DK175623B1 - Fremgangsmåde til mikrobiel nedbrydning af trichlorethylen samt anvendelse af fremgangsmåden til nedbrydning af trichlorethylen i kemisk affald - Google Patents

Description

i DK 175623 B1

Den foreliggende opfindelse angår en forbedret fremgangsmåde til mikrobiel nedbrydning af trichlor-ethylen ved hjælp genetisk manipulerede mikroorganismer indeholdende toluen-monoxygenase-generne fra Pseudomo-5 nas mendocIna KR-l (PmKRi). Det har nu uventet vist sig, at PmKRl-toluen-monooxygenase-enzymsystemet er nyttigt til nedbrydning af trichlorethylen. Endvidere vedrører opfindelsen en anvendelse af fremgangsmåden til nedbrydning af trichlorethylen i kemisk affald.

Ifølge ét aspekt angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til mikrobiel nedbrydning af trichlorethylen, ved hvilken man behandler trichlorethylen med en mikroorganisme-værtscelle indeholdende et rekombinant plasmid, idet det rekombinante plasmid 15 indeholder PmKRi-toluen-monooxygenase-generne. Mikroorganisme-værtscellen indeholdende det rekombinante plasmid må behandles med en inducer for toluen-mono-oxygenase-generne for at kunne nedbryde trichlorethylen. Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes 20 der en ny fremgangsmåde til nedbrydning af trichlorethylen ved tilvejebringelse af genetisk manipulerede mikroorganismer, der under visse celledyrknings- og assaybetingelser udviser toluen-monooxygenase-enzym-aktivitetsniveauer, som overstiger de niveauer, der 25 kommer til udtryk i PmKRi-celler af den vilde type. Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes der derfor et mere effektivt middel til at udføre visse bionedbrydninger, der er afhængige af dette enzymsystem, ...specielt nedbrydningen af trichlorethylen. Opfindelsen 30 er anvendelig til nedbrydning af trichlorethylen, som det kan være til stede som et forurerende stof eller en kontaminant i åbne eller lukkede miljøsystemer.

• Trichlorethylen (TCE) er et i vid udstrækning anvendt industrielt opløsningsmiddel, der hyppigt

I DK 175623 B1 I

I 2 I

I findes som en kontaminant i grundvand, drikkevand og I

I spildevand. Grundvand indeholder den største beholdning I

I af forkert behandlede farlige spildprodukter. Mere end I

I 200 organiske og uorganiske kemiske stoffer er blevet I

I 5 identificeret i forskellige grundvandsforsyninger, men I

I af alle sådanne Identificerede kontaminerende kemiske I

I stoffer har EPA imidlertid identificeret TCE som den I

I hyppigst iagttagne kemiske kontaminant på National I

I Priority List (NPL) steder i USA. I

I 10 Størrelsen af problemet med grundvandskontamine- I

I ring illustreres yderligere af den omstændighed, at I

I grundvandet leverer 25% af alt vand, der anvendes i I

I USA. Beregninger foretaget af The Conservation Founda- I

I tion ("Groundwater - Saving the Unseen Resource", no- I

I 15 vember 1985, på side 5) viser, at i USA er grundvandet I

I kilden til: (1) 35% af alt kommunevand, (2) 50% af alt I

I drikkevand (97% i landområder), (3) 40% af alt vand an- I

I vendt til kunstig vanding i landbruget, og (4) 26% af I

I alt vand anvendt af industrien (bortset fra el-kraft- I

I 20 værker). Der kan således ikke lægges for megen vægt på I

I "betydningen af at udvikle miljømæssigt effektive meto- I

I der til nedbrydning af TCE til uskadelige materialer. I

I Udvikling af genetisk manipulerede mikroorganis- I

I mer, der har overlegne egenskaber med hensyn til at I

I 25 nedbryde specifikke kemiske kontaminanter, såsom TCE, I

I til uskadelige materialer, er én betydningsfuld strå- I

I Ttegi i udviklingen af omkostningseffektive og miljø- I

I mæssigt sunde metoder til rensning for farligt kemisk I

I affald. Udviklingen og anvendelsen af mikroorganisme- I

I 30 værtsceller med rekombinante plasmider indeholdende I

I . PmKRl-toluen-monooxygenase-gener ved den foreliggende I

I opfindelse er den første fremgangsmåde, ved hvilken der I

I anvendes sådanne genetisk manipulerede mikroorganismer, I

3 DK 175623 B1 der er nyttige til rensning af TCE-holdigt kemisk affald. udviklingen og anvendelsen af mikroorganismeværtsceller indeholdende de heri beskrevne rekombinante plasmider er særlig fordelagtig, da specifikke og vel-5 karakteriserede gensegmenter, der koder for PmKRl-to-luen-monooxygenase-gener, er blevet klonet og anvendt til konstruktion af de rekombinante plasmider. Det er disse gensegmenter, anbragt under regulering af visse promotorer, der specifikt overfører overlegne egenska-10 ber med hensyn til at nedbryde TCE til visse mikroorganisme-værtsceller som anvendt ved den foreliggende opfindelse. Dette system muliggør på let måde manipulering af de isolerede genér ved kloning i flere forskellige kloningsvektorer og ekspression via mange forskel-15 lige promotorsysterner, således at man kan forøge og optimere den metaboliske aktivitet til nedbrydning af TCE. Desuden muliggør dette system på let måde undersø-llgelse og manipulering af de specifikke enzymer og proteiner, der er involveret i TCE-nedbrydning. Som følge 20 af fremstillingen af DNA-segmenter indeholdende PmKRl-toluen-monooxygenasegener, inkorporeringen af sådanne DNA-segmenter i passende plasmidvektorer og transformeringen af mikroorganisme-værtsceller bliver PmKRl-toluen-monooxygenase-enzymprodukter eksprimeret og kan 25 isoleres. Der kan således benyttes en anderledes fremgangsmåde til nedbrydning af TCE under anvendelse af isolerede og rensede enzymprodukter fremfor de transformerede mikroorganisme-værtsceller. Det tages med i betragtning, at PmKRltoluen-monooxygenase-30 enzymprodukterne kan anvendes direkte til nedbrydning af TCE. Sådanne enzymprodukter kan frigives i eller overføres til steder med TCE-holdigt kemisk affald og kan være nyttige til forureningskontrol, f.eks. ved be-

DK 175623 B1 I

handling af industrielt spildevand, der er forurenet

med TCE. I

Mange forskellige fremgangsmåder er blevet fore- I

slået til at gøre giftigt affald uskadeligt. Blandt I

5 disse er forbrænding, kemisk omdannelse og mikrobiolo- I

gisk nedbrydning. Da mikrobiologisk nedbrydning af I

toksisk affald ikke indebærer anvendelse af kemiske I

reagenser, der selv kan være giftige, og ikke medfører I

dannelse af store mængder giftig røg, som der dannes I

10 ved forbrænding af giftigt affald, er det blevet en fo- I

retrukken fremgangsmåde til fjernelse af giftigt af- I

fald. I

De fleste mikrobiologiske nedbrydninger af gif-

. tige materialer er baseret på opdagelsen af en særlig I

15 mikroorganisme, som metaboliserer det giftige materia- I

le, og omdanner det til uskadelige metaboliske produk- I

ter, idet den i tilfælde af giftige organiske forbin- I

delser sædvanligvis omdanner sådanne forbindelser til I

carbondioxid, vand og salte. Det at finde mikroorganis- I

20 mer, især genetisk manipulerede mikroorganismer, som på I

effektiv og sikker måde kan omdanne giftigt affald til I

t.uskadelige metaboliske produkter, er en i høj grad ind- I

viklet procedure, som indebærer mange vanskelige trin I

og kræver et betydeligt tidsforbrug. De fleste hidtidi- I

25 ge bestræbelser har koncentreret sig om at finde mi- I

kroorganismer, der hører hjemme i og isoleres fra kon- I

tamineret jordbund eller vand. I

Én metode er at opnå en jord- eller vandprøve og

berige prøven med hensyn til en blanding af mikroorga- I

30 nismer eller fra en blanding at isolere en renset kul- I

tur af en mikroorganisme med evne til at nedbryde en I

eller flere giftige forbindelser. Flere undersøgelser I

med anvendelse af blandinger af mikroorganismer inde- 5 DK 175623 B1 holdende methan-udnyttende bakterier opnået ved methan-berigning af en jordprøve har vist, at sådanne blandinger har evne til at nedbryde TCE og andre chlorerede ethener. Fogel et al., Appl. Environ. Microbiol. 51: 5 720-724 (1986); Wilson og Wilson, Appl. Environ, Microbiol. £9: 242-243 (1985). Selvom disse methan-udnyttende kulturer indeholder mere end én type bakterier, antages det, at methanotroferne er ansvarlige for nedbrydningen af TCE. Fogel et al. (supra) rapporterer en 10 hastighed af TCE-nedbrydning på 0,03 nanomol TCE pr. minut pr. mg celleprotein.

Ved andre undersøgelser er der ikke anvendt blandinger af mikroorganismer, men rensede stammer isoleret fra jordbund eller vand. Én sådan metode er be-skrevet i US patentskrift nr. 4.493.895, hvori der er opstillet krav på en fremgangsmåde til mikrobiel nedbrydning af kontaminerende, halogenerede, aromatiske forbindelser til udskadelige materialer. Denne fremgangsmåde består i de trin, at man (1) udtager en mate-20 rialeprøve fra det sted, der er kontamineret med ubehagelige kemiske stoffer, (2) opkoncentrerer de mikroorganismer, der findes levende i prøven, (3) adskiller de stammer af mikroorganismer, der kan have forskellige metabolismer for de forskellige kemiske stoffer i prø-25 ven fj-Q. stedet, fra hinanden, (4) renser de stammer, der er i stand til bionedbrydning af de kemiske stoffer, der skal fjernes, (5) overfører stammen til stedet med kontaminanterne, der skal fjernes, og (6) kontrollerer fjernelsen af kontaminanterne på anvendelsesste-30 det. I US patentskrift nr. 4.477.570 er der beskrevet og opstillet krav på^e mikroorganismer, der anvendes ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåden ifølge US pa-'.tentskrift nr. 4.493.895.

