohe Glutaraldehydresistenz aufwiesen. Die Sulfidtoleranz wird durch die grafischen Darstellungen in Abb. 1 bis 4 veranschaulicht, in denen die Bakterienzellkonzentration durch die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 460 Nanometern dargestellt wird und gegen die Inkubationszeit in Tagen bei 30ºC und pH 7,0 aufgetragen wird. In Abb. 1 beträgt die anfängliche Sulfidkonzentration 0uM; in Abb. 2 825uM; in Abb. 3 1000uM; und in Abb. 4 1500uM.
Die Fähigkeit des sulfidtoleranten T. denitrificans-Stamms, die biogene Sulfidproduktion zu bekämpfen, wurde dadurch nachgewiesen, daß dieser Stamm mit sulfatreduzierenden Bakterien, wie z. B. Desulfovibrio desulfuricans in Flüssigkulturen und porösen Sandstein- Bohrkernen co-kultiviert wurde. In allen Kulturen wurden Lactat als Elektronendonator für die sulfatreduzierenden Bakterien und Sulfat als Elektronenakzeptor verwendet. Biogenes Sulfid stellte den Elektronendonator für T. denitrificans und Nitrat dessen Elektronenakzeptor dar. Das Wachstumsmedium enthielt auch Mineralsalze und Vitamine. Von diesem Medium war bekannt, daß es das Wachstum sowohl der sulfatreduzierenden Bakterien als auch von T. denitrificans allein (mit Thiosulfatzusatz als Elektronendonator) ermöglicht.
Wurde D. desulfuricans allein oder als Co-Kultur mit dem Wildtyp-T. denitrificans kultiviert, so wurden in allen Reinkulturen von D. desulfuricans und in allen Co- Kulturen mit dem T. denitrificans-Wildtypstamm große Sulfidmengen produziert (Tabelle 2). Mit 0,3 ml einer T. denitrificans-Wildtyp-Suspension inokulierte Co-Kulturen wiesen niedrigere Sulfidgehalte auf als Co-Kulturen, die mit 0,1 ml bzw. 0,2 ml inokuliert worden waren, was darauf schließen läßt, daß hohe Zellzahlen erforderlich sind, bevor die Sulfidproduktion abnimmt. Wurde D. desulfuricans in Co-Kultur mit dem sulfidtoleranten Stamm kultiviert, so wurde wenig oder gar kein Sulfid produziert. Die geringe Sulfidmenge (4,0 mg/l), die nach 14 Tagen in der Kultur mit dem niedrigsten Inokulum des sulfidtoleranten Stamms produziert wurde, verschwand nach 19 Tagen. Die folgende Tabelle 2 enthält eine Aufstellung dieser Versuchsergebnisse: TABELLE 2 Sulfidproduktion einer Kultur von D. desulfuricans mit bzw. ohne Wildtyp-T. denitrificans oder dessen Mutantenstamm Kultur T. denitrificans Inokulum-Menge Sulfidkonzentration (mg/l) nach: Tagen nur Dd nur Wt nur st Abkürzungen: Dd = D. desulfuricans WT = T. denitrificans-Wildtyp st = sulfidtoleranter T. denitrificans
In jeder Kultur, in der Sulfid nachgewiesen wurde, wurde auch Eisensulfid als schwarzer Niederschlag gefunden; in denjenigen Probenröhrchen, in denen kein Sulfid gefunden wurde war dies jedoch nicht der Fall. Diese Versuche wurden einige Male wiederholt, und ähnliche Resultate wurden erhalten. Der Zusatz einer bekannten Sulfidmenge zu einer Probe dieser Kulturen zeigte, daß die Co-Kulturen keine Substanzen enthielten, die sich auf das für den Sulfidnachweis verwendete kolorimetrische Verfahren störend ausgewirkt haben könnten. Eine Symbiose sulfatreduzierender Bakterien, die durch Anreicherung aus einer Ölfeld-Sole erhalten wurde, ergab ähnliche Ergebnisse.
