DE3210911C2

DE3210911C2 - Verfahren zur Gewinnung von Furfurol abbauenden Bakterien, danach erhältliche Bakterien und deren Verwendung

Info

Publication number: DE3210911C2
Application number: DE3210911A
Authority: DE
Inventors: Gerhard Dipl.-Ing. Brune; Hermann Prof. Dr. 5170 Jülich Sahm; Siegfried Dr. Schoberth
Original assignee: Kernforschungsanlage Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1982-03-25
Filing date: 1982-03-25
Publication date: 1985-10-31
Also published as: DE3210911A1; FI79138C; FI831005A0; SE459975B; SE8301643L; FI79138B; FI831005L; CA1224170A; SE8301643D0

Abstract

Die anaerobe Aufbereitung bzw. Reinigung furfurolhaltiger Abwässer und insbesondere des Brüdenkondensats der Sulfitablaugeneindickung bei der Zellstoffabrikation in Abwesenheit von sulfatreduzierenden und methanogenen Bakterien kann gemäß der Erfindung durch Zusatz furfurolabbauender Bakterien ohne weiteres gestartet und gesteuert werden. Solche furfurolabbauenden Bakterien wurden ausgehend von einer Quelle für anaerobe Bakterien wie Moor, Sumpf oder insbesondere Klärschlamm unter Zwischenanreicherung in kontinuierlicher Flüssigkultur unter Zufütterung furfurolhaltiger Lösung durch eine spezielle Selektionstechnik erreicht, bei der die Bakterien (in unterschiedlichen Konzentrationen) in Agar fixiert werden, der mit einer verdünnten Lösung von Furfurol überschichtet wird, das als einzige Kohlenstoffquelle dient und beim Eindiffundieren in den Agar einen Konzentrationsgradienten ausbildet, innerhalb dessen auf alle Fälle ein für die Bakterien verträglicher Konzentrationsbereich vorhanden ist. Auf diese Weise wurden diskusförmige, beigefarbene Einzelkolonien von furfurolabbauenden Bakterien erhalten, die stark beweglich sind, leicht S-förmig gebogene Stäbchen mit Geißel darstellen und morphologisch dem Desulfovibrio gigas ähnlich sind.

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von Furfurol abbauenden Bakterien, und sie umfaßt die danach erhältlichen Bakterien und deren Verwendung (vgl. die Ansprüche 1,5 und 6).

Die anaerobe Abwasserreinigung gewinnt in jüngster Zeit zunehmend an Bedeutung, da im Vergleich zum aeroben Abbau von Verunreinigungen weniger Restschlamm zu bewältigen ist und Biogas als erwünschtes Nebenprodukt anfällt

Von Nachteil ist allerdings, daß Methan-Bakterien gegenüber toxischen Stoffen relativ empfindlich sind. So wurden furfurolhaltige Abwasser der Papierindustrie bislang allenfalls nach dem Belebtschlammverfahren gereinigt.

Erst in jüngster Zeit wurde erkannt, daß man Brüdenkondensat, das beim Eindicken von Sulfitablaufen der Zellstoffabrikation anfällt, durch anaeroben Abbau reinigen kann (s. Brüne, G.; Schoberth, S.; Sahm, H.: »Anaerobic treatment of wastewater from the pulp and paper industry«, Sec. Int. Symp. on Anaerobic Digestion, Travemünde, 6.— 11.9.1981). Diese Brückenkondensate enthalten normalerweise 100 bis 400 mMol/1 Essigsäure, bis 30 mMol/1 Furfurol und 20 bis 50 mMol/1 Schwefel in Form von Sulfit und Sulfat Der pH-Wert dieses Brüdenkondensats liegt in der Gegend von 2 und der CSB bei 10 000 bis 20 000 mg O₂/l.

Der bekannte anaerobe Abbau wurde durch Beimpfung des Brüdenkondensats mit Poben aus dem Faulturm einer kommunalen Abwasserkläranlage unter zeitaufwendiger selektiver Anreicherung der zum Abbau erforderlichen Bakterien erreicht

Als wirksame Mikroorganismen wurden dabei methanogene Bakterien (coccoide und fadenförmige) und sulfatreduzierende Bakterien ermittelt

Bringt man nun eine Bakterieninischkultur mit den genannten Spezies mit einem Brüdenkondensatansatz unter den genannten Abbaubedingungen zusammen, so ste3t man eine erhebliche Abbauhemmung fest, d. Il, das genannte Abwasser ist mit einer Mischkultur aus sulfatreduzierenden Bakterien und methanogenen Bakterien nicht ohne weiteres abbaubar.

Wie festgestellt wurde, wirkt Furfurol, das im Brüdenkondensat in Mengen von üblicherweise etwa 5 bis 30 mMol/1 und bisweilen bis zu 40 mMol/1 vorhanden ist, hemmend auf den Abbau, und selbst bei Verdünnung ist eine Selbstanzüchtung von furfurol-abbauenden Bakterien äußerst zeitraubend und nimmt mehrere Monate in Anspruch.