I DK 175623 B1 I

I I

I En anden fremgangsmåde er beskrevet i US patent- I

I skrift nr. 4.664.805, hvori der er opstillet krav på en I

I fremgangsmåde til dekontaminering af miljøer med halo- I

I generede organiske forbindelser, ved hvilken man anven- I

I 5 der (1) mikroorganismer, der hører hjemme i miljøet, I

I som skal dekontamineres, og som kan metabolisere, men I

I ikke kan vokse på kontaminanten, (2) et inoculum af I

I mikroorganismer, der ikke hører hjemme i miljøet, og I

I som metaboliserer kontaminanten hurtigere end de hjem- I

I 10 mehørende mikroorganismer, men ikke kan vokse på den, I

I og (3) en ikke-toksisk analog til kontaminanten, hvil- I

I ken analog tjener som substrat for væksten af de hjem- I

I mehørende og ikke-hjemmehørende mikroorganismer. Man I

I sætter sin lid til mikroorganismer, der allerede er til I

I 15 stede i miljøet, såkaldte hjemmehørende mikroorganis- I

I mer, med hensyn til gennemførelsen af nedbrydningen. I

I Nedbrydningen forøges af de ikke-hjemmehørende mikro- I

I v organismer. I

I 2C En yderligere fremgangsmåde, der er beskrevet i I

I US patentskrift nr. 4.511.657, involverer en proces til I

I behandling af afløbsvand fra opfyldninger af kemisk I

I affald med aktiveret slam, der indeholder bakterier, I

I som er i stand til at metabolisere ubehagelige organi- I

I 25 ske stoffer, der er til stede i af løbs vandet. Alle de I

I ovenfor beskrevne fremgangsmåder indebærer anvendelsen I

I af mikroorganismer, som er hjemmehørende i eller isole- I

I ret fra kontamineret jordbund eller afløbsvand. De ned- I

I brydningsdygtige enzymer, der er nødvendige for mikro- I

I 30 organismer for at nedbryde halogenerede organiske for- I

I bindeiser, kan være indkodet i gener båret af plasmi- I

I der. Et enkelt plasmid indeholder almindeligvis gener, I

I der koder for enzymer til en enkelt nedbrydningreak- I

I tionssvej. Plasmider er blevet anvendt ved fremgangsmå- I

7 DK 175623 B1 der til bionedbrydning af visse chlorerede aromatiske organiske forbindelser, som belyst i de ovennævnte US patentskrifter nr. 4.535.061 (der beskriver plasmid-understøttede formeringsprocedurer til frembringelse af 5 rene og blandede kulturer af mikroorganismer, der er i stand til at dissimilere miljømæssigt persistente kemiske forbindelser) og US patentskrift nr. 4.664.805.

Ved anvendelse af plasmider fra mikroorganismer, der nedbryder halogenerede aromatiske organiske forbin-10 delser (A.T.C.C. 31939-31945) (hvilke mikroorganismer er beskrevet i US patentskrifterne nr. 4.477.570 og 4.493.895) er der i beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 8511008.1 beskrevet fremstillingen af hybrid-plasmider og transkonjugater, der indeholder 15 disse plasmider. I beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 8511008.1 er der beskrevet en fremgangsmåde til fremstilling af en mikroorganisme med specificitet for bionedbrydelige halogenerede organiske forbindelser, hvilken fremgangsmåde består i de trin, at 20 man (1) hver for sig dyrker og vedligeholder (a) en bredspektret mikroorganisme valgt fra gruppen ATCC 31945, ATCC 31941, ATCC 31942, ATCC 31940, ATCC 31943, ATCC 31944, ATCC 31939 og mutanter heraf og (b) en vektor med bredt værtsområde, (2) hver for sig isolerer 25 plasmid-DNA'et fra (a) og (b) ovenfor, (3) hver for sig renser plasmid-DNA'et fra (a) og (b) ovenfor, (4) hver for sig underkaster det rensede DNA fra (a) og (b) ovenfor enzymatisk restriktion, (5) kombinerer produkterne fra trin (4) og underkaster de kombinerede pro-30 dukter enzymatisk ligering, (6) transformerer produkterne fra ligeringen ind i en modtagelig mikroorganisme, såsom coli eller arter af Pseudomonas, (7) udvælger de transformanter, der har det ønskede plasmid-

I DK 175623 B1 I

I I

I DNA indføjet i vektoren, (8) konjugerer det udvalgte I

I plasmid-DNA ind i en modtagelig vært valgt blandt I

I pseudomonas, Klebsielle, Rhizoblum, Aqrobacterlum og I

I Escherichia ved hjælp af et hjælper-plasmid, og (9) ud- I

I 5 vælger de transkonjuganter, der har det ønskede plas- I

I mid-DNA. I

I Elleve transkonjugater blev åbenbaret, og uven- I

I tet viste et flertal af transkonjugaterne sig som deres I

I eneste carbohkilde at udnytte visse alifatiske haloge- I

I 10 nerede organiske forbindelser, specielt tetrachlor- I

I ethylen, ethylendichlorid, methylchloroform og TCE, I

I medens stam-mikroorganismerne A.T.C.C. 31939-31945 kun

I udnyttede et bredt spektrum af aromatiske organiske I

I forbindelser som beskrevet i US patentskrift nr.

I 15 4.493.895. Den eneste prøve for udnyttelse af disse I

I alifatiske halogenerede organiske forbindelser var I

I vækst på medium indeholdende forbindelsen, hvor væksten I

I var en halv gange større end middelvæksten. Bortset fra I

I denne vækstprøve er transkonjugaterne overhovedet ikke I

I 20 karakteriserede. Specielt er der intet åbenbaret om om- I

I fanget af nedbrydning af disse alifatiske halogenerede I

I organiske forbindelser ved hjælp af disse mikroorganis- I

I mer eller om arten og toksiciteten af de metaboliske I

I produkter. Der bringes ingen lære om eller beskrivelse I

I 25 af hvilke gener, gensegmenter, enzymer, proteiner eller I ^ I .proteinprodukter, der er involveret i transkonjugater- I nes evne til at metabolisere sådanne alifatiske halo-

I generede organiske forbindelser, herunder TCE. Nærmere I

I ·. angivet er den i beskrivelsen til europæisk patentan- I

I 30. søgning nr. 8511008.1 bragte lære begrænset til udnyt-

I

I ' teisen af alifatiske halogenerede organiske forbindel-

I ser, herunder TCE, hvad angår plasmider, der er ud- I

I valgt fra gruppen af mikroorganismer betegnet som

I A.T.C.C. 31939-31945. I

9 DK 175623 B1

Med hensyn til specielt TCE-metabolisme er delvis nedbrydning af TCE ved hjælp af anaerobe organismer blevet rapporteret, men metabolitter fra nedbrydningsprocessen indbefatter vinylchlorid og dichlorethylen, 5 der ligeledes er skadelige som grundvandskontaminanter. Kleopfer et al., Environ. Sci. Technol., 19:277-280 (1985); Parsons et al., J. Am. water Works Assoc., 76: 56-59 (1984); Vogel 6 McCarty, Appl. Environ. Microbiol. , 49:1080-1083 (1985). I en nylig rapport er der 10 beskrevet et naturligt forekommende bakterieisolat, som er i stand til at nedbryde TCE under anaerobe betingelser. Nelson et al., Appl. Environ. Microbiol., 52:383-384 (1986); Nelson et al., Appl. Environ. Microbiol., 53^:949-954 (1986). Mikroorganismen betegnet stamme G4 15 kræver phenol, toluen, o-cresol eller m-cresol til TCE-nedbrydning. Som den er karakteriseret, gælder det, at stamme G4 (1) ikke udnytter TOL-reaktionsvejen til toluennedbrydning, (2) ikke synes at have enzymet toluen-dioxygenase, det første enzym ved TOD-reaktions-20 vejen til toluennedbrydning, og (3) ikke udnytter tmo-reaktionsvejen til toluennedbrydning. Nelson et al. bringer ikke nogen lære om eller beskriver, hvilke gener, gensegmenter, enzymer, proteiner eller proteinprodukter, der er involveret i stamme G4's evne til at 25 nedbryde TCE, og heller ikke om de involverede gener er plasmid-indkodede eller chromosomalt indkodede. Genetisk manipulering af stammen G4 er ikke blevet rapporteret.

Senere har Nelson et al., Appl. Environ. Mi- •an crobiol., _5i:604-606 (1988), afprøvet TCE-nedbrydnings-w evnen hos seks mikroorganismestammer, der er i stand til at nedbryde naphthalen, biphenyl, phenol og toluen.

Kun to af de afprøvede stammer, Psueodmonas putida PpFl

DK 175623 B1 I

(PpFl) og Pseudomonas putida B5 (B5), nedbrød TCE.