Um zu zeigen, daß der sulfidtolerante T. denitrificans-Stamm tatsächlich Sulfid zu Sulfat durch Nitratreduktion oxidierte, wurde an sulfidproduzierenden Kulturen mit oder ohne sulfidtoleranten Stamm der Substrat- und Stoffwechselprodukthaushalt ermittelt. Bei einer anfänglichen Lactatkonzentration von 1,5 mM würde man eine Produktion von 1,5 mM Acetat und 0,75 mM Sulfid erwarten, wenn das gesamte Lactat von D. desulfuricans verwertet wird. Es wurden Werte von 1,4 mM Acetat (Wiederfindungsrate 95%) und 0,6 mM Sulfid (Wiederfindungsrate 83%) gefunden. Bei Co-Kultur mit dem sulfidtoleranten Stamm wurde das Lactat vollständig verwertet, und ein gleichzeitiger Rückgang des Nitratgehalts wurde beobachtet, was auf ein Wachstum sowohl von D. desulfuricans als auch von dem sulfidtoleranten T. denitrificans-Stamm schließen läßt. Weder optisch (als Eisensulfid) noch kolorimetrisch wurde Sulfid nachgewiesen. Die Sulfatendkonzentration glich der Ausgangskonzentration, was beweist, daß der sulfidtolerante Stamm das von D. desulfuricans produzierte Sulfid stöchiometrisch zu Sulfat oxidierte.
Ähnliche Ergebnisse wurden bei den Kulturen beobachtet, die durch Anreicherung aus der Ölfeld-Sole erhaltene Organismen enthielten, es wurde jedoch kein Acetat nachgewiesen. In Kulturen ohne den sulfidtoleranten Stamm wurde ungefähr 50% mehr Sulfid als in Kulturen von ausschließlich D. desulfuricans nachgewiesen. Dies läßt möglicherweise auf die Anwesenheit von acetatverwertenden sulfatreduzierenden Bakterien oder eines anderen Acetatverwerters schließen, der H&sub2; für diejenigen Desulfurikanten produziert, die Wasserstoff als Substrat verwerten können. Wurde der sulfidtolerante Stamm gemeinsam mit der Symbiose aus der Sole kultiviert, so wurde kein Sulfid nachgewiesen, die Nitratkonzentration sank ab, und die Sulfatkonzentration entsprach ungefähr der Ausgangskonzentration. Das heißt, daß der sulfidtolerante Stamm wachstumsfähig war und die gesamte Sulfidmenge, die in einer Anreicherungskultur aus einer Feldprobe produziert worden war, wirksam verwerten konnte, und sich wirksam gegen eventuell vorhandene Denitrifikanten behaupten konnte.
Um die Wirksamkeit des sulfidtoleranten Stamms bei der Verhinderung von biogener Sulfidproduktion in einem lagerstättenartigen Milieu nachzuweisen, wurden der sulfidtolerante T. denitrificans-Stamm und sulfatreduzierende Bakterien auch in Berea-Sandsteinbohrkernen cokultiviert. Aus Berea-Sandsteinblöcken wurden kleine zylinderförmige Bohrkerne ausgeschnitten, und diese wurden bei 121ºC 30 Minuten in einem Wachstumsmedium ohne Spurenelementmetalle autoklaviert. Der Autoklaviervorgang erhöht die Permeabilität. Anschließend wurde die Permeabilität jedes Bohrkerns bestimmt, und nur solche mit Permeabilitäten über 500 mdarcy oder mehr wurden verwendet. Zur Bestimmung der Permeabilität jedes Bohrkerns wurde Wachstumsmedium verwendet, sodaß jeder Bohrkern mit Wachstumsmedium gesättigt war. Jeder Bohrkern wurde anschließend zwischen zwei Flaschen (A und B) befestigt, wobei jede Flasche das oben beschriebene Wachstumsmedium enthielt. Der Inhalt jeder Flasche war mit einer Seite des Berea-Bohrkerns in Kontakt. Diese Wachstumskammern wurden autoklaviert, in die anaerobe Glove-Box gegeben, und jede Flasche wurde mit Spurenelementmetallen versetzt. Flasche A wurde dann mit der jeweiligen Kultur bzw. den jeweiligen Kulturen beimpft. Für jede Kultur wurde die ungefähre Durchwuchszeit, definiert als die Anzahl der nach Beimpfung der Flasche A bis zum Erscheinen von Mikroorganismen in Flasche B vergangenen Tage, ermittelt.
