PT89063B

PT89063B - Processo para a preparacao de profarmacos derivados de dissulfureto-benzilcarbamatos e dissulfureto-benzilcarbonatos com avtividade anti-tumoral

Info

Publication number: PT89063B
Application number: PT89063A
Authority: PT
Inventors: Peter D Senter
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1987-11-23
Filing date: 1988-11-23
Publication date: 1993-03-31
Also published as: NO885200D0; JPH01165586A; KR910007977B1; FI885360A0; NZ226956A; KR890007725A; EP0317956A2; FI885360A; NO169959C; DK651188D0; DK651188A; AU2582688A; EP0317956A3; NO169959B; NO885200L; IL88427A0; AU605648B2; ZA886812B; PT89063A

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PROFÁRMACOS DERIVADOS DE DISSULFURETO-BENZILCARBAMATOS E DISSULFURETO-BENZIL-CARBONATOS

COM ACTIVIDADE ANTI-TUMORAL

REFERENCIAS CRUZADAS

O presente pedido de patente de invenção está relacionado com o pedido de patente de invenção intitulado Drug-Monoclonal Antibody Conjugates de Peter D. Senter como responsável por este pedido de patente de invenção e requerido concorrentemente com o presente pedido de patente de invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a profármacos anti-tumorais que constituem uma forma de fármacos anti-tumorais sus. ceptíveis de se modificarem num hospedeiro de forma a liberta, rem o farmaco sob a forma livre e activa. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a a) derivados de dissulfu reto benzilcarbamato de fármacos anti-tumorais de aminas primárias e secundárias e b) derivados de dissulfureto benzilcarbonato de fármacos anti-tumorais que contêm grupos hidróxilos que são susceptíveis de suportar cisão redutora do radical dissulfureto e subsequente fragmentaçao química de modo a libertarem o fármaco sob a forma livre e activa.

2Técnica relacionada

Uma quantidade considerável de investigações em anos anteriores, focou-se no desenvolvimento de agentes anti-tumorais que possuem alto grau de selectividade para o tecido tumoral versus tecido normal. Concorrentemente, a principal limitação na utilização de agentes quimio-terapêuticos consiste na toxicidade limitativa da dose. Uma via para ultrapassar es. te problema, tem sido projectar fármacos que exploram as dife. renças entre as células normais e as células neoplásicas (1).

Tem sido verificado que frequentemente os tumores sólidos apresentam uma vasculizaçao inadequada e podem existir em condiçoes de deficiência de oxigénio ou em estados hi póxicos (2, 3). Além disso, níveis elevados de agentes redutores, tais como NADH, NADPH e glutationa têm sido associados com linhas de células tumorais (4-6). Estas observações têm impulsionado a investigação no sentido do desenvolvimento e compreensão de fármacos anti-cancro activados por via bio-redu. tora que sao susceptíveis de evidenciarem actividade reforçada sob condiçoes hipóxicas (2, 3, 7). Agentes citotóxicos que sao activados de preferência num ambiente redutor das células tumorais podem ser considerados com valor terapêutico.

RESUMO DA PRESENTE INVENÇÃO

Descobriu-se uma nova estratégia de libertação de fármacos em que agentes de redução moderada sao susceptíveis de efectuar a eliminação de fármacos que contêm grupos amina provenientes de derivados de farmacos de dissulfureto de benzilcarbamato. Uma série de a) profármacos de dissulf ureto-beii zilcarbamatos de fármaco anti-tumor incorporando grupos amina primária ou amina secundária, e b) derivados de dissulfureto benzilcarbonato de fármacos anti-tumorais contendo grupos hidroxilo foram concebidos e investigados para determinação da citotoxicidade in vitro sobre linhas de células tumorais huma nas e da actividade sobre murganhos com formações tumorais.

Descrição das figuras

Fig. 1 - representa a síntese de um modelo de dissulfureto de benzilcarbamato.

Fig. 2 - representa o esquema de eliminação de p-nitro-anil£ na após tratamento do derivado anilido de benzilcarbamato com ditiotreitol.

Fig. 3 - representa uma série de derivados de mitomicina e daunomicina sob a forma de profármacos de acordo com a presen, te invenção.

Nos Exemplos e Quadros, os compostos enumerados referem-se aos compostos que correspondem aos indicados nas Figuras .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a profármacos anti-tii morais de fórmula de estrutura geral

D^^C^0

S - S - R₃ (Pouf-)

I

-4fr ·' na qual

D representa ura radical de um fármaco anti-tumoral com portando na sua estrutura principal um grupo funcio. nal quimicamente reactivo que permite a ligação des_ sa estrutura ao grupo dissulfureto-benziloxi-carbonilo que deriva de um grupo amina primária, representado pela fórmula geral R^NH-, na qual R^ representa a estrutura principal do radical do referido fármaco; um grupo amina secundária, representado pe. la fórmula geral R^Ry^-, na qual R^ tem o significa do definido antes e R^ representa, independentemente do símbolo R^, grupos alquilo de cadeia linear ou ramificada com 1 a 10 átomos de carbono e, eventual mente, substituinte(s) escolhidos entre 1 a 3 grupos alcoxi comportando 1 a 3 átomos de carbono e 1 a 3 átomos de halogéneo, grupos fenilo comportando, eventualmente, substituinte(s) escolhidos entre 1 a 3 grupos alquilo com 1 a 3 átomos de carbono, 1 a 3 grupos alcoxi comportando 1 a 3 átomos de carbono e 1 a 3 átomos de halogéneo, e um grupo fenilalquilo, comportando, eventualmente, um substituinte, caso em que o grupo fenilo tem o significado definido antes para o grupo fenilo substituído e o grupo alquilo representa um grupo polialquilénico comportando 1 a 3 átomos de carbono, ou R·^ e R£ representam, considerados conjuntamente, a estrutura principal do ra dical do fármaco representada pelo símbolo D, citado antes, comportando um grupo divalente ligado por via química ao átomo de azoto que integra o grupo amina secundária; ou um grupo álcool representado pela fórmula geral R^O-, na qual tem o significa, do definido antes; e