PpFl og B5 er toluen-nedbrydende stammer, men en tredje I

toluen-nedbrydende stamme Pseudomonas putIda mt-2 (Pp I

mt-2) nedbrød ikke TCE. Det ser således ud til, at ikke I

5 alle toluen-nedbrydende stammer er i stand til at ned- I

bryde TCE. I

Pp mt-2, som Nelson et al., supra, fandt ikke I

kunne nedbryde TCE, indeholder pWWO-plasmidet, hvilket I

plasmid koder for enzymer ved toluen-nedbrydningsreak- I

10 tionsvejen, der betegnes TOL. PpFl, som Nelson et al.,

supra, fandt kunne nedbryde TCE, vides at indeholde en- I

zymer for toluen-nedbrydningsreaktionsvejen, der beteg- nes som TOD. Wackett og Gibson, Appl. Environ. Micro-

biol., 54:1703-1708 (1988), har også fornylig vist, I

15 at PpFl-celler har evne til at nedbryde TCE. Under de- I

res dyrknings- og assaybetingelser fandt wackett og H

Gibson, supra, at ca. 50% til 60% af tilført TCE (20 I

PM) blev nedbrudt. I modsætning hertil kunne der ved I

høje TCE-koncentrationer (320 μΜ) ikke påvises nogen I

20 TCE-nedbrydning. Den højeste TCE-nedbrydningshastighed, I

som de observerede, var 1,8 nanomol pr. minut pr. mg I

celleprotein. I

Generne for TOD-reaktionsvejen i PpFl er chromo- I

somalt indkodede i modsætning til de plasmid-indkodede

25 TOL-reaktionsvej-gener i Pp mt-2. Det er således ikke I

muligt at forudsige, hvorvidt gener involveret i TCE- I

nedbrydning er chromosomalt indkodede eller plasmid- I

^ indkodede. Undersøgelser foretaget af Nelson et al., I

supra, og wackett og Gibson, supra, med mutanter af I

30 PpFl, der er defektive med hensyn til forskellige kom- I

ponenter i TOD-toluen-nedbrydningsreaktionsvej en, tyder I

på, at evnen hos PpFl til at nedbryde TCE er forbundet I

med toluen-dioxygenase-enzymaktiviteten, hvilket er det I

11 DK 175623 B1 første enzym ved den chromosomalt indkodede TOD-reak-tionsvej. Undersøgelser foretaget af Nelson et al., supra, med Pp mt-2 viste, at TCE-nedbrydningsevnen ikke er forbundet med nogen som helst enzymer ved den plas-5 mid-indkodede TOL-reaktionsvej.

ingen af de mikroorganismer, der hidtil er afprøvet for TCE-nedbrydningsevne, udnytter den plasmid-indkodede TMO-reaktionsvej til toluennedbrydning. Endvidere er ingen mikroorganisme endnu blevet genetisk 10 manipuleret til forøgelse af enzymaktiviteten og TCE-nedbrydningsevnen. Ydermere har anvendelsen af ethvert af de ovenfor beskrevne mikroorganismesystemer til nedbrydning af TCE flere dermed forbundne problemer. Et første problem er, at for at nedbryde TCE må en ned-15 brydende enzym-reaktionsvej (f.eks. TOD-reaktionsvejen) induceres i mikroorganismerne, og inducerne, der må sættes til den TCE-kontaminerede prøve, er carbonhy-drider. Et andet problem er, at da TCE (et substrat for de inducerede nedbrydende enzymer) selv ikke kan 20 anvendes af disse mikroorganismer som carbonkilde til cellevækst, må cellerne forsynes med et andet substrat (et cosubstrat) til vækst. Sådanne cosubstrater sat til den TCE-kontaminerede prøve, er carbonhydrider, såsom toluen. Disse to problemer har relation til det prak-25 tiske problem, at for at nedbryde TCE i en kontamine-ret prøve, såsom et vandførende lag, er det ikke ønskeligt at måtte tilsætte carbonhydrider, såsom toluen (som inducer og/eller carbonkilde), da carbonhydrider som toluen selv er miljømæssigt toksiske forbindelser.

30 Et tredje problem, der er nært forbundet med de to første, er, at i de ovenfor beskrevne systemer, hvor et carbonhydrid såsom toluen virker som induceren for og substratet for nedbrydnings-reaktionsvej-enzymerne

I DK 175623 B1 I

I 12 I

I (hvilke enzymer både metaboliserer carbonhydridet og I

I nedbryder TCE), er der en konkurrence mellem carbon- I

I hydridet og TCE for det samme enzymsystem. Under be- I

I tingelser, hvor carbonhydridkoncentrationen ligger I

I 5 langt over TCE-koncentrationen, vil carbonhydridet kon- I

I kurrere mere effektivt for enzymsystemet og forsinke I

I TCE-nedbrydningen. Disse tre problemer belyser forskel- I

I lige aspekter af hvad der betegnes cosubstratproblemet, I

som optræder ved de tidligere beskrevne inducerbare I

I 10 enzymsystemer til TCE-nedbrydning. I

Det har nu uventet vist sig, at PmKRl og gene- I

I tisk manipulerede mikroorganismer indeholdende PmKRl- I

toluen-monooxygenase-gener har evne til at nedbryde I

I TCE. Følgelig er PmKRl og mikroorganisme-værtsceller I

I 15 indeholdende PmKRl-toluen-monooxygenase-gener nyttige I

ved en fremgangsmåde til nedbrydning af TCE. I

I Den foreliggende opfindelse omfatter således en I

ny fremgangsmåde til nedbrydning af TCE under anvendel- I

I se af disse mikroorganismer, der indeholder PmKRl-to- I

I 20 luen-monooxygenase-gener. Specielt omfatter den fore- I

liggende opfindelse en fremgangsmåde til nedbrydning af I

TCE under anvendelse af genetisk manipulerede mikro- I

I organismer, som er blevet udviklet, og som har over- I

I legne egenskaber med hensyn til at nedbryde en speciel I

I 25 kemisk kontaminant såsom TCE til udskadelige materia- I

I ler. I

I Følgelig er et af formålene med den foreliggende I

I opfindelse at tilvejebringe en fremgangsmåde til ned- I

I brydning af TCE, hvor som helst det kan optræde som I

I ^0 kontaminant eller forurenende stof. I

Et andet formål med opfindelsen er at tilveje- I

I bringe en fremgangsmåde til mikrobiel nedbrydning af I

I TCE, hvor som helst det er ønsket, f.eks. som et middel I

13 DK 175623 B1 til rensning af lukkede og åbne vandområder, industrielle effluent-udtømninger, statslige, kommercielle eller industrielle installationer og anlæg eller forskellige laboratorieoperationer, samt i andre situationer, 5 hvor TCE kan blive akkumuleret. Specielt tilvejebringes der ifølge opfindelsen en forbedret fremgangsmåde til nedbrydning af TCE under anvendelse af de genetisk manipulerede TCE-nedbrydende mikroorganismer ifølge opfindelsen, når TCE'et er blevet fjernet fra kontamine-10 ret vand (f.eks. ved luftstripning).

Et yderligere formål med opfindelsen er at tilvejebringe en procedure til på let, effektiv og forholdsvis økonomisk måde at nedbryde TCE.

Et yderligere formål med opfindelsen er at til-15 vejebringe mikroorganismer indeholdende rekombinante plasmider med toluen-monooxygenase-gener fra PmKRl, hvilke gener koder for enzymer, som er i stand til at nedbryde TCE, idet de efterlader en ikke-toksisk cellemasse, idet disse mikroorganismer er ikke-patogene for 20 mennesker, dyr eller marin fauna og flora.

Et yderligere formål med opfindelsen er at tilvejebringe en fremgangsmåde til nedbrydning af TCE, ved hvilken mikroorganisme-værtscellen, der indeholder det rekombinante plasmid med toluen-monooxygenase-generne 25 fra PmKRl og er i stand til at nedbryde TCE, kan tilføres direkte til stedet med TCE-kontaminering.

Et yderligere formål med opfindelsen er at tilvejebringe en fremgangsmåde til nedbrydning af TCE under anvendelse af genetisk manipulerede mikroorganismer 3°..med PmKRl-toluen-monoxygenase-gener, ved hvilken gener-ne er anbragt under kontrol af forskellige promotorer, og medfører forøget ekspression af toluen-monoxygenase-aktivitet og forøget nedbrydning af TCE, under visse celledyrknings- og assaybetingelser.

I DK 175623 B1 I

I 14 I

I Et yderligere formål med opfindelsen er at til- I

I vejebringe en fremgangsmåde til nedbrydning af TCE υη- I

I der anvendelse af genetisk manipulerede mikroorganis- I

I mer med PmKRl-toluen-monooxygenase-gener, ved hvilken I

I 5 generne anbringes under kontrol af promotorsystemer, I

I som ikke induceres af carbonhydrider, såsom toluen, I

I hvorved man løser det cosubstratproblem, som tidligere I

I beskrevne, inducerbare enzymsystemer for TCE-nedbryd- I

I ning frembyder. Fordele ved anvendelsen af genetisk I

I 10 manipulerede mikroorganismer ved den foreliggende op- I

I findelse indbefatter således: eliminering af et carbon- I

I hydrid såsom toluen som inducer, eliminering af et I

I carbonhydrid såsom toluen som cosubstrat for det ned- I

I brydende enzymsystem, og eliminering af konkurrerende I

H

I 15 hæmning af TCE-nedbrydning fremkaldt af carbonhydrid- I

I cosubstrat/induceren. I

I Ifølge opfindelsen tilvejebringes der en frem- I

I gangsmåde til mikrobiel nedbrydning af TCE, hvilken I

I fremgangsmåde består i, at man behandler TCE med en mi- I

I 20 kroorganismevært valgt fra gruppen bestående af E^ coll I

I JM109, JM83, HB101 og FM5 , hvor mikroorganismeværten I

I indeholder et rekombinant plasmid, som er i stand til I

I at udtrykke toluen-monooxygenase-gener fra Pseudomonas I

I mendocina KR-1 og ekspression af de nævnte gener styres I

I 25 af en inducer. Endvidere tilvejebringes der·ved opfin- I

I delsen anvendelse af fremgangsmåden ifølge kravene 1-4 I

I til nedbrydning af TCE i kemisk affald. I

I En fordel ved den foreliggende opfindelse i ét I

I af dens aspekter er, at der benyttes genetisk manipule- I

I 30 rede mikroorganismer, med vel-karakteriserede klonede I

I gener, hvis ekspression er under kontrol af meget vel- I

I karakteriserede og let regulerede promotorer, således I

I at disse genetisk manipulerede mikroorganismer har I

15 DK 175623 B1 evnen til på effektiv måde at nedbryde TCE. Desuden kan disse genetisk manipulerede mikroorganismer på hurtig og billig måde dyrkes til meget høje celledensiteter med den moderne fermenteringsteknologi, der er blevet 5 udviklet for stammer af E^ coll, i modsætning til vanskeligheden med at dyrke naturlige isolater såsom PmKRl-cellerne. Desuden kan disse genetisk manipulerede mikroorganismer, i nærværelse af lave koncentrationer af glucose, opretholde TCE-nedbrydningen i tids-10 rum på over 12 timer. En yderligere fordel ved at anvende disse rekombinante mikroorganismer er, at de er i stand til at nedbryde TCE til yderst lave koncentrationer i kraft af den omstændighed, at metabolismen ikke længere kræver tilstedeværelsen af aromatiske 15 carbonhydrider (såsom toluen) i mediet, sådan som det kræves af PmKRl-cellerne.