Bei Reinkultur hatten sowohl der Wildtyp- als auch der sulfidtolerante T. denitrificans-Stamm Durchwuchszeiten von 17 Tagen. Bei Reinkulturen von D. desulfuricans und der Sole-Symbiose wurden 25 bzw. 22 Tage benötigt, bis die Bohrkerne durchwachsen waren. Bei Co-Kultur wurden Organismen des sulfidtoleranten Stamms und D. desulfuricans nach 25 Tagen bei zweimaliger Autoklavierung und nach 70 Tagen bei einmaliger Autoklavierung der Wachstumskammer beobachtet. In beiden Fällen wurde T. denitrificans in Flasche B zur gleichen Zeit wie D. desulfuricans beobachtet, was darauf schließen läßt, daß dieser Organismus gemeinsam mit dem Desulfurikanten wuchs. Sulfidproduktion wurde in Flasche A mit einer alleinigen Kultur von D. desulfuricans und einer alleinigen Kultur der Sole-Symbiose beobachtet. Eisensulfid wurde beobachtet, und lösliches Sulfid in Flasche B dieser Kulturen wurde ungefähr 3 Tage nach erstmaliger Beobachtung von mikrobiellem Wachstum kolorimetrisch bestimmt. Bei Anwesenheit des sulfidtoleranten Stamms wurde in keiner Flasche der Wachstumskammer jemals schwarzer Niederschlag oder Sulfid in den sulfidproduzierenden Kulturen nachgewiesen. Nachdem die Flüssigphase in Flasche B jeder Wachstumskammer analysiert worden war, wurde jeder Bohrkern aufgebrochen und zerschlagen. Ein schwarzer, aus Eisensulfid bestehender Niederschlag wurde in jedem Bohrkern mit ausschließlich D. desulfuricans und ausschließlich der Sole-Symbiose beobachtet. Wurden Bohrkerne, in denen D. desulfuricans und zusätzlich der sulfidtolerante Stamm gewachsen waren, aufgebrochen und zerschlagen, so fand sich kein schwarzer Niederschlag. Diese Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt. TABELLE 3 Kultur Durchwuchszeit (Tage) Sulfid (mM) Flasche B Schwarzer Niederschlag im Bohrkern Sole-Symbiose a Abkürzungen: Dd = D. desulfuricans st = sulfidtoleranter T. denitrificans Wt = T. denitrificans-Wildtyp a = Bohrkern wurde vor der Beimpfung zweimal autoklaviert.
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß ein sulfid- und glutaraldehydresistenter T. denitrificans- Stamm erfolgreich in Co-Kultur mit dem sulfatreduzierenden Bakterium D. desulfuricans sowohl in Flüssigkultur als auch in Berea-Sandsteinbohrkernen ohne Sulfidakkumulation kultiviert wurde. Die mikrobielle Sulfidproduktion in einer Anreicherungskultur aus Ölfeld- Sole wurde auch durch die Gegenwart dieses sulfidtoleranten Stamms bekämpft. Die Wirkung beruht auf der Sulfidresistenz des Stamms, da dieser zum Wachstum und zur Verwertung von Sulfid in Konzentrationen, die auf den T. denitrificans-Wildtypstamm eine Hemmwirkung ausübten, fähig ist. Es gibt viele sulfidoxidierende Bakterien, aber diese Bakterien werden üblicherweise bei störenden H&sub2;S-Konzentrationen gehemmt. Der sulfidtolerante Stamm war nicht nur wirksam bei der Bekämpfung von Sulfid in D. desulfuricans-Kulturen unter Verwendung von Lactat als Energiequelle, sondern auch in einer Mischung von sulfatreduzierenden Bakterien, die Lactat und Produkte des Lactatstoffwechsels, Acetat und H&sub2; für die Sulfidproduktion verwenden.