R^ representa um grupo funcional orgânico, compatível com a ligaçao dissulfureto e com 0 radical do fármaco representado por D, escolhido entre 0 grupo constituído por um grupo alquilo, de cadeia linear ou ramificada, comportando 1 a 10 átomos de carbono e, eventualmente, substituinte(s), caso em que 0 gr.u po alquilo tem o significado definido antes para o grupo alquilo substituído, fenilo e fenilalquilo,eventualmente substituídos, caso em que o grupo feni. lo tem o significado definido antes para o grupo fe. nilo substituído e 0 grupo alquilo, representa um grupo polialquilénico, comportando 1 a 3 átomos de carbono, um grupo heteroarilo, eventualmente substi^ tuído, escolhido entre um grupo piridilo eventualmen. te substituído, um grupo naftiridilo, quinolilo, is£ quinolilo e indolilo ou um grupo heterocíclico,eventualmente substituído, escolhido entre um grupo cons. tituído por pirrolilo, pirrolidilo, imidazolilo, imi. dazolidilo, piperidilo, morfolilo, furilo e tienilo, sendo os referido(s) substituinte(s) do referido grti po alquilo escolhidos entre 1 a 3 átomos de halogéneo e comportando 0 referido grupo fenilo dos grupos fenilalquilo, heteroarilo ou heterocíclico substitu. intes escolhidos entre 1 a 3 grupos alquilo com 1 a 3

-6atomos de carbono ou alcoxi comportando 1 a 3 átomos de carbono e 1 a 3 átomos de halogéneo, sendo a ori. entaçao do grupo representada pela fórmula geral -S-S-Rg no núcleo fenílico do radical benzilcarbama^ to escolhida entre as posiçoes orto- e para-. Fármacos que contêm grupos amino representativos sao a mitomicina-C, mitomicina-A, daunomicina, adriamicina, amino. pterina, actinomicina, bleomicina e seus derivados; e um fármaco representativo dos referidos fármacos que contêm grupo al. cool é o etoposido.

As abreviaturas utilizadas são as seguintes: MMC, ini tomicina-C; MMA, mitomicina-A; DAU, daunomicina; PBS, solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato; T/C, tempo de sobre, vivência médio de murganhos tratados com fármaco (T) dividido pelo tempo de sobrevivência medio de murganhos de controlo com tumores (C) x 100; i.p., via intraperitoneal; i.v., via endovenosa; HPLC, cromatografia líquida de alta resolução; DDT, ditiotreitol; PNA, p-nitro-anilina.

A designação profármaco é utilizada neste pedido de patente de invenção referindo-se a um precursor ou uma forma derivada de uma substância activa do ponto de vista farmacêutico que é menos citotóxica para células tumorais comparativamente com o farmaco inicial e que e capaz de ser activada por via enzimática ou convertida na forma inicial mais activa (ver, e.g., D.E.V. Wilman, Prodrugs In Câncer Chemotherapy, Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382 (615th Meet. ing, Belfast 1986) and V.J. Stella et al., Prodrugs: A Cheini cal Approach to Targeted Drug Delivery,

Directed Drug Delive-7- ι ry, R. Borchardt et al. (ed), pp. 247-267 (Humana Press 1985)].

Num outro aspecto da presente invenção, descreve-se um método para a libertação, no local dos tumores solidos de um animal mamífero que apresente níveis reforçados de agentes de redução endógenos, incluindo, pelo menos, um membro de um grupo constituído por NADH, NADFH e por glutationa, um fármaco anti-tumor activo, comportando na sua estrutura principal um grupo funcional quimicamente reactivo escolhido entre grupo constituído por um grupo amina primaria representado pela fórmula geral R^NH-, com um grupo amina secundária representa, do pela fórmula geral e um grupo álcool representado pe.

la formula geral R^O em que R^ e R£ têm os significados definidos antes e que compreendem as fases seguintes;

a) administraçao a um animal mamífero de uma quantidade anti-tumoral eficaz do fármaco anti-tumoral com a fórmula geral I;

b) contacto do profármaco anti-tumoral obtido na fa. se a) com as condiçoes de redução endógenas, e

c) possibilidade de cisão redutora do fármaco anti. -tumoral para que liberte o fármaco sob a forma livre a partir do composto profármaco.

Os compostos profármaco de acordo com a presente in. venção podem ser proporcionados para utilizar de acordo com o método desta invenção para tratar um hospedeiro, particularmente um hospedeiro mamífero tal como, p. ex., um hospedeiro animal de experiência afectado por um tumor maligno, sob a forma de uma composição farmacêutica. As composiçoes farmacêii ticas incorporam uma quantidade eficazanti-tumoral, isto é,

uma quantidade que inibe o desenvolvimento de um tumor, do pro. farmaco de acordo com esta invenção, e um veículo aceitável em farmácia e eventualmente excipientes convencionais e adjuvantes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.

Um veículo farmacêutico pode ser uma forma sólida ou líquida para proporcionar condiçoes sólidas ou líquidas. Afor ma de composição sólida apropriada para administraçao oral in. clui pos, comprimidos, cápsulas, comprimidos oblongos, grânulos dispersíveis e hóstias. Veículos sólidos apropriados incluem, pelo menos, uma substância que pode funcionar somente como um veículo ou pode, além disso, desempenhar ainda uma fun çao tal como um solvente, um agente apaladante, um agente solubilizante, um agente lubrificante, um agente de suspensão, um agente ligante, um agente de desagregaçao de comprimidos, um agente para encapsulaçao e outros. Os veículos sólidos iner. tes sao, apenas para nomear alguns, carbonato de magnésio, es tearato de magnésio, talco, açúcar, lactose, pectina, dextrina, amidos, gelatina, materiais celulósicos e outros. Os compostos de acordo com a presente invenção também podem ser for. necidos sob a forma de compostos solúveis estéreis ou composi. çoes que incluem soluçoes, suspensões e emulsões, que podem ser dissolvidas em água estéril ou outro meio líquido para ad. ministraçao oral ou para administraçao parentêrica. Exemplos de veículos líquidos apropriados para administraçao oral incluem a água, álcool, polipropileno glicol, polietileno glicol e misturas de dois ou mais dos veículos referidos anterior^ mente. Exemplos de veículos líquidos apropriados para adminis. tração parentêrica, incluem a água para injectáveis, solução

-9de cloreto de sódio fisiológico e outros meios estéreis apropriados para injectar. Tampões apropriados para utilizar com veículos líquidos para proporcionar, de um modo geral, uma so luçao isotónica tamponada apropriada, incluem o ortofosfato trissódico, bicarbonato de sódio, citrato de sódio, N-metilglucamina, L(+)-lisina e L(+)-arginina para apenas referir al_ guns agentes tampao representativos.

As composiçoes farmacêuticas poderão conter uma quaii tidade de, pelo menos, um composto de fórmula geral I ou uma mistura de um ou mais dos referidos compostos ou ainda uma sua mistura com outros agentesanti-tumorais. A quantidade eficaz anti-tumoral do composto de fórmula geral I pode variar ou ser facilmente corrigida dependendo da aplicação particular a que se destina, a forma, a potência do composto particular utilizado e a concentração desejada do composto na composição. De um modo geral, a quantidade de componente activo poderá variar entre cerca de 0,5 a 90% em peso do total do peso da compo sição.