De genetisk manipulerede mikroorganismer kan anvendes direkte på det TCE-holdige miljø, der skal de-kontamineres. Alternativt kan enzymprodukter af de klo-20 nede gener anvendes til nedbrydning af TCE, fremfor de genetisk manipulerede mikroorganismer, på steder med TCE-holdigt kemisk affald. Fremskyndelse af dekontami-neringshastigheden hidrører fra anvendelsen af sådanne genetisk manipulerede mikroorganismer med inducerbare 25 gener til nedbrydning af TCE.

Disse og andre formål og fordele ved den foreliggende opfindelse vil fremgå for fagmanden af den efterfølgende detaljerede beskrivelse med krav.

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af tegnin-30 gen, der omfatter Θ figurer, hvoraf fig. 1 er en graf, der viser forsvinden af 10 μΜ (1,3 ppm) TCE sat til celler, der afprøves for TCE-nedbrydningsevne, som skyldes metabolismen af TCE frem- I DK 175623 B1

I 16 I

I kaldt af cellerne til ikke-flygtigt materiale, som en I

funktion af tiden; de afprøvede celler var Pseudomonas I

mendoclna KR-1 (PmKRl), Pseudomonas putida F1 (PpFl) og I

I Pseudomonas putlda Y2101 (Pp Y2101), I

I 5 fig, 2 er en graf, der viser virkningen af at I

I tilsætte toluen på tidspunktet for TCE-tilsætningen på I

I forsvinden af 20 μΜ {2,6 ppm) TCE sat til celler, der I

I afprøves for TCE-nedbrydningsevne, som skyldes meta- I

bolismen af TCE til ikke-flygtigt materiale, som en I

I 10 funktion af tiden; de afprøvede celler var; (1) PmKRl I

med og uden toluen tilsat på tidspunktet for TCE-til- I

I sætningen, og (2) PmY4001, I

I fig. 3 er en graf, der viser forsvinden af 50 μΜ I

I (6,5 ppm) TCE sat til celler, der afprøves for TCE- I

I 15 nedbrydningsevne, som skyldes metabolisme af TCE til I

I ikke-flygtigt materiale, som en funktion af tiden; de I

I afprøvede celler var; (1) coli hbioi Indeholdende I

I rekombinant plasmid pMY402 (HB101/pMY402) under betin- I

gelser, hvor cellerne var blevet induceret med IPTG før I

20 og under assayen (kontrolcellerne var ikke induceret I

med IPTG), og (2) EU coll FM5 celler indeholdende re- I

kombinant plasmid pKY287 (FM5/pKY287), hvor cellerne I

var blevet induceret med en stigning i temperatur (kon- I

I trolcellerne var FM5-celler indeholdende plasmid-vekto- I

I 25 ren pCFM1146), I

I fig. 4 er en graf, der viser forsvinden af TCE, I

I der sættes til cellerne i varierende koncentrationer, I

som følge af metabolismen af TCE til ikke-flygtigt ma- I

I teriale, som en funktion af tiden, fremkaldt af HB101- I

I 30 celler indeholdende pMY402 rekombinant-plasmidet, - I

I * fig. 5 er en graf, der viser en HPLC-eluerings- I

profil af i cellemediet tilstedeværende 14C metabolit- I

ter efter nedbrydningen af 14C-TCE fremkaldt af PmKRl- I

celler (kontrolcellerne var PmY4001-celler), I

17 DK 175623 B1 fig. 6 er en graf analog med fig. 5, men hvor nedbrydningen af 14C-TCE blev fremkaldt af FM5/pKY287-celler (kontrolcellerne var FM5/pCFM1146-celler), fig. 7 er en graf, der viser forsvinden af 20 μΜ 5 (2,6 ppm) TCE sat til celler, som følge af metabolismen af TCE til ikke-flygtigt materiale, som en funktion af tiden, til sammenligning af hastigheden og omfanget af TCE-nedbrydningen fremkaldt af PmKRl-celler af vild type og af HBlOl-celler indeholdende pMY402 rekombinant-10 plasmidet (HBl01/pMY402), og fig. 8 er en graf analog med fig. 7, men hvor der anvendtes 50 yM (6,5 ppm) TCE i stedet for 20 μΜ (2,6 ppm) TCE som i fig. 7. Desuden omfatter den resultater med Ε_^ col i FM5-celler indeholdende rekombinant 15 plasmid pKY287 (FM5/pKY287), til sammenligning af hastigheden og omfanget af TCE-nedbrydning fremkaldt af vildtype PmKRl-, HB101/pMY402- og FM5/pKY287-celler.

I det følgende skal de foretrukne udførelsesformer beskrives nærmere.

20 Som angivet ovenfor er TCE et vigtigt industri elt opløsningsmiddel og har vist sig at være vidt udbredt i vandmiljøet. Ca. 234.000 ton TCE produceres årligt verden over (U.S. Environmental Protection Agency, 1980, EPA 440/5-80-077). TCE er meget persi-25 stent og kan være yderst vanskeligt at fjerne, når det først er til stede i miljøet. For nærværende ved man kun lidt om den mikrobielle metabolisme af TCE. Isolerede og klonede gener, såsom de ved den foreliggende opfindelse anvendte PmKRl-toluen-monooxygenase-gener, 30 skulle muliggøre klarlæggelsen af en nærmere forståelse af en unik type mikrobiel TCE-metabolisme. Desuden kan de klonede gener manipuleres, f.eks. ved at kombinere generne med forskellige promotorer, til forøgelse af I DK 175623 B1 I 18

I ekspressionen af enzymprodukterne, således at hastig- I

I heden og omfanget af nedbrydningen af TCE forøges. Som I

I belyst ved den foreliggende opfindelse kan anvendelsen I

I af visse promotorsystemer under visse celledyrknings- I

I 5 og assaybetingelser forøge ekspressionen af toluen- I

I monooxygenase-genprodukter og kan resultere i fremskyn- I

I delse af hastigheden af TCE-nedbrydning fremkaldt af I

I organismer indeholdende disse klonede gener. I

I Udvikling af genetisk manipulerede mikroorga- I

I 10 nismer, der har overlegne evner med hensyn til at ned- I

I bryde specifikke kemiske kontaminanter såsom TCE til I

I uskadelige materialer er én vigtig strategi ved udvik- I

I lingen af omkostningseffektive og miljømæssigt sunde I

I fremgangsmåder til rensning for farligt kemisk affald. I

I 15 Udviklingen og anvendelsen af mikroorganisme-værtscel- I

I ler med rekombinante plasmider indeholdende toluen- I

I monooxygenase-gener fra PmKRl ved den foreliggende op- I

I findelse er en ny og nyttig metode, der kan anvendes I

I til rensning af TCE-holdigt kemisk affald. Især er dis- I

20 se genetisk manipulerede mikroorganisme-værtsceller I

nyttige ved en forbedret fremgangsmåde til nedbrydning I

I af TCE, når TCE'et er blevet fjernet fra kontamineret I

I vand (f.eks. ved luftstripning). Disse genetisk manipu- I

I lerede mikroorganisme-værtsceller med PmKRl-toluen- I

I 25 monooxygenase-gener er blevet fuldstændig beskrevet i I

I beskrivelsen til US patentansøgning nr. 177.631, der er I

I i dens helhed skal betragtes som inkorporeret heri i I

kraft af henvisningen dertil. I

I Det tages også i betragtning, at enzymprodukter- I

I 30 ne af toluen-monooxygenase-generne kan anvendes til I

I nedbrydning af TCE, fremfor anvendelse af mikroorganis- I

I me-værtscellerne, der indeholder rekombinante plasmider I

I med toluen-monooxygenase-gener, til nedbrydning af I

DK 175623 B1 I

19 I

TCE'et. Enzymprodukterne kan tilføres direkte til ste- I

der med TCE-holdigt kemisk affald. I

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebrin- I

ges der en fremgangsmåde, som kan anvendes til nedbryd- I

5 ning af TCE på et hvilket som helst sted, hvor det kan I

forekomme som en kontaminant eller et forurerende stof. I

Med fremgangsmåden bliver det således muligt at rense I

for og nedbryde TCE på steder med TCE-holdigt kemisk I

affald fundet i vand eller jordbund. I

I 10 Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de ef- I

I terfølgende, ikke-begrænsende eksempler. I

I Eksempel 1 I

I 15 Bakteriestammer og vækst. I

I De nedenfor anførte bakteriestammer er beskrevet I

I i beskrivelsen til US patentansøgning nr. 177.631, der I

I skal betragtes som inkorporeret heri i kraft af hen- I

I 20 visningen dertil. Specielt er konstruktionen og egen- I

I skaberne af de genetisk manipulerede mikroorganisme- I

I værtsceller, herunder plasmider, vektorer, gener og I

I gensegmenter, beskrevet i beskrivelsen til den oven- I

I nævnte ansøgning. De nedenstående bakteriestammer dyr- I

I 25 kedes natten over ved 30 C i PAS-medium (Chakrabarty et I al., Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A., 70:1137-1140, 1973) I suppleret med følgende vækstsubstrater og inducere: I PmKRl, toluen (tilført som damp) til vækst og induktion I af toluen-nedbrydende enzymer eller 0,2% glucose til I 30 vækst, Pseudomonas putlda F1 (PpFl), toluen (tilført I som damp) til vækst og induktion af toluen-nedbrydende I enzymer eller 0,2% glucose til vækst, Pseudomonas puti- I da KT2440 (KT2440), 0,2% L-glutamat til vækst, Pseudo-

