NO319148B1 - Sulfidoksiderende bakterier og prosess med dem - Google Patents

Abstract

En bakteriekultur som omfatter en Campylobacterlignende art er tilveiebrakt. Bakteriekulturen er i stand til å oksidere en sulfidforbindelse i en fluid så som f.eks. en produsert saltoppløsning. Videre er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for hovedsakelig å redusere sulfidinnholdet i en fluid hvori prosessen omfatter å bringe fluidet i berøring med en bakteriekultur som omfatter en Campylobacter-lignende art.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår bakterier som er istand til å oksidere en sulfidforbindelse eller hovedsakelig redusere sulfidinnholdet i saltoppløsninger, olje, gass eller kombinasjon av en eller flere derav. Foreliggende oppfinnelse angår også en fremgangsmåte for å redusere sulfidinnholdet i saltoppløsninger, olje, gass eller kombinasjoner av to eller flere derav.

Sulfider, spesielt oppløselige sulfider (H2S, HS", S<2>" eller kombinasjoner derav), blir ofte oppdaget i saltoppløsninger såsom f.eks. oljefeltsaltoppløsninger som en konsekvens av aktiviteten til sulfatreduserende bakterier (SRB), og gir alvorlige problemer for industrien pga. deres toksisitet, lukt, korroderende natur og potensiale for å plugge brønnhullet. Foreliggende behandlingsteknologier for å fjerne sulfid inkluderer fysikalsk/kjemiske fremgangsmåter såsom stripping med damp eller røykgass, luftoksidasjon og utfelling. Mikrobiell behandling kan imidlertid være et mer effektivt og kostnadseffektivt alternativ for å redusere sulfidnivået.

Mineraloljereservoarer har adskilte mikrobielle kolonier som inneholder en variasjon av fysiologiske bakterietyper. Gjærende bakterier, hydrokarbon-oksiderende, denitrifikerende, metanogene og SRB har alle blitt isolert fra reservoarsaltoppløsninger. SRB er av stor betydning for petroleumsindustrien pga. deres evne til å redusere sulfater til sulfider for derved å bidra på en ødeleggende måte til å plugge injeksjonsbrønner, korrosjon av utstyr og surgjøring av gass, olje eller begge. Omkostningene for oljeproduksjonen økes betydelig pga. utstyrssvikt, tilleggsutstyr som er nødvendig for å fjerne sulfid, behov for biocider.til å kontrollere mikrobiell vekst og ytterligere kjemikalier nødvendig for å fjerne eller hindre jernsulfidskall.

Sulfidproduksjonen avhenger generelt av et antall ernærings- og fysikalske faktorer som påvirker veksten av SRB i f.eks. oljereservoarer. Konsentrasjonene av utnyttbart karbon, sulfat, nitrogen og fosfor påvirker også veksten av SRB og sulfatreduksjonshastigheter.

Andre bakterier kan også spille en rolle ved korrosjon og reservoarsurgjøring. F.eks. har tallrike stammer av Shewenella putreficians blitt isolert fra oljefeltsaltoppløsninger og relaterte væsker som kan vokse anaerobt ved å redusere svoveloksyanioner andre enn sulfat til hydrogensulfid.

Tradisjonelt har oljeindustrien benyttet biocider, såsom f.eks. kvaternære ammoniumforbindelser, isotiazolonderivater, glutaraldehyd, formaldehyd, akrolein eller kombinasjonen av hvilken som helst to eller flere av disse til å kontrollere SRB. Suksessen med denne tilnærming er imidlertid begrenset pga. bakterienes tilbøyelighet til å danne biofilmer som er relativt impermeable for biocider. Biologiske tilnærminger for kontroll av SRB er blitt undersøkt som alternativer til fysikalsk/kjemisk behandling. Tilsetting av høye konsentrasjoner av nitrat til anrikingskulturer forbedret med sulfat og forskjellige elektrondonorer, er blitt rapportert å resultere i inhibisjon av biogensulfidproduksjon i lange tidsavsnitt.