Na utilização terapêutica para o tratamento de um hospedeiro mamífero, p. ex. um animal de experiência portador de um tumor maligno, o composto da presente invenção pode ser administrado numa quantidade eficaz para inibir o desenvolvimento do tumor, isto é, uma quantidade de dose que iniba o dj2 senvolvimento tumoral. De um modo geral, a quantidade que inibe o desenvolvimento do tumor poderá variar entre cerca de 10,1 e cerca de 15 mg por quilograma de peso do animal e por dia. Deve entender-se que a dose actualmente preferida do com posto poderá variar largamente, dependendo das necessidades do

-10animal a ser tratado, da composição a utilizar e da via de ad. ministraçao. Muitos factores que modificam a acçao do agente anti-neoplásico têm que ser considerados pelos especialistas na técnica a que esta invenção se refere, incluindo, p. ex., id£ de, massa corporal e sexo do animal hospedeiro; dieta, tempo de administração, velocidade de excreção, condiçoes do hospedei, ro, gravidade da doença e outros. A administraçao pode realizar-se simultaneamente ou periodicamente com a dose máxima to. lerada. As proporçoes óptimas a administrar (ou a aplicar) re lativamente a um dado conjunto de condiçoes, podem ser facilmente determinadas pelos técnicos utilizando ensaios de deter, minaçao de dose convencionais.

Os exemplos que se seguem são ilustrativos do âmbito e utilidade da presente invenção e nao foram construídos co mo limitantes do seu âmbito. A menos que especificado de outro modo, todas as partes e percentagens sao referidas em peso e as temperaturas em graus Celsius. Como se referiu antes, nos Exemplos e Quadros seguintes os compostos enumerados referem-se aos compostos que correspondem aos indicados nas Figuras.

MATERIAL E MÉTODOS

Linhas de células

HSB2 (células T de leucemia humana) e Namalwa (Burkitts lymphonia) foram obtidas da American Type Culture Collection (Gaitesburg MD), As células desenvolveram-se em meio

RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal a 10%, penicili. . - o na e estreptomicma a temperatura de 37 C em atmosfera húmida com 5% de anidrido carbónico.

-11-/

Ensaio de incorporação de H-timidina

Avaliou-se a citotoxicidade de derivados da mitomicina e daunomicina pela inibição da síntese de DNA. Fizeram-se diluições em série em PBS de fármacos e adicionaram-se a cada cavidade 100 /Al contendo 1 x 10^ células. As células fo» o ram incubadas durante uma hora a temperatura de 37 C, lavadas duas vezes e postas de novo em suspensão em 200 /Al de meio de cultura. Após incubaçao à temperatura de 37° C durante 19 horas adicionaram-se 50 /*1 de ly^> Ci [6-^H]-timidina (New England Nuclear, 15 Ci/mmole) em cada cavidade e incubaram-se durante 4 horas à temperatura de 37° C. As células foram trans. feridas para placas microtiluladoras Millipore e precipitadas com ácido tricloro-acético arrefecido a 25% (TCA). Os precipi. tados foram lavados dez vezes com TCA arrefecido a 5%. Os fil tros foram secos, retirados e contados num fluido de cintilação de líquidos Econofluor (New England Nuclear). Todas as con tagens foram corrigidas por subtracçao de contagens antecederi tes .

Ensaios in vivo

Os ensaios de tumor in vivo foram realizados utilizando-se os métodos descritos detalhadamente numa anterior pu. blicaçao (8). Utilizaram-se células de leucemia linfática P-388 e células L-1210 para ensaios iniciais de derivados de mitomi. cina e daunomicina respectivamente. Os compostos escolhidos fjo ram ensaiados sobre células de melanoma B16 implantadas por via subcutânea com tratamento administrado por via endovenosa. Os parâmetros da experiência estão representados nas observa-12 çoes que acompanham o fim dos Quadros.

Métodos químicos

Determinaram-se pontos de fusão num aparelho de pon to de fusão Thomas-Hoover que nao foram corrigidos. Os espectros de ressonância magnética nuclear de todos os derivados fo. ram obtidos num aparelho Bruker WM 360 MHZ. Os espectros de ressonância magnética nuclear de rotina foram obtidos num apa. relho IBM NR 80 MHZ. Os espectros de infravermelhos foram determinados num espectrômetro de Nicolet 5 DX e espectros de ul travioletas invisíveis foram registados com aparelho Hewlett Packard 8450. Os álcoois orto, meta e para mercaptobenzílico (1-3) foram preparados de acordo com os processos de Grice e Owens (9).

Preparaçao de dissulfuretos mistos 4-7

Os cloretos de sulfenilo derivados de 2, :2’-ditiodi. piridina e de bis-(3-nitrofenil) dissulfureto foram preparados de acordo com o processo de Matsueda e Aiba (10). Todos os vestígios de dissolvente e cloro foram eliminados sob vácuo e os resíduos suspensos em dicloreto de metano para se obter uma concentração final O,1M. As soluçoes (O,1M, 0,9eq.) de 1 - 3 em cloreto de metano foram adicionadas num lote. Após 5 minutosà temperatura ambiente a mistura foi extraída com NaHCOg, solução de NaCl saturada e secos sob sulfato de magnésio (MgSO^). 0 produto foi purificado por cromatografia rápida utilizando-se como eluente acetato de etilo a 30% em éter vulgar.

3-nitrofenil-dissulfureto (4): rendimento 41%; P.F. 83-84° C; ^-NMR (CDCl₃)íl,75 (s-lH,0H), 4,68 (s,2H,ÇH₂0H),

-137,2-7,6 (q.4H,ArH).

Orto-2-piridil-dissulfureto (5): rendimento 64%;

P.F. 50-52° C; H-NMR (CDCip $4,60 (br d, 1H, OH), 4,90 (d,2H, ArCH₂), 7,0-7,8 (m,7H,ArH), 8,4-8,5 (m,lH,ArH).

Meta-2-piridil-dissulfureto (6): rendimento 86%; óleo amarelo; ^XH-NMR (CDCl₃)£l,8 (s,lH,0H), 4,65 (s , 2H,ArCH^, 6,9-7,8 (m,7H,ArH) 8,35-8,60 (m,lH,ArH).