I DK 175623 B1 I

I 20 I

I monas putIda, KT2440 indeholdende plasmid pND50 I

I (KT2440/pND50), 2,5 mM p-cresol (fortyndet 1000 gange I

ud fra en koncentreret stamopløsning i dimethylform- I

amid) til vækst og induktion af p-cresol-nedbrydende I

5 enzymer, Pseudomonas putida KT2440 indeholdende plasmid . I

I pAUTl (KT2440/pAUTl), toluen (tilført som damp) til I

I vækst og induktion af toluen-nedbrydende enzymer, I

I Pseudomonas mendocina Y4001 (PmY4001), 2,5 mM p-cresol I

I til vækst og induktion af p-cresol-nedbrydende enzymer, I

I 10 coll stamme HB101 indeholdende rekombinante plas- I

I mider pKY277, pMY402 eller plasmid-vektor pMMB66EH I

(henholdsvis HB101/pKY277, HB101/pMY402 og HB101/ I

I ρΜΜΒββΕΗ), 0,2% L-glutamat eller 0,2% glucose, 0,2% I

I casaminosyrer og 2 yg/ml vitamin Bl til vækst, 250 I

I 15 yg/ml ampicillin til plasmidvedligeholdelse og 1 mM I

I isopropyl-p-D-thiogalactosid (IPTG) til induktion af I

toluen-monooxygenase-syntese, KT2440 indeholdende re- I

I kombinant plasmid pMY402 (KT2440/pMY402), 0,2% L-glu- I

tamat til vækst, 1 mg/ml ampicillin til plasmidvedlige- I

20 holdelse og 5 mM IPTG til induktion af toluen-monooxy- I

genase-syntese, coli PM5 indeholdende rekombinant I

plasmid pKY287 eller plasmid-vektor pCFM1146 (henholds- I

I vis FM5/pKY287 og FM5/pCPM1146), 0,2% glucose og 0,05% I

I gærekstrakt til vækst, 50 yg/ml kanamycin til plasmid- I

I 25 vedligeholdelse, og for FM5/pKY287 en temperaturfor- I

I ° I

skydning for kulturen til 42 C i 2 timer og derefter I

I I

tilbagevenden til 30 C i 2 timer til induktion af I

I toluen-monooxygenase-syntese. Cellerne dyrkedes til I

I en OD55q på mindst 0,5, hvilket svarer til ca. 3 x 10® I

I 30 CFU/ml. I

I Foruden de ovenfor anførte stammer blev flere I

I ny-isolerede stammer betegnet El, E2, E4, E5, E7 og E9, I

I der udnytter ethylbenzen eller toluen som carbonkilde I

21 DK 175623 B1 til vækst, dyrket og afprøvet for TCE-nedbrydende evne.

De ethylbenzen-udnyttende stammer isoleredes som følger. Syv prøver (nummereret 1-7) opnåedes fra LaBrea 5 Tarpit, og ni prøver (nummereret 1-9) opnåedes fra Thousand Oaks Sewage Treatment Plant. En delmængde på 1 ml af hver prøve inoculeredes i 50 ml PAS-medium \ suppleret med ethylbenzen tilført som damp fra 0,2 ml ethylbenzen, og kulturerne dyrkedes ved 25°C i 5 dage.

10 Kulturerne nummereret 1, 4, 5 og 9 fra Thousand Oaks Sewage Treatment Plant og kulturerne nummereret 2 og 7 fra LaBrea Tarpit dyrkedes til mætning (ingen vækst opnåedes i andre kulturer). Én delmængde på 1 ml blev udtaget af kulturerne 1, 2, 4, 5, 7 og 9, og hver blev 15 inoculeret i 50 ml PAS-medium suppleret med ethylbenzen tilført som damp som beskrevet ovenfor. Man lod

O

disse 50 ml kulturer vokse natten over ved 25 C. En prøve fra hver kultur påførtes som stregkultur på en PAS-ethylbenzen-plade, og to gange for enkeltkolonier.

20 De rensede kolonier fra hver prøve blev betegnet El, E2, E4, E5, E7 og E9. Disse naturlige bakterieisolater, som udnytter ethylbenzen, viste sig også at vokse på 0 toluen og dyrkedes natten over ved 30 C i PAS-medium suppleret med følgende vækstsubstrater og inducere: 25 o,2% L-glutamat til vækst, 1 mM toluen til induktion af toluen-nedbrydende enzymer. Cellerne dyrkedes, som beskrevet for andre ovenfor anførte stammer, til en OD550 på mindst 0,5.

I DK 175623 B1 I

I 22 I

I Eksempel 2 I

I Radloaktlvitetsassay for TCE-nedbrydning. I

I 5 Dette eksempel beskriver en radioaktivitetsas- I

I say til måling af fremkomsten af ikke-flygtige meta- I

I bolitter af TCE. De ved denne assay anvendte bakterie- I

I stammer dyrkedes som i eksempel 1. Om nødvendigt for- I

tyndedes cellerne med PAS-medium til en OD55q på 0,5 I

10 til assayen. Til 4 ml cellesuspension i en 50 ml serum- I

I flaske sattes TCE (1,2-14C, 72 mCi pr. mmol, New Eng- I

land Nuclear, Boston, Massachusetts) til en slutkon- I

I centration på 5 μΜ. Opløsningen af 14C-TCE fremstille- I

des ved at blande radioaktivt og ikke-radioaktivt TCE I

I 15 til opnåelse af en 5 mM opløsning i dimethylformamid I

I med ca. 1 x 106 impulser pr. minut ("counts per I

minute") pr. μΐ. 4 μΐ opløsning sattes til hver 4 ml I

cellesuspension, serumflasken lukkedes med en teflon- I

I overtrukket gummimembran og en krympekapsel af metal, I

20 omhvirvledes og Inkuberedes under omrystning ved 30°C. I

Til tidspunktet 0 og med 30 minutters mellemrum deref- I

I ter blev ca. 100 μΐ af cellesuspensionen udtaget under I

anvendelse af en nål og en sprøjte, og 20 μΐ af denne I

I suspension anbragtes som en plet på en lille sektion I

25 af en Whatman silicagel-tyndtlagschromatografiplade I

I (Whatman, Clifton, New Jersey), lufttørredes i 15 mi- I

I nutter og underkastedes tælling i en Beckman LS-100 I

I scintillationstæller (Beckman Instruments, Inc., Palo I Alto, California) under anvendelse af Biofluor (New I 30 England Nuclear) flydende scintillationsfluidum. Til I tabel 1 blev de efter lufttørring opnåede data omregnet til nanomol TCE metaboliseret til ikke-flygtigt materiale ved anvendelse af 200 impulser pr. minut pr.

23 DK 175623 B1 picomol som den specifikke aktivitet af det tilførte 14C-TCE.

DK 175623 B1 I

24 I

Tabel 1 I

TCE-Nedbrydning

Nanomol 14C-TCE I

omdannet til I

5 ikke-flygtigt I

materiale efter I

Stamme Inducer 2 timer I

PpFl ingen 0,4 I

toluen 1,1-2,0 I

PmKRl ingen 0,4 I

toluen 5,1-6,5 15

PmY4001 p-cresol 0,4

PpY2101 ingen 0,4 I

toluen 3,8-5,1

20 PpY2119 p-cresol 0,4 I

PpY2118 ingen 0,4 I

IPTG 0,7-1,1 I

25 HB101/pKY277 ingen 0,4 I

IPTG 1,6 I

HB101/pMY402 ingen 0,3, 0,5 efter I

6 timer I

30 IPTG 3,3-3,5, 4,7 efter 6 timer 25 DK 175623 B1

Tabel l sammenfatter omfanget af 14C-TCE-omdannelsen til ikke-flygtigt materiale efter 2 timer som en funktion af den inducer, der var til stede under væksten natten over. ved disse forsøg blev ca. 0,4 nanomol 5 14C-TCE ikke forflygtiget, og dette svarer til en baggrundsværdi på ca. 2% af det tilførte 14C-TCE.

Eksempel 3 10 Gaschromatografiassay for TCE-nedbrydning.

I dette eksempel beskrives en gaschromatografiassay til måling af forsvinden af flygtigt TCE. De ved denne assay anvendte bakteriestammer dyrkedes som be-15 skrevet i eksempel 1. Kulturer dyrket natten over fortyndedes (om nødvendigt) til en OD55q på 0,5 med PAS-medium til assayen, og 4 ml af cellekulturen hældtes i serumflasker. TCE ( Aldrich, (Milwaukee, Wisconsin), spektrofotometrisk kvalitet) fortyndedes. med Ν,Ν'-di-20 methylformamid (DMF) (Aldrich, spektrofotometrisk kvalitet) til 10 mM eller 20 mM, og 4 μΐ sattes til cellesuspensionen til opnåelse af en TCE-slutkoncentration på 10 μΜ (1,3 ppm) (fig. 1) eller 20 μΜ (2,6 ppm) (fig.

2). Serumflaskerne blev lukket til og omhvirvlet, og 10 25 μΐ gasfase blev udtaget under anvendelse af en gastæt sprøjte på de tidspunkter, der er angivet i figurerne. Gasfaseprøver blev analyseret på en Hewlett-Packard 5890A gaschromatograf forsynet med en 25 meter 5% phe-nylmethyl-siliconkolonne (Hewlett-Packard, Palo Alto, 30 California) og en 63Ni-elektronopfangningsdetektor.