Nitrat har også blitt brukt som en elektronakseptor for anaerob sulfidoksidering. Nitratavhengig sulfidoksidering ved endogene bakterier i vann assosiert med produksjon av olje, gass eller begge er blitt demonstrert i laboratoriestudier med stenkjerner såvel som i felttester, hvor sulfidnivåene falt 40 til 60% i saltoppløsning fra tre tilstøtende produksjonsbrønner 45 dager etter injeksjon av nitrat inn i formasjonen. Mesteparten av forskningen på biooksidasjon av sulfid i saltoppløsninger, gasstrømmer og råolje har fokusert på anvendelse av eksogene arter av Thiobacillus. I en feltdemonstrasjon for å helbrede surt produsert vann, oksiderte Thiobacillus denitrificans, stamme F, effektivt sulfid aerobt til sulfat, på tross av flere mangler ved systemet.

Å oksidere sulfider til sulfater synes ikke å være løsningen fordi sulfater kan igjen bli redusert av SRB til sulfider og derved skape problemene illustrert ovenfor. Derfor er det et stadig økende behov for å utvikle en bakteriekultur som kan oksidere et sulfid eller deler derav til elementært svovel og å utvikle en fremgangsmåte for hovedsakelig å oksidere et sulfid, eller hovedsakelig redusere sulfidinnholdet i en fluid såsom saltoppløsning, olje, gass eller kombinasjoner av to eller flere av disse. Utvikling av slike bakterielle kulturer eller fremgangsmåter eller begge vil også i stor grad bidra til bedre forståelse av anvendelser, begrensninger eller kombinasjoner derav i biobehandlinger av saltoppløsninger, olje, gass eller kombinasjoner av to eller flere av disse.

EP 0 218 958 A2 og US patent nr. 4,760,027 beskriver en fremgangsmåte til desulfurisering av gasser ved mikrobiologiske teknikker ved å bruke Thiobacillus denitrificans til å oksidere hydrogensulfid til sulfatforbindelser. WO 95/24960 beskriver en mikroorganisme som tilhører slekten Thiobacillus som degraderer hydrogensulfid til sulfat. US patent 5,366,891 beskriver anvendelse av mikroorganismer av slekten Thiobacillus til å konvertere metallsulfider til metallsulfat. US patent 5,236,677 angår en fremgangsmåte til å fjerne illeluktende svovelforbindelser, for eksempel hydrogensulfid, ved å bruke mikroorganismer i Thiobacillus familien. US 5,196,129 angår stabile, enkeltfasede oppløsninger av vann-i-olje mikroemulsjoner som inneholder mikroorganismer. US patent 4,968,622 angår degradering av svovelholdige forurensinger, for eksempel hydrogensulfid til sulfat. Brock, Madigan, Martinko, Parker: Biology of Microorganisms, syvende utgave, Prentice-Hall, 1994, ISBN 0-13-176660-0 beskriver flere bakterier, for eksempel svovelbakterier og forskjellige sykler, for eksempel redox sykler for nitrogen og svovel.

En hensikt med foreliggende oppfinnelse er derfor å tilveiebringe en bakteriell kultur eller en bakterie som er istand til hovedsakelig å oksidere et sulfid, eller hovedsakelig redusere sulfidinnholdet i en fluid såsom saltoppløsning, olje, gass eller kombinasjoner av to eller flere av disse. En annen hensikt med foreliggende. oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte til hovedsakelig å oksidere et sulfid eller hovedsakelig å redusere sulfidinnholdet i en fluid såsom saltoppløsning, olje, gass eller kombinasjoner av to eller flere av disse. Andre hensikter og trekk vil bli klart når oppfinnelsen blir mer fullstendig beskrevet nedenfor.

Disse hensikter er oppnådd med foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremgår av de vedlagte krav.

I henhold til den første utforming av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en bakteriekultur som er istand til hovedsakelig å oksidere sulfid eller hovedsakelig redusere sulfidinnholdet i en fluid.

I henhold til en annen utforming av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en prosess for hovedsakelig å oksidere et sulfid eller hovedsakelig redusere sulfidinnholdet i en fluid som omfatter å bringe fluidet i kontakt med en blanding som omfatter en bakteriekultur som er istand til å oksidere sulfid i en fluid.

Fig. 1 illustrerer sulfidoksidasjon ved Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472) i en filtrert saltoppløsning som inneholder eksogent tilsatt kaliumnitrat og natriumfosfat (monobasis). Fig. 2 viser sulfidoksidasjon ved Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472) i CSB/DTA medium. Fig. 3 illustrerer den synergistiske effekt som oppstår når Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472) kombineres med natriumnitrat og natriumfosfat (monobasis) i en produsert saltoppløsning ved sulfidoksidasjon.