Para-2-piridil-dissulfureto (7): rendimento 55%; óleo amarelo; ¹H-NMR (CDClg)£ 1,4-1,9 ( br s , ΙΗ,0H), 4,65 (s,2H,ArCH₂), 7,0-7,8 (m,7H,ArH), 8,3-8,6 (m,lH,ArH).

Processo geral para a preparaçao de carbamatos 12, 17-21, 24, 25. Preparaçao de 24

Uma solução de 137 mg (0,55 mmole) de álcool benzílico 5^ e 0,044 ml de piridina (0,55 mmole) em 1 ml de dioxano anidro, foi adicionada durante 3 minutos a uma solução agitada de 0,032 ml (0,275 mmole) de cloroformato de triclorometilo em 0,5 ml de dioxano. Após agitaçao durante 15 minutos adi. cionou-se rapidamente uma solução de 96 mg de MMA (0,275 mmole) e 0,153 ml (1,1 mmole) de trietilamina em 4 ml de dioxano. Após 5 minutos os solventes foram evaporados e extraíu-se uma solução do resíduo em cloreto de metano com solução saturada de bi. carbonato de sódio, cloreto de sódio e secou-se sobre sulfato de magnésio. 0 produto foi purificado por cromatografia rápi1 da sobre uma coluna de sílica de 2 x 20 cm, separando-se primeiro o material nao-polar com acetato de etilo em éter do pe.

tróleo a 30% (300 ml) e em seguida eluiu-se o carbamato com me.

tanol a 5% em clorofórmio. 0 produto obtido foi o produto 24, sob a forma dum sólido vermelho amorfo que se dissolveu em 3 ml de cloreto de metano e se adicionou gota a gota a 30 ml de éter dietílico. Obteve-se um produto sólido vermelho puro. (125 mg, rendimento de 73%): P.F. 148-150° C; ¹H-NMR (CDCip £ 1,80 (s,3H,CH₃), 3,2(s3H, 0CH₃), 3,3-3_t8 (m, 4H) , 4 .,05 ( s , 3H, 0CH₃), 4,95 (m,lH), 5,3 (ABq,2H,ArCH₂), 7,1-7,4 (m,4H,ArH),

7.5- 7,7 (m,3H,ArH), 8,47 (d,lH,ArH); IR (KBr),λ 3400,1570 cm^-1; uv/vis (CH₃0H) λmax nm (log £) 520 (3,01), 319 (4,03), 285 (3,95).

Aplicando substancialmente os processos descritos aii tes para o Exemplo 24, excepto na substituição do derivado ti£ fenol inicial e no fármaco indicado nas Figuras.

Dissulfureto de carbamato de benzilo 12: rendimento 41%,sólido amarelo; P.F. 158-160° C; ¹H-NMR (CDCip ^1,60 (s, ΙΗ,ΝΗ), 5,25 (s,2H,CH₂0H), 7,2-84 (m,12H,ArH); uv/vis /max 313 nm (log £ = 4,18).

MMC Carbamato de benzilo 17: rendimento 55%,pó azul; P.F. 100-101° C (lit 102-104° C) (11).

MMC Dissulfureto de carbamato de benzilo 18: rendimento 63%,pó azul; P.F. 96-98° C; ^XH-NMR (pyr-d₅) ζ 1.90 (s, 3H,CH₃), 3,07 (s,3H,0CH₃), 3,4-3,55 (m,2H), 3,8-4,05 (m,3H),

4.6- 5,0 (m,3H), 4,85 ( s , 3H) , 5,35-5,70 (m,3H), 6,8-7,7 (m,7H, ArH), 8,35 (d,lH,ArH); IR (KBr) ^ 3400, 1692, 1600, 1552 cm^-1; uv/vis (CH₃OH) X max 365 nm (log^ = 4,32).

MMC Dissulfureto de carbamato de benzilo 19: rendimento 98%,pó azul; P.F. 90-92°C; ^-NMR (pyr-d₅) £ 1,90 (s,3H,

CH₃), 3,05 (s,3H,CH₃), 3,3-3,5 (m,3H), 3,7 (m,2H), 3,9-4,0 (m,2H), 4,5-4,8 (m,3H), 4,80 (s,3H), 5,0-5,1 (m,2H), 5,50

(dd,2H,ArCH₂), 6,8-7,7 (m,7H,ArH), 8,3-8,4 (m,lH,ArH); IR (KBr) ^3400, 2920, 1690, 1600, 1550 cm’¹; uv/vis (CH₃0H) max 357 nm (log ê = 4»31).

MMC Dissulfureto de carbamato de benzilo 20: rendimento 92%,pó azul; P.F. 99°C(dec); ¹H-NMR (pyr-d₅) £ 1,95 (s,3H,CH₃), 3,15 (s,3H,0CH₃), 3,4-4.2 (m,6H),4,6-5,0 (m,2H), 5,20 (s,2H,ArCH₂), 5.6 (dd,1H),6.9-7.8 (m,7H,ArH), 8,35-8,5 (m,lH,ArH); IR (KBr) 0 3400, 2920, 1690, 1552 cm uv/vis (CHgOH)λ max 356 nm (log £ = 4,31).

MMC Dissulfureto de carbamato de benzilo 21: rendimento 70%,pó azul; P.F. 97-98° C; ^H-NMR (pyr-d^) & 1,85 (s,3H,CH₃), 3,03 (s,3H,QCH₃), 3,17 (m,2H), 3,65 (d,lH), 3,85-3,95 (m,lH), 4,55 (d,lH), 4,70 (t.lH), 5,0-5,1 (m,2H,ArCH^, 5,-5 (dd,lH), 7,-2-7,9 (m,7H), 8,30 (m, ΙΗ,ΑγΗ) ; IR (KBr) 3400, 2920, 2690, 1600, 1560, 1350 cm ; uv/vis (CH₃0H) X, max nm (log£) 356 (4,32), 242 (4,50).

MMA Dissulfureto de carbamato de benzilo 23: rendimento 43%,pó vermelho; P.F. 78-81° C; ^H-NMR (pyr-d^) & 1,83 (s,3H,CH₃), 3,05 (s,3H,0CH₃), 3,35 (m,2H), 3,7 (d,lH), 3,85 (s,3H,0CH₃),.3,9 (q,lH), 4,2 (d,lH), 4,6-4,9 (m,2H), 5,08 (s,2H,ArCH₂) , 5,46 (q,lH), 7,0-7,6 (m, 5H, ArH) ; IR (KBr)Ò 3400, 2900, 1735, 1580, 1280 cm^-1.