Ziel der Erfindung ist daher die Bereitstellung furfurol-abbauender Bakterien, die in der Lage sind. Furfurol in Konzentrationen von bis zu etwa 5 bis 10 mMol/I abzubauen, um so eine kontinuierliche Reinigung von Brüdenkondensat in Anwesenheit dieser Bakterien bei entsprechender Verdünnung bzw. angemessener Zulaufrate in kontinuierlicher Fermentation zu ermöglichen.

Da Furfurol in höherer Konzentration hemmend auf die Entwicklung von anaeroben Bakterien wirkt wurde ein Verfahren zur Gewinnung von Furfurol abbauenden Bakterien entwickelt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Bakterienmischpopulation von Klärschlamm in stufenweiser Verdünnung bis 1 :10⁹ in Nähragar fixiert und mit verdünnter Furfuroilosung als einziger C-Quelle überschichtet dann die verdünnten, im Agar fixierten Bakterien dem langsam eindiffundierenden Furfurol aus der überstehenden Lösung aussetzt bis zur Ausbildung sichtbarer Kolonien, die dann isoliert werden.

Als Ausgangsmaterial kann dabei Klärschlamm aus einem Faulturm dienen, der zunächst einer Anreicherungskultur unter Zufütterung von Brüdenkondensat der Zellstoffabrikation unterworfen wird. Auf diese Weise werden den avisierten Anwendungsbedingungen angepaßte Bakterien bevorzugt, die dann in stufenweiser Verdünnung bis 1 :10⁹ im Agar fixiert werden können.

Besonders zweckmäßig ist aber eine weitere Voradaption durch Flüssigkultur mit Furfurol als einziger Kohlenstoffquelle, bevor die entsprechend verdünnten Bakterien in Agar fixiert der langsamen Eindiffusion de^. Furfurols aus der überstehenden Lösung ausgesetzt werden.

Die auf diese Weise gewonnenen Reinkulturen können als Zusatz für die anaerobe Reinigung furfurolhaltiger Abwässer in Anwesenheit einer sulfatreduzierende Bakterien und methanogene Bakterien enthaltenden Bakterienmischkultur verwendet werden. Diese anaerobe Reinigung kann im etwa neutralen bis schwach sauren pH-Bereich erfolgen, insbesondere bei etwa pH 6 bis 7,5, vorzugsweise im Bereich von pH 6,4 bis 7,2 und speziell bei pH 6,8. Die Temperatur kann zwischen etwa

Zimmertemperatur und 65°C gewählt werden, bevorzugte Bereiche liegen um 37° C und 60⁰C Spezielle technische Bedeutung hat das erfmdungsgemäße Verfahren bei der Reinigung von Brüdenkondensat der SuI-fitablaugeneindickung bei der Zellstoffabrikation.

Weitere Besonderheiten gehen aus den Unteransprüchen hervor sowie aus der nachfolgenden Beschreibung eines Ausführungsbeispiels für die Isolierung furfurolabbauender Bakterien.

10 A: Ausgangsmaterial: Klärschlamm aus dem Faulturm der Kläranlage Alsdorf-Bettendorf B: Adaptionskultur: Kontinuierliche Zufütterung von Brüdenkondensat aus Zellstoffabriken; C-Quelle: Acetat (90%), Furfurol (10%). Zugabe von Mineralien (Nährlösung I; s. u.); Temperatur (für alle weiteren Versuche) 37°C±1°C Acetat wird zu 99%, Furfurol restlos abgebaut; vornehmliches Endprodukt Biogas (CH₄ und CO₂). Der pH-Wert wurde im Fermenter durch Zugabe von 5 η NaOH auf 6,8 gehalten.

C: Spezifische Adaption von furfurol-abbauenden Mikroorganismen (flüssige Selektionskultur): Die Adaptionskultur erfolgte mit Furfurol als einziger C-Quelle unter kontinuierlicher Zulieferung von Furfurollösung (150mMol/l) und Umsetzung zu CH4 + CO2. Die aktuelle Furfurolkonzentration im Fermenter blieb praktisch vernachlässigbar. Ausgehend von dieser Mischkultur wurde die Isolierung des furfurol-abbauenden Bakteriums gestartet
D: Isolierung

1. Nach einer stufenweisen Verdünnung der durch Flüssigkultur wie vorstehend erhaltenen Bakterien in Nährlösung I (ohne C-Quelle) der folgenden Zusammensetzung:

40

45

50

55

60

Nährlösung I	lenkondens;	at oder I	-2H₂O
lOIBrüc	NH₄CI		■ H₂O
5g	MgCI₂ · 6	H₂O
6g	CaCl₃ · 2	H₂O
2.5 g	NaCl
2g	FeSO₄
ig	FeCl₂
15g		Spurenlösung*)
30 mi	Na₂HPO₄
10.2 g	NaH₂PO₄
7.8 g

0.13 ml MoSeWO-Lösung**) 745 mg KCl

*) Spurenlösung in I 1 H₂O(dest): 0.475 MnCI₂ · 4 H₂O
0.17 g CoCI₂ · 6H₂O
0.05 g CuSO₄ · 5 H₂O
0.18 g ZnSO₄-7 H₂O
0.018 g AIK(SO₄J₂ ■ 12H₂O 0.01 g H₁BO₃

") MoSeWO-Lösung in 1 I H₂0_(dest): 2 g Na₂SeO₃ ■ 5 H₂O
2 g Na₂WO₄-2 H₃O
2 g Na₂MoO₄ -2H₂O

die 15 mMoI/I Furfurol enthielt. Diese überstehende Lösung wurde nach einer und nach zwei Wochen erneuert Nach 4 Wochen hatten sich im Agar bei allen Ansätzen beigefarbene, diskusförmige Kolonien ausgebildet. Eine Gasbildung wurde nicht beobachtet Die Abbildung zeigt eine mikroskopische Vergrößerung eines Bakteriums (begeißelte, leicht gebogene kurze Stäbchen).