Betegnelsen "sulfid" anvendt i denne oppfinnelsen er generisk referert til som, med mindre noe annet er angitt, uorganiske sulfider, organiske sulfider eller kombinasjoner av to eller flere derav som inneholder en gjentagende enhet av -S„- i sulfidmolekylet, hvor n er et tall fra 1 til 10, fortrinnsvis 1 til ca. 5, og mest fortrinnsvis 1 til 3. Sulfidforbindelsen kan være oppløselig, uoppløselig, hovedsakelig oppløselig eller hovedsakelig uoppløselig i vandig media, ikke-vandige media eller kombinasjoner derav. Oppløselige sulfider som beskrevet ovenfor kan være H2S, HS", S<2>" eller kombinasjoner av to eller flere av disse.

Eksempler på sulfid forbindelser som kan bli hovedsakelig oksidert eller fjernet inkluderer, men er ikke begrenset til, hydrogensulfid, dimetylsulfid, dimetyldisulfid, dietylsulfid, dietyldisulfid, natriurrisulfid, narriumhydrosulfid, kaliumhydrosulfid, kaliumsulfid, jernsulfid og alle kombinasjoner av hvilken som helst to eller flere derav.

I henhold til foreliggende oppfinnelse betegner "fluid" en væske, en gass eller kombinasjoner derav. Eksempler på fluider som er egnet til anvendelse i foreliggende oppfinnelse inkluderer, men er ikke begrenset til, saltoppløsninger, olje, gass eller kombinasjoner to eller flere derav. Betegnelsen "saltoppløsning" eller "saltoppløsninger" brukt i denne oppfinnelse er referert til som, med mindre noe annet er angitt, vann, en oppløsning, en suspensjon eller kombinasjoner av to eller flere derav. Generelt inneholder en oppløsning oppløselige stoffer såsom salter. Suspensjonen kan også inneholde oppløste, delvis oppløste eller uoppløste stoffer såsom salter. Eksempler på salter inkluderer, men er ikke begrenset til, metallsalter, såsom f.eks. natriumklorid, kaliumklorid, kalsiumklorid, kalsiumbromid, magnesiumklorid, magnesiumbromid, natriumdikarbonat, natriumsulfat, ammoniumklorid, natriumsulfid, natriumhydrosulfid, kaliumhydrosulfid, kaliumsulfid, jernsulfid og kombinasjoner av to eller flere derav. Generelt kan det totale saltinnholdet i en oppløsning eller suspensjon variere i stor grad fra f.eks. ca. 0,5 til så høyt som ca. 50 vekt%. Den for tiden foretrukkede saltoppløsning er en produsert saltoppløsning som noen ganger også refereres til som oljefeltsaltoppløsning, eller produsert vann, eller mineraloljesaltoppløsning eller reservoarsaltoppløsning og er en saltoppløsning produsert sammen med olje, gass eller begge to. En produsert saltoppløsning er generelt kontaminert med noe olje, og/eller gass.

I henhold til en første utforming av foreliggende oppfinnelse oppfatter en bakteriekultur, eller består essensielt av, eller består av sulfidoksiderende bakterier som er tilveiebragt som er istand til å oksidere sulfidforbindelse i en sulfidholdig fluid. Oksidasjonsproduktet av sulfid eller deler derav i foreliggende oppfinnelse omfatter generelt elementært svovel. Betegnelsen "deler" er brukt heri for å angir enhver brøkdel av sulfid. Bakterien er Campylobacter-lignende arter.

Bakterier som er kjent for å oksidere en sulfidforbindelse produserer generelt en sulfatforbindelse. Slike bakterier, f.eks. Thiobacilli, oksiderer generelt ikke en sulfidforbindelse til elementært svovel. Bakteriene beskrevet i denne søknad oksiderer imidlertid en sulfidforbindelse eller deler derav til dementert svovel, spesielt i blandede kulturer og eliminerer derved problemet med produksjon av sulfat som i sin tur reduseres av SRB til en sulfidforbindelse. Oksidering av sulfid til elementært svovel er virkelig overraskende.

Disse nye bakteriene ble isolert ved anriking av en produsert saltoppløsning oppnådd fra saltoppløsninger oppsamlet fra fritt vanns væskeutskillingstank i Coleville Unit, Coleville, Saskatchewan, Canada. Anrikingen ga to stammer av bakterier som er blitt gitt laboratoriebetegnelsene CVO og FWKO B, og gitt aksesjonsnummerene NRRL B-21472 og NRRL B-21473.