MMA Dissulfureto de carbamato de benzilo 25: rendimento 69%,pó vermelho; P.F. 73° C (dec); ^H-NMR (pyr-dç-)</ 1, 83 (s,3H,CH₃), 3,20 (s,3H,OCH₃), 3,.3-4,5 (m,6H), 4,0 (s,3H,0CH₃), 5,2 (s,2H,ArCH₂) , 6,9-7,7 (m,7H,ArH), 8,4-8,6 (d,lH,ArH); IR (KBr) \) 3400, 1690, 1580 cm uv/vis (CH₃OH) \j max nm (lo'g &) 520 (2,90), 3,9 (3,88), 285 (3,83).

-16- /

MMA Dissulfureto de carbamato de benzilo 26: Uma so lução de 11,3jxl (0,106 mmole) de para-fluorotiofenol em 1 ml de acetona foi adicionada a uma solução constituída por 65 mg (0,106 mmole) de 23 cm 3 ml de acetona durante um período de 3 minutos. Após 5 minutos, o solvente foi evaporado e o prodii to foi purificado por cromatografia em camada fina preparativa utilizando-se como eluente álcool metílico a 5% em clorofor. mio. 0 produto desejado foi recolhido, dissolvido em 2 ml de cloreto de metano e precipitado por adiçao gota a gota de 10 ml de éter dietílico. Obtiveram-se 26 mg (rendimento de 39%) dum pó vermelho; ponto de fusão 133-135° C; ^H-NMR (CDClg) 1,80 (s,3H,CH₃), 3,18 (s,3H,0CH₃), 3,30-3,70 (m,6H), 4,05 (s,3H,

0CH₃),4,2-4,3 (m,2H), 4,87-4,97 (q.lH), 5,1-5,25 (q,2H,ArCH₂), 6,95-7,05 (t,2H,ArH), 7,2-7,4 (m,5H,ArH), 7,60 (d,lH,ArH); IR (KBr)\)3400, 1690, 1580 cm^-1; uv/vis (CH₃0H)\max 338 nm.

MMA Dissulfureto de carbamato de benzilo 27: foi pre. parado de 25, como descrito na síntese de 26.. Rendimento de 39%, pó vermelho; P.F. 70°C; ¹H-NMR (pyr-d₅)^ 1.70 (s,3H,CH₃), 3,05 (s,3H,CH₃), 3,3-3,4 (m,2H), 3,7 (d,lH), 3,85 (s,3H,0CH₃), 3,80-4,0 (m,2H), 4,2 (d,lH), 4,7 (t,lH),5,05 (s,2H,ArCH₂) , 5,47 (m,lH), 6,8-7,0 (m,2H,ArH), 7,3-7,5 (m,2H,ArH),7,35 (2,4H,ArH); IR (KBr)

3400, 1690, 1580 cm \ uv/vis (CH₃0H)J^max 518, 319 nm.

PAU Carbamato de benzilo 29: Adicionaram-se 6,3/zl (44,3ytunoles) de cloroformato de benzilo a uma solução de 25 mg (44,3 ylunoles) de PAU em 1 ml de cloreto de metano contendo 12,4yWmoles (88,óyUmoles) de trietilamina. Após 2 minutos à temperatura ambiente á solução foi dividida entre ácido acéti.

co a 0,1% de pH4 e clorofórmio. A fase clorofórmica foi lava<33 da duas vezes com tampao de pH4 para eliminar qualquer quanti. dade de DAU nao reagida e, em seguida, com solução saturada de cloreto de sódio e seca sobre sulfato de magnésio. 0 produto foi obtido sob a forma de um sólido vermelho puro (24 mg, ren dimento de 82%) que se mostrou instável em gel de sílicazP.F.

60° C (dec); ^-NMR (CDCip £ 1,25 (d,3H,CHCH₃), 1,7-1,95 (m,3H), 2,05-2,15 (m,lH), 2,25-2,5 (m,2H), 2,40 (s,3H,C0CH₃),

3,1 (q,2H), 3,6-3,7 (d,lH), 3,8-4,0 (m,lH), 4,05 (s,3H,0CH₃), 4,15-4,3 (m,lH), 4,4-4,6 (m,lH), 5,03 (s , 2H, ArCHp , 5,05-5,50

J (m,3H), 7,1-7,5 (m,6H,ArH), 7,76 (t,lH,ArH), 8,05 (d,lH,ArH),

13,28 (s,lH,0H), 13,97 (s,lH,0H); IR (KBr)í> 3400, 1720 cm¹; uv/vis (CH₃0H) X, max nm (log £ ) 494 (4,11), 4,78 (4,11), 289 (3*96), 252 (4,45), 234 (4,59).

DAU Dissulfureto de carbamato de benzilo 30, preparado de DAU e Ί_ como descrito na síntese de 24. 0 produto foi purificado de acordo com a purificação de 29.. Rendimento 69%, pó vermelho; P.F. 75-78° C; ¹H-NMR (CDCip 1,25 (d,3H,

CHCH₃), 1,7-1,9 (m,2H), 2,05-2,37 (m,3H),2,40 (s,3H,CH₃), 3,10 (q,2H), 3,6-3,9 (m,2H), 4,08 (s,3H,0CH₃), 4,2 (d,lH), 4,4 (br s, 1H), 4,98 (s,2H,ArCH₂), 4,05-545 (m,3H), 7,0-7,65 (m,8H,

ArH), 7,77 (t,lH,ArH), 8,0 (d,lH,ArH), 8,4-8,45 (m,lH,ArH),

13,28 (s,lH,0H), 13,97 (s,lH,0H); IR (KBr) 3400, 2920, 1715 cm 1; uv/vis (CH₃0H) λ max nm (log £ ) 494 (3, 93), 476 (3,93),

289 (4,12), 252 (4,51), 233 (4,63).

Reacçao de MMC Dissulfureto de carbamato de benzilo 18-20 com ditiotreitol. A uma solução de 83/17 de álcool meti, lico/água à temperatura de 30° C contendo os compostos 18, 19 ou 20 (0,81 mM), tampao tris-(hidroximetil)aminometano (17mM),

ί ·’

-¹⁸/

EDTA (0,08mMj a um pH 7,2 foi adicionada a 100 mM de ditiotreji tol, para uma concentração final de 2mM. A libertação de MMC foi avaliada por HPLC utilizando-se um aparelho Whatman Parta, sil 5 ODS-3 de fase inversa, coluna C-18 e o sistema de grad£ ente seguinte: álcool metílico a 30% em acetato a 1% pH 6 para álcool metílico a 95% durante 6 minutos; continuação duraii te 8 minutos; débito, 2 ml/minuto; controlado a 340 nm.