Injektor-, ovn- og detektortemperaturerne var henholds- p O 0 vis 120 , 100 og 300 C. Bærergassen var helium, og kompletteringsgassen var 95% argon-5% methan. Toparea-

I DK 175623 B1 I

I 26 I

I lerne beregnedes ved hjælp af en Hewlett-Packard 3392A I

I integrator. Dataene præsenteres, i fig. 1, 2 og 3 som I

I den procentmængde TCE, der er tilbage på forskellige I

I tidspunkter efter tilsætning af cellesuspensionen. I

I 5 Mængden af tilstedeværende TCE til tidspunktet 0 sættes I

I til 100%. I

I Fig. 1 viser hastigheden af TCE-nedbrydning ved I

I 10 μΜ (1,3 ppm) TCE for PmKRl, KT2440/pAUTl og PpFl. I

I Nedbrydningen er hurtig ved 1 til 2 timer efter TCE- I

I 10 tilsætningen og bliver langsommere på senere tidspunk- I

I ter. PmKRl udviser den højeste aktivitet af de tre af- I

I prøvede stammer. I

I Fig. 2 viser stimuleringen af TCE-nedbrydning I

I fremkaldt PmKRl-celler, der er for-dyrket i PAS-medium I

I 15 Indeholdende toluen, når toluen er til stede på tids- I

I punktet for TCE-tilsætning. PmKRl vil nedbryde mere end I

I 90% af den oprindeligt tilstedeværende TCE-mængde på I

I 20 μΜ (2,6 ppm), når toluen er til stede som damp, og I

I kun ca. 50% af TCE'et nedbrydes af PmKRl, når toluen I

I 20 ikke er til stede på tidspunktet for TCE-tilsætningen. I

I Fig. 3 viser hastigheden af TCE-nedbrydning ved I

I 20 μΜ (2,6 ppm) fremkaldt af HB101/pMY402-celler og I

I FM5/pKY287-celler. Mere end 95% af TCE'et er nedbrudt I

I efter 4 timer. I

I 25 I

I Eksempel 4 I

I TCE-Nedbrydning ved hjælp af naturlige bakterieisola- I

I ter. I

I 30 I

I De ethylbenzen- (og toluen-) udnyttende stammer, I

I isoleret og dyrket som beskrevet i eksempel 1, afprøve- I

I des for deres evne til at nedbryde TCE. TCE-Koncentra- I

27 DK 175623 B1 tionerne bestemtes ved gaschromatografi i henhold til eksempel 3. TCE tilsattes til en koncentration på 20 μΜ (2,6 ppm). Resultaterne er anført i tabel 2. Sammenlignet med vildtype PmKRl-cellerne var den procentmængde 5 TCE, der var tilbage efter 18 timers nedbrydningstid, 6 til 14 gange større end for vildtype PmKRl-cellerne, hvilket angiver, at disse stammer var betydelig mindre I effektive end vildtype PmKRl-cellerne med hensyn til I deres evne til at nedbryde TCE.

I 10 I Tabel 2 I TCE-Nedbrydning ved hjælp af naturlige bakterieisolater I Stamme % TCE tilbage efter 18 timer I 15 I PmKRl I PmY4001 * I »η s I El **

I E2 JJ

I E4 39 I 20 ES 56 I Γ7 Ikke afprøvet I £ 38 I 24^ I 25 TCE-Niveauer bestemt ved gaschromatografi i henhold til I eksempel 3. TCE tilsat til 20 μΜ (2,6 ppm). Ved dette I forsøg dyrkedes El, E2, E4, E5, E7 og E9 cellerne på I toluen som carbonkilde, selvom disse celler, som be~ I skrevet i eksempel 1, oprindeligt var udvalgt til vækst I 30 på ethylbenzen.

I DK 175623 B1 I

I 28 I

I Eksempel 5 I

I Virkning af højere TCE-koncentrationer. I

Dette eksempel beskriver nedbrydningen af sti- I

I 5 gende TCE-koncentrationer ved hjælp af rekombinante I

celler ifølge den foreliggende opfindelse. Bakterie- I

cellerne ved denne assay dyrkedes som i eksempel 1, I

bortset fra at der anvendte 0/5% gærekstrakt (Difco, I

Detroit, Michigan) i stedet for casaminosyrer og vita- I

I 10 min Bl i vækstmediet. Assayen var den i eksempel 3 be- I

skrevne gaschromatografi-assay for TCE-nedbrydning. I

I Fig. 4 viser, den forsvinden af til cellerne i varieren- I

I de koncentrationer tilsat TCE fra gasfasen, som skyldes I

I metabolismen af TCE til ikke-flygtigt materiale, som I

I 15 en funktion af tiden, ved indvirkning af HBlOl-celler I

indeholdende pMY402 rekombinantplasmidet (ρΜΜΒββΕΗ I

plasmid-vektor med PmKRl-toluen-monooxygenase-gener). I

I De uudfyldte cirkler viser metabolismen af 20 yM (2,6 I

I ppm) TCE, de udfyldte kvadrater viser metabolismen af I

20 50 yM (6,5 ppm) TCE, de uudfyldte trekanter viser meta- I

I bolismen af 125 yM (16 ppm) TCE, de udfyldte trekanter I viser metabolismen af 310 yM (41 ppm) TCE, og de uud- I fyldte kvadrater viser metabolismen af 780 yM (100 ppm) I TCE. Der udførtes kontrolforsøg for hver TCE-koncen- I 25 tration under anvendelse af HBlOl-celler indeholdende I pMY402-plasmid i fraværelse af induceren IPTG eller I HBlOl-celler indeholdende pMMB6EH plasmid-vektoren.

Fig. 4 viser, at HB101 indeholdende p-MY402 induceret med IPTG metaboliserer næsten 100% TCE ved kon-30 centrationer af TCE på op til næsten 20 ppm på 6 timer eller mindre. Ved 48 ppm TCE metaboliseres 75% på 8 timer. Desuden viser fig. 4, at forøgede hastigheder af 29 DK 175623 B1 TCE-nedbrydning optræder ved forøgede koncentrationer af TCE.

Eksempel 6 5

Kinetik af TCE-nedbrydning.

Por at undersøge kinetikken af TCE-nedbrydning ved indvirkning af PmKRl-toluen-monooxygenase-genpro-10 dukter dyrkedes PmKRl- og PmY4001-celler som i eksempel 1. Til disse forsøge dyrkedes desuden FM5/pKY287- og FM5/pCFM1146-celler som følger: Et inoculum af celler

O

sattes til L-broth, og kulturen inkuberedes ved 30 C, indtil cellerne havde nået en OD550 på 0,5, hvorefter 15 temperaturen øgedes til 42°C i 1,5 timer til muliggø-relse af enzyminduktion og -syntese og derefter bragtes tilbage til 30°C i 4 til 6 timer til fortsat vækst. Cellekulturerne centrifugeredes og resuspenderedes i PAS-medium eller PAS-medium indeholdende 0,2% glucose.

20 For at bestemme kinetikken af TCE-nedbrydning fortyndedes cellekulturerne med 0,1 M KP04, pH 7,5, til en OD55q som angivet i nedenstående tabel 3. En portion af de fortyndede celler blev gemt til protein-assays som beskrevet nedenfor. TCE-Nedbrydningen be-25 stemtes ved gaschromatografi i det væsentlige i overensstemmelse med den i eksempel 3 beskrevne procedure, bortset fra at 10 ml (i stedet for 4 ml) cellereaktioner blev foretaget i serumflasker, og 5-10 pi TCE i DMF sattes til cellerne til de i nedenstående tabel 3 30 anførte slutkoncentrationer. Cellereaktionerne inkuberedes under omrystning ved 30 C, og til tidspunktet 0 og til forskellige tidspunkter efter TCE-tilsætning blev 10 pi gasfase udtaget og analyseret for TCE-kon- I DK 175623 B1

I 30 I

I centration som beskrevet i eksempel 3. Begyndelsesha- I

I stighederne for TCE-nedbrydningen beregnedes ud fra I

I mængden af nedbrudt TCE under de første 20 til 30 mi- I

I nutter af reaktionen og er angivet som nanomol pr. mi- I

I 5 nut pr. mg protein i nedenstående tabel 3. De fleste I

I kinetiske forsøg udførtes under anvendelse af FM5/ I

I pKY287-celler, men flere forsøg blev dog udført under I

I anvendelse af PmKRl-celler for at sammenligne hastighe- I

I derne under anvendelse af rekombinante celler med ha- I

I 10 stighederne under anvendelse af vildtypeceller. I

I FM5/pCFM1146-celler anvendtes som kontrolceller for I

I FM5/pKY287-cellerne, og PmY400l-celler anvendtes som I

I kontrolceller for PmKRlcellerne, for at måle ethvert I

I tab af TCE som følge af udsivning fra flasken eller som I

15 følge af adsorption til cellerne. Forsøgene viste, at I

tabet fra kontrolflaskerne sædvanligvis var mindre end I

I I

5% efter 1 times inkubering ved 30 C. I

I Totalt celleprotein kan bestemmes ved hjælp af I

I flere forskellige metoder, herunder den metode, der er I

I 20 angivet af Bradford, Anal. Biochem. 72:248-254 (1976), I

I og som fås i handelen som Bio-Rad Protein Assay (Bio- I

I Rad, Richmond, California, katalog nr. 500-0006). Til I

I lysering af celler og udsættelse af cellulært protein I

for reaktion ved proteinassayproceduren sattes der na- I

25 triumhydroxid til cellesuspensionerne til en slutkon- I

centration på 0,1 N, hvorefter der inkuberedes ved I

I ° I

100 C i 30 minutter forud for assayproceduren. Bovint I

I plasmaalbumin, behandlet med NaOH og opvarmet som netop I

I beskrevet, anvendtes som proteinstandard ved assaypro- I

I 30 ceduren. Hastighederne af TCE-nedbrydningen fremkaldt I

I af FM5/pKY2B7-celler ved varierende celletætheder I

I (°D550 0,05 til 1,00) og varierende TCE-koncentra- I

I tioner (1 til 40 yM, 0,13 til 5,2 ppm) er anført i ta- I

bel 3.

DK 175623 B1 31

Tabel 3

Kinetik af TCE-nedbrydning fremkaldt af FM5/pKY287-cel-5 ler (nmol/min/mg protein)

Celle- TCE-koncentration (μΜ) densitet ved start 10 (OD550) 1 2_j_5 5_j_0 10,0 20,0 40,0 0,05 - 1,2 0,10 0,4 0,5 1,5 1,3 1,0 0,1 0,20 - - 1,4 - 0,50 - 0,9 - 1,4 15 1,00 0,2

Ved forsøg med PmKRl-celler, der var blevet induceret med toluen, var hastighederne af TCE-nedbryd-ningen ved en OD550 på 0,50 og ved en TCE-koncentration 20 på 5,0 μΜ og 20,0 μΜ henholdsvis 1,3 og 2,4 nmol/min/mg protein, ved en OD55q på 1,0 og en TCE-koncentration på 5 μΜ var hastigheden af TCE-nedbrydningen fremkaldt af PmKRl-celler 2,7 nmol/min/mg protein. Disse resultater viste, at hastigheden af TCE-nedbrydningen for vildty-25 pe PmKRl-cellerne er i det mindste sammenlignelig med, og generelt lidt højere end, hastigheden af de rekom-binante celler. Resultaterne i tabel 3 viser desuden, at de rekombinante FM5/pKY287-celler effektivt kan nedbryde TCE ved lav celledensitet (OD550 på 0,05-0,10) 30 og ved lave TCE-koncentrationer (1 μΜ-2,5 μΜ). Selv ved lave celledensiteter kan disse celler således anvendes ved en effektiv proces til TCE-nedbrydning.