Designeringene NRRL B-21472 og NRRL B-21473 reflekterer det faktum at bakteriekulturene CVO og FWKO B er blitt deponert ved en offentlig deponeringsinstitusjon, United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604, USA. Deponeringen er blitt foretatt under Budapestavtalen og i henhold til praksis i United States Patent and Trademark Office slik at alle restriksjoner på tilgjengelighet av stammene til offentligheten vil ugjenkallelig fjernes ved at det gis patent på denne søknad i hvilken disse viktige, nye stammer er gjenstanden. Således vil stammene være tilgjengelig for offentligheten for utnyttelse i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Fremsatt i tabell I nedenfor er konsentrasjonen av forskjellige elementer brukt i anriket medium for å dyrke de nye stammene til Campylobacter sp.-stammer NRRL B-21472 og NRRL B-21473. Konsentrasjonen er i hvert eksempel uttrykt av elementet, skjønt det er anerkjent at alt eller del av hver kan være tilstede i form av et oppløselig ion, således hvor P er tilstede i en kombinert form, f.eks. som fosfat. Svovel er ønskelig anvendt i form av sulfat. Noen av de nødvendige metaller er fordelaktig tilsatt i form av et sulfat. Således er minimumkonsentrasjonene for svovel normalt overskredet. Fortrinnsvis er magnesium, kalsium, jern, zink, kobber, mangan og kobolt anvendt i form av et sulfat eller i form av en forbindelse som er konvertert in situ til et sulfat. Fortrinnsvis er molybden og bor anvendt i en oppløselig form såsom f.eks. henholdsvis molybdat og borat. Kalium er fortrinnsvis anvendt som et sulfat eller fosfat, eller i form av en forbindelse som er konvertert in situ til et sulfat eller fosfat. Fosfor er fortrinnsvis anvendt i form av fosforsyre eller i form av et fosfat (monobasis), eller fosfat (dibasis), f.eks. som et kalium- eller ammoniumsalt eller som en forbindelse som er konvertert in situ til et slikt salt. Mens nitrogen også er nødvendig for produksjonen av cellemasse, er det ikke fremsatt noe minimumsnivå ovenfor pga. at slike minimumsverdier lett kan bli avhengig av ønsket cellemasse og fordi en nitrogenholdig forbindelse er brukt som midler til å dyrke cellemasse.

Generelt kan enhver uorganisk eller organisk nitrogenholdig forbindelse anvendes som en nitrogenkilde. Den for tiden foretrakkede nitrogenkilde er en uorganisk nitrogenholdig forbindelse såsom f.eks. ammoniumsalter, metallnitratsalter eller kombinasjoner av hvilken som helst to eller flere derav. Eksempler på egnede nitrogenkilder inkluderer, men er ikke begrenset til, ammoniakk, ammoniumnitrat, ammoniumklorid, ammoniumsulfat, natriumnitrat, kaliumnitrat, magnesiumnitrat og kombinasjoner av hvilke som helst to eller flere derav. Enhver organisk forbindelse som er generelt anvendt for å understøtte vekst av mikroorganismer kan anvendes som kilder for karbon eller energi eller begge. Den for tiden foretrakkede karbon- eller energikilde er et acetat. Andre elementer såsom natrium, selen, jod, kan også være tilstede i vekstmediet.

Bakteriene i henhold til foreliggende oppfinnelse kan dyrkes i enhver egnet beholder i fravær av oksygen. Veksttémperaturen kan variere noe, men generelt i området fra ca. 10°C til ca. 40°C, fortrinnsvis ca. 10°C til ca. 35°C og mest fortrinnsvis 20°C til 35°C. Bakteriene kan dyrkes under et variasjon av trykk i området fra ca. 0,5 til ca. 15 atmosfærer (atm), fortrinnsvis ca. 0,5 til ca. 10 atmosfærer og mest fortrinnsvis 0,9 til 5 atmosfærer. pH-verdien til vekstmediet kan variere fra 5 til ca. 8,5, fortrinnsvis fra ca. 6 til ca. 8,5 og mest fortrinnsvis 7 til 8.