Prepara-se um profármaco antitumoral possuindo um fármaco contendo um grupo álcool, etoposido, através do qual se ligava ao radical dissulfureto-benzilo por uma ligaçao car bonato de preferência a uma ligaçao carbamato, mediante aplicaçao do processo geral para a preparaçao de carbamatos substancialmente como descrito, excepto no facto de se utilizarem 162 mg (0,275 mmolç).de etoposido em substituição de MMA, ref£ rido antes, no exemplo anterior para se obter o produto sob a forma dum sólido branco.

RESULTADOS

Estudos gerais

A fim de se determinar se os carbamatos de benzilo com substituintes dissulfureto nas posiçoes apropriadas eram susceptíveis de fragmentação do grupo carbamato após redução do grupo dissulfureto, foram realizados estudos que utilizaram como grupo eliminável a p-nitroanilina. A síntese do carbamato de benzilo de ensaio 12 está descrita na Fig. 1. Numa solução aquosa de metanol tamponada com o pH compreendido entre 6 e 8, 12 apresentou-se estável durante vários dias. Contudo, após tratamento com ditiotreitol a ligaçao dissulfureto

-19reduziu-se e a para-nitroanilina foi libertada. 0 esquema pre. sumível para a eliminação da para-nitroanilina está representado na Fig. 2.

desenvolvimento da reacçao foi controlado por espectroscopia uv/visível em que 14 ( λ. max 371 nm) foi facilmen. te distinguido do material inicial 12 (Λ max 313 nm).

A análise por HPLC serviu para confirmar que a para, -nitroanilina fora eliminada. Demonstrou-se que se formava 14 em função do pH e que a libertação era mais rapida a valores de pH neutros ou básicos. Também se observou que a libertação de 14 era ligeiramente mais rápida a temperatura de 37° C do que a temperatura ambiente.

Sintese e reactividade dos profármacos

Preparou-se uma série de derivados de mitomicina e daunomicina por condensação destes fármacos com cloroformato de benzilo ou com os cloroformatos 8-11 (Fig. 3). Os dissulfuretos 26 e 27 foram derivados de 24 e 25 por deslocamento do grupo tiopiridilo com p-fluorotiofenol. Os derivados dos fármacos obtidos deste modo eram apenas ligeiramente solúveis em água, mas podiam ser facilmente dissolvidos em soluções orgânicas aquosas.

Em solução aquosa tamponada de metanol a pH 7,2, os três derivados da mitomicina C, 18, 19 e 20., entraram em redu. çao rapida com ditiotreitol, mas a eliminação subsequente de mitomicina C ocorreu a diferentes níveis. Sob condiçoes de re. duçao o para-dissulfureto (20) libertou a mitomicina C mais rapidamente (t^^lO min.) e o orto-dissulfureto (18) foi signi.

-20- ί ficativamente mais lento (tempo médio, 72 min.). Como se espe^ rava, o isómero em posição meta nao libertou qualquer mitomicina, mesmo após 18 horas. A redução do dissulfureto de dauno. micina, 30., resultou numa reacçao de fragmentaçao idêntica e a daunomicina foi libertada. Os carbamatos de benzilo simples, 17, 23 e 29 apresentaram-se estáveisísob as condiçoes de reac ção.

Ensaios in vitro

Os derivados de fármaco foram ensaiados para se de^ terminar a actividade in vitro com duas linhas de células liri fóides humanas Namalwa e HBS-2. As células foram contactadas com os fármacos durante uma hora em PBS, lavadas e, em seguida, incubadas durante 19 horas. A viabilidade foi determinada pela quantidade de H-timidina incorporada no DNA frente a um controlo não tratado. Os valores de CI-50 estão representados no Quadro 1.

ft

Os resultados mostraram que os derivados de MMC mais activos 18, 20 e 21 foram os que foram susceptíveis de encetar o processo de eliminação do carbamato de benzilo mediado pelo tiol. De facto, estes compostos foram significativamente mais activos do que a própria MMC. 0 profármaco de MMC mais citotó^ xico foi o dissulfureto 20, que foi, pelo menos, 20 vezes mais citotóxico do que MMC. Os derivados de MMC não cindíveis, 17 e 19, eram muito menos citotóxicos do que MMC. Observou-se uma tendência similar para os derivados de DAU 29 e 30. 0 profá.r maco de DAU 30 cindível foi muito mais citotóxico do que o dje rivado 29 nao cindível, mas algo menos activo do que DAU. To-21dos os derivados de MMA eram altamente citotóxicos. Sob as cori dições utilizadas para o ensaio in vitro, o carbamato de benzjL 1° 23, foi mais activo do que MMA.

Ensaios in vivo

Foram utilizados três modelos de tumor murino para a. valiar as actividades in vivo dos fármacos. Indicam-se os efei. tos terapêuticos de doses de fármaco por via intraperitoneal óptimas frente a tumores administrados por via intraperitoneal no Quadro 2. Na série de MMC, o agente menos activo foi o composto 17, um derivado de MMC nao cindível. 0 derivado mais activo de MMC foi o dissulfureto de carbamato de para-benzilo, 20 que foi significativamente mais activo do que MMC sobre célula: P388. Todos os derivados de MMA foram menos activos do que o fármaco original. Os dois derivados de daunomicina, 29 e 30 apresentaram-se inactivos.

Alguns dos derivados de MMC e MMA foram ensaiados pa. ra determinação da actividade sobre melanoma B16 implantado por via subcutânea. Nesta experiência, os fármacos foram administrados por via endovenosa nos dias 1, 5 e 9 após implantaçao do tumor. Os resultados estão representados no Quadro 3. Os profarmacos de MMC cindiveis, 20 e 21, foram quase tao activos co. mo MMC. Foi observada actividade significativamente menor para carbamato de benzilo MMC, .17.. MMA verificou-se ser mais activo do que MMC sobre este tumor experimental. Os profármacos cindi, veis 24--.27, foram tão activos como MMA, sendo o 24 o que mostrou uma actividade ligeiramente superior. 0 derivado de MMA não cindível, 23, foi muito menos activo do que MMA.