Der sulfidtolerante T. denitrificans-Stamm wuchs in Reinkultur rasch durch Berea-Sandsteinbohrkerne hindurch. Seine Durchwuchsgeschwindigkeit betrug ungefähr 0,4 cm/Tag, was wesentlich schneller ist als die für D. desulfuricans und die Organismen der Ölfeldsolenanreicherungskultur ermittelten Daten. Es schien, daß der sulfidtolerante Stamm und die sulfidproduzierenden Organismen gemeinsam durch den Bohrkern hindurchwuchsen, da bei mikroskopischer Überprüfung Organismen, die eine morphologische Ähnlichkeit zu D. desulfuricans und T. denitrificans aufweisen, in Flasche B in mit diesen beiden Stämmen beimpften Wachstumskammern beobachtet wurden. Dies ist wichtig, da es nahelegt, daß der sulfidtolerante Stamm Sulfid in jenem Ausmaß verwertete, als es produziert wurde, und daher eine Ansammlung von Sulfid verhinderte. Die langsamen Durchwuchsgeschwindigkeiten von D. desulfuricans legen nahe, daß Desulfovibrio-Arten nicht leicht durch Sandstein hindurchwachsen. Hierbei scheint es sich um eine allgemeine Eigenschaft von sulfatreduzierenden Bakterien zu handeln, da die verschiedenen Desulfurikanten in der Ölfeldsolenanreicherungskultur ebenfalls nur langsam durch die Bohrkerne hindurchwuchsen. Nachdem D. desulfuricans die Bohrkerne durchwachsen hatte, war das Sulfid hauptsächlich an den Seiten der Bohrkerne konzentriert, obwohl Nährstoffe innerhalb des ganzen Bohrkerns zur Verfügung standen. Trifft dies auch auf ein natürliches Milieu zu, so mag es sein, daß das Problem der Sulfidansammlung stärker lokalisiert ist, als angenommen wurde. Die Einbringung von sulfatreduzierenden Bakterien in eine Formation tief unter der Erde durch Überflutung mit Wasser ist möglicherweise nicht der Hauptgrund für die Existenz dieser Organismen in Öllagerstätten. Es ist vielmehr möglich, daß sulfatreduzierende Bakterien indigen in diesen Milieus vorkommen, und daß ihre Aktivität durch die Ölförderung stimmuliert wird. Interessant ist, daß es sich auch bei der Pfropfenbildung in Einpreßsonden durch die Entwicklung von dünnen biogenen Schichten um eine örtliche Erscheinung handelt. Dabei können sich möglicherweise Abhilfsmaßnahmen, wie z. B. die Verwendung des sulfidtoleranten Stamms, zur Entfernung von Sulfid auf die Umgebung in der Nähe des Bohrlochs beschränken, da diese Tätigkeit nur hier beobachet wird.
Die Fähigkeit von T. denitrificans, solche Formationen mit Leichtigkeit zu durchwachsen, macht diesen Organismus bei der Bekämpfung von Sulfidansammlungen äußerst nützlich. Da es sich bei dem sulfidtoleranten T. denitrificans-Stamm um ein chemoautotrophes Bakterium handelt, brauchen keine weiteren organischen Nährstoffe zugesetzt werden, um dessen Wachstum zu unterstützen. Dadurch wird das Wachstum von anderen indigen vorhandenen Organismen, die möglicherweise diese verschiedenen organischen Nährstoffe benötigen, beschränkt. Da T. denitrificans ein fakultativer Anaerobier ist, ließe sich dieser Organismus nicht nur in streng anaeroben Milieus verwenden, sondern er könnte auch wirksam H&sub2;S verwerten, das in eine aerobe Zone diffundiert. Der durch sulfatreduzierende Bakterien verursachte anaerobe Korrosionvorgang läuft bei neutralem pH-Wert, was optimal für das Wachstum von T. denitrificans ist, ab. Das Wachstumsoptimum von T. denitrificans liegt bei 30ºC, und die Wachstumsgeschwindigkeit nimmt bei höheren Temperaturen rasch ab. Temperaturen über 40ºC hemmen das Wachstum vollständig. Thermophile sulfatreduzierende Bakterien wurden in großer Anzahl bestimmt, und T. denitrificans wäre in Milieus, wo solche Organismen vorkommen könnten, nicht wirksam. Ein weiterer limitierender Faktor für das Wachstum von T. denitrificans ist die Salzkonzentration. Bei einem Zusatz von 1% Natriumchlorid zu T. denitrificans-Kulturen wurde das Wachstum nach einer Inkubationszeit von 72 Stunden zu 30% gehemmt. Wurde die Salzkonzentration auf 2% erhöht, so betrug die Wachstumshemmung 82%. Ähnliche Ergebnisse wurden in der Gegenwart von ähnlichen Mengen Kaliumchlorid erhalten ( 1,28% bzw. 2,56%). In der Gegenwart von 3% NaCl bzw. 3,74% KCl wurde eine vollständige Wachstumshemmung beobachtet. Wird jedoch T. denitrificans in Medien kultiviert, die 0,05% Lactat enthalten, so beträgt die Wachstumshemmung ungefähr 50%. Unter diesen Bedingungen verwertete der sulfidtolerante Stamm noch immer wirksam das von den co-kultivierten sulfatreduzierenden Bakterien produzierte Sulfid. Dies zeigt, daß der sulfidtolerante T. denitrificans-Stamm nicht unbedingt unter Idealbedingungen wachsen muß, um Sulfid wirksam zu verwerten.