Fremgangsmåten med hensyn til oppfinnelsen kan utføres kontinuerlig. F.eks. det å bringe en fluid i kontakt med den bakterielle kultur kan gjøres ved å anvende kontinuerlige omrøringstankreaktorer, reaktorer sammenkoblet i serier, pluggjennomstrømningsreaktorer, pakkede kolonner eller tårn, eller andre kontinuerlige gjennomstrømninger som er klart innenfor området til en med kunnskap på feltet.

Stamme CVO er en Gram-negativ stav, 0,4 um i diamter og 0,5 til 2,0 (im i lengde, ikke-bevegelig under standard kulturbetingelser og ikke sporedannende. Den vokser anaerobt med ingen vekst observert under mikroaerofile betingelser. Stamme FWKO B er en Gram-negativ stav, 0,4 um i diameter og 2,0-4,0 um i lengde, bevegelig og ikke-sporedannende. Denne stamme er muligens mikroaerofil (pga. vekst i gradientmedia med sulfid og oksygen) og vokser like godt anaerobt. Disse to stammer CVO (NRRL B-21472) og FWKO B (NRRL B-21473) er blitt videre kjennetegnet som følger i tabell II. Tester for spesifisitet av 16S rRNA målrettede prober ble utført ved å bruke hele celler. Celler ble plassert i flekker på en nylonmembran i en konsentrasjon på 5 x 10<7>/spalte og lysert ved oppvarming (baking) i henhold til fremgangsmåten til Braun-Howland et al. (Braun-Howland, E.B., Vescio, P.A., og Nierzwici-Bauer, S.A., 1993, Use of a simplified Cell Blot Technique and 16S rRNA-Directed Probes for Identification of Common Environmental Isolates, Appl. Environ. Microbiol., 59:3219-3224). Blottene ble forvasket to ganger med 1 x SET-buffer (0,15 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,02 M Tris; avsluttende pH-verdi 7,8) som inneholder 0,1% SDS, hybridisert over natten med radiomerket oligonukleotidprobe, vasket flere ganger med SET-buffer som inneholder 0,1 % SDS, og visualisert ved autoradiografi. Celler fra nært beslektede slekter (Thiobacillus denitrificans, Thiomicrospira denitrificans, Sulfurospirillum deleyianum, Arcobacter nitrofigilis, Campylobacter sp. DSM806), såvel som andre saltoppløsningsisolater ble brukt som negative kontroller. I tillegg ble blottene probet med en generell eubakteriell probe (EUB) som en positiv kontroll (se Braun-Howland et al; ovenfor).

En av probene testet reagerte spesifikt med stamme CVO og celler oppnådd fra en anrikning av produksjonssaltoppløsning (designert 59-20). Spesifisiteten til proben ble demonstrert ved mangel på hybridisering til andre lignende arter og isolater. Hybridisering av proben til cellene fra produksjonssaltoppløsningen anga nærvær av lignende bakterier i denne prøve. Den generelle eubakterielle probe, EUB, reagerte med alle prøvene som ventet.

Den andre Campylobacter-lignende art, designert FWKO B (NRRL B-21473), som var lik men forskjellig fra stamme CVO som bestemt ved kromosomale hybridiseringsstudier ble også isolert og renset.

På basis av informasjonen diskutert og demonstrert ovenfor er begge stammene CVO og FWKO B ment å være stammer av Campylobacter species, og er referert til som Campylobacter-lignende arter i denne søknad.

Med hensyn til en andre utforming av foreliggende oppfinnelse, en fremgangsmåte som kan anvendes i applikasjoner såsom oksidering av et sulfid i en fluid såsom saltoppløsning, olje eller gass er tilveiebragt. Fremgangsmåten omfatter eller består essensielt av, eller består av, å bringe en fluid i kontakt med en bakteriekultur som omfatter eller består essensielt av, eller består av, en bakterie som er istand til å oksidere sulfid, som er en Campylobacter species. Området og andre beskrivelser av bakteriekulturen og fluidet er det samme som de beskrevet i den første utforming av oppfinnelsen.

Å bringe fluidet i kontakt med bakteriekulturen kan utføres med hvilket som helst middel kjent for den med kunnskap på området. F.eks. kan bakteriekulturen som inneholder de nødvendige veks tel emen ter tilsettes til en fluid i en tilstrekkelig tidsperiode til hovedsakelig å redusere en sulfidforbindelse. Deretter kan bakteriekulturen eller brukt vekstmedium adskilles fra fluidet. Fluidet som har redusert fluidinnhold kan deretter anvendes i et utvalg av applikasjoner. Fordi vekst av en bakterie og adskillelse av en fluid fra bakteriell cellemasse og brukt. vekstmedium er vel kjent for en med kunnskap på området, er denne beskrivelse unngått her for korthets skyld.