-ί

DISCUSSÃO

Desenvolveu-se uma nova classe de profármacos em que a libertação de um fármaco se realiza sob condiçoes de redução moderadas. A fragmentaçao é devida a instabilidade dos carbama tos de mercaptobenzilo com substituintes nas posiçoes orto e para.As reacções quimicamente relacionadas foram observadas com carbamatos de benzisoxazolilo sob condiçoes básicas (12) e car. bamatos de amidobenzilo após hidrólise da ligaçao amida (13). Estas reacções sao todas relacionadas do ponto de vista mecâni. co e sao iniciadas pela libertação da densidade de electrões a partir do heteroátomo desprotegido no sistema TV, resultando na libertação de anidrido carbónico e do componente amina do carbamato. Demonstram-se aqui aspectos únicos da fragmentação como a utilização do átomo de enxofre como heteroátomo e a ex pulsao de um fármaco quimicamente intacto sob a forma activa. Também se demonstrou uma relaçao entre a orientação do heteroátomo e a velocidade da reacçao. A expulsão do fármaco ocorre mais rapidamente quando em orientação para e é menor quando o dissulfureto está em posição orto relativamente ao grupo carbq mato. Como se esperava nao é induzida fragmentaçao após redução dos dissulfuretos de carbamatos de meta-benzilo. As diferenças de velocidade entre as fragmentações dos carbamatos de mercaptobenzilo orto e para pode ter significado para o desen. volvimento de velocidades de libertação óptimas.

- Os profármacos de MMC que foram susceptíveis de fragmeq taçao (18, 20, 21) foram significativamente mais citotóxicos do que a própria MMC, enquanto que os derivados estáveis 17 e 19, foram muito menos citotóxicos (Quadro 1). De um modo idêntico, ií o profármaco de DAU, 30 foi mais activo do que o derivado 29 estável. Estes factos indicam que a libertação de MMC e DAU dos profármacos é requerida para se obter o efeito citotóxico máximo. De facto, o facto de que os compostos 18, 20 e 21 exibem valores de CI-50 menores do que MMC deve sugerir que eles sao absorvidos de um modo mais eficaz ou libertam outros agentes citotóxicos, tais como metetos de tioquinona durante a fragmentação (Fig. 2).

- É de notar que uma correlação entre a libertação de fármaco e a citotoxicidade nao foi observada para os derivados de MMA. Carbamato de MMA 23 nao cindível, foi mais citotóxico do que MMA ou qualquer outro profármaco de MMA. MMA mostrou di. ferir de MMC por um numero significativo de factos. 0 farmaco tinha uma potencial redução muito mais baixa e era susceptivel de ataque nucleofílico na posição 7-metoxi (14). É, portanto, possível que o fármaco exerça o seu efeito citotóxico através de esquemas que envolvem a redução ou alquilação ainda que pre. sentes substituintes no átomo de azoto do grupo aziridinilo. Alternativamente, é possível que, sob as condiçoes utilizadas para os ensaios in vitro o carbamato do composto 23 seja hidro.

lisado.

Os efeitos citotóxicos de profármacos de MMC correlacionam-se bem com as experiências com p-388 (Quadro 2). Os derivados de MMC nao cindíveis, 17 e 19, sao menos activos do que MMC sobre P-388, o que é consistente com as observações in vitro. Actividades mais elevadas foram detectadas para os profármacos cindíveis 18, 20 e 21. 0 carbamato de benzilo subs. tituído com MMC em posição para, 20, nao era apenas 20 a 25 ve

-24- # zes mais citotóxico do que MMC nos tecidos em cultura, mas tam bém significativamente mais activo em o tumor experimental P-388.

Todos estes profármacos cindíveis MMC e MMA ensaiados sobre melanoma B16 implantado por via subcutânea, mostraram ac_ tividade anti-tumoral (Quadro 3). Os derivados nao cindíveis, Y7_ e 23 apresentaram pequena actividade. 0 facto de que há pouca diferença entre os profármacos cindíveis e os fármacos originais sobre B16 pode indicar que os profármacos entram em fragmentaçao quando administrados sistemicamente. Esta decomposição não é aparentemente tão pronunciada na via de administração do fármaco intraperitoneal, uma vez que o fármaco 20, foi signifi. cativamente mais activo do que MMC (Quadro 2). Estes dados devem sugerir que se pode obter uma actividade melhorada de profármacos administrados por via endovenosa com derivados de dis. sulfureto mais estáveis. A estabilidade de dissulfuretos in vivo pode ser afectada por factores electrónicos e estéricos. Por exemplo, verificou-se que o impedimento estérico pode estabili. zar as ligações dissulfureto em imunoconjugados na cadeia de rjí cino A-anticorpo (15). A estabilidade in vivo dos profármacos aqui referidos, pode ser controlada de um modo idêntico.

Deste modo, foi descoberta e desenvolvida uma nova classe de derivados de fármacos anti-tumorais que entram em fra& mentaçao após redução das ligações dissulfureto. Mostrou-se que esta fragmentaçao conduz à libertação do fármaco original quimicamente inalterado. Os profármacos são, pelo menos, tao cit£ tóxicos como o fármaco original in vitro e vários destes têm actividade anti-tumoral acentuada in vivo. É possível que a es-25tratégia de libertação aqui apresentada se mostre utilizável p_a ra o desenvolvimento de derivados de profármacos que podem selectivamente actuar sobre células que apresentam níveis aumentados de agentes de redução ou sobre tecidos em ambientes hipóxicos.

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J., Parnell, G.D., Mirza, A., W.C.J. (1986) Anti-Cancer Drug

.../27

-27QUADRO 1

VALORES DE CI-50 DE AGENTES ANTI-TUMORAIS CONCENTRAÇÃO

FÁRMACO_CI-50 MOLAR

	NAMALWA	HSB-2
16	5xl0^-6	4xl0^-6
17	lxlO^-5	8xl0^-6
18	2xl0^-6	2xl0^-6
19	> !0-^{5 b}	> io^{-5 c}
20	2xlO^-7	2xl0^-7
21	7xl0“⁸	lxlO^-7
22	-9 4x10 *	lxlO^-8
23	7xl0^-10	2xl0^-9
24	2xl0~⁸	4xl0~⁸
25	-9 9x10 *	2x10 ⁸
26	2xl0“⁸	5xl0~⁸
27	lxlO^-8	4xl0^-8
28	3x10 ⁷	2xl0^-7
29	2xl0^-5	3xl0^-6
30	lxlO^-6	6xl0^-7
, Células	era contacto com o fármaco durante	1 hora à tempe
ratura	de 37° C era PBS. Ver pormenores na	secção de ”Ma-

terial e Métodos”.

b. Morte 32% a 10^-5M

c. Morte 26% a 10 ⁶M

.../28

-28rf

QUADRO 2

EFEITO DOS DERIVADOS DA MITOMICINA E DA DAUNOMICINA SOBRE LEUCEMIA³ P388 e L121O

	Dose	Efeito
	Óptima	máximo
FÁRMACO	mg/kg	T/C,
16.	3,2	D 266
17.	12,8	144
18	51,2	195
li	51,2	185
20.	25,6	353
21	12,8	222
22	3,2	180
24	0, 8	116
25.	3,2	153
26	3,2	163
27	12,8	163
28	3,2	154
29	9,0	100
30	3,0	100

* 6 a· Inoculo de tumor: 10 células de ascites implantadas

i.p. injecção simples de fármaco, dia 1. Compostos 16-27 ensaiados contra P388; 28-30 ensaiados contra L1210. A duração da experiência foi de 30 dias.

b. T/C = tempo médio de sobrevivência (tratado/testemunha) X 100.