2. Isolierung der Kolonien und erneute Beimpfung von Agar-Shakes; gleiche Bedingungen wie unter D 1;3 χ Wechsel der Nährlösung. Nach 4 Wochen: Kolonien wie unter D 1.

3. Die Isolierung einiger Kolonien und Test auf Wachstum im speziellen Sulfatreduzierer-Medium (Nährlösung II, Äthanol als C-Quelle, SO4" als Elektronenakzeptor) ergab positive Ergebnisse sowohl in Flüssigmedium als auch auf Agar (Hungate-Technik). Die Nährlösung II hatte folgende Zusammensetzung pro 11 H₂O:

Nährlösung II

4,4 μΜοΙ/l Resazurin

?.8 mMol/1 KH₂PO₄ZK₂HPO₄, pH 7,00 7,2 mMol/1 NH₄Cl

63 μΜοΙ/l FeSO₄ · 7 H₂O

0,77 mMol/1 MgSO₄ · 7 H₂O 10 ml/I Wolfe's Vitamine*) 10 ml/1 Wolfe's Minerale*) 23,8 mMol/1 NaHCO₃

12mMoI/l KHCO3

28mMoI/l Na₂SO₄ ■ 10H₂O

als Reduktionsmittel:
0,23 ΓπΜοί/Ί Na-dithionit
0,416 mMol/I Na₂S · 9 H₂O
438 mMol/1 Thioglykolat

als C-Quelle (in der Regel):
239 mMol/1 Äthanol

*) siehe E. A. Wolin, M. J. Wolin, P. S. Weife, J. biol. Chem. 238 (1963). 2882 - 2886).

4. Isolierung von Einzelkolonien aus Agar von D 3. und Inkubation in Nährlösung II (ohne Äthanol aber unter Zugabe von 3 bis 5 mMol/1 Furfurol). Furfurol wird jedesmal nach Zugabe sofort abgebaut, und Acetat wird gebildet (mehrmalige Zugabe von kleinen Mengen Furfurol bis max. b Mol/l). Mikroskopisches Bild: stark bewegliche, !eicht S-för:nige Bakterien; morphologische Ähnlichkeit mit Desulfovibrio gigas. Diese Bakterien können Sulfat in Anwesenheit von Äthanol als Kohlenstoffqualle unter Acetatbildung zu H₂S reduzieren und Furfurol zu Essigsäure abbauen.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

wurden damit Agar-Shakes (Nährlösung 1 + 1 bis 2% Agar als Festigungsmittel) beimpft. Die 65 Inkubation erfolgte bei einem pH-Wert zwischen 6,4 und 7,0 unter Überschichtung des festen Agars mit i ml flüssiger Nährlösung I,

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von Furfurol abbauenden Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Bakterienmischpopulation von Klärschlamm in stufenweiser Verdünnung bis 1 :10⁹ in Nähragar fixiert und mit verdünnter Furfurollösung als einziger C-Quelle überschichtet, dann die verdünnten, im Agar fixierten Bakterien dem langsam eindiffundierenden Furfurol aus der überstehenden Lösung aussetzt bis zur Ausbildung sichtbarer Kolonien, die dann isoliert werden.

Z Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man suspendierte Bakterien enthaltenden festen Agar im Verhältnis 5 :1 mit flüssiger mineralienhaltiger Nährlösung überschichtet, die 15 mMol/1 Furfurol als einzige C-Quelle enthält und den Ansatz mit wochenweisem Wechsel der Nährlösung einige Wochen inkubiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die im Agar zu suspendierende Bakterienmischpopulation einer voranreichernden Selektionskultur in flüssiger Nährlösung mit 5 bis lOmMol/I Furfurol als einziger C-Quelle unterwirft

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ausgehend von Klärschlamm aus einem Faulturm eine Anreicherungskultur unter kontinuierlicher Zufuhr von Brüdenkondensat einer Zellstoffabrikation zur Erzielung einer Bakte^anmischpopulation zur Beimpfung der flüssigen Selektionskultur bzv zur Suspension in Agar durchführt

5. Furfurol abbauende Bakterien, erhältlich nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

6. Verwendung der Bakterien nach Anspruch 5 zur anaerobetv Aufbereitung von furfurolhaltigen Abwässern in Anwesenheit einer sulfatreduzierende Bakterien und methanogene Bakterien enthaltenden Bakterienmischkultur.