I noen anvendelser, såsom f.eks. økt oljegjenvinning som involverer injeksjon'av en fluid såsom en saltoppløsning i en undergrunnsformasjon, behøver ikke bakteriekulturen og brukt medium å separeres fra fluidet. Bakteriekulturen i en saltoppløsning kan injiseres i en formasjon. Formasjonstypen er generelt ikke viktig og injeksjonen kan utføres ved ethvert middel kjent for den med kunnskap på området, såsom f.eks. pumping.

Alternativt, kan en fluid såsom sulfidholdig gass tilsettes til en bakteriekultur som inneholder vekstmediet. Tilsetting av gassfluid til et vandig medium kan utføres ved ethvert middel kjent for en med kunnskap på området såsom f.eks. å boble gassfluidet inn eller gjennom det vandige medium.

Tiden nødvendig for kontakten mellom et fluid med en bakteriell kultur beskrevet i en andre utforming av foreliggende oppfinnelse kan være ethvert tidsavsnitt så lenge som det er tilstrekkelig til å utvirke oksidasjon av et sulfid i fluidet. Nødvendig tid kan også være avhengig av konsentrasjoner av både sulfid og bakterielle celler i fluidet og kan være så kort som ca. 30 minutter til så lenge som ca. 1 uke. F.eks., hvis konsentrasjonen av inokulum er IO<7> celler/ml og sulfidkonsentrasjonen i fluidet er ca. 5 mM, kan det ta ca. 2 til ca. 20 timer å hovedsakelig oksidere sulfidet.

De følgende eksempler er tilveiebragt for å illustrere foreliggende oppfinnelse og er ikke ment uten grunn å begrense området for foreliggende oppfinnelse. Veksttemperaturen var der hvor ikke annet er angitt 30°C.

EKSEMPEL I

Dette eksempel demonstrerer biologisk mediert sulfidoksidasjon ved å bruke anrikede kulturer av saltoppløsning oppsamlet ved Coleville Unit, Saskatchewan.

Oljereservoirsaltoppløsning med lav salinitet (0,71% totalt oppløste faststoffer) ble oppsamlet i sterile flasker under strengt anaerobe betingelser, fra en sandstensformasjon i Saskatchewan av Phillips Petroleum Company. Salt-oppløsningen ble oppsamlet fra en olje/vann separatortank på et punkt som var før reinjeksjon inn i i reservoiret (heretter referert til som injeksjonssaltoppløsning). Preparering av alle media og kulturer inkludert inkuberinger ble utført under anaerobe betingelser. De viktigste ioner tilstede i saltoppløsningen var natrium (0,29%), klorid (0,41%), bikarbonat (0,19%), sulfat (0,026%) og ammoniakk (0,001%) og pH-verdien var 7,5. Saltoppløsningen inneholdt 3,3 mM oppløselig sulfid som ble antatt å være dannet biologisk pga. den moderate reservoirtemperatur (30-35°C). Sulfid ble bestemt kolometrisk ved å bruke en metylenblåttmetode. Se også Fogo, L.K. og Popowski, M.; Spectrophotometric Determination of Hydrogen Sulfide, Anal. Biochem. 21:732-734 (1949). Fordi fremgangsmåten er vel kjent for en med kunnskap på området, er beskrivelsen utelatt heri.

Det totale antall bakterier tilstede ble anslått til 0,5-1,0 x 10<7> celler/ml ved direkte telling under anvendelse av akridinorange. Fermenterende, denitrifiserende, sulfatreduserende og sporedannende bakterier var alle tilstede i saltoppløsningen som vist ved vekst på anrikingskulturer og på agarplater. SRB representerte tilnærmet 1% av den mikrobielle populasjon på dette sted eller 10<4->10<5>/ml ved å bruke et laktatmedium formulert av American Petroleum Institute (API). Assayene ble satt opp i triplikat som brukt i "mest sannsynlige tall" (MPN)-assay. Anslag av tall ble for enkelthets skyld imidlertid gjort fra rådata heller enn å utføre en MPN-beregning.