.../29

-29QUADRO 3

EFEITO DOS DERIVADOS DE MITOMICINA SOBRE MELANOMA Bl6^&

FÁRMACO	Dose õptima mg/kg/inj	Efeito máximo T/C
iâ	3,0	143
Γ7	4,8	96
20	12,8	145
21	6,4	123
22	0,4	182
23	6,4	124
24	6,4	205
25.	3,2	191
26.	3,2	182
27	9,6	182

a. Inoculo de tumor. Porção de trocarte implantada por via subcutânea. Três injecções i.-v., dias 1, 5 e 9. A duração da experiência foi de 60 dias.

Claims

1·-* Processo para a preparação de compostos com actividade de profármaco anti-tumoral de fórmula geral O na qual

D representa um radical de um fármaco anti-tumoral comportando na sua estrutura principal um grupo funcional quimicamente reactivo que permite a ligação dessa estrutura ao grupo dissulfureto-benziloxi-carbonilo que deriva de um grupo amina primária, representado pela fórmula geral R^NH-, na qual R^ representa a estrutura principal do radical do referido fármaco; um grupo amina secundária, representado pela fórmula geral

-31/

R-^N-, na qual tem o significado definido antes e R₂ representa, independentemente do símbolo R^, grupos alquilo de cadeia linear ou ramificada com 1 a 10 átomos de carbono e, eventualmente, substituinte(s) escolhidos entre 1 a 3 grupos alcoxi comportando 1 a 3 átomos de carbono e 1 a 3 átomos de halogêneo, grupos fenilo comportando, eventualmente, substituinte(s) escolhidos entre 1 a 3 grupos alquilo com 1 a 3 átomos de carbono, 1 a 3 grupos alcoxi comportando 1 a 3 átomos de carbono e 1 a 3 átomos de halogêneo, e um grupo fenilalquilo, comportando, eventualmente, um substituinte, caso em que o grupo fenilo tem o significado definido antes para o grupo fenilo substituído e o grupo alquilo representa um grupo polialquilénico comportando 1 a 3 átomos de carbono, ou R^ e R₂representam, considerados conjuntamente, a estrutura principal do radical do fármaco representado pelo símbolo D, citado antes, comportando um grupo divalente ligado por via química ao átomo de azoto que integra o grupo amina secundária; ou um grupo ãlcool representado pela fórmula geral R^0-, na qual R^ tem o significado definido antes; e

R^ representa um grupo funcional orgânico, compatível com a ligação dissulfureto e com o radical do fármaco representado por D, escolhido entre o grupo constituído por um grupo alquilo, de cadeia linear ou ramificada, comportando 1 a 10 átomos de carbono e, eventualmente, substituinte(s) ,

X «a caso em que o grupo alquilo tem o significado definido antes para o grupo alquilo substituído, fenilo e fenilalquilo, eventualmente substituídos, caso em que o grupo fe- nilo tem o significado definido antes para o grupo fenilo substituído e o grupo alquilo representa um grupo polialquilénico, comportando 1 a 3 átomos de carbono, um grupo heteroarilo eventualmente substituído, escolhido entre um grupo piridilo eventualmente substituído, um grupo naftiridilo, quinolilo, isoquinolilo e indolilo ou um grupo heterocíclico, eventualmente substituído, escolhido entre um grupo constituído por pirrolilo, pirrolidilo, imidazolilo, imidazolidilo, piperidilo, morfolilo, furilo e tie nilo, sendo os referido(s) substituinte(s) do referido grupo alquilo escolhidos entre 1 a 3 átomos de halogénio e comportando o referido grupo fenilo dos grupos fenilalquilo, heteroarilo ou heterociolo substituintes escolhidos entre 1 a 3 grupos alquilo com 1 a 3 átomos de carbono ou alcoxi comportando 1 a 3 átomos de carbono e 1 a 3 átomos de halogéneo, sendo a orientação do grupo representado pela fórmula geral -S-S-R^ ^no núcleo fenílico do radical benzilcarbamato escolhida entre as posições orto- e para-;

..cterizado

2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, car caracterizado pelo facto de se fazer reagir um fármaco anti-tumoral do fórmula gorai D, na qual D, tom o significado definido antes, com cloroformato do tricloromctilo no seio dc um meio dissolvente inerte.

pelo facto de o radical do fármaco representado pelo símbolo D,ser escolhido entre fármacos que contêm um grupo amina primária e fármacos que contêm um grupo amina secundária.

3.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o radical representado pelo símbolo D ser escolhido entre mitomicina-C, mitomicina-A, daunomicina, adriamicina, aminopterina, aotinomicina, oleomicina e seus derivados.

4.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como radical de um fármaco representado pelo símbolo D, um grupo carbinol representado pela fórmula geral RJD-, na qual R^ tem os significados definidos antes.

5.- Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de se utilizar etoposido como radical do fármaco representado pelo símbolo D.

6.- Método para a libertação em células de tumor sólido de um mamífero, apresentando níveis elevados de agentes de redução endógenos que incluam pelo menos um membro do grupo constituído por NADH, NADPH e glutatião, de uma quantidade de um fármaco antitumoral activo, comportando na sua estrutura principal um grupo funcional quimicamente reactivo escolhido entre um grupo amina primária representado pela fórmula geral R’NH-, um grupo amina secundária representado pela fórmula geral R^í^N- ou um, grupo ãlcool representado pela fórmula geral R^O-, na qual R^ e R₂ têm os significados definidos para a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender as fases:

a) de se administrar a um animal mamífero uma quantidade anti-tumoral eficaz de um profármaco anti-tumoral preparado de acordo com a reivindicação 1, de preferência compreendida entre cerca de 0,1 e cerca de 15 mg/Kg de peso corporal do animal e por dia.

b) de se fazer contactar o pro-fármaco anti-tumoral da fase

a) sob condições de redução endógenas; e

c) de se permitir a cisão redutora do pro-fãrmaco anti-tumoral para libertar o fármaco livre,