Wie oben erwähnt ist eine der besonderen Anwendungsgebiete der Erfindung die Bekämpfung der Sulfidproduktion in einer Wassereinpreßsonde zur sekundären Förderung von Erdöl. In dieser Situation wird eine Suspension eines sulfid-/glutaraldehydtoleranten T. denitrificans-Stamms in die Wassereinpreßsonde gepreßt (gepumpt). Das Glutaraldehyd-Biozid kann gleichzeitig eingepreßt werden. Anschließend kann man einen gewissen Zeitraum für die Inkubation und für die Wanderung der Kultur vorsehen, bevor man mit dem Einpressen von Wasser beginnt, wobei dieser Zeitraum von der geologischen Formation abhängt. Das Einpreßwasser kann gegebenenfalls mit Nährstoffen für T. denitrificans angereichert werden, je nach Herkunft und Gehalt des Preßwassers. Gewisse Wässer aus Seen können zum Beispiel genug Nitrat und Phosphat enthalten, um als Nährstoffquelle ausreichend zu sein, während Wasser anderer Herkunft nicht genug Nährstoffe enthält. Sobald mit dem Einpressen von Wasser begonnen wurde, kann der Sulfidgehalt des geförderten Erdöls überprüft werden, und T. denitrificans kann zusätzlich nach Bedarf periodisch eingebracht werden, wenn Sulfid beobachtet wird. In Milieus, die nicht im Zusammenhang mit der sekundären Förderung von Erdöl stehen, z.B. bei der Behandlung von Abfallstoffen, die sulfatreduzierende Bakterien enthalten, wird lediglich eine Suspension von T. denitrificans (mit oder ohne Glutaraldehyd) der Abfallsuspension zugesetzt, wo sich der Organismus vermehrt. Auch hier kann man die Abfallsuspension auf die Gegenwart von Sulfid überprüfen und dann neu beimpfen.

Claims

1. Verfahren zur Unterdrückung der biogenen Sulfidproduktion in einer Umwelt, die Sulfat und sulfatreduzierende Bakterien sowie durch die Umwandlung des Sulfats in Sulfid durch die sulfatreduzierenden Bakterien produziertes Sulfid enthält und in der die sulfatreduzierenden Bakterien andernfalls weiter Sulfat in Sulfid umwandeln würden, gekennzeichnet durch den Verfahrensschritt der Einbringung in diese Umwelt eines Stamms des Thiobacillus denitrificans, der gegen Sulfidkonzentrationen über der vom Wildtyp des Thiobacillus denitrificans tolerierten Sulfidkonzentration von 200 uM resistent ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der besagte Stamm des Thiobacillus denitrificans auch gegen das Biozid Glutaraldehyd resistent ist und daß man die Umwelt zusätzlich mit Glutaraldehyd behandelt, um die sulfatreduzierenden Bakterien mengenmäßig zu verringern.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Umwelt aus einer Wassereinpreßsonde zur sekundären Förderung von Erdöl besteht und daß der besagte Verfahrensschritt darin besteht, daß man die Sonde mit dem besagten Stamm beimpft.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umwelt aus einer Wassereinpreßsonde zur sekundären Förderung von Erdöl besteht und daß der besagte Verfahrensschritt darin besteht, daß man die Sonde mit dem besagten Stamm beimpft.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich Nährstoffe für das Wachstum des besagten Thiobacillus denitrificans in diese Umwelt einbringt.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich Nährstoffe für das Wachstum des besagten Thiobacillus denitrificans in diese Umwelt einbringt.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich Nährstoffe für da. Wachstum des besagten Thiobacillus denitrificans in diese Umwelt einbringt.

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich Nährstoffe für das Wachstum des besagten Thiobacillus denitrificans in diese Umwelt einbringt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß diese Umwelt aus einer Suspension von Abfallstoffen besteht.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet daß man zusätzlich Nährstoffe für das Wachstum des besagten Thiobacillus denitrificans in diese Suspension einbringt.