I DK 175623 B1 I

I 32 I

I Eksempel 7 I

I Metabolisme af 14C-TCE. I

I 5 For at bestemme metabolismen af 14C-TCE frem- I

I kaldt af PmKRl-toluen-monooxygenase-genprodukter blev I

I PmKRl-celler, PmY4001-celler og HBlOl-celler indehol- I

I dende pMY402 dyrket som i eksempel 1 og inkuberet som I

beskrevet i afsnit 1 i eksempel 2. Inkuberingen blev I

I 10 foretaget i 16 til 18 timer ved 30 C. Omdannelse af I

I 14C-TCE til 14C02, 14C i cellemasse og 14C i vækstme- I

I dium måltes som beskrevet i Nelson et al., Appl. Bnvl- I

I ron. Micro. £3:949-954 (1987), og Spain og Nishino, I

I Appln. Environ. Micro. 53:1010-1019 (1987). I

I 15 Kort beskrevet blev mediet efter inkuberings- I

I perioden syrnet med 100 yl 2N svovlsyre. 14C02 udrense- I

I des fra den vandige fase ved at stikke en luftledning I

I ned i flasken og boble luft gennem i et tidsrum på l I

I til 2 timer, idet man frigav og dirigerede den 14C02- I

20 holdige luft gennem en anden ledning til et rørglas in- I

I deholdende 5 ml IN natriumhydroxid. Radioaktiviteten i I

I 0,5 ml af natriumhydroxidopløsningen bestemtes, og pro- I

centmængden af 14c som C02 i 5 ml prøven beregnedes i I

I Efter fjernelse, af 14C02 som netop beskrevet fjernedes I

I ^5 en 1 ml delmængde af cellesuspensionen, og radioakti- I

vlteten af cellesuspensionen bestemtes. Den tilbagevæ- I

I rende suspension af medium og celler fjernedes fra fla- I

I sken og centrifugeredes til pelletering af cellerne, og I

I supernatanten passeredes gennem et 0,2 μ filter. Radio- I

I 30 aktiviteten af en 50 yl delmængde af filtratet bestem- I

I tes, og procentmængden af 14C i mediet beregnedes. For- I

skellen mellem radioaktiviteten 1 cellesuspensionen og I

I filtratet blev taget som den i cellemassen tilstedevæ- I

33 DK 175623 B1 rende radioaktivitet. Alternativt kunne 14c i cellemassen tælles direkte ved at resuspendere cellepelleten og underkaste en delmængde af de resuspenderede celler tælling. Resultaterne af et repræsentativt forsøg under 5 anvendelse af PmKRl-, PmY4001- og HB101/pMY402-celler er sammenfattet i tabel 4.

Tabel 4 14C-TCE-Metabolisme 10 %14C som %14C i %14C i

Stamme C02 cellemasse medium P^_ mendoclna KR-1 34 12 32 P. mendoclna Y4001 159 HB101/pMY402 18 14 39 15 (+IPTG) HB101/pMY402 4 4 13 (-IPTG) ved andre forsøg dyrkedes PmKRl-, PmY4001-, 20 FM5/PKY287- og FM5/pCFMll46-celler som i eksempel 1 og inkuberedes derefter med 14C-TCE. Reaktionen med 14c-TCE udførtes som beskrevet ovenfor, bortset fra at: (i) 14C02 udrensedes fra den vandige fase og opfangedes i 20 ml 1 N natriumhydroxid, og (ii) 1,2 ml 1 M BaCl2 25 sattes til 5 ml af 20 ml natriumhydroxidopløsningen til udfældning af 14C02‘et. Den fremkomne udfældning analyseredes for 14C sammen med en delmængde af superna-tanten. Resultaterne er sammenfattet i tabel 5. Næsten alt 14C'et, der var til stede i 1 N natriumhydroxidop-30 løsningen, blev udfældet ved hjælp af BaCl2, hvilket bekræftede, at det tilstedeværende 14C var 14C02.

I DK 175623 B1 I 34 I Tabel 5 I *4C-TCE-Metabolisme I %14C som %14C i %14C i I Stamme C02 cellemasse medium I 5 P. mendoclna KR-l 32 31 31 ;

Pj. mendoclna Y4001 <1 12 I FM5/pKY287 45 18 39 I FM5/pCFM1146 <1 12 I 10 For yderligere at analysere hvilke metabolit- I ter, der var til stede i cellemediet, blev hver celle- I mediumfraktion i tabel 5 behandlet som følger. Tre drå- H ber af 45% KOH sattes til de 10 ml cellemedium indehol- I dende 14C-mærkede vandopløselige metabolitter for at I 15 bringe opløsningens pH på 11-12. Denne opløsning lyo- I filiseredes i 16-18 timer til et slutrumfang på 0,4- 0,6 ml med 60-70%. genvinding af 14C-mærket materiale.

Det koncentrerede materiale analyseredes ved højtryks- I væskechromatografi (HPLC) under anvendelse af en Aminex I 20 ioneksklusionskolonne (Bio-Rad) og 0,01 N H2S04 som I elueringsmiddel. Fraktioner på 0,6 ml opsamledes, og I 14C'et i 0,2 ml af hver fraktion bestemtes som vist i I fig. 5 og 6. Identificeringen af de 14C-mærkede pro- I dukter bestemtes ved at sammenligne HPLC-elueringsti- 25 derne med elueringstiderne for umærkede standarder, som vist i fig. 5 og 6. De anvendte standarder var mono- I chloreddikesyre, dichloreddikesyre, glyoxylsyree og myresyre.

I En sammenfatning af de 14C-metaboliske produkter I 30 fra TCE-nedbrydning fremkaldt af PmKRl-celler (fig. 5) I og FM5/pKY287-celler (fig. 6) er angivet i tabel 6.

DK 175623 B1 I

35 I

Tabel 6 I

Analyse af cellemedium for TCE-nedbrydningsprodukter I

%14C i cellemedium I

Forbindelse PtnKRl FM5/pKY287 I

5 Dichloreddikesyre 9 5 I

Glyoxylsyre 64 71 I

Myresyre 16 15 I

Uidentificeret forbindelse 11 10 I

10 Af det totale 14C-TCE sat til PmKRl- eller FM5/pKY287- I

cellerne (bemærk at ca. 30-40% af det totale 14C blev I

fundet i cellemediumf rakt ionen) blev ca. 3-5% af det I

totale 14C identificeret som en chloreret forbindelse, I

dichloreddikesyre. Resten af 14C-radioaktiviteten ud- I

15 vandtes som C02 (-30-45%), uskadelige cellebestanddele I

I i cellemassen (-18-35%), eller overvejende ikke-chlore- I

I rede vandopløselige komponenter. I

I Eksempel 8 I

I 20 I

I Dechlorering af TCE I

I Dette eksempel beskriver en assay, som måler I

I frigørelsen af chloridioner fra TCE fremkaldt af I

I 25 PmKRl-celler eller mikroorganisme-værtsceller indehol- I

I dende et rekombinant plasmid med PmKRl-toluen-monooxy- I genase-gener.

I PmKRl- og FM5/pKY287-celler dyrkedes som beskre- I vet i eksempel 1. Efter cellevækst centrifugeredes bak- I 30 teriekulturerne ved 5000 o/min i 5 minutter, vækstme- I diet bortkastedes, og de pelleterede celler resuspen- I deredes i 15 ml 0,1 M kaliumphosphat, pH 7,0, centri- I fugeredes igen og resuspenderedes i 15 ml 0,1 M kalium- I DK 175623 B1 I 36 I phosphat, pH 7,0. Cellerne fortyndedes med den samme I puffer til en od550 på 0,8 og et slutrumfang på 10 ml.

Til PmKRl-cellesuspensionen sattes toluen til en slut- I koncentration på 1 mM. Til FM5/pKY287-cellesuspensionen I 5 sattes glucose til en slutkoncentration på 0,2% og ka- I namycin til en slutkoncentration på 50 pg/ml. Flasker- I ne lukkedes med kapsel, og TCE tilsattes ved hjælp af I en sprøjte til en slutkoncentration på 40 μΜ (5,2 ppm).

I Inkubering blev foretaget ved 30 C i 5-18 timer, og I 10 omfanget af TCE-nedbrydningen bestemtes ved gaschroma- I tografi.

I Efter at TCE*et var nedbrudt, centrifugeredes cellerne i 5 minutter, og supernatanterne passeredes I gennem et 0,2 μ filter. Chloridionkoncentrationerne i I 15 supernatanterne bestemtes med et Orion EA 920 ionmeter I under anvendelse af en model 94-17B chloridelektrode og I en model 90-02 referenceelektrode, begge fra Orion. En

I kalibreringskurve fra 20 μΜ KCl til 200 μΜ KCl i 0,1 M

I kaliumphosphat, pH 7,0, fastlagdes ved at sætte lige I 20 store delmængder KCl til en baggrundskontrolprøve

I (PmKRl- eller FM5/pKY287-celler i 0,1 M KP04 uden noget I

TCE tilsat). Chloridionkoncentrationer i prøver inde-

I holdende TCE bestemtes ud fra denne kurve. I

I Resultaterne viste, at 2,5 mol chloridioner blev

I 25 frigjort pr. mol TCE ved anvendelse af inducerede I

I PmKRl-celler, og 2,7 mol chloridioner blev frigjort pr. I

mol TCE ved anvendelse af inducerede FM5-celler inde- I

I holdende pKY287. I

DK 175623 B1 37

Eksempel 9 TCE-Nedbrydende evne og toluen-monooxygenase-aktivitet A. Toluen-monooxygenase-assay ved høje celledensiteter 5 og korrelation med TCE-nedbrydning.