Det ble funnet at sulfidoksidasjon fant lett sted når nitrat og fosfat ble satt til saltoppløsningsanrikingskulturer. F.eks. etter tilsetting av 5 mM KNO3 og 100 uM KH2PO4, ble sulfidnivået redusert fra 3,3 mM til et ikke-detekterbart nivå (< 0,1 mM) på 48 timer ved 30°C. I kontrast var det ingen forandring i kontrollmediet som ikke inneholdt nitratet. Med tilsatt fosfat og nitrat var det en 10-ganger økning i celletall ved direkte telling sammenlignet med kontroller, noe som anga at vekst foregikk. Lignende hastigheter for sulfidoksidasjon ved å bruke saltoppløsninger fra tre produksjonsbrønner ble også observert og antyder at sulfidoksiderende bakterier er fordelt gjennom formasjonen.

Det ble også funnet at økende nivåer av nitratstimulért sulfidoksidasjon, opptil 2,5 mM, på hvilket punkt sulfidnivået ble redusert til ikke-detekterbart. Disse resultatene demonstrerer at sulfidoksidasjon var nitratavhengig.

Analyser av brukte anrikingskulturer beskrevet ovenfor for sulfat, sulfitt og total oppløselig svovel anga at et oppløselig svoveloksidasjonsprodukt såsom sulfat ikke ble akkumulert. Under oksidasjonsprosessen kom imidlertid et gulhvitt bunnfall tilsyne i anrikingsflaskene. Analyse av dette uoppløselige materiale ved røntgendifraksjon og elektrondispersjonspektroskopi anga at det var en blanding av element ert svovel og kalsitt. Nitratreduksjonen resultert i dannelse av nitrit og nitrogengass. Det var ingen netto økning i ammoniakk.

EKSEMPEL II

Dette eksempel illustrerer opptelling og identifikasjon av sulfidoksiderende bakterier. Dette eksempel demonstrerer også oksidasjon av sulfid i saltopp-løsninger og syntetiske media ved å bruke bakteriene i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Nitratreduserende sulfidoksiderende bakterier ble opptelt med MPN, som beskrevet 1 eksempel I, ved å bruke oksidasjon av redoksindikatoren resazurin som en vekstindikator. Bruk av indikatoren resazurin er en fremgangsmåte som er vel kjent for en med kunnskap på området. Tilnærmet 10<4> sulfatoksiderende bakterier/ml var tilstede i prøvene fra injeksjonssaltoppløsningen og prøvene fra tre produserende brønner. Plating av de anrikede kulturer fra injeksjonssaltoppløsning på 295 agar medium (se fotnote, Tabell II) resulterte i rensing av flere kolonityper av bakterier. En av de oppnådde isolatene, CVO, (NRRL B-21472), var en Gram-negativ stav, istand til å oksidere sulfid når den ble inokulert i filtersterilisert saltoppløsning supplementert med nitrat og fosfat (se fig. 1). Filtersterilisert saltoppløsning var Coleville saltoppløsning oppsamlet ved fritt-vann-utskylling og filtrert gjennom et 0,2 um celluloseacetatfilter for å fjerne bakterielle celler. Inokulasjon ble gjort med 2 ml av en kultur som inneholdt ca. 10<7> celler pr. ml.

Fig. 1 viser oksidasjon av sulfid av stamme CVO i filtrert saltoppløsning supplementert med 5 mM KNO3 og 100 uM natriumfosfat (NaH2P04). Uten nærvær av CVO-celler (-CVO, fig. 1), var det liten eller ingen sulfidoksidasjon. I nærvær av cellene av stamme CVO (+CVO, fig. 1), skjedde sulfidoksidasjon imidlertid hurtig. Lignende resultater ble oppnådd når syntetisk medium CSB/DTA ble brukt istedenfor filtrert saltoppløsning (fig. 2). Med i esamm en setningen til CSB/DTA er vist i tabell III. Resultatene vist i fig. I og fig. 2 viser at bakteriene i henhold til foreliggende oppfinnelse katalyserte oksidasjonen av sulfid inn i enten oljefeltsaltoppløsninger eller i syntetiske media.