Til disse assays dyrkedes celler i PAS-medium indeholdende 0,4% glutamat eller i L-broth til mætning. FM5-Cellerne dyrkedes imidlertid som beskrevet i eksem-

O

10 pel 6, bortset fra at cellerne induceredes ved 42 C i 3 timer og derefter bragtes tilbage til 30°C i 2 timer. Cellerne resuspenderedes i et passende rumfang af det samme medium til en ODggø på 3,0. En delmængde af cellerne anvendtes til bestemmelse af totalt celleprotein 15 som beskrevet i eksempel 6. En delmængde på 0,5 ml af cellerne blandedes med 4 ymol p-cresol i 10 μΐ og 15 nmol radioaktivt toluen (toluen-ring-14C, Sigma Chemical Co. , 56,3 mci/nmol) i 5 vi, og blandingen inkuberedes ved stuetemperatur med lejlighedsvis omhvirvlning 20 i 20 minutter. Efter inkubering anbragtes 20 μΐ af blandingen som en plet på et lille stykke af en tyndt-lagschromatografiplade, og pladen lufttørredes i 20 minutter. Den på filteret tilbageblevne ikke-flygtige radioaktivitet bestemtes i en væskescintillationstæller 25 og anvendtes til at beregne mængden af toluennedbrydningsprodukt på pladen og den specifikke aktivitet af toluen-monooxygenase.

Tabel 7 sammenfatter resultaterne af den ovenfor beskrevne assay ved høj celledensitet for flere for-3° skellige stammer, der også afprøvedes for TCE-nedbry-dende evne. Tabel 7 viser også korrelationen mellem TCE-nedbrydende evne og toluen-monooxygenase-aktivitet I DK 175623 B1 I 38

(TMO-aktivitet). Specielt viser tabel 7, at under be- I

tingelser med høj celledensitet udviser HBlOl-cellerne I

Indeholdende pMY402, og FM5-cellerne indeholdende I

pKY287, niveauer af PmKRl-toluen-monooxygenase-enzym- I

5 aktivitet, der er ca. 2 til 4 gange højere end for I

vildtype PmKRl-celler. Disse samme to genetisk manipu- I

lerede værtsceller udviser overlegne egenskaber med I

I hensyn til at nedbryde TCE som godtgjort ved en mere I

B vedvarende nedbrydningshastighed og et forøget omfang I

B 10 af nedbrydning ved højere TCE-koncentrationer i forhold I

B til vildtype PmKRl-celler. Dette er belyst i fig. 7 og I

B 8 for HBlOl-celler indeholdende pMY402 induceret med I

B IPTG (uudfyldte cirkler) i sammenligning med vildtype |

B PmKRl-celler^ (uudfyldte trekanter) og er desuden vist I

B 15 i fig. 8 for FM5/pKY287-celler (udfyldte kvadrater). I

B Forøget enzymaktivitet under de ovenfor beskrevne be- I

B tingelser korrelerer således med forøget evne til at I

B nedbryde TCE som belyst ved hjælp af fig 8 og tabel 7. I

DK 175623 B1 39

Tabel 7 TCE-Nedbrydning og toluen-monooxygenase-aktivitet ved høje celledensiteter 5

Enheder af TCE- TMO-aktivi- nedbryd-

Plasmld Inducer Vært tet1_ Vektor ninq pAUTl Toluen PmKRl 0,130 — + 10 pAUTl Ingen PmKRl 0,010 pMY402 Ingen E.coli 0,005 ρΜΜΒββΕΗ HB101 pMY402 IPTG E.COll 0,200 pMMB66EH + HB101 15 pKY287 Temp E.coli 0,500 pCFM1146 + PM 5 pCFM1146 Temp E.coli 0,005 PM5 pMMB66EH IPTG E.coli 0,005 20 HB101 Én enhed TMO-aktivitet udtrykkes som 1 nmol 14C-to-tuen omdannet til ikke-flygtigt materiale pr. minut pr. mg helcelleprotein.

25

Foruden de i tabel 7 anførte plasmider, der indeholder PmKRl-toluen-monooxygenase-gener, vil andre plasmider, der indeholder disse gener, herunder pKY277, pKY280, pKY281, pKY282, pMY401 og pMY404 som beskrevet 30 i beskrivelsen til US patentansøgning nr. 177.631 (indleveret 5. april 1988 og inkorporeret heri gennem henvisning dertil), være egnede til TCE-nedbrydning.

I DK 175623 B1 40 i

I B. Toluen-monooxygenase-assay ved lavere celledensite- I

I ter og korrelation med TCE-nedbrydning. I

I Celler dyrkedes som beskrevet i eksempel 6. Cel- I

I 5 lekulturerne centrifugeredes og resuspenderedes i PAS- I

I medium eller PAS-medium indeholdende 0,2% glucose til I

I en OD55q på 0,5. Toluen-monooxygenase-assayen udførtes I

I som beskrevet i del A ovenfor, bortset fra at inkube- I

I ringstiden med 14C-toluenet var 5 minutter, ikke 20 mi- I

10 nutter. I

I tabel 8 er sammenfattet resultaterne af den I

I ovenfor beskrevne assay ved lavere celledensiteter for I

stammer, der også afprøvedes for TCE-nedbrydende evne. I

I Tabel 8 viser også korrelationen mellem TCE-nedbrydende I

15 evne og toluen-monooxygenase-aktivitet (TMO-aktivitet). I

I I modsætning til de ved højere celledensiteter opnåede I

I resultater som anført i tabel 7 viser tabel 8, at under I

I betingelser med lavere celledensitet udviser HBlOl-cel- I

I lerne, der indeholder pMY402, og FM5-cellerne, der in- I

20 deholder pKY287, niveauer af PmKRl-toluen-monooxygena- I

I se-enzymaktivitet, der er lavere end for vildtype I

I PmKRl-celler. I

> DK 175623 B1 41

Tabel 8 TCE-Nedbrydning og toluen-monooxygenase-aktivitet ved lavere celledensitet.

5 Enheder af TMO-aktivi- TCE-ned-

Plasmld Inducer Vært tet_ Vektor brydning pAUTl Toluen PmKRl 8,35 - + pAUTl Ingen PmKRl 0,08 -

ίο PMY402 Ingen E.coll 0,01 pMMB66EH

HB101 pMY402 IPTG E.coll 0,72 pMMB66EH + HB101 pKY287 Temp E.coll 1,29 pCFM1146 + 15 FM5 pKY287 Ingen E.coll 0,12 pCFM1146 FM5 pCFM1146 Temp E.coll 0,05 FM 5 20 PMMB66EH IPTG E.coll <0,01 - HB101 * Én enhed TMO-aktivitet udtrykkes som 1 nmol 14C-to-luen omdannet til ikke-flygtigt materiale pr. minut 25 pr. mg helcelleprotein.

Ved genetisk manipulering af PmKRl-toluen-mono-oxygenase-generne, således at de bragtes under kontrol af forskellige promotorer, opnåede man forøgede eks-30 pressionsniveauer med hensyn til PmKRl-toluen-monooxy-genase-genprodukter og samtidig en forøgelse i TCE-nedbrydende evne.

Under betingelser, hvor PmKRl-celler inkuberes med mindst et 40 ganges overskud af toluen i forhold I DK 175623 B1 I 42

I til TCE, er der blevet observeret en latenstid på flere I

I timer, før PmKRl-cellerne begynder at nedbryde TCE

I (fig. 7, uudfyldte trekanter). Dette skyldes, at toluen I

og TCE er cosubstrater for PmKRl-toluen-monooxygenase, I

I 5 og begge konkurrerer om de disponible PmKRl-toluen- I

I monooxygenase-enzymer. Når toluen og TCE er til stede I

I samtidig, og toluen er til stede i overskudskoncentra- I

I tioner sammenlignet med TCE, vil PmKRl-cellerne derfor I

I først begynde at nedbryde TCE, efter at toluenkoncen- I

I 10 trationen er blevet betydeligt formindsket. Denne samme I

I latensperiode ses ikke, når PmKRl-cellerne først indu- I

I ceres med toluen, og toluenet derefter fjernes før til- I

I sætning af TCE (fig. 2). Ved kloning af PmKRl-toluen- I

I monoxygenase-generne og anbringelse af dem under kon- I

15 trol af promotorer, der ikke er induceret af toluen, I

I er det netop beskrevne cosubstratproblem blevet elimi- I

I neret. I

Det må forventes, at mange andre promotorsyste- I

I mer end de heri beskrevne toluen-inducerbare, IPTG-in- I

I 20 ducerbare og temperatur-inducerbare promotorer vil være I egnede til forøget toluen-monooxygenase-ekspression og I således forøget TCE-nedbrydning. Desuden må det forven- I tes, at mange andre typer plasmid-vektorer og mikroor- I ganisme-værtsceller vil være egnede til PmKRl-toluen- j I 25 monooxygenase-ekspresion og TCE-nedbrydning. Opfindel- I sen som sådan skal derfor ikke betragtes som begrænset I af de ovenfor beskrevne eksempelvise udførelsesformer.

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til mikrobiel nedbrydning af trichlorethylen, kendetegnet ved, at man behandler trichlorethylen med en mikroorganismevært 5 valgt fra gruppen bestående af coli JM109, JM83, HB101 og FM5, hvor mikroorganismeværten indeolder en rekombinant plasmid, der er i stand til at udtrykke toluen-monooxygenase-gener fra Pseudomonas mendocina KR-1 og ekspression af de nævnte gener styres af en 10 inducer.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det rekombinante plasmid er valgt fra gruppen bestående af pKY277, pKY280, pKY281 og pKY282, og at induceren er toluen.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kende tegnet, ved, at det rekombinante plasmid er pMY402, pMY405, pMY401 eller pMY404, og at induceren er isopropyl-/?-D-thiogalactopyranosid.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kende-20 tegnet ved, at at induceren er en temperaturændring op til 42°C.

5. Anvendelse af fremgangsmåden ifølge kravene 1-4 til nedbrydning af trichlorethylen i kemisk affald.

6. Anvendelse ifølge krav 5,, hvor det kemiske affald er til stede i grundvand.

7. Anvendelse ifølge krav 5, hvor det kemiske affald er til stede i drikkevand.

8. Anvendelse ifølge krav 5, hvor det kemiske 30 affald er til stede i spildevand.

9. Anvendelse ifølge krav 5, hvor det kemiske affald er til stede i en opfyldning. I DK 175623 B1 I I 44 I

10. Anvendelse ifølge krav 5, hvor det kemiske I I affald er til stede i jordbund. I