Fig. 3 illustrerer økning av sulfidoksidasjon ved å tilsette CVO-celler til naturlig produsert saltoppløsning. Kjøringen ble utført som følger. Anrikinger med en ufiltrert produksjon av saltoppløsning som har sammensetningen som vist i CSB basis (første fem linjer i tabell III), som inneholder 4,4 mM oppløselig sulfid ble fremstilt ved å tilsette 50 ml saltoppløsning, 5 mM KN03 og 100 uM NaH2P04 til serumflasker. I et tilfelle ble saltoppløsningen supplementert med 2 ml (ca. 10 celler/ml) av en kultur av stamme CVO som var dyrket natten over. Tilsetting av stammen CVO reduserte forsinkelsestiden betydelig og reduserte den tid som var nødvendig for fullstendig oksidasjon av sulfidet fra mer enn ca. 34 timer til mindre enn ca. 12 timer.

EKSEMPEL III

Dette eksempel illustrerer sulfidoksidasjonshastighet til Campylobacter-lignende arter i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Kjøringene ble utført med fritt-vanns væskeutskillingstanker (FWKO) saltopp-løsning som beskrevet i eksempel II. Saltoppløsningen, satt opp i triplikat, ble filtersterilisert og supplementert med 5 mM KNO3 og 100 uM NaH2P04 (stamløsning av disse ble sterilisert separat). Hver kjøring vist i tabell IV nedenfor ble inokulert med kulturer som inneholder ca. 10<7> celler/ml som notert i tabell IV. Sulfid ble målt som beskrevet i eksempel I.

Resultatene vist i tabell IV angir at sulfidnivåene i filtrert saltoppløsningskontroll ble hovedsakelig ikke forandret i løpet av 14 timer. Resultatene viser også at hastigheter og forsinkelsestid for sulfidoksidasjon var lik for begge stammer av CVO og FWKO B og ufiltrert saltoppløsningsanrikelse (siste kolonne, tabell IV).

Etter 24 timers inkubasjon ble celletellinger for kulturene til disse fire kjøringene vist i tabell IV bestemt ved direkte mikroskopisk telling og bruk av akridin orange. Resultatene vist i tabell IV ovenfor angir at det endelige celleantall, unntagen for den filtrerte saltoppløsningskontroll, var tilnærmet de samme.

Resultatene vist i de ovenstående eksempler demonstrerer klart at den foreliggende oppfinnelse er godt tilpasset til å utføre de hensikter og nå de mål og har de fordeler som er nevnt, såvel som de som ligger innebygget deri.

Claims (10)

1. Bakteriekultur, karakterisert ved at den omfatter Campylobacter arter som er i stand til å oksidere et sulfid eller deler derav til elementært svovel i en fluid valgt fra gruppen som består av saltoppløsninger, olje, gass og kombinasjoner av hvilke som helst to eller flere derav, hvori nevnte Campylobacter art er valgt fra gruppen som består av Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472), Campylobacter sp. FWKO B (NRRL B-21473), og kombinasjoner derav.

2. Bakteriekultur som angitt i krav 1, karakterisert ved at den nevnte Campylobacter art er Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472).

3. Bakteriekultur som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte bakteriekultur er en biologisk ren kultur av stammen Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472), eller en biologisk ren kultur av stammen Campylobacter sp. FWKO B (NRRL B-21473).

4. Bakteriekultur, som angitt i ethvert av kravene 1-3, karakterisert ved at den ytterligere er i stand til å redusere nitrat.

5. Fremgangsmåte for å oksidere en sulfidforbindelse i en fluid, karakterisert ved at den omfatter å bringe nevnte fluid i kontakt med en bakteriekultur som omfatter en Campylobacter art, som er i stand til å oksidere et sulfid eller deler derav til elementært svovel, hvori nevnte fluid er valgt fra saltoppløsninger, olje, gass og kombinasjoner av hvilke som helst to eller flere derav, og hvori nevnte Campylobacter art er valgt fra gruppen som består av Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472), Campylobacter sp. FWKO B (NRRL B-21473) og kombinasjoner derav.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at.nevnte saltoppløsning er en produsert saltopp-løsning.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 5 eller 6, karakterisert ved at nevnte Campylobacter art er Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472).

8. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 5-7, karakterisert ved at nevnte bakteriekultur ytterligere er i stand til å redusere nitrat, og hvori nevnte fluid ytterligere omfatter et nitrat.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at nevnte fluid er en produsert saltoppløsning som omfatter nitrat og hvori nevnte Campylobacter arter er Campylobacter sp. CVO (NRRL B-21472).

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at nevnte sulfid er hydrogensulfid.